Plan du cours
Introduction à la biocatalyseCatalyse acide/base (protéines à Zinc)Réactivité de O2 en (bio)catalyseFixation de O2 (protéines à Fer et Cuivre)Activité « oxygénase » des protéines à FerActivité « oxydase » et « oxygénase » des protéines à Fer et Cuivre
Introduction à la BiocatalyseI. Introduction
II. Pré-organisation des enzymesIII. III. Métaux et biocatalyse
I. Introduction
+ faible, + réaction facileQuand < énergie thermique à une température donnée, réaction spontanée
Coordonnée de réaction
Energie d’activation
Etat de transitionEnergie
ΔrG°
Un catalyseur va …
Être non consomméRendre possible une réaction:
Oxydation du méthane en méthanol par la Méthane Monooxygénase
Accélèrer une réaction:Hydrolyse d’amides: k = 0.01 sHydrolyse d’amides: k = 0.01 s--11 sans enzyme, sans enzyme, 1000000 s1000000 s--11 avec Carboxypeptidaseavec Carboxypeptidase
Comment ?
Diminue l’énergie d’activationRevient à stabiliser l’état de transition
Coordonnée de réaction
Energie d’activation
Etat de transitionEnergie
ΔrG°
Etat de transition
Rouge: Réaction catalysée
Catalyse par des enzymesPré-organisation du site actif: plus complémentaire avec l’état de transition qu’avec le substrat initial
Coordonnée de réaction
Energie Etat de transition
Site actif
‡
Forte affinité
Pour une catalyse efficace
Très complémentaire
Faible affinité
Structure tridimensionnelle des enzymesStructure tridimensionnelle des enzymes
Substrat
Etat de transition
Produit
II. Préorganisation des enzymes (protéines)
Amino-acides connectés par des liens amides
Résidus R vont jouer un rôle primordial dans:Solubilité, interactions entre biomolécules (Balance hydrophile / lipophile)Stabilité de la structure, fixation du substrat(Liaisons H ou hydrophobe, ponts S-S)Catalyse acide / baseCoordination de métaux
Structure des protéines
Primaire: séquence d’acides aminés
Secondaire: repliement de régions de protéines
• Hélices α:Ala, Glu, Leu, Met, Pro, Gly, Tyr, Ser
Structure des protéines
Secondaire: repliement de régions de protéines• Feuillets β:Val, Leu, Ile, Trp, Tyr, Thr, Phe
Structure des protéines
Structure tertiaire: forme de la protéine entière
Structure quaternaire: Résulte de l’interaction entre plusieurs sous-unités. Responsable de l’allostérie de l’hémoglobine par ex.
Site actifLà où la réaction catalytique a lieuDomaine très restreint de la protéine
Site actif: réaction catalytique
Enveloppe protéique: Stabilité, régulation, allostérie, fixation de cofacteurs, interaction avec d’autres biomolécules
III. Métaux et biocatalyse
Acidité de Lewis: Facilitent les réactions acide-baseMultiples degrés rédox accessibles: Facilitent les réactions rédoxActivation par coordination: Facilitent le transfert d’atomes ou de groupements
Métaux omniprésents car la plupart des grandes réactions biochimiques peuvent être facilitées !!!
Concentration en métaux au niveau cellulaire
Nb atome / Cellule(E. Coli)
Concentration
Log
8
6
4
2
0Mg K Fe Zn Ca V,Cr,Mn,Co,
Ni,Cu,As,Se,Mo
LogC
-1
-2
-3
-4
-5
Mg,K Ca Fe,Zn-6
Cu,V,Cr,Mn,Co,Ni,Cu,As,Se,Mo
Cellule
Milieu de culture
Rôles biochimiques des métaux:
Structure (protéines, ADN, os): Ca, Zn, MgTransfert d’information, maintien de pression osmotique: Na, K, CaCatalyse acide-base: Zn, MgTransfert d’électrons: Fe, Cu, Mn, Mo, W, V, Co, NiTransport d’O2 (Fe, Cu) et fixation de N2 (Fe, Mo, V)
Rôles biochimiques des métaux:
Structure (protéines, ADN, os): Ca, Zn, MgTransfert d’information, maintien de pression osmotique: Na, K, CaCatalyse acide-base: Zn, MgTransfert d’électrons: Fe, Cu, Mn, Mo, W, V, Co, NiTransport d’O2 (Fe, Cu) et fixation de N2 (Fe, Mo, V)
LogC
-1
-2
-3
-4
-5
Mg,K Ca Fe,Zn-6
Cu,V,Cr,Mn,Co,Ni,Cu,As,Se,Mo
Cellule
La nature a sélectionné des métaux:
Abondance dans la croûte terrestre:Si: 2.8x105
Fe: 5x104
Ca: 3.6x104
Na: 2.8x104
K: 2.6x104
Mg: 2.1x104
Mn: 950V: 135Cr: 100Ni: 75Zn: 70Cu: 55Co: 25
Rem: Soulignés = métaux rédox actifs en bio
AbondantsSinon coût énergétique
La nature a sélectionné des métaux
AbondantsSinon coût énergétique
Plutôt labiles (Cr rare en bio)Réactions facilitées au niveau des sites actifs de métalloprotéines
Dont les complexes sont stables thermodynamiquement
Stabilité des biomolécules
Métaux les plus « universels » en biocatalyse: Fer et Cuivre
Fonction Fer CuivreTransport d’O2 Hémoglobine HémocyanineOxygénation Cytochrome P450 Tyrosinase
Catéchol dioxygénaseOxydase Hème peroxydase Amine oxydase
Peroxydase Galactose oxydaseTransfert d’électrons Cytochrome protéine « blue copper »Antioxydant Peroxydase Superoxyde dismutaseRéduction de nitrites Cytc nitrite réductase Cu nitrite réductase
Protéines à Fe et Cu ayant même fonction: Théorie de l’évolutionAdaptation du vivant à la présence d’oxygène: Fe2+ s’oxyde en Fe3+ qui
précipite et devient indisponible pour le vivant. Cu+ toxique s’oxyde en Cu2+
qui va être utilisé à la place du fer.
a- Acidité de Lewis
Comportement des ions métalliques dans l’eau:
H2O: base de Lewis Formation de complexes aquo M(H2O)n
z+
Effet du métal (acide de Lewis): Acidité des molécules d’eau coordinées augmenteEx: pKa Fe(H2O)6
3+ / Fe(H2O)5(OH)2+ = 2 !!Acidité augmente qd z augmente et r diminue
Propriétés générales des métaux
Effet de ligand sur le potentiel d’oxydation
Chargé négativement: Stabilise haut degré d’oxydationσ-donneur: Stabilise haut degré d’oxydationπ-accepteur: Stabilise bas degré d’oxydationEffet stérique !
Effet des ligands sur le potentiel d’oxydation
E° (Fe(H2O)63+ / Fe(H2O)6
2+) = 0.77 VE° (Fe(CN)6
3- / Fe(CN)64-) = 0.36 V
Explication:CN- est un meilleur ligand que H2O pour Fe3+
Degré +III du complexe favoriséPlus grand domaine de prédominance
EFeII FeIII
EFeII FeIII
H2O
CN-
Potentiels de métalloenzymes à Fe ou Cu catalysant des réactions rédox
En fonction du ligand tous les potentiels sont accessibles !!!En fonction du ligand tous les potentiels sont accessibles !!!
c- Sites actifs de métalloenzymesLe squelette protéique défini une sphère de coordination autour du métalNormalement un métal bien défini se fixeEffet de la seconde sphère de coordination souvent non négligeable
Première sphère: coordination directe (en rose)Deuxième sphère: acides aminés dans les feuillets b adjacents
Quel ligand pour quel métal ? Théorie HSAB
Hard
Soft
Cation Ligand
Liaison: dur-dur Caractère ioniquemou-mou Caractère covalent
d. Classes de ligands biologiques
Amino-acidesADN (phosphates)Sucres (hydroxyles)Cofacteurs, groupements prosthétiques (porphyrines …)Agrégats (ferritine)
d. Classes de ligands biologiques
Amino-acidesADN (phosphates)Sucres (hydroxyles)Cofacteurs, groupements prosthétiques (porphyrines …)Agrégats (ferritine)
d.1 Amino-acides
Coordination par les chaines latéralesH2N CHC
CH2
OHO
COH
O
H2N CHCCH2
OHO
SH
H2N CHCCH2
OHO
CH2COH
O
H2N CHCCH2
OHO
NNH
H2N CHCCH2
OHO
CH2CH2CH2NH2
H2N CHCCH2
OHO
OH
H2N CHCCH2
OHO
CH2SCH3
Hard
Soft
Cation Ligand
DurDur MouMou
pKa10.810.2 6.0
3.6 4.38.4
d.1 Amino-acides
Mode de coordination observé uniquement lorsque la biomolécule est flexibleRarement observé lorsque la protéine présente une structure tertiaire ou quaternaire
Cas particulier des oligopeptides: Complexationpar les N- d’amides déprotonés ou les carbonyles d’amides.
Le plus couramment rencontré: HèmeStructure dérivée du tétrapyrroleMétaux: essentiellement Fe (hémoglobine) et Mg (chlorophylle)
d.2 Groupements prosthétiques
Définition: groupe ou ligand fixant le métal et qui peut être enlevé (intact) de la protéine
HN
NNH
N
HN
NNH
N
COOOOC
Protoporphyrine IX
HN
NNH
N
COOOOC
O
HO
Hème a
HN
NNH
N
COOOOC
SS Cys
Cys
Hème c(lié de manière covalente
≠ prosthétique)
Cytochrome OxydaseCytochrome OxydaseCytochrome cCytochrome c
HémoglobineHémoglobine
Réactivité des protéines à fer héminique(les plus courantes)
L’environnement protéique (ionisation)Le type d’hèmeLe métal, son degré rédox, son spin
Réactivité dictée par:
HN
NNH
N
COOOOC
Protoporphyrine IX
N
NN
N
COOOOC
Fe
HisHis de l’hémoglobinede l’hémoglobine
Fixation de la porphyrine à la protéine
Nécessite que la porphyrine soit métallée
Ferrochelatase+ Fe2+, - 2 H+
Hème