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NOTAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR J. Ramos- Zapata y L. González-Herrera

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UNIDAD 1

ADN COMO FUENTE DE INFORMACIÓN 1.1 DESCUBRIMIENTO DEL ADN El ácido desoxiribunucleico fue identificado inicialmente en 1868 por Friedrich Miescher, en los núcleos de las células del pus y en esperma de salmón. La llamo nucleína, observó la presencia de fósforo. Robert Feulgen, en 1914, describió un método para revelar por tinción el ADN, basado en el colorante fucsina. Se encontró la presencia de ADN en el núcleo de todas las células eucariotas, específicamente en los cromosomas. El bioquimico P.A. Levene en los 20’s analizó los componentes del ADN y encontró que contenía cuatro bases nitrogenadas: citosina y timina (pirimidinas), adenina y guanina (purinas); el azúcar desoxirribosa; y un grupo fosfato. Fosfato. La virtud del material genético es su habilidad para especificar una larga variedad de proteínas. Un error inicial fue el pensar que la estructura del material genético debería ser tan compleja como la variedad de proteínas producidas, ya que, se pensaba, que únicamente las proteínas poseían la suficiente diversidad para especificar otras proteínas, sin embargo, se aclaró esta cuestión cuando se sugirió que el material genético producía proteínas siguiendo un código basado en la diversidad de combinaciones que se podían obtener de los nucleótidos, tomados de tres en tres. El descubrimiento del principio de transformación en los núcleo celulares por Griffth (1928), dio la base para pensar que el ácido nucleico era el material genético. La bacteria del género Pneumococus provoca la muerte en ratones produciéndoles neumonía, la virulencia de las bacterias están determinadas por los polisacáridos capsulares, componentes de la superficie de diferentes tipos de Pneumococos, estos pueden ser tres diferentes tipos (I, II y III) de polisacáridos capsulares, todos con apariencia algodonosa (S) en la pared y por lo tanto en la colonias formadas. La bacteria S, con apariencia lisa, muerta puede transformar a las bacterias vivas R. A esta capacidad de transformación se le aisló, como un principio de transformación, en cultivo por Avery y colaboradores en 1944 y demostraron que era el ácido desoxiribonucleico (ADN), que se encontraba en abundancia en los núcleos de las células (Figura 1).


Figura 1.1 Experimento de transformación de Avery y colaboradores El papel del ADN luego fue confirmado con el descubrimiento de las enzimas ADNasas, pues al degradar los ácidos la capacidad transformante se perdía, lo que no sucedía se empleaba la tripsina que degrada proteínas lo cual no influía en la transformación, se desechó entonces la idea de que las proteínas poseían la capacidad de trasmitir la información génica. 1.2 ADN MATERIAL GENETICO UNIVERSAL Después de demostrar que el principio transformante consistía de ADN, era necesario probar que este era el material genético en todos los sistemas biológicos. Procariotas: Cuando el fago T2 infecta a células de E. coli, cuando estas se aplican a la bacteria son absorbidos y 20 minutos mas tarde las bacterias son lisadas, liberando una gran cantidad de fagos. Hershey y Chase (1952), infectaron bacterias E. coli, con fagos T2 marcados radiactivamente ya sea con P32 en el ADN o bien con S35 en las proteínas. Las bacterias infectadas fueron centrifugadas separándose en dos capas. La capa superficial consistía de las envolturas de los fagos liberados de la superficie bacteriana y por lo tanto marcados con S35. La otra fracción consistía de las bacterias infectadas, la mayoría de P32 se presentó en las bacterias infectadas. La progenie de fagos producidos por la infección contenía un 30% del P32 marcado, y muy poco (1%) de S35 marcado. Este experimento demuestra que el ADN del fago interno entra a la bacteria y forma parte de la progenie de fagos, exactamente el patrón de herencia esperado

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del material genético. Aunque se demostró claramente que el ADN es el material genético, el experimento de infección con fagos no es tan preciso como la transformación bacteriana para excluir proteínas contaminantes del ADN.

Figura 1.2 Experimento de Hershey y Chase Eucariontes: La discusión de los resultados de transmisión de Avery, son aplicados a un amplio rango de organismos tanto procariontes como eucariontes. Cuando el ADN es aplicado a poblaciones de células eucarióticas simples crecidos en cultivos, los ácidos nucleicos entran a la célula y en algunas resulta en la producción de proteínas nuevas. Al inicio la extracción se realizaba en masa, pero ahora el ADN se puede purificar para incorporar secuencias que producen una proteína particular. Como en el caso de células mutantes (TK-) para la producción de Timidina kinasa (TK) y que pueden obtener esta capacidad cuando se le aplica una secuencia de

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ADN que poseea el gen que la sintetiza Los experimentos de transformación en células eucariotas se denominan como transfección, sin embargo es similar a la transformación bacteriana. El ADN introducido se convierte en parte del material genético de la célula que ha sido transfectada. Al inicio la técnica se realizaba únicamente en cultivos de células, pero más recientemente el ADN puede ser introducido en huevos de mamíferos por microinyecciones. Estos experimentos demuestran no solamente que el ADN es el material genético, sino que, puede ser transferido entre especies diferentes y permanecer funcional. El materia genético de todos los seres vivos y algunos virus es el ADN. Sin embargo algunos virus poseen ARN como material genético, no obstante aún siguen siendo los ácidos nucleicos los encargados de dirigir los cambios y perpetuaciones génicas. 1.3 COMPONENTES DEL ADN La observación de que las bases están presentes en diferentes cantidades en el ADN de las diferentes especies dio como conclusión el concepto de que las secuencias de bases debe ser la forma en que la información genética es almacenada.

Figura 1.3 Componentes del ADN.

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Figura 1.4 Cada nucleótido contiene un anillo heterocíclico de carbono con átomos de nitrógeno (base nitrogenada), un azúcar con cinco carbonos en forma de anillo de pentosa y un grupo fosfato. Figura 1.5 Las bases nitrogenadas pueden ser pirimidinas: con anillos de seis miembros. Purinas: con dos anillos formados de cinco y seis miembros cada uno.

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Las bases purínicas son: adenina y guanina tanto en moléculas de ADN como en las moléculas de ARN. Por otro lado, se encuentran 2 pirimidinas en ADN, citosina


y timina, mientras que en el ARN se encuentran la citosina y el uracilo. La timina difiere del uracilo por la presencia de un sustituto del metilo en la posición C5. Las pentosas también son diferentes entre las moléculas de ADN y de ARN, de donde proviene su nombre: ADN = 2 – desoxyribosa y ARN = ribosa.

Figura 1.6 Esquemas de los azúcares presentes en las moléculas de ARN (iquierda) y ADN (derecha). Son diferentes por ausencia o presencia del grupo hidroxil en la posición dos. Las bases nitrogenadas se unen a la posición uno de pentosa por una unión glucosidica en la posición N1 de la primidina y en la N9 de las purinas. Una base ligada a un azúcar es llamado nucleosido y cuando se une a un grupo fosfato se llama nucleótido. Los nucleótidos proveen de bloques, los cuales se unen para construir los ácidos nucleicos. Los nucleótidos se unen en una cadena de polinucleótidos por una columna que consiste de series alternadas de azúcar y residuos de fosfato. Los nucleótidos pueden existir en formas en las cuales más de un grupo fosfato se une a la posición 5’. Son enlaces de alta energía, la cual es proveída para actividades celulares. NTP – nucleócido trifosfato, NDP – nucleócido difosfato (ver figura 1.4).

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Figura 1.7 La posición número 5’ de una pentosa se conecta con la posición 3’ del siguiente anillo de pentosa, por un grupo fosfato. Por lo que la columna de fosfodiester–azúcar se dice que consiste en uniones 5’–3’, las bases nitrogenadas se pegan en la periferia de la columna azúcar – fosfato. 5’ izquierda y 3’ derecha. 1.4 LA DOBLE HÉLICE DEL ADN Tres puntos claves sirvieron de base para que Watson y Crick propusieran el modelo de doble hélice del ADN en 1953: 1. Los datos de las fotografías de los rayos X, que mostraban que el ADN tenía una forma de hélice regular, dando una vuelta completa cada 34 Aº (3.4 nm) con un diámetro de 20 Aº (2 nm) aproximadamente.

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2. La distancia entre nucleótidos adyacentes es 3.4 Aº, 10 nucleótidos por vuelta. La densidad del ADN sugería que la hélice debería contener dos cadenas de polinucleótidos. El diámetro constante se explica si las bases de cada cadena se unen de manera restringida por lo que las purinas siempre son opuestas a las pirimidinas.

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Pirimidina con pirimidina, muy delgado

Purina con purina, muy grueso

20 Aº

3. Independientemente de la cantidad de cada base, la proporción G y C es siempre la misma en el ADN al igual que la proporción A y T. la composición de cualquier ADN se describe por la proporción G + C que tiene un rango de entre 26 a 74 % para las diferentes especies. Watson y Crick propusieron que las dos cadenas están unidas no por enlaces covalentes, sino por uniones de hidrogeno entre las bases nitrogenadas por lo que G pasa puentes de hidrogeno que la unen con C, y A con T de igual manera estas reacciones se conocen como bases pareadas. Estas bases pareadas se dice que son complementarias. Figura 1.8 Para que se pareen las bases, estas deben de estar en su forma Tautomerica, es decir NH en lugar de NH2 y COH en lugar de C=O. El modelo también requiere de que las cadenas corran en direcciones opuestas antiparalelas. Una cadena corre en dirección 5´- 3´ y su contraparte 3´- 5´.


La cadena azúcar- fosfato se presenta en la parte exterior por fosfato cargado negativamente, los cuales in vitro se neutralizan usualmente con Na+ y in vivo proteínas positivamente cargadas neutralizan estos grupos, los cuales juegan un papel importante para determinar la organización del ADN en la célula. Las bases se encuentran en la parte anterior, forman los escalones de la escalera en hélice (figura 1.7). Estas bases intervienen en la estabilidad termodinámica de la doble hélice, de dos formas: a). Puentes de hidrogeno entre las bases b). Uniones hidrofóbicas, resultando en intervenciones entre los sistemas de electrones de los pares de bases. Cada par de bases rota 36º alrededor del eje central relativo al siguiente par, por lo que 10 pares de bases dan un giro completo de 360º. El giro completo de una hélice doble con surcos angostos (12 Aº) y surcos amplios (22 Aº), esta es la forma β del ADN. 1.5 REPLICACIÓN SEMICONSERVATIVA DEL ADN Un experimento crucial del material genético es que este debe reproducirse de manera adecuada. Debido a que las fibras de polinucleótidos están unidos

sible que se separen.

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únicamente por puentes de hidrogeno, es po

Figura 1.9 Cada cadena sirve como

ste modo de replicación produce que la cadena doble materna origine dos

replicación es SEMICONSERVATIVA.

templete para la síntesis de la cadena complementaria. Por lo que la estructura del ADN lleva la información necesaria para perpetuar su secuencia.

Ecadenas fijas y cada una con una cadena materna y otra hija nueva, por lo tanto la


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nitrogenadas de las cadenas de ADN y ser cilmente reconocibles en las cadenas, resultado de la replicación, observándose

perimento con 3 generaciones continuas e E. coli. La disrupción es solamente transitoria y localizada en una pequeña zona

igura 1.10. Experimento de M. Meselson y F. Stahl para demostrar la hipótesis e la replicación semiconservativa. Cultivos de E. coli en un medio cuya fuente de

Marcas con isótopo (N15) en las bases fáque en la primera generación se obtienen dos cadenas dobles, con una cadena original y una nueva cada una, en la segunda generación se obtienen cuatro cadenas dobles y dos totalmente nuevas. Menselson y Stahl (1958) realizaron el exdde la cadena doble, por lo que apenas se forme la cadena hija, la cadena original se acopla a ésta, esta región se denomina “horqueta de replicación”, la cual se mueve sobre el templete.

Fdnitrógeno era un isótopo pesado, el N15 que se incorporaba al ADN sintetizado. El cultivo se mantuvo durante varias generaciones para que el N15 formara parte de todo el ADN. Se extrajo a continuación el ADN marcado y se transfirió a un medio con N14. Las incubaron el tiempo suficiente para que se dividieran una sola vez. Se sometió la mezcla aultracentrifugación para distinguir las moléculas que contenían N15 y N14.


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1

GGGGGAG

l y

GG l u

GAl a

GVa l

GCGGGGUG

l y

GA s p

GAl a

GVa l

GGGAAAIAAA

r g

AL y s

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AIleACAAAAUS

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pUUUUAA UA

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UCUUUUUC

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UT y r

USe r

UPhe

U GACU

3*

Segunda base1*

.6 CÓDIGO GENÉTICO: TRIPLETES ebe sintetizarse al menos 20 aminoácidos distintos con la del ADN y debido a que

igo debe de ser de más de una base.

cíficos, mientras que otros aminoácidos ueden ser originados por más de una combinación de tripletes. Solo una de las

= codón

proteína comprende a la ecuencia de aminoácidos de la proteína escrita en dirección N hacia terminación

igura 1.11. Cuadro con el odigo genético “casi

Déste solo posee 4 bases distintas, el cód 42 = 16 combinaciones posibles 43 = 64 combinaciones posibles Por lo que algunos tripletes deben ser espepdos cadenas codifica para proteínas, por lo que el código genético es una secuencia de bases (no de pares de bases ). Tres nucleótidos = 1 aa trinucleótido Leído de 5’ – 3’, los nucleótidos que codifican para unasC. Fcuniversal”. Los cuadros rojos representan los codones que significan alto en el proceso de síntesis. El cuadro verde con la letra I, representa el codón de inicio “universal”.


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El código genético es degenerado: un mismo aminoácido puede estar determinado por más de un triplete o codón. Debido a que existen 64 tripletes distintos y hay

del ARN mensajero es continua, sin interrupciones. Cualquier pérdida o anancia de un sólo ribonucleótido produce a partir de ese punto una modificación

iniciación suele ser AUG que codifica para Formil-Metionina. También ueden actuar como tripletes de iniciación GUG (Val) y UGG (Leu) aunque con

l análisis genético de utantes del fago T4. En 1961 Crick y colaboradores demostraron que el código

ACG ACG ACG ACG

inicio de la lectura y por lo tanto del aminoácido lo ue produce un cambio en la región de lectura. El colorante Acridina puede

uadro 1.1 Excepciones a la universalidad del código en eucariontes ORGANISMO CODÓN SIGNIFICADO EN SIGNIFICADO EN

O

solamente 20 aminoácidos diferentes. Es un código sin superposición o sin solapamientos: dos aminoácidos sucesivos no comparten nucleótidos de sus tripletes. La lectura gde la pauta de lectura, cambiando todos los aminoácidos desde el lugar de la alteración. El triplete depmenor eficacia. Existen tres tripletes sin sentido o de terminación que no codifican para ningún aminoácido: UAA (ocre), UAG (ámbar) y UGA. Las bases generales del código fueron descubiertas por emdebe de leerse en tripletes que no se traslapan a partir de un punto de inicio. Tres posibles maneras de leerse, lo que se conoce como Región de lectura. CGA CGA CGA CGA GAC GAC GAC GAC Una mutación cambian el sitio de qprovocar esta mutación. C

CODIGO CODIGNUCLEAR MITOCONDRIAL

Todos Levadura

hila ovino vino

UGA CUX

GC inicio) inicio)

DrosopHumano, bHumano, boRatón

AGA AGA,AAUA AUU,AUC,AUA

FIN Leu Arg Arg Ile Ile

Trp Thr Ser FIN Met (Met (


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.7 MUTACIONES PUNTUALES CAMBIAN PARES DE BASES SENCILLAS odos los organismos sufren de un cierto número de mutaciones como resultado

ste

mpuestos pueden aumentar la ocurrencia de utaciones, estos compuestos son llamados MUTAGENOS y los cambios

ue cambia nicamente un par de bases simples, se conoce como MUTACIÓN PUNTUAL, la

igura 1.12. Esquem un cambion en una ase, o bien a una adición o a una supresión (corte) de una base.

1Tde las operaciones celulares normales o por interacciones con el ambiente. Etipo es llamado ESPONTÁNEO. El tratamiento con ciertos comprovocados por estos son referidos como MUTACIONES INDUCIDAS. Cualquier par de base del ADN puede ser mutado. Una mutación qúcual se puede deber por: un mal funcionamiento del sistema celular que se encarga de replicar y reparar el ADN. Interferencia química directa con una de las bases en el ADN. F a de una mutación, puede deberse a b


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RANSICIÓN: mutación puntual más común, se presenta por una sustitución de ases del mismo grupo o familia (purina por purina; pirimidina por pirimidina).

e une a Guanina o a Adenina.

RANSVERSIÓN: esta mutación es menos común, se presenta por sustitución de ases de familias distintas. Ejemplo: cuando una base anormal se introduce en la

eneralmente poseen algunas nciones residuales. Luego entonces, se sustituye un aminoácido pero no

igura 1.14. Cuando el colorante naranja de acridina cambia la región de lectura el ambio provoca una alteración completa de la proteínay en la estructura de la

TbEjemplo: conversión química directa de una base a otra Figura 1.13. Ejemplo de una transversión, por sustitución de bases, el bromutoacil s Tbcadena: BrdU (bromouracil) en lugar de T (timina). Las mutaciones por sustituciones de bases, gfunecesariamente cambia la función de la proteína. Fcmolecula de ADN.


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TACIÓN utación espontánea que inactivan la función de un gen en una bacteria ocurre

on una tasa de 10-5 a 10-6 eventos por locus por generación. Se estima que la similar.

cambio de nucleótidos individuales es de 10 por generación. Sin embargo no todas las mutaciones del ADN provocan

DN no cambian los aminoácidos presentes en proteína, o bien el cambio en los aminoácidos no afectan la función de la

UTACIÓN POR GENERACIÓN

1.8 TASAS DE MUMctasa en eucariontes debe ser En un gen bacteriano de 1200 pares de bases, que codifica para 400 aminoácidos la tasa de mutación promedio para un -

-109 a 10cambios observables en el fenotipo. Las mutaciones silenciosas: no tienen un efecto aparente en el fenotipo. Se puede deber a: el cambio de bases en el Alaproteína, por lo que se dice que se presentan substituciones neutrales. Cuadro 1.2 Algunos valores de tasas de mutaciones puntuales en los organismos

ORGANISMO GEN TASA DE M

Bacteriofago Rango de hospederos 2.5 x 10Escherichia coli Zea mays

melanogaster

encia a fagos Factor de color (R)

2.6 x 10

Drosophila

Resist

Color de semillas (Y) Letalidad

-9

2.0 x 10-8

2.9 x 10-4

2.0 x 10-6

-5

de un gen, puede ser reversible por otra mutación llamada MUTACIÓN REVERSA, que posee una probabilidad muy baja de presentarse en el mismo sitio.

1 NUCLEICOS a cadena de ADN es más que una secuencia de bases ordenadas, posee ciertas aracterísticas fisiológicas que son de crucial importancia para su actividad.

doble élice no existe de manera estirada y recta, sino que se enrolla para ocupar un

erente a la configuración beta del ADN. Para que el ADN se plique o se exprese, las bandas de la doble hélice deben separarse.

Mutación directa: afecta la actividad

.9 TOPOLOGÍA DE LOS ÁCIDOSLc El número de pares de bases por cada vuelta en la molécula de ADN no es necesariamente fijo, sino que puede variar según las circunstancias. Lahespacio menor. Ciertas secuencias tienen la propiedad de adoptar una confirmación alterna de doble banda difre Este último punto es de mucha importancia, desde la perspectiva de su función en


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los enlaces ovalentes. Es posible que las bandas se separen y se vuelvan a reponer bajo

uy pequeño de temperatura (85–93ºC) sultando en un cambio amplio de sus propiedades físicas.

de fusión, esta temperatura se ve afectada por la omposición de bases del ADN y las condiciones de desnaturalización. En

, siendo así, más estable que A – T. Mientras ás pares de base G – C en el ADN más E se necesita para separar las bandas.

ADN con 60% G – C (aves) requiere 95ºC en condiciones similares.

e en la Tm.

a desnaturalización del ADN es reversible bajo condiciones apropiadas. Esta ce como

ENATURALIZACIÓN.

ncias son complementarias se aparean formando regiones e hélices dobles.

ecto similar a la cremallera, formando una molécula doble más rga. La renaturalización provoca la restauración de las propiedades originales del

la replicación y expresión como proteína, para lo cual no se rompenccondiciones fisiológicas y a las tasas (rápidas) necesarias para sostener las funciones genéticas. La especificidad del proceso se determina por la complementación de los pares de bases. Este proceso de separación de las bandas es llamado DESNATURALIZACIÓN. Este fenómeno ocurre en un rango mreLa densidad óptica cambia, ya que la absorción de luz del ADN disminuye en un 40 % de lo que se observa en una mezcla de nucleótidos de la misma composición. EFECTO HIPOCRÓMICO HIPOCROMICIDAD: se da por desnaturalización. Tm= es la temperatura ccondiciones fisiológicas 85 – 95ºC. El valor exacto de Tm depende de la proporción de pares de bases G – C ya que estas poseen un triple enlace de Hm Esta relación entre Tm y la composición en pares de bases es lineal. ADN con 40% G – C (mamíferos) requieren 87ºC. La fuerza iónica de la solución tiene también un efecto fuert Lhabilidad de las bandas separadas de ADN se conoR Las hebras simples de ADN entran en contacto con su hebra complementaria por casualidad, si sus secued La región de complementación de pares de bases se extiende a lo largo de la molécula con un eflaADN.


ROSETÓN

CROMOSOMA

CROMATIDAS

DOBLE HÉLICE DE ADN

NUCLEOSOMAS

BUCLE

ESPIRAL DE ROSETONES

SOLENOIDE

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de la molécula de ADN, lo ual le confiere la topología clásica.

uando los ácidos nucleicos provenientes de entes distintas, o bien ADN y RNA.

se relaciona algunos aspectos de su ncionamiento.

Figura 1.15. Grado de empaquetamiento y organizaciónc Esta propiedad de los ácidos nucleicos de complementarse entre bandas sencillas se conoce como HIBRIDACIÓN, cfu El ADN se organiza de tal manera que posee un cierto grado de “arreglo” o “empaquetamiento”. Con el que fu La cromatina (ADN + proteínas) puede ser dividida en dos tipos: Eucromatina: Menos densa que en el cromosoma mitótico su radio de mpaquetamiento es aproximadamente de 1000 – 2000 durante la interfase. e

Heterocromatina: Muy densa » cromosomas en mitosis, durante el ciclo celular no cambian su densidad. En esta forma el ADN no es transcripto. Heterocromatina es iferente a la Eucromatina solo por el grado de condensación. d


Heterocromatina constitutiva: Regiones particulares que nunca son expresadas incluyendo secuencias satélites de ADN

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igura 1.16. Cambio en la topología (a diferentes niveles) de la molécula de ADN, omo respuesta a los procesos celulares. A) Molecula en proceso de replicación, ) Molecula en proceso de transcripción.

.10 AISLAMIENTO DE GENES

)Aislamiento a partir de proteínas

A B

FcB 1 A

noácidos de una proteína, podemos deducir la ecuencia del ADN que la codifica, utilizando el código genético (aunque de

minoácido puede ser codificado por más de

A partir de la secuencia de amismanera imperfecta), pues un mismo aun triplete o codón).


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amente generando una sonda o detector que mediante una ibridización nos permite detectar su secuencia complementaria.

RNm TACCAXTTT(C)CC(X)CTT(G)TACTTA(G) ADNsonda

Cuan las de o

de una sonda con base en la secuencia de un gen de rata para intentar detectar

Figura 1.17 teriano empleando

Se sintetiza una cadena de oligonucleotidos con la aproximación de la secuencia y se marca radiactivh Ejemplo: Met-Val-Lys-Gly-Glu-Met-Asn Proteína

AUGGUXAAA(G)GGXGAA(G)AUGAAU(C) A

do se emplea una sonda, se puede analizar el contenido de las células colonias derivadas de una genoteca, las aplicaciones pueden ser: el diseñ

el gen en humano.

. Esquema del proceso de aislamiento de un gen bacuna sonda marcada con isotopos radiactivos.


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B) Aislamiento de genes utilizando anticuerpos En ocasiones las proteínas cuyo gen correspondiente queremos aislar no se pueden purificar en gran cantidad y los métodos para determinar la secuencia de aminoácidos de una proteína son bastante laboriosos. El sistema inmunológico nos

lecular para localizar genes.

n imal, inducen en éste la producción de anticuerpos. Estas moléculas son, a su

suero sanguíneo del conejo odemos obtener anticuerpos dirigidos contra dicha proteína. Estos anticuerpos, se

permite utilizar otro fenómeno de reconocimiento mo Desde hace muchos años, los investigadores del campo de la inmunología han utilizado animales de laboratorio para obtener anticuerpos específicos contra sustancias de interés. Las proteínas, en particular; cuando son extrañas a uanvez, proteínas con características muy interesantes. Los anticuerpos pueden ser usados como reactivos que reconocen, en medio de mezclas complejas, las sustancias específicas que indujeron su producción. Si se inyecta una proteína en un conejo, a partir del pusan de manera análoga a como se usaron los oligonucleótidos o sonda de ADN, para detectar las clonas que contengan el gen que codifica para la proteína de interés lo que se conoce también como "inmunobúsqueda“o “inmunodetección”. C) Aislamiento de genes utilizando sus ARN mensajeros A finales de los años setenta, los trabajos pioneros de Phillip Sharp y Richard

oberts sorprendieron a la comunidad científica con un asombroso descubrimiento: trasncriptasa reversa.

nscripción acelerada). Por ejemplo: si se purifica ARN mensajero del oviducto de gallina, la mayor parte de esta preparación estará

(codificada en la ecuencia) esta en la molécula de ARN. Lo que se requiere es una enzima que

Rla

En los tejidos que presentan una abundante cantidad de una proteína específica, por lo general poseen abundantes copias del gene en forma de ARN mensajero (como resultado de la tra

constituida por el mensajero que codifica para la ovoalbúmina. Se hace necesario utilizar un procedimiento que convierta la información de ARN a ADN. Es decir, que copie una hebra de ARN y la "transcriba", de manera reversa hacia ADN. Esto es, en principio, posible: la informaciónsrealice la copia, pero que acepte como molde al ARN, y nucleótidos para incorporar a los del ADN. Tal enzima existe en la naturaleza: en los retrovirus. Usando una preparación que contenga esta enzima, la transcriptasa reversa, sobre el ARN, se obtiene el llamado ADNc, o ADN complementario. El ADNc puede ser clonado igual que cualquier otro ADN.


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igura ación de ADNc a artir de una molecula de ARN.

F 1.18. Esquema que representa la reacción de amplificp


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UNIDAD 2

PERPETUACION Y EMPAQUETAMIENTO DEL ADN

2.1 PERPETUACIÓN DEL ADN 2.1.1 RReplicación

ión posterior. Cuando se inicia la ocurre hasta que ésta halla finalizado. Puede

ontrolarse en la iniciación, una vez que esto ocurre se replica todo lo comprendido de replicación es regulada por ciertas

n eucariontes: El genoma se encuentra organizado en un gran número de

ía misma del ADN. Las proteínas que prevén estas ctividades enzimáticas no funcionan de modo independiente, y son contenidos en na estructura multiprotéica.

zimas capaces de sintetizar nuevas hebras de ADN a artir de un templete. Una enzima posee la función de replicación las otras poseen

oxirribonucleótidos, todas las nzimas requieren de una cadena previamente iniciada por lo que un paso

eplicón: unidad de replicación : La replicación del ADN es necesaria para perpetuar la información

genética y prepara a la célula para una divisreplicación, la división celular centre origen y termino, la frecuencia proteínas. La replicación puede ser Unidireccional o bidireccional, formando un ojo que crece hasta que se replique el replicón entero. En moléculas de ADN circular, por lo general, se forma una estructura en forma de letra griega teta (θ). Replicón: El material genético está organizado en unidades denamonidas replicones, las cuales se confromoan de un sitio de Origen y un sitio de término, toda la secuencia de ADN que se encuentre entre estos puntos será replicado una vez que comience el proceso. En procarióntes: Todo el genoma se encuentra organizado en un solo replicón, si poseen plásmido, éstos no son considerados como parte del genoma y cada uno representa un replicón autónomo. Cada fágo o virus de ADN constituye un replicón. Ereplicones. Cada replicón se activa una sola vez por ciclo celular, aunque no lo hacen simultáneamente. 2.1.2 Horquilla de replicación Todas las actividades de replicación son reguladas por un conglomerado de enzímas y por la topologau Replisoma: Es un conjunto de enzimas y proteínas, que se ensamblan en una sola unidad antes de la replicación, esta compuesto de: ADN Polimerasa: Que son enpvarios subsidiarios en la replicación o participa en la reparación del ADN. Ninguna ADN polimerasa puede iniciar una cadena de deeesencial, es la presencia de una actividad "primaria" para comenzar la cadena de


ADN. Esta actividad involucra la síntesis de una secuencia corta de ribonucleótidos que luego es removido PRIMER (primario). Creación de la horquilla de replicación en el origen Se requiere dos tipos de funciones para convertir una cadena doble de ADN a una cadena sencilla. I

sando la hidrólisis de ATP para roveer la energía necesaria.

de unión a hebras.sencillas se une a la hebra sencilla del ADN reviniendo la formación del estado doble.

iento se mueve sobre el ADN lo que marca la eneración de la orquilla de replicaciòn, que continúa moviéndose durante la

I) El primer nucleótido de la cadena nueva debe ser sintetizado en el “primer”, esta

ocurren unicamente en el origen, y otros al inicio de cada fragmento e Okazaki durante la elongación.

) Una enzima Helicasa separa las hebras de ADN up II) Una proteína p III) Un punto de desenrrollamgelongación. Vacción es requerida una vez en la hebra lider pero es repetida al inicio de cada fragmento de Okasaki en la hebra convicta. Algunos eventos que se requieren para la iniciaciòn d

23


F

24

igura 2.1 Esquema de la horquilla de replicación de un eucariota.

n Eucariontes E : Existen cinco clases de ADN polimerasas con diferentes

nciones, como se preenta en el siguiente cuadro 2.1.

replicación del ADN mitocondrial. Se replica de una

pero cada cadena de ADN osee su propio origen de

peucariontes. α(1) δ (II) ε(I

fu

2.2 Esquema de la

manera particular, ya que es circular, preplicación, pero no se encunatra situado en sitios cercanos. El origen (OL) se encuentra en la cadena de ADN “externa”, y el origen (OH) en la cadena “interna”, por lo que el inicio de la replicación acontece a tiempos diferentes en cada una, dirigida por la ADN polimerasa γ .

roceso de replicación del ADN en

II) β γ

Cuadro 2.1 Enzimas que intervienen en el

Localización Función

Síntesis de

Síntesis de

Reparación

Reparación

Replicación

Sub-unidades

xonucleasa ´- 5´

Núcleo

hebra cautiva ing

Desconocida

Núcleo

hebra lider

Desconocidequiere CNA

Núcleo

atalitico .Sin nción

onocida

Núcleo

atalítico

o

Mitocondria

atalítico .Sin nción

onocida

Actividad E3

y prim I)Núcleo catalítico 2)PrimasasI) No

I) Núcleo catalitico I)RP Si

I) Núcleoc1fuc Si

1.Núcleo c N

1.Núcleo c1fuc Si

En procariontes: Las enzimas poseen actividad exonucleolítica que procede en irección reversa, 3'-5', a partir de la síntesis de ADN ejecuta una función d


ostsintética de prueba de lectura.

sa I ADN polimerasa II ADN polimerasa III

p Cuadro 2.2 Enzimas implicadas en la relicación del material genético de procariotas. ADN polimeraFunción principal Elongación

Reparación Replicación

Número/célula 400 Desconocido 10-20

Actividad 3’-5’

xonucleasa 5’-3’ 3’-5’ 3’-5’ enzimática

Elongación5’-3’ ExonucleasaE

Elongación5’-3’ Exonucleasa

Elongación5’-3’ Exonucleasa

Subunidades 1) Fragmento da)

equeño (35,000

mueve 10 pares,

α, sintetiza ADN

γ, Factor II ε, Exonucleasa 3’-

Klenow (68,000 2) Fragmentopda) actividad de exonucleasa 5'-3' reinicia la replicación en un corte, "Nick Traslatión”

β, sintetiza ADN δ, Factor I

5’

Locus Pol B N, dna x , dna q, dna t.

Pol A dna E (Pol C), dna

igura 2.3 Horquilla de replicación donde se muestran los componentes que tervienen en el proceso de incio de la replicación en procariotas.

Fin

25


26

.1.3 Mecanismo de replicación: eucariotas, procariotas y virus

eplicación en procariotas

2 R

eucariontes, su ucen muchas

orquillas de replicación al mismo tiempo, y que se conocen menos las proteínas s que en procariontes.

Desenrrollamiento y apertura de la doble hélice

El proceso de replicación en procariontes y eucariontes es similar, las diferencias entre uno y otro son el mayor tamaño del material genético enempaquetamiento con histonas, que en los eucariontes se prodhque intervienen en eucarionteAl igual que en eucariontes, los procariontes replican su DNA de forma continua en la hebra 5' - 3' (conductora) y de forma discontinua en la hebra 3' - 5' (retardada).El DNA en las bacterias suele ser circular y su replicación ocurre en tres etapas, empezando por un único punto: 1. Desenrollamiento y apertura de la doble hélice 2. Síntesis de dos nuevas hebras de ADN 3. Corrección de errores

. Intervienen un grupo de enzimas y proteínas, a cuyo co licasas que facilitan en

e A y asas que eliminan la tensión enerada por la torsión en el desenrrollamiento y actúan las proteínas SSB que se

u

njunto se denomina replisoma. Primero intervienen las hee es un lugar con gran contenido desenrrollamiento en el punto ORI o de orígen qu

irasas y topoisomerd T. Después actúan las ggnen a las hebras molde para que no vuelva a enrollarse.

Síntesis de dos nuevas hebras de ADN. Actúan las ADN polimerasas para sintetizar las nuevas hebras en sentido 5´-3´, ya que la lectura se hace en el sentido 3´-5´. Intervienen las ADN polimerasas I y III, que se encargan de la replicación y corrección de errores. a que lleva la mayor parte del trabajo es la ADN polimerasa III. ActúaL la ADN polimerasa II,

s tarde se unen. A

a copia como si eran ADN, entre los fragmentos de Okazaki, hasta que se alcanza el RNA

ragmentos de Okazaki, cada uno e unos 1000-2000 nucleótidos(en eucariotes es de 100-200). Hace falta un RNA

cebador por cada fragmento de Okazaki.

corrigiendo daños causados por agentes físicos.La cadena 3´-5és leída por la ADN polimerasa III sin ningún tipo de problemas (cadena conductora). La cadena 5´-3´ no puede ser leída directamente, esto se soluciona leyendo pequeños fragmentofragmentos de Okazaki) que crecen en el sentido 5´-3ý que más(

esta hebra se le llama retardada porque su síntesis es más lenta. La ADN polimerasa III es incapaz de iniciar la síntesis por sí sola, para esto necesita un cebador (ARN) que es sintetizado por una ARN polimerasa (primasa). Este cebador es eliminado posteriormente. La ARN primasa, va sintetizando a intervalos los ARN cebadores que van siendo incorporados a lfucebador del fragmento de Okazaki ya terminado. La ARN primasa se une directamente a la ADN helicasa, formando un complejo llamada primosoma, que se va desplazando con la cadena en formación. Conforme van existiendo fragmentos de cadena abiertos de suficiente longitud, se va sintetizando la cadena discontinua formando los Fd


Corrección de errrores. La enzima principal en esta fase es la ADN polimerasa I, que corrige todos los errores cometidos en la replicación o duplicación. También intervienen otros enzimas como: endonucleasas que cortan el segmento erróneo; ADN polimerasa II que rellenan correctamente el hueco y ADN ligasas que unen los extremos corregidos. La labor de la ADN polimerasa I es de exonucleasa, puede poner bases como sacar bases, con esto puede reparar la hebra. El dominio de esta proteína encargado de incluir bases a la hebra se llama Fragmento Klenow. En E. coli la replicación e

27

s bidireccional y se inicia a partir de un solo origen, que s conocido como Ori C: Sitio en la molécula de ADN en el que se Inicia el ciclo de

l origen de la replicación contiene muchos sitios de unión de las proteínas, PBS

o la molécula de ADN que se replica es circular, y la

mino provoca el cese de movimiento, debido que en esta zona se adhieren unas proteínas que

igura 2.4 Replicación bidireccional del genoma circular de E. coli. La horquilla se ueve a una velocidad de 500 nucleótidos por segundo, la hélice debe rotar a 50 voluciones por segundo

ereplicación, en este sitio se controla la frecuencia de los eventos de iniciación, este debe segregarse a los cromosomas replicados que se dirigen hacia las células hijas. E(por sus siglas en inglés), que son secuencias relativamente cortas de ADN y que funcionan como un sitio de anclaje para proteínas que regulan el proceso de replicacón. Cuandreplicación es bidireccional, los dos ejes de replicación se mueven alrededor del genoma hasta el punto de encuentro, el cual por lo general no se ubica en medio, la región de teradetienen el avance de la horquilla de replicación y por lo tanto el proceso. Fmre


28

as bacterias por lo general poseen dos puntos de unión entre la replicación y el recimiento celular. La frecuencia de iniciación de los ciclos de replicación se ajusta ara coincidir y dirigir la tasa de crecimiento celular y por lo tanto la

entre la replicación completa y la división celular, es de proximadamente 20 min. En este perído se da el ensamblamiénto de los

Lcpcomplementación del ciclo de replicación se conecta con la división de la célula. En términos de: C = Replicación del genoma bacteriano entero. El proceso tarda aproximadamente 40 minutos, el movimiento de la horquilla de replicación se da a 50,000 pb por minuto, esta velocidad es no variable a temperatura constante. D = Periodo acomponentes necesarios para la división. Replicación en virus Aeucariotas y procariotas (incluyendo en éstos a los virus), se describe en este apartado el modo de replicación de los los virus que poseen su material genético en forma circular. En el cuadro 2.1 se pr

unque, el proceso de replicación, como ya se menciono, es similar para

esentan los diferentes tipos de material enético que poseen los virus, asi como la forma de su arreglo (cadena simple,

ndonucleasa hace un corte en la cadena positiva (+). (c) La ADN polimerasa ñade nucleótidos en el extremo 3’ de la cadena abierta, de manera que produce esplazamiento del extremo 5’. (d) El desplazamiento del extremo 5’ se hace más xtenso en la medida que la enzima polimerasa recorre el templado de ADN ircular (cadena negativa). El resultado es la formación de un ADN con longitud

gcircular, etc.). Figura 2.5 Mecanismo de replicación del círculo rodante. (a) ADN circular. (b) Una eadecmayor a la normal. Ejemplo: fago l el fago ØXI74.


29

todo el ciclo celular, y cuando la oncentración aumenta se dispara la iniciación. Esta es la hipótesis mas aceptada n términos de que la síntesis proteica es necesaria para disparar la iniciación. El

élulas

iferentes ciclinas en la fase

1. En levaduras, el tamaño de la célula regula la velocidad a la cual se dará el esta estrategia sea usada por otras células.

de

ualquier segmento de ADN con un origen puede replicarse, a estas regiones se le conoce como

a velocidad de replicación ADN en células de mamíferos es de 50 nucleótidos por segundo. El

¿Cómo se regula el inicio de la replicación en procariotas? Una proteína iniciadora puede sintetizarse durantecegen FtsZ juega un papel importante, una mutación en este gen provoca cmúltinucleadas con filamentos. Este gen es el blanco de otra proteína (Sol A) que bloquea la división celular bajo ciertas condiciones. Una sobreexpresión de este gen FtsZ provoca e induce mini-células, que carecen de ADN y son morfológicamente normales. Por lo tanto la expresión del gen FtsZ determina la frecuencia de la división, actuando como una proteína iniciadora. Otra hipótesis relaciona una proteína inhibidora que puede sintetizarse a una velocidad fija, cuando el volumen celular aumenta, esta se diluye y permite la iniciación. Replicación en Eucariotas a síntesis de ADN está ligada con el ciclo celular, el inicio de la replicación y su L

coordinación con el ciclo celular parecen estar regulados por acciones deacelerado y frenado controladas por la producción de dGinicio de la replicación, quizás La células que inician G1 siendo anormalmente pequeñas tardarán mas en llegar al punto de inicio mientras que células anormalmente grandes llegarán a esta etapa más pronto. Los mecanismos por los cuales los factores ambientales regulan el inicio se relacionan con el efecto que una disminución de nutrimentos tiene sobre la tasa de producción de ciclinas, las cuales reducen su concentración en las células y por lo tanto la concentración no es la suficiente para disparar la explosión

uinasa (Ver figura 2.6) q La síntesis de ADN se lleva al cabo en la fase S del ciclo celular, por lo tanto las células en G2 son células con una contenido de ADN tetraploide. La mitosis reduce a un número diplóide de ADN en cada célula hija. En los eucariotes, cada replicón se activa en un momento específico durante el período S. Puede existir una replicación bidireccional y cuando la horquilla de replicación llega al punto de término se detiene la replicación. Csecuencias de replicación autónoma, ARS (por sus siglas en inglés), conformada por una zona con secuencia consenso de nucleótidos, que está formada por lo general de 11 pb y rodeada de una región de ADN rica en los nucleótidos Adenina y Timina. Cada cadena o zona de ADN que se replique necesita de su propia secuencia de origen. Lproceso esta regulado por proteínas que actúan rápido y sincronizadamente. El complejo multienzimático que lleva al cabo este proceso constituye una elaborada “maquina de replicación”.


30

irus con ARN ARN de cadena sencilla. Ej. TMV y Poliovirus. Cuadro 2.3 Tipos de genomas virales. V

ARN de cadena doble. Ej. Reovirus.

Virus con ADN

ADN de cadena sencilla Ej. Parvovirus.

ADN circular sencillo. Ej. M13 y bacteriófago ÆX174.

ADN de cadena doble. Ej. Bacteriófago t4 y herpesvirus.

ADN circular de cadena doble. Ej. SV40 y polyoma.

ADN de cadena doble co terminaciones asociadas a proteínas n covalentemente. Ej. Adenovirus.

ADN de cadena doble con terminaciones covalentesEj. Poxvirus.

selladas.

Ciclina

Quinad

Ciclina it ti

Factor promotor


F

31

ORIGEN

ORIGEN

Crecimiento

Crecimiento

igura 2.6 Control de la replicación-ciclo celular. Esquema de las variación de las ctividades de las ciclinas dependientes de quinasasa (cdc) a lo largo del ciclo elular en una célula de mamífero. Diferentes ciclinas y diferentes quinasas, ueden unirse para formar los diferentes complejos, incrementando las opciones e combinaciones posibles de los complejos de ciclinas dependientes de quinasas ue se forman en el transcurso de un ciclo celular.

igura 2.7 Esquema del proceso de replicación bidireccio

ada uno de los cuales comienza la replicación a diferente tiempo, pero se replican olo una vez por ciclo celular. La horquilla de replicación se mueve en una o en dos irecciones hasta llegar al sitio de termino de cada replicón.

acpdq F nal.

Inicio de la replicación

ADN de nueva síntesis

Horquilla modirección co

viéndose en ntraria

Figura 2.8 El genoma de los eucariontes está organizado en muchos replicones, csd


32

íntesis semidiscontinua del ADN

´-3´ esto se resuelve intetizando la hebra que crece de 3´-5´ en una serie de fragmentos cortos, cada

tizados de 5´-3´.

a iniciación de la síntesis es acompañada por un complejo proteico llamado

e varias formas:

final OH pueda ser usado por retrovirus para iniciar una transcripción reversa de

por el duplex de ADN, el mecanismo mas común s la introducción de un corte como el usado en la iniciación de la replicación del

) Una proteína inicia la reacción directamente por la presentación de un nucleótido

S La estructura antiparalela del ADN posee un problema en la replicación, la orquilla de replicación se mueve en dirección 5´-3´ en una hebra y 3´-5´ en la otra, y los ácidos nucleicos son sintetizados unicamente en dirección 5suno de los cuales realmente son sinte La hebra que se sintetiza de 5´-3´ se conoce como hebra lider, la otra es la hebra convicta o cautiva, cada segmento es sintetizado en una dirección contraria al movimiento de la horquilla, los fragmentos sin embargo se sintetizan de 5´-3ý luego son unidos conformando una replicación discontinua. LPrimosoma en E. coli. Las ADN polimerasas de Procariotas y Eucariotas no pueden iniciar la síntesis de una cadena de ADN a partir de nucleótidos libres. Se requiere de un "primer" (primario) para proveer de un final libre 3´-OH que pueda elongarse por la adición de nuevos nucleótidos, esto se da d a) Una secuencia de ARN es sintetizada en el templete, por lo que la cadena de ARN se extiende por la ADN polimerasa. Comunmente usado en la replicación del ADN celular y por algunos virus. b) Unos pares de bases de ARN preformado con el templete, permite que su3ÁRN. c) Un termino inicial es generadoecirculo rodante, en este caso la hebra preexistente es desplazada por una nueva hebra sintetizada (diferente de “Nick Translation” en la cual la hebra es degradada). dpara la ADN polimerasa. Esta forma es utilizada por ciertos virus.


33

squema de la derecha la formación del fragmento de Okazaki en la hebra cautiva.

Cómo se regula la iniciación de la replicación? ) Metilación: la replicación ocurre unicamente en un origen metilado, lo cual ucede en la secuencia palíndroma: GATC/CTAG, y se metìla la posición N6 de la

Amet TC - MaternaCTAG-NuevaGATC– NuevaCTAmetMaterna

jo de iniciación de la replicación no reconoce el origen.

ón se ha iniciado, s orígenes de las nuevas cadenas formadas se unen a la membrana previniendo

directa por que los rígenes han sido ocupados o bien de manera directa por que algunos

Figura 2.9 Esquema del avance de una horquilla de replicación, se observa en el e ¿Asadenina por una enzima llamada DAM Metilasa. GAmetT CCT Amet G La replicación sintetiza cadenas dobles hemimetiladas de ADN: G Por lo tanto el comple B) Asociación a la membrana: después que el ciclo de replicaciloque se repliquen de nuevo, lo cual puede ser de manera inocomponentes de la membrana inhiben la reacción.


34

su modo de acción.

.- Mutágenos químicos e conocen varios productos químicos que son mutagénicos, clasificándose según su modo de

2.1.4 Mutaciones: mutágenos Existen una gran variedad de agentes físicos y químicos que pueden inducir mutaciones. A continuación se presentan algunos de los principales grupos y 1Sacción en: Análogos de bases: Debido a su similitud estructural los análogos de bases como el 5-Bromo la 2-Aminopurina se incorporan en el ADN que se replica en lugar de las bases co

ouracilo rrespondientes

mina y adenina. Cuando uno de estos análogos de bases se incorpora en el ADN, la replicación ue ocasionalmente ocurren errores de lectura que resultan en la

e guanina (la timina se aparea con adenina) ocasionando la transición de AT a GC (la parea con citosina). La 2-Aminopurina puede aparearse con citosina ocasionando la

iguolécula de 5-Bromouracilo

gentes que reaccionan con el DNA: Existen una serie de agentes uímicos que reaccionan directamente sobre el ADN que no se está eplicando ocasionando cambios químicos en las bases lo que provoca

citosina se aparea con adenina produciéndose transiciones C ----> AT.

tipuede ocurrir normalmente aunqincorporación de bases erróneas en la copia de ADN. Así por ejemplo, el 5-Bromouracilo se puedaparear con

uanina se agtransición de AT a GC.

F ra 2.10 Esquema que representa la sustitución de las bases normales por una m

Aqrun apareamiento incorrecto. Acido nitroso (HNO2), desamina la adenina a hipoxantina y la citosina a uracilo. Debido a las distintas propiedades de apareamiento de los productos de desaminación (hipoxantina aparea con citosina; uracilo con adenina) se producen transiciones AT---->GC y/o GC---->AT. Hidroxilamina (NH2OH), reacciona con la citosina donde el grupo amino es reemplazado por un grupo hidroxilamino. Este derivado de la G Agentes alquilantes: Grupo de productos químicos que afectan al ADN que no sereplica. Junto con la luz ultravioleta son los sistemas mutagénicos

más potentes

nte

oxi butano (DEB), N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), N-metil-N-itroso urea y gas mostaza.

para aplicaciones prácticas. Los compuestos utilizados más frecuentemeincluyen el etil metano sulfonato (EMS), metil metano sulfonato (MMS), dietil sulfato (DES), diepn


35

ando la transición GC ----> AT.

igurlquilante etil metano sulfonato (EMS)

l N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), cancerígeno, es uno de los utágenos químicos más efectivos. Se obtienen, en condiciones óptimas, un gran

todavía. gentes intercalantes

La mutagénesis con agentes alquilantes se produce a través de varias vías ya que originan la formación de un espectro completo de bases alquiladas en el ADN lo que origina transiciones y delecciones. El etil metano sulfonato (EMS) introduce un metilo en la guanina que ya no se aparea con la citosina provoc F a 2.11 Esquema de una mutación de la Guanina provocada por el agente a Emnúmero de mutantes con una tasa de muerte baja. El mecanismo molecular exacto de la reacción de la NTG no se conoce A : Un grupo interesante de sustancias como las acridinas y romuro de etidio, son moléculas planas que se insertan entre dos pares de bases

igur

bdel ADN, separándolas entre sí. Durante la replicación, esta conformación anormal puede conducir a microinserciones o microdelecciones en el DNA, originando mutaciones por corrimiento de lectura. Aunque las acridinas son útiles en investigación, no son muy adecuadas para el aislamiento rutinario de mutantes durante el desarrollo de cepas ya que tienen poco o ningún efecto mutagénico en bacterias. F a 2.12 Esquema del modo de acción del agente intercalante Acridina.


36

.- Mutágenos físicos

uz ultravioleta: Uno de los agentes mutagénicos más efectivos es la adiación ultravioleta de longitud de onda corta. La longitud de onda

0 nm nm que es la absorción máxima del ADN. La

adiación a longitudes de onda entre 300 y 400 nm tiene menos efectos

-)

de un enzima de fotorreactivación que corta los dímeros de timina. En resencia de luz, el enzima corta los dímeros originando pirimidinas monoméricas.

igu rovocada por la radiación UV.

adiación ionizante: La radiación ionizante es una forma de radiación ás potente e incluye rayos de longitud de onda corta como los rayos

ias; produciéndose indirectamente efectos utagénicos debido a esta ionización.

2

Lrefectiva para la mutagénesis está comprendida entre los 200 y 30con un óptimo a 254 rletales y mutagénicos que la luz UV de longitud de onda corta. Los productos más importantes de la acción de la luz UV son dímeros (timinatimina; timina-citosina; citosina-citosina) que se forman entre pirimidinas (T, Cadyacentes, lo que incrementa enormemente la probabilidad de que durante lareplicación del ADN, la ADN polimerasa inserte un nucleótido incorrecto en talposición. La radiación UV es muy útil en el aislamiento de mutantes de cultivos bacterianos. Cuando las poblaciones irradiadas con luz UV son expuestas subsecuentemente a la luz visible de una longitud de onda de 300 a 450 nm, la velocidad de supervivencia aumenta y la frecuencia de mutación desciende. Esto se debe a la activaciónp F ra 2.13 Esquema que representa la formación de dimeros de Timinap

RmX, rayos cósmicos y rayos gamma. Esta radiación causa la ionización del agua y de otras sustancm


37

bajas dosis de radiación ionizante sólo ocurren unos cuantos impactos sobre el rte

igur bserva que la radiación ionizante es de longitudes de onda muy pequeñas. .1.5 Sistema de protección del ADN espués de su incorporación, las bases se metilan para marcar segmentos de DN. Tanto procariotas como eucariotas contienen enzímas que metílan el ADN

N de nueva replicación, por la adenina (involucrando el control de replicación y marcaje de ADN

Entre las especies químicas formadas por la radiación ionizante se encuentran radicales libres, siendo el más importante el radical hidroxilo (OH-). Los radicales libres reaccionan con el ADN, y lo inactivan produciendo rupturas que dan lugar a cambios estructurales importantes como son las mutaciones cromosomales. AADN, pero a mayores dosis ocurren impactos múltiples que conducen a la muede la célula. Al contrario que la radiación UV, la radiación ionizante penetrafácilmente el vidrio y otros materiales Fo

a 2.14 Diferentes tipos de radiacción que se presentan en la naturaleza, se

2DAaunque sus funciones de metilación son diferentes. Procariotas E. coli posee pequeñas cantidades de 6-metil-adenina y 5-metil-citosina en su ADN, estas bases se generan por acción de tres metilasas. a) Sistema hsd: que confiere especificidad del hospedero metilándo la adenina. b) Sistema dam: que distingue las hebras de ADmetilación depara su reparación). c) Sistema dcm: que metíla citosina, su función es desconocida. Las bacterias que poseen mutaciones en los tres sistemas carecen de bases metiladas y siguen siendo viables, por lo que la metilación no es un evento escencial.


38

a metilación en este grupo tiene distinta función, es distinguir genes en las iferentes condiciones funcionales. Los daños al ADN pueden ser minimizados por n sistema de contención del daño, que reconoce la presencia de un cambio y lo ctifica. Los sistemas de reparación son similares a los complejos de replicación,

de su importancia en la sobrevivencia de la célula.

sual estructura de oble hélice, los cambios se pueden dividir en dos grupos.

.1.6 Reparación del ADN: pre y postreplicativa

EucariotasLdureun indicativo La tasa de mutación refleja un balance entre el número de eventos dañinos que ocurren en el ADN y el número que ha sido corregido (o mal corregido). Un daño al ADN consiste en cualquier cambio que desvíe la ud 2

Mecanismos de reparación A) Eliminación directa del daño

Fotorreactivación• ntre dos pirimidinas adyacentes

(normalmente dímeros de timina). La fotoliasa, mediante el proceso de endiente de luz, revierte la primera reacción y deshace

La luz ultravioleta induce la formación de dímeros e

fotorreactivación, que es depel dímero. • Alquiltransferasas Ciertos mutágenos (nitrosoguanidina, etilmetanosulfonato) añaden grupos alquilos en la posición O-6 de las guaninas. Las alquiltransferasas eliminan esos grupos alquilos. B) Sistemas de reparación dependientes de homología

te y relleno• Reparación por cor

(12-13 nucleótidos en procariotas, 27-29 en eucariotas). El hueco se li intervienen los genes

er en ese sitio.Esto inicia un proceso de reparación por escisión mediado or una exonucleasa, la ADN polimerasa I y la ligasa de ADN.

s. Los dímeros de irimidinas resultan de una reacción inducida por la luz, y las fotoliasas usan

Sistema general: El sistema reconoce una base anormal. Rompe puentes fosfodiéster a una distancia de varias bases a ambos lados de la lesión. Elimina el fragmentorellena con ADN polimerasa I y se sella con ligasa. En E. couvrABC. Sistema específico: Una ADN glucosilasa libera la base dañada al romper un puente N-glucosídico (base-azúcar). Esto da lugar a un sitio apurínico o apirimidínico (AP). Una AP endonucleasa reconoce el sitio AP y rompe un puente fosfodiéstp C) Sistema de reparación directa Varios tipos de daños son reparados sin la remoción de bases. El ejemplo mas estudiado es la fotoreactivación directa de los dímeros de pirimidina ciclobutano, que es una a reacción promovida por la ADN Fotoliasap


39

ida para revertir este daño. Las Fotoliasas

igura 2.15

) Reparación de emparejamientos erróneos l sistema reconoce dos bases mal emparejadas tras la replicación. MutS es la roteína encargada en E. coli. Determina qué base es la incorrecta, la base

dena vieja se distingue porque está metilada en las adeninas que se encuentran dentro de las

es postrreplicativa y la lleva a cabo la

a, llevando a cabo la síntesis reparadora. Una exonucleasa elimina n trozo de la cadena nueva desde el sitio GATC hasta más allá del

energía derivada de la luz absorbgeneralmente contienen dos cofactores que sirven como agentes absorbentes de luz o cromoforos. Uno de los cromoforos es siempre FADH2. El otro es un folato en E. coli y levadura. F Esquema de reparación directa de un dimero de pirimidina.

DEpincorrecta es la que se encuentra en la cadena recién sintetizada. La ca

secuencias 5'-GATC-3'. Esta metilaciónmetilasa Dam. La cadena nueva tarda de 1 a 2 minutos en re-metilarse tras la replicación. MutL y MutH forman un complejo con MutS. MutH es un endonucleasa que corta la cadena nueva en el sitio GATC más cercano al emparejamiento erróneo y escinde la base incorrectuemparejamiento erróneo. Proteínas de unión a ADN de cadena simple protegen el hueco. La ADN polimerasa III rellena el hueco y la ligasa lo sella.


40

igura 2.16 Esquema del proceso de etilación de las adeninas en la

adena de ADN recién sintetizada, este

El regulón SOS de E. coli eplicación del ADN está bloqueada por

na lesión y la reparación no es posible por uno de los sistemas antes

sto atrae a las proteínas de unión a cadena simple (SSB) y a RecA.

UmuC

ión. El sist

paración propenso a error.

REPLICACIÓN

Hebra vieja metilada y hebra nueva NO metilada

Las adeninas de la hebra nueva se metila por medio de la Dam metilasa

Fmcproceso es necesario para que el sistema de reparación de bases malparedas reconozca la hebra materna o vieja.

E) Reparación sin hebra molde:Sólo se induce en situaciones en que la rumencionados. Etapas:

1.La ADN polimerasa III se detiene ante una lesión, lo que genera ADN de cadena simple.

2.E3. La presencia de filamentos de RecA es una señal para que la célula

sintetice UmuD y4. RecA corta UmuD para dar lugar a UmuD‘. 5. El complejo UmuD' / UmuC permite que la polimerización de ADN

continúe a pesar de la les

ema SOS permite continuar la replicación pero introduciendo nucleótidos al azar. Este es un sistema de re


Cuadro 2.4 Genes inducidos por el sistema SOS

41

IENTO DEL ADN

enoma bacteriano tra organizado en cuerpos definidos, aunque si

morfológicamente distintas como en eucariontes. El genoma

íde as de un juego de genomas en ADN. En la división el material se separa en dos

2.2 EMPAQUETAM 2.2.1 Genomas y cromosomas GEl genoma bacteriano se encuenbien no en estructuraspuede verse como un conglomerado que ocupa cerca del 35% del volumen de la célula . El material genético se condensa en un área conocida como nucleoide. Las bacterias que han replicado parcialmente su ADN presentan en el nucleomnucleoídes los cuales se particionan entre las células hijas, la segregación involucra la adhesión del genoma bacteriano a la membrana interna. Mecanismo similar al de los cromosomas de eucariontes. Un locus específico es conectado a un sitio en la membrana.

FUNCIÓN DESCONOCIDA

dinB inDd

dinF

PARTICIPACIÓN EN REPARACIÓN POCO CLARA Proteínas SSB. Codifica para Helicasa II.

unidad de factor de integración a hospedero. reparación por recombinación.

Codifica para subProteína involucrada en la

sbvrD

s uhimArecN

Codifica para proteínas que detienen la división celular.

ión por rueba y por recombinación.

Codifica para la proteína RecA involucrada en la reparacp

SulA RecA

Codifica para la ADN polimerasa II, inv

olucrada en reparar.

odifican para proteínas involucradas en la reparación por prueba y rror.

Codifican para la ABC exinucleasa. Ce

PuvrA

muD

Papel el el sistema de reparación po

olB (din A)

uvrB uvrC umuCu

r SOS Nombre del gen


42

E.coli las fibras de ADN se liberan en forma de rizos nidos a la envoltura rota los rizos condensan al ADN gracias a unas proteinas,

enoma viral on respecto al empaquetamiento del genoma, existen diferencias entre el genoma

. El genoma viral se ve restringido por dos aspectos: a) la cantidad

cápsula se pueden encontrar otras

ntenga el ácido nucleico? . La cubierta proteica puede ensamblarse alrededor del ácido nucleico,

urante el

valentes en eucariotas

Si se rompe una bacteriaumuchas proteinas de union con el ADN han sido aisladas de E.coli. Cuadro 2.5 Proteínas de unión al ADN en E. coli Proteína Composición Número por célula Equi

Hu

1

des 9000 d

000

bunidad de 1500 d

nocido

H H1 HLP P

α y β subunida

2 sbunidades idénticas 28d Su Monomero de 17000 d Subunidad de 3000 d

40,000 dimeros

30,000 dimeros 10,000 copias 20,000 copias desconocido

H2B H2A Desco Desconocido protaminas

GCviral y el celularde ácido nucleico está predeterminada por el genoma y b) el ácido nucleico debe empaquetarse en una cápsula de proteína. El genoma está contenido en una cápsula simétrica o cuasimétrica, ensamblada por una o mas proteínas. Junto con laestructuras proteicas. El volumen interno de la cápsula pocas veces es mayor que el volumen de ácidos nucleicos que debe contener. La cápsula es construida con proteínas codificadas por el virus, por lo que se construye por un tipo simple de subunidades restringiéndose la forma de la cápsula a dos tipos: A. Filamentosas o forma de bastón. B. Pseudoesféricas o simetría icosaedrica ¿ Cómo se construye una cápsula que co1condensando el ADN o ARN por interacciones ácido proteína densamblaje. Un ejemplo es: el MTV, en el cual la cadena sencilla del ARN se ve cubierta por el ensamblamiento de las proteínas. El ensamble comienza en un punto determinado del ARN y se dirige hacia ambos extremos de la cadena. Formándose una estructura cilíndrica gracias a la interacción con la forma helical del ARN. Estructuras semejantes se observan en cápsulas esfericas ejemplo: TYMV, la posición del ARN en la cápsula es determinada directamente por su unión con la proteína de la cubierta.


43

partir de sus componentes en forma de una ubierta vacia,después de lo cual los ácidos nucleicos pueden ser insertados

a fago posee su propio mecanismo

2. La cápsula puede ser construida acsiendo condensados cuando entran. Ejemplo: en los fagos lambda y T4 , cápsulas esféricas con ADN . Una cabeza vacía de la cápsula es ensamblada a partir de un juego pequeño de proteínas, luego el genoma dúplex es insertado en la cabeza, junto con un cambio estructural de la cápsula. El ADN insertado a la cabeza vacía de la cápsula tomó una forma concatemérica. Genomas múltiples unidos final con final. Cadpara reconocer la cantidad apropiada de ADN que debe ser insertada.

Figura 2.17 Esquema de un virus icosahedrico, se observan los componenetes y el material genético (ADN) en el interior de la cabeza. Lambda: Los finales del genoma se encuentran marcados por sitios denominados COS. Este se corta a la izquierda del sitio COS que produce un final libre que es

igura 2. Esquema de replicación y recircularización del ADN del fago lambda.

insertado dentro la cápsula. La inserción de ADN continua hasta que el sitio COS derecho se libera al cortarse para generar el otro fin. El último final que entra en la cápsula durante el ensamblaje es el primero en entrar a la célula infectada. Cualquier ADN contenido entre ambos sitios COS puede ser empaquetado. El empaquetamiento no resulta si la distancia entre los sitios COS es muy grande o reducido. Solo un 15 % extra del ADN puede ser empaquetado.

F 18


Fago T4: La inserción del genoma se inicia en un sitio al azar en el precursor

44

oncatemérico. Continua hasta que un valor del genoma de ADN ha sido insertado

igura 2.19 Esquema de los ciclos reproductivos de los virus, se presenta la forma e propagación del material genético, y el esamble.

os cromosomas eucarioticos individuales solo se observan durante un periodo isión celular y pueden observarse como una unidad

terial genético cupa un área en el núcleo, por lo que los cromosomas individuales no pueden ser

oma contiene un dúplex de ADN muy largo, por lo que la replicación e los cromosomas al igual que del ADN es semi-conservativa.

olos opuestos de la élula, el movimiento depende de la unión de los cromosomas a los microtúbulos

clo que involucra la existencia de algunos mecanismos para medir la cantidad de ADN (realmente la cantidad de ADN insertado es un poco mayor que el genoma) creando una redundancia terminal. Fd Cromosomas en eucariotas Lcorto de tiempo, durante la divcompacta con un radio de empaquetamiénto de 10,000. Una cromátida consiste de una fibra de un diametro de aprox 30 Nm y de apariencia nebulosa. Durante el ciclo de vida de la célula eucariótica, sin embargo, el maoobservados. Cada cromosd Durante la mitosis las cromátidas hermanas se mueven hacia pcque se conectan en su otro final con los polos. El lugar al cual se unen los cromosomas en los microtúbulos se le denomina: Centrómero, que tiene un significado funcional y estructural, el centromero es escencial para la segregación.


45

antidad considerable de heterocromatina constitutiva. En esta región, puede

El centromero posee una región rica en ADN satélite y por lo tanto contiene una cobservarse una zona obscura fibrosa con un diametro o longitud de 400 nm aproximadamente. Esta región es conocida como cinetocoro a la cual se unen directamente los microtubulos. Se asúme que una secuencia específica de ADN define el sítio en que el cinetocoro se establece.

Figura 2.20 Esquema de la integración del ADN para formar un cromosoma en mamífero.

tra estructura importante en los cromosomas es el telómero, que sella el final del romosoma, es importante ya que se ha observado que cromosomas rotos sin esta

ples rotas que previene que la enzima ligasa los selle. La región o

Ocestructura son inestables y tienden a pegarse a otros cromosomas. Se encuentra al final del cromosoma o al final de un ADN lineal. Confiere estabilidad a una molécula lineal. Cada telómero consta de una serie larga de secuencias cortas y repetitivas. En la región telomérica se encuentran ciertas discontinuidades, en forma de bandas simlongitud del telómero se encuentra bajo control genético, diferentes cepas de levaduras presentan diferentes longitudes, algún mecanísmo exíste para prevenir longitudes muy largas, removiendo algunas repeticiones, por lo cual la secuencia exácta es irrelevante ya que la región puede crecer al avanzar en las generaciones.


46

aracterísticas necesarias para la existencia de los cromosomas: Telómeros propios para sobrevivir.

histonas y nucleosomas

Ci)ii)Centrómeros: para la segregación. iii)Origen: inicio de la replicación. 2.2.2 Estructura de la cromatina: Histonas La masa de la cromatina contiene dos veces mas proteína que ADN, las proteínas

r histonas o no histonas, y el ARN es menos del 10% de la masa de

los eucariontes se pueden encontrar las

eínas, por lo que una proteína se encuentra en menor

tonas tienden a contaminarse con proteínas nucleares.

nción

pueden seADN, éste ARN, está formado por cadenas recién sintetizadas que aún se encuentran unidas al templete de ADN. Las histonas conforman aproximadamente la misma cantidad de ADN. Y son las proteínas mas importantes. En todos mismas histonas que son las siguientes: H2A Y H2B interactúan directamente con el ADN son particulas de primer nivel en la cromatina. H1 muestra gran variación entre tejidos y especies (ausente en levaduras) y una variante es la H5. Células sanguíneas rojas en aves. Las no histonas son mas variables entre tejidos y especies, menor masa que las histonas, muchas mas protcantidad que una histona dada. Las proteínas no histonicas incluyen funciones relacionadas con la expresión génica. ARN Polimerasa es una no histona de mucha relevancia. Proteínas HMG (high mobílity group), son un grupo de proteínas no histónicas bien definido. Las no hisCuadro 2.6 Proteínas histonicas presentes en los mamíferos Nombre de la histona Lisina (%) Arginina (%) Peso molecular y fuH1 29 1 23,000

e sobre el

“Sella” el ADN que senrrolla nucleosoma.

H2A 11 9 ctamente con

13,960 Interactúa direel ADN.

H2B 16 6 a directamente con

13,774 Interactúel ADN.

H3 10 13 a directamente con


H4 11 14 a directamente con



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ucleosomaN ontiene aproximadamente 200 pb de ADN asociado a un octámero de histonas.

el núcleo del nucleosoma, está conformado por: 2 copias de H2A,

por 146 pb. Cortes nzimáticos, demuestran que este núcleo permanece sin cortes después de cierto

eslabón entre 0 a 114 pb por nucleosoma.

observan unidos por ADN libre, pero in vivo, debe xístir muy poco ADN libre (no asociado), por lo que todo o casi todo el ADN esta

igura 2.21 Esquema de un nucleosoma y los omponantes que lo forman. Se observan las

CEl octamero esH2B, H3 y H4. Asociada a cada nucleosoma una molécula sencilla de H1, la cual puede ser removida sin alterar la estructura del nucleosoma. El nucleosoma siempre posee un núcleo de ADN formadoetiempo, sin embargo, si continúa la digestión se observan longitudes de ADN, la mayor de las cuales mide 146 pb y la menor, mide menos de 20 pb . El ADN nucleosomal mide entre el ADN núcleo y el ADN de unión o 8 Los nucleosomas in vitro se easociado en nucleosomas. Sin embargo, se pueden observar cambios en diferentes etapas embrionarias.

Fcproteínas histónicas disosiadas.


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o al ctámero de histonas siendo “proteínas de ensamble“ sin formar parte estructural

une en la vecindad de los nucleosomas, en degradaciones con 60- 170 pb.de ADN, se encuentra H1 lo que sugiere que se encuentra en una

m de ltura. Los ≈ 67 Nm (200 Pb) del ADN se encuentran rodeando dos veces al

os del nucleosoma pueden obtenerse por: Extracción de la cromatina. vitro: dejando a las histonas en condiciones de alta salinidad.

rimer paso para la tegración del nucleosoma es la union de proteínas no histónicas en sitios

ras: fibras de 10nm de diámetro y fibras de 0 nm, la diferencia es la estructura y organización de los nucleosomas. 200 Pb =

La H1 y proteínas no histónicas influyen en la longitud del ADN asociadodel nucleosoma. La proteína H1 se1región cercana al núcleo del nucleosoma . Cortes de 16 pb no lo presentan. El nucleosoma es un disco o cilindro plano con un diametro de 11Nm y 6Naoctámero con un giro de ≈ 34Nm cada una. El ADN entra y sale del octámero en la misma posición o punto. Realmente el ADN gíra alrededor del nucleosoma dando 1.8 vueltas. Los octamerIn El ADN que se une al nucleosoma no lo hace al azar, pues un pinespecíficos del ADN. Por lo que se dice que el ADN del nucleosoma se encuentra “fraseado” es decir siempre reconoce la misma región para unirse al octamero, al menos en secuencias cortas de ADN. La cromatina presenta dos tipos de fib3262,000. Daltons.

Figura 2.22 Esquema de una cadena de ADN asociada a nucleosomas

200 pb de ADN

Proteína no ADN de unión

Núcleo del nucleosoma

Histona H1

histónica


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urante la replicación, cuando la cromatina se duplica, no se observa ninguna dividida en dos tipos :

mitótico su radio de mpaquetamiento es aproximadamente de 1000 – 2000 durante la interfase .

e los romosomas en mitosis, durante el ciclo celular no cambian su densidad. En esta

or el grado de ondensación.

a constitutiva: Regiones particulares que nunca son expresadas cluyendo secuencias satélites de ADN .

igura 2.23 Empaquetamiento e la cromatina a diferentes

2.2.3 Naturaleza de la cromatina Ddisrupción. La cromatina puede ser Eucromatina: Menos densa que en el cromosoma e Heterocromatina: Muy densa, el grado de empaquetamiento es similar al dcforma el ADN no se transcribe. Cromocentro: Varias heterocromatinas agregadas en una región. La heterocromatina se diferencia de la eucromatina solo pc Heterocromatinin

Fdniveles, hasta conformar un cromosoma en eucariotas.


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eterocromatina facultativa: Toma la forma de un cromosoma completo inactivo en na linea celular pero en otras circunstancias puede ser expresado.

de transcripción y organización structural. La condensación del material genético se asocia con su inactividad,

terfase y cromosomas mitóticos poseén grandes rizos de bra constitutiva formando regiones o campos independientes, como en los

de bandeo G mostró que cada cromosoma posée una ltra estructura diferente y reproducible. El teñir los cromosomas después de un

HuEj: Cromosoma X en mamiferos, una copia elegida al azar es inactiva en una hembra dada, lo que compensa la presencia de dos X en hembras. El cromosma X inactivo se perpetúa como estado heterocromatido. El cromosoma X activo se perpetúa como estado eucromátido. Por lo tanto hay correlación entre actividad epero lo contrario no necesariamente es cierto. Los genes activos son contenidos en la eucromatina, la localización en eucromatina es necesaria para la expresión génica pero no sufiiente. In vitro la cromatina en infinucleósidos bacterianos. El desarrollo de la técnicautratamiento, con el colorante giemsa , genera una serie de bandas. Aunque esta técnica es muy ampliamente empleada aun no se reconoce por que se produce el bandeo.


UNIDAD 3

EXPRESIÓN DE LA INFORMACIÓN DEL ADN 3.1 TRANSCRIPCION Unidad de transcripción: Se extiende del promotor al punto de término de un gen. La transcripción se divide en tres etapas: 1. Iniciación, en la cual se une el complejo enzimático de transcripción sobre una secuencia de ADN conocida como promotor, y avanza hasta la secuencia que significa el punto de inicio, que es donde se une el primer ribonucleótido. 2. Elongación, es el proceso de unión covalente de los ribonucleótidos. 3. Terminación, cuando el complejo enzimático de transcripción llega a una secuencia que significa el término de la transcripción.

EL DOGMA CENTRAL EXPLICA EL

AD

TRASNCRI TRASNCRIPCIÓN INVERSA

AR

PROTE

Figura 1 Dogma central del flujo de información en los sistemas vivos. 3.1.1 Unidad de transcripción ARN polimerasa: enzima encargada de la síntesis de ARN a partir de templado de ADN. La ARN polimerasa fue descubierta independientemente en 1960 por Samuel Weiss y Jerard Hurwits.

51


52

La reacción que cataliza consiste en:

(ARN)n-residuos + NTP (ARN)n-residuos + 1 + PPi. NTP: nucleósido trifosfato (ATP, CTP, GTP y UTP); posteriormente, el bifosfato (PPi) se hidroliza Todas las células contienen a la ARN polimerasa. En procariontes esta enzima sintetiza todo el ARN excepto el necesario para el cebador en la replicación del ADN (esta reacción es catalizada por la primasa). Algunos bacteriofagos sintetizan una ARN polimerasa que solo sintetiza ARN específico del fago. En eucariontes hay 3 ó 4 ARN polimerasas diferentes que sintetizan diferentes tipo de ARNs. La ARN polimerasa mejor caracterizada es la de E. coli. Procariotas Posee una sola enzima ARN polimerasa (encargada de pegar los ribonucleótidos). Esta enzima sintetiza los tres diferentes tipos de ARN: mensajero, transferencia y ribosomal. Esta enzima está conromada por varias subunidades, por lo que se le conoce como holoenzima o complejo enzimático que tiene un tamaño de 48,000 Daltons (Da). Cuadro 3.1 Componentes de la holoenzima ARN polimerasa de procariotas Subunidad Locus Número por holoenzima Función α Rpo A 2 Unión al promotor β Rpo B 1 Unión de nucleótidosβ′ Rpo C 1 Unión al templete σ Rpo D 1 Iniciación El núcleo enzimático de la holoenzima (α,β,β´) puede iniciar el proceso de transcripción pero no reconoce la secuencia de inicio. El complejo enzimático cubre 60 pares de bases (pb) de la molécula de ADN, sin embargo, sólo desenrolla 17 pb. La velocidad de la reacción de unión entre nucleótidos es igual a 70 nucleótidos por segundo a una temperatura media de 37°C. El proceso de la trasncripción en procariotas puede bloquearse por la acción de antibióticos, por ejemplo la Rimfacina actúa bloqueando la actividad de la subunidad β del complejo. La Estreptomicina inhibe el proceso de elongación. La Heparina es un polianión que bloquea la transcripción in vivo, uniéndose a la subunidad β.


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Eucariotas Este proceso es mas complejo e involucra la actividad de 3 polimerasas de ARN en el núcleo, cada una con una estructura compleja de subunidades y con una función diferente. Cuadro 3.2 Enzimas ARN polimerasas presentes en eucariotas Nombre Ubicación Función ARN polimerasa I Nucleolo Transcribe ARNr ARN polimerasa II Nucleoplasma Transcribe ARNm y ARN nuclear

heterogéneo (ARN) ARN polimerasa III Nucleoplasma Transcribe ARNt y otras moléculas de

ARN menores La principal diferencia entre las enzimas eucarioticas es su respuesta al octapeptido biciclico. α Amanitina, la cual bloquea los ciclos de la ARN polimerasa II. Uniéndose a ella y no la de ARN polimerasa I. Cada enzíma se compone de dos subunidades grandes, con untamaño de 200,000 y 140,000 Daltons y varias súbunidades con tamaño de entre 10,000 a 90,0000 Daltons. No existe especificidad ni entre tejidos ni entre especies en la actividad de la enzima ARN polimerasa II, in vitro, sin embargo muchos otros factores regulan la transcripción en condiciones naturales. ARN polimerasa en mitocondrias y cloroplasto son menos activos y diferentes de los nucleares y su control parece ser mas simple. 3.1.2 Transcripción en procariotas y eucariotas Procariotas El factor sigma (σ) en los procariotas juega un papel muy importante pues asegura que la ARN polimerasa bacteriana se una al ADN de los promotores y no en otros sitios, ya que la holoenzima por si misma presenta una alta afinidad por el ADN. Permite a la holoenzíma reconocer sitios específicos en el ADN y que en ese momento requieren de ser trasncritos a ARN. Se forma un complejo terciario ADN-ADN-ARN naciente, cuando se une el primer ribonucleótido a la secuencia de ADN que se trasncribe, lo que dispara la liberación del factor sigma de toda la holoenzíma. Este paso es el inicio de la trasncripción propiamente dicho, cuando ocurre la síntesis del primer enlace fosfodiéster entre ribonucleótidos. La proporción entre el factor sigma bacteriano y el núcleo de la holoenzima es de 1:3. Por lo que cuando finaliza la transcripción el tetrámero (holoenzíma) se libera y debe unirse a otro factor sigma que dirija una nueva transcripción. Se dan tres etapas en el movimiento de un sitio de unión a otro de la ARN polimerasa, este movimiento está limitado por la velocidad de difusión en el medio.


La afinidad de la holoenzíma hacia el ADN es tan alto como la afinidad del factor σ hacia la secuencia del promotor. Sin embargo el factor σ solo no se une al ADN, únicamente se une si forma parte del complejo enzimático. La iniciación de la transcripción es un punto crítico para controlar la expresión génica. Los promotores varían en su afinidad hacia la ARN polimerasa.

INICIO DE LANÚCLEO

ARN POLIMERAS

REGIÓN PROMOT

UNIÓN DE LA ARN POLIMERASA

ARN POLIMERAS

HOLOEN Figura 3.2 Esquema del proceso de transcripción en procariotas. 3.1.3 Eventos de la transcripción La ARN polimerasa comienza a copiar cuando encuentra una secuencia promotora de ADN, y termina cuando alcanza una señal de terminación. En el caso de los procariontes el ARN transcrito se une desde el primer momento a proteínas, debido a que es muy inestable ya que no tiene el 7-metil-guanocina (CAP), ni la poliA, que estabilizan el ARNm eucariótico. En la transcripción intervienen factores de naturaleza proteica de tres tipos: Factores de transcripción: Son diversas proteínas que se unen al ADN promotor, convirtiéndolo en funcional, lo que atrae a las ARN polimerasas. Hay un factor especifico para cada tipo de ARN polimerasa. - Factores de iniciación: Es la subunidad s de la ARN polimerasa y se libera tras la síntesis de los ocho primeros nucleótidos.

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Factores de elongación: Se incorpora a la polimerasa tras la liberación del factor de iniciación. Sirve para la elongación y terminación de la cadena de RNA. En eucariotas gran parte del ARNm de la célula es producido por un complejo proceso que empieza en el núcleo con la síntesis y procesamiento de un RNA muy largo, denominado ARNm precursor, ARN nuclear heterogéneo (ARNhn) o transcrito primario.

POR LOS SALIDA AL CITOSOL PARA SER

POLIADENIZACIÓ

ESCISIÓN DE INTRONES Y UNIÓN DE EXONES

ARNm

Pre ARNm

TRANSCRIPCION

Figura 3.3 Proceso de maduración del ARN en eucariotas Este transcrito tiene unos 8,000 nucleótidos (llegando hasta 20,000) y contiene segmentos que se traducirán como aminoácidos (exones) y segmentos no codificantes (intrones o secuencias intercaladas) y, además secuencias reguladoras a las que se unirán las proteínas de regulación génica. A continuación, este transcrito sufre un proceso de maduración, en el que se cortan y empalman largas secuencias de ARN (splicing), para eliminar los intrones y dar lugar al ARNm definitivo que es selectivamente transportado al citoplasma. En este proceso, la mayor parte del ARNhn (90%) se elimina y degrada en el núcleo. El transcrito primario de ARN hn es producido por la acción de una ARN polimerasa II. El ADN promotor contiene una secuencia llamada BLOQUE TATA, porque consta de secuencias ricas en T y A, esta secuencia está situada a unos 25 nucleótidos por delante del nucleótido de inicio de la transcripción. En eucariotas (no en procariotas), al transcrito primario se le añaden dos señales, una en cada extremo:

55

CAP: Al extremo 5’ del transcrito se le añade un nucleótido especial la 7-metil-guanosina trifosfatada. Este nucleótido (SELLO) se le añade cuando se llevan


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sintetizados unos 30 nucleótidos, y sirve para que la subunidad pequeña del ribosoma reconozca el ARNm y se una a él en la síntesis proteica. Además, evita que se degrade el ARNm recien creado. Secuencia poli-A: En el extremo 3’ se añade una cadena de unos 200 residuos poliadenilados (polinucleótido en forma de poli-A). La cola poli-A desempeña las siguientes funciones:

a) Interviene en la exportación del ARNm al citoplasma. b) Contribuye a la estabilidad del ARNm en el citoplasma. c) Sirve de señal de reconocimiento al ribosoma. 3.2 Control por transcripción de la expresión génica 3.2.1 Interacción ARN polimerasa-promotor Procariotas Existen diferentes factores sigma, específicos para cada clase de promotores. En E. coli, por ejemplo, se ha observado que en condiciones de choque calórico actúa un factor sigma distinto ya que modifica su patrón de transcripción como efecto del incremento en la temperatura. Tanto en procariotas como en eucariotas un aumento en la temperatura resulta en una reducción de la síntesis proteica. Y un nuevo juego de proteínas son sintetizadas como resultado de los genes de choque calórico. Probablemente protegen a la célula contra el estrés ambiental y quizá pueden ser sintetizadas en otras condiciones. E. coli se producen 17 proteínas de choque calórico por un cambio en el blanco de la transcripción, el gen htpr es un regulador necesario para encender la respuesta al choque calórico, pues produce una proteína de 32,000 Da que funciona como un factor sigma alternativo. σ70 .- factor sigma de 70,000 Da en condiciones normales. σ32 - factor sigma de choque calórico, dirige a la holoenzima hacia el inicio de los promotores de los genes de choque calórico. Los promotores de los genes de choque calórico presentan ciertas diferencias en cuanto a la secuencias consenso. Ligeramente modificada la secuencia –35 y muy diferente la secuencia –10, con respecto a la secuencia consenso. σ60 - factor sigma alterno utilizado cuando se presentan condiciones de carencia de nitrógeno, este factor se activa cuando el amonio falta en el medio, y los genes necesarios son activados para permitir el uso de fuentes alternas de nitrógeno, este factor permite a la holoenzima reconocer promotores que presentan secuencias consenso distintas, con elementos conservados en el sitio –10 y otra secuencia en el sitio – 20.


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En Bacilus subtilus se encuentran aún mas factores σ distintos un ejemplo es cuando esta bacteria es infectada por un virus lítico SPO1 cuyo ciclo infectivo pasa por tres etapas : Genes tempranos: inmediatamente después de la infección el genoma viral se transcribe con la holoenzíma completa del huésped que contiene un σ43 lo cual indica que su promotor es reconocido por el complejo ARN polimerasa del huésped. Esto produce la expresión del gen 28 (gp 28) el cual sustituye al factor σ43 de la holoenzíma que permite reconocer promotores distintos Genes medios: son expresados después de 4-5 min de la infección como resultado de la holoenzima unida al factor σgp 28 lo que provoca que se expresen los genes medios y la holoenzima no reconoce al genoma del hospedero y permite la transcripción de los genes medios, estos transcriben los genes 33 y 34 dando como resultado las proteínas GP33 y GP34 que de nuevo sustituyen al GP28 de la holoenzima. Genes tardíos: después de 8-12 min. Estos genes son transcritos por la holoenzima + gp33 y gp34 que únicamente reconocen los promotores de los genes tardíos. Por lo tanto se observa un patrón de regulación creado por cascada por la holoenzíma del hospedero que transcribe un gen del fago cuyo producto es necesario para transcribir los genes medios, cuyo producto de los genes son necesarios para transcribir los genes tardios. Gp28= 26,000 Da, Gp33 =13,000 Da y Gp34 = 24,000 Da. Las sustituciones sucesivas de los factores σ tiene como consecuencia que cada vez que la subunidad es cambiada la ARN polimerasa es capaz de reconocer una nueva clave de gen y deja de reconocer la clave previa de genes. Por lo tanto constituye un cambio global en la utilidad de la ARN polimerasa, el cambio que sufre la polimerasa es irreversible. Durante la esporulación de Bacilus subtilus, también entran en juego diferentes factores σ de la misma célula. σ43 - Estado vegetativo. σ37 - Esporulación.- este factor únicamente se une al 10% del núcleo de la holoenzima. Probablemente σ43 permanece durante la esporulación, el σ43 remanente no se destruye . σ32 - Esporulación, presente en células vegetativas y activo en etapas tempranas de esporulación > 1% de la holoenzima se encuentra asociada con este factor sigma. σ29 - Después de cuatro horas del inicio de la esporulación, este factor aparece y permite que se transcriban otros genes, no se encuentra en células vegetativas por lo tanto es el producto de genes activados por la ARN polimerasa + σ37. σ28 - Presente en células vegetativas, desaparece en células en esporulación probablemente expresa genes cuyo producto detecta estrés nutritivo e inician la respuesta de esporulación.


Eucariotas Promotores para ARN polimerasa II Para identificar la secuencia de los componentes del promotor, se puede usar varios criterios: a) Una secuencia consenso debe estar presente en varios ejemplos del sitio. b) Las mutaciones en el sitio deben provocar que la función se modifique. c) Las proteínas involucradas en el uso del sitio pueden marcarse en ellas. Para definir un promotor se considera su habilidad de iniciar la transcripción, tres sistemas han sido empleados: in vitro: Componentes definidos purificados para cada una de las tres ARN polimerasas. Comparación de las actividades in vitro de las ARN polimerasas de diferentes tejidos y especies. Oocitos: Se lleva a cabo una inyección de un templete de ADN en el núcleo del oocito de Xilopus laevis. El ARN transcripto es aislado y analizado, se observa la formación de la proteína indicada en el templete inyectado, esta prueba se desarrolla bajo las condiciones prevalescentes en el Oocito. In vivo: Células cultivadas que transcriben un templete introducido por transfección. Utiliza el mismo aparato que se encarga de transferir el genoma de la célula huésped pero el templete causante de un gen que no se transcribe usualmente en el huésped. En cualquiera de los tres sistemas se emplea la misma técnica para caracterizar al promotor: Cualquier sección de ADN transcripta debe poseer un promotor, y para localizarlo se reducen los fragmentos a ambos sitios del punto, hasta que este se inactive. Promotor

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Corte negativo(-) Corte positivo (+) ADN


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La misma longitud corriente arriba debe ser recolocada después de que las fronteras del promotor han sido encontradas, entonces se puede analizar la importancia de bases particulares mediante la introducción de mutaciones puntuales u otro re-arreglo en la secuencia . Una técnica muy útil para analizar la secuencia necesaria para que el promotor funcione es llamada: LINKER SCANING. La cual permite introducir mutaciones en sitios específicos. De esta manera la secuencia original puede ser monitoreada hasta encontrar un sitio sensible a la mutación. En posición corriente arriba, se pueden remover secuencias progresivamente sin ningún efecto, hasta alcanzar un punto localizado entre –45 y –30 pares de bases (pb), lo que define la frontera izquierda del promotor, cuando esta es traspasada la transcripción se reduce en un 20% o más . Corriente, abajo la frontera derecha del promotor se localiza cerca del punto de inicio y puede encontrarse después de él a +6 o antes en –10 o –12 pb. Cuando se corta el punto de inicio, la iniciación ocurre en un punto del templete localizado a la misma distancia del promotor, al igual que el punto de inicio original, a excepción de que probablemente se ajuste en una base o dos para hallar una purina usualmente adenina (A) con la cual iniciar. Al igual que en bacterias, los promotores presentan regiones homologas cercanas al punto de inicio en tres regiones: a) Punto de inicio: homología no extensa, pero con tendencia de la primera base del ARNm de ser flanqueado a ambos lados de pirimidinas. b) Secuencia a –25 pb: la mayoria de las proteínas presentan una secuencia llamada TATA ó caja de Hogness en –19 a –17 pb, hallándose en mamíferos, aves, anfibios e insectos, para los casos conocidos la secuencia consenso es: A63 A50 T82 A97 T93 A85 A83 T37 T33 La secuencia consta enteramente de bases A y T y en una minoría de casos reales el par C-G esta presente. La caja TATA tiende a rodearse de secuencias ricas en C-G las cuales podrían ser un factor de funcionamiento.La caja Hogness es equivalente a la Caja Pribnow, sólo difieren en su localización, -25 en lugar de -10 pb. Es una secuencia corta bien definida y localizada cerca del punto de inicio de la transcripción. Cuando la caja TATA es removida, la transcripción continúa pero el punto de inicio se corre de su ubicación inicial. c) Secuencia a -75 pb: cuando esta región es cortada la transcripción inicia en el punto de inicio usual, pero disminuye en un 2%. Presenta una estructura multiperiférica localizada en regiones de -50, -70 y -80 a –110 pb, todos necesarios para una iniciación eficiente.


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Las regiones entre estas secuencias no parecen involucrarse en la función del promotor y la distancia que los separa entre sí o de la caja TATA, puede ser flexible permitiendo un incremento de >15 pb en el primer caso y >30 pb en el segundo. In vivo los promotores parecen tener dos funciones: La frecuencia de la iniciación parece estar fuertemente influenciada por las secuencias medias y distales de la región –75 pb. Su función es la unión de la ARN polimerasa. La elección del punto de inicio parece estar influenciada por la secuencia cercana al punto, caja TATA altamente conservada, su papel es alinear a la ARN polimerasa para que inicie en el sitio correcto. ¿ Cómo se pone en contacto con regiones tan alejadas dentro del promotor? Región alejada: muy importante para la unión de ARN polimerasa. Región cercana: Importante para que se inicie en el punto correcto. La ARN polimerasa III posee un promotor corriente abajo El ARNm 5S posee un promotor que encaja dentro del gen a +50 pb. Se descubrió empleando exonucleasas, 5S ARN seguía siendo transcrito hasta que el corte del gen dejaba +55 pb. La transcripción se inicia en la purina ubicada a 55 pb corriente arriba del promotor. ¿Cómo? ARN polimerasa es lo suficientemente grande que abarca la región a +55Pb. Factores de transcripción Son proteínas que reconocen secuencias consenso particulares, pueden ser de dos tipos: a) Factores de transcripción que se unen a la ARN polimerasa durante o cuando el complejo de iniciación se ha formado, sin formar parte de la enzima libre .Necesarios para iniciar o terminar la transcripción. b) Factores de transcripción que se unen en secuencias específicas de los promotores blancos . En este último caso, se han podido aislar factores de transcripción que reconocen secuencias determinadas. Cuadro 3.3 Factores de transcripción en eucariotas Factor Especie Promotor Sitio de reconocimiento B Drosophila TATA TATA/Pto de incio TFIID Hombre Adenosin TATA CTF Hombre Globin, tk CAAT USF/MTLF Hombre Tardío GGCCACGTGACC SP1 Hombre TATA,CAAT,GC GC HSTF Drosophila Choque calórico Consenso de choque calórico.


Algunas estructuras características de los promotores actúan directamente con los factores mas que con la ARN polimerasa. Los resultados indican que los promotores deben encontrarse en grupos generales identificados por la presencia de secuencias concenso y los factores que reconocen tales secuencias son los responsables de coordinar al reconocimiento de los promotores. Este reconocimiento por factores múltiples puede ser necesario para que se inicie la transcripción. Cuando esto sucede, la interacción con los promotores es de manera cooperativista: la unión de un factor promueve la unión de otro. Sin embargo, el papel de los factores es únicamente necesario para la transcripción general sin incluir un papel regulatorio. Algunos factores pueden actuar como reguladores como es el caso de los genes de choque calórico. La respuesta al cambio calórico es similar en procariotas como en eucariotas. Un aumento en la temperatura apaga unos genes y enciende otros, y probablemente cambia la traducción de los ARN mensajeros. Los genes de choque calórico en eucariotas poseen una región consenso a -15 pb del punto de inicio. HTSF es activo en células con choque calórico y se une al sitio que posee la secuencia consenso, lo que provee un medio para iniciar la transcripción de los genes específicos. Por lo que se puede decir que los factores son análogos a los factores σ en procariotas. Un gen puede ser regulado por una secuencia en el promotor la cual es reconocida

por una proteína específica, ésta funciona como un factor necesario para que la ARN polimerasa inicie la transcripción, la proteína se encuentra disponible únicamente bajo condiciones en las que el gen necesita ser expresado, la ausencia, asegura que el promotor no pueda ser usado. Probablemente el promotor carece de ciertas características que le confieren los factores para poder ser reconocido por la ARN polimerasa .

INICIO DE LA

INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN

PROTEÍNA QUINASA

Figura 3.4 Esquema que representa la interacción de las factores de trasncripción con la ARN polimerasa II, el factor TFII D se une a la región TATA y puede interaccionar con el factor TFIIB, interactuando con los factores TFIIH y TFIIE. El factor TFIIF se une a la ARN polimerasa. Lo cual prepara el medio para que se inicie el proceso de la trasncripción.

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Cuando un promotor es regulado en mas de una forma, cada evento regulatorio depende de la unión de su propia proteína a una secuencia particular. Los promotores para la ARN polimerasa II contienen las secuencias básicas (caja TATA) involucradas en el funcionamiento general con ARN polimerasa II y una serie de secuencias específicas que le permiten a la ARN polimerasa II unirse e iniciar la transcripción bajo condiciones particulares. Aceleradores En algunos casos los promotores no funcionan solos, otras secuencias pueden incrementar enormemente la actividad de los promotores. Estas secuencias son conocidas como Aceleradores o Aumentadores. La diferencia entre un promotor y un acelerador es su posición relativa al promotor, la cual puede variar y funciona en cualquier sentido, pueden asistir a cualquier promotor vecino. ¿Cómo un aumentador estimula la iniciación en un promotor? La razón puede estar relacionada con la estructura, localización o la unión enzimática. a) El aumentador (intensificador) puede cambiar la estructura completa del templete. b) Si el intensificador provee de un sitio de unión puede ser responsable de mover al templete a un lugar particular de la célula. c) Un intensificador puede proveer de un “sitio de entrada” bidireccional, donde la ARN polimerasa se une con la cromatina

AUMENTADOR

ACELERADOR Figura 3.5 Esquema que representa la forma de acción de las moléculas aumentadoras y las regiones aceleradoras.

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3.2.2 Operones Las bacterias presentan un mecanismo simple para coordinar la regulación de la expresión de sus genes. Los genes se encuentran arreglados de manera continua en el cromosoma y se transcriben simultáneamente. Este arreglo, denominado operón, da origen a un ARNm en donde se encuentran

muchos genes, es decir, es policistrónico. La transcripción de este ARNm está regulada por un único promotor, que es el sitio de regulación para la expresión de la información codificada en el

operón, no es un gen pues su secuencia es únicamente de reconocimiento.

Figura 3.6 Esquema del operón de lactosa de E. coli

Muchos de los principios de la expresión genética en procariotas, tienen su origen en el estudio del operón de lactosa (operón lac) de E. coli, bacteria que puede utilizar a la lactosa (azúcar de la leche), como única fuente de Carbono. En 1960 Francois Jacob y Jacques Monod, publicaron cómo dos genes adyacentes involucrados en el metabolismo de la lactosa, son coordinados y regulados por un elemento genético localizado en uno de los extremos de la fila de genes. El fenómeno que inspiró la idea fué el de la inducción enzimática. Grupos de genes que codifican para proteínas relacionadas se agrupan en unidades conocidas como operón. Un operón consiste en: un operador, un promotor, un regulador y un gen estructural. El gen regulador codifica para una proteína que se pega al operador, obstruyendo al promotor (y por lo tanto a la transcripción), del gen estructural. El regulador no tiene que estar adyacente a los otros genes en el operón. Cuando se remueve la proteína represora, puede producirse la transcripción

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3.2.3 Control en la terminación: atenuación y antiterminación Operón trp: atenuación La regulación de la expresión de ciertos genes que participan en la biosíntesis de aminoácidos en E. coli en particular del operón trp, da origen a 5 proteínas 3 de ellas son enzimas que participan en la síntesis del triptofano. Charles Yanofsky encontró que la expresión de este operón está controlada por el represor trp, que es un homodímero de 107 aminoácidos por subunidad (trpR forma un operón independiente). El represor trp une L-triptofano que es el producto final de la vía. Este complejo se une al operador (trpO) con lo que se reduce 70 veces la velocidad de la transcripción.

Figura 3.7 Esquema que representa el control por atenuación de la síntesis del triptófano. Un represor inactivo se activa cuando el triptofano se encuentra presente en el medio. Operón trp: antiterminación Existe un control alterno para regular la expresión del operón de triptófano, y se basa en la velocidad de transcripción.

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Cuando por algún motivo se presenta un aporte de triptófano al medio y aún se está llevando a cabo la síntesis, ésta puede detenerse a pesar de que ya se halla iniciado el proceso de expresión del operón.


En el operón de triptófano se encuentran cuatro regiones que son secuencia complementaria y pueden reconocerse y pegarse, cambiando la estructura de la molécula de ARN, y por lo tanto impidiendo el avance de los ribososmas sobre la molécula y deteniendo la síntesis de triptofano.

Figura 3.8 Esquema del control de la expresión del operón de triptófano por antiterminación. 3.2.4 Cascada lítica y represión lisogénica Los Virus consisten en un ácido nucléico (ADN o ARN) envueltos en una cubierta de proteína (conocida como cápsido). El cápsido puede ser una sola proteína que se repite una y otra vez, como en el virus del mosaico del tabaco (TMV). También puede estar formado por varias proteínas, como en los bacteriofagos de la serie T. Los Retrovirus, como el de la Inmunodeficiencia Humana (HIV), poseen una enzima: la transcriptasa reversa amén del ARN viral. La transcriptasa reversa fabrica ADN de una sola cadena , copiando el ARN viral. El ADN viral monocatenario se transforma por medio de la ADN polimerasa en bicatenario.

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Figura 3.9 Esquema que representa los diferentes ciclos de los virus, se observa la cascada lítica y la represión lisogénica. El ciclo lítico ocurre cuando el material genético del virus penetra en la célula huésped (recuerde que los virus son parásitos intracelulares obligados) y comienza a fabricar nuevos virus. Eventualmente los nuevos virus causan la ruptura o lisis de la célula y continúan el ciclo infeccioso. El ciclo lisogénico ocurre cuando el ADN viral es incorporado al ADN del huésped como profago, y cuando la célula huésped se divide, se duplica como si fuera ADN del huésped. Algunas veces el profago emerge del cromosoma de la célula huésped y entra en el ciclo lítico espontáneamente (aproximadamente 1/10,000 divisiones). La luz ultravioleta y los rayos X también pueden producir este fenómeno. La transducción es el fenómeno por el cual el ADN es transferido de una célula huésped a otra por un virus. Algunos bacteriófagos son "temperados" o atenuados dado que tienden a ser lisogénicos mas que líticos.

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3.3 Traducción El proceso de síntesis de proteínas o traducción se divide en tres partes: Iniciación: reacción que precede a la unión entre los dos primeros aminoácidos. El ribosoma se encuentra unido al ARNm, este paso es lento. Elongación: síntesis del primer enlace peptídico entre el primer par de aminoácidos, este es un paso rápido. Terminación: movimiento del ribosoma hasta una secuencia de bases necesarias para completar la cadena peptídica, desensamble del ribosoma del ARNm. Este es una paso lento. La síntesis de proteínas en procariotas se da a una velocidad de 15 aminoácidos por segundo a una temperatura de 37º C. Mientras que en eucariotas este proceso es mas lento, la velocidad de síntesis es de 2 aminoácidos por segundo a 37 º C. El ribosoma posee dos: sitio A (ARNt- aminoacil) sitio P (ARNt- peptidil) polipeptido sintetizado. Figura 3.10 Esquema que representa las tres etapas del proceso de traducción o síntesis de proteínas.

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3.3.1 ARN de transferencia El ARN de transferencia (ARNt): los diversos ARNt transportan los diferentes aminoácidos hacia los ribosomas en la síntesis proteica. Constituyen el 15% del ARN celular. Es una molécula de 75-85 bases de longitud, existe

al menos un ARNt por cada aminoácido. Reconoce a un solo aminoácido al cual se une covalentemente. Cada ARNt contiene una secuencia de trinucleótidos que es llamada ANTICODON, ya que es complementario a la secuencia del CODON que se encuentra en el ARNm. La estructura que presenta se conoce como trebol. Cuando el ARN se carga con su aminoácido específico, se conoce como ARNt-aminoacil. El aminoácido se une con una unión éster entre su grupo carboxilo y el grupo hidroxílo de la ribosa de la última base, la cual es siempre Adenina Una enzíma específica sintetiza la formación de ARNt-aminoacil, la cual se conoce como ARN aminoacil sintetasa, la cual reconoce únicamente a un aminoácido, por lo que al menos existen 20.

Una vez formado el complejo ARNt- aminoacil, el aminoácido no juega un papel en la determinación de la

especificidad, la cual es regulada por el anticodón. Figura 3.11 Esquema de una molécula de ARN de transferencia, se sençñala la región del anticondón y los puntos donde se forman puentes de hidrógeno.

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3.3.2 Ribosomas: fábricas traductoras El ARN ribosómico (ARNr): conforman a los ribosomas los diversos ARNr, junto con sus proteínas asociadas, intervienen en la síntesis proteica. Representa el 70% del ARN celular; mientras que sus precursores (45S),

presentes en el núcleo representan el 5% del RNA celular.

ARN PROTE SUBUNID RIBOSOMAS

P R O C A R I O T A

EUCAR I OTA

Figura 3.12 Esquema de la formación de los ribosomas en procariotas y eucariotas. Se observa el papel preponderante que las cadenas de ARN tienen como parte central de las subunidades de los ribosomas. Los aminoácidos se ensamblan en proteínas por los ribosomas. Los ribosomas son partículas de ribonucleoproteínas, que consisten de dos subunidades las cuales constan de varias proteínas asociadas con una molécula larga de ARN conocida como ARN ribosomal (ARNr). Todos los ribosomas son idénticos y lo que hacen es descifrar el ARNm que proporciona el templete. Proveyendo un ambiente adecuado que controla el reconocimiento del codón del ARNm. Y el anticodón del ARNt Cada ribosoma se mueve en dirección 5’→ 3’ sobre el templete de ARNm permitiendo la formación del polipéptido, en ciertos casos, mas de un ribosoma se encuentra unido al ARNm, lo que se conoce como polirribosoma o polisoma.

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Figura 3.13 Esquema que representa el ensamble de los ribosomas sobre el ARNm y su movimiento sobre la molécula, se observan mas de un ribosoma sobre la cadena de ARN, lo que se conoce como polisoma o poliribosoma. Se sintetiza un solo polipéptido por acción de un ribosoma en el ARNm. El tamaño de los poliosomas depende de la longitud del ARNm el cual puede codificar para varias proteinas. En bacterias los ribosomas se unen al ARNm aún en formación. Tanto en bacterias (en donde es rápidamente degradado) como en eucariotas, el ARNm no es abundante. En eucariotas, puede sobrevivir algunas horas en la célula, aunque representa únicamente el 3% de la masa nuclear del ARN . El ribosoma puede ser reconocido como una pequeña fabrica migratoria, la energía para la síntesis proteica se obtiene de la hidrólisis de GTP (Guanina tri-fosfato). Los ribosomas son los componentes mayores de las células. En una bacteria en crecimiento activo, pueden presentarse cerca de 20,000 por genoma. 10% del total de las proteínas bacterianas y aproximadamente 80% del total de la masa de ARN celular. En eucariotas estos porcentaje de proteínas son menores. El número de ribosomas en las células está directamente relacionado con la actividad sintética de proteínas de éstas. En bacterias se encuentran asociadas en ARNm naciente mientras que en eucariotas están asociadas con el citoexqueleto o con estructuras celulares.

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Cada subunidad contiene un gran componente de ARN y nucleoproteínas diferentes, la mayoría presentes con una sola copia por unidad. La principal función del ARN es estructural, ya que las proteínas se unen en sitios específicos del ARN. Los ribosomas varían en forma y tamaño dependiendo de los organismos. Tripanosoma posee moléculas de ARNr de menos de 2,000 bases, en mamíferos se pueden encontrar moléculas hasta de 7000 bases. El ARNm se une entre las dos subunidades. Las regiones importantes de la estructura secundaria del ARNr se encuentran conservadas, por lo que se encuentran tanto en 16S como en 23S ARNr. El ARNr presenta 4 campos principales con muchas bases pareadas, (menos de 8 nucleótidos) y muchas regiones sin parear. Algunas proteínas in vitro se unen fuertemente con el ARNr, pero algunas no lo hacen, lo que significa que requieren de la presencia de otros para la unión. Cada proteína ribosomica se une a un sitio específico del ARNr. Split Proteínas: proteínas separadas por centrifugación en CsCl, se separan núcleos de 23S y 42S a partir de las subunidades 30s y 50s respectivamente. El reensamble requiere de los siguientes pasos: 1) ARNr 16S + 15 proteína 2) Formación de partículas RI 3) Partículas RI calentadas → RI* (40°C) 4) 6 proteínas + RI* = 30S (Subunidad) ó 5) 23S + 6 proteínas = 30S (Subunidad) Paso limitante es la conversión dependiente de la temperatura, que provoca el dobles en un estructura más compacta. Los ribosomas presentan sitios activos específicos, divididos en: 1) Campo de Traslación: conforma la tercera parte del ribosoma, centro de peptidil tranferasa, unión con EF-→ 50S. 2) Campo de Salida: factores de iniciación – ARNti Met 30S, se une a membranas.


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3.3.3 ARN mensajero: templete El ARN mensajero (ARNm) son las diferentes secuencias de los nucleótidos que constituyen los múltiples ARNm de la célula determinan las cadenas polipeptídicas que se sintetizarán en los ribosomas. La proporción de ARNm varía mucho dependiendo del tipo de célula que se analice y el momento funcional. Por término medio representa el 3% del ARN celular y sus precursores (ARNhn) el 7%. Cuando lleva la información para una sola proteína, se denomina monocistrón, y policistrón, si lleva información para más. 3.3.4 Línea de ensamble para la síntesis proteica; código genético Iniciación en procariotas Ribosoma no se une directamente al ARNm para iniciar la síntesis. Cada ARNm posee un sitio de unión para el ribosoma (RBS, por sus siglas en inglés ribosome binding site) el cual es una secuencia corta de bases que precede a la región codificante. La subunidad pequeña del ribosoma se une al ARNm para formar un complejo de iniciación (30S+RBS), posteriormente, se une la subunidad mayor del ribosoma 50S. La unidad pequeña no puede sintetizar sola las proteínas, posee factores de iniciación (IF) que son proteínas. Bacterias 3IF: IF1, IF2 e IF3 IF1: Se une a la subunidad 30S para completar el complejo de iniciación, pero su papel es de estabilización mas que de reconocimiento. Probablemente es un factor de reciclamiento. IF2: Reconoce a un iniciador especial del ARNt y lo une a 30S, lo que asegura que solo el ARNt–iniciador se una en la reacción de iniciación. Permanece como parte de la subunidad 30S durante esta etapa de iniciación. Activa la hidrólisis de GTPs indirectamente, motivándola en alguna proteína del ribosoma. IF3: Necesario para generar más subunidades 30s y debe estar presente en ellas para que se unan al ARNm. Controlando su estado de asociación con la subunidad 50S , ya que cuando se une a 30S, impide que se formen los complejos 70S. Existe una molécula de IF3 por cada subunidad y ya que hay pocos IF3 su disponibilidad determina el número de 30S libres. Absolutamente necesaria para unir la 30S al ARNm. No se involucra en la selección del sitio. Este factor es liberado antes de que 50S se una a 30S, por lo tanto 30S no puede tener unión con IF3 y 50S simultáneamente. Y 30S existe libre unida a IF3 o bien en el complejo 70S. El número de copias de cada factor es suficiente para unirse únicamente a un pequeño numero de ribosomas libres, por lo que deben de ser reusados eficientemente.


El complejo de iniciación esta formado por 30S unido a RBS en el ARNm. El codón de iniciación es AUG universalmente, pero en bacterias puede ser también :GUG y UUG. AUG= Metionina, Existen dos tipos de ARNt que pueden transportar este aminoácidos, un tipo reconoce la iniciación y el otro reconoce los codones AUG durante la elongación.

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Figura 3.14 Esquema del proceso de iniciación de la síntesis de proteínas en procariotas


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En bacterias y mitocondrias, el ARNt iniciador acarrea un residuo de metionina que ha sido modificado en su grupo amino, formando un formaldehido. ARNt-N-Formilmetionina : ARNtf Met . Bloquea el grupo del aminoácido y previene su formación en la elongación, actuando únicamente como iniciador de proteínas, usándose por lo tanto, este ARNt para reconocer las cadenas de iniciación .AUG (algunas veces GUG; UUG) ARNtm met reconoce los codones internos. ARNtf met se une al sitio P originando así la síntesis. Siendo este el único ARNt–aminoacíl que se vuelve parte del complejo de iniciación, entrando directamente al sitio P. En bacterias y mitocondrias el residuo de formol es removido por una enzíma (deformilasa específica) que genera una terminal NH2 normal. Si la metionina es el aminoácido terminal N de la proteína este es el único paso, pero en cerca del 50% de las proteínas, la metionina es removida por una aminopeptidasa, creando un nuevo termino, cuando esto sucede, ocurre de manera rápida, cuando la cadena polipeptídica, naciente aún, presenta una longitud de entre 15 y 30 aminoácidos. Iniciación en eucariotas La subunidad pequeña del ribosoma se une al extremo 5´ del ARNm y se mueve hacia el sitio de iniciación, ahí se le une la subunidad mas grande. Existen al menos nueve factores de iniciación, estos son llamados de la misma manera que en bacterias pero con el prefijo e. eIF2 y eIF3 contienen cadenas múltiples, mientras que los otro presentan polipéptidos sencillos. La iniciación en eucariotas inicia con la formación de un complejo terciario : ARNt;Met - eIF2 y GTP. Primero se une GTP + eIF2 y después este complejo se una al ARNtiMet . Este complejo terciario finalmente se une a la subunidad 40S. Esto sucede independientemente de la presencia de ARNm pero primero se debe formar el complejo de iniciación para que 40S se una al ARNm. La unión del complejo terciario (ARNt;Met - eIF2 y GT) + 40S al ARNm depende del factor eIF3, que participa únicamente en la unión con el ARNm junto con otros factores. eIF6: mantiene disociadas a las dos subunidades, actuando sobre la subunidad mas grande 60S.


La unión de 60S con 40S unido al ARN únicamente se presenta cuando eIF2 y eIF3 han sido liberados del complejo de iniciación, esta acción es realizada por el

eIF5. eIF4c: determina la unión de 60S y40S. Es probable que todos los demás factores sean liberados cuando el ribosoma 80S ha sido formado. Figura 3.15 Esquema del proceso de ensamblaje del complejo de iniciación en eucariotas.

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El factor eIF2 es el punto de control para la síntesis proteica, contiene tres subunidades, sus propiedades generales son similares en plantas y mamíferos lo que indica semejanzas en muchos eucariotas. Cuadro 3.4 Subunidades que componen el factor de iniciación de la traducción eIF2

Subunidad Función Masa α Union a GTP. Controlado por fosforilación 35,000. Da. β Factor de reciclamiento. 38,000. Da. γ Union con ARNmet 55,000. Da. Para que el factor EIF2 esté activo, la subunidad α debe acarrear GTP, durante la iniciación, GTP es hidrolizada a GDP, aquí interviene otro factor el eIF2B necesario para que se dé la reacción de generar GTP de nuevo y el factor eIF2 se active. Elongación e procariotas y eucariotas Una vez completada la formación del ribosoma y que el sitio P se encuentre ocupado por un peptidíl ARNt, cualquier aminoacil ARNt excepto el iniciador, puede entrar al sitio A, su entrada es mediada por un factor de elóngación (EF).

Salida del ARNt sin aminoaci

Entrada de aminoacil-ARNt.

Movimiento del ribosoma

Formación de nueva unión peptídica

Figura 3.16 Representación del proceso de elongación de la cadena polipeptídica.

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EF actúa como IF2 en procariota, asociándose con el ribosoma únicamente mientras el aminoacil– ARNt entra al ribosoma. Cando el aminoácil–ARNt se encuentra en su sitio, este factor deja el ribosoma, para unirse de nuevo a otro complejo aminoacil-ARNt. Este factor de elongación EF esta formado de dos componentes: EF-Tu y EF-Ts, denominados así por ser T un factor de transferencia, y su nombre representa su estado cuando es calentado: Tu – inestable en el calentamiento y Ts – estable en el calentamiento EF-Tu acarrea un nucleótido de guanina, en su forma activa el factor posee GTP, el complejo binario EF-Tu+GTP se une al aminoacil-ARNt y forma el complejo terciario Aminoacil+EF-Tu+GTP, y este complejo se une al sitio A del ribosoma únicamente cuando el sitio P ya está ocupado por el peptidil-ARNt. Cuando el aminoacil-ARNt ha sido colocado en el sitio A, el GTP es cortado (hidrolizado) y el complejo binario EF-Tu+GDP es liberado. El factor EF-Ts interviene en la regeneración de la formación EF-Tu+GDP a su forma activa: EF-Ts desplaza el GDP de la forma EF-Tu formando el factor combinado EF-Tu+EF-Ts (factor T completo). El factor EF-Ts es desplazado por GTP, formando EF-Tu+GTP. Este factor activado se une al aminoacil y libera el EF-Ts que es reciclado. La mayor cantidad de EF-Tu se encuentra en forma de complejo binario o terciario, ya que existe mucho menos EF-Ts, su cantidad aprovecha el número de ribosomas. La GTP se necesita presente para que el aminoacil-ARNt se una al sitio A, pero su hidrólisis no es requerida hasta posteriomente. Traslocación del Ribosoma El ribosoma permanece estático, hasta que la cadena de polipéptidos crece por la transferencia del polipeptidil, unido al ARNt en el sitio P al aminoacil-ARNt del sitio A. La síntesis del enlace peptídico es catalizada por la peptidil transferasa. Esta enzima está en función con la subunidad más grande del ribosoma (50S ó 60S), debe encontrarse en el sitio ribosomico en que las terminaciones del peptidil-ARNt y el aminoacil-ARNt se encuentran juntos. La actividad de la transferasa se controla por la subunidad más grande de ribosoma y 23S ARNr.

Etapa de terminación Determina la conclusión de la síntesis de la proteína cuando el sitio A del ribosoma es abordado por el codón de terminación del ARNm (UUA, UGA o UAG, indistintamente). Ello deja al sitio A sin el esperado aminoacil-ARNtaa, aunque pronto es ocupado por un factor de terminación llamado RF o eRF en eucariotas (por sus siglas en inglés eucaryotic releasing factor), que sabe reconocer a los tres codones de terminación.


Figura 3.17 Esquema del proceso de terminación de la síntesis de proteínas.

Figura 3.18 Esquema que representa el termino de la traducción. Cuando un ribosoma llega a un codón de termino (UAA, UGA, UAG), los factores de liberación (RFs) entran al complejo ribosomal, probablemente en o cerca del sitio A. En bacterias, RF1 o RF2 primero reconocen el codón de inicio. RF3-GTP entonces corta la cadena petidica del tRNA y libera las dos subunidades ribosomales, esta reacción requiere de la hidrolisis de GTP.

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En síntesis la terminación de la cadena polipeptídica está señalada por el ARNm mediante un codón que no especifica la incorporación de ningún aminoácido . Ese codón de terminación puede ser UUA, UGA o UAG, y sobre él no se une ningún ARNt. En cambio, es reconocido por dos proteínas llamadas factores de liberación (RF o eRF). Cuando esto sucede, la proteína terminada se libera del último ARNt, que también se separa del ARNm. Por último también se disocian las subunidades ribosómicas. Todos estos elementos pueden ser reutilizados en una nueva síntesis. Código genético El código genético consiste en 61 codones para aminoácidos y 3 codones de terminación, que detienen el proceso de traducción. El código genético es por lo tanto redundante, en el sentido que tiene varios codones para un mismo aminoácido. Por ejemplo, la glicina es codificada por los codones GGU, GGC, GGA, y GGG. Si un codón muta por ejemplo de GGU a CGC, se especifica el mismo aminoácido.

Figura 3.19 Esquema del código genético y la manera de “leerse”, comenzando con la primera letra del lado izquierdo.

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UNIDAD 4

TECNICAS DE RECOMBINACIÓN DEL ADN

4.1 ADN COMO MATERIA PRIMA EN LA RECOMBINACIÓN GÉNICA El requisito inicial y en muchas ocasiones limitante de la manipulación del ADN es el acceso a cantidades suficientes o al conocimiento de la secuencia del ADN del gen en estudio. Por tanto, la clonación es el paso inicial para poder utilizar a la Biología Molecular como una herramienta de investigación. Una clona es una grupo de células o moléculas de ADN idénticas a una célula o molécula ancestral y clonar es el proceso mediante el cual obtenemos múltiples copias de una fragmento de ADN originados a partir de una copia. El resultado inmediato de clonar un fragmento de ADN es el poder reproducirlo en grandes cantidades, y además secuenciarlo para determinar el ordenen que están dispuestas las bases. Así la clonación lleva implícito el cumplir con los requisitos de la mayor parte de las metodologías en biología molecular: tener acceso a grandes cantidades del gen y conocer su secuencia. La clonación se basa en la producción de una molécula recombinante (unión de dos o más moléculas de ADN provenientes de diferentes especies) entre el gen de interés a clonar (proveniente de cualquier especie) y un vector de clonación. El ADN recombinante se utiliza para transformar células (usualmente bacterias), y una vez obtenidas clonas con ADN recombinante en su interior, el final del proceso de clonación consiste en la identificación de la bacteria que lleve el gen de interés. El procedimiento de clonación involucra 4 pasos principales: 1.- Construcción de moléculas de ADN recombinante mediante enlaces covalentes in vitro (unión o ligamiento) de fragmentos del ADN deseado (ADN blanco) a un replicon (cualquier secuencia capaz de replicar el ADN de manera independiente). Este paso se facilita por el corte del ADN blanco y de las moléculas del replicon con endonucleasas de restricción específicas antes de la unión de fragmentos de ADN diferentes con la enzima ADN ligasa. 2.- Transformación. Las moléculas de ADN recombinantes son transferidas dentro de las células huésped (con frecuencia células bacterianas o de levadura) en las cuales el replicon seleccionado puede llevar a cabo la replicación del ADN independientemente de los cromosomas de la célula huésped. 3.- Propagación selectiva de las clonas. Involucra dos etapas. Inicialmente las células transformadas se siembran en una caja de petri sobre una superficie de agar para asegurar el crecimiento de colonias de células “bien separadas”. Estas son las clonas (poblaciones de células idénticas todas descendientes de una sóla célula). Subsequentemente, las colonias individuales pueden tomarse de la caja de petri y las células pueden extenderse después en cultivo líquido. 4.- Aislamiento de clonas de ADN recombinante cosechando los cultivos celulares extendidos y aislando selectivamente el ADN recombinante.


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4.2 PURIFICACIÓN DEL ADN: ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Una consideración importante para obtener el ADN purificado es su enorme tamaño y la complejidad de las secuencias del ADN (comparada por ejemplo con la secuencia de proteínas). Las moléculas individuales de ADN nuclear contienen cientos de millones de nucleótidos. Cuando el ADN es aislado de las células usando métodos estándar, estas enormes moléculas se fragmentan mediante fuerzas, generando mezclas complejas de fragmentos de ADN todavía muy largos (aproximadamente de 50 a 100 Kb de largo). De acuerdo a lo anterior, ¿Cómo se pueden preparar poblaciones de ADN relativamente homogéneas a partir de mezclas complejas?. En el caso de ADN de células humanas y de una amplia variedad de células eucariontes complejas, el primer acercamiento fue separar las diferentes clases de fragmentos de ADN de acuerdo a la composición de las bases. La preparación de ADN fue sometida a ultracentrifugación en equilibrio de gradientes de densidad (por ejemplo; en gradientes de densidad de CsCl). Cuando esto se realizó, el ADN se fraccionó en una banda principal y en varias bandas menores de ADN satélite. Las especies de ADN satélite tienen diferentes densidades que el volumen principal de ADN debido a que tienen secuencias poco comunes y su composición de bases es diferente a la mayoría del ADN en las células (estas propiedades reflejan la participación del ADN satelite en aspectos específicos de la estructura y función de los cromosomas). Aunque valiosos e interesantes, los ADN satélite purificados corresponde, sin embargo, a un componente menor del genoma y no contiene genes. Para el estudio de los genes, se han desarrollado varios métodos para purificarlos. Debido a que los genomas de los mamíferos son complejos, cualquier gen específico o fragmento de ADN de interés representa normalmente solo una pequeña fracción del ADN total en una célula. Por ejemplo, el gen de la β-globina comprende únicamente 0.00005% de las 3300 megabases (Mb) del ADN genómico humano, y aún el gen más grande hasta ahora identificado, el gen de la distrofina de 2.5 Mb, cuenta con sólo el 0.08% del ADN genómico humano. Para seleccionar una fuente adecuada de ADN es importante saber el fragmento del gen que se pretende estudiar. Cuando la finalidad es conocer los mecanismos de regulación de transcripción del gen en estudio, entonces se desea clonar el ADN correspondiente a fragmentos no codificantes de un gen, conocidos como intrones. Cuando se pretende conocer la estructura completa de un gen, el investigador estará interesado en clonar los fragmentos del gen, tanto codificantes como no codificantes, es decir los exones y los intrones. Finalmente, cuando se quiere conocer la estructura primaria de una proteína, se necesita clonar únicamente los fragmentos codificantes del gen, es decir, los exones. En los dos primeros casos la fuente apropiada es el ADN genómico (cromosómico) porque contiene los genes completos. En el tercer caso, lo más apropiado es partir del ARN mensajero (ARNm) que representa únicamente las secuencias codificantes (exones).


La manera de obtener el ADN genómico es sencillo. Como todas las células de un individuo contienen el mismo ADN, se parte de células de fácil acceso, como los leucocitos en el caso del humano, mientras que en animales se parte de tejidos con alto contenido de ADN, como el hígado. Se realiza un extracto celular del cual, mediante precipitaciones con diferentes solventes, se separa el ADN genómico del resto del material celular. El siguiente paso es tratar el ADN genómico con enzimas de restricción para reducirlo a fragmentos manejables. La enzima más empleada es Sau 3ª por tener sitio de restricción de cuatro pares de bases, lo que asegura encontrarlo con frecuencia y por lo tanto, reducirá el ADN genómico en múltiples fragmentos. Figura 4.1 Modo de acción de las enzimas de restricción, se representa el reconocimiento de una secuencia específica y la generación de extremos “pegajosos”.

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La segunda fuente de ADN es un poco más complicada de obtener: la conocemos como ADN complementario (ADNc) por ser una copia en espejo del ARNm . En este caso la fuente de ARNm debe ser un tejido o línea celular que se sabe de antemano que expresa la proteína de interés. El primer paso es aislar el ARN del tejido o línea celular a partir de un homogeneizado celular mediante extracción con solventes. Después, se debe separar el ARNm de los otros tipos de ARN (ribosomal y de transferencia), lo que se logra al tomar ventaja de que toda molécula de ARNm tiene al final (extremo 3’) una cola de poliadeninas. Al pasar el ARN total por una columna de cromatografía con oligo-dT (fragmentos de


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polideoxitiminas unidas a la celulosa), el ARNm se queda “atrapado” en las columnas debido a que la cola de poliadeninas del ARNm se híbrida con la de polideoxitiminas del oligo-dT. Ya descartados el ARN ribosomal y el de transferencia, se separa el ARNm de la columna con una serie de elusiones que promueven la desnaturalización (separación) de las hebras de ácidos nucleares. Una manera de obtener las secuencias génicas es mediante el aislamiento del ARN total, o ARNm poly (A)+ a partir de células disponibles y convertir estas a ADN complementario (cADN) usando la enzima transcriptasa reversa. En algunos casos, esto puede resultar en el enriquecimiento profundo de secuencias de ADN exónicas cuando los genes relevantes se sabe que se expresan a niveles muy elevados en un tipo celular específico. En la mayoría de los caso, sin embargo, las secuencias génicas deseadas todavía representan únicamente una pequeña proporción del ADNc total de la población. 4.3 MANIPULACIÓN DEL ADN PURIFICADO Gracias al desarrollo de la Ingeniería Genética en los últimos 20 años, el ADN pasó de ser la molécula más difícil y complicada de estudiar, a ser la más fácil. Mediante la tecnología del ADN recombinante es posible manipular in vitro el ADN de manera tal que cada investigador puede estudiar un sinnúmero de aspectos en relación a su proteína favorita. La manipulación del ADN es el fundamento de las técnicas utilizadas en un laboratorio de Biología Molecular. Así, las endonucleasas de restricción son útiles para fragmentar el ADN en sitios específicos y obtener diversos genes. La ADN polimerasa sirve para sintetizar ADN in vitro que pueda posteriormente ser utilizado para clonación o bien secuenciación, con lo que se podrá conocer la secuencia de bases en el ADN y por lo tanto, la estructura primaria de la proteína. Con la transcriptasa reversa se puede sintetizar ADN a partir del ARNm, y así generar lo que se conoce como genoteca del ADN complementario, que representa el ADN que codifica para proteínas en un tejido o célula particular. Se puede marcar el ADN o ARN con métodos radioactivos o no radioactivos y generar una sonda que será útil para detectar ADN o ARN específico tanto en bloques (Southern y Northern blot) como en el tejido mismo (hibridación in situ). Con la reacción en cadena de la polimerasa podemos amplificar ciertos fragmentos de ADN y así, aunque sean muy escasos, poder detectarlos, clonarlos y modificarlos. Finalmente se puede trasladar el ADN a células extrañas con lo que se consigue clonar fragmentos de ADN o crear modelos de animales transgénicos. La tecnología del ADN recombinante comprende un conjunto de técnicas que son utilizadas en la manipulación del ADN, las más importantes son: 1.- El corte de ADN en sitios específicos mediante nucleasas de restricción, que facilitan enormemente el aislamiento y manipulación de genes individuales. 2.- La secuenciación rápida de todos los nucleótidos en un fragmento de ADN purificado, que hacen posible determinar las fronteras de un gen y la secuencia de aminoácidos que codifica.


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3.- La hibridación de ácidos nucleícos, que hace posible encontrar una secuencia específica de ADN o ARN con gran precisión y sensibilidad con base en su habilidad de unirse a una secuencia de ácidos nucleícos complementaria. 4.- La clonación del ADN, en la cual una sola molécula de ADN puede copiarse para generar muchos millones de moléculas idénticas. 5.- La Ingeniería genética, mediante la cual secuencias de ADN son alteradas para crear versiones modificadas de genes, los cuales son reinsertados de nuevo dentro de las células u organismos. Las moléculas de ADN recombinante son generalmente construidas usando la enzima ADN ligasa para unir dos moléculas de ADN con extremos cohesivos complementarios. Para la producción de una biblioteca de ADN, una de las dos moléculas de ADN a unirse es el vector, derivado de un plásmido bacteriano o virus, mientras que la otra es un fragmento de un cromosoma o una molécula de ADNc. Una molécula de ADN recombinante puede a su vez servir como un vector para la clonación adicional de moléculas de ADN, y la repetición sucesiva del procedimiento de clonación, una serie de fragmentos de ADN pueden ser reunidos extremo con extremo. De esta manera pueden generarse moléculas nuevas de ADN, las cuales son diferentes de cualquier molécula que ocurre naturalmente. 4.4 MULTIPLICACIÓN DEL ADN 4.4.1 Introducción de ADN a células La transformación es el fenómeno por el cual las células bacterianas adquieren nuevo material génico. Cuando el fenómeno se lleva a cabo en células eucariótica se denomina transfección. Una vez obtenido el ADN recombinante, el siguiente paso es introducirlo dentro de una célula huésped que le ofrezca la maquinaria necesaria para su autorreplicación. En el caso de los bacteriófagos y de los cósmidos, el proceso es relativamente sencillo: se empaqueta el ADN en fagos viables in vitro y se exponen a las células para ser infectadas en forma natural. En el caso de los plásmidos existen algunas estrategias para transformar bacterias. El procedimiento estándar consiste en mezclar bacterias con plásmidos en una solución de cloruro de calcio, exponerlas a un choque térmico (42°C) de 30 a 90 segundos de duración, y por razones, aún no claras, las células se vuelven momentáneamente permeables al ADN. Otra técnica útil por su alta eficiencia es la electroporación, que consiste en colocar a las células en una solución que contiene al ADN recombinante, y someterlas a pulsos eléctricos que causan aberturas o agujeros momentáneos en la membrana celular, permitiendo el paso del ADN recombinante al citoplasma. Para células eucarióticas existen además otras formas de transfección, como el uso de liposomas o la microinyección. De esta forma, las moléculas de ADN recombinante son transferidas dentro de la célula huésped en el cual un replicon seleccionado puede llevar a cabo la replicación independientemente de los cromosomas de la célula huésped.


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4.4.2 Células competentes La membrana plasmática de las células es permeable selectivamente y normalmente no admite moléculas grandes como fragmentos de ADN muy largos. Sin embargo, las células pueden tratarse de ciertas formas ( por ejemplo, por exposición a ciertas sales altamente iónicas, choques eléctricos, etc), para alterar las propiedades de permeabilidad de la membrana. Como resultado, una fracción de las células se vuelven competentes, esto es, son capaces de introducir ADN extraño del ambiente extracelular. Sólo un pequeño porcentaje de las células introducirá el ADN extraño, esto es una transformación de ADN. La célula toma únicamente una molécula de ADN, la cual se puede replicar muchas veces dentro de la célula. Esta es la base del paso de fraccionamiento crítico en la clonación de ADN, la población de células transformadas. Debido a que el ADN circular transforma mucho más eficientemente que el ADN lineal, la mayoría de la células transformadas contendrán productos circulares en vez de concatámeros de ADN recombinante lineal y si se hace un esfuerzo en suprimir la ciclización del vector, por ejemplo por defosforilación, la mayoría de las transformadas tendrán ADN recombinante. Entonces, las células transformadas se dejan multiplicar. En el caso de clonación usando vectores plásmidos y de huésped una célula bacteriana, una solución que contenga las células transformadas se siembra en la superficie de una caja de petri con agar, lo que resulta en la formación de colonias de bacterias que consisten en células clonadas. En general, cada bacteria puede ser transformada con una sola molécula de ADN recombinante (dos moléculas son tóxicas para la bacteria). Por lo tanto, las bacterias transformadas con una sola molécula de ADN recombinante empezarán a crecer y serán seleccionadas gracias a la resistencia al antibiótico que les confiere el vector. El resultado final es que cada clona de bacterias tendrá en su interior un tipo específico de ADN recombinante proveniente de una molécula ancestral. 4.4.3 Selección de recombinantes La identificación de las células que contienen la molécula del vector requiere la construcción y selección del vector que contenga un gen marcador cuya expresión ofrezca un medio para identificar a las células que lo contienen. Los dos sistemas génicos usados frecuentemente como marcadores se basan en los siguientes:

1) Genes de resistencia a antibióticos. Una cepa celular huésped se selecciona por su sensibilidad a un antibiótico en particular, con frecuencia a ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol. El vector correspondiente se construye de manera que contenga un gen que confiera resistencia al antibiótico. Después de la transformación, las células se siembran en agar que contenga el antibiótico para recuperar las células transformadas por el vector.

2) Complementación por el gen de la β-galactosidasa. La célula huésped es una mutante que contiene un fragmento del gen de la β-galactosidasa pero no puede producir una β-galactosidasa funcional. El vector se construye de


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manera que contenga un fragmento diferente del gen la β-galactosidasa. Después de la transformación por el vector, la complementación funcional ocurre resultando en una β-galactosidasa activa que puede evaluarse mediante la acción de una sustancia colorante, al Xgal (5-bromo, 4-cloro, 3-indolyl β-D-galactopirano), para generar un producto azul.

La identificación de células que contienen ADN recombinante involucra con frecuencia la inactivación insercional del gen marcador. La molécula vector se diseña de manera que tenga un sitio de clonación múltiple llamado también polilinker localizado entre el gen marcador. El número de nucleótidos, en la secuencia polilinker que contiene los sitios de clonación múltiple, es múltiplo de tres, de modo que su inserción en el gen marcador no resulta en alguna alteración en la traducción del marco de lectura. Como resultado de mantener el marco de lectura, y del pequeño tamaño del polilinker, la actividad del gen marcador se mantiene a pesar de la inserción del polilinker. Sin embargo, si el vector contiene el ADN recombinante insertado en medio del polilinker, la inserción resultante causa pérdida de expresión del gen marcador. En el caso de un gen marcador de la β-galactosidasa, la inactivación insercional significa que las células que contienen ADN recombinante no se tiñen o permanecen blancas en presencia de X-gal, mientras que las células que contienen un vector no-recombinante son azules. Otro sistema de selección de recombinantes involucra el uso de genes supresores de tARN, genes mutantes de tARN que pueden reorganizar una señal normal de un codón de terminación y en respuesta, introducir un aminoácido en la cadena del polipéptido. Esto es posible debido a que la mutación en los genes tARN (con frecuencia genes tARNGlu o tARNTyr) resultan en una secuencia anticodón alterada que es complementaria a uno de los codones de terminación normales: UAA, UAG, y UGA. En estos sistemas, la célula huésped con frecuencia porta un gen marcador defectuoso que es diseñado para tener un codón de stop prematuro, resultando en un fenotipo que puede ser identificado fácilmente. Si el vector porta un gen tARN supresor que inhiba el efecto del codon de terminación, la actividad del gen marcador se recuperará y el fenotipo silvestre se restaurará. Sin embargo, si el gen supresor tARN se inactiva por inactivación insercional, un fenotipo mutante se producirá de nuevo.

Si ya se tiene una sonda disponible que este muy relacionada al ADN recombinante deseado, las colonias que contengan el recombinante pueden detectarse directamente por hibridación.


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4.5 CLONACIÓN: VEHÍCULOS DE CLONACIÓN PARA E. COLI Y OTROS ORGANISMOS Vehículos de clonación Los vehículos o vectores se utilizan para clonación porque pueden seguir su desarrollo normal a pesar de que secuencias adicionales del ADN sean incorporadas en su material genético; se autorreplican utilizando la maquinaria de las bacterias, y en este proceso, no se mezclan con el ADN genómico de la bacteria. Existen tres tipos de vectores: los plásmidos que son fragmentos de ADN circular extracromosómico de las bacterias; los bacteriófagos o virus bacterianos y los cósmidos que son combinaciones entre plásmidos y bacteriófagos. La desición de cual utilizar depende principalmente de la longitud del ADN que se pretende clonar. Los plásmidos aceptan insertos de 0.1 a 6 kilobases (1Kb = 1,000 bases), los fagos de hasta 20 Kb y los cósmidos de hasta 45 Kb. Por tanto, los plásmidos sirven cuando se trata de clonar ADNc, mientras que los fagos y los cósmidos se utilizan más en el caso de ADN genómico. Existen vectores de clonación para hebras mayores de 50Kb conocidos como cromosomas artificiales de levadura (YACs del inglés yeast artificial chromosomes). Los tamaños de los fragmentos de ADN que se pueden obtener con los diferentes vectores de clonación se describen en la Cuadro 4.1. Los vectores contienen una región en la cual el ADN foráneo puede insertarse sin interrumpir ninguna función vital del vector. Esta región se conoce como sitio de clonación múltiple. La digestión del plásmido con una enzima de restricción, en el sitio de clonación múltiple, lo convierte en una molécula lineal que puede ligarse (en presencia de ADN ligasa) con ADN que tenga en los extremos las mismas terminaciones cohesivas, y así, formar un plásmido quimérico nuevamente circular. De esta manera, para clonar ADN, se necesita digerir el vector con la enzima de restricción para la cual los fragmentos de ADN tengan terminaciones cohesivas en los extremos 5’ y 3’, y después, ligar los fragmentos de ADN en el vector con ADN ligasa. El ADN recombinante obtenido podrá replicarse indefinidamente en la bacteria apropiada. Los vectores tienen además secuencias que les confieren resistencia a uno o dos antibióticos. Las bacterias transformadas se pueden seleccionar fácilmente de las no transformadas porque adquieren la capacidad de crecer en presencia del antibiótico. Además, la inserción de ADN foráneo interrumpe el gen para la β-galactosidasa y por eso en ausencia de inserción, las bacterias producirán colonias de color azul en presencia del sustrato galactosa, mientras que en los plásmidos con ADN foráneo (ADN recombinante), no habrá síntesis de β-galactosidasa y las clonas serán blancas en presencia de galactosa. Así, no solo es posible distinguir las bacterias transformadas por su capacidad de crecer en presencia del antibiótico, sino también, se puede saber por el color si tienen en su interior ADN recombinante o únicamente plásmidos no quiméricos. Finalmente, una ventaja de los vectores es que el sitio en donde queda el ADN foráneo está flanqueado por los promotores para la síntesis de ARN y por las secuencias de iniciadores universales para la síntesis de ADN. El vector plasmídico típico pUC18 (figura 4.1) posee un


tamaño de unas 269 Kb y contiene un origen de replicación que permite la replicación del ADN del plásmido en un alto número de copias en las bacterias, un marcador de resistencia a fármacos (resistencia a la ampicilina) para permitir la selección de las células bacterianas portadoras del ADN del plásmido y sitios que permiten la inserción de una secuencia de ADNc o ADN genómico. Cuadro 4.1 Tamaño de ADN que puede clonarse en los distintos vectores

Vector de clonación Tamaño del inserto Plásmidos con No. De copia alto estándar Bacteriófago λ de inserción Bacteriófago λ de sustitución Cósmidos Bacteriófago P1 PAC (cromosomas artificiales P1) BAC (cromosomas artificiales bacteriano)YAC (cromosomas artificiales de levadura)

0-10 Kb 0-10 Kb 9-23 Kb

30-44 Kb 70- 100 Kb 130-150 Kb

hasta 300 Kb 0.2 – 2.0 Mb

Figura 4.2 El plásmido pUC18 Uno de los vectores por excelencia para E. Coli es el fago lamda, λ. Para diseñar vectores de clonación λ apropiados, es necesario construir un sistema donde el ADN extraño pueda unirse al replicon de λ in vitro y para que el ADN recombinante resultante sea capaz de transformar células de E. Coli a alta eficiencia. Este último requerimiento se logra por el desarrollo de un sistema de empaquetamiento in vitro, que mimetiza la manera en la cual el ADN λ de tipo silvestre se empaqueta en una cubierta proteíca, resultando en alta eficiencia de infección.

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La atención en lo que respecta a vectores, también se ha centrado en los que poseen replicones con bajo número de copias, como el factor-F, que es un plásmido de fertilidad de E. Coli. El plásmido contiene dos genes, par A y par B, que mantienen el número de copias del factor F de 1-2 copias por célula de E. Coli. Los vectores basados en sistemas del factor-F son capaces de aceptar fragmentos de ADN extraños largos (> 300 Kb). Las recombinantes resultantes pueden transferirse con eficiencia considerable dentro de las células bacterianas usando electroporación. El bacteriófago λ es muy usado como vector de clonación del ADN. Los “brazos” izquierdo y derecho del fago codifican genes estructurales fágicos y así son indispensables para la replicación de este. Las secuencias de la región media del fago son indispensables y pueden eliminarse para permitir la inserción de ADN o ADNc específicos. Los extremos del fago λ también tienen secuencias cohesivas de ADN monocatenerio, los sitios COS que se necesitan para envasar el genoma fágico dentro de la partícula viral. Los fagos envasados se utilizan para infectar E. Coli y las células infectadas forman placas en una capa bacteriana. Las placas con fagos pueden ser transferidas a filtros de nitrocelulosa para que estos sean analizados por medio de sondas de ADN o ARN, (figura 4.4).

Figura 4.3 Fago lambda como vehículo para la clonación de ADN o ADNc.

4.6 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es un instrumento útil para analizar el nivel de expresión génica particularmente cuando se trata de genes de poca abundancia en donde la baja expresión en el northern blot complica la detección en los cambios de dicha expresión.

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El principio de la utilización de PCR se basa en dos posibilidades: la PCR cuantitativa y la semicuantitativa. En la primera se coamplifica el ARNm del gen de interés junto con un control interno que pueda medirse con presición y así utilizarse como guía de referencia para cuantificar el ARN de interés. Este procedimiento es muy utilizado en la cuantificación del ARN viral en casos de infecciones virales. En la PCR semi-cuantitativa se coamplifica el ARNm de interés junto con el ARNm de un gen de expresión constitutiva, como la actina, que permita comparar cuanto del gen de interés se expresa en relación con el gen control. La detección del producto amplificado se puede hacer mediante electroforesis o por cuantificación con centelleo líquido. En ambos casos, la PCR es útil para conocer cambios en la expresión de genes que estén en bajas cantidades. La PCR permite la amplificación masiva de secuencias de ADN específicas, logrando producir en el laboratorio millones de copias de un segmento del gen que se desea analizar y que se encuentra en muy bajas cantidades en el material clínico a investigar. La reacción tiene su fundamento en la unión de dos cebadores o iniciadores cortos, cada uno de ellos complementario a la secuencia de ADN flanqueante de la región a ser amplificada. Estos cebadores inician la síntesis de ADN por la acción de una enzima ADN polimerasa termoestable especial (polimerasa Taq). La nueva molécula de ADN bicatenario, que se compone de una cadena modelo y otra neosintetizada, es luego desnaturalizada a altas temperaturas. En este momento los cebadores se unen o alinean nuevamente y otra vez son alargados para sintetizar la nueva cadena por la ADN polimerasa Taq. La PCR se realiza en ciclos, cada uno compuesto de tres fases: Desnaturalización: El ADN se calienta hasta que se separan las cadenas sencillas, aproximadamente de 93°C a 95°C. Apareamiento o alineación: Las cadenas se aparean con el par de cebadores, que son oligonucleótidos sintéticos específicos, de los cuales uno es complementario al extremo 5’ del gen o fragmento de ADN que se desea amplificar y el otro se aparea con el extremo 3’ del mismo, pero en la cadena opuesta. La temperatura de alineación es de 50°C a 70°C dependiendo de la temperatura de fusión (Tm) del ADN dúplex esperado. Típicamente la temperatura de alineación ocurre aproximadamente 5°C por debajo de la Tm. Extensión: Los oligonucleótidos sintéticos actúan como iniciadores para que la ADN polimerasa termoestable sintetice a partir de los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTP) que usa como sustrato, las dos nuevas cadenas de ADN complementarias a las cadenas originales. La síntesis de ADN ocurre aproximadamente de 70°C a 75°C.


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Este ciclo de desnaturalización/apareamiento/extensión se repite de 25 a 40 veces, lográndose en cada ciclo doblar la cantidad del ADN blanco, lo que causa una amplificación logarítmica de la secuencia de ADN de interés (figura 6). El ADN a copiarse (templado) se coloca en un microtubo en presencia de buffer a pH 8.3; MgCl2 y los cuatro análogos de los nucleótidos que se incorporan al nuevo ADN (dCTP, dATP, dGTP y dTTP). Se agrega una escasa cantidad de polimerasa termorresistente Taq (extraída de la bacteria Thermus aquaticus) y las dos secuencias cortas de ADN (18 a 25 bases) que sirven como cebadores, uno en una cadena y el otro en la segunda cadena, y que por crecer en sentidos opuestos se denominan “sentido y antisentido”.

La mezcla de reacción preparada en el tubo, todavía sin reaccionar, se pone en una máquina de PCR o termociclador, el cual es un aparato que es capaz de calentar y enfriar rápida y repentinamente, en ciclos, los tubos. Las tres temperaturas que usa el aparato son generalmente: 96ºC para desnaturalizar el ADN, 55ºC para alinear y 72ºC para incrementar la longitud del nuevo ADN

Esta capacidad de amplificar una secuencia de ADN mediante PCR tiene su principal aplicación en la detección de mutaciones de trastornos genéticos conocidos y en la detección de ADN o ARN viral o bacteriano responsable de infecciones en muestras clínicas. Así mismo se la está aprovechando cada vez más en diversas técnicas de clonación molecular y para el análisis de la expresión de los genes. La PCR también se puede usar para modificar la secuencia precisa de un fragmento amplificado en otra secuencia a elección. Por ejemplo, si se hace que los extremos 5’ de los cebadores de la PCR contengan sitios para enzimas de restricción, entonces el producto final de la PCR estará flanqueado por esos sitios, lo que facilita enormemente su posterior clonación y manipulación. 4.7 ANÁLISIS DE SECUENCIAS A finales de los 70s se desarrollaron varios métodos que permiten la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN purificado. Estos métodos hicieron posible determinar la secuencia de ADN completa de miles de genes, incluyendo los que codifican para proteínas bien conocidas como la insulina, hemoglobina, interferon y citocromo c. El volumen de la información de la secuencia de ADN ya es tan grande (muchas decenas de millones de nucleótidos) que deben usarse computadoras para almacenar y analizar la secuencia. Los métodos químicos de secuenciación del ADN que se emplearon al principio usaban una modificación química específica de cada base con el subsiguiente corte del ADN. Actualmente, la mayoría de los métodos de secuenciación llevan a cabo un método enzimático: el ADN que se va a secuenciar se transforma a moléculas de cadena sencilla de donde la ADN polimerasa sintetiza nuevas hebras de ADN complementario. Las reacciones de secuenciación involucra la síntesis de ADN usando uno o más nucleótidos marcados y un iniciador de secuenciación universal que es complementario a la secuencia del vector flanqueando el sitio de clonación.


La síntesis de ADN se lleva a cabo en presencia de dideoxynucleótidos base-específicos (ddNTPs). Estos son análogos de los dNTPs normales con la diferencia de que carecen de un grupo OH en la posición del carbono 3 ‘ así como en el carbono 2’. Un dideoxinucleótido puede incorporarse en la cadena de ADN creciente mediante la formación de un enlace fosfodiéster entre el carbono 5’ y el carbono 3’ del nucleótido previamente incorporado. Dado que los ddNTPs carecen de un grupo OH 3’, cualquier ddNTP que se incorpore a la cadena de ADN creciente no puede participar en el enlace forfodiéster en su átomo de carbono 3’, causando así una terminación abrupta de la síntesis de la cadena.

Figura 4.4 Amplificación de ADN por PCR. En el ciclo se duplica el material genético presente al inicio del mismo, generándose de 25 a 30 ciclos entre 106 a 107 copias de la molécula inicial.

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Cuatro reacciones paralelas base-específica se llevan a cabo usando una mezcla de los cuatro dNTPs y también una proporción pequeña de uno de los cuatro ddNTPs. Al poner la concentración del ddNTP mucho menor que lo normal, la terminación de la cadena ocurrirá al azar en una de las muchas posiciones que contienen la base en cuestión. Por lo que cada reacción es una reacción parcial: la terminación de la cadena ocurre al azar en una de las posibles bases en cualquier cadena de ADN. Sin embargo, el ADN a secuenciar en una reacción de secuenciación es una población de moléculas idénticas. Como resultado, cada una de las cuatro reacciones específicas de base generará una colección de fragmentos de ADN marcado de diferente tamaño, con un extremo 5’ común pero extremos 3’ variables (el extremo 5’ común se define por la secuenciación del iniciador y los extremos 3’ que terminan con el ddNTP seleccionado son variables debido a la inserción del dideoxinuceótido que ocurre al azar en una de las muchas posiciones diferentes que aceptará la base específica. Los fragmentos que son diferentes en tamaño por un solo nucleótido pueden separarse en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Los fragmentos de diferente tamaño pueden detectarse incorporando grupos marcados en los productos de reacción, incorporando nucleótidos marcados, o usando un iniciador con un grupo marcado. La secuencia puede descifrarse, leyendo la secuencia de abajo hacia arriba del gel, una dirección que da la secuencia 5’- 3’ dela cadena complementaria del molde de ADN. 4.7.1 Gel de electroforesis La longitud y la pureza de las moléculas de ADN puede determinarse adecuadamente por los mismos métodos de gel de electroforesis que se usan en el análisis de proteínas, debido a que cada nucleótido en la molécula tiene una carga negativa. Para fragmentos de ADN de menos de 500 nucleótidos de largo, los geles de poliacrilamida diseñados especialmente permiten que las moléculas de diferente longitud, de hasta un solo nucleótido de diferencia, puedan separarse de cada una. Los poros en los geles de poliacrilamida, son tan pequeños para permitir el paso de moléculas de ADN muy grandes, que para separar estas por su tamaño se utilizan geles con más poros fromados con soluciones diluidas de agarosa. En los geles de agarosa, los fragmentos de ADN migran con una velocidad inmersamente proporcional a su tamaño, es decir, que los fragmentos pequeños corren con mayor rapidez (figura 4.2). Los fragmentos de ADN se mueven en un campo eléctrico simplemente porque poseen las abundantes cargas negativas de sus fosfatos, los cuales están colocados regularmente a lo largo de la cadena. El gel de agarosa, usado en concentraciones entre 0.2 y 3%, produce mallas de espacios menores cuanto mayor es la concentración.


A una concentración dada, los fragmentos de ADN más chicos sortean con más facilidad las mallas y avanzan más rápidamente hacia el ánodo (polo positivo) mientras los fragmentos más largos tardan más en atravesar las mallas, debido a que el ADN es una molécula relativamente rígida y con forma de filamento. De esta manera, en geles de agarosa es posible separar fragmentos de ADN entre 50,000 nucleótidos y 100-200 nucleótidos. Debido a su gran densidad de cargas negativas, el ADN corre rápidamente y las electoforesis pueden realizarse en menos de una hora según el voltaje aplicado.

Figura 4.5 Electroforesis en agarosa Una variante de gel de electroforesis en agarosa, llamado electroforesis de gel de campo pulsátil, hace posible separar moléculas de ADN aún más largas. El gel de electroforesis falla en separar esas moléculas debido a que el campo eléctrico constante las deforma por lo que viajan al primer extremo a través del gel en configuraciones de forma como de serpiente a una velocidad independiente de su longitud. En la electroforesis de campo pulsátil, por el contrario, la dirección del campo eléctrico se cambia periódicamente, lo que fuerza a las moléculas a reorientarse antes de continuar su movimiento en forma de serpiente a través del gel. Esta reorientación toma mucho más tiempo para moléculas más largas, por lo que se mueven progresivamente más lento. En consecuencia, aún cromosomas enteros de bacterias o de levadura se separan en bandas discretas en geles de campo pulsátil y así pueden acomodarse e identificarse con base en su tamaño. 4.7.2 Visualización Las bandas de ADN en geles de poliacrilamida o agarosa son invisibles hasta que el ADN sea marcado o teñido por algún método. Un método sensible de tinción de ADN es exponerlo a un colorante fluorescente, el bromuro de etidio, que se observa bajo luz ultravioleta cuando se intercala en el ADN. Un método de detección más sensible involucra la incorporación de un radioisótopo en las moléculas de ADN antes de la electroforesis, el fósforo 32 (P32), es el más utilizado porque puede incorporarse en los grupos fosfato del ADN y emite una partícula energética β, la cual se detecta fácilmente por autorradiografía.

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El procedimiento consiste, en que una vez terminada la electroforesis, se baña el gel en una solución muy diluida del colorante florescente bromuro de etidio, que se introduce entre las dos hélices del ADN y absorbe intensamente la luz UV a 300 nm, emitiendo una luz anaranjada. El gel teñido con bromuro de etidio y lavado se coloca sobre una fuente de luz UV (altamente dañina para la vista y la piel no protegidas) y los lugares donde se encuentran los fragmentos de ADN se visualizan como bandas anaranjadas que deben ser fotografiadas para conservar la documentación. Mediante este procedimiento se detecta hasta menos de un centésimo de µg de ADN, lo que representa entre 1 y 10 ng (nanogramos). 4.7.3 Estimación del tamaño La electroforesis, el procedimiento por el cual moléculas cargadas migran en un campo eléctrico, ha tenido amplias aplicaciones en el análisis de ácidos nucleícos. Debido a que la velocidad de migración en un gel de electroforesis está determinada por el tamaño de las moléculas y su carga eléctrica, es un herramienta apropiada para la identificación de muestras diferentes de ADN con el fin de estimar el tamaño de los fragmentos de interés. La velocidad de migración de las moléculas de ADN conforme migran a través de los poros en los geles de agarosa is inversamente proporcional a sus pesos moleculares. El tamaño de los fragmentos de ADN puede determinarse en la electroforesis al comparar las movilidades electroforéticas de varios marcadores de peso molecular conocido. Existen patrones de ADN de varios rangos de peso molecular , se debe aplicar el que comprenda el peso molecular esperado para el fragmento de ADN que se quiere determinar. Estos marcadores estándar deben ser tratados de manera similar a la muestra y deben estar en cada gel que se desee medir el tamaño de los fragmentos de ADN. Un marcador de pesos estándar de los más usados y conocidos es el ADN del fago λ digerido con la enzima de restricción Hindi. La secuencia completa del ADN del fago λ está bien conocida así como los tamaños de los fragmentos del ADN λ están bien determinados bajo la digestión con varias enzimas de restricción. 4.8 ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS DE EXPRESIÓN 4.8.1 Purificación de ARN Una alícuota de una cantidad conocida de ARN (habitualmente 5 a 20 mg de ARN por pocillo) se somete a electroforesis horizontal unidimensional en un gel de agarosa. El gel se corre por el tiempo necesario de acuerdo al tamaño del mismo, a bajo voltaje. Simultáneamente con las muestras corridas en el gel de electroforesis, se corre una muestra que contiene estándares de ARN o ADN de tamaños conocidos para posteriormente identificar el tamaño de los fragmentos de ARN obtenidos e hibridizados. El proceso de transferencia a una membrana de nailon es precedido de un lavado con una solución altamente concentrada en sales para eliminar el formaldehído y se procede a la transferencia por capilaridad que puede tener una duración de varias horas.


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Una vez transferido el ARN a la membrana de nailon, aquél debe ser fijado a la misma mediante horneo con altas temperaturas o anclaje con luz ultravioleta. Luego, se expone la membrana al análisis de Northern blot que incluye la síntesis de la sonda, la hibridación, los lavados y el revelado de la señal. La utilidad principal del Northern blot es para conocer cómo diversos estímulos pueden afectar la expresión de un gen al aumentar o disminuir el ARNm que codifica para este. La hibridación del ARN de un gen de interés con la sonda puede hacerse más específica al someter la reacción a la acción de las ARNsas. Este procedimiento permite no sólo visualizar los fragmentos hibridados sino además cuantificarlos. Para esto, se construyen sondas de ARN complementario anti-sentido mediante una reacción de transcripción in vitro. El ARN del tejido de interés se híbrida en una tubo de ensaye con la sonda marcada con radioactividad. Posteriormente, con la finalidad de digerir los fragmentos de ARN monocadena y en consecuencia no hibridados, se agrega a las muestras una solución con ARNsas. Una vez completado el ensayo de protección de ARNsas o hibridación en solución, las muestras se precipitan y se cuentifican mediante centelleo líquido o bien son corridas con electroforesis en un gel. De esta manera, la evidencia por imagen de que la cantidad de ARNm cambió puede determinarse mediante conteo de radioactividad con centelleo líquido. 4.8.2 Plásmidos de expresión Los plásmidos de expresión han sido modificados de tal manera que poseen un promotor muy activo, lo que provoca una producción inusualmente elevada de ARNm que producirá la síntesis del polipéptido en las células transformadas. Los vectores de expresión en E. coli permiten la producción de cantidades abundantes de proteínas de interés una vez que el ADNc que lo produce ha sido clonado. Uno de los sistemas de expresión más productivos emplea células modificadas de E. coli que expresan una gran cantidad de ARN polimerasa T7 en presencia del análogo de lactosa IPTG (Figura 4.6). Los vectores de expresión eucarióticos son empleados para producir proteínas que se modifican post-trasncripcionalmente, por ejemplo por la adición de carbohidratos o grupos fosfatos. Debido a que E. coli carece de enzimas que catalizen estas modificaciones, estas proteínas sólo pueden ser producidas en el interior de cálulas eucariotas.

Los clones de ADNc pueden ser trasncritos y traducidos in vitro, pero la producción de proteínas por lo general es menor que en los sistemas de expresión in vivo. La ventaja de la producción de proteínas in vitro es que la proteína de interés puede ser marcada radioctivamente durante la síntesis.


Figura 4.6 Producción de proteínas por medio de un plásmido de expresión. 4.8.3 Despliegue diferencial Un número importante de funciones celulares están reguladas a nivel transcripcional en mamíferos. Del conjunto de genes que forman el genoma de cada célula, una fracción de ellos se están transcribiendo activamente, se están expresando en unas condiciones fisiológicas concretas, mientras que otros muchos genes permanecen silentes. Entre los genes activos transcripcionalmente se encuentran un número importante de genes de expresión ubicua, que llevan a cabo funciones de mantenimiento celular y que se suelen expresar a niveles bastante uniformes, de modo constitutivo. Otro grupo de genes se expresa de manera específica en el tiempo y el espacio, siendo sus niveles de transcripción variables según el momento del desarrollo, tipo celular y condiciones fisiológicas. Es este último grupo de genes, inducidos, el más interesante a la hora de definir en términos moleculares la respuesta celular a cambios ambientales y por tanto el que ha focalizado la atención de los fisiólogos. Los niveles de expresión génica se pueden analizar a nivel proteico, midiendo la cantidad o actividad de producto génico producido, o bien a nivel de ARN mensajero (ARNm). Los niveles de ARNm de un gen concreto no dependen sólo del ritmo al que se transcriba, sino también de la vida media de la molécula, el ritmo a que se degrade.

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Por otro lado, la interfase ARNm-proteína, la traducción proteica, también puede estar regulada, haciendo que los niveles de ARNm no sean extrapolables a los niveles de proteína producida, pero no es lo mas frecuente. La tecnología del ADN recombinante hace mucho más fácil analizar niveles de ARNm que de proteína, por lo que se ha generalizado la medición de ARNm como indicador del nivel de expresión génica. En las últimas décadas se ha profundizado en los mecanismos de respuesta fisiológica midiendo los niveles de ARNm de uno o varios genes implicados en el proceso, utilizando herramientas como el “Northern blot”, el ensayo de protección con ARNasa, la RT-PCR o la hibridación in situ. Pero dada la complejidad de la célula de mamífero, este tipo de análisis, en serie, de uno o varios genes candidatos a jugar un papel en la respuesta estudiada conlleva una simplificación notable del problema. Por esto es que ha existido gran interés en analizar, en paralelo, respuestas ‘globales’ de los niveles de transcripción de todos los genes a un determinado cambio ambiental. Este interés en analizar el conjunto de ARNm presentes en la célula en un momento concreto (su ‘transcriptoma’), ha llevado a desarrollar varias herramientas para el estudio de la expresión diferencial, para averiguar qué genes se expresan más o menos en la situación experimental con respecto a la control. Es así que se han utilizado variantes de procedimientos de hibridación substractiva, despliegue diferencial (“differential display”), y análisis seriado de expresión génica (SAGE), que han contribuido notablemente a este conocimiento. Pero ha sido en los últimos años cuando se han dado dos avances importantes que han facilitado la generalización del análisis global de la expresión génica. Por un lado, el conocimiento del genoma humano y de organismos modelo como S. cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster o M. musculus hace que se disponga en la actualidad de colecciones de sondas moleculares capaces de detectar los niveles de expresión de cada gen en el genoma. Al mismo tiempo, se ha desarrollado nanotecnología que posibilita la colocación ordenada de miles de sondas moleculares en una superficie de uno o varios centímetros cuadrados. Estas micromatrices de sondas moleculares, conocidas como “DNA-microarrays” o “DNA-chips” se están fabricando en laboratorios comerciales y académicos. 4.8.4 Purificación y análisis de proteínas: análisis de aloenzimas, Norther blot, Southern Blot, Western Blot y ELISA Southern La hibridación molecular es uno de los pilares de la mayor parte de los procedimientos que se utilizan en un laboratorio de biología molecular. La hibridación se refiere al apareamiento específico que ocurre entre cadenas de ácidos nucleícos con secuencias complementarias: se lleva a cabo mediante la creación de puentes de hidrógeno entre las bases de ambas cadenas lo que mantiene la inestabilidad del ADN. Con este principio se han desarrollado una serie de procedimientos en el laboratorio en las que se aprovechan las propiedades de


apareamiento de bases de los ácidos nucleícos para hibridar ADN o ARN del tejido en estudio con un fragmento de ADN o ARN con secuencia conocida (denominado sonda) y marcado de manera tal que pueda detectarse con algún método colorimétrico o mediante autorradiografía.

TRATAMIENTO

AISLAMIENTO DE ARNm

RT-PCR CON UN PRIMER AL AZAR

ANÁLISIS POR GEL ELECTROFORÉSIS

Reprimido

inducido

RECUPERACIÓN Y CLONACIÓN DE LA BANDA

Figura 4.7 Esquema del proceso de “despliegue diferencial” de ARNm como respuesta a un estímulo. La primera de estas técnicas surgió en 1975 en que Southern describe una manera de transferir ADN, previamente desnaturalizado o fraccionado según su tamaño en un gel, a una mebrana de nylon en la que el ADN podía ser hibridado con una sonda específica y así detectar la secuencia deseada. Debido a que la transferencia de ADN del gel de agarosa a la membrana de nylon es por capilaridad, con el mismo principio utilizado por años para limpiar manchas con papel secante, el proceso es conocido en inglés como blotting; Southern propuso utilizar el término blot (secado) o blotting para referirse a esta técnica y actualmente se conoce como Southern blot.

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Por lo tanto, el southern sirve para detectar secuencias específicas de ADN en una membrana de nylon. El esquema de los pasos generales para el análisis de ADN por transferencia de tipo Southern se muestra en la figura 4.5. El ADN digerido con enzimas de restricción específicas puede ser fraccionado sobre la base del tamaño de los fragmentos mediante la electroforesis en gen de agarosa. Los fragmentos de ADN en el gel pueden transferirse a un soporte sólido como la nitrocelulosa, ya sea electroforéticamente o por medio de la transferencia de soluto a través del gel hacia la lámina de nitrocelulosa. Luego puede hibridarse el filtro con una sonda radioactiva que contenga una secuencia de ADN o ARN de interés, eliminarse la sonda no fijada y localizarse las posiciones de los fragmentos de ADN en el gel complementarios a la sonda por medio de la autorradiografía sobre película de rayos X.

Figura 4.8 Análisis de ADN por transferencia tipo Southern

Western La técnica en la que se utilizan proteínas en una membrana de nailon que se detectan con anticuerpos se le conoce como western blot. Este método está diseñado para la investigación sobre la expresión de proteínas usando extractos celulares que son fraccionados de acuerdo a su tamaño. Esto se logra por análisis de PAGE-SDS unidimensional, el cual es una forma de electroforesis en gel de

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poliacrilamida en el cual la mezcla de proteínas extraídas se disuelve primero en una solución de sodio duodecil sulfato (SDS, un detergente aniónico que rompe casi todas las interacciones no covalentes en las proteínas nativas). El Mercaptoetanol o ditiotreitol se agrega también para reducir los enlaces disulfuro. Después de la electroforesis, las proteínas fraccionadas pueden visualizarse por tinción con algún colorante (por ejemplo, azul de Comassie) o tinción con nitrato de plata. Los geles de dos dimensiones también pueden ser útiles: la primera dimensión incluye la migración isoeléctrica, que es la separación de acuerdo a un gradiente de pH, y la segunda dimensión, involucra que se fraccionen las proteínas por su tamaño mediante SDS-PAGE. En este caso, las proteínas fraccionada son transferidas a un pedazo de nitrocelulosa y luego expuestas a un anticuerpo específico.

Northern Esta técnica se basa en el fraccionamiento de los diferentes ARNs de acuerdo a su tamaño en un gel desnaturalizante de agarosa para posteriormente transferirlo a una membrana de nitrocelulosa o nailon sobre la cual puede ser hibridado con una sonda generalmente de ADN complementario (ADNc). Con este método, de entre todos los ARNs contenidos en la muestra, se puede determinar la presencia específica de uno de ellos, determinar su concentración y analizar su variación ente diferentes estímulos. ELISA Uno de los métodos más utilizados para la detección de proteína transgénica es el ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay). Como alternativa a este método, ha aparecido recientemente en el mercado un sistema llamado LFA (Lateral Flow Strip) cuya diferencia fundamental es el formato ya que la base es la misma: detección de proteínas usando anticuerpos específicos de la proteína de interés. Estas técnicas, que permiten cuantificar, están limitadas a alimentos no procesados, es decir, no sometidos a tratamientos que hayan podido destruir la mencionada enzima. Los análisis ELISA detectan o miden la concentración de proteína de interés en una muestra que puede contener numerosas proteínas distintas. Se utiliza un anticuerpo fijado a un soporte que se une específicamente a la proteína transgénica. Un segundo anticuerpo conjugado a un enzima genera un producto cuyo color es visible al añadir un sustrato determinado, y es fácilmente cuantificable mediante una curva patrónde la proteína de interés. Frente a la técnica PCR, los análisis ELISA presentan menor sensibilidad, siendo sin embargo por ello, menos susceptible a “falsos positivos”. Por otra parte, se necesita desarrollar previamente anticuerpos que reconozcan específicamente la proteína transgénica que se desee, por lo tanto no puede utilizarse este método como técnica de “screening”. La única limitación tecnológica para utilizar el método ELISA como análisis rutinario es que se debe de conocer qué proteína concreta se ha debido modificar en cada caso, y se deben desarrollar anticuerpos frente a esa proteína.


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4.9 BIBLIOTECA DE GENES 4.9.1 Identificación de genes Por muchos casos, la clonación de ADN se lleva a cabo para lograr simplemente la amplificación de un ADN integrado para obtener cantidades suficientes por una variedad de estructuras subsiguientes y estudios funcionales. Sin embargo, hay muchas circunstancias donde en vez de solo amplificar y propagar el ADN clonado se desea poder expresar el gen de alguna manera (clonación de expresión). En esos casos, las señales de expresión apropiadas necesitan estar en el sistema de clonación. Existe una gran variedad de sistemas de clonación que pueden usarse de acuerdo a lo siguiente:

1.- Al tipo de producto de expresión. Para algunos propósitos, sería suficiente poder obtener un producto de ARN. Los ejemplo incluyen la generación de sondas de ARN antisentido (ribosondas) para el uso en estudios de hibridación in situ, o generación de ARN antisentido para inhibir o destruir la expresión de genes específicos, tanto en estudios funcionales como para propósitos terapéuticos.

2.- Al tipo de ambiente. Algunas veces puede ser suficiente expresar el producto in vitro. Con frecuencia, se desea poder expresar el producto en un sistema celular particular, que puede ser una línea celular bien definida procarionte o eucarionte.

3.- Al propósito del sistema de expresión. El sistema de expresión puede diseñarse simplemente para investigar la expresión. En algunos casos, sin embargo, el propósito puede ser obtener grandes cantidades de un producto de expresión, así como la necesidad de generar grandes cantidades de una proteína específica para subsiguientes estudios de cristalografía o preparar anticuerpos específicos contra la proteína. La expresión de proteínas eucarióticas en bacterias puede usarse como un sistema blanco para tamizar con anticuerpos e identificar genes no caracterizados previamente. En estos casos, aún cuando no haya información sobre la secuencia codificante del gen en cuestión, la purificación parcial de un producto protéico puede permitir generar un anticuerpo específico. Filtros que contengan las colonias bacterianas individuales pueden tamizarse por exposición al anticuerpo. La bacteria que reaccione positivamente puede ser propagada para aislar la clona de ADNc, la cual puede a su vez puede emplearse en una genoteca para identificar genes relacionados. Cuando se requiere la producción de grandes cantidades de una proteina (por lo general extraña al huésped), y la producción a gran escala puede ser letal para el crecimiento de la bacteria, entonces se diseñan sistemas de expresión con promotores inducibles. La expresión del gen insertado puede activarse por exposición a un agente inductor y las células pueden ser cosechadas pronto. Una aplicación importante de este método es el diseño que permite la construcción de un anticuerpo especifico para un polipéptido eucariótico donde no se tiene ninguna información disponible. Entonces, se pretende preparar proteínas de fusión que consisten de un péptido aminoterminal codificado por una porción de un gen bacteriano, como el gen LacZ de E. coli, ligado al polipéptido eucariótico deseado.


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Las propiedades biológicas de muchas proteínas eucarióticas sintetizadas en las bacterias pueden no ser muy representativas de las moléculas nativas debido al procesamiento post-traduccional y al desdoblamiento incorrectos e ineficientes de la proteína. Como resultado, se ha hecho un esfuerzo considerable para expresar proteínas de mamífero preferentemente en células eucariónticas de mamífero. Los siguientes son los sistemas de expresión principales:

1.- Los que se diseñan para producir expresión estable del ADN transfectado; como los sistemas de expresión basados en células COS de mono, que se construyeron por transformación de células CV-1de riñón de simio con un genoma del virus SV-40 con un origen de replicación defectuoso.

2.- Los que incluyen el uso de vectores de expresión virales, como los

derivados de los virus SV40, adenovirus, de vaccinia, retrovirus y el baculovirus de insecto. Este último sistema de expresión es el más usado para la preparación de una proteína eucarióntica específica.

4.9.2. Localización del gen Cuando se parte de ADN genómico, o de una genoteca de ADNc, la transformación celular resulta en miles o millones de clonas con moléculas de ADN recombinante diferentes. El último paso, es localizar entre esos millones de clonas aquella o áquellas transformadas con el ADN recombinante del gen a estudiar. Las clonas se siembran en membranas de nylon o nitrocelulosa, a densidades de cientos o miles por membrana, sobre cajas de Petri con agar. Ya crecidas las clonas, se hacen copias en espejo con nuevas membranas que se utilizan para localizar la presencia y posición de la clona de interés. La forma más fácil y rápida de localizar una clona entre miles es por homología, o sea, si conocemos al menos parte de la secuencia. Cuando conocemos parte de la secuencia podemos sintetizar una sonda (fragmento de ADN o ARN con secuencia complementaria), marcarla con algún método radiactivo (32P-dCTP) o no radiactivo (digoxigenina-11-UTP), y utilizarla para localizar a una clona entre miles mediante hibridación del ADN en las membranas y autorradiografía de estas.

Otra posibilidad es que no se conozca la secuencia de bases o de aminoácidos de la proteína que le interesa clonar, pero por alguna razón ha podido extraer la proteína del tejido. En este caso, se generan primero anticuerpos, de preferencia monoclonales, en contra de la proteína y después, con dichos anticuerpos se analizan las membranas con las clonas. Se utiliza un vector de expresión, el cual permite a las bacterias no solo replicar el ADN, sino además traducir su código genético y sintetizar la proteína. La clona con el epítope apropiado será localizada por los anticuerpos. El ADNc identificado sirve de molde para sintetizar una sonda útil para localizar el resto del gen por homología.


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La tercera posibilidad es cuando no conocemos la secuencia de bases o de aminoácidos, ni tampoco se tiene aislada a la proteína, pero conocemos con cierto detalle la función de la proteína. En este caso, nos podemos guiar en la función para identificar el ADN recombinante que contiene dicho gen. La estrategia es transfectar células en forma permanente (por ejemplo, células COS) o transitoria (ovocitos de Xenopus leavis), con ADN recombinante de grupos de clonas y buscar manifestaciones de su función. Las positivas son las que fueron transfectadas con ADN recombinante que contiene el mensaje para la proteína de interés. A partir de ese momento se reduce progresivamente el número de clonas hasta llegar a una sola con el ADN recombinante que induce la función deseada. 4.9.3 Bibliotecas de ADN complementario Como la expresión de un gen puede variar en las diferentes células y en las diferentes etapas del desarrollo, el material inicial para construir bibliotecas de ADNc es generalmente el ARN total de un tejido específico o etapa de desarrollo específico de embriogénesis. De aquí, que un ARNm poli(A)+ puede seleccionarse por unión específica a un oligonucleótido complementario de cadena sencilla o polinucleótido unido a una matriz sólida. Por ejemplo, columnas de cromatografía que contienen puentes poli(U) a sefarosa o puentes oligo (dT) a celulosa son de los más usados: el ARNm poli(A) se une selectivamente al poli (U) o componentes oligo (dT) y subsiguientemente puede eluirse usando amortiguadores o soluciones iónicas de alta astringencia para disociar el puente de hidrógeno. El ARNm poli(A) aislado puede entonces convertirse, con transcriptasa reversa, a una copia de ADNc de doble cadena. Para fines de clonación, los oligonucleótidos linkers que tienen un sitio de restricción apropiado se ligan a cada extremo del ADNc. Las bibliotecas de ADNc tienen dos apreciables ventajas: 1) todos los fragmentos son copias de genes; 2) son específicas para el tipo de célula del cual se extrae el ARN de la genoteca. Los ARNm detenidos y purificados, se incuban con deoxinucleótidos y transcriptasa inversa, MgCl2 y un cebador o primer de polideoxitimidina con lo cual se copia la información del ARNm en una cadena complementaria de ADN. Luego de otros procedimientos es posible vehiculizar o clonar estos ADNc en bacterias, con lo cual se obtiene la genoteca de ADNc. Dado que cada ADNc es posiblemente idéntico a los exones de un gen, cada inserto de un plásmido en una genoteca de ADNc podría transcribir un ARNm y finalmente codificar un polipéptido. Para ello se usan los vectores o plásmidos “de expresión”, como el pUC19. Finalmente, una genoteca de ADNc es un conjunto de colonias de E. coli, cada una con un tipo de plásmido que contiene un inserto correspondiente a un ARNm.


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4.10 SECUENCIACIÓN DE ADN: POLIMORFISMOS En la actualidad es posible “secuenciar”, es decir, obtener la secuencia exacta de las bases de fragmentos cada vez mayores, ya sea manualmente o con dispositivos automáticos, y por lo general por el método de dideoxinucleótidos. Varios centenares de bases se pueden secuenciar manualmente en dos días. Al principio se desarrollaron dos métodos de secuenciación, el químico y el enzimático. Este último se ha convertido en el método estándar para la secuenciación del ADN y se basa en la síntesis in vitro del ADN en presencia de nucleósidos trifosfato de cadena terminal. Para estudios sobre la determinación de la estructura y función de genes es una prioridad inicial obtener la secuencia completa de ADNc. Una manera de lograr la secuenciación completa se ADNc es tamizar diferentes genotecas de ADNc y luego mapear la extensión de las sobreposiciones entre los insertos de las clonas positivas. Debido a la enormemente rápida proliferación de secuencias de ADNc en las bases de datos electrónicas es posible obtener secuencias de ADNc casi completas para un gen previamente no caracterizado.

La secuenciación por el método de Sanger de terminación de cadenas se vale de dideoxinucleótidos que pueden ser incorporados en cadenas de ADN en crecimiento pero que, una vez incorporados, impiden la ulterior prolongación de esa cadena de ADN. En esta reacción de secuenciado se divide en cuatro la muestra de ADN a secuenciar y se agrega a cada una un cebador o primer de oligonucleótidos radiomarcado que es complementario de un extremo de la cadena de ADN a ser secuenciada. Luego se alarga el cebador por acción de la ADN polimerasa en presencia de dNTP pero cada una de las cuatro muestras también contiene uno de los NTP en la forma didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). En condiciones adecuadas, esto produce una serie de moléculas de ADN de longitudes variables que pueden ser separadas en geles de acrilamida contiguos y expuestas a películas de rayos X. El patrón de las bandas del ADN pueden entonces usarse para determinar la secuencia del ADN (figura 4.7). 4.10.1 Gel retardado Esta técnica es alternativamente conocida como ensayo de desviación en la movilidad electroforética (EMSA, del inglés) y se basa en que la unión de una proteína a un fragmento de ADN disminuye o retrasa su movilidad en un gel de electroforesis (gel de retardamiento). Un fragmento de ADN de una clona genómica o un correspondiente oligonucleótido sintético, que se sospecha contenga secuencias regulatorias, es marcado en un extremo y luego mezclado con el extracto de una proteína. La preparación resultante se fracciona en un gel por PAGE en paralelo con una muestra control en la cual el ADN no está mezclado con la proteína. Los fragmentos de ADN que están unidos a proteína se identificarán como bandas de movilidad baja. Dado que el ADN es una molécula altamente cargada, puede haber la posibilidad para uniones inespecíficas.


4.10.2 ADN footprinting Una modificación del método químico para secuenciación de ADN puede usarse para determinar la secuencia de nucleótidos reconocidas por uniones de ADN-proteína. Algunas de estas proteínas participan en la determinación de genes que están activos en una célula en particular por unión a secuencias de ADN regulatorias, que generalmente están localizadas fuera de las regiones codifcantes de un gen. Para analizar cómo funcionan estas proteínas, es importante identificar las secuencias específicas a las que se une. Un método usado para este propósito en el ADN footprinting. Primero, un fragmento de ADN puro marcado en un extremo con P32 se aísla; esta molécula es luego fraccionada con una nucleasa o por un procedimiento químico que corte al azar cadenas sencillas en el ADN. Después de que la molécula del ADN se desnaturaliza para separar sus cadenas, los subfragmentos resultantes de la cadena marcada se separan en un gel y se detectan por autoradiografía.

Figura 4.9 Secuenciación por el método de Sanger 106


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El patrón de bandas del ADN cortado en presencia de un proteína unida a ADN se compara con el patrón de bandas de ADN cortado en su ausencia. Cuando la proteína está presente, cubre los nucleótidos en su sitio de unión y protege sus enlaces fosfodiéster de ser cortados. Como resultado, los fragmentos marcados que terminan en el sitio de unión se perderán, dejando una brecha en el patrón del gel llamada “footprint” o “huella de pisada”. Cuando una proteína se une específicamente a una secuencia de ADN, solo pocos nucleótidos del ADN están incluidos en el contacto ADN-proteína. La unión de proteína encuentra, sin embargo, al segmento de ADN en cuestión relativamente resistente al corte por deoxyribonucleasa pancreática I (ADNsa I), cuando se compara con ADN desnudo (Figura 4.8). Fragmentos cortos de ADN clonados (por lo general de unos cientos de bases de largo) se usan como blanco y se marcan únicamente en un solo extremo. Los fragmentos clonados se incuban individualmente en presencia o ausencia de un extracto de proteína ( por ejemplo, un extracto nuclear de células humanas HeLa) y luego expuestas brevemente a bajas concentraciones de ADNsa I. Esta condiciones de digestión parcial aseguran que para cualquier fragmento de ADN, cada molécula es cortada solo raramente y en una posición al azar si no está unida a proteína. Los productos de la digestión se fraccionan de acuerdo a su tamaño en geles largos de poliacrilamiada no desnaturalizante y luego resueltos por autorradiografía. Las muestras control mostraran una serie de bandas correspondientes a los fragmentos de ADN de cada longitud posible. Los carriles que se analizan revelarán brechas donde no se observan fragmentos o footprints, en los que la ADNsa I no fue capaz de cortar estas posiciones debido a inhibición estérica por unión a proteína.


Figura 4.10 La prueba de footprint con ADNsa I identifican secuencias de ADN específicas que interaccionan con proteínas.

4.10.3. Genes reporteros Además del estudio de la expresión génica, también es importante poder estudiar el control de la expresión génica. Una manera de identificar elementos regulatorios es usar un sistema de expresión génica artificial. Las células humanas son los sistemas más apropiados para el estudio de la expresión de genes humanos, pero esto deja el problema de cómo seguir la expresión de un gen humano tranfectado en presencia de un homólogo endógeno que puede expresarse en las mismas células. Por lo que se recomienda clonar las secuencias regulatorias en un vector que contiene un gen reportero “río abajo” del sitio de clonación. El gen reportero se diseña deliberadamente de manera que sea el único que no se encuentre en las células humanas y que pueda evaluarse fácilmente. Los genes reporteros más ampliamente usados son el gen CAT (cloranfenicol acetil transferasa,) bacteriano, derivado del transposon Tn9 de E. Coli, el gen β-galactosidasa y el gen de luciferaza de la libélula. La luciferasa tiene la ventaja de ser un ensayo muy sensible, porque cataliza la oxidación de liciferina con la emisión de luz verde-amarilla que puede detectarse fácilmente y a bajos niveles. La potencia de un promotor génico puede ser analizada mediante la transfección de “construcciones” informadoras para promotores.

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La transfección en células eucarióticas de vectores informadores de CAT trae como consecuencia la expresión del gen de la CAT, la cual puede ser investigada con facilidad midiendo la conversión de cloranfenicol- 14 C en cloranfenicol acetilado en presencia de extractos celulares transfectados. Si estos resultados son luego analizados por medio de cromatografía ascendente en capa delgada, la cantidad de cloranfenicol acetilado se puede cuantificar por autorradiografía. Los productos de la acetilación del cloranfenicol migran más rápido en el cromatograma (figura 4.9). En los sistemas de expresión artificial antes mencionados, el vector se construye para que la expresión del gen reportero se controle casi totalmente por las secuencias humanas introducidas “río arriba”. El producto construido gene reportero-vector se transfecta luego a células blanco cultivadas mediante métodos convencionales. Si todos los elementos necesarios se presentan por expresión del gen humano, altos niveles de expresión del gen reportero resultaran cuando el producto construido sea transfectado en un tipo apropiado de células humanas en cultivo. Con frecuencia, el producto construido es simplemente transfectado en células HeLa, una línea celular bien establecida derivada de un carcinoma cervical humano. Sin embargo, si se sabe que el gen se expresa predominantemente en un cierto tipo de células, por ejemplo, hepatocitos, se recomienda usar una línea celular receptora apropiada, una línea celular de hepatoma en este caso. La transcripción de un gen es controlada por secuencias de ADN regulatorias que no son transcritas. Estas secuencias determinan qué células expresarán el gen y bajo qué condiciones. En eucariontes superiores estas secuencias regulatorias pueden localizarse muchos miles de pares de bases “río arriba o abajo” de las secuencias transcritas, y actúan en combinaciones para controlar la transcripción génica. Las secuencias regulatorias de ADN pueden identificarse para cualquier gen en particular mediante una manipulación que involucra sustituir parte de la secuencia codificante de un gen con una secuencia codificante diferente, llamada secuencia reportera, seleccionada porque la proteína que codifica puede detectarse fácilmente por simple tinción citológica o ensayo enzimático. Las secuencias regulatorias para el gen de interés pueden identificarse uniendo la secuencia reportera a varios fragmentos o secuencias de ADN tomadas de los sitios “río arriba o abajo” del gen.

Cuando estas moléculas de ADN recombinante se usan para transfectar células, el nivel, duración y especificidad celular de la producción de la proteína reportera reflejará la acción de las secuencias regulatorias que cada ADN recombinante tiene.


Figura 4.11 Prueba del gen reportero de cloranfenicol acetiltransfersa (CAT)

4.10.4 Análisis por delección Otra forma de estudiar el control de la expresión génica es analizando cómo diferentes fragmentos delecionados del ADN “río arriba” del gen u ocasionalmente en el primer intrón, afectan la expresión génica. Una serie de construcciones de deleción progresiva se puede hacerse usando la enzima exonucleasa III de E. coli que está inactiva en el ADN de cadena sencilla pero progresivamente corta el extremo 3’ en el ADN de doble cadena. Esto permite el mapeo de secuencias que controlan la expresión génica.

Alternativamente, se puede diseñar una serie de productos de amplificación por PCR, que cubran las regiones de interés y luego clonarlas en un vector de expresión apropiado. El análisis por deleción arroja sólo una indicación general de la localización de una secuencia que regula la expresión génica. Debido a que estas secuencias de control pueden unirse específicamente a proteínas regulatorias, una manera de identificarlas es el tamizaje de secuencias que se unen específicamente a proteínas. Esto incluye el uso de oligonucleótidos sintéticos correspondientes a secuencias de una región que contenga una secuencia regulatoria. 4.6 BIBLIOTECA DE GENES Los procesos modernos de clonación de ADN ofrecen la posibilidad de realizar amplias colecciones de clonas de ADN conocidas como bibliotecas de ADN, de poblaciones de ADN extremadamente complejas, como por ejemplo, el ADN

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genómico total humano. Este procedimiento permite que secuencias de ADN que son muy raras en la población inicial estén representadas en una biblioteca de clonas de ADN, en cuanto puedan ser aisladas individualmente por selección de una colonia celular huésped y amplificándola. Dos variedades básicas de este método son las que se ejecutan comúnmente: la construcción de bibliotecas de ADN genómico y bibliotecas de ADNc. Bibliotecas de ADN genómico. Si el ADN de un organismo es sometido a la acción de una enzima de restricción, se forman numerosísimos fragmentos con un grado de repetición determinado por el número de células usado para preparar el ADN. Esos fragmentos pueden ser ligados a un vector tratado con la misma enzima, de forma tal que se produce una colección de moléculas de vector que llevan todos los tipos de fragmentos; esta colección se llama genoteca genómica. En el caso de eucariontes, como los mamíferos, todas las células nucleadas tienen esencialmente el mismo contenido de ADN y con frecuencia es conveniente preparar una biblioteca genómica a partir de células fácilmente accesibles, como células sanguíneas. El material inicial es ADN genómico que ha sido fragmentado previamente, por algún método, por lo general digestión con una enzima de restricción. Típicamente el ADN se digiere con una enzima que corte 4 pb como la MboI que reconoce la secuencia GATC. Esta secuencia esta presente aproximadamente cada 275 pb en promedio sobre el ADN genómico humano, así que habrá pocas secuencias de ADN que carecen del sitio de reconocimiento para esta enzima. Claramente, la digestión completa del ADN inicial con esta enzima producirá fragmentos muy pequeños. Además, el número de cortes puede acortarse bajo condiciones de restricción parcial (baja concentración de enzima, tiempo corto de incubación, etc.). El corte ocurrirá solamente en un pequeño número de sitios de restricción potenciales. Esto tiene el beneficio de que da la capacidad de producir grandes filamentos para clonación. Importantemente, también permite fragmentación al azar del ADN. Entonces, para la localización de una secuencia específica, el patrón de restricción será diferente en copias diferentes de la misma secuencia de ADN inicial. La fragmentación al azar asegura que la biblioteca contenga mucha representación del ADN inicial como sea posible. Adicionalmente, tiene la ventaja de que resulta en clonas con insertos sobrepuestos. Como resultado, después de la caracterización del inserto de una clona, se pueden hacer ensayos para llegar a las clonas de la misma región general, identificando aquellas con insertos que muestran algunas similitudes a la de la clona original. Las genotecas genómicas son colecciones de fragmentos de ADN presentes en colecciones de plásmidos o de fagos, que a su vez están contenidas en cultivos bacterianos. Materialmente esa genoteca es un conjunto de cajas de Petri (20 o más) con cultivos, donde cada colonia contiene un fragmento de ADN. La


genoteca también puede estar representada por improntas de cada cápsula, hechas en una membrana, o por un único cultivo donde están mezcladas colonias de bacterias conteniendo diferentes fragmentos. La cantidad de ADN usada para crear la genoteca debe ser bastante mayor que un genoma para descontar las fallas en las distintas etapas. Se considera que con 1/10 de mg de ADN (100 µg) es factible hacer una genoteca genómica. 4.11 APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 4.11.1 Medicinas génicas

Figura 4.12 Esquema de un proceso de producción de vacunas recombinantes

a) Obtención de proteinas de mamíferos Una serie de hormonas como la insulina, la hormona del crecimiento, factores de coagulación, etc. tienen un interés médico y comercial muy grande. Antes, la obtención de estas proteínas se realizaba mediante su extracción directa a partir de tejidos o fluidos corporales.

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En la actualidad, gracias a la tecnología del ADN recombinante, se clonan los genes de ciertas proteínas humanas en microorganismos adecuados para su fabricación comercial. Un ejemplo típico es la producción de insulina que se obtiene a partir de la levadura Sacharomyces cerevisae, en la cual se clona el gen de la insulina humana. b) Obtención de anticuerpos monoclonalesEste proceso abre las puertas para luchar contra enfermedades como el cáncer y diagnosticarlo incluso antes de que aparezcan los primeros síntomas. c) Obtención de vacunas recombinantesEl sistema tradicional de obtención de vacunas a partir de microorganismos patógenos inactivos, puede comportar un riesgo potencial. Muchas vacunas, como la de la hepatitis B, se obtienen actualmente por ingeniería genética. Como la mayoría de los factores antigénicos son proteínas lo que se hace es clonar el gen de la proteína correspondiente.

4.11.2 Plantas trasgénicas Mediante la ingeniería genética han podido modificarse las características de gran cantidad de plantas para hacerlas más útiles al hombre, son las llamadas plantas transgénicas. Las primeras plantas obtenidas mediante estas técnicas fueron un tipo de tomates, en los que sus frutos tardan en madurar algunas semanas después de haber sido cosechados

a) Resistencia a herbicidas, a insectos y a enfermedades microbianas Ya se dispone de semillas de algodón, que son insensibles a herbicidas. Para la resistencia a los insectos se utilizan cepas de Bacillus thuringiensis que producen una toxina (toxina - Bt) dañina para las larvas de muchos insectos. b) Incremento del rendimiento fotosintético Para ello se transfieren los genes de la ruta fotosintética de plantas C4 que es más eficiente. c) Mejora en la calidad de los productos agrícolas Tal es el caso de la colza y la soja transgénicas que producen aceites modificados, que no contienen los caracteres indeseables de las plantas comunes. d) Síntesis de productos de interés comercial Existen ya plantas transgénicas que producen anticuerpos animales, interferón, e incluso elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos biodegradables e) Asimilación de nitrógeno atmosférico Aunque no hay resultados, se ensaya la transfección del gen nif responsable de la nitrogenasa, existente en microorganismos fijadores de nitrógeno, y que permitiría a las plantas que hospedasen dicho gen, crecer sin necesidad de nitratos o abonos nitrogenados.


Figura 4.13 Se utiliza a la bacteria Agrobacterium tumefaciens como vector de los genes que se desean introducir en una célula vegetal, con lo que se transforma dicha célula, la cual puede regenerar, por micropropagación, una planta entera que será transgénica. 4.11.3 Animales transgénicos Entre las aplicaciones de los animales transgénicos se pueden destacar: la posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulación, manipular de forma específica la expresión génica in vivo, estudiar la función de genes específicos, poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la producción de proteinas humanas y la corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia génica. a) Transferencia nuclear Se toman células embrionarias en fase de mórula o blástula, obtenidas por disgregación, se cultivan in vitro, y después se transfieren a ovocitos a los que se les ha quitado el núcleo. Se provoca la fusión de las dos células animales de modo que el núcleo de la célula embrionaria quede en el interior del ovocito, pudiendo éste empezar a funcionar como un zigoto. b) Introducción de ADN extraño en células embrionarias totipotentes (células ES) o células embrionarias madres (células EM) Estas células se toman del interior de la blástula en desarrollo y se pasan a un medio donde se tratan con distintos productos con lo que se conseguirá que las células no se diferencien, y se mantiene su estado embrionario.

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Figura 4.14 Cerda Genie, que fabrica en su leche la proteina C humana que controla la coagulación sanguínea y es necesaria para los hemofílicos.

4.11.4 Microorganismos modificados genéticamente La introducción de ADN foráneo en un microorganismo da lugar a los microorganismos transgénicos. La mayoría de microorganimos transgénicos son bacterias unicelulares o levaduras. Las bacterias y levaduras transgénicas se usan principalmente en la industria alimentaría, en la producción de aditivos alimentarios, aminoácidos, péptidos, ácidos orgánicos, polisacáridos y vitaminas. También se han aplicado en procesos de bioremediación y, en medicina, se emplean ampliamente para producir proteínas de interés como por ejemplo, la insulina.

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Fabricar un transgénico unicelular es más fácil que producir una planta o animal transgénico, ya que en éstos hay que asegurar la presencia del nuevo ADN en todas las células del organismo.


Figura 4.15 Introducción de células embrionarias a blastocitos receptores. Para desarrollar una bacteria transgénica, el gen de interés se incorpora en un plásmido (ADN circular extracromosómico capaz de autoreplicarse) y se incuba junto con la bacteria bajo condiciones específicas que favorecen la entrada del plásmido en el interior de la bacteria. Si la bacteria retiene el plásmido y la proteína que expresa el gen de interés no resulta tóxica para su desarrollo, se obtiene una bacteria transgénica, con nuevas características determinadas por el gen introducido. La bacteria más utilizada es la Escherichia coli. No obstante y a pesar que su fácil manipulación, las bacterias no son siempre la mejor elección para producir proteínas humanas. Algunas de éstas no son funcionales si no están glicosiladas, es decir, si no se añaden azúcares a la cadena de aminoácidos, y este proceso no lo pueden llevar a cabo las bacterias. En estos casos se utilizan levaduras transgénicas, que sí son capaces de glicosilar. La producción de levaduras transgénicas implica también el empleo de plásmidos, siendo la levadura Saccharomyces cerevisiae la especie más empleada.

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Aplicaciones de los microorganismos transgénicos Investigación Los microorganismos transgénicos son una herramienta de fundamental importancia en investigación. La introducción en bacterias de plásmidos que contienen un gen concreto a estudiar se realiza de forma rutinaria en los laboratorios, ya sea con el objeto de tener un stock de dicho gen (mediante el crecimiento de colonias que permiten tener gran cantidad de células que lo contienen) o para expresar una proteína de interés. Estas bacterias transgénicas ayudan a los científicos a entender mejor algunos procesos bioquímicos, la regulación de genes y su función. Producción de proteínas en medicina Como ya se ha comentado, se han desarrollado bacterias E.coli capaces de producir insulina humana, imprescindible para pacientes diabéticos. Antes del empleo de bacterias transgénicas, la insulina se obtenía de vacas y cerdos, pero, como su estructura difería ligeramente de la variedad humana, en algunos casos provocaba una reacción alérgica. Las bacterias transgénicas han eliminado este problema. Asimismo, la levadura Saccharomyces cerevisiae se ha modificado genéticamente para obtener insulina humana. También se han desarrollado bacterias transgénicas para producir la hormona del crecimiento, que se emplea para tratar a niños con enanismo. Otros usos en medicina de los microorganismos transgénicos son la producción de vacunas, anticuerpos, etc Bioremediación Existen microorganismos capaces de utilizar como nutrientes compuestos tóxicos o peligrosos, como hidrocarburos, detergentes, bifenilos policlorados, etc, de forma que su metabolismo los convierte en productos inocuos para el medio ambiente. El empleo de organismos vivos para degradar residuos se conoce como bioremediación. La mayoría de aplicaciones biotecnológicas aplicadas al medio ambiente utilizan microorganismos naturales, pero se están desarrollando microorganismos transgénicos para eliminar materiales difíciles de degradar. Por ejemplo, bacterias Pseudomonas transgénicas son capaces de degradar compuestos polihalogenados. La investigación en este campo busca los enzimas presentes en microorganismos naturales que son eficientes en el tratamiento de compuestos tóxicos y determinar como pueden mejorarse mediante ingeniería genética. Industria alimentaria Los microorganismos modificados genéticamente se emplean en la industria alimentaria para producir aditivos alimentarios como edulcorantes artificiales y aminoácidos con el propósito de incrementar la eficiencia y reducir su coste. Otros productos de estos microorganismos son enzimas recombinantes que se emplean en panadería, producción de cerveza, producción de queso (por ejemplo, quimosina). También se aplican en procesos de fermentación, como por ejemplo el empleo de levaduras transgénicas para desarrollar el sabor y aroma en la industria de la cerveza.


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Solari A.J. Genética Humana. Fundamentos y aplicaciones en Medicina. Editorial Médica Panamericana. 1996. p 24 2. Carnevale A. y Sánchez-Torres G. Genética y Biología molecular en Cardiología. Preludios del XVIII Congreso Nacional de Cardiología. Sociedad Mexicana de Cardiología. 1993. p 87. Innis A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., y White T.J. PCR protocols. A guide to Methods and Applications. Academic Press, inc. San Diego.1990 p472. Strachan T y Read A. Human Molecular Genetics. Second Ed. Wiley-Liss. 1999. 576p. Cox T y Sinclair J. Biología Molecular en Medicina. Editorial Médica Panamericana. 1998. 366p. Guizar-Vázquez J. Genética Clínica. Diagnóstico y manejo de las enfermedades hereditarias. Editorial El Manual Moderno. 2001. 984p. Lewin B. Genes VIII. Oxford University Press. 2000. 990p Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K. y Watson J. Molecular Biology of the Cell. 3ra edición. Garland publishing. 1994. 1294p