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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL PERÚ
ESCUELA DE POSGRADO
CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DEL COMPLEJO DE FENBENDAZOL Y
β-CICLODEXTRINA EN SOLUCIÓN ACUOSA
Tesis para optar el grado de Magíster en Química que presenta
Q.F. FRANCO LUIGI CENTURIÓN RODRIGUEZ
Dirigido por:
Dr. MAYNARD JORGE KONG MORENO
JURADOS:
Dra. JUANA ROSA ROBLES CAYCHO
Dr. DESIDERIO VASQUEZ RODRIGUEZ
San Miguel, 2016
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DEDICATORIA
A Dios, mi familia, amigos, colegas y Profesores por la orientación, fuerza, incentivo,
compañerismo y amistad. Sin ellos nada esto hubiera sido posible.
AGRADECIMIENTOS
A Dios por permitirme y darme la posibilidad de afrontar nuevos retos en mi carrera
profesional, y agradecerle por brindarme una luz en los momentos de angustia y así poder
vencer las dificultades.
A mi familia la cual amo mucho por estar siempre apoyándome constantemente, pues al ser
joven aun, las experiencias de nuestros Padres (Magda Rodriguez) y abuelos (Rosa Olga Y
Jacinto Espino) siempre serán de mucha ayuda, a mi hermano (Abel Centurión) y primo (Pool
Escamilo) por darme un punto de vista siempre diferente y tecnológico, a mi Tío Milton, Tía
Yassue y Esmeralda.
A mi asesor, el Prof. Maynard Kong por brindarme siempre la oportunidad para desarrollar
mis ideas y con mucho criterio para corregirme, a mi co-asesor el Prof. Juan Davalos, quien
apareció en el momento justo para poder apoyarme con los cálculos computaciones y por sus
ideas siempre visionarias.
A mis colegas y compañeros becarios como Jose Monteza, Yenny Allcca, Nieves Flores,
Glibver Vaszquez, Betty Tevez, Pier Ruiz, Alexis Uechi por sus opiniones y críticas
constructivas que permitieron enfocar el trabajo; además a mis colegas Farmacéuticos como
Deivy Quiroz quien con su gentileza también colaboro con algunos análisis, y de manera
especial para Edgar Vega quien además de colaborar con la tesis, entre tantas conversaciones
surgió esta idea; así mismo a Oscar Díaz por su paciencia para poder crear en conjunto el
módulo AMBERTOOLS en el servidor LEGION de la PUCP.
También es preciso agradecer al Estado Peruano que por medio de CONCYTEC nos dio la
facilidad de contar con una beca para poder cursar esta Maestría, teniendo como
responsabilidad ulterior aplicar nuestros conocimientos para dar un aporte a la investigación
en nuestro país, así mismo a la facultad de Química de la PUCP por permitirnos integrarnos y
a todo el apoyo que recibimos por parte de parte de Profesores y amigos.
Es preciso mencionar un agradecimiento a Profesores de la Escuela de Química
computacional y teórica de las Américas (Prefalc 2014-2015) como el Prof. Alain Fritsch, y
amigos como Eugenio Furtado quien brindo una gran colaboración para los cálculos
3
computacionales; al mismo tiempo es importante mencionar mi travesía por la Universidad
de Buenos Aires (UBA), por el cual tuve la fortuna de asistir al curso de Simulación
Computacional Avanzada en Química, Bioquímica y ciencia de los Materiales, el cual fue
brindado por el gobierno Argentino, esto permitió sin duda reforzar mis conocimientos sobre
simulación y aprender nuevas técnicas para aplicar en mi tesis. Y claro la importantísima
opinión de Profesores de este curso y al grupo CELFI (amigos y colegas del curso).
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ABSTRACT
Here is reported a physical-chemical characterization of the complex formed between
fenbendazole and β-cyclodextrin, in order to assess whether it is feasible to prepare a
hydrosoluble pharmaceutical formula containing this complex. For such purpose, these
complexes were prepared by co-precipitation in aqueous media, obtaining an increasing
solubility of the pharmaceutical from 0.28 up to 2.5 µg/mL. Thereafter the complexes were
characterized by UV-visible spectrophotometry, IR, DSC-TGA and computational calculations.
Fenbendazole became more soluble as the content of β-cyclodextrin was increased, as shown
by B-type saturation observed in phase solubility diagrams. According to the Benesi-
Hildebrand method, the association constants were calculated to be 10.9 M-1 and 1.78 x105 M-1
for 1:1 and 1:2 stoichiometries respectively, without exhibiting a particular selectivity for any
of these proposed stoichiometries. The decrease of fenbendazole signals by IR and DSC-TGA
characterizations reveal evidence of the complex formation. In order to clarify the inclusion
nature of fenbendazole in the formed complexes, quantum and molecular mechanic calculations
were performed, showing that the thiobenzyl group is favoured energetically to interact with the
first cyclodextrin molecule. These results were obtained by DFT-D3 and M05-2X functionals,
and it is also proven that the 1:2 (FBZ:BCD) stoichiometry was favoured by quantum mechanics
and the MM-PBSA method of molecular mechanics.
Keywords: β-cyclodextrin, fenbendazole, IR, DSC-TGA, UV/vis, computational calculations,
DFT-D3, M05-2X, MM-PBSA
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RESUMEN
El presente trabajo de Tesis tuvo como objetivo de estudio realizar una caracterización
fisicoquímica del complejo de fenbendazol y β-ciclodextrina y poder examinar si sería factible
realizar una formulación farmacéutica conteniendo un complejo fenbendazol- β-ciclodextrina
hidrosoluble. Para tal fin se prepararon los complejos en medio acuoso por el método de
coprecipitación obteniéndose un aumento de la solubilidad del fármaco desde 0,28 hasta 2,5 µg/mL,
para después caracterizarlos por técnicas de espectrofotometría UV/Vis, IR, DSC-TGA y con
cálculos computacionales.
Los resultados del presente estudio indicaron que el fenbendazol aumentaba su solubilidad
conforme aumentaba la cantidad adicionada de β-ciclodextrina, esto se evidencio en el
diagrama de solubilidad de fase del tipo B, el cual refleja que llegaba hasta un punto de
saturación. La constante de asociación calculada por el método de Benesi-Hildebrand es de
10,9 M-1 y 1,78 x105 M-1 para una estequiometría 1:1 y 1:2, respectivamente, no mostrando
una selectividad por alguna estequiometria propuesta. La caracterización por medio de IR,
DSC-TGA evidencia la complejación del sistema al observar la desaparición de las señales de
la molécula de fenbendazol. Con la intención de dilucidar la naturaleza de la inclusión se
realizaron cálculos de mecánica cuántica y mecánica molecular, permitiendo entender el
mecanismo de inclusión por el cual el grupo tiobencil del fenbendazol era favorecido
energéticamente para interaccionar con la primera ciclodextrina, estos cálculos fueron
obtenidos con los funcionales DFT-D3 y M05-2X, a su vez se demostró que la relación
estequiométrica 1:2 (fenbendazol:β-ciclodextrina) era favorecida por cálculos de mecánica
cuántica y por el método MM-PBSA de mecánica molecular.
Palabras clave: β-ciclodextrina, fenbendazol, IR, DSC-TGA, UV/Vis, cálculos
computacionales, DFT-D3, M05-2X, MM-PBSA
6
ÍNDICE GENERAL
DEDICATORIA ....................................................................................................................... 2
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................ 2
ABSTRACT ............................................................................................................................. 4
RESUMEN ............................................................................................................................... 5
ÍNDICE GENERAL ................................................................................................................. 6
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................ 9
ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................ 12
ÍNDICE DE ECUACIONES .................................................................................................. 14
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 15
2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 21
a. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................ 21
b. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 21
3. MARCO TEÓRICO .......................................................................................................... 22
3.1. FENBENDAZOL ....................................................................................................... 22
3.2. CICLODEXTRINAS .................................................................................................. 23
3.3. COMPLEJOS DE INCLUSIÓN Y EQUILIBRIO ASOCIACIÓN-DISOCIACIÓN
………………………………………………………………………………………28
3.4. ISOTERMA DE SOLUBILIDAD .............................................................................. 30
3.5. COMPLEJOS DE INCLUSIÓN Y DE NO INCLUSIÓN ......................................... 34
3.6. ECUACIÓN DE BENESI-HILDEBRAND ............................................................... 34
3.7. SIMULACIÓN COMPUTACIONAL ........................................................................ 35
3.7.1. MÉTODOS COMPUTACIONALES ...................................................................... 36
3.7.1.1. MÉTODOS SEMIEMPÍRICOS ........................................................................ 38
3.7.1.1.1. MÉTODO DE PARISER-PARR-POPLE (PPP) .......................................... 38
3.7.1.1.2. MÉTODOS DEL DESPRECIO INTERMEDIO DEL SOLAPAMIENTO
DIFERENCIAL (INDO) Y DESPRECIO COMPLETO DEL
SOLAPAMIENTO DIFERENCIAL (CNDO) ............................................. 39
7
3.7.1.1.3. MÉTODO DEL MODELO 1 DE AUSTIN (AM1) ..................................... 39
3.7.1.1.4. MÉTODO PARAMETRIZADO 3 (PM3) ................................................... 39
3.7.1.1.5. MÉTODO PARAMETRIZADO 6 (PM6) ................................................... 40
3.7.1.2. TEORÍA DEL FUNCIONAL DE DENSIDAD (DFT) .................................... 40
3.7.1.3. DINÁMICA MOLECULAR ............................................................................. 43
4. METODOLOGÍA .............................................................................................................. 52
4.1. PREPARACIÓN DEL COMPLEJO DE FENBENDAZOL:β-CICLODEXTRINA
EN MEDIO ÁCIDO POR EL MÉTODO DE COPRECIPITACIÓN. ....................... 52
4.2. PREPARACIÓN DEL COMPLEJO DE FENBENDAZOL: β-CICLODEXTRINA EN
MEDIO NEUTRO POR EL MÉTODO DE COPRECIPITACIÓN. .......................... 52
4.3. PREPARACIÓN DE UNA MEZCLA FÍSICA DE FENBENDAZOL:β-
CICLODEXTRINA .................................................................................................... 53
4.4. CARACTERIZACIÓN DEL COMPLEJO FENBENDAZOL:β-CICLODEXTRINA
EN SOLUCIÓN POR MEDIO DE LA ESPECTROSCOPIA DE UV/VIS ............... 53
4.4.1. DIAGRAMA DE SOLUBILIDAD DEL COMPLEJO FENBENDAZOL:β-
CICLODEXTRINA SEGÚN EL MODELO DE HIGUCHI-CONNORS .............. 53
4.4.2. DETERMINACIÓN DE LA CONSTANTE DE ASOCIACIÓN DEL COMPLEJO
……………………………………………………………………………………54
4.5. CARACTERIZACIÓN DEL COMPLEJO POR ESPECTROSCOPĺA
INFRARROJA…… .................................................................................................... 55
4.6. CARACTERIZACIÓN DEL COMPLEJO POR CALORIMETRÍA DIFERENCIAL
DE BARRIDO ............................................................................................................. 55
4.7. ESTUDIO TEÓRICO DEL COMPLEJO DE FENBENDAZOL:β-
CICLODEXTRINA POR MÉTODOS CUÁNTICOS ............................................... 56
4.8. ESTUDIO TEÓRICO DEL COMPLEJO DE FENBENDAZOL:β-
CICLODEXTRINA A TRAVÉS DE CÁLCULOS DE MECÁNICA MOLECULAR
………………………………………………………………………………………56
5. PLAN DE ANÁLISIS DE DATOS ................................................................................... 58
5.1. DETERMINACIÓN DE LA ESTEQUIOMETRÍA Y LA CONSTANTE DE
ASOCIACIÓN DEL COMPLEJO DE INCLUSIÓN ................................................. 58
8
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 60
6.1. DIAGRAMA DE SOLUBILIDAD DE FASE ........................................................... 60
6.2. DETERMINACIÓN DE LA CONSTANTE DE ASOCIACIÓN POR EL MÉTODO
DE BENESI-HILDEBRAND .................................................................................... 63
6.3. SÍNTESIS DE LOS COMPLEJOS EN MEDIO ACUOSO ....................................... 65
6.4. ESPECTROSCOPÍA FT-IR DE LOS COMPUESTOS SINTETIZADOS ............... 66
6.5. ANÁLISIS POR CALORIMETRÍA DIFERENCIAL DE BARRIDO Y POR
TERMOGRAVIMETRÍA. ......................................................................................... 70
6.6. CÁLCULOS DE MECÁNICA CUÁNTICA ............................................................. 75
6.7. CÁLCULOS DE MECÁNICA MOLECULAR ......................................................... 81
6.7.1. ESTABILIDAD DEL SISTEMA .......................................................................... 83
6.7.2. ENERGÍA LIBRE DE UNIÓN DEL COMPLEJO FENBENDAZOL:β-
CICLODEXTRINA ............................................................................................... 85
7. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 88
8. RECOMENDACIONES .................................................................................................... 89
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 90
10.ANEXOS…………………………………………………………………………….......92
9
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: (a) Estructura química del fenbendazol (parte izquierda) y (b) estructura química
de albendazol (parte derecha). .............................................................................. 16
Figura 2: Representación esquemática de los hidrógenos H2, H3, H4, H5 y H6 de la β -
c i c l o d e x t r i n a ................................................................................................. 18
Figura 3: Estructuras químicas de las moléculas de la α-ciclodextrina, β-ciclodextrina
y γ-ciclodextrina. Adaptada de Miranda, J. C. de, Martins, T. E. A., Veiga,
F., & Ferraz, H. G. (2011) ................................................................................ 25
Figura 4: Sitios de modificaciones frecuentes en la β-CD (VEIGA et al, 2006). Adaptada de
Silva Arrais, M. (2012). .......................................................................................... 27
Figura 5: Ilustración esquemática de la asociación de la ciclodextrina libre (hospedero) con
el ligando (huésped) para formar un complejo de inclusión. Adaptada de Crini,G
(2014). .................................................................................................................... 29
Figura 6: Diagrama de solubilidad de fases que muestra el comportamiento de un complejo
soluble (A), o un complejo menos o poco soluble (B). Higuchi y Connors (1965)
Adaptada de Loftsson(2007)................................................................................... 31
Figura 7: Modelos de simulación para un sistema de un determinado tamaño y escala de
tiempo.Roca Sabio,A (2013). .................................................................................. 37
Figura 8: Condiciones periódicas de contorno. La célula central es replicada en ambas
direcciones. Adaptada de Zhiju Zheng (2010). ...................................................... 46
Figura 9: Sistema de átomos interaccionantes que muestra un potencial cutoff. Adaptada de
Zhiju Zheng (2010). ................................................................................................ 47
Figura 10: Ilustración del problema de calcular ΔGunión . Ross Walker (2006) Adaptado de
Hermansson, A. (2015) ........................................................................................ 49
Figura 11: Ciclo termodinámico utilizado en cálculos de MM/PBSA y MM/GBSA. Ross
Walker (2006). Adaptado de Hermansson, A. (2015) ........................................ 49
Figura 12: Espectrofotómetro UV/Vis 8453 de Agilent. ........................................................ 54
Figura 13: Espectrofotómetro FT/NIR de Perkin-Elmer ....................................................... 55
Figura 14: Calorímetro diferencial de barrido NETZSCH STA 449 F3 Jupiter. .................. 55
Figura 15: Sistema de coordenadas que describe el proceso de inclusión de la β-ciclodextrina
y fenbendazol. ....................................................................................................... 57
Figura 16: Diagrama de solubilidad del fenbendazol en presencia de β-ciclodextrina ........ 60
10
Figura 17: Espectro UV/Vis del complejo fenbendazol y β-ciclodextrina a concentración de
0 mM a 12 mM de β-ciclodextrina ....................................................................... 62
Figura 18: Comportamiento del fenbendazol a distintas concentraciones de β-ciclodextrina
.............................................................................................................................. 63
Figura 19: Método de Benesi-Hildebrand para una estequiometría 1:1 del complejo
fenbendazol y β-ciclodextrina. ............................................................................ 64
Figura 20: Método de Benesi-Hildebrand para una estequiometría 1:2 del complejo
fenbendazol y β-ciclodextrina. ............................................................................. 65
Figura 21: Espectro FT-IR de (a) β-ciclodextrina,(b) fenbendazol y (c) mezcla binaria. ..... 66
Figura 22: Espectro FT-IR de (a)β-ciclodextrina, (b) fenbendazol, (d) complejo fenbendazol:β-
ciclodextrina en relación molar 1:1 en agua. ........................................................ 68
Figura 23: El espectro FT-IR de (d) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar
1:1 en agua, (e) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:2 en
agua, (f) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:10 en agua.
.............................................................................................................................. 68
Figura 24: El espectro FT-IR de (g) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar
1:2 en HCl/etanol (1 %), (h) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación
molar 1:10 en HCl/etanol (1 %). .......................................................................... 69
Figura 25: Espectro DSC-TGA de (a)β-ciclodextrina. .......................................................... 71
Figura 26: Espectro DSC-TGA de (b) fenbendazol ............................................................... 71
Figura 27: Espectro DSC-TGA de (c) Mezcla binaria .......................................................... 72
Figura 28: Espectro DSC-TGA de (d) Complejo fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) en agua
.............................................................................................................................. 73
Figura 29: Espectro DSC-TGA de (d) Complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación
molar 1:2 en agua ............................................................................................... 74
Figura 30: Espectro DSC-TGA de (a) β-ciclodextrina, (b) fenbendazol, (c) mezcla binaria (d)
complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:1 en agua. ............. 74
Figura 31: Energías de complejación de fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) a diferentes
posiciones en el eje Z (coordenada de reacción) para la orientación A a un nivel
del PM6 ............................................................................................................... 75
Figura 32: Energías de complejación de fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) a diferentes
posiciones en el eje Z (coordenada de reacción) para la orientación B a un nivel
de PM6 ................................................................................................................ 76
11
Figura 33: Energías de complejación de fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) a diferentes
posiciones en el eje Z (coordenada de reacción) para la orientación A a un nivel
de B3LYP/6-31G ................................................................................................. 77
Figura 34: Energías de Complejacion de fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) a diferentes
posiciones en el eje Z (coordenada de reacción) para la orientación B a un nivel
de B3LYP/6-31G ................................................................................................. 77
Figura 35: Estructura de los complejos fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) optimizados con
el nivel B3LYP/6-31G para la orientación A (parte superior) y orientación B
(parte inferior). Vista frontal (parte izquierda) y vista lateral (parte derecha).
............................................................................................................................ 79
Figura 36: Estructuras del complejo fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) obtenidos para
alcanzar la orientación A desde los 0ns hasta los 10 ns .................................... 82
Figura 37: Gráfica de RMSD para el complejo fenbendazol:β-ciclodextrina, el ligando
fenbendazol, la ciclodextrina para la orientación A y C .................................... 84
Figura 38: Estructura del complejo fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) de más baja energía
en medio acuoso obtenidos en 10 ns de simulación ........................................... 85
Figura 39: Representación esquemática de la interacción del fenbendazol y β-ciclodextrina
de más baja energía en medio acuoso en 11 ns de simulación .......................... 86
Figura 40: Estructura del complejo fenbendazol:β-ciclodextrina (1:2) de la orientación C.
.............................................................................................................................. 86
12
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Sistema de Clasificación Biofarmacéutica (BCS) con características de fármacos
(Adaptada de Khadka, P., Ro, J., Kim, H., Kim, I., et al. (2014)) ........................... 16
Tabla 2: Productos farmacéuticos que contienen β-CD en el mercado global (Adaptado de
Miranda, J. C. de, Martins, T. E. A., Veiga, F., & Ferraz, H. G. (2011)).............. 24
Tabla 3: Propiedades de las ciclodextrinas naturales (Szejtli,1994;Veiga et al.,2006;
Brewster, Loftsson, 2007;Wintgens y Amiel, 2010). Adaptado de Jullian
Matthaei.C (2007) ................................................................................................. 26
Tabla 4: Concentración obtenida de fenbendazol en los complejos sintetizados .................. 66
Tabla 5: Distribución de frecuencias características de β-ciclodextrina y los complejos
sintetizados. ............................................................................................................ 70
Tabla 6: Confórmeros de menor energía a diferentes niveles de teoría sin restricción alguna
para las orientaciones A y B ................................................................................... 78
Tabla 7: Energías de complejación a distintos niveles de teoría para el complejo
fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) en medio gaseoso. ........................................... 80
Tabla 8: Energías de complejación a distintos niveles de teoría para el complejo β-
ciclodextrina:fenbendazol (1:1) en medio acuoso. .................................................... 80
Tabla 9: Energías libre de unión (kcal/mol) con la aproximacion de MM-PBSA del sistema
de fenbendazol:β-ciclodextrina ................................................................................ 87
Tabla 10: Optimización de energía y cálculos singlepoint de las moléculas de partida en el
vacío……………………………………………………………………………………….96
Tabla 11: Optimización de energía de los confórmeros generados para la orientación A con
el semiempírico PM6 en el vacío……………………………………………………….97
Tabla 12: Optimización de energía de los confórmeros generados para la orientación B con
el semiempírico PM6 en el vacío……………………………………………………….98
Tabla 13: Optimización de energía de los confórmeros generados para la orientación A con
el funcional B3lyp/6-31G en el vacío…………………………………………………..99
Tabla 14: Optimización de energía de los confórmeros generados para la orientación B con
el funcional B3lyp/6-31G en el vacío…………………………………………………100
Tabla 15: Cálculo de energía del tipo singlepoint de los confórmeros generados para la
orientación A con los funcionales de Grimme y de Truhlar en el vacío………….101
13
Tabla 16: Cálculo de energía del tipo singlepoint de los confórmeros generados para la
orientación B con los funcionales de Grimme y de Truhlar en el vacío………….101
14
ÍNDICE DE ECUACIONES
Ecuación 1: Solubilidad aparente para una relación estequiométrica 1:1 (hospedero:huésped)
............................................................................................................................. 32
Ecuación 2: Pendiente del diagrama de solubilidad para una relación estequiométrica 1:1
(hospedero:huésped)............................................................................................ 33
Ecuación 3: Pendiente del diagrama de solubilidad para una relación estequiométrica 2:1
(huésped:hospedero) ........................................................................................... 33
Ecuación 4: Modelo de ajuste para una relación estequiométrica 1:2 (huésped:hospedero)
para el diagrama de solubilidad ......................................................................... 33
Ecuación 5: Constante de formación del complejo 1:1 (hospedero:huésped) ........................ 34
Ecuación 6: Modelo de Benesi-Hildebrand para la relación estequiométrica 1:1
(hospedero:huésped) ........................................................................................... 35
Ecuación 7: Modelo de Benesi-Hildebrand para la relación estequiométrica 2:1
(hospedero:huésped) .......................................................................................... 35
Ecuación 8: Ecuación simplificada de Schrödinger .............................................................. 37
Ecuación 9: Ecuación de la energía de valencia molecular para el método PM3 ................ 39
Ecuación 10: Ecuación de Kohn y Sham ............................................................................... 41
Ecuación 11: Promedio termodinámico de una magnitud dinámica arbitraria A................. 44
Ecuación 12: Ecuación del campo de fuerza para el programa AMBER 14 ......................... 45
Ecuación 13: Contribución electrostática según el modelo generalizado de Born ............... 50
Ecuación 14: Ecuación de Poisson- Boltzmann ..................................................................... 50
Ecuación 15: Contribución electrostática según el modelo de Poisson- Boltzmann ............. 51
Ecuación 16: Determinación de la constante de asociación para el modelo estequiométrico
1:1 y 1:2 según Benesi-Hildebrand ................................................................. 59
Ecuación 17: Relación molar para fenbendazol:β-ciclodextrina con la eficiencia de
complejación ..................................................................................................... 62
15
1. INTRODUCCIÓN
La biodisponibilidad es un término farmacocinético que describe la velocidad y el grado
con que una sustancia activa es absorbida a partir de un medicamento y se vuelve
disponible en su lugar de acción. Parámetros como la solubilidad, velocidad de disolución,
permeabilidad gastrointestinal y el metabolismo del primer paso ejercen un control sobre
la biodisponibilidad de los medicamentos. La solubilidad de los medicamentos en agua es
una propiedad que juega un rol fundamental en la absorción del principio activo después
de la administración oral y se considera una medida de equilibrio. Además, la velocidad
con la que el principio activo pasa de estado sólido a una solución es críticamente
importante cuando el tiempo de disolución es limitado, tal es el caso de los medicamentos
de liberación controlada [1].
En la última década los cálculos computacionales y el modelaje molecular están siendo
usados por la química y uno de los métodos más adecuado para aumentar la potencia del
fármaco in vitro es la adición de grupos lipofílicos a determinada posición de la estructura
molecular. Esto ha causado un aumento significativo del número de moléculas de carácter
lipófilo, poco solubles. De esta forma el número de candidatos de principios activos
insolubles en agua se ha incrementado [2].
El sistema de clasificación biofarmacéutica (BSC) clasifica los medicamentos basados en
su solubilidad acuosa y permeabilidad intestinal, además correlaciona la disolución i n
v i t ro y la biodisponibilidad in vivo; esta clasificación abarca cuatro grupos, basados en
su habilidad de atravesar las membranas biológicas y su solubilidad acuosa. Entre estas
categorías se tiene la categoría (I) los fármacos que poseen alta solubilidad y alta
permeabilidad, categoría (II) los que poseen baja solubilidad y alta permeabilidad,
categoría (III), alta solubilidad y baja permeabilidad y categoría (IV) con baja solubilidad
y baja permeabilidad (Tabla 1) [2].
De los diversos compuestos que pertenecen a la clase II, se encuentran los fármacos del
tipo benzimidazol, los cuales han probado tener un amplio espectro de eficacia frente a
parásitos tisulares e intestinales y son ampliamente usados para el control de estos en el
ganado bovino, equino y otros mamíferos.
16
Entre los representares de los benzimidazoles se tiene al fenbendazol y albendazol (Figura
1a y Figura 1b) debido a su particular largo tiempo de vida media in vivo. Estos son
generalmente pobremente solubles en agua y son administrados oralmente en suspensión,
pasta, polvo o en un bolo intraluminal. De esta manera, el 2-aminobenzimidazol-1-
carbamato tiene baja solubilidad probablemente debido a la presencia de un enlace de
hidrógeno intramolecular entre el grupo NH del benzimidazol y el carbonilo del
carbamato. Esta característica ha sido hasta ahora el mayor obstáculo para el desarrollo de
aplicaciones más convenientes como para ser administradas con agua de beber [4].
El problema para los benzimidazoles en general y para el fenbendazol en particular, es su
baja solubilidad y por lo tanto, su absorción limitada, lo que, unido a su metabolismo
rápido, hace que se use frecuentemente en dosis elevadas para mejorar su efectividad.
Sería idóneo que las nuevas formulaciones lleguen a mejorar estos factores limitantes [4].
Tabla 1: Sistema de Clasificación Biofarmacéutica (BCS) con características de
fármacos (Adaptada de Khadka, P., Ro, J., Kim, H., Kim, I., et al. (2014))
Clase
BCS Solubilidad Permeabilidad Absorción Ejemplos
I Alta Alta Bien
absorbido
Metoprolol, Diltiazen,
Propranolol
II Baja Alta Bien
absorbido
Fenitoina, Nifedipino,
Danazol
III Alta Baja Variable Cimetidina, Aciclovir,
Captopril
IV Baja Baja Pobremente
absorbido
Hidroclorotiazida,
Taxol, Furosemida
Figura 1: (a) Estructura química del fenbendazol (parte izquierda) y (b) estructura
química de albendazol (parte derecha).
17
El desarrollo de nuevas formulaciones de medicamentos para su uso en medicina humana
y veterinaria, requiere de un enfoque multidisciplinar. Con el uso de la tecnología
farmacéutica, se puede mejorar la actividad farmacológica y/o farmacocinética. Entre las
herramientas de las formulaciones de fármacos, se tiene el uso cada vez más frecuente de
excipientes químicamente modificados para mejorar características como solubilidad,
desintegración, aglutinación, compresibilidad y uso de la química computacional como
una herramienta más para la predicción de sus propiedades [4].
Con el fin de diseñar sistemas de administración de fármacos, se han desarrollado varios
tipos de materiales transportadores para llevar la cantidad necesaria de principio activo
hacia el sitio de acción, con gran eficiencia y precisión.
Las ciclodextrinas son potenciales candidatos para esta función por su habilidad de alterar
las características fisicoquímicas y propiedades biológicas de la molécula huésped a
través de la formación de los complejos de inclusión en estado sólido y solución. La alfa,
beta y gama ciclodextrinas son las formas más comunes de ciclodextrinas naturales,
consistiendo en seis, siete y ocho residuos de glucosa, respectivamente, unidos a través
de enlaces glucosídicos α-1,4, formando un compuesto macrocíclico. Cada ciclodextrina
tiene sus propiedades y una capacidad de formar complejos de inclusión hospedero-
huésped con moléculas “huésped” específicas, esta habilidad depende de su
compatibilidad con la cavidad hidrofóbica de la ciclodextrina [5][6].
El conocimiento de cómo es que la molécula de ciclodextrina se acompleja con su
huésped es la clave de la formación del complejo. Así algunos estudios se orientan a
conocer las interacciones responsables de la estabilidad de este complejo. Estudios sobre
el mecanismo de inclusión entre ciclodextrinas y fármacos esteroideos fueron realizados
a través de simulaciones de dinámica molecular, se encontró una buena correlación entre
estos y sugiriendo que las fuerzas intermoleculares que priman son las de tipo de van der
Waals y las interacciones hidrófobas [7].
Debido a la capacidad de las ciclodextrinas para formar complejos de inclusión, su
naturaleza apolar dentro de su cavidad y su naturaleza polar fuera de ella, es posible que
moléculas insolubles en agua puedan llegar a ser completamente solubles mediante un
tratamiento con disoluciones acuosas de ciclodextrina, sin que se produzca modificación
química alguna en la molécula huésped, ya que no se origina ningún enlace covalente
durante la interacción entre la ciclodextrina y la molécula insoluble en agua [8].
18
Varias hipótesis han sido propuestas para la formación de complejos de ciclodextrinas y
su estabilización, así como también la liberación de agua del interior de la cavidad, la
liberación de la tensión del anillo, interacciones hidrofóbicas, puentes de hidrógeno,
fuerzas de inducción, fuerzas de dispersión de London y los factores estéricos. Sin
embargo, el mecanismo por el cual suceden todas estas contribuciones relativas no son
aun bien conocido [8].
De hecho, aunque las constantes de estabilidad han sido medidas para ciertos complejos
de ciclodextrinas, en la actualidad todavía resulta difícil predecir “a priori” la estabilidad
real de un posible complejo entre una ciclodextrina dada y una molécula de fármaco en
un disolvente dado y después establecer si esta complejación podría ser realmente factible
[9].
Diversos estudios han sido realizados para caracterizar complejos de inclusión entre
fármacos y ciclodextrinas. La β-ciclodextrina es la más utilizada debido al bajo costo y al
tamaño de su cavidad apropiado para acomodar una gran variedad de fármacos. Las
técnicas experimentales más utilizadas han sido las técnicas de análisis térmico,
calorimetría exploratoria diferencial, espectroscopia de resonancia magnética nuclear
(RMN), las espectroscopias en el ultravioleta-visible y en el infrarrojo [1][11].
La resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica que evidencia mejor la formación
del complejo de inclusión. De acuerdo a la literatura, las alteraciones ocurren
principalmente en los H3 y H5, incluso en el H6 (Figura 2), dependiendo de la profundidad
con la que la molécula huésped entra en la cavidad de la ciclodextrina. Esta técnica
fortalece las informaciones de la topología de interacción entre la molécula huésped y la
ciclodextrina y también sobre la estequiometría y la constante de asociación del complejo
[1][11].
Figura 2: Representación esquemática de los hidrógenos H2, H3, H4, H5 y H6 de la
β - c i c l o d e x t r i n a
19
Estudios como los del fármaco dapsona y de las ciclodextrinas sugieren que la
caracterización en estado sólido y en solución son herramientas importantes para entender
el mecanismo de inclusión de estos complejos. Estos permitieron verificar la formación
de este. Así mismo, en otros estudios de Guilherme Lionello sobre una caracterización
fisicoquímica del complejo de inclusión de tiabendazol:β-ciclodextrina, se comparó sus
estudios experimentales y teóricos encontrando una correlación entre resultados,
destacando en este estudio el uso de cálculos computacionales como el uso de la teoría
del funcional de densidad (DFT) para su aproximación teórica y también el uso de
modelos semiempíricos [1][10].
Numerosas técnicas han sido desarrolladas para la preparación y caracterización de los
complejos de inclusión con ciclodextrinas. Según Sharma, entre los métodos de
preparación se tiene los métodos de coprecipitación, kneading, griding, neutralización y
liofilización. Muchas de ellas demuestran ser adecuadas dependiendo de las
características fisicoquímicas de las moléculas huésped. Así mismo en su caracterización
se emplean técnicas de espectroscopía infrarroja (IR), espectrofotometría UV/Vis,
espectrometría de RMN (Resonancia Magnética Nuclear), difracción de rayos X,
espectrometría de masas, dicroísmo circular y espectroscopía de fluorescencia. Algunos
de estas técnicas evidencian la formación del complejo, pero otras tienen varias
limitaciones en el rango de aplicaciones. De esta forma, métodos de modelización
molecular han sido propuestos recientemente como herramientas poderosas para obtener
información acerca de las estructuras tridimensionales y las energías de interacción de la
inclusión de complejos [9][11].
Un estudio sobre formación de complejos de inclusión de ciclodextrinas y el fármaco
meloxican, en el uso de cálculos de la teoría de la densidad del funcional (DFT) a través
de la aplicación del funcional B3LYP/6-31G, permitió la obtención de geometrías más
confiables entre los demás métodos semiempíricos y también las interacciones de energía
pueden ser obtenidas con alta precisión. Sin embargo, los cálculos fueron desarrollados
en moléculas en fase gas, despreciando las posibles interacciones que son dadas por la
solvatación en el sistema de inclusión [6] [12].
Otro método computacional desarrollado para estudiar las interacciones moleculares
entre el complejo de inclusión de β-ciclodextrina y agentes antiulcerantes fue de mecánica
20
molecular, con el cuál la molécula de cloranbucil es estabilizada en gran medida sobre la
cavidad de la ciclodextrina. La estabilización entálpica se debió a la formación de enlaces
de hidrógeno e interacciones van der Waals con un ajuste favorable. Este proceso de
inclusión fue impulsado por la entalpía [13].
Sin embargo, un problema fundamental en la formación de los complejos de inclusión
huésped-hospedero entre las ciclodextrinas es su estabilidad y estequiometría.
Investigaciones demuestran que el complejo de inclusión entre β-ciclodextrina y valsartan
solo es viable en relación 1:1 y se verificó que es inviable en relación 2:1. Este estudio
fue realizado a través de dinámica molecular y métodos semiempíricos [14].
El presente trabajo busca contribuir a la solución de la problemática de la poca solubilidad
de los fármacos de tipo benzimidazol, al caracterizar el complejo de inclusión entre
fenbendazol y β-ciclodextrina en solución, con el uso de herramientas como la
espectroscopía de absorción UV/Vis, espectrometría de RMN, calorimetría diferencial de
barrido (DSC), espectroscopía IR y cálculos computacionales.
La β-ciclodextrina es un potencial candidato para poder formar un complejo con el
fenbendazol, potenciando de esta manera la solubilidad del fármaco de partida. Esto
podría significar el desarrollo de nuevos tipos de formulaciones en el sector farmacéutico.
No obstante, la mejora de la solubilidad también tiene que acompañar a la estabilidad del
complejo formado, siendo necesario hacer una caracterización de estos.
21
2. OBJETIVOS
a. OBJETIVO GENERAL
Realizar una caracterización fisicoquímica del complejo formado entre
fenbendazol y β-ciclodextrina en solución acuosa.
b. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Preparar el complejo de fenbendazol y β-ciclodextrina
Caracterizar el complejo en solución por espectrofotometría de absorción
ultravioleta.
Caracterizar el complejo en estado sólido a través de técnicas de
calorimetría diferencia de barrido (DSC) y espectroscopía infrarroja.
Aplicar cálculos teóricos para determinar las energías asociadas a su
formación en estado gaseoso y acuoso. Se usarán cálculos semiempíricos
(PM6), de la teoría del funcional de densidad (DFT) y de dinámica
molecular.
A continuación, se detallan las propiedades de las ciclodextrinas y del fenbendazol, se
describe su química y en particular de los complejos de inclusión. También se hace
indicación de cuál es el interés práctico del estudio de sus interacciones con las
ciclodextrinas.
22
3. MARCO TEÓRICO
3.1. FENBENDAZOL
El fenbendazol, metil-5-(feniltio) benzimidazol-2-carbamato, es un fármaco de uso
veterinario derivado del benzimidazol, con propiedades antihelmínticas, antifúngicas y
bactericidas. Su principal aplicación es en la quimioterapia de parásitos de canes. El
fenbendazol tiene amplio espectro de acción que incluye prevención de transmisión
transplacentária de T.canis, tratamiento de la giardiasis y fases parasitarias de huevos,
larvas y adultos de otros parásitos [15][16].
El mecanismo de acción es debido a la unión del fármaco a la tubulina dimérica del
nemátodo para prevenir la polimerización de la tubulina durante el ensamblamiento de los
microtúbulos. Los microtúbulos son esenciales en la mitosis y metabolismo energético.
Estos benzimidazoles son más efectivos en contra de células con división activa que están
presentes en los huevos del nemátodo y las larvas. El parásito morirá por interferencia con
su habilidad para metabolizar energía [15][16].
El fenbendazol se administra vía oral a razón de 50 mg/kg cada 24 horas durante 3 días
consecutivos contra la giardiasis. Pero para otro tipo de parásitos, una sola dosis suele ser
altamente eficaz. El fenbendazol ofrece el margen de seguridad más amplio y la mejor
eficacia de todos los benzimidazoles. No obstante, una de sus desventajas es que se
absorbe por el tracto gastrointestinal en pequeña proporción, alcanzando niveles
plasmáticos en 2 a 4 horas no mayores del 1 % de la dosis administrada [15][16].
En cuanto a la fotoestabilidad, estudios de Soto et al. sobre fenbendazol evidenciaron
fotosensibilidad en presencia de luz directa, más no en luz indirecta y oscuridad. Se
evidenció por FT-IR que las señales características del grupo amida desaparecieron,
indicando un rompimiento del enlace del grupo amida por la exposición a la luz en el
tiempo. Estos cambios se observaron en un medio ácido [17].
Un factor limitante para la eficiencia de este fármaco es su baja solubilidad en agua,
reportada en la literatura de menor a 1 mg/L según la ficha de datos del Directorio Europeo
para la Calidad de Medicinas y Cuidado de la Salud (EDQM). De esta manera el uso de
excipientes que ayuden a mejorar esta propiedad puede ser considerada una alternativa
para mejorar su biodisponibilidad.
23
3.2. CICLODEXTRINAS
Las ciclodextrinas son una familia de oligosacáridos cíclicos derivados del almidón que
contienen unidades de (α-1,4)-D-glucopiranosa y poseen una superficie externa
hidrofílica y una cavidad lipofílica central, y actualmente han recibido gran atención en
el campo farmacéutico debido a la capacidad de formar complejos de inclusión con
muchos fármacos lipofílicos.
Las ciclodextrinas tienen larga aplicación a través de la historia. Estas fueron descubiertas
por Villiers en 1891, sin embargo, ellas no llegaron a utilizase hasta que French y sus
colaboradores modificaron el proceso químico para su producción en 1950. Las
ciclodextrinas son obtenidas de la digestión del almidón por una enzima llamada
glucosiltransferasa. Pero la disponibilidad de las ciclodextrinas y su alto costo de
producción limitaron las investigaciones y aplicaciones hasta 1970. Con el avance de la
biotecnología, esto cambió rotundamente llegándose a producir ciclodextrinas con alto
grado de pureza y a un bajo costo [3].
De acuerdo con Yang, H. (2008), más de 30 diferentes productos farmacéuticos contienen
ciclodextrinas y son vendidos alrededor del mundo (Tabla 2) [3].
La familia de ciclodextrinas comprende una serie de oligosacáridos cíclicos, y varios
miembros de esta familia son usados en la industria farmacéutica, química y aplicaciones
en la ciencia de los alimentos. Las ciclodextrinas son generalmente cristalinas, solubles
en agua, cíclicas, homogéneas, no reductoras. Los tres tipos de ciclodextrina más
conocidas son la α-ciclodextrina, β-ciclodextrina y γ-ciclodextrina, las cuales poseen
respectivamente 6, 7 y 8 monómeros de glucosa (Figura 3).
La estructura molecular de las ciclodextrinas fue definida mediante estudios
cristalográficos por la técnica de difracción de rayos X, estas presentan una forma toroidal
o cónica debido a la ausencia de libre rotación de las ligaciones glicosídicos y de la
conformación de cada unidad de glucosa. En su estructura presenta dos grupos
hidroxílicos: los secundarios, que se encuentran localizados en el borde más amplio, están
ligados a los átomos de carbono C2 y C3, mientras que los primarios se encuentran
ubicados en el borde más estrecho y ligado a los carbonos C6 (Figura 3). Esta
característica es debido a la libre rotación de los grupos hidroxílicos primarios, que
reducen el diámetro efectivo de la cavidad. En cuanto a los grupos hidroxilos secundarios,
24
estos constituyen una cadena relativamente rígida. Por eso esta cavidad de las
ciclodextrinas es más larga según Bekers et al. [26].
Tabla 2: Productos farmacéuticos que contienen β-CD en el mercado global (Adaptado de Miranda, J.
C. de, Martins, T. E. A., Veiga, F., & Ferraz, H. G. (2011))
Nombre de
Marca Fármaco/ciclodextrinas Formulación Compañía
Prostarmon E PGE2/βCD Tableta sublingual Ono (Japón)
Caverject Dual Alprostadil/ αCD Solución i.v Pfizer (USA)
Aerodiol 17-β-Estradiol /MβCD Spray Nasal Servier (Francia)
Cetirizina Cetirizina/βCD Tableta masticable
Losan Pharma
(Suiza),UCB Pharma
(USA)
Fluner Flunarizina/βCD Tableta Geno Pharmaceutical
Vitaseptol Tiomersal/βCD Solución oftálmica Europhta (Mónaco)
Mobitil Meloxicam/βCD Tableta
supositorio
Medical Union
Pharmaceuticals (Egipto)
Abilify Aripiprazol /sulfobutil-βCD Solución inyección
muscular
Bristol-Myers Squibb
(USA), Otsuka Pharm.
(Japón, USA)
Cerenia Maropitant/sulfobutil-βCD Solución parenteral Pfizer Animal Health
(USA)
Dexocort Hidrocortisona/HPβCD Solución Actavis (UE)
Nicorette Nicotina/βCD Tableta sublingual Pfizer (USA)
Vfend Voriconazol/Sulfobutil eter-βCD Solución i.v Pfizer (USA)
MitoExtra Mitomicina /HPβCD Solución i.v Novartis (Suiza)
Voltaren Diclofenaco sódico /HPβCD Solución oftálmica Novartis (Suiza)
25
Las β-ciclodextrinas consisten en siete monómeros de glucosa unidas covalentemente a
través del enlace glucosídicos α-1,4. Desde el punto de vista topológico, este macrociclo
puede ser observado como un cono truncado, en el cual el borde interno (~ 6,4 Å) lleva
los grupos hidroxilos primarios y el borde externo (~ 15,4 Å) lleva los grupos hidroxilos
secundarios. Dentro de la cavidad toroidal no hay presencia de grupos hidroxilos. Esta
zona de la molécula tiene un fuerte carácter hidrófobo, de acuerdo a esta característica,
junto con las fuerzas de van der Waals y los puentes de hidrógeno, permiten a la β-
ciclodextrina alojar pequeñas moléculas en solución acuosa [26].
Figura 3: Estructuras químicas de las moléculas de la α-ciclodextrina, β-
ciclodextrina y γ-ciclodextrina. Adaptada de Miranda, J. C. de, Martins, T.
E. A., Veiga, F., & Ferraz, H. G. (2011)
26
Las principales ventajas de las ciclodextrinas naturales como transportadores son: (1) su
bien definida estructura química, que proporcionan muchos sitios potenciales de
modificación química; (2) la capacidad de las ciclodextrinas de tener diferente tamaño de
cavidades; (3) baja toxicidad y acción farmacológica; y (4) la protección del “huésped”
incluido la degradación. Su principal aplicación de las ciclodextrinas es la mejora de la
solubilidad, estabilidad y biodisponibilidad de la molécula “huésped”.
Como se mencionó anteriormente, las tres principales ciclodextrinas difieren entre sí por
la cantidad de unidades de glucosa y esa diferencia le confiere propiedades únicas a cada
ciclodextrina (Tabla 3).
Debido a estas características, las ciclodextrinas pueden ser
disueltas en agua y además pueden encapsular diferentes tipos de compuestos
hidrofóbicos en su interior, especialmente compuestos aromáticos, formando así
variados complejos de inclusión. De esta manera la molécula huésped puede ingresar en
un medio hidrofílico sin necesariamente cambiar su solubilidad, sino es la
Propiedades α-CD β-CD γ-CD
Unidades de glucosa 6 7 8
Peso molecular (g/mol) 972 1135 1297
Diámetro externo (Å) 14,6 15,4 17.5
Diámetro interno (Å) 4,7-5,3 6,0-6,5 7,5-8,3
Altura (Å) 7,9 7,9 7
Volumen de la cavidad (Å) 174 262 427
Forma de cristales Red hexagonal Paralelogramos
monocíclicos
Prisma
cuadrático
pKa por potenciometría 12,333 12,202 12,081
Constante de difusión a
4 0 ° C (m/s)
3,443 3,232 3,0
Hidrólisis por α-amilasa Insignificante Lento Rápido
Tabla 3: Propiedades de las ciclodextrinas naturales (Szejtli,1994; Veiga et al.,2006; Brewster, Loftsson,
2007;Wintgens y Amiel, 2010). Adaptado de Jullian Matthaei.C (2007)
27
ciclodextrina en sí la que se disuelve en agua mientras que la molécula huésped está
en el interior hidrofóbico de la ciclodextrina, sin tener contacto con el agua [18].
No obstante, en ocasiones, la contribución de la ciclodextrina no es suficiente para
obtener la solubilidad deseada, por lo que se han sintetizado numerosas ciclodextrinas
derivatizadas, las que, dependiendo del sustituyente, pueden aumentar la solubilidad de
la misma ciclodextrina, modificar su volumen e hidrofobicidad y estabilizar a la molécula
huésped, lo que puede provocar cambios en las propiedades físicas, biológicas y químicas
de dichas moléculas. Ejemplo de ello son: la carboximetil-β-ciclodextrina, sulfobutiléter-
β-ciclodextrina, 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina y la 2,6 dimetil-β-ciclodextrina.
Dentro de las ventajas que presentan las ciclodextrinas, destaca su baja toxicidad, lo que
permite que sean utilizadas en química analítica, agricultura, en industrias farmacéuticas
y alimentarias [18].
Las modificaciones en la estructura de las ciclodextrinas que se evidencian en la Figura 4,
generalmente son realizadas por la sustitución de los grupos hidroxilos
primarios/secundarios por diversos grupos funcionales, siendo clasificados en derivados
hidrofílicos (grupo metil e hidroxipropil), hidrófobos (grupo acetil y etil), anfifílicas
(estructuras de micelas) y derivados iónicos (sulfobutil-éter) según Silva Arrais, M.
(2012).
Figura 4: Sitios de modificaciones frecuentes en la β-CD (Veiga et al, 2006). Adaptada de
Silva Arrais, M. (2012).
28
3.3. COMPLEJOS DE INCLUSIÓN Y EQUILIBRIO ASOCIACIÓN-DISOCIACIÓN
La formación de un complejo de inclusión estable en solución acuosa puede ser atribuida,
en parte, al hecho de que las ciclodextrinas poseen una cavidad apolar con una geometría
bien definida. Los complejos de inclusión pueden ser modelos útiles del proceso de
complejación biomolécula-ligando, debido a su similaridad en sus propiedades
termodinámicas de asociación cuando se compara con la relación antígeno-anticuerpo,
ligando-ADN, enzima-sustrato y complejos proteína-carbohidrato [19].
Las constantes de asociación proveen una medida cuantitativa de la estabilidad del
complejo y un completo entendimiento del complejo de inclusión es impedido por la
incertidumbre en el valor de la constante de asociación. Entonces, es necesario llevar a
cabo estudios de asociación entre el sistema hospedero y huésped, en los cuales las
estructuras moleculares de estos son variadas sistemáticamente para permitir una
correlación de parámetros de la estructura química con la estabilidad del complejo [19].
La condición mínima requerida para la formación del complejo de inclusión está en la
compatibilidad geométrica entre la molécula receptora y el sustrato. El tamaño y la
geometría de la molécula a ser incluida en la ciclodextrina deben ser adecuados para la
cavidad apolar, pues dependiendo de la ciclodextrina utilizada, la cavidad puede ser
pequeña o grande para la acomodación del huésped. La α-ciclodextrina, por poseer una
cavidad pequeña, es utilizada en la complejación de moléculas pequeñas o de cadenas
laterales de moléculas grandes. En cuanto a la γ-ciclodextrina, se usan para complejar
moléculas grandes como antibióticos macrólidos o esteroides y la β-ciclodextrina es muy
útil en aquellas moléculas que por lo menos tengan un anillo aromático.
Otra condición a ser observada es la polaridad de la molécula huésped pues, en general,
las moléculas hidrófobas tienen mayor afinidad por la cavidad apolar de la ciclodextrina
cuando está en solución acuosa según Loftson y Brewster [20].
Así, la formación del complejo de inclusión está condicionada a la estructura y
propiedades fisicoquímico de los fármacos y las ciclodextrinas.
En solución acuosa la cavidad hidrófoba de la ciclodextrina está llena de moléculas de
agua. La adición de moléculas hidrófobas como fármacos, promueve la movilización de
las moléculas de agua que se encuentran originalmente en el interior de la cavidad de la
ciclodextrina. Debido al microambiente termodinámicamente desfavorable (interacción
polar-apolar) de la cavidad, las moléculas de agua tienden a salir de ella (Szejtli, 1998),
29
contribuyendo también un aumento de entropía. Este proceso lleva a la encapsulación
total o parcial de la molécula huésped en la cavidad de la ciclodextrina, formándose un
complejo soluble en agua. La estequiometría de esos complejos puede variar entre las
siguientes proporciones 1:1; 1:2; 2:1 y 2:2; pero es más común y frecuente encontrar
complejos 1:1 (una molécula del fármaco y una de la ciclodextrina) [21].
La extensión de la complejación en medio acuoso es caracterizada por la constante de
asociación o estabilidad del complejo, esta constante es directamente proporcional al
grado de asociación de la molécula huésped en la cavidad de la ciclodextrina. Su valor
debe estar comprendido entre 50 y 2000 L.mol-1 para que los complejos formados tengan
aplicación práctica [20].
Figura 5: Ilustración esquemática de la asociación de la ciclodextrina libre (hospedero)
con el ligando (huésped) para formar un complejo de inclusión. Adaptada de
Crini,G (2014).
La constante de asociación es un parámetro muy importante en la evaluación de la
afinidad y del grado de conexión de las moléculas encapsuladas en la cavidad de la
ciclodextrina.
Las fuerzas intermoleculares que estabilizan al complejo pueden ser:
Puente de hidrógeno
En el cual se involucra un átomo de hidrógeno ligado a un elemento electronegativo.
Generalmente estas interacciones de puentes de hidrógeno entre el huésped y la
30
ciclodextrina son provenientes de los grupos hidroxilos primarios (C6-OH) de las
ciclodextrinas, que pueden girar en el enlace C5-C6. En contraste, los hidroxilos
secundarios, enlazados a los C2 y C3, están rígidamente enlazadas.
Fuerzas de van der Waals
Según Tabushi son responsables por la estabilización del complejo de inclusión,
debido a la remoción de agua en la cavidad de la ciclodextrina.
Todas estas interacciones pueden ser consideradas relativamente débiles, pero
proporcionan efectos sinergístico en conjunto. De esta forma, las moléculas
interaccionan unas con otras, resultando en la formación de complejos con
estabilidad suficiente para garantizar su aislamiento. (Quiñones, 2001).
3.4. ISOTERMA DE SOLUBILIDAD
En un sistema heterogéneo constituido por el huésped, hospedero y agua, es posible
observar la variación de solubilidad del huésped a través de las isotermas de solubilidad.
Esta variación puede repercutirse en un aumento ligero, un aumento hasta un cierto límite
o una disminución. Experimentalmente este ensayo es realizado con la adición del
fármaco en exceso a varios viales que contienen la solución de ciclodextrina en gradiente
de concentración. Estos viales con su contenido son mantenidos sobre agitación a una
temperatura constante. Después del equilibrio alcanzado el sobrenadante es analizado
para determinar la concentración total del huésped. Con los valores obtenidos se
construye un diagrama de fases, donde se expresa la concentración del huésped versus el
gradiente de concentración del hospedero (Higuchi y Connors, 1965; Brewster y
Loftsson, 2007).
31
Figura 6: Diagrama de solubilidad de fases que muestra el comportamiento de un
complejo soluble (A), o un complejo menos o poco soluble (B). Higuchi y
Connors (1965) Adaptada de Loftsson (2007).
Nota: [G] es la concentración de la molécula huésped, [H] es la concentración de la molécula que es el
hospedero y los puntos a, b y c representan el distinto desarrollo en la isoterma de solubilidad.
El método de diagrama de solubilidad planteado por Higuchi-Connors tiene la ventaja de
un simple análisis de datos y el hecho que es aplicable para una variedad de
estequiometrías. Debajo del prerrequisito de idealidad, el método genera información
sobre la solubilidad intrínseca del compuesto, constante de asociación y estequiometría
del complejo.
De estas representaciones se puede distinguir dos tipos de diagramas, A y B, de acuerdo
a la Figura 6. Los del tipo A corresponden a los complejos que son solubles, lo que indica
que el hospedero ha facilitado el incremento de la solubilidad del huésped. Existen tres
tipos de variantes para los diagramas tipo A. El primero es el AL, el cual se obtiene cuando
el complejo es de primer orden con respecto al huésped lo que puede significar una
estequiometría hospedero-huésped 1:1; 1:2 y 1:3; pero hay casos especiales que podrían
evidenciar una estequiometría hospedero-huésped 2:1 [20][22].
32
Si la curvatura es positiva, como se observa para AP, los complejos son de elevado orden
con respecto al hospedero, presentando estequiometrías hospedero-huésped de 2:1; 3:1;
4:1. Una curvatura negativa, AN, podría ser si el hospedero a grandes concentraciones
produce una auto agregación o una interacción soluto-solvente que permiten alguna
alteración que afecta la constante de estabilidad del complejo (Higuchi y Connors, 1965)
[20][22].
Los diagramas de tipo B representan la situación donde los complejos son menos solubles
o insolubles. Existen dos variantes de B. Una en la cual el complejo formado es tan
insoluble que no incrementa la solubilidad del huésped, el resultado puede ser una línea
como BI, y otra en la cual la meseta y la declinación no es tan marcada (la línea BS). La
línea Bs es similar a AL en el inicio del incremento, pero a concentraciones críticas del
hospedero en el punto “a”, la meseta emerge indicando un límite en la solubilidad del
complejo. El punto “b” puede ser alcanzado cuando todo el sólido del huesped presente
en el sistema ha sido complejado y consecuentemente cada complejo ha precipitado. Sin
el huesped sobre el complejo formado en la solución se observa una declinación aparente
de la solubilidad hasta el punto “c” [20][22].
Entonces como se mencionó, los diagramas de solubilidad más frecuentes son del tipo
lineal (AL) y en el caso de tener una relación estequiométrica 1:1, la aparente solubilidad
del fármaco (Stotal) será dado por la ecuación 1.
Ecuación 1: Solubilidad aparente para una relación estequiométrica 1:1
(hospedero:huésped)
Stot = S0 + m [Dm.CD]
Nota: So es la solubilidad inherente del fármaco en medio acuoso, Dm es una molécula del fármaco
(huésped) y [DmCD] es la concentración del complejo entre el fármaco y la ciclodextrina.
Si una molécula del fármaco forma un complejo soluble en agua con una molécula de
ciclodextrina, entonces se obtendrá una pendiente en el diagrama de solubilidad que
puede ser determinado por la Ecuación 2.
33
Ecuación 2: Pendiente del diagrama de solubilidad para una relación estequiométrica 1:1
(hospedero:huésped)
Pendiente = 𝑆0 . 𝐾1:1
𝑆0 𝐾1:1 + 1
Nota: K1:1 es la constante de asociación para el complejo. En este caso, la pendiente es siempre menor a
la unidad
Si el complejo formado fuera 2:1 (fármaco/ciclodextrina), entonces la pendiente podría
ser determinado de acuerdo a la siguiente ecuación:
Ecuación 3: Pendiente del diagrama de solubilidad para una relación estequiométrica
2:1 (huésped:hospedero)
Pendiente = 2 𝑆0
2 𝐾2:1
2 𝑆02 𝐾2:1 + 1
Nota: K2:1 es la constante de asociación del complejo, 𝑆02 es la solubilidad intrínseca elevada al cuadrado. En este caso
la pendiente es siempre menor que dos.
La desviación positiva de la linealidad (diagramas de Tipo Ap), sugiere la formación de
complejos de alto orden con respecto a la ciclodextrina. La estequiometría del sistema
puede ser probado por un modelo cuadrático con un buen ajuste para la estequiometría
1:2 (fármaco/ciclodextrina) que se muestra en la Ecuación 4.
Ecuación 4: Modelo de ajuste para una relación estequiométrica 1:2
(huésped:hospedero) para el diagrama de solubilidad
Stot = S0 + K1:1 S0 [CD] + K1:1 K1:2 S0 [CD]2
Nota: [CD] representa la concentración libre de ciclodextrina, So es la solubilidad inherente del fármaco
en medio acuoso, K1:1 es la constante de asociación para una estequiometría 1:1 y K1:2 es la constante de
asociación para una estequiometría 1:2 [20][22].
El cálculo de la constante de estabilidad requiere de conocer la estequiometría. Pero esto
no siempre es posible, obteniendo solo una estimación de la estequiometría de los
diagramas de solubilidad. Por esta razón, los cálculos de la constante de asociación son
frecuentemente basados en la asunción de una estequiometría razonable y el resultado es
algunas veces ambiguo.
Es importante recordar que esta técnica no indica si el fármaco forma un complejo de
inclusión con la ciclodextrina, solo evidencia cómo influencia la ciclodextrina sobre la
solubilidad del fármaco. Estos estudios de diagrama de solubilidad son realizados en
34
soluciones acuosas saturadas con el fármaco donde la formación de complejos agregados
de alto orden está más favorecida que en soluciones no saturadas [22].
3.5. COMPLEJOS DE INCLUSIÓN Y DE NO INCLUSIÓN
Los grupos hidroxilo existentes en la superficie exterior de la molécula de ciclodextrina
son capaces de formar puentes de hidrógeno con otras moléculas y de esta manera las
ciclodextrinas pueden formar complejos solubles en agua con compuestos lipófilos
insolubles en agua. En soluciones acuosas saturadas, los complejos hospedero:huésped
frecuentemente consisten en una mezcla de complejos de inclusión y no inclusión.
Esto puede explicar por qué el valor de la constante de asociación para el complejo de
formación es dependiente de la concentración. Los complejos de no inclusión también
pueden existir en situaciones en que ocurre adsorción del huésped y la superficie exterior
de la ciclodextrina [Loftsson e col., 2002; Loftsson e col., 2004].
3.6. ECUACIÓN DE BENESI-HILDEBRAND
Este método presupone diferentes estequiometrías para el complejo de inclusión, y a partir
de estas se deduce una expresión válida para el cálculo de la estequiometría real,
confirmándose a partir de los resultados obtenidos si la estequiometría presunta es cierta
o por el contrario es necesario ajustar otro modelo [25].
Si se supone una estequiometría 1:1 (hospedero:huésped), la constante de formación del
complejo viene dada por la Ecuación 5.
Ecuación 5: Constante de formación del complejo 1:1 (hospedero:huésped)
𝐾 =[𝐹𝐵𝑍. 𝐵𝐶𝐷]
[𝐹𝐵𝑍]. [𝐵𝐶𝐷]
Nota: [𝐹𝐵𝑍. 𝐵𝐶𝐷] es la concentración del complejo de β-ciclodextrina y fenbendazol en el equilibrio,
[FBZ] es la concentración de fenbendazol libre en el equilibrio y [BCD] es la concentración de
ciclodextrina libre en el equilibrio.
El método parte de las siguientes suposiciones:
(1) La concentración inicial de la β-ciclodextrina y fenbendazol son [BCD]o y [FBZ]o
respectivamente
(2) La [BCD] es mucho mayor que [FBZ]o
(3) La concentración de [BCD.FBZ] es x, entonces
𝐾𝑎 =𝑥
([𝐹𝐵𝑍]0 − 𝑥)([𝐵𝐶𝐷]0 − 𝑥)
35
Teniendo en cuenta que la longitud del paso óptico es 1,0 cm, la absorbancia dada a una
longitud de onda puede ser descrita como sigue:
A = εBCD ([BCD]o − x) + εFBZ ([FBZ]o − x) + εBCD·FBZ.x
Nota: εBCD, εFBZ y εBCD·FBZ son los coeficientes de absorción molar de β-ciclodextrina, fenbendazol y del
complejo, respectivamente.
Como no existe absorbancia para β-ciclodextrina en el rango de 220 a 350 nm, esta puede
ser insignificante comparando con, εFBZ y εBCD·FBZ. Tomando en cuenta esta aproximación
y estableciendo que:
ΔA = A − εS([FBZ]o)
Δε = εBCD·FBZ − εFBZ
[BCD]o ≫ [FBZ]o
se obtiene la ecuación de Benesi-Hildebrand, Ecuación 6 y 7.
Ecuación 6: Modelo de Benesi-Hildebrand para la relación estequiométrica 1:1
(hospedero:huésped)
1
∆𝐴=
1
∆𝜀+
1
𝑘(∆𝜀). [𝐵𝐶𝐷]
Y para un modelo estequiométrico 2:1 (hospedero:huésped), se tiene
Ecuación 7: Modelo de Benesi-Hildebrand para la relación estequiométrica 2:1
(hospedero:huésped)
1
∆𝐴=
1
∆𝜀+
1
𝑘(∆𝜀). [𝐵𝐶𝐷]2
3.7. SIMULACIÓN COMPUTACIONAL
Diferentes enfoques pueden ser usados para investigar un fenómeno. El más común es
realizar un experimento, el cual ha sido usado a lo largo del tiempo. A través de los
experimentos, el observador puede obtener una representación real del proceso de interés.
En base a estos, es posible comprobar o verificar las hipótesis planteadas y obtener una
conclusión, de esta forma se obtiene teorías y leyes.
36
El segundo aproximamiento para investigar un fenómeno es una simulación, la cual es
una imitación de un sistema real, en otros términos, la realidad es modelada en un sistema
representativo. Las simulaciones son realizadas cuando el experimento no es posible
realizar o llega a demandar un procedimiento tedioso o demandante de tiempo. Pero para
obtener una simulación exitosa es necesario que sus condiciones impuestas sean lo
suficientemente precisas; de esta manera los experimentos validan y confirman los
resultados de la simulación.
Las simulaciones en computadores han llegado a ser una herramienta muy útil, no solo
en la ciencia, si no en diferentes campos, como el manejo de riesgos, predicción del stock
en las ventas, desarrollo de carros y planos, desarrollo de fármacos y muchos más. En
esta parte del trabajo se enfocará a describir las interacciones en un sistema
hospedero:huésped.
En la siguiente sección se describirá una breve introducción de los métodos
computacionales empleados.
3.7.1. MÉTODOS COMPUTACIONALES
Los métodos computacionales para la simulación de biomoléculas han emergido
rápidamente en los últimos años como un complemento útil para los experimentos. Los
modelos generados por computadora y las simulaciones permiten analizar la estructura y
los detalles cinéticos de sistemas biológicos grandes, que son difíciles de capturar
experimentalmente. Estudios sistemáticos y análisis estadísticos proveen información
acerca de conformaciones estables y cambios topológicos de un sistema debido a
influencias externas e internas. Estos análisis pueden mejorar el entendimiento y
predicción de funciones biológicas al proveer nuevas bases para la experimentación y
aplicación práctica en medicina y tecnología.
Además, este campo de la química computacional puede ser considerado relativamente
joven, debido a los recientes avances y desarrollo del poder computacional, capacidad de
memoria, arquitectura en paralelo, cálculos en la nube y eficiencia de cálculo de
algoritmos. De esta manera existen diversos programas que permiten realizar
simulaciones de sistemas químicos y biológicos cubriendo diversas escalas de simulación
dependiente del tiempo. Los modelos de simulación pueden cambiar dependiendo la
propiedad que se desee observar y el tamaño del sistema (Figura 7).
37
Figura 7: Modelos de simulación para un sistema de un determinado tamaño y escala
de tiempo.Roca Sabio,A (2013).
Las técnicas de cálculos computacionales pueden ser clasificados bajo tres categorías:
a) cálculos ab initio y de la estructura electrónica del funcional de densidad, b) métodos
semiempíricos y c) mecánica molecular [27].
Los métodos de estructura electrónica utilizan las leyes de la mecánica cuántica en vez
de la física clásica como base de sus cálculos. De acuerdo a esta, la energía así como
otras propiedades de la molécula se pueden obtener mediante la resolución de la
ecuación de Schrödinger (Ecuación 8).
Ecuación 8: Ecuación simplificada de Schrödinger
H Ψ = E Ψ
No obstante, para sistemas polielectrónicos grandes no es posible resolver esta ecuación
de forma exacta, caracterizándose los métodos de estructura electrónica por diferentes
aproximaciones matemáticas para su solución. Entre estos se tiene:
- Los métodos semiempíricos, los cuales usan modelos parametrizados a partir de
datos experimentales con el fin de simplificar los cálculos.
Mecánica
Cuántica
(electrones)
Dinámica
Molecular
(átomos)
Grano grueso
Dinámica
(grupo de átomos
Mesoescala
Modelaje
(segmentos)
Elemento finito
Análisis
Proceso de simulación
Horas
Minutos
Segundos
Distancia
Tie
mp
o
38
- Los métodos ab initio, que se basan en las leyes de la mecánica cuántica y en un
pequeño número de constantes físicas, como son: la velocidad de la luz, las masas y
cargas de electrones y núcleos y la constante de Planck.
- Los métodos del funcional de densidad (DFT), que son similares a los ab initio, pero
incluyen la correlación electrónica [27].
3.7.1.1. MÉTODOS SEMIEMPÍRICOS
Los métodos como el orbital molecular del electrón libre (FEMO), orbital molecular de
Hückel (HMO) y el de Pariser-Parr-Pople (PPP), se aplican solamente a moléculas
conjugadas planares con electrones π. Sin embargo, otros métodos semiempíricos, como
de la teoría del orbital molecular (TOM) como AM1, PM3, PM6, PM7, CINDO y
MINDO (se muestran a continuación) pueden ser aplicados a la mayoría de moléculas
y consideran todos los electrones de valencia [28].
La teoría del orbital molecular semiempírico se subdivide en dos categorías:
a. Los que usan el hamiltoniano, que es la suma de los términos de un electrón
encontrados en la teoría de Hückel.
b. Los que usan un hamiltoniano que incluye tanto términos de repulsión de dos
electrones como términos de un electrón, encontrados en el método de Pariser-
Parr-Pople.
3.7.1.1.1. MÉTODO DE PARISER-PARR-POPLE (PPP)
Este método es generalmente considerado ser el más confiable en predicción de la
longitud de absorción máxima de moléculas conjugadas grandes y considera efectos
interatómicos. Diferente a todos los demás métodos semiempíricos, el método PPP
incorpora solo efectos de orbitales π y no considera los efectos σ. Cuando se
compara a otros métodos, como CNDO, INDO, etc; este tiene las siguientes
ventajas:
a) habilidad para trabajar efectivamente con sistemas heteroatómicos
b) habilidad para distinguir la geometría molecular
c) habilidad para distinguir entre singletes y tripletes.
39
Este método usa la misma asunción del método de Hückel (HMO), sin embargo la
diferencia es que en el caso del método PPP las cantidades de energía alfa o beta
definidas en el determinante incluyen efectos de interacciones electrónicas [28].
3.7.1.1.2. MÉTODOS DEL DESPRECIO INTERMEDIO DEL
SOLAPAMIENTO DIFERENCIAL (INDO) Y DESPRECIO
COMPLETO DEL SOLAPAMIENTO DIFERENCIAL (CNDO)
Pertenecen a la categoría de OM semiempíricos de dos electrones (generalizaciones
del método PPP) que son aplicables a moléculas planares y no planares. El método
de desprecio completo del solapamiento diferencial (CNDO), el método de
desprecio intermedio del solapamiento diferencial (INDO). Ambos métodos tratan
explícitamente solo con los electrones de valencia. CNDO e INDO son
considerados obsoletos debido al avance de los otros métodos [28].
3.7.1.1.3. MÉTODO DEL MODELO 1 DE AUSTIN (AM1)
Fue desarrollado por Dewar et al. y fue parametrizado para compuestos que
contienen H, B, Al, C, Si, Ge, Sn, N, P, O, S, F, Cl, Br, I, Zn y Hg al usar 100
compuestos modelo. La diferencia entre AM1 y MNDO es que los exponentes de
orbital de valencia de tipo Slater de “s” y “p” sobre los mismo átomos son diferentes
[28].
3.7.1.1.4. MÉTODO PARAMETRIZADO 3 (PM3)
El método PM3 toma la energía de valencia molecular Vval que incluye la repulsión
internuclear, como la suma de la energía puramente electrónica Eel-val, más la
energía de la repulsión core-core Vcc [29].
Ecuación 9: Ecuación de la energía de valencia molecular para el método PM3
Vval = Eel-val + Vcc
Los métodos tipo Dewar (MINDO, AM1, PM3) tratan a la molécula como una
colección de electrones de valencia y centros atómicos, donde cada centro (core)
consiste de un átomo y sus electrones internos. La aproximación más simple se
puede escribir de la siguiente forma:
Vcc = ∑ ∑ [𝐶𝐴𝐶𝐵 ⟨ 𝑆𝐴𝑆𝐴 | 𝑆𝐵𝑆𝐵 ⟩] + 𝑓𝐴𝐵𝐴 𝐵>𝐴
40
Nota: 𝐶𝐴𝐶𝐵 son las cargas del core A y B, además ⟨𝑆𝐴𝑆𝐴|𝑆𝐵𝑆𝐵⟩ es la integral de repulsión
electrónica que involucra los orbitales de valencia s de los átomos A y B; el ultimo termino
𝑓𝐴𝐵 corresponde a un valor que varía según el método y que concuerda con los datos
experimentales.
3.7.1.1.5. MÉTODO PARAMETRIZADO 6 (PM6)
Este nuevo método semiempíricos que fue desarrollado en el 2004 es superior a los
otros en varios aspectos. Está basado en el método NDDO y mejorado por la
adopción de Viotyuk en los términos de interacción diatónica núcleo-núcleo y la
aproximación de Thiel del orbital d.
Estas modificaciones permiten la parametrización de 80 elementos y también
reducen el error para un grupo de elementos.
3.7.1.2. TEORÍA DEL FUNCIONAL DE DENSIDAD (DFT)
La teoría del funcional de densidad es un método computacional que deriva
propiedades de la molécula basándose en la densidad del electrón de la molécula.
DFT difiere de los métodos ab initio, donde la energía de la molécula y todos sus
valores derivados dependen de la determinación de la función de onda. La función
de onda no es una realidad física pero sí es una construcción matemática, mientras
la densidad electrónica es una característica física de todas las moléculas. Esta es
una primera ventaja al recurrir a DFT, al basarse en la densidad electrónica como
una propiedad real de toda molécula. Otra ventaja al usar DFT es que esta densidad
electrónica depende solo de las coordenadas (x, y, z) de un electrón, mientras que
la función de onda es matemáticamente más complicada cuando aumenta el número
de electrones. Sin embargo, la precisión del método DFT puede ser afectada debido
a las aproximaciones que usa.
El fundamento matemático del método DFT es el funcional, que se entiende como
una función de otra función, denotada como Y = F [f (x)]. Esto significa que el valor
de Y es por sí misma dependiente de otra función. En el método DFT, la energía de
la molécula es un funcional de la densidad del electrón. La densidad electrónica es
una función el cual depende de tres variables, las coordenadas (x, y, z)
correspondientes a las posiciones electrónicas. El funcional (F) de la densidad
electrónica da la energía de la molécula.
41
Densidad electrónica = ρ (x, y, z)
Energía = F [ρ (x, y, z)]
Con el fin de encontrar el valor del funcional F, se realizan ciertas aproximaciones.
Esta es una de las razones por la que hay muchos métodos diferentes de DFT, lo
cual significa que hay muchas maneras de aproximar el funcional.
En 1960, Hohenberg y Kohn usaron el teorema de Thomas-Fermi para desarrollar
una versión más detallada de la teoría. La teoría de Kohn y Sham describe la
matemática de la densidad electrónica y su subsecuente correlación con la energía
molecular, la cual se muestra en la Ecuación 10 [30].
Ecuación 10: Ecuación de Kohn y Sham
EDFT[ρ] = T[ρ] + Ene [ρ] + J[ρ] + Exc [ρ]
Nota: donde EDFT es la energía electrónica total, T es la energía cinética de los electrones, Ene es la
atracción núcleo-electrón (energía coulómbica), J es la energía de repulsión electrón-
electrón, y Exc es la energía de correlación-intercambio electro-electrón, en tanto que ρ es
por sí mismo una función de las coordenadas (x, y, z) del electrón [30].
Entonces, EDFT, T, Ene, J y Exc son funcionales, donde el funcional Exc está
relacionado al principio de exclusión de Pauli, el cual establece que dos electrones
no pueden ocupar el mismo nivel de energía [30].
Los métodos de DFT son complicados y diversos, pero generalmente pueden ser
divididos en tres clases:
1. Métodos que usan la aproximación de la densidad local (LDA), donde el
supuesto más importante es que, en estado gaseoso, una molécula con muchos
electrones posee regiones del espacio donde la densidad electrónica se
mantiene uniforme. Sin embargo, esta aproximación LDA no funciona bien
con la estructura de banda electrónica de sólidos.
2. Métodos que aplican el factor de corrección de gradiente. La gradiente toma en
cuenta la no uniformidad de la densidad electrónica en regiones del espacio
alrededor de la molécula.
3. Métodos que son una combinación de la aproximación de Hartree-Fock y DFT
para la energía de intercambio. Ellos son conocidos como los métodos híbridos
[30].
Las fuerzas de dispersión de London constituyen un tipo de fuerza intermolecular
que considera efectos de correlación, los cuales son cruciales, no solo en la
42
estabilidad de biomoléculas de agregados moleculares, sino también en las
propiedades termoquímicas de sistemas de mediano tamaño, como son las energías
de reacción o barreras energéticas. Debido a su universalidad, una descripción
apropiada de las dispersiones de London, es un prerrequisito para la precisión de
los métodos computacionales [31].
La teoría del funcional de Kohn-Sham (DFT) ha llegado a ser una importante
metodología en química computacional, además que es considerada en principio,
una teoría exacta. Sin embargo, es conocido que las aproximaciones realizadas
mediante estos cálculos de energía no describen adecuadamente a las fuerzas de
dispersión de London en el sistema [31].
En los últimos 10 años se ha desarrollado un gran esfuerzo para resolver este
problema, y varias estrategias para tratar las dispersiones de London con DFT han
sido desarrolladas y estas pueden ser clasificadas en cuatro categorías:
1. El funcional de densidad parametrizado en contra de la energía de interacción
no-covalente, tales como los métodos usados en las formas reparametrizadas
del funcional de intercambio de Perdew-Wang, donde también se incluyen los
funcionales de Truhlar M05 y M06.
2. El funcional de densidad que directamente incluye una porción no local que
permite la descripción de la dispersión de London. El funcional de densidad de
tipo van der Waals (vdw) combina un funcional estándar de intercambio-
correlación con un término de energía no local [31].
3. Correcciones de dispersión aditivas que pueden ser combinadas con
funcionales de densidad estándar, asegurando el correcto comportamiento
asintótico de la energía de dispersión por construcción. Estas correcciones
pueden ser divididas en dos sub-categorías:
a. La primera pertenece el funcional de Grimme, correcciones atómicas por
pareja independientes de la densidad, como DFT-D1, DFT-D2 y DFT-D3.
b. La segunda incluye las correcciones dependientes de densidad, como las
del modelo por Becke y Johnson (XDM), el aproximamiento DFT +
vdw/vdw-TS por Tkatchenko y Scheffler.
4. Los potenciales efectivos de un electrón diseñados para imitar efectos de
dispersión de London multi-electrónicos. Este aproximamiento es inspirado
43
por la idea de potenciales efectivos del núcleo (ECPs), normalmente usados
para describir los electrones del núcleo de elementos pesados [31].
De los métodos que pertenecen a la tercera categoría, en particular la corrección
de Grimme, DFT-D3 ha recibido mucha atención y ha sido usado
satisfactoriamente en varios estudios que han probado su universalidad,
incluyendo estudios sobre termoquímica, geometría, energías relativas en
confórmeros de relevancia biológica [31].
3.7.1.3. DINÁMICA MOLECULAR
En general, el modelado molecular engloba varios métodos teóricos y técnicas
computacionales, los cuales son usados para simular el comportamiento y características
de biomoléculas u otra sustancia química.
Estas técnicas son mayormente aplicadas en el campo de la física, química y biología
computacional, así como en bioinformática y ciencia de los materiales, para el estudio de
sistemas moleculares desde el rango de compuestos químicos pequeños hasta sistema
biológicos complejos y agregados de materiales [32].
La característica común de la dinámica molecular (MD) es la descripción del nivel
atomístico del sistema, en contraste con simulaciones de química cuántica, donde la
función de onda electrónica es considerada explícitamente. El beneficio de la dinámica
molecular es que esta reduce la complejidad del sistema molecular, lo que permite que
muchos átomos sean considerados durante la simulación por un largo periodo de tiempo
[32].
En el método de dinámica molecular, lo que se analiza es la evolución temporal del
modelo considerado, aquí destacan los ensembles de volumen constante y energía
constante (NVE), volumen constante y temperatura constante (NVT), presión constante
y temperatura constante (NPT). Por tanto, la parte central de este constituye el algoritmo
de integración de las ecuaciones de movimiento de Newton, que son ecuaciones
diferenciales ordinarias acopladas, no-lineales y de segundo orden, que deben ser
resueltas numéricamente. Dadas las posiciones y velocidades iniciales a un tiempo inicial
to, la tarea del algoritmo es obtener las posiciones y velocidades iniciales a un tiempo
to + Δt [32].
44
Existen numerosos algoritmos para integrar las ecuaciones de Newton. Todos ellos
convierten las ecuaciones diferenciales en ecuaciones de diferencia finita. La elección del
algoritmo es fruto del compromiso entre el grado de precisión requerido y el costo
computacional. Los algoritmos más usados son el de Verlet y el velocity Verlet [32].
En resumen, un programa de dinámica molecular (MD) trabaja de la siguiente manera:
1. Se leen los parámetros que especifican las condiciones de la simulación
2. Se inicializa el sistema, se asignan posiciones y las velocidades iniciales
3. Se calculan las fuerzas sobre todas las partículas
4. Se integran las ecuaciones de movimiento de Newton, en este paso y junto con el
anterior, conforman el núcleo de la simulación. Se repiten n veces hasta haber
calculado la evolución temporal del sistema durante el tiempo total de simulación
deseado. Se van guardando las posiciones, velocidades, fuerzas, etc, durante cada paso
en un archivo para luego ser procesadas.
5. Se calculan e imprimen los diferentes promedios relevantes. Para ello se descartan
n0 pasos iniciales, correspondientes al periodo para alcanzar el equilibrio entre estados
y se estima el promedio termodinámico de una magnitud dinámica arbitraria A como
se observa en la ecuación 11
Ecuación 11: Promedio termodinámico de una magnitud dinámica arbitraria A
Numerosos paquetes de programas de computadora existen para realizar simulaciones de
dinámica molecular, uno de los cuales ha sido usado ampliamente es Amber, el cual
contiene un paquete llamado AmberTools, con estos programas es posible desarrollar
múltiples simulaciones químicas. El programa Amber refiere más que solo un paquete de
dinámica molecular, esto incluye la colaboración de numerosos programas que trabajen
juntos para configurar, desarrollar y analizar simulaciones de dinámica molecular desde
la preparación hasta su análisis. El nombre Amber también refiere a una serie de campos
de fuerza de mecánica molecular clásica, primariamente designada para la simulación de
biomoléculas, también de aminoácidos, carbohidratos, fosfolípidos y moléculas orgánicas
generales [45][46].
45
De aquí en adelante se describirá algunos conceptos usados por el software Amber 14, el
cual fue usado para el desarrollo de la tesis.
1. APROXIMACIÓN DEL CAMPO DE FUERZA
Uno de los paquetes que contiene Amber 14 es el llamado Sander, es un programa de
minimización de energía y de dinámica molecular el cual relaja la estructura por
movimientos iterativos de átomos a través de un gradiente de energía y genera
configuraciones por integración de las ecuaciones de Newton. Estas configuraciones son
guardadas en intervalos regulares durante la simulación y después pueden ser procesados
para el cálculo de propiedades químicas como por ejemplo el cálculo de energía libre
[33].
La ecuación del campo de fuerza que utiliza este programa tiene la siguiente forma:
Ecuación 12: Ecuación del campo de fuerza para el programa AMBER 14
Nota: d y d0 son las distancias de enlace finales e iniciales respectivamente, θ y θ0 son los ángulos finales
e iniciales, Kb, Kθ son constantes de fuerza, nφ es la multiplicidad del diedro, δ es la fase del ángulo
diedro, qi, qj son cargas atómicas parciales [45].
Los dos primeros términos representan la aproximación armónica de la física clásica, la
cual se ejecuta en el modelo de mecánica molecular (MM), y corresponden a la vibración
armónica y flexión del enlace químico. El sistema no tiene permitido ir más allá de su
estado de equilibrio, el estiramiento del enlace químico llega hasta cierto punto en que se
generan configuraciones impropias para los ángulos de enlaces. Estas perturbaciones
permiten restaurar las fuerzas, las cuales aumentan la energía potencial del sistema [33].
Parámetros tales como ángulos diedros y de torsión restringen las rotaciones alrededor de
los enlaces. El componente de energía potencial de cada rotación del enlace es dado por
una serie de expansiones de Fourier alrededor del ángulo diedro de equilibrio, con una
barrera de energía potencial y periodicidad [33].
46
El resto de la Ecuación 12 representa los términos no enlazantes dentro de la molécula,
los cuales cambiarán la orientación espacial molecular global. Las fuerzas involucradas
para estos términos son las van der Waals y las fuerzas electrostáticas. De acuerdo al
campo de fuerza clásico de Amber, estos parámetros son definidos por un grupo de
átomos que son separados por 4 enlaces o más [33].
2. SISTEMAS PERIÓDICOS
Las computadoras solo pueden guardar y manejar la información de la trayectoria para
un número limitado de átomos en una simulación dada. Para tratar con esta limitación e
imitar un sistema infinito, se introducen condiciones periódicas de contorno. La idea
básica es que el sistema infinito es aproximado por un arreglo periódico de réplica de un
sistema finito. La siguiente Figura muestra un sistema de dos dimensiones. Todos los
átomos están contenidos en una celda central y cada celda está rodeada por ocho vecinos.
Si un átomo deja un lado de la celda, este reingresa del lado opuesto con la misma
velocidad. No existen paredes entre las celdas y los efectos superficiales son eliminados
[34].
Figura 8: Condiciones periódicas de contorno. La célula central es replicada en ambas
direcciones. Adaptada de Zhiju Zheng (2010).
3. EFICIENCIA DEL CÁLCULO
Para obtener las fuerzas, la función potencial debe ser evaluada, lo cual constituye el paso
que más tiempo demanda en una simulación computacional. Un esquema común para
reducir el tiempo computacional es considerar una esfera con un radio alrededor de cada
partícula. Como se muestra en la Figura 9 las interacciones entre el átomo central y los
47
átomos contenidos en la esfera son incluidas, mientras que las interacciones con otros
átomos fuera de la esfera son despreciadas.
Figura 9: Sistema de átomos interaccionantes que muestra un potencial cutoff. Adaptada
de Zhiju Zheng (2010).
Nota: La caja punteada muestra una región óptima para testear si un átomo está dentro del cutoff.
El radio es llamado distancia cutoff y se emplea generalmente en las simulaciones un
valor de cutoff de 2,5 σ (σ es el parámetro de Lennard-Jones, la distancia a la cual el
potencial inter-partícula es cero), este potencial de Lennard-Jones contiene solo la
interacción no enlazante. Cuando las interacciones electrostáticas de largo alcance están
presentes, el cutoff debería ser más grande para reducir los errores. Esta es una manera
eficiente para evitar calcular demasiadas distancias mientras se busca los átomos vecinos
localizados en la esfera [34].
El procedimiento de la partícula de malla de Ewald (PME) o la suma completa de Ewald
es usada para manejar las interacciones electrostáticas de largo alcance sobre condiciones
periódicas de contorno, mientras que las de van der Waals son estimadas por el modelo
continuo.
El tamaño del tiempo de paso en la dinámica molecular (t = 1 fs) es determinada por la
rapidez de velocidad local del sistema y se aplica un algoritmo que permite restringir las
longitudes de enlace llamado SHAKE, lo que mejora la velocidad de simulación.
Restringiendo el estudio a situaciones de equilibrio, es importante seleccionar las
condiciones bajo las cuales se realizará la simulación, lo que nos seleccionará el colectivo
de Gibss que se deberá usar. Por ejemplo, si fijamos el número de partículas N, el volumen
V y la energía E, el colectivo adecuado será el microcanónico (NVE), que es el colectivo
convencional en dinámica molecular. En otras situaciones, interesará fijar la temperatura
48
T en vez de energía, por lo que habrá que considerar el colectivo canónico (NVT), que es
el caso habitual para el método Monte Carlo. Si estamos interesados en transiciones de
fase, es más conveniente usar colectivos generalizados, como el isotermo-isobaro (NPT).
La elección del colectivo influye en la caracterización de las fluctuaciones de las
magnitudes termodinámicas. Estas son importantes desde un punto de vista práctico ya
que permiten calcular funciones respuesta como la capacidad calorífica o el módulo de
elasticidad, etc.
4. DESVIACIÓN CUADRÁTICA MEDIA (RMSD)
La desviación de la estructura con respecto a una conformación particular es medida por
el RMSD, el RMSD es definida por:
RMSD = √(∑ (𝑅𝑖 − 𝑅𝑖
0)2𝑁
𝑁)
Nota: N es el número total de átomos/residuos considerados en el cálculo y Ri es el vector posición de la
partícula i en la imagen o en la conformación de referencia (con el 0 en superíndice), calculado
después de la alineación de la estructura a la conformación de referencia usando el último encaje
cuadrático.
5. MÉTODOS PARA DETERMINAR LA ENERGIA LIBRE DE UNION
Existen muchos métodos computacionales disponibles para determinar el ΔGunión. Sin
embargo, no todos de ellos son aplicables en la práctica en sistemas grandes. Incluso
métodos clásicos como perturbación termodinámica (FEP) o integración termodinámica
(TI) son extremadamente rigurosos y requieren demasiado poder computacional para
ser usado a gran escala [44].
5.1 MÉTODOS MMPBSA (MOLECULAR MECHANICS POISSON-BOLTZMAN
SURFACE AREA) Y MMGBSA (MOLECULAR MECHANICS-GENERALIZED
BORN SURFACE AREA)
Estos métodos calculan ΔGbind,solv por utilizar un ciclo termodinámico descrito en la
Figura 10. Todas las contribuciones pueden ser divididas de acuerdo a la siguiente
ecuación
∆𝐺𝑢𝑛𝑖ó𝑛,𝑠𝑜𝑙𝑣 = ∆𝐺𝑢𝑛𝑖ó𝑛,𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜 + ∆𝐺𝑠𝑜𝑙𝑣,𝑐𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜 − (∆𝐺𝑠𝑜𝑙𝑣,𝑙𝑖𝑔𝑎𝑛𝑑𝑜 + ∆𝐺𝑠𝑜𝑙𝑣,𝑟𝑒𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟 )
49
El primer término describe la contribución de la mecánica molecular del campo de
fuerza; la otra parte de la fórmula depende de la elección del método. En el método
MM/PBSA, la ecuación de Poisson para encontrar el potencial electrostático es
combinada con la ecuación de Boltzmann para encontrar la distribución de cargas
para dar una ecuación linealizada de Poisson-Boltzmann. En el método de
MM/GBSA se aplica el modelo generalizado de Born [44].
Figura 10: Ilustración del problema de calcular ΔGunión . Ross Walker (2006)
Adaptado de Hermansson, A. (2015)
Figura 11: Ciclo termodinámico utilizado en cálculos de MM/PBSA y MM/GBSA.
Ross Walker (2006). Adaptado de Hermansson, A. (2015)
5.2. LA ENERGÍA LIBRE DE SOLVATACIÓN
La energía libre total de solvatación es dada por la siguiente ecuación:
Gsol = Gelec + Gvdw + Gcav
Gcav + ΔGvdw = γ A + b *
Nota: Gsol es la energía libre de solvatación, Gelec es la energía de la contribución electrostática, Gvdw
es la energía de la contribución de las fuerzas de van der Wals y Gcav es la energía de la cavidad
o receptor. * La contribución no-polar es dada por una formula empírica, mientras la
electrostática es un método independiente [44].
unión
50
5.3. EL MODELO GENERALIZADO DE BORN
El método analítico generalizado de Born (GB) supone una alternativa para el cálculo
del término electrostático de la energía libre de solvatación, debido a su menor coste
computacional comparado con Poisson-Boltzman (PB), esta metodología se ha
popularizado en dinámica molecular, para el reemplazo del solvente explícito [43].
A cada átomo de la molécula le corresponde una esfera de radio αi con carga qi centrada
en el núcleo. En el interior del átomo, se asume un material dieléctrico de constante
uno. La molécula está envuelta de un solvente de alta permitividad dieléctrica (80 para
el agua a 300 K). La energía libre electrostática se determina a partir de la solvatación
individual de Born para cada átomo, corregida por la perturbación del resto de átomos,
según la ecuación 13.
Ecuación 13: Contribución electrostática según el modelo generalizado de Born
ΔGelec = -1
2 (1 −
1
ε) ∑ ∑
𝑞𝑖𝑞𝑗
ℱ𝐺𝐵(𝑟𝑖𝑗,𝑅𝑖𝑅𝑗)
𝑁𝑗=1
𝑁𝑖=1
Nota: rij es la distancia entre cargas, y Ri y Rj son los denominados radios de Born (effective Born
radii) [43].
5.4 ECUACIÓN DE POISSON-BOLTZMAN
La ecuación de Poisson resuelve el potencial electrostático (φ(r)) generado por una
distribución de cargas moleculares (ρ(r)) dentro de un medio con una determinada
constante dieléctrica (ε(r)). Si además se considera la presencia de iones, la
distribución de los mismos se incluye en la ecuación de Poisson mediante una
distribución de Boltzmann, de donde resulta la ecuación de Poisson-Boltzmann
(Ecuación 14) [43].
Ecuación 14: Ecuación de Poisson- Boltzmann
∇. ε(r) ∇ φ(r) – k´ φ(r) = -4 πρ(r)
La constante dieléctrica es dependiente de la distancia ε(r) y equivale a la del agua en
zonas alejadas del soluto y desciende rápidamente con la distancia en las zonas límite
soluto-solvente [43].
51
El parámetro (k´), inverso de la longitud de Debye-Hückel, adopta valores de 0,1 Å en
condiciones fisiológicas. Una vez que se calcula el potencial φ(r), la contribución
electrostática a la energía de solvatación viene dada por:
Ecuación 15: Contribución electrostática según el modelo de Poisson- Boltzmann
ΔGelec = 1
2 ∑ 𝑞𝑖 (φ(r𝑖)|𝑠𝑜𝑙𝑣𝑖 − φ(r𝑖)|𝑣𝑎𝑐í𝑜)
Nota: qi es la carga parcial del átomo en la posición ri que genera la densidad molecular y 𝜑(𝑟𝑖)|𝑣𝑎𝑐í𝑜
es el potencial electrostático calculado para la misma distribución de cargas pero en ausencia
de límites dieléctricos (en vacío, en el que se utiliza una dieléctrica de 1 tanto en la cavidad del
soluto como fuera de ella) [43].
La ecuación de Poisson-Boltzmann no es de fácil resolución, por lo que se tiene que
aplicar métodos numéricos. Entre ellos, el método de diferencias finitas en una malla
(finite-difference method, FDPB) es el más usual. Este método se ha implementado en
diversos programas como Amber [43].
52
4. METODOLOGÍA
4.1. PREPARACIÓN DEL COMPLEJO DE FENBENDAZOL:β-CICLODEXTRINA EN
MEDIO ÁCIDO POR EL MÉTODO DE COPRECIPITACIÓN.
Se preparó el complejo (fenbendazol:β-ciclodextrina) en proporciones molares 1:1, 1:2 y
1:10 Para el complejo en relación 1:1, se disolvió 1,25 x 10-4 mol de fenbendazol (37,42
mg) en 10 mL de etanol/HClcc (99:1) en un matraz volumétrico de 25 mL. De igual forma
se disolvió una cantidad equimolar de β-ciclodextrina (141,87 mg) en 20 mL agua/etanol
(2:1). Las soluciones se mezclaron de forma que la solución de fenbendazol fue agregada
gota a gota a la solución de β-ciclodextrina y dejadas en agitación por 2 horas. Entonces
el etanol se removió por medio de una estufa a 60 °C por un promedio de 12 horas. El
complejo precipitado se redisolvió en agua y se dejó en agitación por un espacio de 8 horas,
la suspensión resultante se filtró obteniendo el producto final. En la última etapa la
solución se transfirió para un tubo tipo “falcon”, posteriormente se congeló sobre
nitrógeno líquido y se liofilizó por 3 días, se obtuvo el complejo fenbendazol:β-
ciclodextrina como un sólido fino y seco.
Después del secado, los complejos fueron pulverizados en un mortero de porcelana con
ayuda de un pilón. Los productos fueron acondicionados en viales y almacenados en
deseador de vidrio.
Nota: Debido al límite de solubilidad de β-ciclodextrina de 1,85 g/100 mL en agua, se consideró la relación
1:10 (2,5 x 10-6 M: 2,5 x 10-5 M)
4.2. PREPARACIÓN DEL COMPLEJO DE FENBENDAZOL: β-CICLODEXTRINA EN
MEDIO NEUTRO POR EL MÉTODO DE COPRECIPITACIÓN.
Se preparó el complejo (fenbendazol:β-ciclodextrina) en proporciones 1:1, 1:2 y 1:10.
Para el complejo en relación 1:1, se disolvió 1,25 x 10-4 moles de fenbendazol (37,42 mg
y una cantidad equimolar de β-ciclodextrina (141,87 mg) en 18 mL de agua. La mezcla
fue agitada por 48 horas. Luego se procedió a filtrar y así obtener el producto final. En la
última etapa la solución fue transferida a un tubo tipo “falcon”, posteriormente fue
congelada sobre nitrógeno líquido y liofilizada por 3 días, se obtuvo el complejo
fenbendazol:β-ciclodextrina como un sólido fino y seco.
53
Después del secado, los complejos fueron pulverizados en un mortero de porcelana con
ayuda de un pilón. Los productos fueron acondicionados en viales y almacenados en
deseador de vidrio.
4.3. PREPARACIÓN DE UNA MEZCLA FÍSICA DE FENBENDAZOL:β-
CICLODEXTRINA
Se procedió a realizar una mezcla física por la cual se tomó fenbendazol y β-ciclodextrina
en un mortero y se realizó una homogenización simple. Esta mezcla sirvió como punto de
referencia para evidenciar si existe el proceso de inclusión en los métodos ensayados.
4.4. CARACTERIZACIÓN DEL COMPLEJO FENBENDAZOL:β-CICLODEXTRINA EN
SOLUCIÓN POR MEDIO DE LA ESPECTROSCOPIA DE UV/VIS
4.4.1. DIAGRAMA DE SOLUBILIDAD DEL COMPLEJO FENBENDAZOL:β-
CICLODEXTRINA SEGÚN EL MODELO DE HIGUCHI-CONNORS
El diagrama de solubilidad es construido conforme a la metodología desarrollada por
Higuchi y Connors, se prepararón soluciones saturadas de fenbendazol con soluciones
acuosas de β-ciclodextrina a diferentes concentraciones (0; 1; 3; 5; 7; 10; 12 y 15 mM),
para ello se adicionó 7 mg del fármaco a 10 mL de las respectivas soluciones de β-
ciclodextrina. En seguida los viales fueron dejados en agitación magnética a 600 rpm con
10 Watt de potencia a temperatura de laboratorio por 48 h, hasta el equilibrio de solubilidad
del fenbendazol. Después se retiró la agitación y se dejó reposar por un periodo de 1 h. Las
respectivas soluciones fueron filtradas utilizando una jeringa acoplada de unidad filtrante
millipore 0,45 µm de diámetro, poro medio, para después cuantificar el fenbendazol por
espectroscopia de UV/Vis.
Los espectros fueron obtenidos en el espectrofotómetro UV/Vis Agilent 8453 empleando
una longitud de onda de 297 nm. El experimento se desarrolló por triplicado.
54
4.4.2. DETERMINACIÓN DE LA CONSTANTE DE ASOCIACIÓN DEL COMPLEJO
Se prepararon soluciones acuosas de β-ciclodextrina, para ello se partió de una solución
madre de 100 mM y se realizaron diluciones para obtener concentraciones de β-
ciclodextrina de 0; 1; 2; 3; 5; 7; 10 y 12 mM para un volumen de 18 mL. A estas soluciones
fueron adicionadas 20 µL de solución patrón de fenbendazol (48,63 mM en
dimetilsulfóxido), llegando al volumen final de 18,02 mL, resultando en soluciones de
fenbendazol de 5,4 x 10-5 mol/L. Se dejó en agitación magnética a 700 rpm con 10 Watt de
potencia por 24 horas. Después se retiró la agitación y se dejó reposar por un periodo de
una hora. Las respectivas soluciones fueron filtradas utilizando una jeringa acoplada de
unidad filtrante millipore 0,45 µm de diámetro, poro medio, para después cuantificar el
fenbendazol por espectroscopia de UV/Vis.
Los espectros fueron obtenidos en el espectrofotómetro UV/Vis Agilent 8453 (Figura 12)
empleando una longitud de onda de 297 nm. El experimento se desarrolló por triplicado.
Figura 12: Espectrofotómetro UV/Vis 8453 de Agilent.
55
4.5. CARACTERIZACIÓN DEL COMPLEJO POR ESPECTROSCOPĺA
INFRARROJA
Las lecturas de las muestras fueron realizadas en el espectrofotómetro, modelo Frontier
FT/NIR Perkin – Elmer (Figura 13). El rango espectral que se utilizó fue de 650 cm-1 a
4000 cm-1
Figura 13: Espectrofotómetro FT/NIR de Perkin-Elmer
4.6. CARACTERIZACIÓN DEL COMPLEJO POR CALORIMETRÍA DIFERENCIAL
DE BARRIDO
Los estudios termoanalíticos fueron realizados en el Instituto de Química-Física
Rocasolano-Madrid y en el Laboratorio de Materiales de la Pontificia Universidad
Católica del Perú, se utilizó el equipo de calorimetría diferencial de barrido (DSC), modelo
Pyris 1 de Perkin Elmer y NETZSCH STA 449 F3 Jupiter (Figura 14).
Los estudios del comportamiento térmico fueron realizados, a partir de la célula
calorimétrica con una razón de calentamiento de 10 °C/min.
Figura 14: Calorímetro diferencial de barrido NETZSCH STA 449 F3 Jupiter.
56
4.7. ESTUDIO TEÓRICO DEL COMPLEJO DE FENBENDAZOL:β-
CICLODEXTRINA POR MÉTODOS CUÁNTICOS
La geometría inicial de β-ciclodextrina fue adquirida de Protein Data Base y del fármaco
fenbendazol de Pubchem Database. Las estructuras fueron optimizadas previamente con
el semiempírico PM6, para después construir manualmente los complejos en Gaussian
View 5.0.
Los oxígenos glicosídicos de la β-ciclodextrina fueron posicionados en el plano XY y se
localizó su centro con un dummy atom entre ellos para definir el centro del sistema de
coordinación. La molécula de fenbendazol se posicionó en el plano Z y se hizo pasar a
través de la cavidad de la β-ciclodextrina de -5 Å a 9 Å con un tamaño de paso de 1 Å,
generándose múltiples confórmeros de partida derivadas a partir de dos orientaciones
posibles (Ver Figura 15). Estos cálculos se realizaron a un nivel PM6 de partida y luego
con DFT B3LYP/6-31G en fase gaseosa.
Además se consideró aplicar cálculos single point con el funcional DFT-D3 B3LYP/6-
31G (d,p) y con el funcional de Truhlar M05-2x; los cuales consideran fuerzas de
dispersión. Para el efecto del solvente se consideró un modelo continuo polarizable (PCM)
Las simulaciones fueron realizadas con el paquete de Gaussian 09 Versión D01 del
instituto de Química-Física Rocasolano - Madrid [49].
4.8. ESTUDIO TEÓRICO DEL COMPLEJO DE FENBENDAZOL:β-
CICLODEXTRINA A TRAVÉS DE CÁLCULOS DE MECÁNICA MOLECULAR
La geometría de partida para la β-ciclodextrina fue construida con el programa xleap del
paquete de modelamiento AmberTools 15. Los fragmentos de β-ciclodextrina fueron
tomados de la base de datos R.E.DD.B (http://q4md-forcefieldtools.org/REDDB).
Asimismo, los parámetros del campo de fuerza q4md-CD fueron aplicados para la β-
ciclodextrina. Este campo de fuerza es una combinación de GLYCAM04 y
AMBER99SB, el cual ha sido reportado con buenos resultados al usar AMBER 10. La
geometría para la molécula de fenbendazol fue tomada de Pubchem Database, la cual fue
optimizada con un nivel de teoría de HF/6-31G** con el paquete de Gaussian 09 Rev.
D.01, también se calcularon las cargas parciales con el modelo RESP (Potencial
electrostático restringido) con este programa, y junto con la herramienta antechamber
del paquete Ambertools 15 se parametrizó la molécula de fenbendazol con el campo de
fuerza GAFF (Campo de fuerza Generalizado de Amber)[46].
57
Figura 15: Sistema de coordenadas que describe el proceso de inclusión de la β-
ciclodextrina y fenbendazol.
Nota: El átomo marcado con lineas punteadas es usado para expresar el atomo de referencia que
ingresara a la cavidad de la Β-ciclodextrina en pasos de tamaño de un 1Å.
Las simulaciones de dinámica molecular se desarrollaron con el módulo Sander de
AmberTools 15. Se tomó las dos orientaciones mencionadas anteriormente para predecir
el modo de inclusión y generar los confórmeros. Los sistemas fueron solvatados en una
caja cúbica con una distancia buffer de 12,0 Å (distancia entre los bordes de la caja y la
molécula de interés). El parámetro utilizado para el agua es un modelo explícito TIP3P.
Y
X
Z
Orientación A
Y
X
X
X
Z
X
Orientación B
58
La preequilibración de los sistemas consistió en las siguientes etapas:
1. Minimización del soluto utilizando 1000 pasos del algoritmo de minimización de
Dirección de Máximo Gradiente (Steepest Descent) y 500 pasos del algoritmo de
Minimización Gradiente Conjugado (Conjugate Gradients), esto mantuvó el soluto fijo
con una constante de fuerza de 500 kcal mol-1 angstrom-2.
2. Minimización de todo el sistema utilizando 2500 pasos del algoritmo de minimización
de Dirección de máximo gradiente (Steepest Descent) y 1500 pasos del algoritmo de
minimización Gradiente Conjugado (Conjugate Gradients).
3. Simulación de 10 ps en un ensamble NVT, con una rampa de temperatura desde 0 hasta
300 K, y se tuvo el soluto fijo con una constante de fuerza de 25 kcal mol-1 Å-2.
4. Simulación de 50 ps en un ensamble NPT para cinco subpasos, en cada uno de ellos se
liberó gradualmente la restricción de la constante de fuerza de 25 kcal mol-1 Å -2 hasta
dejar el sistema relajado.
Una vez que se tiene preequilibrado el sistema, se procede a equilibrar para que los
parámetros de densidad, presión y temperatura se encuentren estables y constantes para
la producción de la dinámica.
5. Simulación de 25 ps de un ensamble NPT y NVT sin restricción del soluto.
6. Finalmente, una simulación de 50 ps de un ensamble NVE sin restricción del soluto [35].
Cuando el sistema estaba equilibrado, se procedió a realizar la producción de la dinámica
molecular, por el cual se realizó 20 simulaciones de 1ns cada una por cada confórmero.
Estos cálculos fueron realizados en el Sistema de súper cómputo Legión de la Dirección de
Informática Académica (DIA) de la Pontificia Universidad Católica del Perú.
5. PLAN DE ANÁLISIS DE DATOS
5.1.DETERMINACIÓN DE LA ESTEQUIOMETRÍA Y LA CONSTANTE DE
ASOCIACIÓN DEL COMPLEJO DE INCLUSIÓN
La constante de asociación y estequiometría del complejo de inclusión entre
fenbendazol y β-ciclodextrina es obtenido a partir de la Ecuación de Benesi-
Hildebrand, los valores obtenidos de absorbancia fueron usados en las siguientes
ecuaciones que describen los modelos estequiométricos 1:1 y 1:2 respectivamente
(Ecuación 6 y 7)
59
1
𝐴 − 𝐴𝑜=
1
𝐴´ − 𝐴𝑜+
1
𝐾(𝐴´ − 𝐴𝑜)(𝐶𝐷)
1
𝐴 − 𝐴𝑜=
1
𝐴´ − 𝐴𝑜+
1
𝐾(𝐴´ − 𝐴𝑜)(𝐶𝐷2)
En las ecuaciones mostradas, Ao es la intensidad de absorción de la molécula
huésped en ausencia de β-ciclodextrina, A es la absorbancia con una particular
concentración de β-ciclodextrina, A´ es la absorbancia al máximo de concentración
de β-ciclodextrina usada y K es la constante de asociación. La linealidad es obtenida
al graficar 1/A-Ao versus 1/CD para los complejos 1:1 y la gráfica de 1/A-Ao versus
1/CD2 para los complejos 1:2. La constante de asociación es calculada de la
pendiente de la Ecuación de Benesi-Hildebrand [22][23][24].
Ecuación 16: Determinación de la constante de asociación para el modelo
estequiométrico 1:1 y 1:2 según Benesi-Hildebrand
𝑘 =1
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒(𝐴´−𝐴𝑜)
60
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. DIAGRAMA DE SOLUBILIDAD DE FASE
El diagrama de solubilidad de fase del fenbendazol en función de la concentración de β-
ciclodextrina a temperatura ambiente es mostrado en la Figura 16 y 17. La solubilidad del
fenbendazol aumenta con el incremento de la concentración de ciclodextrina indicando en
una primera aproximación de que se trata de un diagrama de tipo AL, el cual es
característico de los complejos con una estequiometría 1:1 (fenbendazol:β-ciclodextrina).
La constante aparente de estabilidad (Ks) del complejo fue calculado del slope y el
intercepto del diagrama de solubilidad de fase de acuerdo a un rearreglo de la Ecuación 2
(descrito en el apartado 3.4)
Ks= 𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒
𝑆𝑜(1−𝑆𝑙𝑜𝑝𝑒)
Nota: S0 es la solubilidad intrínseca del fármaco en ausencia de ciclodextrina, la cual estaría
representado por el intercepto de la regresión lineal.
Figura 16: Diagrama de solubilidad del fenbendazol en presencia de β-ciclodextrina
61
La Ks del complejo fenbendazol:β-ciclodextrina fue calculado a ser 1,9 x 104 M-1. Esta
constante aparente de solubilidad está relacionada con la constante de asociación
microscópica y la constante de asociación propia (self-association). Es decir que esta
constante se encuentra enmascarada por efectos de autoagregación de la ciclodextrina con
otras ciclodextrinas, e incluso es probable que exista un comportamiento micelar por el
cual el fármaco es rodeado por moléculas de ciclodextrinas aumentado de esta manera la
solubilidad [36].
De acuerdo a las observaciones de Loftson et al. (2005), sobre el diagrama de fases de
Higuchi, establecen que su confiabilidad se ve limitada para drogas o fármacos que poseen
una solubilidad intrínseca menor a 1 mg/mL, permitiendo considerar este diagrama solo
como un estimativo de la estequiometría [22].
Con lo anteriormente considerado, se tiene que el fenbendazol es un fármaco pobremente
soluble, que de acuerdo a la Food Drug Administration (FDA) tiene una solubilidad de 40
µg/L, y que el diagrama de tipo AL obtenido solo sería un estimativo de la estequiometría
al igual que la constante calculada. De acuerdo con la Figura 17, se puede observar el
espectro UV/Vis de la interacción del fenbendazol y β-ciclodextrina, no se evidencia un
cambio significativo del espectro en relación a un desplazamiento de la longitud de onda
de máxima absorción, la cual se desplazó un nanómetro. Se observó que a medida que
aumenta la concentración de β-ciclodextrina, la concentración de fenbendazol disuelto
también aumentaba, lo que puede indicar que existe un proceso de inclusión o no-inclusión
que permite aumentar la solubilidad del fenbendazol.
Un método más confiable de evaluación de las ciclodextrinas, que no involucren la
variable de la solubilidad intrínseca, es la eficiencia de complejación (CE), el cual es igual
a la fracción molar del complejo y la concentración libre de ciclodextrina y se halla de la
pendiente del diagrama de solubilidad con la siguiente ecuación [22].
𝐶𝐸 =𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
1 − 𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
62
Figura 17: Espectro UV/Vis del complejo fenbendazol y β-ciclodextrina a concentración
de 0 mM a 12 mM de β-ciclodextrina
Nota: Cada línea punteada pertenece a una concentración de β-ciclodextrina.
De esta ecuación se deduce que el valor de la CE es de 0,0066. Esta variable puede ser
usada para calcular la proporción fenbendazol:β-ciclodextrina que corresponda a
incrementar las concentraciones adecuadas a usar durante una formulación.
Ecuación 17: Relación molar para fenbendazol:β-ciclodextrina con la eficiencia de
complejación
Fenbendazol:β-ciclodextrina = 1 : (1 +1
𝐶𝐸)
Se encuentra que la relación molar necesaria (MR) es de 1:152. Este valor bajo para CE
es propio de fármacos con muy poca solubilidad. Entre otros ejemplos con baja eficiencia
de complejación y una alta relación molar se tiene la ciclosporina A con una CE de 0,007
y 1:150 de MR, flunitrazepan con una CE de 0,006 y 1:170 de MR, omeprazol con una
CE de 0,002 y 1:500 de MR, retinol con una CE de 0.007 y 1:150 de MR y tamoxifeno
con una CE de 0,004 y 1:250 de MR de acuerdo a Loftsson et al (2007) [37].
12 mM
0 mM
63
6.2.DETERMINACIÓN DE LA CONSTANTE DE ASOCIACIÓN POR EL MÉTODO
DE BENESI-HILDEBRAND
Para estimar la constante de asociación y estequiometría del complejo entre fenbendazol
y β-ciclodextrina, se usó el análisis del test de Benesi-Hildebrand, asumiendo una
concentración fija del fármaco y con adiciones sucesivas de la ciclodextrina y la condición
experimental de que la concentración de ciclodextrina sea mayor a la del fármaco de tal
manera de trabajar a concentraciones diluidas para evitar la influencia de formación de
agregados moleculares y cuantificar exclusivamente la afinidad del fármaco por la
ciclodextrina. Esta afinidad se cuantificó mediante el cambio de absorbancia según se
muestra en la Figura 17.
Figura 18: Comportamiento del fenbendazol a distintas concentraciones de β-
ciclodextrina
El comportamiento que se muestra en la Figura 18 no es similar a un comportamiento
dado según el diagrama de solubilidad de Higuchi, el cual se estimó de ser del tipo AL
para una estequiometría 1:1; por el contrario, esto evidencia que el comportamiento real
puede encajar en una gráfica del tipo B, que refleja una estequiometría de grado superior.
Este resultado está acorde de acuerdo con las investigaciones de Jang-Ha et al (2013)[38].
Las constantes de asociación calculadas con el método de Benesi-Hildebrand son de 10,9
M-1 y 1,78 x105 M-1 para una estequiometría 1:1 y 1:2, respectivamente. La gráfica de
(ΔA)-1 vs 1/β-ciclodextrina para una estequiometría 1:1 (fenbendazol:β-ciclodextrina) se
muestra en la Figura 19 y en la Figura 20 la estequiometría 1:2 (fenbendazol:β-
0.0000
0.1000
0.2000
0.3000
0.4000
0.5000
0.6000
0.7000
0.8000
0.9000
1.0000
0.0000 0.0010 0.0020 0.0030 0.0050 0.0070 0.0100 0.0120
Ab
sorb
anci
a d
e fe
nb
end
azo
l
Concentracion de β-ciclodextrina(M)
Comportamiento de la concentracion de fenbendazol a
distintas concentraciones de β-ciclodextrina
64
ciclodextrina). Aquí se puede observar que las dos estequiometrías se ven favorecidas por
el coeficiente de correlación al ser similares, pero es importante resaltar que la
estequiometría 1:2 presenta una constante de asociación relativamente grande
evidenciando que el desplazamiento del equilibrio estaría dado para la constante K1:2.
Sin embargo, la constante de asociación suele ser sobrestimada por las múltiples
asunciones de la ecuación de Benesi-Hildebrand. Un ejemplo de ellos es el tiempo por el
cual alcanza el equilibrio afectaría en un incremento o disminución de la pendiente en la
ecuación (Loftsson, T et al (2003)(2005)) [20][22][37].
Figura 19: Método de Benesi-Hildebrand para una estequiometría 1:1 del complejo
fenbendazol y β-ciclodextrina.
y = 0,008x + 0,0871R² = 0,9794
0.0000
1.0000
2.0000
3.0000
4.0000
5.0000
6.0000
7.0000
8.0000
9.0000
0.0000 200.0000 400.0000 600.0000 800.0000 1000.0000 1200.0000
1/(
A-A
0)
1/β-ciclodextrina (M-1)
Metodo de Benesi-Hildebrand para una estequiometría
1:1 del complejo Fenbendazol-β-ciclodextrina
65
Figura 20: Método de Benesi-Hildebrand para una estequiometría 1:2 del complejo
fenbendazol y β-ciclodextrina.
6.3. SÍNTESIS DE LOS COMPLEJOS EN MEDIO ACUOSO
Los compuestos sintetizados en medio acuoso por el método de coprecipitación
permitieron obtener un aumento de la solubilidad en un rango de 5-9 veces la
solubilidad intrínseca del fenbendazol en medio acuoso, esto representa un aumento
desde 0,28 µg/L hasta 1,6-2,5 µg/L (Tabla 4).
No obstante, se hubiera esperado un aumento de la solubilidad conforme aumenta la
relación molar de ciclodextrina, tal y como se observó en los diagramas de solubilidad,
este puede deberse a dos hechos reportados por otros autores [45] como es el tiempo
necesario para que el complejo formando alcance el equilibrio y la tecnología usada
para la preparación del complejo.
y = 7E-06x + 1,2888R² = 0,9795
0.0000
1.0000
2.0000
3.0000
4.0000
5.0000
6.0000
7.0000
8.0000
9.0000
0.000E+00 2.000E+05 4.000E+05 6.000E+05 8.000E+05 1.000E+06 1.200E+06
1/(
A-A
0)
1/β-ciclodextrina (M-2)
Metodo de Benesi-Hildebrand para una estequiometría
1:2 del complejo fenbendazol-β-ciclodextrina
66
Tabla 4: Concentración obtenida de fenbendazol en los complejos sintetizados
SUSTANCIAS
ANALIZADAS ABSORBANCIA
mg/ml DEL
COMPLEJO
CONCENTRACIÓN
DE
FENBENDAZOL
(µg/mL)
Fenbendazol en agua 0,0089 n.a 0,20
Complejo en relación
molar 1:1 agua
0,1071 1,457 2,47
Complejo en relación
molar 1:2 agua
0,0673 0,900 1,55
Complejo en relación
molar 1:10 agua
0,0891 1,400 2,06
6.4.ESPECTROSCOPÍA FT-IR DE LOS COMPUESTOS SINTETIZADOS
En las próximas figuras se muestran el espectro FT-IR de (a)β-ciclodextrina, (b)
fenbendazol, (c) mezcla binaria, (d) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación
molar 1:1 en agua, (e) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:2 en
agua, (f) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:10 en agua, (g)
complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:2 en HCl/etanol (1 %), (h)
complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:10 en HCl/etanol (1 %).
Figura 21: Espectro FT-IR de (a) β-ciclodextrina,(b) fenbendazol y (c) mezcla
binaria.
Las frecuencias más características correspondientes a la β-ciclodextrina son
observadas a 3291.80 cm-1, 2925.78 cm-1, 1152.03 cm-1, 1020.22 cm-1, los cuales
corresponden al estiramiento simétrico y asimétrico de ν[OH], ν[CH2], estiramiento
67
[C–O] y a la vibración del enlace [O-C-H], respectivamente. Mientras que las
frecuencias características de fenbendazol son observadas a 3327.57 cm-1, 2954.5 cm-1,
1619.54-1582.22 cm-1, 1439.65 cm-1 y 1091.89 cm-1 y representan las señales del
estiramiento N-H del grupo amida, el estiramiento característico [C-H], el enlace
[C=O] de la porción del grupo carbamato, estiramiento del doble enlace [C=C] de la
parte aromática y el estiramiento del enlace [S-C], respectivamente.
En los espectros FT-IR de la Figura 21 se observa particularmente las señales
correspondientes a β-ciclodextrina y fenbendazol y que la mezcla binaria preparada
por una simple mezcla de ambas materias primas es la superposición de ambos
espectros.
En la Figura 22 se compara los espectros de fenbendazol y β-ciclodextrina con el
complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:1 sintetizado en medio
acuoso, que resulta en un espectro del complejo muy similar a la de β-ciclodextrina.
Este hecho lo corroboran muchas investigaciones donde afirman que es frecuente
observar la desaparición o desplazamiento de las señales en los espectros FT-IR de los
complejos de ciclodextrina-huésped. No obstante, este hecho también puede deberse
a que la cantidad del fármaco incluido es demasiado baja.
Ante esta problemática, el uso de cálculos teóricos puede ayudar a demostrar la
desaparición de estas señales. Sin embargo, son muy pocas las investigaciones
realizadas en este tópico, pero se menciona el trabajo de Oliveira et al, en el cual
concluyen que la desaparición de señales como las de carbonilo podría deberse a la
interacción de este con grupos hidroxilo de la β-ciclodextrina. [39].
68
Figura 22: Espectro FT-IR de (a)β-ciclodextrina, (b) fenbendazol, (d) complejo
fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:1 en agua.
Figura 23: El espectro FT-IR de (d) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación
molar 1:1 en agua, (e) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación
molar 1:2 en agua, (f) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación
molar 1:10 en agua.
69
En las Figura 23 y 24 se observa la comparación de los cinco complejos sintetizados
en agua en relación molar 1:1; 1:2 y 1:10, y en medio ácido en relación molar 1:2 y
1:10, con el fin de observar variaciones en sus desplazamientos, lo que se detalla en la
Tabla 5.
Estos desplazamientos son más notorios para el estiramiento del [O-H] a 3291,8 cm-1.
Para los complejos en medio acuoso, se evidencia una disminución de la frecuencia,
mientras que, para los complejos en medio ácido, un aumento de estos. Esta diferencia
se debe precisamente a la presencia de más interacciones de puente de hidrógeno. Este
comportamiento es también observado para las señales a 1152,03 cm-1, 1076,74 cm-1
y 1020,22 cm-1 (mostrados en la Tabla 5) pero en menor intensidad. Estas evidencias
sugieren una mejor inclusión del fármaco al interaccionar con una mayor cantidad de
ciclodextrina. Este tipo de desplazamiento de las señales de la β-ciclodextrina es
observado en trabajos de Mohan et al [40].
Figura 24: El espectro FT-IR de (g) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación
molar 1:2 en HCl/etanol (1 %), (h) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina
en relación molar 1:10 en HCl/etanol (1 %).
70
Tabla 5: Distribución de frecuencias características de β-ciclodextrina y los
complejos sintetizados.
aRef [ 41]. bRef [39 ].
δ Flexión
ʋ Estiramiento
(a) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:1 en agua, (b) complejo fenbendazol:β-
ciclodextrina en relación molar 1:2 en agua, (c) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación
molar 1:10 en agua, (d) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:2 en HCl/etanol (1
%), (e) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:10 en HCl/etanol (1 %).
6.5. ANÁLISIS POR CALORIMETRÍA DIFERENCIAL DE BARRIDO Y POR
TERMOGRAVIMETRÍA.
Las ciclodextrinas son polvos cristalinos en forma de hidratos, para el caso de la β-
ciclodextrina, el agua de constitución representa el 12 %. De esta forma se observa en
la Figura 25 un pico amplio de naturaleza endotérmica que representa transiciones de
deshidratación de agua aproximadamente por debajo de los 140 °C, corroborándose
con la señal TGA una pérdida de masa de 7,1 %. Luego se observa el segundo pico
endotérmico que corresponde al punto de fusión a 311,8 °C, acompañado de otro pico
exotérmico debido a la descomposición a los 341 °C. Se evidenció con el análisis de
TGA que la pérdida de masa es de alrededor de un 18,82 % comenzando a los 314,7 °C.
71
Figura 25: Espectro DSC-TGA de (a)β-ciclodextrina.
La Figura 26 corresponde al fármaco fenbendazol. Es notorio observar el pico
endotérmico de fusión a los 226,9 °C. A su vez se observa un segundo pico a 233,6
°C, el cual podría ser indicativo de un compuesto enantioméricos o polimórfico. Se
corroboró dos veces el ensayo, dando un resultado similar para la materia prima
fenbendazol.
Figura 26: Espectro DSC-TGA de (b) fenbendazol
72
A su vez el grado de pureza indicado según certificación fue de 98 %. Este resultado
es similar a los encontrados por Moriwaki et al (2008), el cual reporta la presencia de
dos picos endotérmicos para la materia prima albendazol, molécula estructuralmente
parecida a fenbendazol [42].
La Figura 27 pertenece a una mezcla binaria de fenbendazol y β-ciclodextrina, en ella
se observa una superposición de señales, evidenciándose el pico endotérmico de
fenbendazol a 225,8 °C; tres picos endotérmicos a β-ciclodextrina, siendo el primero
correspondiente a la pérdida de agua a una temperatura < 120 °C, el segundo y tercer
pico a 291,4 °C y 308,4 °C como los puntos de fusión de β-ciclodextrina, y el pico
exotérmico de degradación en los 344,3 °C.
Figura 27: Espectro DSC-TGA de (c) Mezcla binaria
La Figura 28 pertenece al complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:1,
en la cual se observan dos picos endotérmicos característicos. El primero pertenece al
proceso de deshidratación y luego el segundo en 286,9 °C, para después empezar el
proceso de degradación aproximadamente a los 310 °C y la señal perteneciente a
fenbendazol desaparece totalmente. En comparación con la molécula de β-
ciclodextrina, esta tiene un pico endotérmico prominente a los 311 °C, con la presencia
adicional de un pequeño pico endotérmico a los 305 °C; lo cual demuestra una
diferencia notable de aproximadamente 24 °C, diferenciándose de la materia prima.
73
De acuerdo a una revisión bibliográfica del comportamiento de los complejos de
ciclodextrinas por calorimetría diferencia realizado por Takahashi et al. (2012);
concluye que la evidencia de complejación se da cuando la señal del fármaco
(huésped) se desplaza o desaparece completamente. Con los resultados obtenidos, se
evidencia la complejación por la desaparición de la señal de la molécula de
fenbendazol, además la señal se diferencia a la de la ciclodextrina al desplazarse a una
menor temperatura de fusión menor a la de la ciclodextrina.
Figura 28: Espectro DSC-TGA de (d) Complejo fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) en
agua
En la Figura 29 se observa las señales DSC y TGA del complejo fenbendazol:β-
ciclodextrina en relación molar 1:2 en medio acuoso, el cual tiene un comportamiento
similar al complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:1 y el segundo
pico endotérmico está a los 286,2 °C, mientras que el pico exotérmico a los 308 °C. Y
la Figura 30 es una superposición de las señales características de la β-ciclodextrina,
fenbendazol, mezcla binaria y del complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación
molar 1:1 en medio acuoso; evidenciándose los desplazamientos del complejo y
comportamiento diferente a las materias primas y mezcla binaria.
74
Figura 29: Espectro DSC-TGA de (d) Complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en
relación molar 1:2 en agua
Figura 30: Espectro DSC-TGA de (a) β-ciclodextrina, (b) fenbendazol, (c) mezcla
binaria (d) complejo fenbendazol:β-ciclodextrina en relación molar 1:1
en agua.
LEYENDA
-----β-ciclodextrina
-----fenbendazol -----mezcla binaria
-----relación molar 1:1
75
6.6. CÁLCULOS DE MECÁNICA CUÁNTICA
La inserción del fármaco fenbendazol en la cavidad de la β-ciclodextrina fue investigado
por cálculos de mecánica cuántica con el uso del programa Gaussian 09 Rev.D.01, el cual
permitió realizar cálculos de optimización geométrica y de singlepoint para obtener las
energías asociadas de los confórmeros estudiados. Las moléculas de partida se optimizaron
con el semiempírico PM6 (Figura 15) y la relación energética encontrada para las
orientaciones A y B (Figuras 31 y 32) establecen que para la orientación A se tiene 3
confórmeros favorecidos energéticamente (confórmeros 3,4 y 12) con un valor de energía
de complejación de -13,3 kcal/mol, mientras que para la orientación B, se tiene 2
confórmeros (confórmeros 13 y14) con una energía de complejación de -19,7 kcal/mol.
El cambio de la energía de complejación a valores mucho más negativos indica una
inclusión más favorable. Así, la orientación B se encuentra favorecida energéticamente con
una diferencia energética entre la orientación A de 6,4 kcal/mol.
Figura 31: Energías de complejación de fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) a diferentes
posiciones en el eje Z (coordenada de reacción) para la orientación A a un
nivel del PM6
Nota: * Se indica que el cálculo realizado tiene restricción de coordenadas tanto para el fenbendazol y β-
ciclodextrina
76
Figura 32: Energías de complejación de fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) a diferentes
posiciones en el eje Z (coordenada de reacción) para la orientación B a un
nivel de PM6
Nota: * Se indica que el cálculo realizado tiene restricción de coordenadas tanto para el fenbendazol y β-
ciclodextrina
Antes de examinar la naturaleza de inclusión de los confórmeros considerados de menor
energía, se debe tener en cuenta qué beneficios y limitaciones posee este nivel de cálculo.
El método semiempírico PM6 (ver el apartado 3.7.1.1) está parametrizado para ciertos tipos
de átomos al usar valores experimentales previos para sus cálculos de energía. La ventaja
real es que debido a que la parte de dos electrones del hamiltoniano no está incluida
explícitamente en los cálculos. Por ende, el sistema se simplifica enormemente y el tiempo
de cálculo también. No obstante, esta simplificación, disminuye la precisión en el cálculo.
En esta tesis, este cálculo permitió realizar un scan de la superficie potencial de una manera
rápida, el uso de estos métodos es muy útil para realizar primeras investigaciones del
sistema a estudiar.
Para aumentar el nivel de precisión de los cálculos, se consideró realizar una optimización
geométrica con el método DFT y el funcional B3LYP/6-31G; con este método se resuelve
la Ecuación de Schrödinger basándose en la densidad electrónica de la molécula y no en la
función de onda como los métodos de Hartree-Fock.
En las Figuras 33 y 34 se encuentra el perfil de energía potencial para las dos orientaciones
consideradas con el funcional B3LYP/6-31G, obteniéndose para la orientación A un
confórmero favorecido energéticamente (confórmero 11) y para la orientación B se observó
4 confórmeros favorecidos energéticamente (confórmeros 14, 15, 16 y 17). Los resultados
77
en términos de energía de complejación sugieren que la orientación B está favorecida sobre
la A con una diferencia energética de 6,4 kcal/mol, teniendo correlación con los cálculos a
un nivel PM6.
Figura 33: Energías de complejación de fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) a diferentes
posiciones en el eje Z (coordenada de reacción) para la orientación A a un
nivel de B3LYP/6-31G
Nota: * Se indica que el cálculo realizado tiene restricción de coordenadas tanto para el fenbendazol y β-
ciclodextrina
Figura 34: Energías de Complejacion de fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) a diferentes
posiciones en el eje Z (coordenada de reacción) para la orientación B a un
nivel de B3LYP/6-31G
Nota: * Se indica que el cálculo realizado tiene restricción de coordenadas tanto para el fenbendazol y β-
ciclodextrina
78
Tabla 6: Confórmeros de menor energía a diferentes niveles de teoría sin restricción
alguna para las orientaciones A y B
Nivel de Teoría del
cálculo
Semiempírico PM6 DFT B3LYP76-31G
ORIENTACIÓN A Confórmeros 3, 4 y 11, 12 Confórmero 11
ORIENTACIÓN B Confórmeros 13 y 14 Confórmeros 14, 15, 16, 17
Nota: ver anexos
Al analizar las conformaciones obtenidas de menor energía para las orientaciones A y B
(Figura 35), se observa que en la orientación A, la inclusión es por la parte aromática de la
molécula de fenbendazol, específicamente por el grupo tiobencil. Además, la naturaleza no
lineal del huésped favorece una inclusión parcial de la molécula. En la orientación B se
observa que la inclusión por parte del grupo carbamato es favorecida, pero además se tiene
que esta conformación es más favorable cuando se aleja del centro de la β-ciclodextrina,
quedando también parcialmente incluida.
Sin embargo, estudios que fueron realizados en los últimos años por Kruse et al, establecen
que las interacciones intermoleculares juegan un rol muy importante en la estabilización
de este tipo de complejos y además indican que una de las debilidades del funcional
B3LYP/6-31G es que no considera fuerzas de dispersión, ni de van der Waals, ni las de
largo alcance. Debido a esto se ensayó con funcionales que incluyan estas fuerzas como lo
es el de Grimme DFT-D3y de Truhlar M05-2X [43].
En la Tabla 6 se describe las energías de complejación determinadas con un cálculo único
(single point) de energía con los funcionales de Grimme y Truhlar de las conformaciones
optimizadas previamente, se evidenció que la orientación A se encontraba favorecida
energéticamente por una diferencia de 1,6 kcal/mol para el funcional de Grimme; y de 0,9
kcal/mol para el funcional de Truhlar. Los resultados obtenidos sugieren que, en medio
gaseoso, la orientación A está ligeramente más favorecida que la orientación B, en
contradicción a los cálculos anteriores con el funciónal B3LYP/6-31G. Esta postura
finalmente obtenida se corrobora con los resultados por otros grupos de investigación como
el de Kruse et al, Antony et al, Chen et al, por el cual describen que la corrección de la
79
dispersión por estos funcionales da un mejor performance de las características
termoquímicas de estos complejos [44][45][46].
Figura 35: Estructura de los complejos fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) optimizados con el nivel
B3LYP/6-31G para la orientación A (parte superior) y orientación B (parte inferior).
Vista frontal (parte izquierda) y vista lateral (parte derecha).
80
Tabla 7: Energías de complejación a distintos niveles de teoría para el complejo
fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) en medio gaseoso.
Nivel de teoría del
cálculo
DFT B3LYP/6-31G
(kcal/mol)
DFT B3LYP/6-
31+G**-D3
(kcal/mol)
(a)
M05-2x/6-
31+G**
(kcal/mol)
(b)
ORIENTACIÓN A
Confórmero 11
-10,66
-24,45
-14,47
ORIENTACIÓN B
Confórmero 16
-17,09
-22,84
-13,60
ORIENTACION C -110,23 108,00 ------
Nota: Los cálculos con los funcionales de Grimme (a) y de Truhlar (b) fueron realizar con un single point
(ver Anexos)
La Tabla 7 corrobora los resultados obtenidos en medio gaseosos, la orientación A adquiere
una energía de complejación más negativa por ende más probable de formación en medio
acuoso, con una diferencia energética de 4,9 kcal/mol y 2,75 kcal/mol para los funcionales
de Grimme y Truhlar. También se puede observar que la orientación C (estequiometría 1:2)
posee una energía de complejación más favorable que las demás orientaciones con -110,23
kcal/mol.
Tabla 8: Energías de complejación a distintos niveles de teoría para el complejo β-
ciclodextrina:fenbendazol (1:1) en medio acuoso.
Nivel de Teoría del cálculo
DFT B3LYP/6-
31+G**-D3
(kcal/mol)
M05-2x/6-
31+G**
(kcal/mol)
ORIENTACIÓN A
Confórmero 11 -22,6 -12,31
ORIENTACIÓN B
Confórmero 16
-17,69
-9,56
Nota: Los cálculos con los funcionales de Grimme y de Truhlar fueron realizar con un single point
81
6.7.CÁLCULOS DE MECÁNICA MOLECULAR
Los cálculos de dinámica molecular fueron realizados con el programa Ambertools 15, el
cual permitió realizar simulaciones de las estructuras de β-ciclodextrina y fenbendazol en
relación estequiométrica 1:1 y se obtuvo que la orientación A era favorecida sobre la B
por ocurrir espontáneamente. Esto se evidencia en la Figura 34, en la cual se extrajeron
fotografías de las estructuras del complejo durante una simulación de 11 ns.
Se observa que en el proceso de inclusión por la parte del grupo tiobencil se da a partir de
los 700 ps, manteniéndose de esta manera hasta alcanzar los 11 ns de simulación Esto
confirma el cálculo energético obtenido por mecánica cuántica con el funcional DFT-D3
y M05-2X, los cuales consideran las fuerzas de dispersión para el complejo fenbendazol:β-
ciclodextrina.
En la orientación B considerada por cálculos de mecánica cuántica, por el cual la inclusión
se daba por el grupo carbamato, no se observó en ningún momento de la simulación ni
tampoco en subsecuentes simulaciones.
La estequiometria 1:2 se testeó también con cálculos de mecánica molecular. Sin embargo,
aún no se logró observar la total inclusión con la segunda ciclodextrina. Esto podría
requerir más tiempo de simulación o estudios más específicos de otras conformaciones
con estequiometría 1:2. No obstante, se calculó la energía libre de unión de este cálculo
con las aproximaciones de MM-PBSA para predecir su energética en relación a la
orientacione A (ver apartado 10.2).
82
0 ps 180 ps 340 ps
600 ps 700 ps 1 ns
4 ns 8 ns 10 ns
Figura 36: Estructuras del complejo fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) obtenidos para
alcanzar la orientación A desde los 0ns hasta los 10 ns
83
6.7.1. ESTABILIDAD DEL SISTEMA
Para obtener alguna información acerca de la estabilidad del sistema después del
proceso de equilibración del complejo de inclusión, se calculó la desviación cuadrática
media (RMSD) relativa a la estructura inicial para todos los átomos del complejo, β-
ciclodextrina y fenbendazol. Esto fue calculado a lo largo de la simulación de las
orientaciones A (11 ns) y C (17 ns) usando el módulo Cpptraj del programa
AmberTools 2015.
Las gráficas del RMSD para estos sistemas se muestran en la Figura 37. En las
orientaciones A, y C, los valores de RMSD de los últimos 5 ns de simulación para el
complejo (azul), β-ciclodextrina (marrón) y fenbendazol (negro) fueron encontrados
hasta ~3,5 Å; ~2,5 Å y ~2,0 Å respectivamente para la orientación A. Para la
orientación C valores para el complejo, β-ciclodextrina y fenbendazol de ~4 Å; ~4 Å
y ~2 Å respectivamente.
Se tiene en consideración que valores bajos de RMSD (hasta 2 Å) son considerados
como sistemas estables y de alta calidad de reproducción, pero también va a depender
de la naturaleza del sistema. En este caso existen dos variables delimitantes a
considerar. Una de ellas es el tiempo de simulación considerado. A pesar de ser un
sistema pequeño, el tiempo de cálculo por cada nanosegundo con las condiciones que
ofrece el servidor Legión requiere aproximadamente 50 horas de cálculo por
nanosegundo. Se estima que para la total estabilización del sistema requiera mayor
tiempo de simulación con ~30 ns como mínimo. La segunda variable a considerar, que
afecta a la orientación C, es que en este sistema se considera dos moléculas de
ciclodextrina, las cuales aumentan el grado de variabilidad de la estructura inicial de
partida en comparación con las otras orientaciones consideradas.
84
Figura 37: Gráfica de RMSD para el complejo fenbendazol:β-ciclodextrina, el ligando
fenbendazol, la ciclodextrina para la orientación A y C
Tiempo de simulación (ns)
ORIENTACION C RMSD
RM
SD
(Å
)
85
6.7.2. ENERGÍA LIBRE DE UNIÓN DEL COMPLEJO FENBENDAZOL:β-
CICLODEXTRINA
El aproximamiento MM-PBSA es el cálculo para estimar la energía libre de unión.
Este método combina las energías de mecánica molecular con los cálculos de
solvatación. Con el fin de calcular la distribución electrostática de la energía libre de
solvatación con una solución numérica, se aplicaron los métodos de Poisson-
Boltzmann (PB) del programa AmberTools. Se extrajeron 200 fotografías de la fase
de producción en cada sistema y fueron usadas para los cálculos de energía libre. En
la Tabla 9 se tiene la energía libre de unión (ΔG) y otras energías de contribución.
Las estructuras consideradas para estos cálculos se muestran a continuación en la
Figuras 38 - 40.
Figura 38: Estructura del complejo fenbendazol:β-ciclodextrina (1:1) de más baja
energía en medio acuoso obtenidos en 10 ns de simulación
ORIENTACION
A
86
Figura 39: Representación esquemática de la interacción del fenbendazol y β-
ciclodextrina de más baja energía en medio acuoso en 11 ns de simulación
Figura 40: Estructura del complejo de fenbendazol:β-ciclodextrina (1:2) de la
orientación C
Según la Tabla 9, la orientación C es la que se encuentra favorecida energéticamente
con -22,6 kcal/mol, mientras que después prosigue la orientación A con -16,43
kcal/mol. Estos resultados se corroboran con la parte cuántica previamente descrita,
reforzando la hipótesis de la formación de un complejo 1:2 para este sistema. Además,
87
se observa como las fuerzas electrostáticas y de van der Waals toman un papel
importante en la estabilización de estos complejos de inclusión. Estas fuerzas se
consideraron también en los cálculos mecano-cuánticos con los funcionales de Truhlar
y Grimme.
Tabla 9: Energías libre de unión (kcal/mol) con la aproximación de MM-PBSA del
sistema de fenbendazol:β-ciclodextrina
orientación A orientación C
Contribución
Energética
MEAN STD MEAN STD
ELE -7,05 4,8 -7,41 2,41
VDW -24,52 1,38 -32,64 2,48
INT 0 0 0 0
GAS -31,58 5,39 -40,05 3,74
PBSUR -2,47 0,12 -2,74 0,13
PBCAL 17,62 4,9 22,2 2,88
PBSOL 15,15 4,79 19,46 2,79
PBELE 10,57 1,6 14,79 2,16
PBTOT -16,43 1,77 -20,6 2,36
Donde ΔEELE es la energía electrostática calculada por el campo de fuerza, ΔEVDW
es la contribución de van der Waals calculada por MM, GAS es la energía total en
fase gas (suma de ELE, VDW, INT), PBSUR es la contribución no polar para la
energía libre de solvatación calculada por un modelo empírico, PBCAL, es la
contribución electrostática a la energía libre de solvatación calculada por PB,
PBSOL es la sumatoria de las contribuciones polares o no polares, PBELE es la
suma de la contribución electrostática de la energía libre de solvatación y de la
MM, PBTOTAL es la estimación final de la energía libre de unión calculada
(kcal/mol).
La Figura 39 muestra la posible interacción del fenbendazol y β-ciclodextrina en la
orientación A en medio acuoso. Se evidencia la formación de un puente de hidrógeno
entre el átomo de nitrógeno del heterociclo del fenbendazol y un residuo de la β-
ciclodextrina, además de la interacción con el solvente a través de puentes de
hidrogeno con el átomo de oxígeno del grupo carbamato y el segundo átomo de
nitrógeno del heterociclo, tal y como se observa en la Figura 36.
88
7. CONCLUSIONES
En base a los resultados presentados en la presente investigación se concluye lo siguiente:
Se logró sintetizar los complejos de inclusión en medio acuoso lográndose aumentar
la solubilidad del fenbendazol hasta 2,5 µg/mL.
Los resultados por espectroscopía UV/Vis indican un claro efecto solubilizante de la
β-ciclodextrina sobre el fenbendazol, obteniéndose un aumento de solubilidad hasta
29,9 µg/mL con 15 mM de β-ciclodextrina y tomando en consideración el
comportamiento del fenbendazol a concentraciones diluidas, se considera un
diagrama de solubilidad de tipo B.
El cálculo de la constante aparente de estabilidad (Ks) fue de 1,9 x 104 M-1. Esto
refleja que la interacción del fenbendazol con la ciclodextrina tiene un grado de
estabilidad moderada a fuerte. Sin embargo, este valor solo es un estimativo debido
a que la ecuación de Higuchi – Connors no brinda una confiabilidad exacta para
fármacos con una solubilidad intrínseca menor a 1 mg/mL.
La constante de asociación calculada por el método de Benesi-Hildebrand es de 10,9
M-1 y 1,78 x105 M-1 para una estequiometría 1:1 y 1:2, respectivamente, no
mostrando una selectividad por alguna estequiometría propuesta.
Los espectros FT-IR y los termogramas DSC-TGA de los complejos se evidencian
como una superposición de las señales de la β-ciclodextrina, desapareciendo
completamente las señales características del fenbendazol. Estos fenómenos ocurren
y son descritos en la literatura como evidencia de complejación.
Los cálculos de mecánica cuántica obtenidos con el programa Gaussian 09 Rev.D.01
permitieron dilucidar el fenómeno de inclusión del fenbendazol con la β-
ciclodextrina, obteniéndose que el grupo tiobencil es el más favorecido
energéticamente para incluirse en la cavidad de la β-ciclodextrina . A su vez se
obtuvo que las fuerzas de dispersión juegan un papel clave en la estabilización del
complejo de inclusión. Los cálculos con los funcionales DFT-D3 y M05-2X
permitieron describir este fenómeno. La diferencia energética de la orientación A
sobre la B fue de1,61 kcal/mol y 0,87 kcal/mol en medio gaseoso y de 4,9 kcal/mol
y 2,5 kcal/mol en medio acuoso con los funcionales de Grimme y Truhlar
respectivamente. Además, los cálculos para la orientación C con el funcional
B3LYP/6-31G sugieren que la inclusión del complejo fenbendazol:β-ciclodextrina
89
es más favorecida para una estequiometría 1:2, lo cual se ratificó con los cálculos de
mecánica molecular.
Los cálculos de mecánica molecular obtenidos con el programa AmberTools 15,
corroboran los resultados obtenidos por mecánica cuántica, obteniéndose que la
orientación A se ve favorecida espontáneamente en un medio acuoso, y observándose
el proceso de inclusión a los 700 ps de simulación. La orientación B no se observó
en ninguna simulación realizada.
La energética de la orientación C como un indicativo de la estequiometría 1:2
(fenbendazol:β-ciclodextrina) se demostró con los cálculos de MM-PBSA,
estimando que la energía libre de unión para esta orientación fue de -20,60 kcal/mol,
con una diferencia energética de 4,17 kcal/mol por encima de la orientación A
(complejo 1:1).
8. RECOMENDACIONES
Según las conclusiones anteriores, se recomienda lo siguiente:
Continuar estudios del fenómeno de inclusión con el uso de RMN para
mediciones de distancias de protones de la β-ciclodextrina y fenbendazol,
mediante análisis de ROESY-2D y COSY-2D.
Examinar el proceso de inclusión considerando el medio ácido, o algún otro
medio que beneficie la inclusión. Asimismo, verificar la estabilidad del
complejo en un medio orgánico como el DMSO.
Considerar en próximos estudios la adición de un tercer compuesto para
aumentar la disgregación del fenbendazol. Actualmente los estudios con
ciclodextrinas consideran compuestos ternarios que mejoran la formulación
de compuestos insolubles.
Continuar los estudios de mecánica molecular hasta obtener un RMSD menor
a 2 Å. Se estima aumentar el tiempo de simulación hasta unos 60 ns.
90
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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inclusão dapsona:βcd e dapsona:sbeβcd para incremento de solubilidade em forma
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desde
http://www.ufpi.br/subsiteFiles/ppgcf/arquivos/files/9a_dissertacao_monica_amar
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2. Grebogi, I. Hinke. (2009). Obtenção e Caracterização de Complexos Binários e
Ternários de Dapsona. Universidade Federal do Paraná, Curitiba. Accedido el 29
de diciembre, 2015, desde
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96
ANEXOS
Tabla 10: Optimización de energía y cálculos singlepoint de las moléculas de partida en el vacío.
MOLÉCULAS
DE PARTIDA
OPTIMIZACIÓN
PM6
OPTIMIZACIÓN
B3LYP/6-31G
SINGLEPOINT
DFT B3LYP/6-
31+G**-D3
(HT)
SINGLEPOINT
M05-2x/6-
31+G** (HT)
ß-
CICLODEXTRINA -2.51287403 -4273.956397 -4275.906263 -4275.16809
FENBENDAZOL -0.01214372 -1292.069963 -1292.485128 -1292.29221
97
Tabla 11: Optimización de energía de los confórmeros generados para la orientación A con el semiempírico PM6 en el vac ío.
CONFORMEROS
CONSIDERADOS
ORIENTACIÓN A
(DISTANCIA EN Å
DESDE LOS
ATOMOS DE
REFERENCIA)
OPTIMIZACIÓN
DE ENERGIA
PM6
RESTRAINT
(HT)
ENERGIA DE
COMPLEJACIÓN
(Kcal/mol)
REOPTIMIZACIÓN
PM6 SIN
RESTRAINT (HT)
ENERGIA DE
COMPLEJACIÓN
(Kcal/mol)
1 -5 -2.52656031 -1.0 -2.52954259 -2.8
2 -4 -2.52535947 -0.2 -2.53148847 -4.1
3 -3 -2.52054064 2.8 -2.54614823 -13.3
4 -2 -2.52900457 -2.5 -2.54614813 -13.3
5 -1 -2.53802953 -8.2 -2.54184246 -10.6
6 0.5 -2.53224626 -4.5 -2.54126348 -10.2
7 1 -2.53127059 -3.9 -2.53703144 -7.5
8 2 -2.53105012 -3.8 -2.54373341 -11.7
9 3 -2.53287423 -4.9 -2.54598774 -13.2
10 4 -2.53845666 -8.4 -2.54469525 -12.3
11 5 -2.54003087 -9.4 -2.54444503 -12.2
12 6 -2.53183852 -4.3 -2.54618929 -13.3
13 7 -2.53130744 -3.9 -2.54132971 -10.2
14 8 -2.52905827 -2.5 -2.54006064 -9.4
98
Tabla 12: Optimización de energía de los confórmeros generados para la orientación B con el semiempírico PM6 en el vacío.
CONFORMEROS
CONSIDERADOS
ORIENTACIÓN
B (DISTANCIA
EN Å DESDE
LOS ATOMOS
DE
REFERENCIA)
OPTIMIZACIÓN
DE ENERGIA
PM6
RESTRAINT
(HT)
ENERGIA DE
COMPLEJACIÓN
(Kcal/mol)
REOPTIMIZACIÓN
PM6 SIN
RESTRAINT (HT)
ENERGIA DE
COMPLEJACIÓN
(Kcal/mol)
1 -6 -2.52214 1.8 -2.5271020
-1.3
2 -5 -2.52720 -1.4 -2.5359995 -6.9
3 -4 -2.53462 -6.0 -2.5359995 -6.9
4 -3 -2.53202 -4.4 -2.5367823 -7.4
5 -2 -2.52777 -1.7 -2.5327131 -4.8
6 -1 -2.52460 0.3 -2.5340835 -5.7
7 0.1 -2.52691 -1.2 -2.5454210 -12.8
8 1 -2.53291 -5.0 -2.5464039 -13.4
9 2 -2.53265 -4.8 -2.5456561 -13.0
10 3 -2.53585 -6.8 -2.5441545 -12.0
11 4 -2.53993 -9.4 -2.5441545 -12.0
12 5 -2.54441 -12.2 -2.5535257 -17.9
13 6 -2.54955 -15.4 -2.5563721 -19.7
14 7 -2.54802 -14.4 -2.5563722 -19.7
15 8 -2.54375 -11.8 -2.5476001 -14.2
16 9 -2.54287 -11.2 -2.5447263 -12.4
17 10 -2.53834 -8.4 -2.5483690 -14.7
18 11 -2.53064 -3.5 -2.5424618 -10.9
99
Tabla 13: Optimización de energía de los confórmeros generados para la orientación A con el funcional B3lyp/6 -31G en el
vacío.
CONFORMEROS
CONSIDERADOS
ORIENTACIÓN A
(DISTANCIA EN Å
DESDE LOS
ATOMOS DE
REFERENCIA)
OPTIMIZACION
DE ENERGIA
DFT B3LYP/6-
31G
RESTRAINT
(HT)
ENERGIA DE
COMPLEJACION
(Kcal/mol)
REOPTIMIZACION
DE ENERGIA DFT
B3LYP/6-31G SIN
RESTRAINT (HT)
ENERGIA DE
COMPLEJACION
(Kcal/mol)
4 -2 -5565.986604 24.95
5 -1 -5565.99086 22.28
7 1 -5566.003538 14.32
8 2 -5566.006419 12.51
9 3 -5565.997294 18.24 -5566.011707 9.20
10 4 -5566.021071 3.32 -5566.0427 -10.25
11 5 -5566.03747 -6.97 -5566.043347 -10.66
12 6 -5566.033639 -4.57 -5566.039659 -8.34
14 8 -5566.029356 -1.88
15 9 -5566.030505 -2.60
100
Tabla 14: Optimización de energía de los confórmeros generados para la orientación B con el funcional B3lyp/6 -31G en el
vacío.
CONFORMEROS
CONSIDERADOS
ORIENTACIÓN
B (DISTANCIA
EN Å DESDE
LOS ATOMOS
DE
REFERENCIA)
OPTIMIZACIÓN
DE ENERGIA
DFT B3LYP/6-
31G
RESTRAINT
(HT)
ENERGIA DE
COMPLEJACIÓN
(Kcal/mol)
REOPTIMIZACIÓN
DE ENERGIA DFT
B3LYP76-31G SIN
RESTRAINT (HT)
ENERGIA DE
COMPLEJACIÓN
(Kcal/mol)
8 1 -5566.021526 3.0 -5566.030425 -2.550
9 2 -5566.032013 -3.5
10 3 -5566.03577 -5.9 -5566.049016 -14.216
11 4 -5566.029874 -2.2 -5566.03856 -7.655
12 5 -5566.039563 -8.3
13 6 -5566.033378 -4.4 -5566.040843 -9.088
14 7 -5566.028627 -1.4 -5566.053594 -17.089
15 8 -5566.040035 -8.6 -5566.053596 -17.090
16 9 -5566.050348 -15.1 -5566.053598 -17.092
17 10 -5566.048034 -13.6 -5566.053595 -17.090
101
Tabla 15: Cálculo de energía del tipo singlepoint de los confórmeros generados para la orientación A con los funcionales de
Grimme y de Truhlar en el vacío.
CONFORMEROS
CONSIDERADOS
ORIENTACIÓN
A (DISTANCIA
EN Å DESDE
LOS ATOMOS
DE
REFERENCIA)
ENERGIA
DE
COMPLEJ
ACION
(Kcal/mol)
SINGLEPOINT
DFT B3LYP/6-
31+G**-D3 (HT)
ENERGIA DE
COMPLEJACIÓN
(Kcal/mol)
SINGLEPOINT
M05-2x/6-
31+G** (HT)
ENERGIA DE
COMPLEJACIÓN
(Kcal/mol)
9 3 9.20
10 4 -10.25
11 5 -10.66 -5568.430354 -24.449 -5567.483352 -14.466
12 6 -8.34
Tabla 16: Cálculo de energía del tipo singlepoint de los confórmeros generados para la orientación B con los funcionales de
Grimme y de Truhlar en el vacío.
CONFORMEROS
CONSIDERADOS
ORIENTACIÓN
B (DISTANCIA
EN Å DESDE
LOS ATOMOS
DE
REFERENCIA)
SINGLEPOINT
DFT B3LYP/6-
31+G**-D3
(HT)
ENERGIA DE
COMPLEJACIÓN
(Kcal/mol)
SINGLEPOINT
M05-2x/6-
31+G** (HT)
ENERGIA DE
COMPLEJACIÓN
(Kcal/mol)
15 8 -5568.4277908 -22.8405
16 9 -5568.4277963 -22.8439 -5567.481976 -13.6025
17 10 -5568.4277909 -22.8405
102