21/07/2014
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Institut de Formation en Soins Infirmiers – 1ère AnnéeAnnée universitaire 2014 - 2015
Biochimie - Biologie moléculaire
Pathologies et génétique moléculaire
Julien Fauré
Plan
Les outils de la génétique moléculaire
Les maladies et la génétique
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Plan
Les outils de la génétique moléculaire
Les maladies et la génétique
- matériel présent dans les virus, les bactéries et les cellules: ADN et ARN
- ARN = ARNm, ARNt, ARNr
- sensibilité aux RNAses- spécificité tissulaire des ARNm
- quantification par mesure de l’absorption à 260 nm
- ADN des cellules eucaryotes animales = ADN nucléaire + ADN mitochondrial
- source : sang, tissus (biopsies) - chez l’homme ≈ 6-7 10-12 gramme /cellule
1 ml de sang ≈ 5-6 106 leucocytes soit ≈ 30 10-6 g d’ADN
Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
Extraction et purification du matériel génétique
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Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
prélèvement biologique
lyse des cellules nuclées
dégradation des protéines
extraction des acides nucléiques
précipitation de l’ADN
- lyse par détergents- traitement mécanique
- traitement par la protéinase K
- solvants organiques- fixation par interaction de charges
- alcools
Principales étapes de la purification des acides nucléiques
Extraction et purification du matériel génétique
Colle
atgctaATC tgat
(endonucléases, DNAses…)
(ligases)
(polymérases…)
(polymérases, kinases…)
(polymérases…)
Des outils enzymatiques pour étudier l ’ADN
Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
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Séparation de fragments d’ADN: l’électrophorèse
Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
- ADN (chargé négativement)- champ électrique: un générateur- support poreux: gel d’agarose
1- Visualiser l’ADN
bromure d ’éthidium(molécule intercalante fluorescente)
UV
- utilisation de molécules fluorescentes
marquer l’ADN
témoins
+
-ADN
gel - +
- coupures franches
- coupures cohésives
5 ’---GTTAAC------CAATTG---5 ’
5 ’---GTT AAC------CAA TTG---5 ’
Hpa I
5 ’---GAATTC------CTTAAG---5 ’
Eco RI 5 ’ ---G AATTC------CTTAA G---5 ’
Enzymes de restriction
- séquences spécifiques de reconnaissance (≈ 4 à 8 bases, palindromes)- origine bactérienne : Eco RI = Escherichia coli type R souche I
Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
2- Couper de l’ADN
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Objectif: amplifier une séquence donnée d’ADN
Objectif quantitatif :pouvoir travailler sur suffisammentde matériel
Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
3- Amplifier de l’ADN : la PCR (Polymerase Chain Reaction)
Objectif: amplifier une séquence donnée d’ADN
Objectif quantitatif :pouvoir travailler sur suffisammentde matériel
Objectif qualitatif :pouvoir travailler sur une portionde génome
2.5 109 pb
100 pb,1000 pb,…
Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
3- Amplifier de l’ADN : la PCR (Polymerase Chain Reaction)
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Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
ADN à amplifier, la matrice
Polymérase thermostable, TaqdNTP
Amorces: oligonucléotides d’environ 20 pb
3- Amplifier de l’ADN : la PCR (Polymerase Chain Reaction)
Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
ADN à amplifier, la matrice
Polymérase thermostable, TaqdNTP
Amorces: oligonucléotides d’environ 20 pb
3- Amplifier de l’ADN : la PCR (Polymerase Chain Reaction)
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Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
1ere étape : dénaturation à 94°C
2eme étape : hybridation à 55°C
3ere étape : polymérisation à 72°C
cycle 1
3- Amplifier de l’ADN : la PCR (Polymerase Chain Reaction)
Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
1ere étape : dénaturation à 94°C
cycle2
3ere étape : polymérisation à 72°C
2eme étape : hybridation a 55°C
3- Amplifier de l’ADN : la PCR (Polymerase Chain Reaction)
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Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
1ere étape : dénaturation à 94°C
cycle2
3ere étape : polymérisation à 72°C
2eme étape : hybridation a 55°C
3- Amplifier de l’ADN : la PCR (Polymerase Chain Reaction)
Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
1ere étape : dénaturation à 94°C
N cycles
3ere étape : polymérisation à 72°C
2eme étape : hybridation à 55°C
3- Amplifier de l’ADN : la PCR (Polymerase Chain Reaction)
x2N
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Méthode enzymatique (aux di-déoxynucléotides) de Sanger
- matrice ADN- ADN polymérase, amorce- dNTP & ddNTP (didéoxy-NTP)
Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
dNTP ddNTP
4- Lire de l’ADN : le séquençage
Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
P P
1’
2’3’
4’
5’1’
2’3’
4’
5’
P P
1’
2’3’
4’
5’1’
2’3’
4’
5’
P P
1’
2’3’
4’
5’1’
2’3’
4’
5’
Méthode enzymatique (aux di-déoxynucléotides) de Sanger
- matrice ADN- ADN polymérase- dNTP & ddNTP (didéoxy-NTP)
Un ADN qui incorpore un ddNTP ne peut plus être allongé
3- Lire de l’ADN : le séquençage
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agcatcgtactacgat 5 ’+ amorce
5 ’ aatgctgatcgatgctatggctagctagctatcgatcgtatcgtatcgtagcatgatgcta
séparation des 2 brins
dATP + 1% ddATPdCTP + 1% ddCTPdGTP + 1% ddGTPdTTP + 1% ddTTP
+ ADN polymérase
+
tagcatcgtactacgat 5 ’
tagcatcgtactacgat 5 ’5 ’ aatgctgatcgatgctatggctagctagctatcgatcgtatcgtatcgtagcatgatgcta
séparation des 2 brins
gcat
5 ’Électrophorégramme de séquence
atagcatcgtactacgat 5 ’5 ’ aatgctgatcgatgctatggctagctagctatcgatcgtatcgtatcgtagcatgatgcta
séparation des 2 brins
atagcatcgtactacgat 5 ’ catagcatcgtactacgat 5 ’
catagcatcgtactacgat 5 ’5 ’ aatgctgatcgatgctatggctagctagctatcgatcgtatcgtatcgtagcatgatgcta
séparation des 2 brins
gcatagcatcgtactacgat 5 ’5 ’ aatgctgatcgatgctatggctagctagctatcgatcgtatcgtatcgtagcatgatgcta
séparation des 2 brins
gcatagcatcgtactacgat 5 ’
Chapitre 1: les outils de la génétique moléculaire
3- Lire de l’ADN : le séquençage
Electrophorèse
détecteur
Plan
Les outils de la génétique moléculaire
Les maladies et la génétique
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Maladie infectieuse:
grippe, rougeole
Maladie génétique:
mucoviscidose, hémophilie A diabète, maladies cardiaques
Méthodes d’études génétiques:Détermination de la cause des pathologies
Chapitre 2: les maladies et la génétique
Détection des génomes exogènes
bactériologie, virologie, parasitologie
caractère pathogène, virulence, résistance…charge virale et suivi thérapeutique
Chapitre 2: les maladies et la génétique
Détection des génomes exogènes
Détection par PCR
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bactériologie, virologie, parasitologie
caractère pathogène, virulence, résistance…charge virale et suivi thérapeutique
Chapitre 2: les maladies et la génétique
Détection des génomes exogènes
Détection par électrophorèse
Détection par PCR
MODIFIEE
bactériologie, virologie, parasitologie
caractère pathogène, virulence, résistance…charge virale et suivi thérapeutique
Chapitre 2: les maladies et la génétique
Détection des génomes exogènes
Détection par PCR
Détection par électrophorèse
MODIFIEE
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bactériologie, virologie, parasitologie
caractère pathogène, virulence, résistance…charge virale et suivi thérapeutique
Chapitre 2: les maladies et la génétique
Détection des génomes exogènes
Détection par PCR
Détection de virus Herpes (HSV) par PCR dans des larmes de patients
Br J Ophthalmol 1999;83:957-960
MODIFIEE
Maladie infectieuse:
grippe, rougeole
Maladie génétique:
mucoviscidose, hémophilie A diabète, maladies cardiaques
Méthodes d’études génétiques:Détermination de la cause des pathologies
Anomalies chromosomiques
Maladies liés à des mutations dans un gène
Maladie génétique: maladie causée par une ou plusieurs modifications du génome.
Chapitre 2: les maladies et la génétique
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Anomalies chromosomiques :
- A la naissance 0,6 à 0,9% des enfants vivants sont porteurs d’une anomalie chromosomique
- 22 paires autosomes + 1 paire gonosomes
Anomalies du nombre : ex. trisomie 21
Chapitre 2: les maladies et la génétique
Anomalies chromosomiques :
- A la naissance 0,6 à 0,9% des enfants vivants sont porteurs d’une anomalie chromosomique
- 22 paires autosomes + 1 paire gonosomes
Anomalies du nombre : ex. trisomie 21
Anomalies de structure : cassures chromosomiques
réarangements (ex LMC, t9;22))
Chapitre 2: les maladies et la génétique
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Anomalies chromosomiques :
- A la naissance 0,6 à 0,9% des enfants vivants sont porteurs d’une anomalie chromosomique
- 22 paires autosomes + 1 paire gonosomes
Chapitre 2: les maladies et la génétique
Chapitre 2: les maladies et la génétique
5’ 3’
gènerégion flanquante 3’région flanquante 5’
ARN polymérase
ARN primaire:
AAAAAAAAAAAAAAAAm7G
Epissage
Mutations dans un gène
ARN messager:
ADN
PROTEINE
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5’ 3’
gènerégion flanquante 3’région flanquante 5’
ARN polymérase
ARN primaire:
AAAAAAAAAAAAAAAAm7G
Epissage
Mutations dans un gène
Chapitre 2: les maladies et la génétique
EFFET FONCTIONNEL SUR LA PROTEINE
ARN messager:
ADN
Chapitre 2: les maladies et la génétique
traductionfin de traduction
fin de transcription
région 3’ UNTrégion 5’ UNT
5’ 3’
gènerégion flanquante 3’région flanquante 5’
ARN polymérase
ARN primaire:
AAAAAAAAAAAAAAAAm7G
Epissage
Mutations dans un gène
transcription
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Chapitre 2: les maladies et la génétique
traductionfin de traduction
transcriptionfin de transcription
région 3’ UNTrégion 5’ UNT
5’ 3’
gènerégion flanquante 3’région flanquante 5’
ARN polymérase
ARN primaire:
AAAAAAAAAAAAAAAAm7G
Mutations dans un gène
EpissageEpissage
Chapitre 2: les maladies et la génétique
traductionfin de traduction
transcriptionfin de transcription
région 3’ UNTrégion 5’ UNT
5’ 3’
gènerégion flanquante 3’région flanquante 5’
ARN polymérase
ARN primaire:
AAAAAAAAAAAAAAAAm7G
Epissage
Mutations dans un gène
EFFET FONCTIONNEL SUR LA PROTEINE
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Chapitre 2: les maladies et la génétique
5’ 3’
gènerégion flanquante 3’région flanquante 5’
Mutations dans un gène
AAAAAAAAAAAAAAAAm7G
Chapitre 2: les maladies et la génétique
5’ 3’
gènerégion flanquante 3’région flanquante 5’
Mutations dans un gène
AAAAAAAAAAAAAAAAm7G
mutations ponctuelles de substitution
--- UGG UGC UCC --- = -- trp-cys-ser--
C > U = --trp-cys-ser--C > G = --trp-trp-ser--C > A = --trp-stop
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Chapitre 2: les maladies et la génétique
5’ 3’
gènerégion flanquante 3’région flanquante 5’
Mutations dans un gène
AAAAAAAAAAAAAAAAm7G
mutations par délétion ou insertion
--- UGG UGC UCC UUA GUU AGA trp cys ser phe val arg
--- UG-U GC U CC U UA G UU ---cys ala pro stop
--- UGG UGC AUC C UU A GU U AG -trp cys ile ile ser stop
-
+décalage du cadrede lecture
Chapitre 3: applications médicales
quand ?
- diagnostic prénatal, pré-implantatoire- caractéristiques génétiques
activités diagnostiquessoumises à agréments
L’identification d’anomalies génétiques
sur quel matériel biologique ?
-ADN -ARNm
pourquoi
- aide au diagnostic, conseil génétique- diagnostic présymptomatique
SANGTISSUS
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PCR
coupure par Rsa I146 pb 117 pb 29 pb
-----GTGC---
gène normal gène muté
site Rsa I
-----GTAC---
Hémochromatose, maladie causée par la mutation c.845 G>A du gène HFE
Chapitre 3: applications médicales
L’identification d’anomalies génétiques
c.845G>A
homozygote sainporteur hétérozygote
homozygote muté
-----GTGC---
gène normal gène muté
site Rsa I
-----GTAC---
analyse par électrophorèse
146 pb
117 pb
29 pb
mig
ratio
n
témoinsde taille
PCR
coupure par Rsa I146 pb 117 pb 29 pb
Chapitre 3: applications médicales
L’identification d’anomalies génétiques
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• analyse de la séquence des exons sur ADN• analyse de la séquence de l’ARNm
Chapitre 3: applications médicales
L’identification d’anomalies génétiques
Central Core disease (CCD) : Myopathie congénitale gène associé RyR1
Électrophorégramme de séquence
Conclusion
Ce qu’il faut retenir ?
Des outils performants : enzymes de restriction, PCR, séquençage
Génétique moléculaire et ses application médicales
- Activité encadrée
- Complexité dans certaines situations
Él t h é d é
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Merci, et bon courage pour la suite …
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