DIAGNÓSTICO: HERRAMIENTAS CONVENCIONALES APLICADAS SEGÚN LA ETAPA (MÉTODOS PARASITOLÓGICOS E INMUNOLÓGICOS). REACTIVOS DISPONIBLES EN EL MEDIOBioq. Verónica AmpueroJTP Parasitología y MicologíaFacultad de Química, Bioquímica y Farmacia.Universidad Nacional de San Luis
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
La Enfermedad de Chagas es una de las endemias más importantes en la región, siendo uno de los problemas de Salud Pública de mayor distribución en América Latina.
La importancia de la enfermedad radica en los daños que ocasiona a nivel del sistema nervioso, cardiovascular y digestivo.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
La transmisión del T. cruzi al ser humano, puede producirse por distintas vías:
a) vectorial por tratomíneos (vinchuca), b) congénita, (vía vertical de madre a hijo) c) por transfusiones o transplante, d) digestiva, considerada ahora como una ETA, e) vía accidental
DIAGNOSTICO DE LABORATORIOLa enfermedad de Chagas
presenta tres etapas clínicas: a) aguda, b) indeterminada c) y crónica
Debemos tener en cuenta el período ventanaque se produce cuando T.cruzi ingresa al organismo,cumple un ciclo de desarrollo en el hospedador que abarca entre 7 a 15 días, donde comienza a ser
detectable.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIOPor esto es fundamental conocer tres
aspectos:Cuándo realizar un análisis Qué análisis realizar Cuales son los objetivos de la realización
del análisis
Para evitar la realización de estudios parasitológicosy/o serológicos en un momento inadecuado, con
la consecuencia de posibles falsos resultadosnegativos.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
ETAPA INICIAL se presentan parasitemias, las que van disminuyendo a medida que transcurre el tiempo, hasta hacerse mínimas o aleatorias.
ETAPA AGUDA
el diagnóstico de laboratorio debe centrarse en la búsqueda del parásito
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
ETAPAS INDETERMINADA y CRÓNICA
el diagnóstico se realiza mediante la demostración de anticuerpos específicos anti
Trypanosoma cruzi.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
En nuestro país, el diagnóstico serológico debe efectuarse por dos
reacciones en paralelo, y en caso de discordancia, se debe recurrir a una tercera prueba a
fin de definir el resultado.
Para lograr un diagnóstico confiable, el laboratorio debe realizar una elección adecuada de los reactivos, antes de
implementar su utilización en la rutina diagnóstica diaria.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- TOMA DE MUESTRA
MOMENTO DEL CONTAGIO
deben realizarse al menos DOS pruebas serológicas para Chagas, a los fines de
conocer si el paciente tiene ya una infección previa.
Si la misma es negativa la segunda muestra debe ser obtenida respetando el periodo de ventana desde el inicio de la
posible infección.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDA
En esta etapa deben realizarse fundamentalmente los
MÉTODOS PARASITOLOGICOS, los cuales pueden ser realizados por distintos procedimientos analíticos, dependiendo de la
disponibilidad de recursos humanos capacitados y equipamiento en cada
laboratorio. La DETECCIÓN DEL PARASITO, como en toda enfermedad infecciosa, es el único parámetro
de CERTEZA DIAGNÓSTICA.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS
Las metodologías actualmente recomendadas son:
GOTA FRESCAGOTA GRUESA
TÉCNICA DE CONCENTRACIÓN DE STROUT
HEMOCULTIVOXENODIAGNOSTICO
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-GOTA FRESCA
Aumentar irrigación
Sensibilidad 50%
100x / 400x
gota de citrato al 2%)
Tripanosoma cruzi
45 minutos
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-GOTA GRUESA
Sensibilidad 50%
Colocar 1 a 3 gotas Desfibrinar
1-2min
Dejar secar
Colorear con Giemsa diluido (1/20) 30 minutos.Lavar y secar
objetivo de 100x aceite
Tripanosoma cruzi
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-STROUT
Sensibilidad 95%
5-10 mL
Tº amb
Coag.
600 rpm 2 min.
2500 rpm 10 min.
Suero
Sedimento
Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-MICROHEMATOCRITO
Sensibilidad 90 a 95%
45 segundos a 5000 rpm
6 a 9 microhematocrito heparinizado
Cerrar extremo con plastilina Cortar
BIOSEGURIDAD
Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)
La técnica de MICROHEMATOCRITO NO ES RECOMENDABLE
Puede brindar falsos resultados negativos:
1. si el capilar es centrifugado a las revoluciones no adecuadas, existe la posibilidad de que los parásitos se vayan al fondo del capilar con el riesgo de no ser visualizados
2. Que el paciente curse con bajas parasitemias y sea muy difícil de observar la presencia del parásito en la interfase, entre la capa de glóbulos blancos y el suero.
3. Si el capilar se rompe en la interfase, pueden quedar restos de vidrio del capilar sobre el portaobjetos con los restos de la interfase y cuando se coloca el cubreobjeto, no tiene una
4. adecuada adherencia y dificulta la observación. Por razones de Bioseguridad del operador:
Esto es crucial, ya que para su observación deben cortarse aproximadamente 7 capilares, para aumentar su sensibilidad y los restos de vidrios pueden traspasar los guantes del operador e incluso herirlo, sin que éste lo perciba, pudiendo adquirir infecciones como Hepatitis, HIV, Chagas, etc.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-HEMOCULTIVO Hemocultivo: consiste en sembrar una muestra
de sangre en un medio de cultivo artificial y amplificar el número de parásitos. Como producto del cultivo se obtienen epimatigotes de T. cruzi.
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El método del hemocultivo es de elección por su menor agresividad
para los pacientes, fundamentalmente en la población neonatal, mayor
precocidad de resultados y menor requerimiento en infraestructura.Existen técnicas estandarizadas con sangre
heparinizada, recogida en condiciones de estricta asepsia, en medio monofásico (Infusión Cerebro
Corazón) y bifásico (pico de flauta de agar sangre) que se realizan en un centro de referencia de la pcia.
De Córdoba.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-XENODIAGNÓSTICO Se realiza con la aplicación de 4 cajas con
20 ninfas de Triatoma infestans, del tercer o cuarto estadio, con 20 días de ayuno, cubiertas con una gasa, sujetada con una banda elástica.
Se sujeta al antebrazo durante 15 o 20 minutos, luego se deja a 28ºC y 70% de humedad durante 30 o 60 días. El material se obtiene por compresión de la zona abdominal del insecto, entre dos pinzas, sobre un portaobjetos, y se lo diluye con solución fisiológica estéril, luego se agrega un cubreobjeto y se observa con objetivo de 40x , recorriendo aproximadamente 300 campos en guarda griega.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLOGICOS-XENODIAGNÓSTICO Xenodiagnostico: consiste en amplificar el nº de
parásitos utilizando al vector.
ventajas desventajasStrout, Microstrout
Resultado precoz Certeza diagnóstica Sencillez operativa Bajo costo
Sensibilidad cercana al 70% en el período agudo y 50% en el período crónico
Hemocultivo Elevada sensibilidad Certeza diagnóstica Facilidad en la obtención de la muestraBajo costo
Requiere experiencia del operador Contaminaciones
Xenodiagnóstico Gold standard Método cruento Reacciones alérgicas Infraestructura compleja
Enfermedad de Chagas Diagnóstico parasitológico
En resumen, los métodos parasitológicos clásicos: EXAMEN EN FRESCO, STROUT O MICROSTROUT y
HEMOCULTIVO empleados secuencialmente, permiten detectar el parásito, y consecuentemente efectuar
el diagnóstico de certeza, prácticamente en el 95% de los casos
durante el período agudo.
ETAPA CRONICA- METODOS SEROLÓGICOS
El concepto básico que debe tenerse en cuenta es que lo que se busca no es el parásito y, por lo tanto, sus resultados nunca
proporcionan certeza diagnóstica y deben medirse en términos de
probabilidad.
Para que las probabilidades de éxito en el diagnóstico serológico se acerquen
a la certeza es imprescindible seleccionar adecuadamente
El MÉTODO A EMPLEAR, EL MOMENTO DE LA TOMA DE MUESTRA e INTERPRETAR ADECUADAMENTE LOS
RESULTADOS.
Métodos serológicos : Los métodos actualmente validados son:
ELISA Hemaglutinación indirecta (HAI) Inmunofluorescencia (IF)
Los parámetros para determinar la confiabilidad de un método son:
Sensibilidad (S), Especificidad (E)
y Valor predictivo (VP)
S: capacidad de un método de dar resultado positivo en presencia de infección
E: capacidad de un método de dar resultado negativo en ausencia de infección
VP: probabilidad que un individuo con resultado positivo esté realmente infectado (VP+) o de que un individuo con resultado negativo sea realmente no infectado (VP-).
Las dos primeras son intrínsecas del método, en cambio el VP depende de la prevalencia de la infección. Así, en zona de alta endemicidad el VP+ de un resultado positivo es más alto que en una zona no endémica (y por lo tanto la probabilidad de resultado falso positivo es menor).
Como ningún método tiene 100% de E, las pautas para diagnóstico de la infección
chagásica (Manual para la atención del paciente infectado con Tripanosoma cruzi Ministerio de Salud de la Nación. 2005) determinan que, para que
un individuo sea considerado chagásico, deben dar positivos al menos dos métodos
serológicos diferentes:
ELISA + HAI ELISA + IF HAI + IF
Actualmente, la reacción más sensible es ELISA que, por otra parte, si se cuenta con un espectrofotómetro de lectura vertical
(lector de ELISA), tiene la ventaja de la objetividad.
Permite procesar elevado número de muestras y, además, es la que mejores resultados
permite obtener en muestras de sangre entera (sangre
con glicerina, papel de filtro) o con otros fluidos
biológicos como el trasudado mucoso oral.
La prueba de HAI tiene la ventaja de permitir la titulación del nivel
de anticuerpos con rapidez y sencillez operativa y también es adecuada para procesamiento de
elevado número de muestras.
La técnica de IF sin dudas se trata de una buena metodología, pero requiere experiencia del operador y depende de
la subjetividad del mismo.
Por otra parte, el equipamiento requerido no está al alcance de
pequeños laboratorios y no es una técnica adecuada para procesar elevado número de muestras.
EN UN LABORATORIO DEBEN ESTAR DISPONIBLES AL MENOS
DOS PRUEBAS, DE ACUERDO A LA COMPLEJIDAD
DEL MISMO, LA INFRAESTRUCTURA
DISPONIBLE Y LA FORMACION PROFESIONAL.
KITS COMERCIALES
KITS COMERCIALES
Gracias por la atención, nos vemos en el
practico!