ING. CHAKIROU OLIVIER
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
CARACTERIZAREA LA NIVEL
MOLECULAR A RASELOR DE CÂINI
CIOBĂNEŞTI ROMÂNEŞTI
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC:
Prof. univ. dr. ing. AUGUSTIN VLAIC
CLUJ-NAPOCA
2012
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI
MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA
ŞCOALA DOCTORALĂ
FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII
1
CUPRINS
Introducere………………………………………………………………………...
PARTEA I. STUDIU BIBLIOGRAFIC …………………………………………
CAPITOLUL I. RASELE DE CIOBĂNEŞTI ROMÂNEŞTI………………….
CAPITOLUL II. CERCETĂRI ASUPRA ORIGINII ŞI DIVERSITĂŢII
CÂINELUI DOMESTIC………………………………………………………….
CAPITOLUL III. STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR LA
CANIDE....................................................................................................................
PARTEA A DOUA. CERCETĂRI PROPRII…………………………………...
Scopul, obiectivele şi importanţa cercetărilor…………………………………...
CAPITOLUL IV. MATERIAL ŞI METODĂ…………………………………..
CAPITOLUL V. REZULTATE ŞI DISCUŢII………………………………….
5.1 REZULTATELE EXTRACŢIEI DE ADN DIN SÂNGE……………………..
5.2 MIGRAREA PROBELOR DE ADN MITOCONDRIAL...................................
5.3 SECVENŢIEREA PROBELOR DE ADN MITOCONDRIAL……………….
5.4 ALINIEREA SECVENŢELOR DE ADN MITOCONDRIAL………………
5.5 ESTIMAREA NUMĂRULUI ŞI FRECVENŢEI HAPLOTIPURILOR………
5.6 DISTRIBUŢIA GRAFICĂ A NEPOTRIVIRILOR NUCLEOTIDICE LA
CELE PATRU RASE DE CIOBĂNEŞTI ROMÂNEŞTI…………………………
5.7 TESTUL D (TAJIMA)………………………………………………………….
5.8 INDICI DE DIVERSITATE MOLECULARĂ………………………………
5.9 ESTIMAREA DISTANŢELOR GENETICE…………………………………
5.10 ANALIZA DE VARIANŢĂ MOLECULARĂ (AMOVA)………………….
5.11 ARBORI FILOGENETICI……………………………………………………
CAPITOLUL VI. CONCLUZII ………………………………………………….
REFERINŢE BIBLIOGRAFICE………………………………………………...
pag.
2
3
3
3
3
4
4
6
8
8
9
9
10
11
18
20
21
24
28
29
38
40
2
INTRODUCERE
La ora actuală, câinele domestic este cea mai răspândită specie din familia Canidae, cu
o populaţie la nivel global de aproximativ 400 milioane de indivizi, având cea mai largă
distribuţie geografică dintre toate speciile domestice. Dintre mamifere, câinii domestici sunt
remarcabili datorită multitudinii de variaţiuni naturale pe care le prezintă din punct de vedere
al caracteristicilor morfologice şi comportamentale, chiar dacă păstrarea raselor de câini se
face după standarde stabilite, astfel că în cadrul fiecărei rase animalele prezintă adesea o
morfologie şi un comportament uniform şi distinct. Există mai mult de 400 de rase la nivel
mondial, iar importanţa lor economică este substanţială (Lindblad-Toh şi colab 2005).
Studiul la nivel molecular a raselor de câini domestici a devenit o necesitate odată cu
punerea la punct a tehnicilor genetice moleculare. Aflarea originii şi a relaţiilor filogenetice
ale câinelui domestic au reprezentat primul pas spre cunoaşterea mai amănunţită a “celui mai
bun prieten al omului”. În anul 2005 câinele a devenit a V-a specie al cărei genom a fost
complet secvenţiat. Genomul canin a fost secvenţiat în speranţa că îi va putea ajuta pe
oamenii de ştiinţă să înţeleagă mecanismele evoluţionare complexe care formează genele şi
genoamele şi să furnizeze o unealtă puternică pentru identificarea factorilor genetici care
contribuie la starea de sănătate a omului. Se aşteaptă ca în următorii ani genomul câinelui
domestic să ajute la înţelegerea cauzei genetice a mai multor boli cu transmitere la
descendenţi pe care oamenii şi câinii le au în comun (Pires E.A. 2006).
O altă direcţie de cercetare la specia canină o reprezintă studiile de filogenie şi
biodiversitate, câinele fiind specia de mamifere cu cea mai mare variabilitate fenotipică. În
România nu s-au efectuat până în momentul de faţă cercetări la nivel molecular asupra nici
unei rase de câini. Caracterizarea la nivel molecular a câinilor ciobăneşti româneşti este foarte
importantă pentru cunoaşterea în detaliu a raselor autohtone, a originii fiecărei rase şi a
relaţiilor filogenetice din cadrul raselor româneşti şi a relaţiilor cu alte rase şi specii de canide.
Câinele reprezintă poate cea mai frumoasă cucerire a omului, fiind primul
element de progres al omenirii, deoarece el a fost acela care a favorizat trecerea
omului de la starea de sălbăticie la starea patriarhală, dându-i posibilitatea să întreţină
în apropierea sa şi alte specii de animale atât de folositoare pentru hrană şi alte utilităţi
(Bud I., 1998).
3
PARTEA ÎNTÂI: STUDIU BIBLIOGRAFIC
CAPITOLUL I. RASELE DE CIOBĂNEŞTI ROMÂNEŞTI
Acest capitol este structurat în două subcapitole. În primul subcapitol sunt prezentate
aspecte genetice generale ale câinelui domestic. Al doilea subcapitol prezintă cele patru rase
de câini ciobăneşti româneşti existente: Ciobănescul de Bucovina, Ciobănescul Carpatin,
Ciobănescul Corb şi Ciobănescul Mioritic.
CAPITOLUL II. CERCETĂRI ASUPRA ORIGINII ŞI DIVERSITĂŢII CÂINELUI
DOMESTIC
În acest capitol, care este structurat în şase subcapitole, sunt prezentate cele mai
importante cercetări efectuate asupra câinelui domestic, cu privire la originea şi relaţiile
filogenetice dintre acesta şi alte specii animale înrudite.
CAPITOLUL III. STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR LA CANIDE
Capitolul III al prezentei teze de doctorat prezintă, pe baza bibliografiei studiate,
cercetările realizate în ultimii ani asupra câinelui domestic. În cel de-al doilea subcapitol sunt
prezentate rezultatele unor măsurători fenotipice asupra raselor de căini ciobăneşti romăneşti
omologate provizoriu de către Federaţia Chinologică Internaţională (Ciobănescul de
Bucovina, Ciobănescul Carpatin, şi Ciobănescul Mioritic), precum şi evoluţia numerică a
acestor rase până în anul 2009.
4
PARTEA A DOUA: CERCETĂRI PROPRII
SCOPUL, OBIECTIVELE ŞI IMPORTANŢA CERCETĂRILOR
Scopul cercetărilor acestei teze de doctorat a fost cel de a stabili distanţele genetice şi
relaţiile filogenetice pentru cele patru rasele de câini ciobăneşti româneşti: Ciobănescul de
Bucovina, Ciobănescul Carpatin, Ciobănescul Mioritic şi Ciobănescul Corb.
Obiectivele şi activităţile cercetării
1. Obţinerea şi analizarea secvenţelor de ADN mitocondrial la cele patru rase de câini
ciobăneşti româneşti.
Pentru realizarea acestui obiectiv au fost întreprinse următoarele activităţi:
Ø au fost identificate expoziţiile canine internaţionale şi naţionale la care au participat
câini din rasele de ciobăneşti româneşti. S-au luat în considerare doar câini specifici rasei
care au Carte de Origine Română (pedigree) şi care au primit un calificativ bun în urma
jurizării din cadrul expoziţiei;
Ø au fost recoltate probe de sânge de la câini ciobăneşti aparţinând raselor Ciobănesc de
Bucovina, Ciobănesc Carpatin, Ciobănesc Mioritic şi Ciobănesc Corb;
Ø s-a realizat extracţia de ADN din probele sanguine recoltate;
Ø s-au secvenţiat probe de ADN mitocondrial pentru rasele Ciobănesc de Bucovina,
Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Mioritic şi Ciobănesc Corb
2. Estimarea indicilor de diversitate moleculară şi a distanţelor genetice
Pentru atingerea acestui obiectiv s-au realizat următoarele activităţi:
Ø Estimarea numărului de haplotipuri şi frecvenţa acestora
Ø Calcularea indicilor de diversitate nucleotidică
Ø Estimarea distanţelor genetice pe baza secvenţelor nucleotidice de la cele patru rase
5
3. Stabilirea relaţiilor filogenetice ale raselor de câini ciobăneşti româneşti pe baza
secvenţelor de ADN mitocondrial
În cadrul acestui obiectiv s-a urmărit realizarea de arbori filogenetici care să arate relaţiile
filogenetice dintre rasele de câini Ciobănesc de Bucovina, Ciobănesc Carpatin, Ciobănesc
Mioritic şi Ciobănesc Corb precum şi a relaţiilor filogenetice dintre fiecare rasa autohtonă şi
alte rase de câini, ale căror secvenţe nucleotidice sunt disponibile în baza de date Genbank.
Pentru realizarea acestui obiectiv s-au derulat următoarele activităţi:
Ø Analiza secvenţelor nucleotidice corespunzătoare indivizilor aparţinând raselor
Ciobănesc de de Bucovina, Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Mioritic. Acest tip de
analiză constă în alinierea secvenţelor de ADNmt ale indivizilor din aceste rase cu
secvenţele de ADNmt de la specia canină existente în baza de date Genbank;
Ø Întocmirea arborilor filogenetici pentru fiecare rasă de câini ciobăneşti în parte, pe
baza rezultatelor obţinute prin intermediul analizei secvenţelor de ADNmt;
Ø Compararea secvenţelor de ADNmt obţinute de la rasele de câini Ciobănesc de de
Bucovina, Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Mioritic şi stabilirea distanţelor
filogenetice dintre acestea.
Importanţa cercetării rezidă în faptul că rezultatele obţinute vor contribui la
cunoaşterea mai detaliată, la nivel molecular, a raselor autohtone de câini ciobăneşti şi de
asemenea la stabilirea relaţiilor filogenetice dintre acestea. Până în momentul de faţă nu s-au
realizat cercetări la nivel molecular asupra acestor rase de câini. De asemenea aceste cercetări
vor face parte din dosarul care va fi înaintat către Federaţia Chinologică Internaţională pentru
recunoaşterea permanentă a raselor de câini ciobăneşti Ciobănesc de de Bucovina, Ciobănesc
Carpatin şi Ciobănesc Mioritic.
6
CAPITOLUL IV. MATERIAL ŞI METODĂ
Pentru obţinerea secvenţelor de ADN mitocondrial în vederea realizării analizelor
genetice şi filogenetice s-au urmat următoarele etape:
1) Recoltarea probelor de sânge
2) Extracţia ADN din sânge
3) Amplificarea probelor de ADN
4) Migrarea probelor de ADN în gel de agaroză
5) Purificarea probelor de ADN
6) Secvenţierea probelor de ADN
Recoltarea probelor de sânge s-a realizat în mai multe etape succesive. Probele de
sânge au fost recoltate în cadrul expoziţiilor canine (de club, naţionale şi internaţionale) de la
indivizi cu pedigree (Carte de Origine Română). Expoziţiile la care am participat şi recoltat
sânge au avut loc în localităţile: Arad, Bistriţa, Râşnov, Alba-Iulia, Suceava, Rădăuţi şi Cluj-
Napoca. S-au recoltat în total 102 probe de sânge de la cele patru rase de câini ciobăneşti
româneşti. Pentru obţinerea unor rezultate corecte în urma analizelor statistice şi a analizelor
filogenetice a celor patru populaţii canine este necesară utilizarea unor eşantioane de probe
formate doar din indivizi neînrudiţi. Din acest motiv nu au putut fi utilizate pentru secvenţiere
şi analiză toate probele recoltate, ci doar o parte a acestora, deoarece la aceste expoziţii unii
dintre câini sunt înrudiţi. Probele de sânge şi probele de ADN obţinute în urma extracţiei au
fost etichetate în felul următor: CC-Ciobănesc Carpatin; CO-Ciobănesc Corb; CB-Ciobănesc
de Bucovina; CM-Ciobănesc mioritic.
În studiul de faţă s-a procedat la secvenţierea unei porţiuni de 887 pb din genomul
mitocondrial de la patru rase de câini ciobăneşti româneşti: Ciobănesc de Bucovina,
Ciobănesc Carpatin, Ciobănesc Mioritic şi Ciobănesc Corb. Secvenţa conţine un segment al
citocromului b, gena care codifică ARNt-Thr, gena care codifică ARNt-Pro şi o parte a
regiunii de control (poz. 15259 până la poz. 16146). S-a secvenţiat această porţiune deoarece
prezintă cea mai mare variabilitate nucleotidică din cadrul genomului mitocondrial (Figura 1).
7
Figura 1. Harta genomului mitocondrial canin. Harta a fost realizată de către Ryong
Nam Kim şi colab. (2012) în urma secvenţierii întregului genom mitocondrial la un individ
din rasa Jindo Coreean.
Analiza genetică efectuată în prezenta teză de doctorat a cuprins următoarele aspecte:
a) Alinierea secvenţelor de ADN mitocondrial
b) Estimarea unor indici de diversitate moleculară
c) Construirea graficelor de distribuţie a nepotrivirilor nucleotidice
d) Calculul Testului D (Tajima)
e) Estimarea distanţei genetice pe baza indicelui de fixaţie (FST) şi a distanţei Nei
f) Analiza de varianţă moleculară (AMOVA)
Ultima parte a studiului a constat într-o analiză filogenetică a celor patru rase de câini
ciobăneşti româneşti. Pentru construirea arborilor filogenetici s-a utilizat programul de analiză
genetică MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood,
Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods (Tamura K. şi colab. 2011). Acest
program construieşte arbori filogenetici pe baza secvenţelor nucleotidice. S-a procedat la
8
construirea de arbori filogenetici între toate secvenţele analizate de la cele patru rase de
ciobăneşti româneşti, precum şi dendrograme cuprinzând secvenţe de lupi sălbatici şi alte
secvenţe nucleotidice de la alte rase de câini din baza de date Genbank.
CAPITOLUL V. REZULTATE ŞI DISCUŢII
5.1 REZULTATELE EXTRACŢIEI DE ADN DIN SÂNGE
Extracţia de ADN din sânge s-a realizat prin două metode: o metodă clasică şi o
metodă pe baza de kit. Ambele metode au dat rezultate bune, însă pentru obţinerea unei
cantităţi mai mari de ADN se recomandă utilizarea metodei clasice de extracţie a ADN din
sânge. În figura 2 sunt date concentraţiile şi purităţile rezultate în urma extracţiei ADN prin
metoda clasică.
Figura 2. Cuantificarea probelor ADN extrase de la câini ciobăneşti româneşti. CC -
Ciobănesc Carpatin; CB - Ciobănesc de Bucovina; CM - Ciobănesc mioritic
Valoarea medie a cantităţii de ADN a fost de 267,24 ng/µl, valorea minimă fiind 40,86
ng/µl, iar cea maximă 609,14 ng/µl. În ceea ce priveşte puritatea probelor de ADN extrase,
acestea au avut valoarea maximă de 1,90 şi valoarea minimă de 1,20. Media a fost în jurul
valorii de 1,41 (Figura 2).
9
5.2 MIGRAREA PROBELOR DE ADN MITOCONDRIAL PRIN ELECTROFOREZĂ
În urma migrării probelor de ADN în gel de agaroză s-au obţinut următoarele profile
electroforetice pentru probele ADN analizate (Figura 3). Unele dintre probele ADN nu s-au
amplificat prin tehnica PCR. Aceste probe au fost extrase din nou, amplificate şi migrate
ulterior.
Figura 3. Vizualizarea în lumină UV a unui gel de agaroză. Benzile întunecate corespund
fragmentului de 887 pb de ADN mitocondrial. CC-Ciobănesc Carpatin; CO-Ciobănesc Corb;
CB-Ciobănesc de Bucovina; CM-Ciobănesc mioritic
5.3 SECVENŢIEREA PROBELOR DE ADN MITOCONDRIAL
Secvenţierea probelor de ADN mitocondrial extras din sângele recoltat de la rasele
Ciobănesc de Bucovina, Ciobănesc Carpatin, Ciobănesc Corb şi Ciobănesc Mioritic s-a
realizat de către firma Macrogen din Olanda. În urma secvenţierii probelor de ADN
mitocondrial s-au obţinut secvenţele nucleotidice (887 pb) pentru rasele: Ciobănesc de
Bucovina, Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Mioritic. Secvenţa conţine un segment al
citocromului b, gena care codifică ARNt-Thr, gena care codifică ARNt-Pro şi o parte a
regiunii de control.
10
Tabel 1
Conţinutul procentual al bazelor azotate corespunzător celor patru rase de căini ciobăneşti
româneşti (valori relative). Conţinutul nucleotidic a fost determinat cu programul Arlequin v.
3.5
Rasa
Adenină
(%)
Guanină
(%)
Timină
(%)
Citozină
(%)
AT
(%)
GC
(%)
Ciobănesc de Bucovina
28,31
15,24
29,74
26,71
58,05
41,95
Ciobănesc Carpatin
28,19
15,32
30,03
26,47
58,22
41,78
Ciobănesc Corb
28,26
15,23
29,90
26,61
58,16
41,84
Ciobănesc Mioritic
27,96
15,85
29,64
26,55
57,60
42,40
În tabelul 1 se prezintă proporţia de baze azotate corespunzător secvenţei nucleotidice
de 887 pb a câte unui individ din rasele Ciobănesc de Bucovina, Ciobănesc Carpatin,
Ciobăbesc Corb şi Ciobănesc Mioritic. Proporţia de baze azotate este foarte apropiată între
secvenţele analizate. Procentele de AT s-au aflat între valorile 57,60 şi 58,22, iar cele de GC
între 41,78 şi 42,40.
5.4 ALINIEREA SECVENŢELOR DE ADN MITOCONDRIAL
Toate secvenţele de la cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti au fost aliniate
între ele. Deasemenea pentru fiecare secvenţă s-a realizat o analiză BLAST, pentru a
determina care sunt secvenţele nucleotidice din baza de date Genbank cele mai asemănătoare
cu secvenţele câinilor ciobăneşti româneşti.
Rezultatele alinierilor au fost utilizate pentru construirea arborilor filogenetici.
11
Figura 4. Exemplu de aliniere a secvenţelor de ADNmt de la câinii ciobăneşti româneşti şi
secvenţele de lupi din baza de date Genbank. Secvenţele de lupi sunt notate cu „W”
5.5 ESTIMAREA NUMĂRULUI ŞI FRECVENŢEI HAPLOTIPURILOR
Pentru efectuarea analizelor statistice s-au luat în considerare câte 11 secvenţe
reprezentative pentru fiecare din cele patru populaţii de câini ciobăneşti româneşti.
În cadrul celor 44 de secvenţe nucleotidice analizate s-a identificat un număr de 18
haplotipuri. Distribuţia haplotipurilor în cadrul celor patru populaţii se poate observa în
tabelul 2.
12
Tabel 2
Numărul de haplotipuri şi numărul de indivizi la care s-au identificat haplotipurile de la cele
patru rase de câini ciobăneşti româneşti
Rasa
Haplotip
Ciobănesc de Bucovina
n = 11
Ciobănesc Carpatin n = 11
Ciobănesc Corb
n = 11
Ciobănesc Mioritic
n = 11
Hap. 1 8 0 0 1 Hap. 2 2 0 0 0 Hap. 3 1 6 1 0 Hap. 4 0 1 0 0 Hap. 5 0 1 0 0 Hap. 6 0 1 0 0 Hap. 7 0 1 0 0 Hap. 8 0 1 0 0 Hap. 9 0 0 2 0
Hap. 10 0 0 2 0 Hap. 11 0 0 1 0 Hap. 12 0 0 3 0 Hap. 13 0 0 2 0 Hap. 14 0 0 0 1 Hap. 15 0 0 0 1 Hap. 16 0 0 0 3 Hap. 17 0 0 0 4 Hap. 18 0 0 0 1
La populaţia Ciobănesc de Bucovina s-au identificat 3 haplotipuri (Hap. 1, 2 şi 3); la
populaţia Ciobănesc Carpatin s-au identificat 6 haplotipuri (Hap. 3, 4, 5, 6, 7, 8); la populaţia
Ciobănesc Corb s-au identificat 6 haplotipuri (Hap. 3, 9, 10, 11, 12, 13 ); la populaţia
Ciobănesc Mioritic s-au identificat 6 haplotipuri (Hap. 1, 14, 15, 16, 17, 18).
Dintre cele 18 haplotipuri identificate, doar două haplotipuri au fost comune între rase
(hap.1 şi hap. 3). Haplotipul 1 este comun raselor Ciobănesc de Bucovina şi Ciobănesc
Mioritic şi a fost identificat la opt indivizi din rasa Ciobănesc de Bucovina, însă doar la un
singur individ Ciobănesc Mioritic.
Haplotipul 3 a fost identificat la rasele Ciobănesc de Bucovina, Ciobănesc Carpatin şi
Ciobănesc Corb. Cea mai mare frecvenţă a acestui haplotip a fost observată la populaţia de
Ciobănesc Carpatin, unde a fost identificat la 6 din cei 11 indivizi analizaţi. La populaţiile de
13
Ciobănesc de Bucovina şi Ciobănesc Corb, acest haplotip a fost prezent la doar câte un
individ din cei 11 analizaţi per rasă.
Restul de 16 haplotipuri au fost caracteristici rasei din care fac parte indivizii studiaţi.
Figura 5. Frecvenţa haplotipurilor la cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti (frecvenţe
relative).
În figura 5 se prezintă frecvenţele relative a celor 18 haplotipuri pentru fiecare rasă
de ciobăneşti româneşti. Cea mai mare frecvenţă a fost atinsă de haplotipul 1 (0,727), urmat
apoi de haplotipul 3 (0,545), haplotipul 17 (0,364), haplotipul 12 (0,300), haplotipul 16
(0,273). Restul haplotipurilor au fost identificate la unul sau maxim doi indivizi şi au
frecvenţe cuprinse între valorile: 0,090 şi 0,200.
14
Pe baza diferenţelor nucleotidice dintre secvenţele de ADN mitocondrial, programul
Arlequin a construit matrici de distanţe între haplotipuri pentru fiecare populaţie de ciobăneşti
şi per total. Matricile corespunzătoare fiecărei rase sunt prezentate în figurile 6, 7, 8 şi 9.
Figura 6. Matricea distanţelor interhaplotipice pentru populaţia Ciobănesc de Bucovina.
Distanţele dintre haplotipuri au fost calculate pe baza numărului de diferenţe nucleotidice
dintre secvenţe. Intensitatea culorii graficului este direct proporţională cu numărul de
diferenţe dintre secvenţele de ADNmt
La rasa Ciobănesc de Bucovina s-au identificat 3 haplotipuri. Numărul mediu de
diferenţe „pairwise” pentru populaţia de Ciobănesc de Bucovina a fost de 3,759 +/- 2,051
(deviaţia standard).
Haplotipul 1 a fost observat la 8 din cei 11 indivizi analizaţi. Haplotipul 2 a fost
observat la doi indivizi, iar haplotipul 3 a fost observat la doar un singur individ.
Matricea distanţei dintre haplotipuri (Fig. 6) ne arată că cea mai mare diferenţă este între
haplotipul 3 şi hap. 1 şi 2. Numărul mare de diferenţe nucleotidice dintre hap. 3 şi hap.1,
15
respectiv hap. 2, se datorează faptului că acest haplotip este comun cu rasele Ciobănesc
Carpatin şi Ciobănesc Corb, deci nu este caracteristic rasei Ciobănesc de Bucovina. Numărul
mic de haplotipuri observate la rasa Ciobănesc de Bucovina este datorat variabilităţii genetice
mici dintre secvenţele de ADN mitocondrial studiate.
Figura 7. Matricea distanţelor interhaplotipice pentru populaţia Ciobănesc Carpatin.
Distanţele dintre haplotipuri au fost calculate pe baza numărului de diferenţe nucleotidice
dintre secvenţe. Intensitatea culorii graficului este direct proporţională cu numărul de
diferenţe dintre secvenţele de ADNmt.
Dintre cele şase haplotipuri identificate la rasa Ciobănesc Carpatin, cea mai mare
distanţă a fost estimată între haplotipul 6 şi restul haplotipurilor. Numărul mediu de diferenţe
„pairwise” pentru populaţia de Ciobănesc Carpatin este de 12,896 +/- 6,300 (deviaţia
standard)
Cea mai mare frecvenţă haplotipică a fost observată la haplotipul 3 (0,545). Acest
haplotip a fost evidenţiat şi la rasele Ciobănesc de Bucovina şi Ciobănesc Corb, însă cu o
frecvenţă mult mai mică (0,090) . Incidenţa acestui haplotip şi la rasele Ciobănesc de
16
Bucovina şi Ciobănesc Corb poate fi explicată prin schimbul de gene care a avut loc între cele
trei rase de ciobăneşti româneşti înaintea recunoaşterii lor ca rase diferite.
Numărul relativ mic de diferenţe nucleotidice între haplotipul 3 şi restul
haplotipurilor identificate la rasa Ciobănesc Carpatin (vezi fig. 7), precum şi frecvenţa mare a
acestuia în cadrul populaţiei studiate, sugerează faptul că acest haplotip este caracteristic rasei
Ciobănesc Carpatin şi a ajuns în cadrul populaţiilor de Ciobănesc de Bucovina şi Ciobănesc
Corb prin încrucişări între femele de Ciobănesc Carpatin şi masculi aparţinând raselor
Ciobănesc de Bucovina şi Ciobănesc Corb (ADN-ul mitocondrial se transmite doar pe linie
maternă).
Figura 8. Matricea distanţelor interhaplotipice pentru populaţia Ciobănesc Corb. Distanţele
dintre haplotipuri au fost calculate pe baza numărului de diferenţe nucleotidice dintre
secvenţe. Intensitatea culorii graficului este direct proporţională cu numărul de diferenţe
nucleotidice dintre secvenţele de ADNmt
Matricea distanţelor interhaplotipice core
(fig. 8) ne arată că cele mai mari distanţe
haplotipurilor, respectiv 12 şi restul haplotipurilor. Restul di
prezentat valori medii. Numărul m
Corb este de 76,817 +/- 36,217 (deviaţia standard).
Figura 9. Matricea distanţelor interhaplotipice pentru populaţia Ciobănesc Mioritic. Distanţele
dintre haplotipuri au fost calculate pe baza
secvenţe. Intensitatea culorii graficului este direct proporţională cu numărul de diferenţe
nucleotidice dintre secvenţele de ADNmt
Pentru populaţia de Ciobănesc Mioritic numărul mediu de diferenţe „pairwise”
de 97,205 +/- 45,335, şi reprezintă cel mai mare număr de diferenţe nucleotidice calculat la
cele patru rase de ciobăneşti analizate.
La rasa Ciobănesc Mioritic s
(0,398), comparativ cu celelate rase
17
Matricea distanţelor interhaplotipice corespunzătoare populaţiei de Ciobănesc Corb
) ne arată că cele mai mari distanţe s-au estimat între haplotipul
haplotipurilor, respectiv 12 şi restul haplotipurilor. Restul distanţelor dintre haplotipuri au
prezentat valori medii. Numărul mediu de diferenţe „pairwise” pentru populaţia de Ciobănesc
36,217 (deviaţia standard).
Matricea distanţelor interhaplotipice pentru populaţia Ciobănesc Mioritic. Distanţele
dintre haplotipuri au fost calculate pe baza numărului de diferenţe nucleotidice dintre
secvenţe. Intensitatea culorii graficului este direct proporţională cu numărul de diferenţe
nucleotidice dintre secvenţele de ADNmt
Pentru populaţia de Ciobănesc Mioritic numărul mediu de diferenţe „pairwise”
45,335, şi reprezintă cel mai mare număr de diferenţe nucleotidice calculat la
cele patru rase de ciobăneşti analizate.
La rasa Ciobănesc Mioritic s-a observat cea mai mare distanţă între haplotipuri
(0,398), comparativ cu celelate rase de ciobăneşti româneşti. Această distanţă a fost calculată
aţiei de Ciobănesc Corb
au estimat între haplotipul 9 şi restul
stanţelor dintre haplotipuri au
ediu de diferenţe „pairwise” pentru populaţia de Ciobănesc
Matricea distanţelor interhaplotipice pentru populaţia Ciobănesc Mioritic. Distanţele
numărului de diferenţe nucleotidice dintre
secvenţe. Intensitatea culorii graficului este direct proporţională cu numărul de diferenţe
Pentru populaţia de Ciobănesc Mioritic numărul mediu de diferenţe „pairwise” este
45,335, şi reprezintă cel mai mare număr de diferenţe nucleotidice calculat la
a observat cea mai mare distanţă între haplotipuri
de ciobăneşti româneşti. Această distanţă a fost calculată
18
între haplotipul 1 şi haplotipul 18. Haplotipul 18 a prezentat distanţe foarte mari comparativ
cu restul haplotipurilor, cu valori cuprinse între 0,383 – 0,398.
5.6 DISTRIBUŢIA GRAFICĂ A NEPOTRIVIRILOR NUCLEOTIDICE LA CELE PATRU
RASE DE CIOBĂNEŞTI ROMÂNEŞTI
Graficele de distribuţie a nepotrivirilor nucleotidice au fost construite pentru două
cazuri. Primul caz are la bază presupunerea că populaţia a trecut printr-o fază de mărime
constantă a populaţiei, în timp ce la al doilea caz se face presupunerea că populaţia a trecut
printr-o fază de expansiune demografică. Graficele prezintă diferenţele „pairwise” observate
şi diferenţele aşteptate pentru cele două cazuri (mărime constantă şi expansiune demografică).
Graficele vor fi prezentate pentru cele două cazuri la fiecare rasă în parte.
Mărime constantă Expansiune demografică
Figura 10. Graficele distribuţiei nepotrivirilor nucleotidice la rasa Ciobănesc de Bucovina
Mărime constantă Expansiune demografică
Figura 11. Graficele distribuţiei nepotrivirilor nucleotidice la rasa Ciobănesc Carpatin
19
Mărime constantă Expansiune demografică
Figura 12. Graficele distribuţiei nepotrivirilor nucleotidice la rasa Ciobănesc Corb
Mărime constantă Expansiune demografică
Figura 13. Graficele distribuţiei nepotrivirilor nucleotidice la rasa Ciobănesc Mioritic
Cele două grafice de distribuţie a nepotrivirilor nucleotidice corespunzătoare fiecărei
rase de ciobăneşti româneşti au fost comparate între ele. Nici unul dintre grafice nu este
susţinut statistic (p>0,05).
La rasa Ciobănesc de Bucovina se observă că există o mai bună potrivire între
distribuţiile observate şi cele aşteptate pentru cazul de evoluţie constantă a populaţiei.
Graficele distribuţiei la rasa Ciobănesc Carpatin sunt aproape identice, deci
neconcludente în ceea ce priveşte istoria demografică recentă a acestei rase.
La rasa Ciobănesc Corb se observă o mai bună potrivire a distribuţiilor observată,
respectiv aşteptată, pentru modelul constant de evoluţie a mărimii populaţiei.
20
Pentru populaţia de Ciobănesc Mioritic graficele nepotrivirilor nucleotidice sunt prea
asemănătoare pentru a se putea trage o concluzie privind evoluţia demografică a acestei
populaţii.
5.7 TESTUL STATISTIC D (TAJIMA)
Deoarece graficele de distribuţie a nepotrivirilor nucleotidice nu au fost concludente s-
a procedat la calcularea statisticului D. Acest test face o discriminare între secvenţele
nucleotidice care au evoluat la întâmplare (pe baza modelului teoriei neutralităţii) şi
secvenţele care nu au evoluat la întâmplare, fiind sub influenţa unui proces nerandomizat cum
sunt selecţia stabilizatoare sau direcţională, expansiunea sau restrângerea demografică, etc.
În tabelul de mai jos sunt trecute numărul de indivizi luaţi în studiu din cele patru rase
de câini ciobăneşti româneşti, valorile testului D, semnificaţia statistică a testului, numărul de
situsuri polimorfice (S) şi coeficentul de diversitate nucleotidică (π).
Tabel 3
Valorile testului D la cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti
Rasa
Statistici
Ciobănesc de
Bucovina
Ciobănesc
Carpatin
Ciobănesc
Corb
Ciobănesc
Mioritic
Nr. indivizi 11 11 11 11
S 16 62 131 327
Π 0,004 0,015 0,084 0,094
Testul D -1,430 -2,115 2,394 -1,817
Semnificaţia
statistică
n.s., p>0.01 **, p< 0.01 **, p< 0.01 *, p< 0.05
Valorile testului D au fost negative pentru populaţiile Ciobănesc de Bucovina,
Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Mioritic. Doar la populaţia de Ciobănesc Corb valoarea lui
D a fost pozitivă. Valorile testului au fost semnificative din punct de vedere statistic pentru
rasele Ciobănesc Carpatin, Ciobănesc Corb şi Ciobănesc Mioritic.
21
Valoarea testului D a fost semnificativă statistic pentru populaţia de Ciobănesc
Mioritic (p < 0.05), şi distinct semnificativă (p < 0.01) pentru populaţiile de Ciobănesc
Carpatin şi Ciobănesc Corb. Valorile negative obţinute la populaţiile Ciobănesc de Bucovina,
Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Mioritic semnifică un exces al polimorfismelor cu frecvenţă
joasă comparativ cu valorile aşteptate, ceea ce indică o creştere a mărimii populaţiei şi/sau
selecţie negativă (purificatoare).
La populaţia de Ciobănesc Corb valoarea statisticului D a fost pozitivă (2,394), ceea ce
semnifică faptul că populaţia prezintă nivele scăzute a polimorfismelor (frecvenţe scăzute şi
ridicate), ceea ce indică o scădere a mărimii populaţiei şi/sau aflarea populaţiei sub efectul
selecţiei stabilizatoare.
5.8 INDICI DE DIVERSITATE MOLECULARĂ
Figura 14. Gradul de diversitate a genelor al cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti
Deoarece genomul mitocondrial este haploid, în loc de terminologia „heterozigoţie
aşteptată” se va utiliza „diversitatea genelor” (Nei, 1973).
22
Analizând datele din figura 14 se poate observa că cea mai mare diversitate a genelor
este la populaţia Ciobănesc Corb, la care s-a observat cea mai mare valoare a diversităţii
genelor GST = 0.888 +/- 0.075 (deviaţia standard). Valorile pentru populaţia Ciobănesc
Mioritic sunt foarte apropiate de cele ale populaţiei de Ciobănesc Corb, cu GST = 0.836 +/-
0.088 (deviaţia standard). La Ciobănescul Carpatin valoarea indicelui de diversitate a fost GST
= 0.7273 +/- 0.1444 (deviaţia standard). Populaţia de Ciobănesc de Bucovina a înregistrat cel
mai mic indice GST, cu o valoare de 0.472 +/- 0.1617 (deviaţia standard).
Valorile obţinute pentru rasele de câini ciobăneşti româneşti sunt asemănătoare cu cele
obţinute de către alţi autori la alte rase de câini pe ADN microsatelit. Koskinen (2000) a
obţinut valori cuprinse între 0.35 şi 0.88 la rasele Golden Retreiver, Ciobănesc German,
Teckel cu păr sârmos, Pembroke Welsh Corgi şi Terrier Bedlington. Pires şi colab. (2009) au
prezentat valori începând cu 0.60 (Pointer portughez), cea mai mare valoare raportată a
heterozigoţiei aşteptate fiind de 0.89 (Câinele tunisian).
În studiul realizat de Kim şi colab. (2001) pe un număr de 11 rase de câini asiatici s-au
raportat valori ale heterozigoţiei aşteptate cuprinse între 0.310–0.718, cu o valoare medie de
0,580.
Figura 15. Numărul de alele la loci diferiţi la cele patru populaţii de câini ciobăneşti
româneşti
23
Datele din figura 15 ne arată că la populaţia de Ciobănesc Mioritic s-a estimat numărul
cel mai mare de alele, cu o medie de 1,444 +/- 0,583 (deviaţia standard). Ciobănescul Corb a
prezentat o valoare medie de 1,161 +/- 0,370 (deviaţia standard). La rasele Ciobănesc
Carpatin şi Ciobănesc de Bucovina numărul mediu de alele a fost de 1,080 +/- 0,289 (deviaţia
standard), respectiv 1,019 +/- 0,138 (deviaţia standard).
Tabel 4
Indici ai diversităţii nucleotidice la cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti
Rasa
Statistici
Ciobănesc de
Bucovina
Ciobănesc
Carpatin
Ciobănesc
Corb
Ciobănesc
Mioritic
Nr. observat de tranziţii
16
32
59
141
Nr. observat de transversii
0
64
73
224
Nr. de substituţii
16
66
132
365
Nr. observat de situsuri cu
tranziţii
16
31
59
133
Nr. observat de situsuri cu
transversii
16
31
59
133
Nr. de situsuri polimorfice
16
62
131
327
Numărul mediu de
diferenţe „pairwise”(π)
3,709
12,509
69,133
77,855
Din datele din tabel se constată că în ceea ce priveşte numărul de substituţii
nucleotidice, populaţia de Ciobănesc Mioritic prezintă cel mai mare număr (365), urmată de
populaţia de Ciobănesc Corb (132). La populaţia de Ciobănesc Carpatin numărul de substituţii
este de 66, iar la populaţia de Ciobănesc Corb s-a observat cel mai mic număr de substituţii
(16). Cel mai mare indice de diversitate moleculară (π) a fost cel obţinut de populaţia de
Ciobănesc Mioritic (77,855), ceea ce denotă faptul că această populaţie are cel mai mare grad
24
de diversitate moleculară la nivel intrapopulaţional. Cea mică diversitate a fost raportată la
populaţia de Ciobănesc de Bucovina, la care π = 3,709. Acest nivel scăzut de diversitate
nucleotidică poate fi pus pe seama unui anumit grad de izolare geografică pe care o suferă
această rasă, deoarece majoritatea indivizilor tipici rasei provin din regiunea Bucovinei şi
prezintă un grad mai mare de cosangvinizare.
5.9 ESTIMAREA DISTANŢELOR GENETICE
1. Estimarea indicelui de fixaţie FST
Figura 16. Matricea distanţelor FST dintre rasele de câini ciobăneşti româneşti. Intensitatea
culorii căsuţelor din grafic este direct proporţională cu valoarea distanţei genetice dintre rase.
Valorile distanţelor genetice dintre cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti
estimate pe baza statisticului FST sunt prezentate în figura 16. Între rasele Ciobănesc de
Bucovina şi Ciobănesc Corb s-a estimat cea mai mare distanţă genetică dintre cele patru rase
25
luate în studiu (FST = 0,368). Indicele FST între rasa Ciobănesc de Bucovina şi rasele
Ciobănesc Corb şi Ciobănesc Mioritic a prezentat valorile 0,317 respectiv 0,299. Distanţa
genetică dintre Ciobănescul Carpatin şi Ciobănescul Corb a atins valoarea 0,146, iar între
Ciobănescul Carpatin şi Ciobănescul Mioritic valorea distanţei a fost de 0,218. Cea mai mică
valoare a indicelui de fixaţie a fost estimată între rasele Ciobănesc Corb şi Ciobănesc
Mioritic, cu o valoare de 0,137.
Parker şi colab. (2004), în cadrul unui studiu amplu realizat pe 85 de rase de câini, a
obţinut o valoare medie a FST de 0,330. Kim şi colab. (2001) au obţinut valori cuprinse între
0,022 şi 0,369, cu o valoare medie de 0,154, pentru cele 11 rase de câini luate în studiu.
Koskinen & Bredbacka (2000) au estimat valori ale FST , pentru cinci rase finlandeze de câini,
cuprinse între 0.182 şi 0.291.
1. Estimarea distanţei genetice Nei (figura 17, tabel 5)
Distanţa genetică estimată în interiorul populaţiilor a atins valori cuprinse între 0,472
(Ciobănesc de Bucovina) şi 0,888 (Ciobănesc Corb). Pentru populaţiile de Ciobănesc Carpatin
şi Ciobănesc Mioritic valorile au fost de 0,727, respectiv 0,836 (vezi figura 19 şi tabelul 6).
Distanţa Nei (DA) a atins cea mai mare valoare (0,350) între populaţiile de Ciobănesc de
Bucovina şi Ciobănesc Carpatin. Valorile DA estimate între rasa Ciobănesc de Bucovina şi
celelalte două rase de ciobăneşti româneşti au fost: 0,310 (Ciobănesc Corb) şi 0,279
(Ciobănesc Mioritic). Între rasa Ciobănesc Carpatin şi rasele Ciobănesc Corb şi Ciobănesc
Mioritic, valorile estimate ale distanţei genetice au fost de 0,137, respectiv 0,218. Distanţa
genetică dintre Ciobănescul Corb şi Ciobănescul Mioritic a fost egală cu 0,147. Valorile
obţinute nu sunt semnificative din punct de vedere statistic (p ^0,05).
Cercetările efectuate de alţi autori au prezentat valori aemănătoare pentru diferite rase
de câini luate în studiu. Zajc şi colab. (1999), într-un studiu realizat pe trei rase de ogari,
Labrador şi Ciobănesc German, au obţinut valori ale DA cuprinse între 0,253 şi 0,395. Kim şi
colab. (2001), în studiul realizat pe 11 rase de câini asiatici, a obţinut valori cuprinse între
0,107 şi 0,323.
26
Figura 17. Graficul distanţelor genetice la nivel intra şi interpopulaţional pentru cele patru
rase de ciobăneşti româneşti. Distanţa Nei brută (Ds) este colorată cu verde, iar distanţa Nei
netă (DA) este colorată în albastru. Culoarea portocalie este corespunzătoare distanţei genetice
din interiorul populaţiilor (numărul mediu de diferenţe „pairwise” dintre secvenţele de
ADNmt de la fiecare rasă).
27
Tabel 5
Matricea distanţelor genetice. Distanţa Nei netă (DA) este sub diagonală, distanţa
genetică din interiorul populaţiilor este pe diagonală, iar distanţa genetică Nei brută (DS) este
deasupra diagonalei
Ciobănesc de
Bucovina
Ciobănesc
Carpatin
Ciobănesc Corb
Ciobănesc
Mioritic
Ciobănesc de
Bucovina
0,472
0,950
0,990
0,933
Ciobănesc
Carpatin
0,350
0,727
0,945
1,000
Ciobănesc
Corb
0,310
0,137
0,888
1,000
Ciobănesc Mioritic
0,279
0,218
0,147
0,836
Distanţa genetică estimată în interiorul populaţiilor a atins valori cuprinse între 0,472
(Ciobănesc de Bucovina) şi 0,888 (Ciobănesc Corb). Pentru populaţiile de Ciobănesc Carpatin
şi Ciobănesc Mioritic valorile au fost de 0,727, respectiv 0,836.
Distanţa Nei (DA) a atins cea mai mare valoare (0,350) între populaţiile de Ciobănesc
de Bucovina şi Ciobănesc Carpatin. Valorile DA estimate între rasa Ciobănesc de Bucovina şi
celelalte două rase de ciobăneşti româneşti au fost: 0,310 (Ciobănesc Corb) şi 0,279
(Ciobănesc Mioritic). Între rasa Ciobănesc Carpatin şi rasele Ciobănesc Corb şi Ciobănesc
Mioritic, valorile estimate ale distanţei genetice au fost de 0,137, respectiv 0,218. Distanţa
genetică dintre Ciobănescul Corb şi Ciobănescul Mioritic a fost egală cu 0,147. Valorile
obţinute nu sunt semnificative din punct de vedere statistic (p >0,05).
Cercetările efectuate de alţi autori au prezentat valori asemănătoare pentru diferite rase
de câini luate în studiu. Zajc şi colab. (1999), într-un studiu realizat pe trei rase de ogari,
Labrador şi Ciobănesc German, au obţinut valori ale DA cuprinse între 0,253 şi 0,395. Kim şi
colab. (2001), în studiul realizat pe 11 rase de câini asiatici a obţinut valori cuprinse între
0,107 şi 0,323.
28
5.10 ANALIZA DE VARIANŢĂ MOLECULARĂ (AMOVA)
Tabel 6
Rezultatele analizei de varianţă moleculară (AMOVA)
Sursa de variaţie
Grade de
libertate
Suma pătratelor
abaterilor
Mediile aşteptate
ale pătratelor
Procentul de
variaţie
Dintre populaţii
3
4,981
0.12069
24.92
Din interiorul
populaţiilor
40
14.182
0.36364
75.08
Total
43
19.163
0.48432
Pentru analiza de varianţă moleculară s-au luat în considerare 400 de loci polimorfici.
Analiza s-a realizat pe baza numărului de mutaţii dintre haplotipurile moleculare. Cele patru
populaţii de ciobăneşti româneşti au fost considerate ca fiind un singur grup. Analiza de
varianţă moleculară ne arată că 24,92% din totalul variaţiei moleculare este datorată
diversităţii inter-rasiale, iar restul de 75,08% se datorează diversităţii intra-rasiale (tabel 6).
Rezultate asemănătoare au fost obţinute şi de către alţi autori. Van Asch şi colab.
(2005) au obţinut în urma analizei AMOVA, pentru cele patru rase de câini portughezi luaţi în
studiu, un procent de variaţie inter-rasială de 32.80%, în timp ce variaţia intra-rasială a fost de
67,30%. Gökçek C. (2005) în cercetarea efectuată asupra raselor de câini ciobăneşti turceşti
Kangal şi Akbash a obţinut un procent de variaţie inter-rasială de aproximativ 17%, iar cel
pentru variaţia intra-rasială a fost de aproximativ 83%. Pires şi colab (2006) au efectuat
analiza AMOVA pe un eşantion de probe aparţinând la 8 rase de câini portughezi autohtoni,
obţinând un procent de aproximativ 20% pentru variaţia inter-rasială.
29
5.11 ARBORI FILOGENETICI
Arborii filogenetici construiţi pe baza analizei BLAST sunt arbori de referinţă. Aceşti
arbori prezintă asocierile filogenetice pe baza scorurilor obţinute la alinierea BLAST a
secvenţelor nucelotidice. Deoarece la întocmirea arborilor s-a utilizat doar câte o secvenţă
nucleotidică pentru fiecare rasă, aceşti arbori nu sunt decât orientativi în ceea ce priveşte
relaţiile filogenetice ale ciobăneştilor româneşti.
Dendrogramele din figurile 39, 40 şi 41 arată că secvenţele de ADNmt de la cele patru
rase de ciobăneşti româneşti s-au grupat în clustere, în funcţie de rasa din care fac parte
indivizii secvenţiaţi. Pentru fiecare rasă s-a format câte un cluster, ceea ce denotă o puternică
diversitate genetică între cele patru rase. Din gruparea apropiată a cladelor corespunzătoare
raselor Ciobănesc Carpatin şi Ciobănesc Corb se poate observa că secvenţele de ADNmt de la
aceste rase prezintă un grad mai scăzut de divergenţă între ele comparativ cu cele de la
celelalte două rase de ciobăneşti româneşti.
Secvenţele de la rasa Ciobănesc de Bucovina prezintă cel mai mic grad de diversitate
moleculară, astfel că din cele 11 secvenţe analizate, 8 sunt grupate sub formă de cluster
datorită diferenţelor nucleotidice foarte mici dintre secvenţe. Restul de trei secvenţe (CB13,
CB18 şi CB24) au prezentat o divergenţă nucleotidică mai mare faţă de restul şi s-au aranjat
separat de cluster.
La rasa Ciobănesc Mioritic, datorită diversităţii moleculare foarte mari, unele din
secvenţele nucelotidice (CM1, CM4 şi CM8) s-au grupat separat de clusterul rasei, fără a se
grupa însă împreună cu secvenţele de la celalte rase de ciobăneşti.
30
Fig. 18. Arbore filogenetic obţinut prin metoda „maximum likelihood” a secvenţelor
nucleotidice de la cele patru rase de ciobăneşti româneşti. Modelul de substituţie nucleotidică
utilizat este modelul Kimura cu 2 parametrii. Prescurtări: CB - Ciobănesc de Bucovina, CC -
Ciobănesc Carpatin, CO – Ciobănesc Corb, CM-Ciobănesc Mioritic
31
Figura 19. Arbore filogenetic fără rădăcină obţinut prin metoda UPGMA a secvenţelor
nucleotidice de la cele patru rase de ciobăneşti româneşti. Modelul de substituţie nucleotidică
utilizat este modelul Kimura cu 2 parametrii. Prescurtări: CB- Ciobănesc de Bucovina, CC -
Ciobănesc Carpatin, CO – Ciobănesc Corb, CM-Ciobănesc Mioritic
32
Figura 20. Arbore filogenetic al secvenţelor nucleotidice de la rasele de ciobăneşti
româneşti şi secvenţe nucleotidice de lupi. Dendrograma a fost construită după metoda
„neighbor joining”, pe baza modelului de substituţie Tamura – Nei. Prescurtări: CB-
Ciobănesc de Bucovina, CC - Ciobănesc Carpatin, CO – Ciobănesc Corb, CM-Ciobănesc
Mioritic; secvenţele de lupi sunt notate cu W
Arborele filogenetic al celor patru rase de ciobăneşti româneşti împreună cu secvenţele
de ADNmt de la lupi indică o mai mare apropiere genetică între rasa Ciobănesc Carpatin şi
lupul sălbatic. Secvenţele nucleotidice de la indivizi din rasele Ciobănesc de Bucovina,
33
Ciobănesc Corb şi Ciobănesc Mioritic prezintă o divergenţă nucleotidică mult mai mare faţă
de secvenţele lupilor decât cele de la indivizii Ciobăneşti Carpatini.
Figura 21. Arbore filogenetic de tip „neighbor-joining” rezultat în urma alinierii BLAST între
secvenţa nucleotidică a unui individ Ciobănesc de Bucovina şi secvenţele nucleotidice a altor
rase de talie mare
Figura 21 prezintă filogenia dintre secvenţa de ADNmt a unui Ciobănesc de
Bucovina şi secvenţele altor rase de câini de talie mare. Arborele a fost construit pe
baza secvenţelor nucleotidice existente în baza de date Genbank. Se poate observa că
cele mai apropiate rase, pe baza secvenţelor de ADNmt, cu rasa Ciobănesc de
Bucovina sunt rasele: Terra Nova, Mastiff Tibetan, urmate la o mai mare distanţă
genetică de rasele Bobtail, Ciobănesc German şi Ciobănesc Australian.
34
Figura 22. Arbore filogenetic de tip „neighbor-joining” rezultat în urma alinierii BLAST între
secvenţa nucleotidică a unui individ Ciobănesc Carpatin şi secvenţele nucleotidice a altor rase
de talie mare
Secvenţa nucleotidică de la individul de Ciobănesc Carpatin (fig. 22) prezintă o
divergenţă nucleotidică mai mare faţă de rasele analizate decât cea a individului din rasa
Ciobănesc de Bucovina, ceea ce face ca lungimea ramurii corespunzătoare acestei secvenţe să
fie mai lungă comparativ cu cea de la Ciobănescul de Bucovina. Cele mai asemănătoare rase,
din punct de vedere al secvenţelor de ADNmt analizate, cu rasa Ciobănesc Carpatin sunt
rasele: Mastiff Tibetan, Saint Bernard, Dog German şi Schnauzer.
35
Figura 23. Arbore filogenetic de tip „neighbor-joining” rezultat în urma alinierii BLAST între
secvenţa nucleotidică a unui individ Ciobănesc Mioritic şi secvenţele nucleotidice a altor rase
de talie mare
Arborele filogenetic rezultat între secvenţa de la un individ Ciobănesc Mioritic şi alte
secvenţe din baza de date Genbank ne arată o mai mare apropiere genetică (la nivel de
ADNmt) între această rasă şi rasele Walker Hound, Ciobănesc de Shetland şi Saint Bernard.
36
Figura 24. Arbore filogenetic de tip „neighbor-joining” rezultat în urma alinierii BLAST între
secvenţa nucleotidică a unui individ Ciobănesc Corb şi secvenţele nucleotidice a altor rase de
talie mare
Organizarea ramificaţiilor arborelui din figura 24 indică o distanţă genetică mare între
secvenţa de ADNmt a Ciobănescului Corb şi celelalte secvenţe. Cea mai asemănătoare
secvenţă aparţine unui individ din rasa Ciobănesc Australian, urmată de secvenţele de ADNmt
de la rasele Rottweiler, English Sheepdog şi Bobtail. La nivel fenotipic rasa Ciobănesc
Corb se aseamănă cu rasa Terra Nova, însă analiza BLAST ne arată că la nivel de
ADN mitocondrial aceste rase sunt diferite.
37
Fig 25. Arbore realizat prim metoda UPGMA rezultat în urma alinierii multiple ClustalW2
între secvenţele ciobăneştilor româneşti şi cele altor rase de câini. Modelul de substituţie a
nucleotidelor este modelul Kimura cu 2 parametrii
Deoarece ramurile arborelui din figura 25 corespunzătoare raselor Ciobănesc Mioritic
şi Ciobănesc Carpatin prezintă mai puţine noduri interne (puncte de divergenţă) şi au o
lungime mult mai mare, indică faptul că aceste rase şi-au păstrat caracterul ancestral, fapt ce
poate confirma istoricul de sute de ani al acestor rase. Secvenţa nucleotidică de la rasa
Ciobănesc Mioritic este cea mai apropiată de nodul ancestral (rădăcina arborelui), adică
prezintă cea mai mare asemănare genetică cu ancestorul ipotetic al raselor de câini din arbore.
Lungimea mare a ramurii corespunzătoare Ciobănescului Mioritic este datorată numărului
mare de substituţii nucleotidice dintre secvenţa corespunzătoare rasei şi restul secvenţelor.
Deasemenea, această distanţă este faţă de ancestorul ipotetic comun indică faptul că această
rasă şi-a păstrat caracterul ancestral, însă a evoluat la rândul său prin selecţie artificială
asemeni celorlalte rase de câini. Numărului mare de puncte de divergenţă şi distanţa genetică
mică dintre rasa Ciobănesc de Bucovina şi celelalte rase din dendrogramă arată că această
rasă este cea mai evoluată dintre rasele de Ciobăneşti Romăneşti.
38
CAPITOLUL VI. CONCLUZII
Analiza haplotipurilor observate la cele patru rase de ciobăneşti româneşti arată
că există o diversitate mare a haplotipurilor la rasele Ciobănesc Corb, Ciobănesc
Carpatin şi Ciobănesc Mioritic. La fiecare din cele trei populaţii s-a observat un număr
de şase haplotipuri. La rasa Ciobănesc de Bucovina s-au identificat doar trei
haplotipuri, dintre care haplotipul 1 a fost prezent la 8 din cei 11 indivizi analizaţi.
Haplotipul 3 a fost identificat la rasele Bucovina, Carpatin şi Corb, însă acest
haplotip pare să fie specific rasei Ciobănesc Carpatin deoarece 6 din cei 11 indivizi
prezintă acest haplotip. La rasele Bucovina şi Corb haplotipul 1 a fost identificat la
câte un individ din fiecare rasă.
Indicii de diversitate moleculară au atins cele mai mari valori la rasa Ciobănesc
Mioritic, urmată de rasa Ciobănesc Corb. Cea mai mică diversitate a fost raportată la
populaţia de Ciobănesc de Bucovina, această rasă fiind şi mai restricţionată geografic
comparativ cu celelalte rase româneşti.
Valorile distanţei genetice calculate pe baza indicelui de fixaţie arată că există
o diferenţiere genetică foarte mare între rasa Ciobănesc de Bucovina şi celelalte trei
rase de ciobăneşti româneşti, deoarece valoarea indicelui de fixaţie FST a fost mai mare
de 0,25 pentru fiecare din cele trei valori estimate. Între rasa Ciobănesc Carpatin şi
rasa Ciobănesc Mioritic există o diferenţiere genetică mare, valoarea FST fiind mai
mare de 0,15. Între rasa Ciobănesc Carpatin şi rasa Ciobănesc Corb există o
diferenţiere genetică moderată, valoarea indicelui FST fiind mai mică de 0,15. Aceeaşi
situaţie apare şi la distanţa dintre Ciobănescul Corb şi Ciobănescul Mioritic, la care
valoarea FST nu depăşeşte pragul de 0,15 (Hartl şi Clark, 1997).
Valorile distanţelor genetice ale lui Nei indică acelaşi nivel de diferenţiere
observat la calculul indicelui de fixaţie şi susţin rezultatele obţinute cu privire la
distanţa genetică dintre cele patru rase de ciobăneşti româneşti.
Atât indicii diversităţii moleculare, cât şi estimatele distanţelor genetice au
prezentat valori în concordanţă cu cele din literatura de specialitate pentru diferite rase
de câini.
39
Gruparea secvenţelor nucleotidice în clustere la fiecare rasă de ciobăneşti
româneşti, aşa cum se poate observa din analiza filogenetică, arată o diferenţiere
puternică între cele patru rase.
Între cele patru rase de câini ciobăneşti româneşti a existat (înaintea începerii
selecţiei în rasă curată) un schimb de gene, fapt observat la alinierea secvenţelor
nucleotidice (anumite mutaţii punctiforme sunt comune între rase), şi deasemenea din
aranjarea unora din secvenţele de la o rasă de ciobăneşti româneşti în cadrul clusterului
altei rase.
Analizele filogenetice şi distanţele genetice foarte mari (distanţa Nei şi indicele
de fixaţie) ne arată că avem de-a face cu patru rase de câini distincte, care prezintă
caracteristici fenotipice şi genetice specifice.
Caracteristicile la nivel molecular, distanţele filogenetice şi aspectul fenotipic al
câinilor ciobăneşti româneşti analizaţi în acest studiu ne arată că cele patru rase de
ciobăneşti româneşti prezintă diferenţe mai mult decât suficiente pentru a putea fi
considerate rase distincte.
40
Bibliografie selectivă
1. BRUFORD M.W., 2006. Mitochondrial DNA Sequence Variation in Portuguese Native
Dog Breeds: Diversity and Phylogenetic Affinities. Journal of Heredity
2006:97(4):318–330 doi:10.1093/jhered/esl006
2. BUD I. şi colab. 1998. Mic tratat de chinologie. Ed. Promedia Plus Cluj-Napoca.
3. ÇIGDEM GÖKÇEK, 2005. Mitochondrial dna (mtdna) sequence analyses of kangal
Dogs in turkey. Teză de dizertaţie.
4. COŞIER V., 2008. Inginerie genetică. Ed. Risoprint. Cluj-Napoca
5. EXCOFFIER, L. AND H.E. L. LISCHER, 2010. Arlequin suite ver 3.5: A new series of
programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows.
Molecular Ecology Resources. 10: 564-567.
6. IRION D.N, SCHAFFER A., FAMULA T., EGGLESTON M., HUGHES S., PEDERSEN N.
2003. Analysis of genetic variation in 28 dog breed populations with 100
microsatellite markers, in: Journal of Hereditary 94(1), 81-87
7. IVANOV S.V., POTAPOV V.A., FILIPENKO E.A., ROMASHCHENKO A.G. 1991.
Heterogeneity of the Canidae Bsp-repeats family: discovery of the EcoRI subfamily.
Genetika;27: 973–982.
8. KOSKINEN M. T., BREDBACKA P. Assessment of the population structure of five
Finnish dog breeds with microsatellites. Animal Genetics, 2000, 31, 310–317
9. LANDER, E.S., LINTON, L.M., BIRREN, B., NUSBAUM, C., ZODY, M.C., LINDBLAD-
TOH, K., WADE, C.M., MIKKELSEN, T.S., KARLSSON, E.K., JAFFE, D.B., KAMAL, M.,
CLAMP, M., CHANG, J.L., KULBOKAS III, E.J., ZODY, M.C., et al. 2001. Initial
sequencing and analysis of the human genome. Nature; 409:860–921.
10. LIBRADO, P. AND ROZAS, J. 2009. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis
of DNA polymorphism data. Bioinformatics25: 1451-1452 | doi:
10.1093/bioinformatics/btp187.
11. LINDBLAD-TOH, K., WADE, C.M., MIKKELSEN, T.S., KARLSSON, E.K., JAFFE, D.B.,
KAMAL, M., CLAMP, M., CHANG, J.L., KULBOKAS III, E.J., ZODY, M.C., et al. 2005.
Genome sequence, comparative analysis and haplotype structure of the domestic
dog. Nature
41
12. NEI M., 1972. ”Genetic Distance between Populations,” In The American Naturalist,
Vol. 106, pp. 283-292, 1972.
13. OLSEN, J. (2000): Genetisk variation hos bedlingtonterrier i Danmark, Veterinary
Master Thesis, Department of Animal Genetics, Royal Veterinary and Agricultural
University, Copenhagen, Denmark
14. OSTRANDER E.A., COMSTOCK K.E. 2004. The domestic dog genome. CurrBiol
14:R98–9.
15. PIRES E.A., OURAGH L., KALBOUSSI M., MATOS J., PETRUCCI-FONSECA F.,BRUFORD
M.W. 2006. Mitochondrial DNA Sequence Variation in Portuguese Native Dog
Breeds: Diversity and Phylogenetic Affinities. Journal of Heredity 2006:97(4):318–
330 doi:10.1093/jhered/esl006
16. POTAPOV V.A.. SOLOV’EV V.V. ROMASHCHENKO A.G., SOSNOVTSEV S.V., IVANOV
S.V. Features of the structure and evolution of complex, tandemly organized Bsp-
repeats in the fox genome. I. Structure and internal organization of theBamHI-dimer.
MolBiol (Mosk) 1990;24:1649–1665.
17. PROSCHOWSKY H., OLSEN J.B., JEPSEN B., FREDHOLM M. (2002). Evaluation of the
present breeding programme against copper toxicosis in Danish Bedlington terriers.
in Animal Genetics 34, 142-145
18. RYONG NAM KIM, DAE-SOO KIM, SANG-HAENG CHOI, BYOUNG-HA YOON, ARAM
KANG, SEONG-HYEUK NAM, DONG-WOOK KIM, JONG-JOO KIM, JI-HONG HA,
ATSUSHI TOYODA, ASAO FUJIYAMA, AERI KIM, MIN-YOUNG KIM, KUN-HYANG
PARK, KANG SEON LEE AND HONG-SEOG PARK. 2012. Genome Analysis of the
Domestic Dog (Korean Jindo) by Massively Parallel Sequencing. DNA Res (2012) 19
(3): 275-288. doi: 10.1093/dnares/dss011 First published online: April 3, 2012
19. VLAIC A., 1997. Inginerie genetică. Realizări, speranţe şi nelinişti. Ed. Promedia Plus,
Cluj Napoca.
20. ZAJC I. & SAMPSON J. (1999). Utility of canine microsatellites in revealing the
relationships of pure bred dogs, in The American Genetic Association 90, 104-107
21. ZAJC I., MELLERSH C.S., SAMPSON J. Variability of canine microsatellites within and
between different dog breeds. Mamm Genome 1997;8:182–185.