Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
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2014
Natalia A. Monje Pinilla
Claudia Elizabeth Llanos
Control de Calidad en la
producción de Bioetanol a
partir de material
lignocelulósico
Prof: Dra.Mabel Sánchez
Natalia A. Monje Pinilla
Claudia Elizabeth Llanos
Seminario de Procesos
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
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Universidad Nacional del Sur
Seminario de Procesos
Profesor: Dra. Mabel Sánchez
Alumnas:
Natalia Andrea Monje Pinilla
Llanos Claudia Elizabeth
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
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Índice general
Introducción 4 1. Característica de la Materia Prima 6 Características generales del bagazo de la caña de azúcar 1.1 Composición Física 7 1.2 Composición Morfológica 8 1.3 Composición Química 8 1.4 Celulosa 10 1.5 Hemicelulosa 11 1.6 Lignina 12 1.7 Aspectos Generales del Etanol 13 1.8 Bioetanol en Argentina 15 2. Proceso Productivo 16 Descripción del Proceso Productivo 2.1 Etapas del proceso 17 2.2 Pretratamiento 19 2.3 Pre hidrólisis 19 2.3.1 Ácidos orgánicos 20
2.3.2 Compuestos fenólicos 21
2.3.3 Compuestos furanos 21
2.4 Detoxificación 21
2.5 Hidrólisis enzimática 22
2.6 Fermentación 25 2.7 Destilación y Deshidratación del producto 27 3. Control de calidad 28 CONTROL DE CALIDAD EN LA PRODUCCIÓN DEL BIOETANOL A PARTIR DE BAGAZO 3.1 Calidad 29 3.2 Puntos Críticos de Control (PCC) 29 3.3 Identificación de puntos de Control 30 3.4 Variables de procesos involucradas en PCC 33 3.4.1 Punto Crítico 1: Materia Prima 33 3.4.1.1 Celulosa 33 3.4.1.2 Hemicelulosa 34 3.4.1.3 Lignina 35 3.4.1.4 Tamaño de partícula 35 3.4.2 Punto Crítico 2: Pre hidrólisis 36 3.4.3 Punto Crítico 3 : Fermentación 37 3.5 Determinaciones Analíticas 38 3.5.1 Mediciones en línea 38 3.5.2 Cuadro de clasificación de mediciones directa (en línea) e indirecta (laboratorio) 38 3.5.3 Caracterización de la materia prima 40 3.5.4 Caracterización del material pretratado. 40 3.5.5 Caracterización en la pre hidrólisis 40 3.5.6 Determinaciones a realizar en el detoxificador 41 3.5.7 Determinaciones en la Hidrolisis enzimática 41 3.5.8 Determinaciones en Fermentador 41 3.5.9 Caracterización del producto final 41 4. Conclusión 43 5 .Bibliografía 44 ANEXOS 47
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Anexo I 48 Anexo II 67
LISTA DE ANEXOS ANEXO I Determinaciones Analíticas
1.DETERMINACIÓN FÍSICO-QUÍMICA 48
Determinación de extractos 48
Determinación de sólidos totales 48
Determinación de cenizas 49
Determinación de carbohidratos estructurales 49
Determinación del contenido de holocelulosa 51
Determinación de celulosa y hemicelulosa 51
Determinación de cenizas 52 2. DETERMINACIÓN DE TAMAÑO 52 3.DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE MATERIA SECA Y HUMEDAD 53 4. DETERMINACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN 53 5. DETERMINACIÓN DE ART (MÉTODO DNS) (EIO) 54 6. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 54 7. DETERMINACIÓN DE ETANOL 55 8. CONTROL DE LA VIABILIDAD DE LAS ZYMOMONA 55 9. CONTROL DE CALIDAD DEL BIOETANOL 55 1.Importancia de cada propiedad 55
2.Caracterización del alcohol etílico anhidro combustible (AEAC) 57 Anexo II Datos experimentales
1. Descripción de la Metodología del ensayo 68 2. Control de la Fermentación 68 3. Resultados del ensayo 70 4. Conclusiones 70
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Introducción
Los combustibles fósiles son la fuente primaria de energía en el mundo. Sin embargo, factores como
el carácter no renovable de los mismos, el agotamiento previsto de las reservas de hidrocarburos, el
constante aumento del precio del petróleo y la necesidad de preservar el medio ambiente han
impulsado la búsqueda de fuentes de energías alternativas basadas en recursos naturales renovables
y menos contaminantes.
Desde que se produjo la primera crisis del petróleo en 1973, se ha considerado la biomasa como una
fuente de energía alternativa al combustible fósil cuyo uso ha sido fomentado, en algunos países con
mayor éxito (Brasil). A nivel mundial en las últimas décadas se han promovido políticas de
preservación y cuidado del medio ambiente, entre las leyes impulsadas con este fin se encuentra el
corte de combustibles fósiles con un porcentaje entre el 5% y 10% de biocombustibles.
Los biocombustibles se clasificaron como de primera, segunda y tercera generación según la materia
prima que se emplea para su producción, que pueden ser plantaciones de especies comestibles (por
ejemplo: el maíz, la soja o el girasol), especies no comestibles y desechos industriales
respectivamente. En la Unión Europea se ha prohibido la producción de combustibles de primera
generación por desestabilizar el mercado alimentario y los desarrollos se han tornado a la búsqueda
de biocombustibles de tercera generación.
Las biomasas más estudiadas como materia prima para la producción de biocombustibles son la
paja, bagazo de caña de azúcar, RAC y residuos procedentes de las agroindustrias. Algunas ventajas
que presentan, frente al uso de los combustibles fósiles, son su fácil consecución, bajo costo y bajo
impacto ambiental. Ejemplos claros de estas iniciativas son las de los biocombustibles de origen
agrícola como el etanol y el biodiesel provenientes de recursos renovables (propuesta
medioambiental apta) que presentan una oportunidad para el crecimiento económico y social de las
zonas en las cuales su producción es factible.
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En Argentina, la Resolución 56/2012 promulga la importancia que conlleva la inserción de los
biocombustibles al esquema energético nacional, para hacer frente a los desafíos de abastecimiento
de energía en el marco de una economía en crecimiento. Actualmente se encuentran inscriptas 208
empresas elaboradoras de biocombustibles que producen bioetanol o biodiesel (Secretaría de
Energía-Ministerio de Planificación Federal Inversión pública y Servicio) estas empresas cuentan a su
favor con promociones otorgadas por el gobierno y la ley de corte de combustibles, por la cual los
combustibles deben contener un 5% de biocombustibles. Cabe destacar que nuestro país ocupa el
primer lugar en la exportación de biodiesel, el cual proviene en gran parte del aceite de soja.
Uno de los principales biocombustibles líquidos producidos es el etanol, éste se puede producir con
una gran variedad de materias primas y su uso no está limitado en lo absoluto porque se puede usar
de forma pura o en mezclas con combustibles fósiles. La mayor parte del bioetanol se produce a
partir de jugos azucarados o melazas de ingenio azucareros, estos procesos generan efluentes con
elevada carga orgánica y actualmente no se cuenta con un tratamiento adecuado para la remoción
de dicha carga. Es por esto que la producción a partir de materiales lignocelulósico se presenta como
una gran oportunidad para la obtención de etanol.
El bagazo ha sido utilizado históricamente como combustible en la industria azucarera, y aún cuando
su valor calórico es relativamente bajo (1.850 kCal/kg), al ser comparado con otros combustibles
fósiles tradicionales, no hay duda de que constituye un valioso potencial energético, sobre todo, para
aquellos países que no tienen disponibilidades significativas de combustible, y a la vez son grandes
productores de azúcar de caña.
En el pasado los esquemas de producción de azúcar se calculaban energéticamente, de manera tal
que el bagazo sirviera de combustible para la generación de la potencia y el calor necesario en la
industria, con el mínimo o ningún sobrante, es decir con “0” bagazo residual. En la actualidad se
buscan esquemas energéticos y de procesos que aseguren la mayor cantidad de bagazo sobrante
para la producción de derivados y, sobre todo para generar electricidad que se aporta a la red,
sustituyendo fuel-oil y asegurando la venta de créditos de carbono con un material renovable en
cada zafra. En este sentido, se ha demostrado la posibilidad de satisfacer las demandas energéticas
de un central con casi la mitad del bagazo que se genera, por lo que el sobrante puede ser utilizado
como materia prima para otras producciones.
Por otra parte, la existencia cada vez menor de materiales fibrosos para ser empleados como materia
prima en la industria de derivados, y su carácter renovable, han estimulado también en las últimas
décadas un desarrollo acelerado de la utilización del bagazo en producciones de derivados [ICIDCA,
2000] siendo el de mayor interés el bioetanol.
Teniendo en cuenta las consideraciones antes descriptas este trabajo está orientado a establecer un
proceso estándar para la obtención de bioetanol a partir de bagazo de caña de azúcar y determinar
los puntos críticos en el proceso para realizar un control de calidad en la producción.
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1. Características de la materia prima
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CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL BAGAZO DE LA CAÑA DE AZÚCAR
La biomasa lignocelulósica contiene valores medios de 38-50% de celulosa, 23-32% de hemicelulosa
y 15-30% de lignina y otros componentes extraíbles (Sierra y col, 2008). La utilización eficaz de estos
tres componentes es clave en la viabilidad económica del proceso de transformación de celulosa a
etanol (Vishnu Menon y Mala Rao, 2012).
El bagazo es el residuo lignocelulósico fibroso remanente de los tallos de caña, obtenido a la salida
del último molino del tándem azucarero, constituyendo un conjunto heterogéneo de partículas de
diferentes tamaños que oscilan entre 1 y 25 mm, presentando una fracción promedio de
aproximadamente 20 mm y una humedad entorno al 50%.
1.1 Composición Física
Desde el punto de vista físico el bagazo se constituye por fibra, sólidos solubles e insolubles. En la
tabla 1.1 se presenta la composición para el bagazo.
Tabla 1.1 Composición promedio del bagazo de caña de azúcar
Composición Porcentaje
Fibra o bagazo 45
Sólidos insolubles 2-3
Sólidos solubles 2-3
Agua 49-51
Se designa como fibra a la fracción sólida orgánica insoluble en el agua, presente en el tallo de la
caña de azúcar y que se caracteriza por su heterogeneidad desde el punto de vista químico y
morfológico. Esta fracción es la portadora de elementos estructurales que permiten el uso del
bagazo en la industria del papel.
Los sólidos inorgánicos están compuestos fundamentalmente por tierra, piedras y otras materias
extrañas, las características de la cosecha influyen en esta pequeña fracción. Los sólidos solubles
forman la fracción que se disuelve en agua, se compone básicamente de sacarosa y otras sustancias
químicas por lo que depende exclusivamente de la calidad de la materia prima.
El bagazo retiene agua a través de mecanismos de adsorción y capilaridad, este fenómeno
desempeña un papel importante en algunos procesos tecnológicos a los que se somete el bagazo
para su aprovechamiento como materia prima. La humedad del bagazo está en relación directa con
el alto nivel higroscópico de la médula, así como el alto nivel de porosidad en las partículas. De ahí su
gran capacidad de adsorción, entre 70 y 80% de humedad, sin agua libre.
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1.2 Composición Morfológica
En primer lugar encontramos la epidermis, que es la capa fina que recubre todo el tallo y que lo
protege, abundan componentes no fundamentales de la caña de azúcar y que luego se clasifican en
el bagazo como “extractivos”.
Luego sigue la corteza, que se compone fundamentalmente de fibras de alto contenido de lignina.
Sus características principales son su ancha pared celular, longitud y rigidez, propiedades que la
hacen adecuadas para proteger el tallo de los efectos mecánicos y exteriores a la planta.
A continuación, se encuentra el área interior del tallo, compuesto principalmente de tejido
parenquimatoso, cuya función es la de almacenar jugo azucarado. La estructura del bagazo semeja la
forma de un tubo interno, lo que permite un rápido transporte del agua.
Las características, que se describieron anteriormente, favorecen la reacción de hidrólisis química, ya
que la presencia de este tipo de estructuras, facilita la difusión de agentes hidrolizantes.
1.3 Composición Química
El bagazo, al igual que todos los materiales lignocelulósicos, se compone de celulosa, hemicelulosa y
lignina como principales polímeros naturales. La celulosa y hemicelulosa componen la fracción de
carbohidratos del bagazo, la cual se designa como holocelulosa. La lignina se diferencia por ser un
polímero heterogéneo de carácter fenólico con diferentes grupos y enlaces químicos. En la figura 1.1
se observa de forma esquemática, la relación que existe entre estos tres compuestos y en la tabla 1.2
se presenta la composición para diferentes tipos de maderas y se incluyen ciertos residuos de la
industria como el bagazo mismo, la cascarilla de arroz, tallos de maíz, papel periódico entre otros.
Figura 1.1 Representación de la pared celular de los materiales lignocelulósicos.
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La pared celular de las plantas está constituida por dos fases: la fase primaria o fibrilar formada
principalmente por celulosa que es un polisacárido cuyas moléculas son cadenas lineales de glucosa
(unidas por enlaces ß 1-4) que pueden alcanzar 4 µm de longitud. Le sigue la fase amorfa o
secundaria que está compuesta principalmente por las hemicelulosas y en tercer lugar está la
pectina. La pared celular secundaria también contiene lignina, que se une a la hemicelulosa mediante
enlaces de éster. Los diseños formados por las microfibrillas son muy variables. En la pared primaria
las fibrillas están entrelazadas, dispuestas aparentemente al azar (Figura 1.2 a); en la pared
secundaria están dispuestas paralelamente (Figura 1.2 b).
Figura 1.2 Pared celular del bagazo. a) Pared celular primaria y b) Pared celular secundaria
En la pared primaria dominan la matriz amorfa, formada por hemicelulosas y polisacáridos no
celulósicos. La fase fibrilar está reducida al 8-25%. En la pared secundaria domina la fase fibrilar
(celulosa, 60%) y la matriz amorfa está formada por hemicelulosas y lignina (30%), los compuestos
pécticos y las proteínas prácticamente desaparecen.
Las hemicelulosas revisten las fibrillas de celulosa y cristalizan con ella, uniéndolas. Los mucílagos de
la pared celular (por ejemplo del episperma de Linum) son especialmente ricos en polisacáridos no
celulósicos. Los compuestos pécticos están formados por moléculas de ácido péctico unidas entre sí
mediante puentes de Ca++. Las proteínas de la pared son ricas en los aminoácidos serina e
hidroxiprolina, y están ligadas con azúcares como arabinosa, glucosa y galactosa. Se cree que dichas
glucoproteínas actúan como elementos estructurales, porque forman cadenas que pueden ligar
entre sí otros componentes.
La diferencia en el porcentaje de cada polímero entre un material y otro, depende del tipo de
madera al que pertenezca, de la edad de la planta y en menor medida de la variedad de cada
material. El contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina permite seleccionar la materia prima que
resulte más conveniente para cada proceso.
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Tabla 1.2 Composición química de materiales lignocelulósicos
Material Lignocelulósico Composición (%)
Celulosa Hemicelulosa Lignina
Algodón (semillas) 89.0 5.0 0.0
Paja de arroz 32.6 19.2 8.5
Paja de trigo 46.3 27.0 14.2
Tallos de maíz 38.0 26.0 11.0
Bagazo de caña de azúcar 46.6 25.2 20.7
Papel periódico 45-55 25-40 18-30
Residuos de la industria del papel 60-70 10-20 5-10
Con relación a los demás componentes del bagazo, que en conjunto representan el 10%, se
encuentran los compuestos solubles en solventes orgánicos, tales como resinas, ceras, grasas, ácidos
grasos, flaconas y fenoles entre otros. El contenido de cenizas en el bagazo es del orden de 2–3%.
También se encuentran los compuestos solubles en agua como sacarosa y otros azucares.
1.4 Celulosa
La celulosa es la sustancia química más importante y el componente principal de la pared celular
(Fase fibrilar o primaria), es un homopolímero lineal de unidades de anhidro ß - (+) anhidro D-
glucopiranosa con uniones ß- 1- 4 glicosidica. La fibra de la celulosa tiene una estructura muy firme y
poco sensible a la degradación .Se encuentra dentro del grupo de carbohidratos de alto peso
molecular. Es insoluble en agua y en solventes orgánicos. Presenta resistencia apreciable al efecto de
agentes oxidantes, lo cual la diferencia del resto de los componentes químicos de la madera.
Químicamente la celulosa se define como un homopolímero de la D-glucosa. Su peso molecular
promedio está en el intervalo de 150 000 a 300 000. Según la tabla 1.2, la celulosa es el compuesto
con mayor porcentaje en el bagazo, al encontrarse en un intervalo del 38.0 – 49.9% y en general se
considera como el compuesto biológico de naturaleza polimérica más abundante de la naturaleza.
Sin embargo, solo una pequeña proporción de éste material se explota con fines comerciales, debido
a problemas técnicos que derivan de la estructura y características de la celulosa. En la figura 1.3 se
destaca la organización interna de la celulosa, la cual está formada por microfibrillas. La unidad
organizativa más simple es la protofibrilla, que a su vez se agrupan y originan la macrofibrilla.
Las fibras de celulosa presentan características comunes como:
• Las cadenas poliméricas de la celulosa muestran diferentes grados de ordenamiento unas con
respecto a otras.
• La fracción con menor grado de ordenamiento no muestra ninguna regularidad y se conoce como
región amorfa. Esta región presenta mayor facilidad de ataque químico o enzimático.
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• La fracción con mayor grado de ordenamiento se conoce como región cristalina y es muy resistente
a la penetración de solventes, enzimas y reactivos.
Figura 1.3 a) Composición de la celulosa y su posición en la pared celular ,b) detalle de la celulosa y sus
principales constituyentes
La diferenciación de la celulosa en estas dos regiones permite reconocer la necesidad de realizar un
pretratamiento al bagazo con el objetivo de desestabilizar la región cristalina y lograr mayor grado de
hidrólisis. La molécula de celulosa presenta a lo largo de la cadena, moléculas de glucosa que
establecen un arreglo en donde los planos de los anillos de glucosa forman ángulos de 10°
aproximadamente, con respecto a la horizontal. Además, el arreglo en zigzag coloca al grupo
hidroxilo sobre el carbono 3, tan cerca del oxígeno de la glucosa vecina que se forman enlaces de
hidrógeno. Así se origina un anillo adicional que contribuye a impedir la rotación mutua de los
residuos de glucosa contiguos.
Una fibra elemental con una sección de 35 Å x 35 Å, contiene 40 moléculas aproximadamente. La
misma estructura reticular se encuentra tanto en fibras de celulosa de algodón y madera, como en
las paredes celulares de algas marinas.
1.5 Hemicelulosa
Las Hemicelulosas son polisacáridos no celulósicos [xilana, glucana, galactana, manana, fructana],
compuestos pécticos y glucoproteínas que pueden lignificarse. Revisten las fibrillas de celulosa y
cristalizan con ella, uniéndolas. Poseen un conjunto de características comunes:
• Solubilidad en solventes orgánicos.
• Reactividad frente a los ácidos.
• Descomposición en azúcares y furfural.
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Las hemicelulosas, al igual que la celulosa, sirven como material de soporte de la pared celular de las
plantas. Están constituidos fundamentalmente por azúcares del tipo pentosa y hexosa como se
muestra en la Figura 1.4, que polimerizan entre sí y forman polisacáridos heterogéneos. Son
generalmente insolubles en agua, solubles en álcali y más fácilmente hidrolizables en ácido que la
celulosa. Estructuralmente se diferencian de la celulosa en que no son fibras, están ramificadas y
tienen masas moleculares más bajas, la mayoría tienen un grado de polimerización de 200.
Figura 1.4 Componentes de las hemicelulosas
Debido a la ausencia de cristalinidad, su bajo peso molecular y su configuración ramificada e irregular
absorben agua con facilidad. Esta cualidad contribuye para la movilidad interna y el aumento de
flexibilidad de las fibras, una reducción en el tiempo y energía requeridos para la refinación de la
pasta celulósica; y un aumento del área específica o de unión de las fibras.
Las hemicelulosas que más abundan en el bagazo son del tipo de las D-xilanas, pero también
contienen azúcares tales como las L-arabinosa, D-galactosa, Lgalactosa, D-manosa, L-ramnosa, L-
fructosa. Las cadenas poliméricas son cortas, el peso molecular promedio se encuentra en el
intervalo de 10 000 a 20 000. La facilidad que presentan las hemicelulosas al ataque químico con
respecto a la celulosa, las convierten en un factor de interés para la hidrólisis.
1.6 Lignina
La lignina es el tercer componente de importancia cuantitativa presente en el bagazo; es un polímero
aromático, heterogéneo, ramificado, de alta masa molecular, compuesta por unidades de
fenilpropano enlazadas en tres dimensiones. La unidad de fenilpropano consta básicamente de un
anillo aromático y de una parte alifática de tres átomos de carbono denominados α, ß y γ (alfa, beta y
gama), que contiene grupos fenólicos, grupos carbonilos, hidroxilos, carboxilos y grupos metoxilos.
En el mundo, cada año se generan por fotosíntesis 1011 – 1012 Ton de lignina. La lignina imparte
rigidez a la pared molecular, forma una estructura resistente a los impactos y a la compresión,
proporciona la impermeabilidad necesaria para conducir agua y sales minerales a la planta. Protege a
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la celulosa y hemicelulosa del ataque enzimático microbiano, por ende, proporciona vida más larga a
los tejidos.
Figura 1.5 Componentes De La Lignina.
Los diferentes grupos se encuentran entrelazados por enlaces altamente estables, entre los cuales se
encuentran los enlaces carbono – carbono, enlaces del tipo alquil – aril y enlaces éter, entre otros. La
lignina no es un material de interés para la producción de azúcares, por lo cual debe retirarse
mediante la aplicación del pretratamiento al bagazo de la caña, sin embargo, al ser esta un
subproducto del proceso puede ser utilizada como combustible o comercializarse como materia
prima para la producción de poliuretano.
1.7 Aspectos Generales del Etanol
De fórmula C2H5OH, es un líquido transparente e incoloro, con sabor a quemado y un olor agradable
característico. Normalmente el etanol se concentra por destilación de soluciones diluidas. El de uso
comercial contiene 95% en volumen de etanol y 5% de agua. Ciertos agentes deshidratantes extraen
el agua residual y producen etanol absoluto.
Desde la antigüedad, el etanol se ha obtenido por fermentación de azúcares. Todas las bebidas con
etanol y casi la mitad del etanol industrial aún se fabrican mediante este proceso. La reacción de la
fermentación, está representada por la siguiente ecuación:
Dicho compuesto químico suele utilizarse como combustible, puro o como aditivo de la nafta en
diferentes proporciones, y su uso se ha extendido principalmente para reemplazar el consumo de
derivados del petróleo, mezcla que es conocida como gasohol o alconafta. Dos mezclas comunes son
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E10 y E85, con contenidos de etanol del 10% y 85%, respectivamente y que son comercializadas en
algunos países de Europa, Estados Unidos y Sudamérica para vehículos flexibles.
El alcohol se usa con frecuencia en el sector farmacéutico (excipiente de cosméticos y
medicamentos) esto es gracias a que no sólo es un buen disolvente, sino que también es un potente
desinfectante. Por otro lado, es empleado como combustible a nivel industrial y doméstico. De forma
general a nivel industrial, no solo se quema para obtener energía, sino que también es un reactivo de
varias reacciones de interés. Sus principales propiedades se presentan en la tabla 1.3. Algunas de sus
ventajas y desventajas son:
Ventajas
o Puede ser producido a partir de fuentes renovables
o Es un combustible líquido que puede ser manejado fácilmente al igual que las naftas
o Presenta un alto índice de octanos
o Su combustión produce menos CO2 que la nafta
o Genera menos CO cuando se lo utiliza como aditivo en las naftas
o Posee baja toxicidad
o Resulta menos inflamable que los combustibles derivados del petróleo
Desventajas
o Presenta una menor densidad de energía que las naftas, tiene una capacidad energética igual
a 2/3 que la de las naftas
o Se incrementan las emisiones de óxidos de nitrógeno y aldehídos
o Presenta dificultades para encender en climas muy fríos
Tabla 1.3 Propiedades del Etanol
Parámetro Valor
Peso molecular 46.07
Punto de ebullición a 1 atm 78.3 ºC
Punto de congelación -114 ºC
Temperatura Crítica 243.1 ºC
Presión crítica 63 atm
Calor específico (vapor) 1.128
Calor de solución -2.3*105 J/kg
Calor de combustión -268.8* 10 5 J/kg
Calor de vaporización latente 8.37*105j/kg
Presión de vapor 43 mm Hg
Peso específico (15.56 ºC) 0.816
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1.8 Bioetanol en Argentina
En la actualidad, cada litro de nafta súper o premium contiene entre un 4% y un 6% del
biocombustible. La intención del Poder Ejecutivo Nacional es elevar ese porcentaje para reducir las
importaciones de naftas que se realizan en el país y que deterioran el equilibrio de la balanza
comercial. Por esto se apunta a reemplazar parcialmente la importación de naftas, a través de un
mayor consumo de bioetanol procesado en el país.
Se estiman que en el 2014 habrá volumen disponible para cortar las naftas al 10%, un 3,5% más que
el porcentaje actual, lo que implicará una demanda de 58.000 m3/mes del carburante orgánico,
según las proyecciones de la Secretaría de Energía-Ministerio de Planificación Federal Inversión
pública y Servicio. En el año 2010 hubo un gran crecimiento para el mercado de los biocombustibles y
Argentina se convirtió en el principal exportador de Biocombustibles. Sin embargo, en este buen
momento del rubro, se presentan algunos condicionamientos coyunturales que obstaculizan la
participación en el mercado interno ya que todavía no se ha logrado acuerdo entre las compañías
petroleras y la Asociación de Fabricantes de Automotores (AdeFA), sobre el contenido de oxígeno del
bioetanol para implementar E10.
El tándem petrolero-automotriz alega que es inviable (la idea que está analizando el Gobierno
Nacional), desde un punto de vista técnico, inyectar un 10% de bioetanol para formar la mezcla. Por
su alto contenido de oxígeno, naftas con un elevado porcentaje de Etil-Terbutil-Eter (ETBE) y
bioetanol, distorsionaría el proceso de carburación. No obstante, a nivel mundial, la utilización de
ETBE se ha reducido en los últimos años debido a denuncias sobre sus presuntos efectos
cancerígenos, esto haría crecer la utilización de etanol para aumentar el octanaje de las naftas de
orígenes fósil como substituto del ETBE y de cierto modo obligaría a las empresas petroleras y
automotrices a utilizarlo.
Además de nueve ingenios radicados en el norte del país, se cuenta con tres destilerías a base de
cereales, fundamentalmente maíz, y se está planificando la apertura de dos plantas para el 2014. La
proyección es que en menos de una década, la Argentina estará en condiciones de abastecer un
programa de corte del 20%, que resulta muy necesario dado el crecimiento que ha tenido el
consumo de combustibles líquidos en las estaciones de servicio.
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2. Proceso Productivo
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DESCRIPCIÓN DEL PROCESO PRODUCTIVO
La producción de bioetanol a partir de materiales lignocelulósico es un proceso en el cual se
involucran biomasa, microorganismos, enzimas y equipos para dar como resultado el producto
deseado y otros compuestos químicos. Las reacciones que se presentan en este proceso son de
origen químico y biológico y las condiciones bajo las cuales se efectúa cada una de ellas deberán ser
controladas.
Por ser un proceso novedoso se está estudiando cada etapa que lo compone para determinar el
camino óptimo que dará la máxima producción de alcohol anhídrido y el mejor rendimiento de la
biomasa. Las etapas en las que se generan situaciones de compromiso y a las que se debe prestar
especial atención son: pre tratamiento, pre hidrólisis, hidrólisis enzimática y fermentación.
El bagazo de caña de azúcar es un material ligno-celulósico, obtenido en las centrales azucareras
como desecho, representando el 25% del total de la caña de azúcar procesada. Se han desarrollado
muchos tratamientos para hacer este material más susceptible a la sacarificación, que incluyen los
tratamientos físicos, químicos y enzimáticos.
Las etapas que conforman el proceso se desarrollaran a continuación junto con la selección de las
condiciones de operación de cada equipo.
2.1 Etapas del proceso
1. Pretratamiento, cuya función es hacer más susceptible y accesible el material para la etapa
posterior.
2. Prehidrólisis, que permite liberar las hemicelulosas que contiene el material.
3. Detoxificación, elimina inhibidores de la fermentación.
4. Hidrólisis enzimática, que libera la glucosa presente en los materiales lignocelulósicos.
5. Fermentación de las hexosas y pentosas para obtener etanol.
6. Separación y concentración del etanol.
En la figura 2.1 se presenta el diagrama completo del proceso con las etapas que lo componen.
Uno de los principales problemas vinculados a la producción de etanol, a partir de biomasas
lignocelulósicas, es el pretratamiento e hidrólisis de la materia prima. De su efectividad dependerá
que se obtengan altos rendimientos durante la conversión de los azúcares a etanol.
La fermentación se llevará a cabo con una cepa modificada del género de las Zymomonas, ésta
fermenta pentosas y hexosas lo cual permite un mayor rendimiento de alcohol.
En el próximo capítulo se analizaran los puntos críticos de este proceso. Estos puntos comprometan
la obtención de azucares fermentecibles y por ende la producción de bioetanol.
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2.2 Pretratamiento
El bagazo proveniente de los trapiches debe ser acondicionado para su uso en la obtención de
bioetanol. La materia prima se somete a una molienda húmeda con la cual se aumenta la superficie
de contacto con reactivos y enzimas. Además favorece la hidrólisis enzimática de la celulosa aun
cuando la molienda disminuye el índice de cristalinidad y el grado de polimerización de la celulosa.
El rango óptimo de tamaño necesario para aumentar la eficiencia de la siguiente etapa debe estar
entre 0,1 y 4 mm. Investigaciones han demostrado que el molino de bolas vibratorio causa un
incremento importante en la velocidad de hidrólisis ácida y enzimática de sustratos celulósicos
(Ferrer J.R et al, 2002) con lo cual el primer paso del proceso de producción es la molienda de la
materia húmeda utilizando este molino, omitiéndose así el paso de pre-secado del bagazo.
2.3 Pre hidrólisis
Luego de la molienda el bagazo pasa a la segunda etapa, esta permite que los rendimientos en la
hidrólisis de celulosa aumenten de menos del 20% de los rendimientos teóricos a valores mayores al
90% (Sanchéz Toro O., 2008). Para el pre-tratamiento de la biomasa se han propuesto y desarrollado
diferentes métodos, uno de ellos es la pre-hidrólisis con ácido sulfúrico diluido a altas temperaturas
que solubiliza y degrada la hemicelulosa en los azúcares que la componen. Simultáneamente puede
ocurrir la solubilización de una pequeña parte de la celulosa y también de la lignina.
Los principales productos de la hidrólisis en un medio ácido son de la celulosa: la celobiosa y glucosa,
mientras que de la hemicelulosa la xilosa. Las reacciones generadas en la hidrólisis ácida son muy
complejas, pues el sustrato está en fase sólida y el catalizador en fase liquida. Uno de los modelo que
se propone en la literatura está basado en reacciones de pseudo-primer orden irreversibles
homogéneas para la sacarificación o hidrólisis con H2SO4 (Aguilar Rivera , 2010).
El grado de hidrólisis y la velocidad del proceso dependen de muchos factores, entre otros del pH,
temperatura, concentración del ácido, concentración de la biomasa hidrolítica, tipo de materia
orgánica y tamaño de la partícula. La constante promedio está en la función de los primeros tres
factores que deberán controlarse para lograr un buen rendimiento de esta etapa.
Para la optimización del proceso el pre-tratamiento con ácido diluido se lleva a cabo en un batch en
el cual se introduce tanto la biomasa como el acido sulfúrico en una relación de ácido 1% y de
biomasa 10% w/w a una temperatura de 160°C por un tiempo de 60 minutos (tabla 2.1).
Una de las principales desventajas de los procesos con ácido diluido son la degradación de los
azúcares durante las reacciones y la formación de subproductos indeseables, por ejemplo ácido
acético, hidroximetilfurfural (HMF). Estos no sólo disminuyen el rendimiento global sino que,
también, actúan como inhibidores de la formación de etanol durante la fermentación, por lo que
deberán ser retirados o disminuidos hasta valores que no repercutan sobre el microorganismo
encargado de la fermentación.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
20
Tabla 2.1 Condiciones Operativas de la pre-hidrólisis.
Pre-Hidrólisis
Temperatura 160 °C
Tiempo 60 min
Concentración de ácido 1 %
Concentración de masa 10 % w/w
Fig 2.2 Reacciones secundarias
2.3.1 Ácidos orgánicos
En el método de hidrólisis con ácido diluido se genera un gran número de ácidos alifáticos que son
originados por los extraíbles del bagazo, la degradación de la lignina y la degradación del azúcar
desde la hemicelulosa. El ácido acético es el que se encuentra en mayor porcentaje, el cual se
produce por la degradación del grupo acetil en los polisacáridos; en cambio el ácido levulínico y el
ácido fórmico son productos de la degradación de azúcares como manosa, galactosa y fructosa.
Se producen también algunos tipos de ácidos grasos como ácido hexadecanoico, ácido 9,12-
octadecadienoico, ácido oleico y ácido octadecanoico que en su mayoría provienen desde los
extraíbles de la madera. Además, se tienen ácidos alifáticos como ácido 2-metil-2-hidroxibutanoico,
ácido metilpropanodioico y ácido metilbutanodioico. En términos de concentración estos últimos
ácidos son menos importantes, ya que no afectan considerablemente a la levadura en la
fermentación alcohólica.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
21
2.3.2 Compuestos fenólicos
Entre los compuestos fenólicos reconocidos se encuentran 3-metoxi-4-hidroxibezaldehido, ácido 4-
hidroxiacetofenona, vanillina, acetovanilina, ácido ferúlico, ácido vanilínico y ácido 4-hidroxibezoico.
Hay compuestos que son liberados mayormente por la degradación de la lignina. Estos son los
aldehídos fenólicos, el cual se reconoce como el mayor inhibidor de la fermentación.
2.3.3 Compuestos furanos
Furfural y 5-hidroximetil furfural (HMF) son productos de la descomposición de pentosas y hexosas,
res-pectivamente (ver Figura 2.2). Se ha reportado que el furfural es un fuerte inhibidor de las
levaduras. Una concentración de furfural de 1 g/l puede disminuir significativamente la tasa de
crecimiento (libera-ción) de CO2 y el número de células totales en la fase de fermentación.
HMF afecta la fermentación de forma similar que el furfural. Estudios reportan que la adición de 4
g/L de HMF disminuye en un 32% la tasa de producción CO2, la producción de etanol disminuye en un
40% y la tasa específica de crecimiento disminuye en un 70%. Cabe señalar que el efecto inhibidor
del HMF es menor que el furfural. Por otro lado, la tasa de conversión del furfural es mucho más
rápida que la del HMF, dado que la primera viene desde las pentosas y el segundo desde las hexosas.
2.4 Detoxificación
La detoxificación es la etapa que tiene como fin eliminar o disminuir la cantidad de agentes tóxicos
presentes en la fracción liquida resultante de la pre-hidrolisis. En esta etapa es necesario determinar
la concentración de cada uno de los compuestos al inicio de la etapa y al final de la misma. Tiene
como defecto que no solo se reducen los tóxicos sino también algunos azucares fermentecibles,
reduciéndose el rendimiento de alcohol obtenido (C.A. Cardona et al., 2010).
Existen varios métodos para la remoción de compuestos inhibidores como neutralización, overliming
con Ca(OH)2 , carbón activado, resinas de intercambio iónico y detoxificación enzimática. Solo
algunos de estos métodos pueden remover todas las sustancias tóxicas.
El overliming es un método de detoxificación que remueve parcialmente los tóxicos inhibidores como
furfural e hidroximetilfurfural (HMF), no obstante los ácidos orgánicos no ven afectada su
concentración. Éste método consiste en elevar el pH de la suspensión al rango de 10-12 y mantener
esas condiciones por un período de tiempo superior a los 15 minutos (Puwardi et. al, 2004).
Se han propuesto diferentes modelos cinéticos para describir la degradación de los azúcares y
furanos, el más efectico considera la reacción de los Ca2+ con los reactivos para formar complejos que
se convierten en productos o retornan a su forma original. El mecanismo de la reacción que describe
este modelo es el siguiente:
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22
Dónde:
A reactivo (azúcar, HMF o furfural)
Z el catión Ca2+
{ZA} es el ion complejo Los complejos que se forman están indirectamente limitados por el pH del medio, pues a mayor pH
se tienen mayores pérdidas de azucares y formación de complejos (Martinez et al, 2000). En este
paso se genera una relación de compromiso y se deberá optimizar para saber cuál es la cantidad
apropiada de Ca(OH)2 a agregar.
La remoción de los tóxicos que se obtiene con este tratamiento puede observarse en la siguiente
tabla 2.2.
Tabla 2.2 Remociones por Overliming
Agente Tratamiento previo Remoción
Overliming con
Ca(OH)2
Hidrólisis
Ácida
Furfural (51%)
HMF (51%)
Comp. Fenólicos
(41%)
Furanos (45.8%)
Fenoles (35.87 %)
Ac. Acético (0%)
Las condiciones de trabajo en la detoxificación pueden observarse en la siguiente tabla.
Tabla 2.3 Condiciones operativas en el Detoxificador
Variables Detoxificación
Temperatura 30 ºC
pH 11
Tiempo 40 min
El pH luego debe ser ajustado a 5.5-6.5 con H2SO4 o HCl para ingresar al fermentador junto con el
líquido proveniente de la hidrólisis enzimática.
2.5 Hidrólisis enzimática
La celulosa obtenida del pretratamiento debe ser reducida a monómeros de glucosa (sacarificación)
para su posterior fermentación, esto puedo lograrse tratando al polisacárido con agentes químicos
(hidrolisis ácida) o enzimas. La reacción de descomposición de la celulosa puede observarse a
continuación, esta reacción tiene un rendimiento teórico de reacción de 1.1 glucosa/g celulosa.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
23
Al emplear ácidos inorgánicos a temperaturas entre 200 y 240 ºC y 1.5% de H2SO4 o HCl, es inevitable
la formación de productos indeseables. Por esta razón, la hidrolisis de la celulosa se lleva a cabo
empleando enzimas denominadas genéricamente celulasas lográndose mejores rendimientos en la
fermentación, no hay degradación de glucosa, aunque el proceso se torne más lento.
Las celulasas son producidas por una variedad de bacterias y hongos aeróbicos o anaeróbicos,
mesófilos o termófilos, que son los mayores descomponedores del planeta. Estas proteínas actúan
sobre los enlaces beta 1-4 de la celulosa dando como resultado monómeros de glucosa. Las más
estudiadas son de origen fúngico, las cuales son segregadas como complejo celulolítico de hongos
que actúan sinérgicamente (Sanchez Toro, 2010). El sistema enzimático tiene tres diferentes tipos de
actividad que son:
1. Endo-β-glucanasas
β- (1,4)-glucanglucanohidrolasa
2. Exo-β-glucanasas.
a. β-(1,4)-glucancelobiohidrolasas
Celobiohidrolasa (CBH)
b. β-(1,4)-glucanglucanohidrolasas
Glucohidrolasa (GGH)
3. β- glucosidasa
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24
Fig 2.3 Sistema enzimático de la celulasa
Las endoglucanasas representan el 20 % del total de proteínas del complejo. Estas actúan al azar en
el interior de la celulosa que ha sido previamente tratada, hidrolizando enlacesβ-(1,4) y generando
nuevos finales de cadena no reductores, no puede actuar sobre la celulosa cristalina, es por esto que
es necesario un buen pretratamiento que ataque la estructura del polímero.
La celobiohidrolasa actúa sobre los extremos no reductores de la cadena generados por la
endoglucanasa, liberando moléculas de celobiosa. Esta enzima tiene actividad sobre celulosa
cristalina y amorfa, y sobre celodextrinas, pero no actúa sobre derivados sustituidos ni sobre
celobiosa. La CBH constituye del 50-80% del complejo celulolítico y por último la glucohidrolasa se
encuentra en pequeña proporción y actúa sobre los extremos no reductores liberando unidades de
glucosa. Tiene actividad sobre celulosa amorfa, celo-oligosacáridos y CMC.
La β-glucosidasa hidroliza celobiosa y oligosacáridos de pequeño tamaño, y es absolutamente
necesaria para evitar la fuerte inhibición que sobre las endo y exoglucanasas produciría la celobiosa
si se acumulara en el medio de reacción.
Las condiciones de trabajo del reactor enzimático presentan en la tabla 2.4
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
25
Tabla 2.4 Condiciones Operativas de la hidrólisis enzimática
Reactor enzimático
Concentración de enzima 10 FPU*
tiempo 36hr
Temperatura 45 °C
pH 4,8
rpm >100
2.6 Fermentación
La fermentación alcohólica es un proceso biológico en plena ausencia de oxígeno originado por la
actividad microorganismos que procesan los hidratos de carbono para obtener como productos
finales: alcohol en forma de etanol, dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y moléculas de ATP
que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energético anaeróbico (fig
2.4).
En esta etapa los monosacáridos obtenidos en la hidrólisis y prehidrólisis son transformados en
etanol. Los microorganismos comúnmente empleados para la transformación de los azúcares
presentes en los hidrolizados son la E. Coli, ZymomonasMobilis, Sacharomyses Cerevisiae y
Pichiastipitis.
El proceso descripto emplea Zymomonas Mobilis ZM4-(pZB5) y sigue la vía metabólica que puede
observarse en la figura 2.4. Esta cepa presenta como principal ventaja la cofermentación de pentosas
y hexosas, con lo cual tiene mayor rendimiento en la producción de alcohol que la S. Cerevisiae y
como principal desventaja que al ser una cepa mutada su reproducción celular da cada vez menores
cantidades de ZM4 por lo que disminuye su capacidad de fermentar pentosas.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
26
Fig 2.4. Metabolismo propuesto de la ruta pentosa fosfato y E-D en la recombinante Z. mobilis CP4pZB5
Otras ventajas que posee esta cepa en comparación con las levaduras, a nivel de laboratorio y planta
piloto, en fermentaciones por lotes son las siguientes:
Mayor captación de azúcar y mayor producción de etanol. Por poseer un transporte de fácil
difusión de azúcar, que se acopla con los genes codificantes de las enzimas piruvato de
carboxilasa y alcohol deshidrogenasa (Dimarco and Romano, 1985)
Menor producción de biomasa. Mientras las levaduras producen 2 moles de
adenosintrifosfato (ATP) por cada mol de glucosa a través de la vía Embden –Meyherhoff –
Parnas, las Z. Mobilis fermenta glucosa a través de la vía Entner– Doudoroff y produce solo 1
mol de ATP por cada mol de glucosa figura 2.4.
Mayor tolerancia al etanol. Esta bacteria puede logran concentraciones de etanol superiores
al 12% p/v en fermentaciones con glucosa. Esto se debe a los ácidos grasos como el ácido
mirístico, palmítico y cisvacénico, presentes en mayor proporción las típicas bacterias Gram
(-). Entre los fosfolípidos, el fosfotidiletanolamina es el más abundante en Zymomonas, así
como la presencia de hopanoides, cuya estructura es muy similar a la de los esteroles y que
juegan un papel muy importante para la estabilidad de las membranas enlas levaduras
(Gunasekaran and Chandra, 1999).
Mayor manipulación genética. Al ser una procariota, el genoma de la Zymomona mobilis presenta menores complicaciones si se compara con levaduras.
De datos experimentales se observa que para las zymomonas el metabolito de preferencia es la
glucosa, en la Fig 2.3.1 se observa que al partir de una concentración de 10 g/l de ambos sustratos la
fermentación se completa en 15 horas para la glucosa, mientras que en ese período la xilosa logra
una conversión próxima al 40% (anexo II).
Las condiciones de fermentación para la cepa recombinante (Joachimsthalet al.,2000) pueden
observarse en la siguiente tabla:
Tabla 2.5 Condiciones operativas del fermentador
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Reactor enzimático
Concentración 65 g/l de glucosa
65 g/l de xilosa
Temperatura 30 ºC
pH 5.0 - 5.5
Rpm 200
Tiempo 24-48 hr
Los rendimientos teóricos dan resultados del 92-94%, los resultados experimentales al trabajar en
estas condiciones dan rendimientos de 64 g/l de etanol.
2.7 Destilación y Deshidratación del producto
La última etapa de la obtención de bioetanol es la purificación del mismo. El etanol forma con el
agua un azeótropo binario de mínimo punto de ebullición a 78,17 °C (1 atm) con un contenido en
peso de 95,6 %. La destilación ordinaria del mismo no conduce a la obtención del etanol absoluto,
pues su punto de ebullición es 78,4 °C superior al del azeótropo.
La destilación es la operación de separar, mediante calor, los diferentes componentes líquidos de
una mezcla (etanol/agua). Una forma de destilación, conocida desde la antigüedad, es la obtención
de alcohol aplicando calor a una mezcla fermentada.
El primer paso en la purificación del producto proveniente de la fermentación es el retiro de dióxido
de carbono. Esto se realiza mediante absorción en una torre de venteo (25 etapas, 48% ef.), la
corriente de tope está formada por CO2, agua y un poco de etanol. Luego se somete a la mezcla a
una separación flash, donde los fondos están compuestos por una mezcla acuosa de celulosa y la
hemicelulosa que no fue hidrolizada y los azucares que no se fermentaron, esta corriente recibe el
nombre de vinazas y son enviadas al sistema de tratamiento de agua; el 99,5% del etanol se retira en
la corriente de tope del flash en una mezcla gaseosa del 20,4 % m/m de etanol y se alimenta al
sistema de destilación.
La destilación se realiza en dos torres que trabajan a presión menor de 110 kPa.La primera es la Torre
Fraccionadora (6 etapas, 48% ef.), con el alimento ingresando por el plato 3. Se utiliza un
condensador total y el destilado es una solución de etanol al 55% m/m. La corriente de fondo es agua
que puede ser reutilizada en el proceso. El destilado es alimentado a la Torre Rectificadora (48
etapas, 59% ef.) con el alimento ingresando por el plato 22. Se utiliza un condensador con reflujo
total y el destilado tiene una pureza del 94,5% m/m de etanol. La corriente de fondo es agua que
puede ser reutilizada en el proceso. El destilado en fase vapor es alimentado al sistema de
deshidratación con tamices moleculares.
Para obtener el etanol con una pureza de 99,5% , requerida para la utilización del etanol como
combustible se utiliza un tamiz molecular. Las especificaciones de las condiciones de operación del
tamiz son propiedad del fabricante, pero el proceso es el siguiente: el vapor procedente de la
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
28
columna de rectificación se sobrecalienta a 115ºC y se pasa por el tamiz molecular que opera en
adsorción, las moléculas de agua son más pequeñas que las de etanol y quedan retenidas en los
poros de la resina mientras el etanol fluye a través de la misma. El vapor obtenido tiene una pureza
del 99,5% que es la requerida para utilizarse como combustible. Para regenerar el tamiz, se recircula
a vacío una pequeña corriente de etanol puro que arrastra el agua retenida, el producto de ésta
regeneración es una corriente que contiene cerca del 28% en agua, que se recircula a la Torre
rectificadora. Esta tecnología es llamada Pressure Swing Adsorption (PSA), y utiliza dos lechos
gemelos: mientras uno está adsorbiendo, el otro se va regenerando. Se escogió ésta tecnología
puesto que en el trabajo de Cardona et al. se establece como la mejor entre las analizadas.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
29
4. Control de calidad
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
30
CONTROL DE CALIDAD EN LA PRODUCCIÓN DEL BIOETANOL A PARTIR DE BAGAZO
La producción de Bioetanol presentan varias dificultades para su monitoreo y control. La falta de
robustez de los sensores en línea para medir variables claves, tales como la biomasa o la
concentración de producto, se han considerado como una seria desventaja para la implementación
de algoritmos de control y optimización. Si bien se utilizan diversas técnicas para medir las
concentraciones de biomasa y productos de manera directa, estas mediciones son aún caras y poco
robustas para procesos en gran escala. Además las mediciones de laboratorio tienen una frecuencia
de muestreo baja y su retraso compromete la eficacia del control.
3.1 Calidad
Existen diferentes definiciones de la calidad, girando todas ellas alrededor de un punto fundamental,
que es la aptitud del producto para el uso o servicio, desde el punto de vista del cliente.
La American Society for Quality Control –ASQC toma el concepto de la calidad como: la totalidad de
requisitos y características de un producto o servicio que determinan su capacidad de satisfacer
determinadas necesidades.
El control de calidad es el proceso de regulación a través del cual se puede medir la calidad real,
compararla con las normas o las especificaciones y actuar sobre la diferencia. Este concepto engloba
las acciones que se realizan para asegurar que el producto cumpla con los requisitos especificados, la
producción del mismo sea óptima y la materia prima que se emplee sea la mínima posible.
El control de calidad no solo se refiere a proceso y producto sino también a la gestión, como pilar
fundamental, para la implementación de tareas. Algunas ventajas de establecer procesos de control
de calidad son:
Muestra el orden, la importancia y la interrelación de los distintos procesos de la empresa.
Se realiza un seguimiento más detallado de las operaciones.
Se detectan los problemas antes y se corrigen más fácilmente.
3.2 Puntos Críticos de Control (PCC)
La determinación de los puntos críticos de control, según la FAO, constituye un principio del Análisis
de Peligro y Puntos Críticos de Control (APPCC) y se define como: la fase en la que puede aplicarse un
control y que es esencial para prevenir o eliminar un peligro relacionado con la inocuidad de los
alimentos o para reducirlo a un nivel aceptable. Si bien este concepto está orientado a la calidad
alimentaria que un producto debe tener, igualmente es útil para todo proceso que tiene como
objetivo producir productos que deben cumplir índices de calidad estrictos para su posterior
comercialización.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
31
Generalizando el concepto se podría decir que un PCC es la fase en la que puede aplicarse un control
y que es esencial para prevenir o eliminar un peligro relacionado con las características del producto
final.
Para poder determinar los PCC se precisa un modo de proceder lógico y sistematizado, como el uso
de un árbol de decisiones, el cual es una secuencia de preguntas hechas para determinar si un punto
de control es PCC o no lo es. En cada una de las etapas, el árbol de decisiones, se debe aplicar a cada
uno de los peligros identificados y a sus medidas preventivas. Si se determina la existencia de un
peligro en una fase y no existe ninguna otra medida preventiva que permita controlarlo, debe
realizarse una modificación del producto o proceso que permita incluir la correspondiente medida
preventiva.
Este árbol de decisiones se aplicará con flexibilidad y sentido común, sin perder la visión del conjunto
del proceso de fabricación.
Fig 3.1. Árbol de decisiones de Puntos Críticos de Control
3.3 Identificación de puntos de Control
La determinación de los puntos críticos del proceso se llevó a cabo teniendo en cuenta la bibliografía
y comprobándolos en el árbol de decisión. Niklitschek (2010) menciona los factores críticos que
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
32
afectan la producción de bioetanol, y señala que los más importantes son: la materia prima a utilizar,
el tipo de pretratamiento aplicado y la estrategia de fermentación adoptada.
En primer lugar, el tipo de materia prima especifica la proporción de celulosa y hemicelulosa que la
componen (PCC 1). Los sensores desarrollados para medir propiedades de la biomasa no son muy
robustos, por lo que la mayoría de las características de la biomasa se hacen fuera de línea y con una
frecuencia baja, lo que entorpece el control. Esta primera información define cuáles son los azúcares
teóricos máximos que en la fermentación pueden convertirse en alcohol y permiten analizar la
eficiencia global del proceso.
En segundo lugar, el tipo de pretratamiento (PCC 2) define, en un principio, los azúcares efectivos
que estarán disponibles para la posterior fermentación. Así, el principal objetivo que tiene la etapa es
la de aumentar el área de exposición de las fibras de celulosa para una posterior hidrólisis enzimática
de estos polisacáridos.
Finalmente, la estrategia de fermentación (PCC 3) define cómo los azúcares disponibles en el
material pretratado son generados y asimilados por el microorganismo escogido para producir
etanol. El microorganismo seleccionado influye en la concentración de alcohol obtenido, pues este
variará según la tolerancia del mismo a ese producto, su capacidad de fermentar pentosas o
hexosas, o ambas.
Estas tres etapas dependen de la cantidad inicial de celulosa y hemicelulosa presente en la materia
prima, de las extracción de los azucares fermentecibles, y por último de la conversión de estos a
alcohol, todas estas etapas influyen en las características del producto final.
En la siguiente figura se puede observar la localización de los PCC y las etapas que se comprometen
al no obtener los rendimientos esperados en algunos de estas. Así, una mala molienda influirá en el
área de contacto que tendrá la celulosa con los agentes químicos y luego con las enzimas, por lo que
la cantidad extraíbles de monómeros de glucosa disminuirá y con esto la producción de alcohol. Este
análisis se realizará de manera más detalla en la sección 3.4.
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3.4 Variables de procesos involucradas en PCC
Los puntos críticos definen variables sobre las cuales se deberá tener un control estricto para lograr
la máxima eficiencia global del proceso. Muchas de esas variables se relacionan con el rendimiento
de otras etapas del proceso, teniendo en cuenta esto se analiza la influencia de las variables
correspondiente a puntos críticos en las etapas del proceso.
3.4.1 Punto Crítico 1
Caracterización físico química
Con los datos provenientes de la caracterización se puede tener una idea de la calidad de la materia
prima con la que se cuenta. La proporción de la celulosa y hemicelulosa se determina para tener una
cuantificación teórica de los ART que ingresarán al fermentador. A su vez el porcentaje de lignina
que conforma la materia prima guarda relación con el contenido de fenoles, los cuales disminuyen el
rendimiento de la fermentación.
Variables: celulosa, hemicelulosa y lignina
3.4.1.1Celulosa
Por el contrario, una baja proporción de celulosa implica una disminución de glucosa en la entrada lo
que dará una menor producción de alcohol.
Celulosa • Aumento ↑
Pretratamiento •no influye
Detoxificación •disminuye el caudal de ingreso
Hidrolisis Enzimatica
•↑ contenido C6O6H12
•↑ concentración de enzimas para la hidrolisis
Fermentación
•↑ los ART: controlar la relación glu/l
•↑%et : controlar para evitar inhibiciones
Mayor producción de alcohol
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
35
3.4.1.2 Hemicelulosa
El aumento de hemicelulosa produce un aumento en la proporción de xilosas que son fermentables
por una vía metabólica más extensa que las glucosas.
Aún cuando el microorganismo puede fermentar ambos sustratos tendrá preferencia por las
hexosas. Esto puede observarse en las curvas de concentración del Anexo II, donde se aprecia que la
glucosa es consumida en las primeras horas y la xilosa no termina de consumirse hasta acabado el
ensayo.
Por lo que se concluye que la producción de alcohol disminuirá cuando aumente la proporción de
hemicelulosa.
Hemicelulosa •Aumento ↑
Pretratamiento •↑ hidrolizada en esta etapa
•↑ % de tóxicos
Detoxificación •↑ caudal de ingreso
Hidrolisis Enzimatica
•↓ contenido C6O6H12
•↓ enzimas necesarias
Fermentación •↑ los azucares de C5
¿Menor producción de alcohol?
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
36
3.4.1.3 Lignina
La disminución de la lignina implica un mayor contenido de azúcares para la fermentación.
Para la selección de materia prima se tiene en cuenta el análisis de los componentes
constitucionales, pues siempre convendrá aquella que tenga el máximo contenido de celulosa y
mínimo de lignina.
El aumento de lignina no solo implica una disminución de los azúcares reductores sino también
menor accesibilidad de la enzima a la celulosa.
3.4.1.4 Tamaño de partícula
Al disminuir el tamaño aumenta del área de contacto con reactivos y enzimas lo que da mejores
rendimientos en las etapas de pre hidrólisis e hidrólisis enzimática, por esto al bagazo proveniente de
los trapiches azucareros se lo somete a la molienda en el molino a bolas.
Variable: tamaño de partícula
Lignina • ↑ Aumento
Pretratamiento •↑ Concentración de fenoles
Detoxificación •↑ Tóxicos a la entrada.
Hidrolisis Enzimatica
•más solidos que dificultan la hidrolisis enzimática
•↓ Rendiminto de la etapa
Fermentación •↓ ART
Menor producción de alcohol
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
37
3.4.2 Punto Crítico 2
Prehidrólisis
En la etapa de la pre hidrólisis debemos tener mayor cuidado en que se mantengan las medidas de la
temperatura y concentración de ácido, ya que la variación de las mismos influyen altamente en la
formación de compuestos inhibidores y el rendimiento de la etapa
Variable: temperatura y concentración de ácido
Las dos variables analizadas tienen el mismo efecto sobre las etapas por lo que se analizara una de
manera indistinta.
Tamaño de partícula
•↓ de tamaño
Pretratamiento •mejor rendimiento por
mayor área de contacto
Detoxificación
Hidrolisis Enzimatica
•↑ facilidad para el contacto enzima-celulosa
•mejor rendimiento de la etapa
Fermentación •↑ ART más ↑ % de et
Mayor producción de alcohol
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
38
La disminución de la temperatura y concentración de ácido provoca una disminución en el
rendimiento de la prehidrólisis pues en la materia prima no se generan sitios para que la enzima
hidrolice al polímero. En estas condiciones las etapas de prehidrólisis e hidrólisis enzimática
disminuyen su eficiencia por lo que los azucares que llegan a la fermentación son menores. Con esto
queda demostrado que se genera una situación de compromiso, la cual se deberá optimizar para
buscar las condiciones óptimas de trabajo.
3.4.3 Punto Crítico 3
Fermentación
Variables: temperatura, pH, %etanol, % ART a la entrada y salida
Temperatura y pH : se deben trabajar en los adecuados para la bacteria, de no ser asi los
rendimientos de esta etapa disminuirán por lo que se obtendrá menor cantidad de etanol
% Azúcar (entrada-salida): A la entrada se debe controlar para q no lise a la bacteria, y a la
salida para asegurar la máxima conversión de este a etanol.
% Etanol: se debe controlar para no superar los límites de tolerancia del microorganismo
A partir del análisis realizado se plantean cuales son las determinaciones necesarias a realizar para
tener un control del proceso a partir de los cambios que estas variables puedan tener. Algunas
pueden realizarse en línea lo cual permite un mejor control del proceso, mientras que las que se
realizan en laboratorio tienen un tiempo de retraso en la devolución de la información con lo cual
comprometen la eficacia del control.
↑Temperatura ↑Concentracion Ac.
Pretratamiento •↑ inhibidores
Detoxificación •↑ Caudal de
entrada
•↑ % de inhibidores
Hidrólisis Enzimatica
•celulosa más accesible para la enzima
Fermentación
•↑ concentración de glucosa y xilosa
•↑ ac. orgánicos
•↓ rendimiento x inhibición de las bacterias (↑ inhibidores)
Menor producción de
alcohol
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
39
3.5 Determinaciones Analíticas
El análisis químico juega un papel muy importante, tanto en el establecimiento y mantenimiento de
la calidad de los productos, como en la industria. Los métodos o técnicas utilizadas pueden variar de
acuerdo al estado de la materia que se analiza. Es importante señalar que el análisis nos lleva a
determinar la calidad de un producto, por lo que es necesario conocer las técnicas y métodos que
permiten cuantificar las características del material analizado.
3.5.1 Mediciones en línea
Las mediciones en línea permiten tener un control estricto de las variables de interés, con estas se
puede hacer un seguimiento continuo del producto a lo largo del proceso. Las medidas se comparan
con los valores deseados (set point) alcanzándose así un proceso controlado con un producto final
que cumple con los índices de calidad requerido. Además las mediciones permiten inferior variables
que se miden periódicamente y detectar tempranamente una falla, de manera de poder tomar
acciones correctivas sobre estos antes de que salga de la empresa.
3.4.2 Cuadro de clasificación de mediciones directa (en línea) e indirecta (laboratorio).
Como se ha comentado las determinaciones se pueden realizar directamente sobre el proceso
aplicando instrumentos de medición como termocuplas, ph-chímetros, sensores de concentración de
azúcar o en laboratorio. A continuación se presenta una tabla en la que se clasifican las
determinaciones a realizar
Tabla 3.1 Determinaciones analíticas para el control del proceso
Determinaciones en laboratorio
Determinaciones on-line
Humedad Sensor de humedad
Caracterización fisico-química pH: reactores, detoxificador
Tamaño de partículas Temperatura en distintos puntos del proceso
Composición de HC (celulosa, hemicelulosa, lignina)
Presión en la etapa de destilación
Azucares Reductores Totales (DNS)
Grados Brix:
Caracterización del producto final
Sensor de etanol : % etanol
Las técnicas utilizadas para las mediciones en laboratorio se encuentran en el ANEXO I. En la
siguiente figura pueden observarse las determinaciones que se realizan.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
40
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Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
41
3.5.3 Caracterización de la materia prima
Al bagazo proveniente del ingenio se le realizan las determinaciones que pueden observarse en el
siguiente esquema
Fig 3.4. Determinaciones a realizar en la materia prima
Las metodologías para realizar los análisis pueden observarse en el Anexo 1. Las determinaciones
del esquema se harán en el laboratorio con una cierta periodicidad o cuando el encargado de
proceso lo disponga por distintas razones, por ejemplo haber cambiado el campo del que se extrajo
la caña de azúcar o que el ingenio haya hecho una modificación en la extracción del jugo azucarado.
La determinación de azucares reductores totales nos permitirá estimar la concentración teórica de
alcohol obtenida después de la fermentación.
3.5.4 Caracterización del material pretratado.
El material pre-tratado es el material obtenido a la salida del molino a bolas. La determinación del
tamaño de partícula forma parte del primer punto crítico al igual que la humedad de la materia
prima. Para la determinación del tamaño de partícula se utiliza una torre de tamices en la que se
coloca la muestra previamente secada. La determinación de la humedad se realiza en línea para
saber el caudal de agua y de ácido sulfúrico que debe ingresa al tanque y lograr la relación
establecida de masa de bagazo/agua.
3.5.5 Caracterización en la prehidrólisis
La prehidrólisis es el segundo punto crítico del proceso, en este se debe tener un control estricto
sobre la concentración de ácido y temperatura de la suspensión para evitar la formación de
inhibidores de la fermentación y no reducir los azucares fermentecibles.
La determinación que se realizan en laboratorio es la concentración de sólido (humedad) para
comprobar que se cumple la relación 10 % w/w, esta determinación lleva un tiempo aproximado de
24 horas.
Materia Prima Biomasa
Pretratada
Hidrolizado H. ácida en 2
fases
Fracc. Líquida HPLC
Az. C5 yC6
Celulosa Hemicelulosa
ART
Fracción Sólida Secado 105 °C
Lignina ácido insoluble
Cen. Totales Calcinac a
550°C
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
42
Las variables que se miden en línea son: temperatura, pH, rpm y ART para evaluar la eficiencia en
este paso del proceso (los ART se determinan después de la filtración como la suma de las corrientes
de entrada al detoxificador y a la hidrolisis enzimática).
3.5.6 Determinaciones a realizar en el detoxificador
La metodología de detoxificación propuesta reduce la concentración de HMF y furanos, no así la de
ácidos orgánicos. Por esto solo se determinan los ácidos orgánicos a la entrada del detoxificador de
manera de asegurarse que la concentración de estos esté por debajo del nivel permitido para no
inhibir la fermentación. Los HMF y furanos se miden a la entrada y salida del detoxificador, al igual
que los ART. Además se utiliza un sensor de pH ya que en esta etapa se eleva el mismo a 12 y
después debe retornarse al pH original.
3.5.7 Determinaciones en la Hidrolisis enzimática
La actividad enzimática es una determinación que se hace en laboratorio, si bien las enzimas que se
utilizan son comerciales, esta determinación se lleva a cabo para asegurar el correcto
funcionamiento de las mismas. La concentración de enzima está directamente relacionada con el
contenido de celulosa de la muestra, al determinar la celulosa queda fijada la cantidad de enzima
que se necesita para la hidrolisis enzimática. En línea se realizan los controles de pH y temperatura y
azucares a la entrada y salida.
3.5.8 Determinaciones en Fermentador
El fermentador constituye el tercer punto crítico de control, en esta etapa del proceso es
fundamental controlar la concentración de %ART al inicio (suma de las corrientes que ingresan) y al
final para determinar el rendimiento de la fermentación. Además se realiza control de la viabilidad
de las zymomonas y de las condiciones aptas para el desarrollo y producción de etanol, para esto se
realizan los siguientes controles en línea durante la fermentación: pH y temperatura, % etanol. La
viabilidad de la bacteria se realiza comparando los rendimientos obtenidos por lote con el
rendimiento óptimo de la etapa.
3.5.9 Caracterización del producto final
La Secretaría de Energía en la Resolución 1295/2008 determina las
especificaciones de calidad que deberá cumplir el bioetanol, de conformidad con el Artículo 3º, Inciso c) del Decreto Nº 109/07.
El BIOETANOL que deberá ser mezclado en un porcentaje del CINCO POR CIENTO (5%), medido sobre la cantidad total del producto final, con el combustible líquido caracterizado como Nafta, en los términos del Artículo 8º de la Ley Nº 26.093, deberá cumplir en su composición con las siguientes especificaciones:
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
43
Tabla 3.2 Especificaciones de combustibles líquido
PROPIEDAD MÉTODO VALOR
Densidad a 20º c, g/ml, valor máximo
ASTM D-4052 0,7915
Etanol - más C3-C5 AS%vol, valor mínimo
ASTM D-5501-IRAM 14651
99,00
Alcoholes superiores C3-C5%vol, valor máximo
ASTM D-5501 2,00
Metanol,%vol, valor máximo ASTM D-5501 0,40
Agua,%vol, valor máximo ASTM E203 0,60
Cobre, mg/kg, valor máximo ASTM D-1688 0,10
Acidez Total (como Acético) mg/litro
ASTM D-1613 30
Azufre, ppm, p/p, valor máximo
ASTM D-5453
10,0
Sulfatos ppm, p/p, valor máximo ASTM D 7318/7319/7328 4,0
Apariencia Visual Límpido sin materiales en suspensión
Conductividad Eléctrica, uS/m, valor máximo
ASTM D-1125 500
Gomas Lavadas mg/l, valor máximo ASTM D-381
50
Benzoato de Denatonio ppm, Valor mínimo (*)
(Espectrofotometría UV)
40
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
44
4. Conclusiones
Existen varias alternativas para realizar cada etapa del proceso las cuales están siendo investigadas
con el fin de encontrar el proceso óptimo.
Las etapas elegidas se consideran altamente factibles para la producción de bioetanol a partir de
bagazo de caña de azúcar a escala industrial.
Los puntos críticos que afectan la producción de bioetanol son: la materia prima a utilizar, el tipo de
pretratamiento aplicado y la estrategia de fermentación adoptada.
El microorganismo seleccionado para la cofermentación es una cepa mutante de la bacteria
Zymomonas que permite altos rendimientos en la producción de alcohol.
Al controlar las variables en los puntos críticos descriptos se optimiza la eficiencia de las distintas
etapas de producción. El efecto de que las variables estén fuera del rango óptimo repercute en la
calidad del producto final y en la viabilidad de los microorganismos empleados en el proceso.
La calidad de la materia prima que estemos utilizando influye en la concentración de ART que se
tendrá en la fermentación, en los inhibidores generados en la prehidrólisis y en el rendimiento global
del proceso.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
45
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Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
48
6. Anexos
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
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Anexo I
Determinaciones Analíticas
1. DETERMINACIÓN FÍSICO-QUÍMICA
Determinación de extractos
Los extractivos son aquellas sustancias que se encuentran presentes en las diferentes fibras
vegetales, pero que no son carbohidratos, tales como ácidos grasos, terpenos, fenoles y resinas.
Muchos de estos compuestos son solubles en agua o disolventes orgánicos polares como el metanol,
etanol o acetona, por lo que se eliminan rápidamente en procesos de extracción. La determinación
de extractos se realiza de acuerdo a la práctica de la NREL “Determination of Extractives in Biomass”.
Empleando un equipo de extracción soxhlet, para aproximadamente 7 g de muestra y 190 ml de
solvente. Primero se realiza una extracción con agua, la cual permite determinar la cantidad de
azúcares presentes en este material. Posteriormente se realiza una extracción con etanol para retirar
los extractos que no son solubles en agua. El solvente obtenido en cada una de las extracciones se
lleva a un rotaevaporador donde este es evaporado hasta obtener los extractos.
Con los datos obtenidos en esta prueba se debe calcular el peso de la biomasa libre de humedad
denominado en las normas como peso seco de horno (ODW), por medio de la ecuación 1. El
porcentaje de sólidos totales (T) se determina a partir de la práctica “Determination of Total solids in
Biomass”.
Ec. 1
El porcentaje de extraíbles en una base libre de humedad se calcula con la ecuación 2.
Ec. 2
Determinación de sólidos totales
Las muestras de material lignocelulósico están compuestas principalmente por dos fracciones: Los
sólidos totales y la humedad. El porcentaje de humedad puede variar de acuerdo a las condiciones
ambientales, haciendo que los resultados en las demás pruebas de caracterización se desvíen de su
valor real. Es por este motivo que es más adecuado determinar la composición del bagazo para
materiales libres de humedad. Este procedimiento se realizó a partir del método propuesto por la
ASTM, a partir de la práctica “Determination of Total solids in Biomass” .
Se toman 0,5 g de la muestra y se ponen en un horno a 105 °C por 62 horas. El tiempo de secado
puede variar entre 3 y 72 horas. El material se deja en el horno hasta alcanzar peso constante, punto
en el cual se ha retirado toda la humedad.
El porcentaje en masa de los sólidos totales obtenidos por secado a 105ºC se calcula empleando la
ecuación 3.
Ec. 3
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
50
Determinación de cenizas
Las cenizas son el resultado de la combustión del material, son minerales que prevalecen después de
la calcinación y generalmente están compuestos por potasio, calcio y magnesio. La determinación de
cenizas se realiza de acuerdo a la práctica “Determination of Ash in Biomass” de la NERL. Se realiza
con las muestras después de la extracción. Se debe calcular el peso seco de horno (ODW) de la
muestra, usando el contenido de sólidos totales promedio determinado por el procedimiento
“Determination of Total Solids in Biomass”. Para lo cual se emplea la ecuación 4.
Ec. 4
El porcentaje de cenizas se calcula con la ecuación 5.
Ec. 5
Determinación de carbohidratos estructurales
Los carbohidratos y la lignina constituyen la mayor porción de las muestras de biomasa. Los
carbohidratos pueden ser estructurales o no estructurales. Los estructurales están enlazados en la
matriz de la biomasa, mientras que los no estructurales pueden ser removidos usando extracción o
lavados. Este procedimiento se realiza de acuerdo a la práctica “Determination of Structural
Carbohydrates and Lignin in Biomass” de la NERL. Para el material libre de extractos por duplicado,
primero se realiza una hidrólisis ácida fuerte (Ácido sulfúrico al 72% en peso, durante 60 minutos a
30°C) a una alícuota de 300mg del material, posteriormente se realiza a esta misma muestra una
hidrólisis ácida diluida (Ácido sulfúrico al 4%, durante 60 minutos a 121°C). El hidrolizado se filtra
obteniéndose dos fracciones.
La fracción sólida es llevada a una mufla a 575°C, donde es calcinada. A partir de los resultados
obtenidos es posible calcular el porcentaje en peso del residuo insoluble en ácido (AIR) y lignina
insoluble en ácido (AIL) en base libre de extractos, empleando las ecuaciones 6 y 7. Se debe tener en
cuenta que el sólido obtenido después de la calcinación también contiene las cenizas, por tanto es
necesario descontar esta fracción.
Ec. 6
Ec. 7
La fracción liquida es empleada para determinar la lignina soluble en ácido, a partir de un
espectrofotómetro UV, midiendo la absorbancia a una longitud de onda adecuada. Los valores de
absorbancia adecuado y su correspondiente absortividad para el bagazo, son presentados en la Tabla
A.1.
Tabla A.1: Longitud de onda recomendada para el bagazo y su correspondiente absortividad.
Material Longitud de onda recomendada (nm)
Adsortividad a la longitud de onda recomendada (Ɛ) (L/(g*cm))
Bagazo 240 25
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
51
Para el cálculo de la cantidad de lignina soluble en ácido (ASL) sobre la base libre de extractos se
emplea la ecuación 8.
Ec. 8
Donde
La cantidad total de lignina sobre la base libre de extractos se calcula empleando la ecuación 9.
Ec. 9
Por medio de la ecuación 10 se calcula el valor de lignina total incluyendo los extractos.
El cual es denominado en la norma porcentaje de lignina en la muestra como se recibió.
Ec. 10
Dónde:
%Extractos = porcentaje de extractos en la muestra de biomasa preparada, determinado por el
procedimiento “Determination of Extractives in Biomass”.
La fracción liquida se emplea también para la determinación de los carbohidratos estructurales. Se
toma una alícuota de 20 mL de la solución, y se lleva a un pH de 5-6, empleando carbonato de calcio.
Se filtran y se analizan por HPLC para xilosa, arabinosa, glucosa y ácido acético.
Para esta prueba es necesario preparar una serie de azúcares estándares de recuperación (SRS), a
los cuales se les realiza también una hidrolisis ácida. Estos son empleados para corregir las pérdidas
debido a la destrucción de los azúcares durante la hidrólisis ácida diluida del bagazo.
Para los estándares de recuperación de los azúcares (SRS), se calcula la cantidad de cada azúcar
recuperado después de la hidrólisis ácida diluida. Se promedian los valores de las replicas (%Razúcar)
para cada azúcar y se reportan como %Razúcar ,prom . Como se presenta en la ecuación 11.
Ec. 11
Empleando los valores calculados con la ecuación 11, se corrigen los valores de concentración de los
azúcares obtenidos por HPLC para cada muestra hidrolizada. Como se presenta en la ecuación 12.
Ec. 12
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
52
A partir de la ecuación 13 se calcula la concentración de los azúcares poliméricos por medio de la
concentración de los correspondientes azúcares monoméricos, usando una corrección anhidra de
0.88 ó 132/150 para los azúcares C-5 (Xilosa y arabinosa), una corrección de 0.9 o 162/180 para los
azúcares C-6 (Glucosa, galactosa y manosa) y una corrección de 0,983 para el acetato.
Ec. 13
Con la ecuación 14 se calcula el porcentaje de cada azúcar sobre la base libre de extractos.
Ec. 14
Donde:
Vfiltrado =Volumen de filtrado
El porcentaje de cada azúcar sobre la base de la biomasa como se recibió, se calcula empleando la
ecuación 15.
Ec. 15
Determinación del contenido de holocelulosa.
Se determina usando el método de clorinación (ASTM D1104). Se usan 2.5 g de muestra libre de
extractivos y se les agregan 80 ml de agua destilada caliente, 0.5 ml de ácido acético y 1 g de clorito
de sodio. La mezcla se calienta a 70°C durante 60 min, luego de este tiempo se agrega nuevamente
0.5 ml de ácido acético y 1 g de clorito de sodio y así sucesivamente cada hora. La adición de estos
dos reactivos se hace un total de 6 veces incluyendo la inicial. Luego de la adición final se deja 24 h.
Pasado este tiempo se filtra la holocelulosa y se lava con acetona para posteriormente secarla. El
peso final es la holocelulosa y el porcentaje se define por la ecuación 16.
Ec. 16
Determinación de celulosa y hemicelulosa.
El contenido de celulosa se determina usando la norma ASTM 1695-77. Se toman 2 g de holocelulosa
libre de extractivos y se agregan 10 ml de NaOH al 17.5% a una temperatura constante de 20°C en un
baño termorregulador. Después de 2 min se agregan 5 ml de la solución de NaOH en intervalos de 5
min hasta completar 25 ml de NaOH en total incluyendo la cantidad inicial. Luego de esto se deja la
mezcla a 20°C durante 30 min, para un total de 45 min.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
53
Pasados los 45 min se agregan 33 ml de agua destilada a 20°C y el sólido se deja reposar por 1 hora
antes de filtrar. Se usan crisoles GOOCH para llevar a cabo la filtración, lavando con agua destilada.
Luego a la celulosa recogida en el crisol se le agregan 15 ml de ácido acético al 10%. El ácido es
retirado pero no en su totalidad, solo para que el sólido celulósico quede ligeramente cubierto por 3
min. Posteriormente se retira el ácido acético remanente por succión y se efectúan lavados hasta
que la concentración de ácido sea la mínima posible.
Posteriormente se seca el crisol con la celulosa. El peso de celulosa se determina como la diferencia
entre el peso del crisol con sólidos y el peso del crisol vacio.
La hemicelulosa se determina haciendo la diferencia entre la cantidad inicial de holocelulosa libre de
extractivos y la cantidad de celulosa determinada aplicando la metodología anterior.
2. DETERMINACIÓN DE TAMAÑO
Método de retención por Tamices: Es uno de los métodos más sencillos para medir el tamaño y
distribución de partículas. Consiste en hacer pasar 100g (si el diámetro promedio de partícula esta
entre 500-1000µM) del material a través de una serie de tamices circulares de cerca de 20 cm. de
diámetro y 7 cm de altura; cada uno de diferente tamaño de poro organizado desde el más grande
hasta el más pequeño de manera que uno encaje en el otro herméticamente para minimizar la
pérdida de polvo. Se debe tener en cuenta que los tamices deben quedar alineados en el mismo
plano vertical. Los tamices se someten a vibración constante durante 10 minutos de manera que el
material pase por todos los tamices y que al final de la prueba el material quede disperso en diversas
fracciones entre los tamices y que no más del 5% del material quede retenido en el más grueso y no
más del 5% pase por el más pequeño. En general los rangos de tamaños de los tamices utilizados
oscilan entre No. 20 hasta 150. Sin embargo para la prueba se pueden utilizar tamices que se pasen
de este rango siempre y cuando la progresión de incremento de tamaños sea proporcional.
Figura 1. Esquema del funcionamiento de un equipo por el método de tamices.
Su gran desventaja es el posible taponamiento que se puede presentar cuando las muestras tienen
humedades superiores al 5%..
El número de tamiz se refiere al número de orificios por pulgada lineal que estos posean y éstos se
relacionan con los sistemas americanos (ASTM E11) y británicos (BS410) de clasificación basados en
la progresión de raíz cuarta de dos.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
54
3.DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE MATERIA SECA Y HUMEDAD
Se determinara utilizando el método AOAC No. 934,01 (AOAC, 1990). En el cual se somete una
muestra representativa del bagazo a secar en un horno a 60º C para poder determinar la materia
seca inicial a 60º C y posteriormente se coloca en una mufla a calentamiento a 105º C para poder
calcular la materia seca a 105º C. La materia seca analítica del bagazo se consigue multiplicando los
resultados fraccionarios de materia seca a 60 C y 105º C.
4. DETERMINACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN
El análisis cualitativo y cuantitativo de los compuestos vainillina, ácido vainíllico, alcohol vainíllico,
siringaldehído, ácido siríngico, alcohol siríngico, 4-hidroxibenzaldehído, ácido 4-hidroxibenzóico,
alcohol bencílico, catecol, guayacol, furfural y 5-hidroximetilfurfural (HMF), se realizó mediante
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en un cromatógrafo de líquidos Hewlett Packard (HP)
modelo 1100 con un detector UV de fotodiodos (Diodo Array) HP 1040A. Se utilizó una columna
cromatográfica Aminex HPX-87H (Sulfonated divinyl benzene styrene copolymer), resina en forma
iónica de hidrógeno de 300 mm x 7,8 mm de diámetro interno, (Bio-Rad Labs, CA, USA). La
temperatura de trabajo fue de 55 ºC. La fase móvil fue una mezcla (v/v) de 82% ácido sulfúrico 5 mM
y 18% acetonitrilo a un flujo de 0,3 ml/min.
La utilización de un detector de fotodiodos permite hacer un barrido total de longitudes de onda,
obteniéndose el espectro de absorción UV completo para cada pico cromatográfico. Esta técnica
permite medir absorbancias frente a tiempos de retención y longitudes de onda simultáneamente, lo
que proporciona resultados a diferentes longitudes de onda para cada compuesto contenido en la
muestra, y permite obtener un análisis cuantitativo para cada compuesto a la longitud de onda de
máxima absorción. El rango de longitudes de onda en el que han sido realizados los análisis fue de
200-320 nm.
La determinación analítica de los ácidos acético, levulínico y fórmico se realizó mediante un
cromatógrafo de líquidos HPLC, Waters, modelo 590, provisto de un detector de índice de refracción,
Waters 410. La separación cromatográfica se realizó mediante una columna de acero inoxidable,
Aminex HPX-87H (Bio-Rad Labs, CA, USA) de 300 mm x 7.6 mm de diámetro interno. La fase móvil
utilizada fue ácido sulfúrico 5 mM, a un flujo de 0,6 ml/min y 65 ºC de temperatura de columna.
5. DETERMINACIÓN DE ART (MÉTODO DNS) (EIO)
Según este método, el DNS (Figura 14) sufre la reducción de uno de sus grupos nitro al reaccionar con los carbohidratos, formando un compuesto rojizo que presenta una fuerte absorción en los 540nm.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
55
Para el procedimiento fueron adicionados 0,5 ml de muestra y 0,5 ml de DNS en un tubo de ensayo.
El medio reaccional permaneció en agua a 95°C por exactamente 5 minutos y enseguida fue
enfriado en un baño de hielo y a cada tubo se le adicionaron 3,5 ml de una solución de tartrato de
sodio y potasio para estabilizar el color. Se hace la lectura en el espectrofotómetro a 540nm. La
cuantificación de ART fue obtenida a través de la curva de calibración obtenida como se explica en el
apartado A1, de este Anexo, utilizando el azúcar reductor de interés (glucosa) como patrón. La curva
de calibración se baso en soluciones patrón que fueron sometidas al mismo procedimiento de las
muestras.
A.1 Construcción de la curva patrón para el método DNS
Para la determinación de la concentración de ART (Azúcares Reductores Totales) por el método DNS,
es necesario construir una curva patrón que relacione la concentración de glucosa con la absorbancia
de la muestra en una longitud de onda de 540nm. Por lo tanto debe realizarse una tabla donde se
muestren la concentración de las soluciones de glucosa y sus respectivas absorbancia después de
aplicarles el método DNS, con esto se construye una curva patrón la cual es utilizada luego para
determinar la cantidad de ART de la muestra analizada.
6. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
La actividad de la enzima celulasa se determina como actividad de filtro de papel (FPA) y expresada
en unidades de filtro de papel (FPU – Filter Paper Units) por volumen de enzima original, como es
recomendado por la IUPAC (Ghose et al. 1987).
Para esto inicialmente se prepara una solución 1:20, es decir una concentración de 0.05 de enzima. A
partir de esta solución se efectuaron 5 diluciones más en tampón citrato 0,05 mol/L, pH 4,8. Se
utilizan 5 diluciones diferentes para la determinación de la actividad. Primero se adicionan a 5 tubos
de ensayo 1.0 ml de tampón citrato 0,05 mol/L, pH 4,8, a cada uno se le agrega 50 mg de filtro de
papel, y son llevados a baño termostatico a 50°C. Después se adicionan 0.5 ml de la enzima
previamente diluida incubados por 60 minutos. Después de este tiempo se sacan los tubos y se les
agrega 1.5 ml del reactivo DNS y se lleva a 95 °C por 5 minutos y luego se transfieren a un baño de
hielo. Al final, se adicionan 10,5 mL de estabilizante se espera a que la pulpa se sedimente para leer
el color formado en el espectrofotómetro.
Después de las lecturas de las absorbancia, se traza una curva donde se relaciona la dilución de la
enzima con la concentración de glucosa liberada por 0.5 mL de enzima y se determina la actividad de
la enzima teniendo en cuenta que la unidad FPU se basa en la liberación de exactamente 2,0 mg de
glucosa siendo esto equivalente a 2,0/0,18016 μmol de 50 mg de filtro de papel por 0,5 mL de
enzima diluida en 60 minutos de reacción.
Según los valores anteriores la actividad de la celulasa queda determinada por la ecuación 17:
Ec. 17
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
56
7. DETERMINACIÓN DE ETANOL
El etanol se analiza en un cromatógrafo de gases Hewlett Packard 5890 serie II, equipado con un
inyector automático Agilent serie 6890, un detector de ionización de llama (FID) y una columna
Carbowax 20M (2 m x 1/8 in) a una temperatura de 85 ºC.
8. CONTROL DE LA VIABILIDAD DE LAS ZYMOMONA
Este control se realiza teniendo en cuenta el rendimiento del lote y comparando ese resultado con
los valores óptimos de fermentación de la cepa. Las zymomonas, por ser bacterias, no se contabilizan
por tinción, a diferencia de las levaduras, y los ensayos necesarios para su control llevan mucho
tiempo por lo cual se considera que los mismos no son útiles como análisis rutinarios, es por esto
que con la determinación de ART al inicio y final de la fermentación servirá para examinar que la
cepa este dando los resultados esperados.
9. CONTROL DE CALIDAD DEL BIOETANOL
Las determinaciones que se realizan sobre el producto final son las citadas en la Resolución
1295/200, en las que se especifica las características de calidad que deberá cumplir el
bioetanol. En la tabla 3.2 se especifica los métodos analíticos a emplear para la determinación
de las distintas propiedades y a continuación se muestran algunas de las propiedades y sus
importancias.
1. Importancia de cada propiedad
El etanol carburante a ser mezclado con la gasolina regular deberá ser anhidro, es decir, alcohol
etílico anhidro combustible (AEAC) y deberá presentar algunas propiedades que garanticen la
obtención de un gasohol adecuado para sustituir la gasolina regular.
La importancia de cada propiedad del AEAC, garantizando la calidad del gasohol, puede ser
comprendida considerando los siguientes puntos:
I. Aspecto y color
Representan características importantes, pues permiten evaluar la presencia de impurezas
provenientes del proceso productivo o del transporte inadecuado, así como la contaminación con
otros productos o con herrumbre. El oscurecimiento también puede ocurrir debido a la oxidación de
compuestos inestables presentes (alcoholes superiores y aldehídos). La presencia de impurezas
podrá también reducir la vida útil de los filtros de combustible de los vehículos, causar la formación
de depósitos u obstrucciones en los carburadores de los automóviles más antiguos, o en piezas
movibles de los motores, como las del sistema de inyección electrónica de los automóviles más
modernos.
II. Acidez total
Propiedad que debe ser controlada, pues refleja el poder corrosivo del etanol, lo que puede causar
daños a los componentes del automóvil. Este parámetro deber ser evaluado, pues si el proceso
fermentativo no es interrumpido adecuadamente después de la formación del etanol, éste se oxidará
transformándose en ácido acético. Cabe señalar también que se adiciona ácido sulfúrico a la mezcla,
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
57
a fin de ajustar el pH, para que la fermentación ocurra. La acidez puede provocar corrosión en el
circuito de combustibles, además de reflejar un grado de etanol inferior al deseado.
III. Conductividad eléctrica
Propiedad directamente relacionada con la cantidad de iones presentes en el etanol.
Cuanto más iones tenga más conductor será el AEAC, que puede ser más corrosivo y/o agresivo a los
materiales del circuito de distribución del combustible en el automóvil. Muchas veces puede
evidenciar contaminación con base, usada en la tentativa de neutralizar la acidez del etanol.
IV. Masa específica
La masa específica (densidad) es una medida indirecta de la proporción agua y alcohol existente en el
combustible. Si es elevada, puede indicar gran cantidad de agua; si la masa específica es muy baja,
indica la presencia de componentes livianos, como metanol y aldehídos, los cuales pueden causar
más polución al medio ambiente. Como los motores son ajustados considerando el poder calorífico y,
en consecuencia, el contenido energético por litro de combustible abastecido, la densidad es una
propiedad que debe ser monitoreada continuamente en diferentes etapas de la distribución del
producto.
V. Grado alcohólico
Además de reflejar el grado de pureza del etanol, permite evaluar especialmente la presencia de
agua, que es soluble en el etanol e incolora, pero que presenta elevada densidad.
VI. Grado de hidrocarburos
Refleja el grado de contaminantes orgánicos no oxigenados, principalmente la gasolina o los
solventes petroquímicos que pueden contaminar el AEAC durante el manejo, cuando se comparten
equipos, tanques u otros ductos. Ese parámetro garantiza el grado de etanol adecuado en el AEAC.
VII. Grado de etanol
Este ensayo es importante cuando existe la posibilidad de que haya otros alcoholes además del
etanol. Es un análisis que se debe realizar en condiciones especiales, por ejemplo, cuando se
sospecha de la presencia de metanol o de alcoholes superiores. No debe ser, por lo tanto, un análisis
de rutina que es útil para la identificación y cuantificación de alcoholes, enfocando especialmente el
etanol.
VIII. Grado de iones cloruro, sulfato, hierro, sodio
La presencia de estos iones aumenta la conductividad del AEAC y reflejan el poder corrosivo del
etanol, especialmente el cloruro, que es muy agresivo a los aceros utilizados en los motores y otras
piezas en contacto con el combustible. El ion hierro delata la presencia de óxido de hierro, debido a
los procesos corrosivos en equipos y líneas de transporte y almacenamiento, lo que puede causar
obstrucciones en las partes movibles de los motores. El elevado grado de sodio puede indicar el uso
de base (NaOH) para la neutralización de la acidez del etanol, cuando se usa, por ejemplo, ácido
sulfúrico para ajustar el pH en la preparación de la mezcla de fermentación.
IX. Grado de los iones de cobre
Este metal tiene especial importancia, dado que muchos equipos de fermentación y de destilación
del etanol pueden ser confeccionados en cobre, metal que es fácilmente transportado por el AEAC.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
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Cuando es agregado a la gasolina, catalizará las reacciones de oxidación de la formación de goma
(producto macromolecular proveniente de la polimerización de olefinas), que es un material de
carácter polimérico, capaz de depositarse y obstruir filtros y el circuito de distribución de
combustible, comprometiendo el funcionamiento de los automóviles.
2. Caracterización del alcohol etílico anhidro combustible (AEAC)
a) Determinación de la masa específica y del grado alcohólico del alcohol etílico y sus mezclas con
agua
Importancia: alta
I. Referencias
• NBR 5992, Determinación de la masa específica y del grado alcohólico del alcohol etílico y sus
mezclas con agua – método de ensayo;
• NBR 5994, Termómetro para alcohol y sus mezclas con agua – características;
• NBR 5995, Densímetro para alcohol y sus mezclas con agua – características.
II. Definiciones y siglas
• Densidad o masa específica, masa de un líquido por unidad de volumen a 15°C y 101.325 kPa
siendo la unidad patrón de medida kg/m3. Otras temperaturas de referencia pueden ser usadas para
algunos productos en ciertos lugares;
• Grado alcohólico, cantidad, en gramos, de alcohol absoluto contenido en 100 gramos de mezcla
hidro-alcohólica, expresada en °INPM;
• °INPM, (porcentaje de alcohol en masa o grado alcohólico INMP): cantidad en gramos de alcohol
absoluto contenido en 100 gramos de mezcla hidroalcohólica.
III. Materiales, equipos y preparación de la muestra
• Densímetro de vidrio conforme especificación NBR 5995;
• Termómetro conforme especificación NBR 5994, escala interna, corto, graduación 0,5 °C, con
lecturas entre -10 y 40 °C (250 mm de largo);
• Probeta de vidrio con diámetro mínimo de 25 mm superior al del densímetro de vidrio, con
proporciones tales que permitan al densímetro fluctuar libremente sin tocar el fondo o las paredes
de la misma;
Esos materiales están ilustrados en la siguiente figura:
Fig 2. Ensayo de determinación de la masa específica. Densímetro de vidrio (alcohómetro) y probeta con
gasolina
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
59
• El ensayo de densidad (densímetro de vidrio) y Grado Alcohólico debe ser realizado con la muestra
a temperatura ambiente.
IV. Metodología
• Verter la muestra en la probeta limpia y seca; Introducir el termómetro y utilizarlo para
homogeneizar la muestra con movimientos verticales y circulares. Esperar hasta que la temperatura
se estabilice y hacer la lectura. Retirar el termómetro;
• Introducir el densímetro de vidrio apropiado, limpio y desengrasado, de modo que quede flotando
libremente sin tocar el fondo o las paredes de la probeta. Dar un leve giro en el densímetro y esperar
la posición de equilibrio. Una vez alcanzada la posición de equilibrio, hacer la lectura observando el
menisco inferior de la superficie principal del líquido, que deberá coincidir con la escala de densidad;
• Introducir el termómetro y leer nuevamente la temperatura de la muestra;
• Los valores de la densidad a 15°C pueden ser obtenidos utilizando las tablas que acompañan las
normas. Para eso, se deben tener los datos de la temperatura y de la densidad leídas, obteniéndose
así la densidad a 15°C;
• Con el valor de las masas específicas o de las densidades en las temperaturas de aferición del
densímetro, entrar en la tabla específica y leer el grado alcohólico en º INPM (% masa) y ºGL (%
volumen).
b) Conductividad eléctrica
Importancia: alta
I. Referencias
• Manual del conductivímetro (en este caso marca DIGIMED, modelo DM31);
• NBR 10547, Alcohol etílico – determinación de la conductividad eléctrica;
• NBR 14340, Agua – determinación de la conductividad y de la resistividad eléctrica;
• ASTM D 1125, Standard Test Methods for Electrical Conductivity and Resistivity of Water. Métodos
de prueba estándar para la conductividad eléctrica y la resistividad del agua.
II. Definiciones y siglas
• Conductancia, propiedad que mide la capacidad de conducir una corriente eléctrica y es el inverso
de la resistencia eléctrica, se mide en siemens (S);
• Conductividad, conductancia medida entre las caras opuestas de un centímetro cúbico
(antiguamente conocida como conductancia específica), se expresa en S cm-1 ó S m-1.
III. Materiales, equipos y preparación de las muestras
• Solución patrón de conductividad; Conductímetro equipado con célula de medición con constante
aproximada de 0,1 cm-1;
• Sensor de temperatura;
• Agua destilada para limpieza de la célula;
• Béquer para lectura de las muestras, con diámetro superior a la célula de medida;
• Béquer para descarte.
El ensayo de conductividad debe ser realizado con la muestra a temperatura ambiente.
IV. Metodología
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
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• Conectar el conductímetro a la toma con voltaje adecuado – verificar previamente el voltaje;
• Esperar que se estabilice, como mínimo 30 minutos, antes de realizar el ensayo;
• Presionar la tecla “ENTRA”;
• Esperar que aparezca en la pantalla:
Seleccione función
Cond. Res. Conc.
• Seleccionar “COND” y presionar “ENTRA”;
• Seleccionar “CHECK” para proceder a la verificación de la célula y presionar
“ENTRA”;
• Sumergir la célula conductimétrica y el sensor de temperatura en la solución patrón de
conductividad y esperar que se estabilice. Si aparece el mensaje “la célula está bien”, pasar a la
verificación con el patrón;
• Si la verificación de la célula muestra el mensaje “la célula está mal”, seleccionar la función “COND”
en la pantalla principal y, luego, “LECTURA” y después “CALIBRAR”, para calibrar la célula. Seguir los
pasos indicados en la pantalla del equipo para insertar la célula en la solución patrón. Después de
concluir la calibración, el equipo estará apto para realizar el ensayo;
• Para hacer la verificación del conductivímetro, sumergir la célula conductimétrica y el sensor de
temperatura en la solución patrón de conductividad y después pasar a la lectura de las muestras. Si la
lectura del patrón no está dentro de la banda esperada, (± 2,0 % de la conductividad del patrón,
según la ASTM D 1125), seleccionar la función “COND” en la pantalla principal y, luego, ‘LECTURA” y
después “CALIBRAR”, para calibrar la célula. Seguir los pasos indicados en la pantalla del equipo para
insertar la célula en la solución patrón. Después de concluir la calibración el equipo estará apto para
realizar el ensayo;
• El factor de corrección de la conductividad eléctrica en función de la temperatura debe ser de 2,0%
°C, basado en la NBR10457.
• Lavar la célula de medición y el sensor de temperatura introduciéndolos en el béquer con la
muestra.
• Descartar el contenido del béquer. Repetir este procedimiento tres veces como mínimo. Llenar
nuevamente el béquer con una cantidad suficiente de muestra para cubrir la célula de medición.
• Esperar como mínimo 2 minutos para que se estabilice.
• Efectuar la lectura y anotar el resultado.
• Al final del día lavar la célula con agua destilada y dejarla secar.
• Para desconectarlo:
Desea desconectar el equipo? SÍ / NO
• Seleccionar “SÌ” y “ENTRA”.
• Para dejar el equipo en el modo “STAND-BY” presionar “ENTRA”.
• OBS: Procedimientos similares deberán ser realizados para conductivímetros de otras marcas.
c) Grado de hidrocarburos en muestras de alcohol
Importancia: baja
I. Referencias
• NBR 13993, Álcool Etílico Anidro Combustível (AEAC) - Determinação do teor de Hidrocarbonetos.
Alcohol Etílico Anhidro Combustible (AEAC) -
Determinación del grado de Hidrocarburos.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
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II. Materiales, equipos y preparación de las muestras
• Solución acuosa de cloruro de sodio al 10% m/v (preparada disolviendo 100,0 g de NaCl en 1000,0 L
de agua destilada);
• Probeta de vidrio calibrada de 100,0 ml, graduada en subdivisiones de 1,0 ml, con boca esmerilada
y tapa;
• El ensayo de grado de hidrocarburos debe ser realizado con la muestra a temperatura ambiente.
III. Metodología
• Colocar la muestra en la probeta previamente limpia, desengrasada y seca hasta completar 50,0 ml;
• Agregar la solución de NaCl 10% m/v hasta completar el volumen de 100,0 ml;
• Tapar la probeta. Asirla por la parte superior sobre la tapa y por la base, e invertirla 10 veces para
completar la extracción del alcohol por la fase acuosa, evitando agitar vigorosamente;
• Dejar en reposo por 15 minutos, a fin de permitir la separación completa de las fases;
• Observar el volumen final de la camada acuosa, en ml, de acuerdo con la figura 3:
Fig 3. Posición adecuada para leer el volumen en la probeta
Las probetas deben ser lavadas con agua y detergente neutro, utilizando un cepillo apropiado
después de realizar cada ensayo. Dejarlas escurrir hasta que se sequen por completo, para ser usadas
nuevamente;
• La limpieza de las probetas deberá hacerse llenándolas con solución sulfonítrica y dejándolas en
remojo por dos horas;
• La solución sulfonítrica se prepara partiendo de una parte de H2SO4 y tres partes de HNO3. Ésta
debe ser preparada dentro de un baño de hielo, y se deben usar anteojos de seguridad y guantes
nitrílicos.
IV. Resultados
• Calcular el grado de hidrocarburos según la ecuación:
% hidrocarburos = (2 A) +1 Ec. 18
Donde, A = volumen de la camada de hidrocarburos, en ml
• Cuando el volumen de la camada de hidrocarburos sea inferior a 0,5 ml anotar el resultado como ≤
1% vol;
• El resultado es obtenido en %. Si es necesario convertir a ml L-1, multiplicar por 10.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
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d) Aspecto y Color
Importancia: alta
I. Materiales, equipos y preparación de la muestra
• Probeta de vidrio de 1 L ó béquer de 1 L;
• El ensayo de aspecto y color visual debe ser realizado con la muestra a temperatura ambiente.
II. Metodología
• Homogeneizar la muestra invirtiendo el frasco tres veces sin agitar vigorosamente;
• Colocar la muestra en la probeta, o béquer, y observar la apariencia y el color de la misma.
III. Resultados
Reportar el color de las muestras de alcohol y gasolina, de acuerdo con el cuadro 5:
Tabla 1. Colores de las muestras a ser reportadas
En el ítem aspecto, reportar el resultado con una de las siguientes expresiones:
1. límpido y exento de impurezas
2. límpido y con impurezas
3. turbio y sin impurezas
4. turbio y con impurezas
e) Densidad automática
Importancia: alta
Se presentan instrucciones para el uso correcto del densímetro automático y la determinación de la
densidad y/o densidad relativa de destilados de petróleo a temperaturas entre 15 y 35 °C, y para
AEAC.
I. Referencias
• Manual del densímetro automático (en este caso, marca Anton Paar, modelo DMA 4500);
• ASTM D 4052, Density and Relative Density of Liquids by Digital Density Meter. Método de prueba
estándar para la densidad y densidad relativa de líquidos mediante medidor digital.
II. Definiciones y siglas
• Densidad o masa específica, masa de un líquido por unidad de volumen a 15°C y 101,325 kPa con la
unidad patrón de medida en kg/m3. Otras temperaturas de referencia pueden ser usadas para
algunos productos en ciertos lugares;
• Densidad Relativa, razón entre la masa de un determinado volumen de líquido a una temperatura
específica y la masa de igual volumen de agua pura a la misma o diferente temperatura. Ambas
temperaturas deben ser explicitadas, por ejemplo: 20/4°C.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
63
III. Materiales, equipos y preparación de la muestra
• Densímetro automático conforme especificado en el ítem 6.1 de la Norma ASTM D 4052;
• Jeringas de capacidad igual o superior a 2 ml, adaptables al equipo, para inyección de la muestra;
• Jeringa de 2 ml, como mínimo, adaptable al densímetro;
• Alcohol y acetona para limpiar la célula;
• La figura 4 es una ilustración del densímetro usado en el ensayo.
Figura 4. Densímetro automático (marca anton paar) usado para determinar la masa específica de
combustibles líquidos
• Las muestras de gasolina deben ser mantenidas a temperatura igual o inferior a 10ºC, y el frasco
sólo debe ser abierto en el momento de comenzar el ensayo, debiendo ser tapado inmediatamente
después, para evitar pérdidas por evaporación de los materiales más volátiles;
• Las muestras de alcohol deberán estar a temperatura ambiente.
IV. Metodología
1) Preparación del equipo
• Conectar el densímetro en la toma de voltaje adecuada;
• Oprimir el botón localizado en la parte posterior inferior izquierda del equipo;
• El aparato deberá permanecer conectado para estabilizarse por un mínimo de 30 minutos antes de
iniciar los ensayos;
• Verificar si en la pantalla principal aparece la densidad del aire, 0,0011 g ml-1, indicando que la
célula de medición del densímetro está seca. Si la tela presenta una densidad diferente del valor
indicado arriba, se deberá realizar una limpieza. Para esto, es necesario inyectar acetona en la célula
y conectar la manguera de la bomba de aire en el orificio de entrada de muestra del densímetro.
Conectar la bomba presionando la tecla “PUMP”;
• Esperar aproximadamente 2 minutos, desconectar la bomba de aire y presionar nuevamente la
tecla “PUMP”;
• Esperar hasta que aparezca la densidad del aire (0,0011 g ml-1);
• Verificar el volumen del frasco de descarte adaptado al equipo. Si está lleno, verter el contenido del
frasco en el galón de descarte apropiado;
• Al concluir el análisis, limpiar el aparato siguiendo las instrucciones anteriores y desconectarlo.
2) Ensayo de Densidad
• La muestra debe ser homogeneizada, invirtiendo el frasco tapado, sin agitar vigorosamente, tres
veces;
• Certificarse de que el equipo está programado para la temperatura del ensayo;
• Utilizando la jeringa, inyectar la muestra en el tubo de muestras limpio y seco;
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
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• Observar el tubo de muestras cuidadosamente, asegurándose de que no haya burbujas;
• Esperar que la temperatura se estabilice;
• El resultado del ensayo será mostrado en la pantalla del equipo;
• Anotar el resultado en la hoja de resultados de la muestra;
• Cada vez que se cambie el tipo de combustible a ser analizado, limpiar la célula con alcohol y
acetona.
V. Resultados
• En el resultado de la densidad, informar la temperatura del ensayo y la unidad.
Por ejemplo: densidad a 20 °C = 0,8765 g cm-1 (para gasolina, se usan unidades de g cm-3, en
cambio, el alcohol generalmente se expresa en kg m-3);
• En el resultado de la densidad relativa, informar ambas temperaturas: la de referencia y de ensayo.
El resultado queda sin unidad. Ejemplo: densidad relativa 20/20 °C = 0,8765;
• Reportar el resultado con cuatro decimales.
f) Acidez total
Importancia: media
I. Referencias
• NBR 9866, Álcool etílico - Verificação da alcalinidade e determinação da acidez total. Alcohol etílico
- Verificación de la alcalinidad y determinación de la acidez total.
II. Materiales y equipos
• Microbureta de 2 ml, graduación de 0,01ml;
• Pipeta volumétrica de 50 ml;
• Erlenmeyer de 250 ml;
• Solución de hidróxido de sodio 0,02 N padronizada;
• Solución indicadora de α naftolftaleína 0,1 % en alcohol etílico 70% v/v.
III. Metodología
• Colocar 50 ml de agua en el erlenmeyer y agregar 3 gotas del indicador α naftolftaleína y
neutralizar con solución de hidróxido de sodio 0,02N;
• Pipetar 50ml de la muestra previamente homogeneizada para el erlenmeyer, agitar y observar el
color de la solución. Considerar la permanencia del color azul como indicación de alcalinidad en la
muestra;
• Titular con solución de NaOH 0,02N, en caso de que la solución quede incolora, hasta que aparezca
el color azul claro. Anotar el volumen consumido;
• La muestra es considerada alcalina (positiva) si permanece de color azul;
• Si la solución permanece incolora (alcalinidad negativa) la acidez deberá calcularse así:
A = 1200 N V Ec.19
Donde:
A = acidez expresada en ácido acético, en etanol
N= concentración del hidróxido de sodio (mol/L)
V= Volumen de la solución de NaOH (en ml)
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
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g) Grado de Cobre
Importancia: media
I. Referencias
• NBR 10893, Álcool etílico - Determinação do teor de cobre por espectrofotometria de absorção
atômica. Alcohol etílico - Determinación del grado de cobre por espectrofotometría de absorción
atómica.
II. Materiales y equipos
• Espectrofotómetro de absorción atómica con llama a 324,8 nm;
• Lámpara de cátodo hueco de cobre;
• Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg;
• Pipetador automático 25 μL;
• Balones volumétricos de 100 ml, 500 ml y 1000 ml;
• Pipeta volumétrica de 100 ml;
• Bastón de vidrio y piseta;
• Cobre metálico p.a., alcohol etílico p.a., agua tipo II, agua destilada con conductividad eléctrica
inferior a 1,0 μS/cm.
III. Metodología
• Construir una curva de calibración con soluciones-patrón de cobre;
• Determinar la concentración de cobre presente en la muestra por medio de la lectura directa del
gráfico de la absorbancia de la misma. Para este fin, la muestra es aspirada y transformada en
aerosol por un nebulizador neumático y posteriormente atomizada en una llama de aire/acetileno,
donde incide un eje de energía radiante emitido por una lámina de cátodo hueco de cobre;
• Calcular el grado de cobre utilizando la siguiente ecuación:
C= A /d x 1000 Ec.20
Donde:
C= grado de cobre en la muestra en mg/kg.
A= grado de cobre en la muestra obtenido en la gráfica, en mg/L.
d= masa específica de la muestra a temperatura del ensayo, en kg/m3, determinada de acuerdo con
NBR 5992 (Determinación de la masa específica y del grado alcohólico del alcohol etílico y sus
mezclas con agua)
h) Grado de cloruro y sulfato
Importancia: baja
I. Referencias
• NBR 10894, Álcool Etílico - Determinação dos Íons Cloreto e Sulfato por Cromatografia Iônica,
Alcohol Etílico - Determinación de los Iones Cloruro y Sulfato por Cromatografia Iónica.
II. Materiales y equipos
• Cromatógrafo iónico con detector conductivimétrico, pre-columna de 50 mm de largo, con un
diámetro interno de 4,0 mm y columna aniónica con grupo amonio cuaternario (HPIC-AS3, Dionex,
USA) de 250 mm de largo y un diámetro interno de 4,0 mm;
• Balanza analítica con capacidad de 200 g;
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
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• Balones volumétricos de 100 y 1000 ml, dos balones de rota vapor (100 ml), pipetas volumétricas
de 20 y 50 ml;
• Dos membranas de filtración con porosidad de 0,45 μm y 47 mm de diámetro, un pre-filtro de 22
mm de diámetro.
III. Metodología
• Este método tiene un límite de detección de 0,1 mg/kg con banda linear de hasta 100 mg/kg;
• Se preparan soluciones patrón del ion cloruro partiendo de cloruro de sodio y soluciones patrón del
ion sulfato partiendo del sulfato de sodio;
• La cuantificación de los iones cloruro y sulfato se hace por comparación directa de las áreas de los
picos de los iones cloruro y sulfato en el cromatograma del patrón y de la muestra, según la
ecuación:
Ca = Cp . Aa / Ap x f Ec 21
Donde:
Ca = concentración de cloruro o sulfato en la muestra (mg/kg).
Cp = concentración de cloruro o sulfato en el patrón (mg/kg).
Aa = área del pico en la muestra (mm2).
Ap = área del pico en el patrón (mm2).
f = factor de dilución de la muestra
i) Grado de Sodio
Importancia: media
I. Referencias
• NBR 10422, Álcool etílico - Determinação do teor de sódio por fotometria de chama. Alcohol etílico
- Determinación del grado de sodio por fotometría de llama.
ii) Materiales y equipos
• Fotómetro de llama o espectrofotómetro de llama ajustado para 589 nm
• Estufa a 110 °C;
• Balanza analítica con precisión de 0,1 mg;
• Béquer de 50 ml;
• Balones Volumétricos de 100 y 500 ml, pipetas volumétricas de 5, 10, 15, 20 y
25 ml, frasco de polietileno de 500 ml;
• Cloruro de sodio p.a., alcohol etílico hidratado, aproximadamente 94 ºINPM, con grado de sodio
inferior a 0,1 mg/kg y alcohol etílico anhidro, aproximadamente 99,8 ºINPM, con grado de sodio
inferior a 0,1 mg/kg.
II. Metodología
• Pesar aproximadamente 0,1017 g de Na Cl previamente secado a 110 °C por 12 horas, disolver en
béquer de 50 ml. con 10 ml. de agua desionizada.
Transferir a un balón volumétrico de 100 ml., completar el volumen con alcohol etílico anhidro,
homogeneizar y almacenar en frasco de polietileno;
• Pipetar 10 ml de la solución almacenada para balón volumétrico de 100 ml, ompletar con alcohol
anhidro. Pipetar 5, 10, 15, 20, 25 ml de esa solución para balones volumétricos de 100 ml, completar
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
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el volumen con etanol y homogeneizar. Estos corresponden a los patrones de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5
mg/kg de sodio en etanol;
• Ajustar el aparato, determinar la transmitancia de las soluciones patrón, graficar en las abscisas los
grados de sodio de las soluciones patrón (mg/kg) y en las ordenadas, las transmitancias (%). Trazar la
recta o curva de ajuste;
• Determinar la transmitancia de la muestra, repetir por triplicado y sacar el valor promedio;
• Determinar el grado de sodio en el alcohol valiéndose de la curva patrón, utilizando el valor
promedio y la curva de calibración;
• El grado de sodio en el alcohol está expresado en mg/kg. Esta metodología se aplica a las muestras
con grados superiores a 0,2 mg/kg. Para muestras con grados de sodio inferiores a este límite se
deber usar la técnica de absorción atómica.
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ANEXO II
DATOS EXPERIMENTALES
Los siguientes datos experimentales fueron tomados del trabajo: "Influence of Furfural on the
Recombinant Zymomonas mobilis Strain CP4 (pZB5) for Ethanol Production" de la Universidad de
Colorado y sirvieron de justificativo para algunas conclusiones de esta monografía.
1. Descripción de la Metodología del ensayo
El ensayo se realizo por duplicado durante 40 horas con concentraciones iniciales de glucosa y xilosa
de 10 g/l en fermentadores de 500 ml, con volumen útil del 40 % y temperatura de 30 ºC.
El medio fue enriquecido con (NH4)2SO4 (1 g/l en un medio que contenia 10 g/l glucosa y 10 g/l
xilosa); KH2PO4 (2 g/l); MgSO4.7H2O (1 g/l); extracto de levadura (10 g/l). También se esterilizo en
autoclave a 121°C ( 2 atmosferas de presión) por 15 minutes. Después de la esterilización se agrego
tetraciclina 10 mg/l , en condiciones asépticas.
Para este ensayo se realizo un blanco, el cual no contenía furfural (fig 1) y estuvo expuesto a las
mismas condiciones físicas que los fermentadores que poseían el tóxico.
Las muestras se tomaron en intervalos regulares para la medición de OD (absorbancia) y filtradas
(Whatman Syringe filters, Fisher Scientific, pore size 0.2 µm, Nylon) para los análisis de xilosa,
glucosa, etanol y furfural.
La evolución de las concentración de la biomasa se realizo con espectrofotómetro a 600 nm y
llevadas a la curva de calibración para referirlas a peso seco celular (DCW) (Gutierrez-Padilla et al,
2005).
2. Control de la Fermentación
En la figura 1 se observan los reactivos y productos principales de la fermentación (eje principal)
además se observa la biomasa cuando no hay furfural en el medio (blanco) . En las Fig 2 y Fig 3 se
presentan la evolución de la fermentación para dos concentraciones de furfural.
Los puntos corresponden a datos experimentales mientras que las líneas a modelos propuestos que
simulan la cinética de conversión de reactivos a producto o biomasa.
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
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Fig 1. Blanco de cofermentación de glucosa y xilosa
Fig 2. Cofermentación con 0.45 g/l de furfural
Fig 3. Cofermentación con 1.9 g/L de furfural
En la Fig 4 se observa la producción de biomasa a tres concentraciones de furfural diferentes. Se
observa que a concentraciones de 0.475 g/l inhibe el crecimiento de la biomasa en el tanque de
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25
Bio
ma
ss, Fu
rfu
ral (g
L-1
)
Glu
co
se, X
ilo
se, E
tha
no
l (g
L-1
)
Time (h)
Control Fermentation
Glucose
Xylose
Ethanol
Biomass
Furfural
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25
Bio
ma
ss, Fu
rfu
ra (
gL
-1)
Glu
co
se, X
ilo
se, E
tha
no
l (g
L-1
)
Time (h)
Fermentation (Furfural: 0.475 gL-1) Glucose
Xylose
Ethanol
Biomass
Furfural
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25
Bio
ma
ss, F
urf
ura
l (g
L-1
)
Glu
cose
, Xil
ose
, Eth
an
ol (
gL
-1)
Time (h)
Fermentation (Furfural: 1.9 gL-1)
Glucose
Xylose
Ethanol
Biomass
Furfural
Control de Calidad en la producción de Bioetanol a partir de material lignocelulósico 2014
70
fermentación (fig 2.3.4) lo cual provoca una disminución en la producción de bioetanol, esto puede
observarse en las siguientes figuras que contiene datos experimentales de la cofermentación de
pentosas y hexosas.
Fig 4. Producción de biomasa
3. Resultados del ensayo
Los resultados que se obtuvieron de este ensayo se presentan en la tabla 1.
Tabla 1. Disminución de los rendimientos de etanol y biomasa.
Variables de seguimiento Concentración de Furfural [g/]
0.45 1.9
Biomasa (w/v) -30 % -60%
Producción de etanol (v/v) -19 % -76%
4. Conclusiones
La bacteria consume a mayor velocidad la glucosa que la xilosa.
La concentración de biomasa es la más afectada por el inhibidor.
La concentración de biomasa y producción de etanol se ven disminuidas por la presencia de
furfural.
La concentración de furfural disminuye en la fermentación, por lo que este podría estar
degradándose en estas condiciones del proceso
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0 5 10 15 20 25 30
Bio
ma
ss (
gL-
1)
Time(h)
Biomass Production Biomass (Furfural: 0 gL-1)
Biomass (Furfural: 0.475 gL-1)
Biomass (Furfural 1.9 gL-1)