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制御性RNAとDDSの一体開発による 抗インフルエンザ予防・治療薬
立命館大学 薬学部 薬学科
教授 木村 富紀
立命館大学 新技術説明会 10
RITSUMEIKAN
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遺伝子の発現を制御する技術
• 核酸を用いた従来法とその問題点: リボザイム法、RNA干渉法、アンチセンスDNAオリゴヌクレオチド法、デコイ核酸法並びにRNAアプタマー法がある。
RITSUMEIKAN
これらの方法は、発現の抑制(低下) のみを可能にする。
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新技術の特徴
• 内因性のアンチセンスRNAを用いるわれわれの制御方法は、特定の遺伝子の発現をseODN (mRNA上の標的配列)により抑制できるだけでなく、asORN(アンチセンスRNA機能ドメイン配列)の使用によりその発現の増強を可能にする(NATRE technology)。
RITSUMEIKAN
• これまで不可能であった双方向性の遺伝子の 発現制御が可能となる点で独創的であり、 従来法にない新規性並びに優位性を有する。
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Transcripts
Rest
Protein-‐coding genes
Rest
ヒトゲノム(ca 3 Gb) 3% (20,687 遺伝子)
Human genome "sequencing "consortium, ʻ03
ヒトトランスクリプトーム
90%<
ENCODE project "Consortium (2012)
(制御性, 非コードRNA)
ゲノムからの転写産物の大部分はタンパク質をコードしない非コードRNAである
Protein-coding genesRest
TranscriptsRest
RITSUMEIKAN
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新技術を応用した新規抗ウイルス薬の開発
• 選択毒性に左右されない標的分子の設定。
• 宿主防御免疫応答の利用。
• 防御免疫応答エフェクター発現の人為的な調節。 • 生理的な範囲における発現の早期化と増大。
副作用が少ない汎抗ウイルス薬の開発
RITSUMEIKAN 6
CSS
An 3ʼ
IFN-α1 mRNA
SL1" SL2"
229"
305"
308"
434"SL1"
SL2"322"
352"
487 487 452"208"
68"
AUG BSL
1 637 876
AREsUAA
5ʼ
IFN-!1
mRNA
IFN-!1
mRNA/!SLI
IFN-!1
mRNA/!SLII
IFN-!1
mRNA/!bulge
A
B
C
D
Nuclear export of IFN-α1 mRNA
IFN-α1 mRNA
IFN-α1 mRNA ΔSL1
IFN-α1 mRNA ΔSL2
IFN-α1 mRNA ΔBSL
Kimura et al., J.Cell Sci., 2004 Kimura et al., Med.Mol.Morp.,2010 Matsui, Kimura et al., Hepatology, 2008
何故インターフェロン-α1 (IFNA1)遺伝子に着目したか
BSL!
28S
18S
- + + + - + + +SeV"
Infection
IFN-α1 !AS"
RNAIFN-α1 !mRNA
IFNA1 �CDS5ʼ 3ʼ
5’ 3’Probe (200 nt x 4)
Northern-blot analysis
ヒトInterferon-α1 antisense RNA (IFN-α1 AS)の同定
SL1"SL2"
BSL1 876/ 0 -242
100 nt
IFNA1
Genomic location of IFN-α1 !AS exons
Nc1"
S1"
S3"
S4"
Nc2"
RITSUMEIKAN8
AAA
IFN-α1 AS
IFN-α1 mRNA
Sense ODN
RNase HによるIFN-α1 AS発現の抑制
RT-minus
IFN-α1 AS
S1 Nc1 Nc2
18S rRNA
Time after transfection
S2 S3 S4hr"
S2"
センスオリゴヌクレオチド (seODNs) によるIFN-α1 AS発現の抑制
T1/2 of IFN-α1 mRNA (
IFN-α1 AS の過剰発現が同mRNA の発現に及ぼす効果
RITSUMEIKAN10
T1/2 of IFN-α1 mRNA (290% ) IFN-α1 mRNA 発現レベルの増大
IFN-α1 AS
0 1 3 6 12 24 0 1 3 6 12 24
Control AS over-expression Time after inf.
1 2 3 4 5 0
IFN
-α1
mR
NA
(fol
d)
Actinomycin D treatment (hr)
Control/ mRNA Over-expression(+)/ mRNA
8.1 hr
2.8 hr
CMV pro
ATG
876
IFNA1
Over-expression(+)/ 18S Control/ 18S
1.4
0
1.2
0.6
0.4
0.2
1.0
0.8
0 1 2 3 4
DSR
3'UTRR
5'UTRR
IFN-a1 AS
Cont
1" 2" 3" 4"0"
RITSUMEIKAN11
Overexpression of truncated IFN-α1 AS mutants
Cont"
ED7R"
CSS+R"
SL2R"
CSSR"
Relative IFN-α1 mRNA "expression (fold)"
AREs
AUG
UAA
BSL
CSS
SL2
5ʼ"3ʼ"1" 2" 3" 4"0"
3ʼUTRR"
DSR"
Relative IFN-α1 mRNA "expression (fold)"
DS
DS
Cont
IFN-α1 "AS
5ʼUTRR
IFN-α1 AS BSLR ドメインが IFN-α1 mRNA の安定性制御のための中心領域である
BSLR!
mRNAR"
mRNAを安定化するIFN-α1 AS機能ドメインの決定
RITSUMEIKAN12
IFN-α1 mRNA
asORN (corresponding to BSLR)
AAA
Time after SeV infectin (hr)
IFN-α1 AS IFN-α1 mRNA
208"
229"
322"
352"asORN
ncORN"
IFN
-α1
mR
NA
(fold
)
0
40
10
30
20
5 10 15 20 25 0
asORN ncORN
mock
2.3 fold increase
0
5
15
10
5 10 15 20 25 0
IFN
-α1
AS
(fol
d)
25塩基長のBSLR塩基配列からなるアンチセンスリボオリゴヌクレオチド (asORN)は全長のAS RNA と同程度にIFN-α1 mRNAの発現量を増加する
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想定される用途
• 現行INF製剤では適応がなく、又抗ウイルス薬が 存在しない呼吸器ウィルス感染症の治療:
1.コロナウイルス、パラインフルエンザウイルスやRSV による乳幼児冬期感冒
2.ライノウイルスやコロナウイルス等による風邪症候群等 3.抗ノイラミニダーゼ阻害薬抵抗性のインフルエンザ
ウイルスによるインフルエンザ
• IFN-αの過剰産生に起因する自己免疫疾患(SLE、 皮膚筋炎等)
【アンチセンスリボオリゴヌクレオチド】
【センスリボオリゴヌクレオチド】
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ここ迄の発表に関わる知的財産権
• 発明の名称 :インターフェロン-αモジュレーター• 出願番号 :特願2011-536201 • 出願人 :学校法人立命館、 学校法人関西医科大学、 株式会社アミノアップ化学 • 発明者 :木村 富紀、西澤 幹雄、蒋 時文、
西川 正雄 発表論文: Kimura et al., CMLS 70 (8):1451-67, 2013)
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この発明は、ヒトIFN-α1 ASを用いて。ヒト細胞で証明。
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実用化に向けた課題
• POC実験:asORN効果の生体内における検証
• インフルエンザウイルス感染動物モデルの構築
• DDSの開発
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RITSUMEIKAN16
モルモット マウス
• Balb/c やC57BL/6等のマウスはIFN-α
刺激応答遺伝子の主体となるMx1遺伝子が 変異している。IFN応答を解析できない。・インフルエンザウイルスに感染すると死ぬ。
• 機能性のMx1遺伝子を持つので、IFN-αによる
刺激応答、抗ウイルス効果を生体レベルで検討 できる。
• インフルエンザに罹患しても死亡せず、感染を 水平伝播するため、実験結果をヒトに外挿可能 である。
モルモット感染モデルの採用
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モルモット感染モデル:IFN-α1遺伝子の特定
RITSUMEIKAN
• モルモットIFNA1遺伝子候補の選択 • 候補遺伝子が示す抗ウイルス効果の検証 • モルモットIFNA1遺伝子の決定(DDBJ/ EMBL/
GenBank accession number, AB671739)
RITSUMEIKANRITSUMEIKAN 18
モルモットIFN-α1 mRNA共通二次構造の選択
• mfoldを用いたモルモットIFN-α1 mRNAの二次構造予測
• 自由エネルギー(ΔG)の低い10の予測二次構造中に最大の保存度が見られた構造(○)の選択。
RITSUMEIKANRITSUMEIKAN 19
モルモットセンスオリゴヌクレオチド (seODN)の決定
• mRNA共通二次構造から一本鎖領域を選択• AS RNAの標的候補とし、その塩基配列を持つセンスオリゴ(S2-S5)を作製
seODNによるモルモットIFN-‐α1 AS RNA発現抑制実験
AAA
IFN-α1 AS
IFN-α1 mRNA
seODN
RNase HによるIFN-α1 AS発現の抑制
RITSUMEIKAN 20
• S4はヒトと同じく、IFN-α1 AS RNA発現を最大値に到達後、低下させた
• S3は、IFN-α1 AS RNA、mRNAを共に経時的に増加させた
モルモットアンチセンスリボオリゴ (asORN)の作製
RITSUMEIKAN 21
• IFN-α1 AS RNAに対し異なる作用を示すseODNを得たので、これに対応するasORNを作製し、mRNA発現への影響を検討した。
モルモットasORN過剰発現実験
RITSUMEIKAN 22
• asORN4はAS RNAに影響することなく、gpIFN-α1 mRNAの発現を増加させた • asORN3はgpIFN-α1 AS RNAを増大させることにより、同mRNAを増加させた
DDSの開発
RITSUMEIKAN 24
ホソカワミクロン株式会社開発DDSナノ粒子へのasORN3封入至適条件の検討
• ヒトA 型インフルエンザウイルスを感染させたモルモット胎児線維芽細胞において、対照として用いた市販の遺伝子導入試薬(MATra; IBA GmbH)を上回るIFN-α1 mRNAを発現誘導する、asORN3量、PLGAナノ粒子作製条件、asORNの封入条件を至適化した。
POC実験:asORN効果の生体内における検証
ヒトインフルエンザウイルス感染モルモット気道においてasORN3が示す抗ウイルス効果
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• ヒトA型インフルエンザウイルスを感染させたモルモットにおいて、投与量に依存して、IFN-α1 mRNA発現量の増大とウイルス力価の低下を観察した。
asORN3投与はモルモット直腸温度その他の副作用指標に影響を示さない
RITSUMEIKAN 27
• ヒトIFN-αタンパク質投与に伴い観察される発熱、自己免疫疾患様 症候の出現の有無を検討したところ、asORN3の投与により、直腸温度、 体重、脾臓重量に変化は認めなかった。
産学連携の経歴
• 2007~2011年 JST A-‐STEPフィージビリティ スタディ、シーズ発掘事業に採択(3回)
• 2013~2014年 JSTシーズ顕在化タイプ事業に採択 課題名:制御性RNAに由来する核酸医薬シー ズとDDSの一体開発による抗インフルエンザ予 防・治療薬の創出(ホソカワミクロン株式会社と の共同研究)
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企業への期待
• POCを終了した本創薬シーズを前臨床試験により検証するべく、JST A-STEP ステージII 産学共同促進ステージ ハイリスク挑戦タイプに共同申請する企業を求めます。
• 自然免疫調節性核酸医薬の前臨床開発を行うのみならず、任意の標的遺伝子の発現制御を可能にする塩基配列の探索・提供が可能です。
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前臨床試験
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本技術に関する知的財産権
• 発明の名称:呼吸器ウイルス感染症の予防・治療剤• 出願番号: 準備中 • 出願人: 学校法人立命館、 ホソカワミクロン株式会社 • 発明者: 木村 富紀、辻本 広行、塚田 雄亮
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お問い合わせ先
立命館大学研究部 リサーチオフィス (BKC)
産学官連携コーディネーター 押柄 和幸
TEL: 077-561-2802
FAX: 077-561-2811
e-mail:coor-024@st.ritsumei.ac.jp
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