Download pdf - Bioluminescencja Kk

5/16/2018 Bioluminescencja Kk - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/bioluminescencja-kk-55ab562abec09 1/40

BIOLUMINESCENCJA

światło życia

Targi Akademia, Gdańsk, 19 marca 2012

Dr hab. Karol Krzymiński



Bioluminescencja…

czyli o zwierzętach które świecą



Bioluminescencja i chemiluminescencja

Utleniona lucyferyna wstanie wzbudzonym

BIOLUMINESCENCJA

Lucyferyna w staniepodstawowym

Lucyferaza

Utleniona lucyferyna w staniepodstawowym

BL

Energia z procesu utleniania

Utlenione cząsteczki wstanie wzbudzonym

CHEMILUMINESCENCJA

Cząsteczki w staniepodstawowym Utlenione cząsteczki w

stanie podstawowym

CL



lucyferyna

+ O2lucyferaza

oksylucyferyna

+

hν

BL: schemat procesu

• Etapy BL: Białko lucyferaza katalizuje utlenianie lucyferyny

tlenem z powietrza.

W wyniku reakcji powstaje nieaktywna formalucyferyny oksylucyferyna i wytwarzane jest

światło.



oxylucyferynaucyferyna

+ O2

Ca2+

Ca2+

Ca2+

fotoproteinapoproteina

+ hν

BL: Fotoproteiny

• Fotoproteiny: specyficzny układ chemiczny tworzący wobecności tlenu kompleks lucyferyny i katalizującegobiałka.

• Kompleks uwalnia lucyferynę w rezultacie wiązania

jonów wapnia dostępnych w układzie.



BL morska i lądowa

Około 2/3 organizmów w górnych 2000 metrach wód

oceanicznych luminezuje

Bioluminescencja nie jest zbyt rozpowszechniona wekosystemach lądowych.

BL organizmów lądowych

BL organizmów morskich

Przyczyna ?

Poziom morza/ nm

Głębokość czerwony

żółty

zielony

niebieski



Organizmy oceaniczneA B C D

E FG

H

I

J

K L

MN

O P

Q R S T

A. Bakterie morskie z rodziny Vibrio

B. Radiolarie przybrzeżne

C. Meduza Aequorea victoria

D. Syfonofory Erenna sp .

E. Wieloszczet Tomopteris

F. Larwa planktonu Ptychodera flava

G. Meduza Aequorea coerulescens

H. Kałamarnica Vampyroteuthis

I. Pałka wodna Caecosagitta macrocephala

J. Żebropław Beroe forskalii

K. Kałamarnica Abraliopsis sp .

L. Beroe forskalii , emisja światła

M. Kryl Thysanoessa sp .

N. Ryba-wędkarz Chaenophryne longiceps

O. Ostryga Conchoecia sp

P. Ryba-topór

Q. Kopepod Gaussia princeps

R. Ryba-lampa Myctophid

S. Ryba Tactostoma sp . w białymświetle

T. Ryba Tactostoma sp . z widocznymfotoforami

Zdjęcia: S. Haddock



Bakterie

Bioluminezujące bakterie morskie to organizmysymbiotyczne (np. Vibrio )



Kałamarnice

Teuthowenia pellucida Kałamarnica „szklana”

Vampyroteuthis swój odstraszającywygląd zawdzięcza organomemitującym promieniowanie

znajdującym się na ramionach.

Bioluminezującakałamarnica głębinowa.Wyposażona jest wspektakularne fotofory(tkanki emitująceświatło), które mogąwyrzucać na zewnątrzluminezujące chmury.

http://www.imagequest3d.com/cgi-bin/ImageFolio3/imageFolio.cgi?img=&search=HITS&cat=&bool=



Ośmiornice

Rzadkie gatunki bioluminezujące

Fotofory: organy, w którychgenerowane jest światłowyewoluowane z wypustek

pokrywających każde ramię.

Wykorzystanie: wabienie ofiary,imitacja świecenia innych

organizmów

Bardzo spektakularna! Stauroteuthis Syrtensis



Ryby głębinowe

Chaenophryne longiceps, ryba-wędkarzwykorzystuje symbiozę z bakteriami w

celu wytwarzania światła

Ryby-lampy z posiadającharakterystyczne dlaróżnych gatunków fotofory.

Myctophids są popularne naśrednich głebokościach imigrują w nocy w kierunku

powierzchni.

Myctophid

Angler fish



Organizmy lądowe

Chrząszcze (robaczki świętojańskie) Robaki i dżdżownice (np. robak kolejowy)



Inne

- Grzyby/Fungi

- Bakterie

Organizmy lądowe BL lądowa obejmuje szeroki zakres kolorów, w

przeciwieństwie do BL morskiej.

Opieńka miodowa grzyb Panellus stipticus



Geografia BL

Okolice wyspy Vigues (PuertoRico sfotografowane przez satelitę

• Tak zwana "fosforescencja" wody jest obserwowana we wszystkich oceanach -szczególnie często w zatokach i wśród raf koralowych.

• Zatoka Bioluminescencji (Bioluminescent Bay ): widowiskowa luminescencjadinoflagellatów (> 200 tyś glonów / 1 litr wody!)



Funkcje biologiczne BL

Wabienie

(przyciąganie)ofiary

Przynęta – światłozewnętrzne

Ogłuszenie lubzmylenie ofiary A T

A K

Oświetlenie ofiary

W A B I E N I E

Rozpoznanie/Przyciąganie osobnikaprzeciwnej płci LEGENDA:

Błysk Żarzenie Zdobycz Drapieżnik 1 Drapieżnik 2

„Ryba-wędkarz” prezentujeświecącą przynętę, abyzwabić ofiarę.

Inne drapieżniki mogą wabić

ofiarę imitując sygnałycharakterystyczne dla ofiary.



Fotofor dwubarwny u Aristostomias

- Wykorzystuje światło czerwone, a nie typoweniebiesko – zielone.

- Zastosowanie: Widzenie w ciemności bezuwidaczniania się ofierze / drapieżnikowi.

• Czarna ryba-smok ( Aristostomias)Jedna szczególnych rodzin ryb głębinowych wyposażona wewłasny "noktowizor" dający możliwość widzenia nocnego.



Fotofor dwubarwny u Aristostomias

• Pigment fluorescencyjny w fotoforze absorbuje promieniowanie zzakresu zieleni i reemituuje je jako światło żółto- czerwone (około600 nm). • Przed wydobyciem się do morza, światło jest jeszcze dodatkowofiltrowane, osiągając długości fal około 700 nm.

Filtr

fotocyty

reflektor

Obraz fluorescencyjny oka i fotofora u Aristostomias

Długofalowe pasmo emisyjne u Aristostomias



Funkcje biologiczne BLZaskoczenieprzeciwnika

Oświetleniekamuflujące

Tworzenie„zasłony dymnej”

Odwracanieuwagi

Podnoszeniealarmu

Kamuflaż u innegodrapieżnika

O B R O N A

Zmiennezabarwienieochronne(zniechęcanie nowych

osadników

LEGENDA:

Błysk Żarzenie Zdobycz Drapieżnik 1 Drapieżnik 2

Niektóre krewetki wyrzucają

luminezującą chmurę, aby zmylić

napastnika i zamaskować ucieczkę



Lucyferyna alg morskich

Lucyferynaglonówmorskich

Świeci zależnie od pH:

- pH 8: lucyferyna przyłączona dobiałka – brak możliwości świecenia

- pH 6: wolna lucyferyna możeuczestniczyć w wytwarzaniuświatła

• Lucyferyna występująca w glonachmorskich prawdopodobnie pochodziod chlorofilu, gdyż ma do niego

podobną strukturę.

Chlorofil

- Dinoflagellaty to organizmy jednokomórkowe (algi)

- Mają kształt wrzecionowatej świecącej komórki



O2 hv

NH HN

O

HN

O

HNHO2C

HO2C

HN

O H

O

R2

O

H

HN

O

R2

H2O

O

R1 R1

Procesowi jej utleniania tlenem cząsteczkowym (katalizator -lucyferaza) towarzyszy powstawanie diketonu i emisja światła

z zakresu niebiesko-zielonego (około 470 nm).

Lucyferyna alg morskich



Lucyferyna bakteryjna

• Najlepiej poznanegatunki:- Photobacterium phosphoreum - Photobacterium luciferum - Vibrio fischeri - Vibrio harveyi

• Lucyferyna bakteryjnajest zredukowanymfosforanem ryboflawiny(FMNH2).

bakterie, kałamarnice, niektóre ryby



Lucyferyna bakteryjna

Zredukowany mononukleotyd flawiny (FMNH2) przekształca się wobecności cząsteczkowego tlenu w pochodną peroksy.

Peroksyflawina reaguje z długołańcuchowym aldehydem, co dajefosforan ryboflawiny (FMN) wodę oraz odpowiedni kwas tłuszczowy.

Reakcji towarzyszy emisja niebiesko-zielonego światła (ok. 490 nm).

NH

N

NH

HN

O

P O

O

O

OH

HO

HO

O

O

C

O

R HO2 ,

HN

N

NH

N

O

O

R2

R1

R3

O

O

C R

H

HO

H2O

N

N

NH

N

O

O

R2

R1

R3

RCO2H hv

FMNH2 FMN



KoelenterazynaRadiolarie, ctenofory, kałamarnice, widłonogi, krewetki Decapod,

strzałki wodne (Chaetognatha), meduzy

• Koelenterazyna należy do najbardziej "popularnych” i poznanychlucyferyn morskich (bratki morza Renilla , meduzy Aequorea ).

• Cząsteczka tego typu jest emiterem promieniowania fotoproteiny o

nazwie akworyna.



Koelenterazyna

N

N N

O

HO

OHH

O2

R1 N

N

R2

NH

OH

O

O

O

CO2

R1 N

N

R2

NH

OH

O

+ hv

• Pierścień imidazolopirazynowy jako centralny układbicykliczny.

• Utlenianie pierścienia imidazolopirazyny jest związane zemisją światła niebieskiego (460480 nm).

• Cykl przemian podobny do utleniania lucyferyny świetlika.



Lucyferyna chrząszczy Robaczki świętojańskie (Lampyridae)

• Lucyferyna robaczków świętojańskich wymaga oprócz

enzymu lucyferazy, obecności ATP jako katalizatora reakcjiluminogennej.

• Jest najlepiej zbadaną lucyferyną, stosowana jako

biowskaźnik obecności ATP.

L f h



+

Lucyferyna chrząszczy

LF: enzym lucyferaza

OL: oksylucyferyna

LFH2: zredukowanalucyferyna

PP: pirofosforan

OL*: wzbudzonaoksylucyferyna

1

2



B. Od atomu węgla C-4 koniugatu LFH2AMP…LF odrywany jest proton z udziałemłańcucha bocznego reszty aminokwasowej lucyferazy.

Mechanizm BL: lucyferyna świetlika Mg2+

LF + LFH2 + ATP LFH2AMP…LF + PP

HO

N

S N

S

CO2H

HATP-Mg2+ HO

N

S N

S

C

H O

O PO

O

O

N

N

N

N

NH2

O

OHOH

HH

HH

PO

P O

O

OO O

O

+

LH2LH2-AMP

PPi

A

LFH2 LFH2-AMP

PP

HO

N

S N

S

CO

O P

OH

O

O

N

NN

N

NH2

O

OHOH

HH

HH

C-4

B

A. Tworzenie kompleksu LFH2AMP…LF



Mechanizm BL: lucyferyna świetlika

HO

N

S N

S

CO

O P

OH

O

O

N

NN

NNH2

O

OHOH

HHHH

O2O O

CO

N

S N

S

O O

CO + AMP

O2

D

C. Określone reszty aminokwasowe lucyferazy promują addycjęcząsteczki tlenu do złożonego anionu.

D. Dioksetanon – wysokoenergetyczne indywiduum pośrednie

- dostarcza ok. 250 kJ mol1 energii

C O

C O

C O

C O

C O

C O

C O*



Mechanizm BL: lucyferyna świetlika LucLH2AMP + O2 LucLO* + AMP + CO2

E O

N

S N

S

*O

H

H

Oksylucyferyna (KETO)

O

N

S N

S

O

H

H

*

- CO2

N

S

S

N

O

O*

• pH ~ 6,0 formaketonowa

• Modulacja koloru emisjinastępuje poprzez zmianę

delokalizacji ładunku wstanie wzbudzonym.

• pH ~ 8,0 forma enolanowa•Emisja w zakresie żółto-zielonym(ok. 560 nm) związana jest zenolanową formą wzbudzonegodianionu oksylucyferyny.

O

N

S N

S

*O

H

Oksylucyferyna (ENOL)

LucLO* LucLO + hv ( ~ 1)

McCapra:mechanizm TICT



Lucyferazy Enzymy reakcji BL - lucyferazy są wśród świecących gatunków

są bardzo zróżnicowane.

Schemat „wstęgowy”struktury Luc (ok.550 a-k). Domena N-końcowa (nieb.-fiol)

jest połączona z

mniejszą domeną C-końcową (żółty)poprzez krótki peptyd„zawiasowy” [1].

Lucyferazaświetlika

(Luc)

Oddziaływania pomiędzy lucyferazą i substratami: lucyferyną (zielony), ATP( fioletowy) i Mg2+. Interakcje w granicach ok. 24Å oznaczono jako

Lys

Thr

BL li i ATP



BL w analityce: oznaczanie ATP• Określanie poziomu ATP jest wykorzystywane jako wskaźnik ilościżywych komórek w układzie biologicznym.

• Stosuje się pomiar natężenia emisji światła układu lucyferyna-lucyferaza.

Rapid Hygiene Tester (Biothema ) (< 1 pg ATP)

BL lit BRET



BL w analityce: BRET

• Technologia BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer )

opiera się na możliwości skierowania energii pochodzącej z reakcji BL(lucyferaza-lucyferyna) do wzbudzenia białka fluorescencyjnego,

znajdującego się w bliskości przestrzennej enzymu lucyferazy.

proteina 1 proteina 2 BRET

Brak oddziaływań Oddziaływania

RLuc eYFP

BL w analityce oznaczenia kaspaz



BL w analityce: oznaczenia kaspaz

• Oznaczenia oparte są o specyficzne substraty peptydowe w stosunku dokaspazy 3, 7, 8 i 9, pojawiających się w sąsiedztwie komórek w stanie apoptozy.

• Najczulsze oznaczenia kaspaz są oparte o analizę luminescencji układu

lucyferyna-lucyferaza.

Monitorowanie aktywności kaspaz – enzymów z grupy kwasowych proteazcysteinowo-asparaginowych – jest podstawową metodą w badaniach procesuapoptozy, czyli programowanej śmierci komórki.

• Tradycyjne metody oznaczenia kaspaz to zastosowanie związkówfluoryzujących (np. pochodnych kumaryny lub fluoresceiny) lub barwnych(pomiary absorpcji).



BL w analityce: oznaczenia kaspazAminolucyferyna (luc) vs rodamina 110 (rho 110) vs Aminokumaryna (AMC)

Stężenie kaspazy (mU)

RLU / RFU

Limitydetekcji(S/T > 3)

N

S N

S

HNZ-DEVD COO

usuwaniepeptydu

N

S N

S

H2N COO

lucyferaza N

S N

S

H2N O

+ hv



Galeria światła włączone Galeria światła wyłączone

BL: inspiracje artystyczne



Dlaczego świecą?

Wprowadzenie obcego fragmentu genu strukturalnego lux CDABE do bakterii umożliwia

ekspresję kompleksu enzymatycznego reduktazy kwasu tłuszczowego oraz lucyferazy iwywołuje emisję promieniowania u organizmu.



BL: inspiracje artystyczne

• Różnorodność emisji jest związana zewzbudzeniem różnychform fluoryzujących protein wprowadzonychdo zmutowanychgenetycznie bakterii.

• Obrazek plaży w San

Diego wykonany zapomocą żywych bakteriiemitujących 8 różnych kolorów BL.

PODSUMOWANIE

http://tsienlab.ucsd.edu/HTML/Images/IMAGE%20-%20PLATE%20-%20Beach.jpg



PODSUMOWANIE:pytania, które pozostają

• Jaka jest historia ewolucyjna wydajnej bioluminescencji?

• Jaka jest fizykochemia procesu BL na poziomiemolekularnym w wyniku którego efektywnie wytwarzane

jest promieniowanie?• Jakie mechanizmy biochemiczne kontrolująsynchroniczne błyski światła?

• Jaką korzyść z bioluminescencji czerpią dżdżownice?• W jaki sposób środowisko wpływa na energię stanuwzbudzonego i przesunięcie zakresu emisji?

• Jak dochodzi do sprzężenia w stanie wzbudzonym z

„białkami antenowymi”?

Materiały źródłowe:



Materiały źródłowe: Conti, Franks and Brick, Structure 4 (1996) 287298.

S. Angers, A. Salahpour, E. Joly, S. Hilairet, D. Chelsky, M. Dennis, M. Bouvier, Proc. Nat. Acad. Sci . 97

(2000) 36843689.

M. W. Griffiths, J. Dairy Sci 76 (1993) 31183125.J. Perroy, S. Pontier, P.G. Charest, M. Aubry, M. Bouvier, Nature 1 (2004) 203208.

A. Roda, P. Pasini, M. Mirasoli, E. Michelini, M. Guardigli, Trends Biotechnol. 22 (2004) 295303.

S. Girotti, E.N. Ferri, L. Bolelli, G. Sermasi, F. Fini, „Applications of Bioluminescence in Analytical

chemistry”, w: S.G. Schulman, J. Schulman, Y. Rakicioğlu. In: Chemiluminescence in Analytical

Chemistry , p. 6781, A.M. Garcia-Campaña, W.R.G. Bayenes eds, Marcel Dekker, New York-Basel 2001.

http://www.lifesci.ucsb.edu/~biolum/http://www.lifesci.ucsb.edu/~biolum/chem/

http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm

http://www.3rd1000.com/labs/lumine.htm

http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/7/3684.

http://las.perkinelmer.com/Content/RelatedMaterials/Posters/PSH_BRET2NovelAssayTechnology.pdf

http://jds.fass.org/cgi/reprint/76/10/3118.pdf http://www.mapageweb.umontreal.ca/bouvier/bret/index.html

Bouvier’s Lab, „Using BRET to study Protein-Protein interactions.”

Montana State University, “Bioglyphs”, http://www.erc.montana.edu/Bioglyphs/default.htm

S. Hosseinkhani. “Bioluminescnece” (2007):

http://www.modares.ac.ir/sci/saman_h/Pages/Bioluminescence%20.htm

Strony internetowe odwiedzono w okresie 12/2010 – 04/2011.


http://jds.fass.org/cgi/reprint/76/10/3118.pdf

http://www.mapageweb.umontreal.ca/bouvier/bret/index.html

http://www.erc.montana.edu/Bioglyphs/default.htm



http://www.erc.montana.edu/Bioglyphs/default.htm

http://www.mapageweb.umontreal.ca/bouvier/bret/index.html

http://jds.fass.org/cgi/reprint/76/10/3118.pdf


http://www.pbase.com/palantiri7/trinidad



