Biotecnologie vegetali per l’industria e l’ambiente
Biochimica classica - atto I
Il Cavallo RossoE. Corti (Ed. ARES)
Come manipolare il metabolismo?
È necessaria la comprensione del sistema metabolico e di come venga modulato il flusso
Metà corso dedicato alla comprensione dei sistemi multienzimatici
Metà corso a discutere degli interventi di ingegneria metabolica
Il metabolismo: questo sconosciuto
Un centinaio di anni di studio degli enzimi e dei metaboliti ci ha permesso di costruire accurate mappe metaboliche:
E. Buchner: cell-free fermentation
"Alcoholic Fermentation Without Yeast Cells". (1897) Ber. Dt. Chem. Ges. 30:
117–124.
http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1907/buchner-lecture.pdf
Teoria generale capace di predire i flussi?
vie metaboliche enzimologia
Flux is phenotype! (H. Kacser)
E’ possibile descrivere il metabolismo a partire dalle proprietà (studiate di solito in vitro) dei suoi componenti?
SK
SVv
M
m
Cinetica di MM irreversibile
E + S = ES E + P
Derivazione della formula reperibile su tutti i testi (decenti) di biochimica. Formula e curva sono la stessa cosa detta in due modi diversi!!!
Breve ripasso di enzimologia
Colmate le lacune con attenzione (ad es. Voet & Voet, Biochemistry)
Curva v/S
Significato di KM e Vm; unità di misura
Molte rappresentazioni della cinetica sono sballate
http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/asympt.htm
Quando v raggiunge Vmax?
A [S] infinito, cioè mai!
Linearizzazionemm
M
VV
K
Sv
111
y = 0
x = 0
Esistono tipi diversi di linearizzazione (vedi Voet e Voet o Fell)
Inibizione competitiva
Il valore di Km viene aumentato: KMapp = KM(1+I/Ki)= KMα
L’inibizione si annulla aumentando la concentrazione del substrato
SKI
K
SVv
iM
m
)1(
E + S = ES E + P
EI + S = EIS no reaction
+
I
es. Succinato deidrogenasi: fumarato (S) e malonato (I)
Che faccià avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?
Ki
COO
CH2
CH2
COO
succinate dehydrogenaseOOC H
H COO
SuccinateFumarate
COO
CH2succinate dehydrogenase
Malonate
COONo reaction
Inibizione incompetitiva
Il valore di Vm viene diminuito: Vmapp= Vm/(1+I/Ki)= Vm/α’
L’inibizione, inefficace a basse [S], non si annulla ad alte [S]
E + S = ES E + P
EIS no reaction
+
I
Che faccià avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?
es. EPSP sintasi (con glifosate)
Ki
'
SK
SVv
M
m
Reazione della EPSP sintasi e sua inibizione da parte del glifosate
OH
OH
COO-
-2O
3PO
CH2
OH
O
COO-
COO--2
O3PO
-OOC NH PO
3
2-
Shikimato-3-fosfato
Fosfoenolpiruvato (PEP)
Glifosate
3-enolpiruvil-3-shikimato -fostato (EPSP)
EPSP sintasi
CH2
O-2 O3 P COO-
Nonostante assomigli molto a parte dello shikimato, il glifosate è un inibitore competitivo del PEP.
La reazione è sequenziale, con lo shikimato che entra per primo, per cui il glifosate risulta essere un inibitore incompetitivo di questo primo substrato.
Questo causa l’accumulo di Shikimato e la riduzione in Arogenato (che è un inibitore della DHAP sintasi che quindi esacerba l’accumulo di Shikimato) (vedi note)
http://plantandsoil.unl.edu/Image/siteImages/ShikimatePathway.gif
Inibizione mista
Sia Vm che Km cambiano: Vmapp = Vm/α′ e KM′ = α KM/α′
L’inibizione si sente sia a bassa che ad alta concentrazione di S
E + S = ES E + P
Che faccia avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?
EIS no reactionEI
+
I
+
I
Ki K’i
'
SK
SVv
M
m
Le inibizioni dal punto di vista grafico
Equazione MM reversibile
Per una dimostrazione elegante:http://www.bioinformaticsservices.com/bis/resources/cybertext/chapter6.html
PS
PrSf
KPKS
KPVKSVv
//1
)/()/(
Due conseguenze importanti:
La v della reazione reversibile sarà minore di quella irreversibile per due motivi:
La presenza di prodotto rende più piccolo il numeratore
La presenza di prodotto rende più grande il denominatore
0)/()/( PrSf KPVKSV
La relazione di Haldane
All’equilibrio v = 0 per cui il numeratore sarà = 0
)/()/( PrSf KPVKSV
eq
eq
Sr
Pf
S
P
KV
KV
= Keq
Le costanti cinetiche non sono indipendenti!
Una formulazione alternativa dell’equazione si ottiene sfruttando la relazione di Haldane (sostituisco Vr)
Ricordatevi che il valore della Keq è indipendente dalla presenza dell’enzima
Seq
Pfr KK
KVV
PS
eqS
f
KPKS
KPSK
V
v//1
)/(
Quando la Keq >>1(o meglio P/Keq<< S)
L’effetto di P si fa sentire solo sul denominatore
(si parla di inibizione da prodotto)
(cioè una reazione molto spostata verso i prodotti)
PS
eqS
f
KPKS
KPSK
V
v//1
)/(
) A
Che altro non è se non l’equazione per la reazione irreveversibile
Inoltre se [P]/KP è bassa ( 0 o comunque <<1)
PS
eqS
f
KPKS
KPSK
V
v//1
)/(
Importantissimo
L’equazione di MM irreversibile non descrive il comportamento in vivo perché la maggior parte degli enzimi catalizzano reazioni reversibili.
Quella reversibile è cruciale per descrivere i sistemi reali
Inoltre la maggior parte delle reazioni enzimatiche hanno più di un substrato o di un prodotto per cui si richiedono equazioni più complesse.
Enzimi a più substrati/prodotti
A + B C + D
Classificati secondo il meccanismo:
*Random order
* Compulsory order
* Ping Pong
Sequenziali
BABKAKKK
BAVv
ABBiA
m
Equaz. generale (irrev.)
Enzimi allosterici:
Molti enzimi non hanno curve iperboliche, ma sigmoidi, per cui sono stati introdotte teorie per spiegare questi comportamente (Hill, MWC e Koshland)
v =Vm*(x*(1+x)n-1+L*c*x*(1+c*x)n-1)/((1+x)n + L*(1+c*x)n) [MWC model]
Andate a rivederli sul testo di biochimica !
http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/transkinetics/ATCasekin.jpg
atto II(ovverosia la termodinamica)
Dopo le nozioni essenziali di enzimologia, ripassiamo alcuni concetti di termodinamica che
sono rilevanti per le vie metaboliche
Si raggiunge sempre uno stato stazionario (ss)?
La presenza di un flusso in una via metabolica cosa implica dal punto di vista termodinamico?
Un G ≠ 0 (<0)
G = G°' + RT lnQ Q = quoziente di reaz.
All’eq. G= 0 e G°' = –RT lnKeq
Che conseguenze avrebbe non raggiungere uno ss…
G°' = –RT lnKeq = –2.3RT Log10(Keq)
G°' è la variazione di energia libera in condizioni standard
Da Lehninger
Ordine di grandezza
ATP + H2O ADP + Pi Go' = -31 kJoules/molPi + glucose glucose-6-P + H2O Go' = +14 kJoules/mol
Values of Go and Keq for common reactions at 25oC
SO3(g) 2 SO2(g) + O2(g) 141.7 1.4 x 10-25
H2O(l) H+(aq) + OH-(aq) 79.9 1.0 x 10-14
AgCl(s) + H2O Ag+(aq) + Cl-(aq) 55.6 1.8 x 10-10
HOAc(aq) + H2O H+(aq) + OAc-(aq) 27.1 1.8 x 10-5
N2(g) + 3 H2(g) 2 NH3(g) -32.9 5.8 x 105
HCl(aq) + H2O H+(aq) + Cl-(aq) -34.2 1 x 106
Cu2+(aq) + 4 NH3(aq) Cu(NH3)42+(aq) -76.0 2.1 x 1013
Zn(s) + Cu2+(aq) Zn2+(aq) + Cu(s) -211.8 1.4 x 1037
Reaction Go(KJ/mol) Keq
R = 8.314472[15] J · K-1 · mol-1 Go (kJ/mol)
Quoziente di reazione e Keq
G = G°' + RT lnQ = –RT lnKeq+ RT lnQ =
= RT ln(Q/Keq) = RT ln ρ
(con ρ Disequilibrium ratio)
Che valori assume ρ? Ovviamente tra 0 e 1 per G <0
Quanto più ρ è vicino a 0 tanto più G < 0 (reaz. spontanea)
ρ (o G, che concettualmente è la stessa cosa) è considerato da molti un indicatore del potenziale di regolazione della reazione:
*se ρ è molto piccolo (0) si ritiene che l’enzima sia un potenziale
sito di regolazione (se ρ 1 c’è poca possibilità di regolazione)
eqK
Qρ
http://users.humboldt.edu/rpaselk/C431.F08/C431Notes/C431nLec31.htm
(=Q/Keq) e quindi G variano da tessuto a tessuto
ΔG°' e ΔG in vivo nella glicolisi
Perché ρ è considerato un indice di potenziale regolazione?
I metaboliti devono essere a concentrazioni nel range μM- mM
A) Non possono essere a concentrazioni molto alte (es. 1M)
* perché ci sarebbero effetti osmotici pesanti
* perché le variazioni nel metabolismo sarebbero lente(ci sarebbe molto intermedio da smaltire)
* perché si investirebbe molto in intermedi (e non prodotti)
B) Non possono essere a concentrazioni molto basse (es. nM)
* perché gli enzimi avrebbero Km basse e quindi una bassa efficacia catalitica: Kcat / Km vale al max 108-109
* perché gli intermedi verrebbero esauriti velocemente (non ci sarebbero riserve efficaci di metaboliti)
Kcat = Vmax/Etot = turnover number
n. di reazioni catalizzate da ogni sito attivo ogni secondo; per un enzima MM vale K2.
Non può essere maggiore della frequenza con cui substrato ed enzima si incontrano. Se ogni incontro è produttivo, si avrà la perfezione catalitica
kcat is called the turnover number
kcat = moli di substrato trasformato / mole di enzima/secondo
http://www.aw-bc.com/mathews/ch11/c11kkkk.htm
SK
SVv
m
M
Quando [S] << KM (soluzioni diluite) ricaviamo
M
T
M
T
K
SEK
SK
SEK
22
ammettendo E= Etot := (k2/KM)[E][S] ~
(kcat/KM)[E][S]
Pendenza della retta: kcat/KM
Rate constant per reaz. Bimolecolare
Non può essere maggiore della
velocità d’incontro
(kcat/KM) vale al massimo 108-109 cioè il valore massimo compatibile con la diffusione
Diffusion theory predicts that kcat/KM will attain a value of about 108-109 (mol/L)-1s-1. Carbonic anhydrase, Catalase, Fumarase and Triose phosphate isomerase actually approach this limit.
TIM accelerates isomerization by a factor of 1010 compared with the rate obtained with a simple base catalyst such as acetate ion. Indeed, the kcat/KM ratio for isomerization of glyceraldehyde 3-phosphate is 2 × 108 M-1 s-1.
Da Lehninger
The kcat and activation energy of Rubisco from a variety of C3 and C4 plants
Sage et al.
Se questi 2 ragionamenti sono veri, ne consegue che :
* quando G° ' <<0 la reazione deve rimanere lontana dell’eq.
* quando G° ' 0 (Keq 1) la reazione deve rimanere vicina all’eq.
Cosa significa (approssimativamente)? G <<0 G 0
Cosa succederebbe infatti se le reazioni con G° ' <<0 andassero all’equilibrio?
E cosa succederebbe se le reazioni con G° ' 0 fossero lontane dall’equilibrio…
[P] >> [S]
Con due reazioni di questo tipo in fila (come ad es. nella glicolisi GG6PF6PF1,6BP*), allora:
[S] << [P1] [P2] << [P3] e più precisamente:
([F1,6BP][ADP]2 / [G][ATP]2) = 106
[P] << [S]
Riassumendo:
Le concentrazioni dei metaboliti possono rimanere dentro ambiti sensati (μM-mM) se le reazioni con
* G° ' <<0 rimangono lontane dall’equilibrio (G <<0, vale a
dire ρ 0). Tali reazioni quindi devono essere ben regolate!
* G° ' 0 rimangono vicine all’equilibrio (G 0) Queste reazioni devono essere catalizzate da enzimi in eccesso (altrimenti rallentando rimarrebbero lontane dall’equilibrio)
Da Lehninger
TPI aumenta la velocità della
reazione 109 volte!!
ReferenzePer la cinetica enzimatica vedere
* Testo di biochimica (ad es. Voet and Voet, Biochemistry)
* Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 3
Per la parte di cinetica chimica vedere:
* Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 1.4.2 e 1.4.3
Effect of reversible inhibitors on the reaction rate: � no inhib. a)� mixed inhib. ([I] = Ki = 0.5 Ki'); lower Vmax
app (= 0.67 Vmax), higher Kmapp (= 2 Km). b)� competitive inhib.
([I] = Ki); Vmaxapp unchanged (= Vmax), higher Km
app (= 2 Km). c)� uncompetitive inhib. ([I]
= Ki'); lower Vmaxapp (= 0.5 Vmax) and Km
app (= 0.5 Km). d)� noncompetitive inhib. ([I] = Ki
= Ki'); lower Vmaxapp (= 0.5 Vmax), unchanged Km
app (= Km).
A special case of uncompetitive inhibition is substrate inhibition which occurs at high substrate concentrations in about 20% of all known enzymes (e.g. invertase is inhibited by sucrose). It is primarily caused by more than one substrate molecule binding to an active site meant for just one, often by different parts of the substrate molecules binding to different subsites within the substrate binding site. If the resultant complex is inactive this type of inhibition causes a reduction in the rate of reaction, at high substrate concentrations. It may be modelled by the following scheme:
http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/inhibition.html
Effect of substrate inhibition the reaction rate. A comparison is made between the inhibition caused by increasing KS relative to Km. � no inhibition, KS/Km >> 100; �
KS/Km = 100; � KS/Km = 10; � KS/Km = 1. By the nature of the binding causing this
inhibition, it is unlikely that KS/Km < 1.
Competitiva
Incompetitiva
Mista
Quando α = α‘ si parla di in. non-competitiva (la Km non cambia)
Effetto degli inibitori sui parametri cinetici