UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE
PAOLA DE SOUZA SANCHES
DESENVOLVIMENTO DE FORMULAÇÕES COSMÉTICAS CONTENDO PIGMENTO NATURAL OBTIDO DE Arthrospira
platensis E AVALIAÇÃO DO EFEITO NA FIBRA CAPILAR ANTES E APÓS IRRADIAÇÃO ULTRAVIOLETA
NITERÓI, RJ
2019
PAOLA DE SOUZA SANCHES
DESENVOLVIMENTO DE FORMULAÇÕES COSMÉTICAS
CONTENDO PIGMENTO NATURAL OBTIDO DE
Arthrospira platensis E AVALIAÇÃO DO EFEITO NA
FIBRA CAPILAR ANTES E APÓS IRRADIAÇÃO
ULTRAVIOLETA
Dissertação apresentada ao Curso
de Pós-Graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde da
Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal Fluminense,
como requisito parcial à obtenção do
título de mestre.
Orientadora: Prof ª. Dr ª Deborah Quintanilha Falcão
Co-orientadora: Prof ª. Dr ª Katia Gomes de Lima Araújo
NITERÓI, RJ
2019
Ficha catalográfica automática - SDC/BFFGerada com informações fornecidas pelo autor
Bibliotecária responsável: Marcos Vinicius Mendonça - CRB7/4773
S211d Sanches, Paola Desenvolvimento de formulações cosméticas contendopigmento natural obtido de Arthrospira platensis e avaliaçãodo efeito na fibra capilar antes e após irradiaçãoultravioleta / Paola Sanches ; Deborah Falcão, orientadora ;Katia Araújo, coorientadora. Niterói, 2019. 106 f. : il.
Dissertação (mestrado)-Universidade Federal Fluminense,Niterói, 2019.
DOI: http://dx.doi.org/10.22409/PPG-CAPS.2019.m.13501633769
1. Cosmético capilar. 2. Fotoprotetor. 3. Antioxidante. 4.Pigmento natural. 5. Produção intelectual. I. Falcão,Deborah, orientadora. II. Araújo, Katia, coorientadora. III.Universidade Federal Fluminense. Faculdade de Farmácia. IV.Título.
CDD -
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por iluminar meu caminho e me guiar durante esta
trajetória.
Dedico este trabalho aos meus pais, José Válter Sanches Lopes e Márcia Cristina de
Souza Sanches e meus irmãos Ramon e Breno de Souza Sanches, que sempre foram
meu refúgio nos momentos difíceis e me deram o incentivo e a força necessária para
acreditar nos meus sonhos e chegar até aqui. Sou grata por todo o cuidado, carinho
e amor que recebo continuamente de vocês.
Agradeço especialmente à minha orientadora, Profa. Dra. Deborah Quintanilha Falcão,
por me receber gentilmente em seu laboratório e compartilhar comigo seu
conhecimento e experiência, tornando possível a execução e conclusão desse
trabalho. Sua amizade e compreensão, mesmo à distância, foram de extrema
importância. Tens minha gratidão e admiração.
À Profa. Dra. Katia Gomes de Lima Araújo pela co-orientação, confiança e apoio e por
estar sempre presente nos momentos tortuosos, com seu incentivo e valiosas
contribuições.
Ao Prof. Dr. Israel Felzenszwalb por ter me recebido em seu laboratório e me
concedido o espaço e o material necessário para os ensaios toxicológicos e de
radiação UV, e à toda a equipe do Laboratório de Mutagênese Ambiental – LABMUT
(UERJ): Carlos, Rafael, Carine, Alana e Eduardo pelo acolhimento e auxílio. Agradeço
especialmente à Andréia Campos pelos seus ensinamentos, atenção e compreensão.
Sem vocês esse trabalho não seria possível.
À Profa. Dra. Bianca Ortiz por disponibilizar o MEV para o estudo da morfologia capilar,
acessível no Laboratório de Biotecnologia (UFRJ) em Xerém, e ao técnico Bruno pelo
encorajamento e obtenção das imagens.
À Profa. Dra. Samanta Cardozo Mourão, revisora deste trabalho, pela sua amizade e
carinho, além das sábias instruções.
Ao Prof. Dr. Leandro Machado Rocha e à toda a equipe do Laboratório de Tecnologia
de Produtos Naturais - LTPN (UFF), principalmente Francisco, Ricardo e Renan, não
apenas pelo auxílio e disponibilização do espectrofotômetro e dos materiais
necessários para o ensaio antioxidante, mas principalmente pela amizade, conselhos
e momentos de entretenimento.
Ao Prof. Deo Anselmo do Laboratório de Cosméticos (UFF) pelo empréstimo da
centrífuga, sem a qual não seria possível a recuperação da biomassa para a
realização desse trabalho.
À minha amiga, Mariana Nunes pelos conselhos e pela doação do cabelo preto
utilizado nos ensaios.
Agradeço ao meu amigo e namorado Henryque Rocca pelo incentivo, acolhimento e
compreensão nos momentos difíceis.
À Universidade Federal Fluminese e ao Programa de Pós Graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde – PPGCAPS (UFF), seus docentes, discentes e
funcionários, pela possibilidade de realização do curso.
Agradeço também aos membros da banca, professores Dr. Bryan Hudson Hossy e
Dra. Elisabete Pereira dos Santos, por aceitarem o convite de participação e pelo
interesse no aprimoramento do trabalho.
À CAPES e FAPERJ pelo apoio financeiro.
E a todos que contribuíram direta ou indiretamente para o sucesso deste trabalho.
Muito obrigada!
RESUMO
Embora não possua função vital, o cabelo apresenta grande impacto na
aparência pessoal e na autoestima dos indivíduos. A radiação ultravioleta presente
na luz solar, é capaz de causar danos à fibra capilar, tornando-a mais porosa e
ressecada, alterando seu brilho, cor e flexibilidade. Tais danos podem ser evitados
pela atividade antioxidante desempenhada por algumas moléculas, que impedem a
formação de radicais livres e ajudam na reparação dos danos oxidativos. A
cianobactéria A. platensis, um microorganismo marinho verde-azulado, é rico em
ficobiliproteínas e β-caroteno, conhecidos por possuir alta capacidade antioxidante. O
objetivo desse estudo foi desenvolver uma formulação cosmética capilar contendo
ficobiliproteínas extraídas da A. platensis e avaliar seu efeito na fibra capilar natural e
descolorida, antes e após irradiação ultravioleta. As concentrações de
ficobiliproteínas estimadas no extrato foram de 2,24 mg/mL de ficocianina e 1,00
mg/mL de aloficocianina. Uma formulação em gel, utilizando hidroxietilcelulose (2,0%
p/p) como agente gelificante, foi desenvolvida contendo 0,5% (p/p) do extrato. Sua
capacidade antioxidante foi avaliada pelo método de captura do radical livre DPPH,
apresentando CE50 = 0,75 mg/mL, enquanto o extrato liofilizado apresentou CE50 =
2,35 µg/mL. A formulação apresentou proteção estatisticamente significativa contra
mutação e fotomutação frente às cepas TA102 e TA104, pelo método de Ames e
fotoAmes, respectivamente. Após 23 ciclos de exposição à radiação UV, a morfologia
da fibra capilar foi analisada por microscospia eletrônica de varredura com captura de
imagem. A composição química foi avaliada por ATR-FTIR, o conteúdo protéico pelo
método de Kjedahl e a variação de cor por espectrofotometria usando o sistema
CIELab. O cabelo tratado com o gel contendo o extrato apresentou cutícula
predominantemente íntegra e com células justapostas, mesmo após irradiação UV.
Além disso, não foram observadas alterações significativas na coloração ou na
composição das mechas tratadas com a formulação desenvolvida e comparadas com
o controle (cabelo não irradiado). Tais resultados demonstram segurança e atividade
protetora contra a radiação UV no cabelo, podendo ser úteis no desenvolvimento de
futuros protetores solares contendo produtos naturais.
Palavras chaves: Arhrospira platensis, antioxidante, tratamento capilar, irradiação
ultravioleta, ficobiliproteína, cosmético.
ABSTRACT
Although hair has no vital function, it has a great impact on appearance and self-
esteem. The sunlight ultraviolet radiation is capable of damage the hair fiber, making
it more porous and dry, changing its brightness, color and flexibility. Such damage can
be avoided by antioxidant activity performed by some molecules, which prevents free
radicals formation and helps repair oxidative damage. The cyanobacterium A.
platensis, a blue-green marine microorganism, is rich in phycobiliproteins and β-
carotene, known due its antioxidant capacity. The objective of this study was to
develop a hair cosmetic formulation containing phycobiliproteins extracted from A.
platensis and to evaluate its effect on the natural and bleached hair, before and after
ultraviolet irradiation. The estimated phycobiliprotein concentrations in the extract
were 2.24 mg/mL of phycocyanin and 1.00 mg/mL of allophycocyanin. A gel
formulation using hydroxyethylcellulose (2,0% w/w) as a gelling agent was developed
containing 0.5% (w/w) of the extract. Its antioxidant capacity was evaluated by DPPH
free radical capture method, presenting EC50 = 0.75 mg/mL, while the lyophilized
extract showed EC50 = 2.35 μg/mL. The formulation showed statistically significant
protection against mutation and photomutation using TA102 and TA104 strains, by
Ames and photo-Ames methods, respectively. After 23 cycles of UV exposure, hair
fiber morphology was analyzed by scanning electron microscopy with image capture.
Hair chemical composition was evaluated by ATR-FTIR, the protein content by Kjedahl
method and the color variation by spectrophotometry using the CIELab system. Hair
treated with gel containing the extract showed cuticle mostly intact and overlapping
cells, even after UV irradiation. In addition, no significant changes were observed in
hair color or chemical composition after treatment with the developed formulation and
compared with control (hair non irradiated). Such results demonstrate safety and
protective activity against UV radiation in hair, beeing useful in the development of
futures hair sunscreens containing natural products.
Keywords: Arthrospira platensis, antioxidant, hair treatment, ultraviolet irradiation,
phycobiliprotein, cosmetic.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: (A) Estrutura do folículo capilar sob a pele; (B) Estrutura e principais partes do fio
de cabelo externo à pele (OLIVEIRA et al., 2014). ................................................................ 5
Figura 2: Estrutura do fio de cabelo (DOLIJAL, 2016). ......................................................... 6
Figura 3: Micrografia eletrônica de varredura do córtex do cabelo (SCANAVEZ, 2001). ...... 7
Figura 4: Esquema representativo de um melanócito (TOLEDO, 2004). .............................. 8
Figura 5: Estruturas químicas das moléculas de (A) eumelanina e (B) feomelanina
(OLIVEIRA et al., 2014). ....................................................................................................... 9
Figura 6: Imagens de MEV de cutícula de (a) controle e (b) fios de cabelo irradiados,
mostrando aumento da rugosidade da superfície, bordas recortadas e esfoliação da cutícula
(FEDORKOVA, 2016). ........................................................................................................ 14
Figura 7: Arthrospira platensis, aumento de 200x e 400x (BARROS, 2010). ...................... 25
Figura 8: Distribuição de patentes de acordo com a área de aplicação de biomassa de
Spirulina (MENDONÇA; DRUZIAN; NUNES, 2012). ........................................................... 26
Figura 9: Estrutura química do pigmento ficocianobilina (adaptado de SPOLAORE et al.,
2006). ................................................................................................................................. 28
Figura 10: Cultivo de Arthrospira platensis em meio Zarrouk ............................................. 34
Figura 11: Biomassa obtida por filtração a vácuo, após 21 dias de cultivo da cianobactéria
A. platensis (A), e diluída em tubo de centrífuga (B). .......................................................... 35
Figura 12: Placas incubadas em estufa a 37ºC para teste de Ames. ..... Erro! Indicador não
definido.
Figura 13: Teste de viabilidade das células bacterianas (FERRAZ, 2015). ........................ 45
Figura 14: Esquema de limpeza das mechas de cabelo. ................................................... 47
Figura 15: Coordenadas do espaço de cor L*, a*, b* do sistema CIE-Lab de cores
oponentes onde L* é a coordenada de luminosidade, a* é a coordenada vermelho-verde e
b*, a coordenada amarelo-azul (Adaptado de U.S. Department of Transportation, 2013). .. 51
Figura 16: Espectro de varredura no UV-visível (200 – 750 nm) do extrato de
ficobiliproteínas obtido da Arthrospira platensis, em destaque o pico característico da
ficocianina (FC) em 620 nm. ............................................................................................... 54
Figura 17: Zona de microemulsão delimitada nos diagramas de fase pseudoternários A
(PEG 40 óleo de rícino hidrogenado / Monooleato de sorbitano (1:3), B (PEG 40 óleo de
rícino hidrogenado / Monooleato de sorbitano 1:1), C (Polissorbato 80 / Monooleato de
sorbitano 1:3), D (Polissorbato 80 / Monooleato de sorbitano 1:1) e E (Polissorbato 80 /
Monooleato de sorbitano 3:1). ............................................................................................. 55
Figura 18: Microemulsões M1, M2 e M3 contendo 0,5% (p/p) de extrato, após 48 horas em
temperatura ambiente. ........................................................................................................ 57
Figura 19: (A) Gel branco de hidroxietilcelulose (GB) e (B) gel de hidroxietilcelulose
contendo 0,5% (p/p) de extrato de A. platensis (GFC). ....................................................... 58
Figura 20: Gráfico de viscosidade x velocidade do gel branco (GB) após 2, 15, 30 e 60 dias
de preparo. ......................................................................................................................... 59
Figura 21: Gráfico de viscosidade x velocidade do gel contendo 0,5% (p/p) de extrato de A.
platensis (GFC) após 2, 15, 30 e 60 dias de preparo. ......................................................... 59
Figura 22: Comparação entre as varreduras, obtidas por espectrofotometria no UV-vis (200-
800 nm), para os géis de hidroxietilcelulose contendo 0,5% (p/p) de extrato de A. platensis
nos dias 2 (azul escuro), 15 (rosa), 30 (roxo) e 60 (azul claro) após o preparo. .................. 61
Figura 23: Inibição do radical DPPH pelo Trolox® (controle)............................................... 62
Figura 24: Inibição do radical DPPH pelo BHT (controle). .................................................. 62
Figura 25: Inibição do radical DPPH pelo extrato aquoso rico em FC, obtido de A. platensis.
........................................................................................................................................... 63
Figura 26: Inibição do radical DPPH pelo gel 0,5% (p/p) de extrato aquoso de A. platensis.
........................................................................................................................................... 63
Figura 27: Gráfico da relação dose-resposta do gel contendo 0,5 % (p/p) de extrato de A.
platensis no ensaio de Salmonella/microssoma usando a linhagem TA102 de S.
thyphimurium. *p < 0,05 relativo ao controle negativo por ANOVA e Tukey’s HSD; MTC =
Mitomicina C (0,5 µg/placa)................................................................................................. 67
Figura 28: Gráfico da relação dose-resposta do gel contendo 0,5 % (p/p) de extrato de A.
platensis no ensaio de Salmonella/microssoma usando a linhagem TA104 de S.
thyphimurium. *p < 0,05 relativo ao controle negativo por ANOVA e Tukey’s HSD; MTC =
Mitomicina C (0,5 µg/placa)................................................................................................. 67
Figura 29: Gráfico da relação dose-resposta do gel contendo 5,0 % (p/p) de extrato de A.
platensis no ensaio de Salmonella/microssoma após irradiação UVA de 0,04 J/cm² usando a
linhagem TA102 de S. thyphimurium. *p < 0,05 relativo ao controle negativo por ANOVA e
Tukey’s HSD; 8-MOP = 8-metoxipsoraleno (10 µg/placa). .................................................. 69
Figura 30: Gráfico da relação dose-resposta do gel contendo 5,0 % (p/p) de extrato de A.
platensis no ensaio de Salmonella/microssoma após irradiação UVA de 0,04 J/cm² usando a
linhagem TA104 de S. thyphimurium. *p < 0,05 relativo ao controle negativo por ANOVA e
Tukey’s HSD; BZE = Benzofenona-3 (400 µg/placa). .......................................................... 69
Figura 31: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) não tratada e não irradiada, submetida a 23 ciclos de lavagem com LSS (2%). O
retângulo em (I) destaca uma área de extensa descamação cuticular; as setas em (II)
indicam cutículas com bordas irregulares. .......................................................................... 71
Figura 32: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) não tratada (ST) e submetida a 23 ciclos de radiação UVA. A seta em (II) indica cutícula
parcialmente retirada. ......................................................................................................... 72
Figura 33: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) não tratada (ST) e submetida a 23 ciclos de radiação UVB. As setas indicam cutículas
levantadas; C indica o córtex e E a endocutícula. ............................................................... 73
Figura 34: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação GFC e não irradiadas, submetidas a 23 ciclos de lavagem. 73
Figura 35: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação GFC e submetidas a 23 ciclos de radiação UVA. As setas
indicam cutículas com bordas irregulares ........................................................................... 74
Figura 36: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação GFC e submetidas a 23 ciclos de radiação UVB. As setas
indicam cutículas com bordas irregulares. .......................................................................... 75
Figura 37: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação GB e não irradiadas, submetidas a 23 ciclos de lavagem. .. 75
Figura 38: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação GB e submetidas a 23 ciclos de radiação UVA. As setas
indicam áreas de exposição da endocutícula e C do córtex. ............................................... 76
Figura 39: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação GB e submetidas a 23 ciclos de radiação UVB. As setas
indicam áreas de exposição da endocutícula e C do córtex. ............................................... 76
Figura 40: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação CP e não irradiadas, submetidas a 23 ciclos de lavagem. As
setas indicam cutículas lentadas. ........................................................................................ 77
Figura 41: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação CP e submetidas a 23 ciclos de radiação UVA. A seta indica
a endocutícula e C o córtex................................................................................................. 78
Figura 42: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação CP e submetidas a 23 ciclos de radiação UVB. As setas
indicam cutículas levantadas; E indica a endocutícula. ....................................................... 78
Figura 43: Espectro ATR-FTIR das mechas de cabelo preto natural não irradiadas sem
tratamento (STN - cinza), tratada com gel branco (GBN – rosa), com gel com 0,5% (p/p) de
extrato de A. platensis (GFCN – verde) e com filtro solar (CPN – azul) após 23 ciclos. ...... 81
Figura 44: Espectro ATR-FTIR das mechas de cabelo preto natural irradiadas com radiação
UVA sem tratamento (STA - cinza), tratada com gel branco (GBA – rosa), com gel com
0,5% (p/p) de extrato de A. platensis (GFCA – verde) e com filtro solar (CPA – azul) após 23
ciclos. .................................................................................................................................. 81
Figura 45: Espectro ATR-FTIR das mechas de cabelo preto natural irradiadas com radiação
UVB sem tratamento (STB - cinza), tratada com gel branco (GBB – rosa), com gel com
0,5% (p/p) de extrato de A. platensis (GFCB – verde) e com filtro solar (CPB – azul) após 23
ciclos. .................................................................................................................................. 82
Figura 46: Espectro ATR-FTIR das mechas de cabelo descolorido não irradiadas sem
tratamento (STN - cinza), tratada com gel branco (GBN – rosa), com gel com 0,5% (p/p) de
extrato de A. platensis (GFCN – verde) e com filtro solar (CPN – azul) após 23 ciclos. ...... 82
Figura 47: Espectro ATR-FTIR das mechas de cabelo descolorido irradiadas com radiação
UVA sem tratamento (STA - cinza), tratada com gel branco (GBA – rosa), com gel com
0,5% (p/p) de extrato de A. platensis (GFCA – verde) e com filtro solar (CPA – azul) após 23
ciclos ................................................................................................................................... 83
Figura 48: Espectro ATR-FTIR das mechas de cabelo descolorido irradiadas com radiação
UVB sem tratamento (STB - cinza), tratada com gel branco (GBB – rosa), com gel com
0,5% (p/p) de extrato de A. platensis (GFCB – verde) e com filtro solar (CPB – azul) após 23
ciclos. .................................................................................................................................. 83
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Composição do meio Zarrouk para cultivo de A. platensis. ................................. 33
Tabela 2: Componentes utilizados nos diferentes diagramas ternários desenvolvidos e seus
respectivos valores de equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL). ..................................................... 37
Tabela 3: Componentes e percentuais das concentrações empregadas para a preparação
do hidrogel. ......................................................................................................................... 38
Tabela 4: Efeito eritematogênico (EE) versus intensidade do Sol (I) em função do
comprimento de onda (𝛌) pré-definindos por Mansur (1984) para o cálculo do FPS in vitro.
........................................................................................................................................... 42
Tabela 5: Características genéticas das linhagens de Salmonella typhimurium e controles
positivos (mutágenos ou fotoprotetores) utilizados para cada fenótipo................................ 43
Tabela 6: Descrição dos grupos de mechas de cabelo humano. ........................................ 46
Tabela 7: Valores das principais bandas encontradas na fibra capilar obtidos por FTIR
(MONTEIRO, 2003). ........................................................................................................... 49
Tabela 8: Resultados da variação intrínseca de cor obtida para as mechas utilizadas neste
trabalho. .............................................................................................................................. 52
Tabela 9: Estimativa da concentração (mg/mL) de cada ficobiliproteína presente no extrato
aquoso de A. platensis. ....................................................................................................... 53
Tabela 10: Microemulsões desenvolvidas com óleo de coco e Polissorbato 80 / Monooleato
de sorbitano (3:1). ............................................................................................................... 56
Tabela 11: Concentração de Ficocianina (FC) (mg/L) nas formulações em gel contendo
0,5% (p/p) de extrato de A. platensis, após 2, 15, 30 e 60 dias de preparo. ........................ 61
Tabela 12: Taxa de reversão espontânea, em número de colônias revertentes/placa,
esperada para as cepas de S. typhimurium (TA102 e TA104) utilizadas neste trabalho
(MORTELMNS, ZEIGER, 2000). ......................................................................................... 66
Tabela 13: Determinação de proteína total em mechas de cabelo preto natural, após 23
ciclos de lavagem e/ou exposição à radiação UV. .............................................................. 84
Tabela 14: Determinação de proteína total em mechas de cabelo descolorido, após 23
ciclos de lavagem e/ou exposição à radiação UV. .............................................................. 85
Tabela 15: Valores dos parâmetros de diferença de cor (CIELab) obtidos para as mechas
de cabelo preto natural após 23 ciclos de tratamento e/ou exposição à radiação UV. ........ 86
Tabela 16: Valores dos parâmetros de diferença de cor (CIELab) obtidos para as mechas
de cabelo descolorido após 23 ciclos de tratamento e/ou exposição à radiação UV. .......... 87
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
8-MOP – 8-metoxipsoraleno
abs – Absorbância
AFC – Aloficocianina
ANOVA – Análise de variância
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
atm - atmosférico
ATR-FTIR – Espectroscopia de reflectância total atenuada na região do
infravermelho com transformada de Fourier
BHT – Butilhidroxitolueno
BZE – Benzofenona-3
CE50 – Concentração efetiva média
CIE – Comissão Internacional de Iluminação
CIELab – Sistema de cor proposto pela Commision Internationale L’Éclairge
CoTA – Cotensoativo
DNA – Ácido desoxirribonucleico
DPPH – 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
EHL – Equilíbrio Hidrófilo Lipófilo
EHMC – Etilhexil metoxicinamato
ERD – Espectrofotometria de reflectância difusa
ERO – Espécies Reativas de Oxigênio
FB – Ficobiliproteína
FC – Ficocianina
FE – Ficoeritrina
FPS – Fator de Proteção Solar
GPX – Glutationa peroxidase
GST – Glutationa S-transferase
IARC – International Agency of Research on Cancer
IM – Índice de mutagenicidade
INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, normalização e qualidade industrial
IV – Infravermelho
LSS – Lauril sulfato de sódio
MAA – Mycosporine-like amino acids
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
MTC – Mitomicina C
NADPH – Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato
NASA – National Aeronautics and Space Administration
OECD – Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico
p/p – Peso por peso
p/v – Peso por volume
pH – Potencial Hidrogeniônico
RDC – Resolução da Diretoria Colegiada
rpm – Rotações por minuto
SOD – Superóxido dismutase
TA – Tensoativo
TA/CoTA – Tensoativo/cotensoativo
UFC – Unidade Formadora de Colônia
UV – Ultravioleta
UVA – Radiação ultravioleta tipo A
UVB – Radiação ultravioleta tipo B
UVC – Radiação ultravioleta tipo C
UV-Vis – Ultravioleta visível
Sumário
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 01
2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 03
2.1. Objetivo Geral ......................................................................................................... 03
2.2. Objetivos Específicos ............................................................................................ 03
3. REFERENCIAL TEÓRICO .......................................................................................... 04
3.1. Cabelos ................................................................................................................... 04
3.1.1. Morfologia e estrutura química .......................................................................... 04
3.1.2. Pigmentação natural dos cabelos ..................................................................... 08
3.1.3. Oxidação Química ............................................................................................... 09
3.2. Influência dos cabelos na autoestima .................................................................. 11
3.3. Radiação UV-Vis e a saúde do cabelo .................................................................. 12
3.4. Cosméticos ............................................................................................................. 14
3.4.1. Testes de mutagenicidade .............................................................................. 15
3.4.2. Cosméticos capilares ...................................................................................... 17
3.4.3. Produtos antienvelhecimento ........................................................................ 19
3.4.4. Fotoprotetores capilares................................................................................. 20
3.4.5. Utilização de organismos marinhos em cosméticos ........................................ 22
3.5. Arthrospira platensis ............................................................................................. 24
4. METODOLOGIA .......................................................................................................... 29
4.1. Materias-primas e reagentes ................................................................................. 29
4.1.1. Microorganismo .................................................................................................. 31
4.1.2. Cabelo .................................................................................................................. 31
4.1.3. Protetor solar para cabelos ................................................................................ 31
4.2. Equipamentos e acessórios .................................................................................. 31
4.3. Métodos .................................................................................................................. 32
4.3.1. Cultivo de Arthrospira platensis ........................................................................ 32
4.3.2. Obtenção do pigmento natural Ficocianina (FC) .............................................. 34
4.3.3. Preparação das microemulsões ........................................................................ 36
4.3.4. Preparação do gel de hidroxietilcelulose .......................................................... 37
4.3.5. Desenvolvimento das formulações contendo extrato e avaliação da
estabilidade ...................................................................................................................... 38
4.3.6. Avaliação da capacidade antioxidante .............................................................. 40
4.3.7. Determinação in vitro do fator de proteção solar (FPS) ................................... 41
4.3.8. Ensaios toxicológicos: Testes de mutagenicidade e de fotomutagenicidade
utilizando Salmonella ....................................................................................................... 42
4.3.9. Tratamento da fibra capilar ................................................................................ 45
4.3.10. Exposição das mechas à radiação UV ........................................................... 48
4.3.11. Caracterização capilar .................................................................................... 48
4.3.12. Análise Estatística ........................................................................................... 52
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 53
5.1. Determinação da biomassa e do conteúdo de ficobiliproteínas (FB) ................. 53
5.2. Desenvolvimento das formulações microemulsionadas..................................... 54
5.3. Incorporação do pigmento nas microemulsões .................................................. 56
5.4. Incorporação do pigmento no gel ......................................................................... 57
5.5. Avaliação da estabilidade ...................................................................................... 58
5.6. Determinação da capacidade antioxidante........................................................... 62
5.7. Determinação do FPS in vitro ................................................................................ 64
5.8. Ensaios toxicológicos de mutagenicidade e fotomutagenicidade ..................... 65
5.9. Morfologia das fibras capilares ............................................................................. 70
5.10. Avaliação da composição química dos fios após tratamento e irradiação UV .. 79
5.11. Determinação do teor de proteínas nas fibras capilares ..................................... 84
5.12. Variação de cor das mechas capilares .............................................................. 85
6. CONCLUSÕES............................................................................................................ 88
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 90
1
1. INTRODUÇÃO
O cabelo é uma fibra natural constituída por várias camadas sobrepostas de
células mortas, compostas majoritariamente por queratina. A cutícula é a camada
mais externa do fio e a principal responsável pela aparência saudável do cabelo. A
disposição justaposta das células nessa camada permite a reflexão da luz e limita a
fricção entre os fios, proporcionando uma aparência macia e brilhosa (BARATA,
2002). Embora não possua função vital, a aparência do cabelo desempenha
importante papel na autoestima dos indivíduos, com grande impacto psicológico e de
inserção social (CORRAL, 2017).
A radiação UV, presente na luz solar, causa danos à fibra capilar devido a
decomposição de ligações dissulfeto e formação de Espécies Reativas de Oxigênio
(ERO), ocasionando redução da resistência mecânica, mudanças na cor e nas
propriedades sensoriais, ressecamento, aumento da porosidade e perda da
flexibilidade (DARIO, 2015; FERNANDÉZ et al., 2012). Com a crescente
conscientização dos riscos advindos da exposição à radiação UV, deu-se um
aumento da produção e do consumo de produtos de proteção solar em todo o
mundo. Neste contexto, os fotoprotetores de origem natural são de grande interesse,
uma vez que as substâncias químicas sintéticas comumente usadas para este fim
podem ter efeitos nocivos, não só para o consumidor, mas também para o meio
ambiente (CORINALDESI et al., 2017). A utilização de moléculas com propriedades
antioxidantes poderia evitar danos causados pela radiação UV, além de combater o
envelhecimento capilar, por impedir a formação de radicais livres, interromper a
reação em cadeia gerada por eles e ajudar na reparação dos danos oxidativos
(FERNANDÉZ et al., 2012).
A cianobactéria Arthrospira platensis é um microorganismo marinho verde-
azulado, conhecido devido ao seu alto teor protéico e de pigmentos, possuindo alta
capacidade antioxidante (CORINALDESI et al., 2017; WANG, 2015). Dentre os
pigmentos encontram-se as ficobiliproteínas (FB), complexos pigmento-proteína com
cor intensa, que têm despertado grande interesse nas áreas de alimentos,
farmacêutica e cosmética (NUHU, 2013).
2
Sendo assim, com o intuito de desenvolver uma formulação cosmética capilar
contendo um pigmento natural com conhecida ação antioxidante, o presente estudo
teve como objetivo desenvolver uma formulação contendo ficocianina (FC)
(ficobiliproteína extraída de Arthrospira platensis) e avaliar o efeito na fibra capilar,
antes e após irradiação ultravioleta.
3
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Desenvolver uma formulação para cabelos contendo o pigmento natural
ficocianina extraído de Arthrospira platensis e avaliar o efeito na fibra capilar antes e
após irradiação ultravioleta.
2.2. Objetivos Específicos
● Extrair e quantificar as ficobiliproteínas produzidas pela cianobactéria
Arthrospira platensis;
● Desenvolver uma formulação cosmética para uso capilar contendo o extrato;
● Avaliar a estabilidade da formulação desenvolvida;
● Avaliar o potencial antioxidante do extrato de A. platensis e da formulação
desenvolvida pelo método do DPPH;
● Determinar o fator de proteção solar (FPS) in vitro da formulação
desenvolvida contendo o extrato;
● Estudar os efeitos do produto na fibra capilar antes e após irradiação
ultravioleta quanto ao teor protéico, caracterização física, química e
morfologia;
● Avaliar a segurança da formulação desenvolvida em modelo in vitro utilizando
o ensaio de mutagenicidade de Salmonella/microssoma (Teste de Ames) e
fotomutagenicidade (FotoAmes).
4
3. REFERENCIAL TEÓRICO
3.1. Cabelos
3.1.1. Morfologia e estrutura química
O cabelo é uma fibra natural, elástica e muito resistente. Trata-se de um
apêndice que deriva da epiderme, constituído entre 65 a 95% por queratina sendo o
restante, água, lipídios e pigmentos, e pode ser dividido em duas partes principais:
haste (a porção visível que se projeta da superfície da pele) e raiz (que está inserida
na pele). A raiz provém de uma invaginação tubular da epiderme conhecida como
folículo piloso (BERNARD, 2002; BHUSHAN, 2010). Abaixo do bulbo piloso fica a
papila, uma camada germinativa, onde ocorre a regeneração do pelo e o seu
crescimento (BARATA, 2002; BOLDUC; SHAPIRO, 2001). Além disso, todos os
folículos pilosos apresentam em anexo uma glândula sebácea, que produz o sebo
envolvido na manutenção da barreira protetora, no odor corporal, na diferenciação
da epiderme e na proteção contra a radiação ultravioleta (GIMIER; JUEZ, 2005;
THIBOUTOT et al., 2003; ZOUBOULIS, 2003).
A haste do cabelo é uma formação epitelial córnea com várias camadas
sobrepostas de células mortas, preenchidas essencialmente por α-queratina. Esta
proteína está disposta em cadeias polipeptídicas helicoidais e é formada por elevada
proporção de cistina insolúvel, estabilizada física e quimicamente por ligações
dissulfeto, ligações de hidrogênio e interações de van der Walls hidrofóbicas e
salinas (SCHUELLER; ROMANOWSKI, 2005; BOLDUC; SHAPIRO, 2001). Estas
células compõem três camadas: cutícula, córtex e, em alguns casos, medula na
região central (Figura 1) (BHUSHAN, 2010; BARATA, 2002; MARIEB; HOEHN,
2007).
5
Figura 1: (A) Estrutura do folículo capilar sob a pele; (B) Estrutura e principais partes do fio
de cabelo externo à pele (OLIVEIRA et al., 2014).
A cutícula é a região mais externa do fio e é composta por 6 a 10 camadas de
células alongadas, sobrepostas longitudinal e circunferencialmente, translúcidas,
sem pigmentos e totalmente queratinizadas. Ela protege as células corticais e regula
o ingresso e o egresso de água, o que permite manter as propriedades físicas da
fibra (BARATA, 2002; BHUSHAN, 2010; BOLDUC, SHAPIRO, 2001). Em uma
cutícula saudável, as células estão justapostas ao eixo do cabelo, tendo por isso
uma aparência macia, que permite a reflexão da luz e limita a fricção entre os fios.
Portanto, a cutícula é responsável pelo brilho e pela textura do cabelo. Porém, em
um cabelo danificado, esta superfície apresenta-se áspera e com irregularidades,
devido às cargas elétricas negativas que se acumulam e fazem levantar as células
(frizz estético) (BARATA, 2002).
A cutícula pode ser dividida em quatro subunidades com composições
químicas distintas (Figura 2). A endocutícula, porção mais interna e hidrofílica da
cutícula, é composta por material não-queratinoso, como aminoácidos,
especialmente lisina, arginina, ácido aspártico e ácido glutâmico. As exocutículas A e
(A)
(B)
6
B são hidrofóbicas e mais reticuladas devido ao maior conteúdo de cistina. A
epicutícula é uma fina membrana hidrofóbica mais externa medindo 2-5 nm e rica
em cistina. Os grupos cistina da epicutícula estão ligados a uma camada de lipídios
(ácido 18-metilenicosanóico), formando uma membrana aproteolipídica que reveste
a cutícula (PÜNTENER, SCHLESINGER, 2000; RICHENA, REZENDE, 2015).
Figura 2: Estrutura do fio de cabelo (DOLIJAL, 2016).
Ao córtex é atribuída a grande resistência dos fios de cabelo (Figura 3). Nele
encontramos quantidades variáveis de grânulos de melanina cujo tipo, tamanho e
quantidade são responsáveis pela coloração dos cabelos e pela sua fotoproteção
natural. Esta camada é composta por células corticais alongadas firmemente
compactadas e preenchidas com filamentos de queratina, que estão orientados
paralelamente à fibra do cabelo (BOLDUC; SHAPIRO, 2001). As queratinas são
proteínas secundárias em forma de espiral, com aproximadamente 1 nm de
diâmetro, produzida pelos queratinócitos e constituída pela mistura de vários
aminoácidos, sendo a cistina o principal deles (ROBBINS, 2002; BHUSHAN, 2010).
Sua estrutura é estabilizada por interações inter- e intracadeias, como pontes de
hidrogênio e dissulfeto. As unidades de cistina podem ligar os filamentos de
queratina adjacentes, através de ligações dissulfeto (-S-S-). Este tipo de ligação forte
forma uma estrutura tridimensional com alto grau de entrecruzamento, que é
7
responsável pela grande estabilidade química e física das fibras de queratina,
contribuindo ainda para a forma e textura do cabelo. A redução destas ligações
causa mudanças nas propriedades mecânicas do fio (SINCLAIR, 2007; BOLDUC;
SHAPIRO, 2001). As pontes dissulfeto permanecem intactas, por exemplo, quando o
cabelo é molhado, permitindo que este retorne à sua forma original. Além destas,
outras ligações mais fracas, tais como as interações de Van de Waals e pontes de
hidrogênio, contribuem para a ligação das cadeias polipeptídicas. No entanto, ao
contrário das anteriores, estas são facilmente quebradas, por exemplo, com o
aquecimento do cabelo (FEUGHELMAN, 1997; SINCLAIR, 2007).
Figura 3: Micrografia eletrônica de varredura do córtex do cabelo (SCANAVEZ,
2001).
A medula pode ou não estar presente nas fibras de cabelo humano. De uma
forma geral, ela não contribui significativamente para a massa do fio do cabelo e
acredita-se que a sua contribuição para as propriedades mecânicas seja
negligenciável, pelo que desempenha um pequeno ou nenhum papel na cosmética
(BOLDUC; SHAPIRO, 2001; BHUSHAN, 2010).
8
3.1.2. Pigmentação natural dos cabelos
A cor do cabelo é determinada pela melanina, que é produzida pelos
melanócitos (Figura 4) presentes na matriz do bulbo capilar, sendo depois
transferida em melanossomas para as células do córtex durante a anagênese (fase
de crescimento) (FITZPATRICK; WOLFF, 2008; HARRISON; SINCLAIR, 2003;
GRAY, 2008).
Figura 4: Esquema representativo de um melanócito (TOLEDO, 2004).
Considera-se que a cor do cabelo resulta da presença de dois tipos principais
de melaninas: as eumelaninas e as feomelaninas (Figura 5). A eumelanina é, em
geral, mais abundante, e é o principal pigmento encontrado nos cabelos
castanhos/pretos. A feomelanina é menos abundante e é o pigmento predominante
nos cabelos louros e ruivos (FITZPATRICK; WOLFF, 2008; HA; REES, 2002).
Assim, a cor natural do cabelo é a consequência das proporções relativas de
eumelanina/feomelanina e da quantidade total de melanina presente no cabelo
(GRAY, 2008).
9
Figura 5: Estruturas químicas das moléculas de (A) eumelanina e (B) feomelanina
(OLIVEIRA et al., 2014).
As melaninas do cabelo fornecem proteção fotoquímica às proteínas
presentes no fio, especialmente frente às radiações de menor comprimento de onda,
pois absorvem as radiações ultravioletas (UV) oxidativas de alta energia e as dissipa
na forma de calor, atuando como filtros solares biológicos. Entretanto, neste
processo os pigmentos são degradados ou descorados (NOGUEIRA; JOEKES,
2004).
O cabelo cinzento ou branco resulta da diminuição da produção de melanina
pelos melanócitos, e é a manifestação mais clássica do envelhecimento (TRUEB,
2006; MARIEB; HOEHN, 2007; GIMIER; JUEZ, 2005). Este processo é quase
sempre irreversível, e os produtos cosméticos procuram combatê-lo das mais
diversas formas (GIMIER; JUEZ, 2005).
3.1.3. Oxidação química do pigmento capilar
A oxidação química (descoloração) provoca o clareamento da cor natural do
cabelo devido à oxidação da melanina presente no córtex (HARRISON; SINCLAIR,
2003). O método mais frequentemente utilizado para este procedimento, envolve o
uso de uma solução alcalina de peróxido de hidrogênio a 12%, com pH entre 9 e 11,
contendo outros intensificadores, tais como persulfato de amônio ou persulfato de
potássio (GARGANO et al., 2018; XIA et al., 2018).
O processo de clareamento ocorre em duas etapas: solubilização dos
grânulos de melanina, seguida de sua descoloração. A mistura alcalina de peróxido
de hidrogênio e persulfato perturba a estrutura da cutícula, fazendo com que suas
camadas se separem e se tornem mais permeáveis. O oxidante libera O2 no interior
10
da fibra, que se liga aos grânulos de melanina, provocando desaglomeração de seus
discos e eliminação das folhas oligoméricas. Com isso, o grânulo torna-se menor e a
fibra mais clara. Dessa forma, o clareamento obtido está diretamente relacionado
com a quantidade de oxigênio liberado (GROSVENOR, et al., 2018; ROBBINS,
2002; ALVES, 2013).
Os procedimentos cosméticos de clareamento capilar causam danos
substanciais nas camadas da cutícula e no córtex, além da degradação extensiva
dos grânulos de melanina, tornando o fio mais frágil e quebradiço e alterando a sua
textura. Isto ocorre devido ao fato da oxidação não provocar alterações apenas na
melanina, mas em diversas estruturas do fio. Durante o processo de
branqueamento, a cutícula se ergue e é desgastada, aumentando a sua porosidade
e causando reflexão difusa. Além disso, as ligações dissulfureto da queratina podem
ser atacadas pelo peróxido de hidrogênio, levando à clivagem oxidativa das pontes
dissulfeto. Outras ligações, como ligações peptídicas e de hidrogênio também são
afetadas durante a reação, assim como diversas proteínas. O acumulo de tais
perturbações na estrutura química do cabelo, se traduz em modificações em níveis
estruturais mais elevados e afeta a aparência, a textura, a força e o brilho do cabelo.
Para minimizar estes efeitos é aconselhável o uso de condicionadores, tanto na
solução de descoloração como após este processo (GROSVENOR, et al., 2018; XIA
et al., 2018; RYU et al., 2016).
Estudos realizados por Grosvenor et al. (2018) sugerem que as proteínas
capilares, tanto as que estão localizadas na cutícula quanto as associadas à matriz
de queratina, são progressivamente oxidadas à medida que aumenta a severidade
da descoloração. Além disso, em estudos realizados por seu grupo de pesquisas, as
proteínas remanescentes na fibra após o processo de descoloração foram
progressivamente oxidadas, principalmente nos resíduos de aminoácidos contendo
enxofre, cisteína e metionina, levando ao aumento dos níveis de ácido cisteico. O
exame ultraestrutural das fibras branqueadas revelou a perda de camadas de
células da cutícula e a degradação do complexo da membrana celular da cutícula
(CMC), além da perda de ligações cruzadas estruturais.
Em pesquisas realizadas por Ryu e colaboradores (2016), a fibra capilar foi
analisada quanto a sua composição durante diferentes etapas do processo de
11
clareamento, utilizando microespectroscopia no infravermelho com transformada de
Fourier. Este estudo demonstrou que, com o aumento do tempo de clareamento, a
banda de monóxido de cistina apresentou área maior e mais intensa, indicando
aumento da oxidação do aminoácido cistina e do dano à fibra capilar.
3.2. Influência dos cabelos na autoestima
Sabe-se que, na sociedade atual, com o aumento da expectativa de vida,
conservar uma boa aparência física e um semblante jovem e enérgico desempenha
um importante papel na autoestima. Os cabelos são capazes de conferir estilo e
personalidade e revelar os valores pessoais e o cuidado que o indivíduo tem consigo
mesmo, além de possuir grande impacto na aparência pessoal, tornando-se parte da
identidade do indivíduo. Portanto, os cabelos são capazes de influenciar na
autoestima de homens e mulheres. Uma pessoa com a autoestima fortalecida é
positiva e construtiva, ao contrário daquelas com baixa autoestima, que agem
movidas pela aprovação ou não das pessoas com as quais se relacionam (TRUEB,
2006; PASINI, 2007; ROSEN, 2015).
Algumas condições, como alopecia, hirsutismo e perda da coloração capilar,
podem ter um impacto muito significativo na qualidade de vida dos indivíduos
induzindo a uma diminuição da auto-estima, um senso de inadequação social e
sentimentos de desamparo. Os seres humanos, ao longo da história, têm utilizado
diferentes materiais e métodos físicos e químicos para alterar a aparência física do
cabelo, como alisamentos, ondulações, tinturas, relaxamentos, entre outros, de
acordo com aspirações individuais e de status social (DIAS et al., 2007; CHUA;
LEVEL, 2005; HARRINSON; SINCLAIR, 2003; ROSEN, 2015).
Segundo Pasini (2007), a autoestima é difícil de ser descrita por ser
inconstante e estar em função do passado, do conjunto de experiências vividas e
dos acontecimentos atuais. Trata-se de uma autoavaliação objetiva e sincera, que
influencia todas as experiências e a qualidade de vida do indivíduo (KHOURY,
2004). A psicologia considera a autoestima a principal ferramenta para o ser humano
enfrentar os desafios do cotidiano e lidar com as frustrações e conflitos diários
(ANDRADE; GONÇALVES, 2008). PASINI (2007) observa que vivemos numa
sociedade baseada na aparência e o peso dessa cultura, que valoriza a imagem e o
status social, influencia diretamente no modo como as pessoas se vêem e agem,
12
principalmente nos casos de profissionais que estão em contato direto com o público
e, consequentemente, estão expostos a julgamentos e à confiabilidade passada pela
imagem.
Segundo Corral (2017), o homem contemporâneo não tem receio de cuidar da
sua aparência física, o que o tem levado a um consumo cada vez maior de
cosméticos, principalmente perfumes e/ou água de colônia, sabonete em barra ou
líquido e gel fixador para cabelo, com o objetivo de melhorar a autoestima, seu
próprio autoconceito e a necessidade de autoafirmação social.
Além de todos os atributos estéticos, o cabelo pode ser um indicador de uma
variedade de condições de saúde. Por exemplo, cabelos quebradiços podem ser
sinal de doença tireoidiana ou deficiência nutricional, psoríase e tinea capitis podem
levar a uma sensação de couro cabeludo ressecado e desequilíbrios hormonais
podem ocasionar em queda de cabelo (ROSEN, 2015).
3.3. Radiação UV-Vis e a saúde do cabelo
A radiação UV compreende uma faixa de comprimentos de onda que vai desde
100 a 400 nm, podendo ser classificada, segundo a Comissão Internacional de
Iluminação (CIE), em três regiões: UVA (315 – 400 nm), UVB (280 – 315 nm) e UVC
(100 – 280 nm). A camada de ozônio bloqueia a entrada de UVC, permitindo a
passagem de 1-10% de UVB e 90-99% de UVA. A exposição a esse tipo de radiação
ocorre tanto devido à radiação solar quanto proveniente de lâmpadas e pode causar
danos à pele e aos cabelos. Os efeitos causados pela radiação UV na estrutura
capilar são cumulativos, uma vez que não ocorre regeneração das fibras
deterioradas. Esses efeitos se associam a outros fatores, acelerando as
modificações estruturais do fio (DARIO et al, 2015).
A cutícula é a camada mais externa do cabelo, portanto, a região mais exposta a
agentes químicos e ambientais, que podem ser prejudiciais à fibra. A exposição do
cabelo humano à luz solar causa danos ao mesmo devido à radiação UV, que é
absorvida pelas fibras capilares. A absorção desta radiação leva à transição de
aminoácidos para estados excitados, uma vez que os fótons podem ser absorvidos
por ligações dissulfeto de proteínas solúveis de baixo peso molecular e queratinas
13
fibrilares do córtex. Os cromóforos mais significativos de proteínas (triptofano,
tirosina, fenilalanina e cisteína) absorvem na faixa de comprimento de onda do UVB,
portanto, não devem sofrer danos diretos significativos quando expostos à radiação
UVA e VIS. No entanto, a radiação UVB pode resultar na decomposição das
ligações dissulfeto, na oxidação da cistina a ácido cisteico e na degradação proteica,
produzindo grupos carbonila e amina (CHANDRASHEKARA, RANGANATHAIAH,
2010; DARIO, 2015; FERNANDÉZ et al., 2012).
A ligação dissulfeto, liga dois aminoácidos contendo enxofre e forma um arranjo
reticulado extenso dentro da fibra capilar, contribuindo para a estabilidade mecânica
e resistência química da fibra. Portanto, a destruição destas ligações reduz a
resistência mecânica da fibra capilar. Em maior escala, os raios UV causam
mudanças na cor e nas propriedades sensoriais do cabelo, promovendo o
ressecamento da fibra, aumento da porosidade e perda de flexibilidade.
Além da interação direta entre a radiação UV e os componentes do cabelo, a
fotodegradação capilar também é produto da formação de espécies reativas de
oxigênio (ERO) pela interação da radiação UVA com fotossensibilizadores
endógenos. As ERO, por sua vez, estão relacionadas à produção de oximelanina a
partir da melanina, à oxidação de pigmentos artificiais em cabelos tingidos e à
oxidação de aminoácidos, como triptofano e cisteína (CHANDRASHEKARA,
RANGANATHAIAH, 2010; DARIO, 2015; FERNANDÈZ et al., 2012).
Estudos realizados por Richena (2015) indicaram alterações na morfologia da
cutícula após irradiação com lâmpada de mercúrio, resultando na formação de
pequenas saliências de forma globular (até 5 nm de altura) na superfície do fio, além
de abertura das escamas das cutículas. Essas alterações foram acompanhadas de
aumento no nível de oxidação da cistina.
Em estudos realizados por Fedorkova et al. (2016), os resíduos de aminoácidos
das camadas mais externas da cadeia capilar mostraram-se mais fotodanificados do
que os das camadas internas, com diminuição da quantidade de ligações S-S e C-S
de cistinas. Isto pode ser explicado devido à ausência de melanina nas camadas
mais externas da fibra. Os grânulos de melanina absorvem seletivamente a radiação
e, deste modo, apresentam uma função fotoprotetora, absorvendo, filtrando e
dissipando a energia como calor, mas no processo ficam degradados ou clareados.
14
A capacidade da melanina de absorver energia está relacionada à presença de
grupos carbonila e de ligações duplas conjugadas em sua estrutura, conforme
encontrado também em filtros UV sintéticos. Porém, esses grânulos representam
apenas uma pequena fração da massa total da fibra (2-3%), enquanto os outros
constituintes estruturais permanecem expostos à radiação. (CHANDRASHEKARA,
RANGANATHAIAH, 2010; RICHENA, REZENDE, 2015; DARIO, 2015). Ainda neste
estudo, imagens de microscopia eletrônica (Figura 6) mostraram sinais típicos de
danos fotoinduzidos na cutícula (perdas focais de arestas cuticulares e
deslocamentos de cutícula), o que pode facilitar a perda de queratinas solúveis da
haste capilar.
Figura 6: Imagens de MEV de cutícula de (a) controle e (b) fios de cabelo irradiados,
mostrando aumento da rugosidade da superfície, bordas recortadas e esfoliação da cutícula
(FEDORKOVA, 2016).
3.4. Cosméticos
Cosméticos são produtos com componentes naturais ou sintéticos, destinados a
serem aplicados na pele, cabelo, cavidade oral e mucosa com a função de
higienização corporal, proteção, manutenção do bom estado, odorização e
embelezamento. Produtos cosméticos podem ser encontrados em diversas formas,
15
tais como: soluções, géis, óleos, cremes, loções, mousses, suspensões, pós,
bastões, pastas e aerossóis. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa)
determina, pela Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 7, de 10 de fevereiro de
2015, a classificação destes produtos em dois grupos, de acordo com seu grau de
risco. Produtos com grau de risco 1 são considerados seguros e possuem
propriedades básicas, cuja comprovação não é necessária, como é o caso de
sabonetes, perfumes, hidratantes corporais, desodorantes corporais e enxaguantes
bucais. Os produtos com grau de risco 2 (como protetores solares, repelentes contra
insetos, antitranspirantes e xampus e condicionadores com ação antiqueda ou
anticaspa, por exemplo) possuem potencial risco para a segurança humana e
indicações específicas, sendo, portanto, exigida a comprovação da eficácia e
segurança, além de informações acerca de cuidados, modo e restrições de uso
segundo a RDC 07/2015 da ANVISA (ANVISA, 2015; FREIRE, 2015).
O mercado de cosméticos é um dos setores que mais cresce mundialmente, com
destaque para a cosmética orgânica. Um dos nichos mais promissores é o de
produtos naturais, considerado o alvo da maioria das empresas farmacêuticas e de
cosméticos internacionais. Aliado a isso, um número considerável de consumidores
optam atualmente por produtos naturais e orgânicos em detrimento daqueles que
utilizam substâncias petroquímicas. A fitocosmética é a ciência dedicada ao estudo e
aplicação dos princípios ativos extraídos de espécies vegetais em cosméticos,
buscando-se recursos disponíveis, renováveis e permitindo uma atividade
sustentável (FREIRE, 2015).
3.4.1. Testes de mutagenicidade
Os produtos cosméticos podem ocasionar efeitos adversos ao usuário e,
portanto, antes de sua colocação no mercado, deve ser assegurada sua segurança
nas condições normais ou razoavelmente previsíveis de uso. As reações adversas a
cosméticos podem ser reações irritativas imediatas ou acumulativas, alérgicas ou
sensibilizantes, dermatites por fotossensibilização, reações sistêmicas, físicas, por
oclusão ou carcinogênica (CHORILLI et al., 2007). Fotomutagenicidade ou
fotogenotoxicidade é a habilidade da radiação UV de gerar fotoprodutos capazes de
causar mutações por diferentes mecanismos. Um destes mecanismos é a geração
de produtos com curta meia-vida, como ERO, ou moléculas em um estado excitado
16
de curta duração, que reagem diretamente com o DNA. Outro mecanismo de
fotomutagenicidade se dá pela formação de fotoprodutos mais estáveis sob
irradiação (MÜLLER, GOCKE, 2013; WATANABE-AKANUMA, INABA, OHTA, 2007).
Diferentes classes de substâncias químicas usadas como ingredientes
farmacêuticos e cosméticos, como por exemplo, diuréticos, antibacterianos,
antiinflamatórios não-estereoidais, psoralenos e retinóides, têm se mostrado
capazes de aumentar a sensibilidade da pele à radiação ou induzir efeito fototóxico
por absorver energia da luz solar, gerando intermediários reativos e/ou EROs e
dando início a numerosas reações fototóxicas e fotoalérgicas (STRUWE et al.,
2007). De acordo com a Agência Internacional de Pesquisas em Câncer (IARC -
International Agency of Research on Cancer), alguns pigmentos e aditivos químicos
presentes em certas tinturas de cabelo foram considerados carcinogênicos e
mutagênicos em ensaios in vitro e in vivo (IARC, 2010). Isso é relevante, uma vez
que, segundo estudos realizados pelo Instituto Nacional de Metrologia, Normalização
e Qualidade Industrial (INMETRO), 26% dos adultos no Brasil fazem uso de tinturas
capilares e muitos são os profissionais expostos diariamente a estes produtos
(INMETRO, 2014). Estudos epidemiológicos indicam um risco aumentado de câncer
de bexiga em cabeleireiros expostos à tinturas de cabelo (TAFURT-CARDONA et
al., 2015).
Para a avaliação do potencial mutagênico de uma substância, é geralmente
utilizado o teste de Ames. Este teste analisa a atividade mutagênica da substância,
utilizando o procedimento experimental do ensaio em placa de
Salmonella/Microssoma de Ames para cada um dos cinco estirpes histidino-
dependentes de Salmonella typhimurium com ou sem ativação com microssomas de
mamíferos (fração S9 de fígado de rato), fazendo uso de um controle negativo e um
controle positivo (composto por um mutágeno conhecido) (CHORILLI et al., 2007).
3.4.2. Cosméticos capilares
Cosméticos capilares são preparações destinadas ao uso no cabelo e/ou couro
cabeludo, com o objetivo de limpar, promover atratividade e alterar ou proteger a
aparência. Um dos principais efeitos buscados pelos consumidores é o aumento do
brilho capilar, relacionado a aspectos de beleza e saúde. A luz, ao atingir a
superfície do cabelo, pode ser refletida especularmente, quando o ângulo de
17
reflectância é igual ao ângulo de incidência, ou difusamente, em ângulos diferentes
do ângulo incidente. A razão entre estas reflexões da luz, geralmente é adotada
como medida do brilho das fibras. A suavidade da cutícula é um dos fatores mais
importantes para reduzir a reflexão difusa na superfície do cabelo, proporcionando
um brilho saudável. Sabe-se também que resíduos de xampu, calor seco excessivo
e alguns tratamentos químicos induzem a formação de poros nas fibras ou
rugosidade na superfície. Caso essas deformações sejam maiores que o
comprimento de onda da luz, irão provocar aumento da reflexão difusa, com
opacificação da fibra capilar. O ato de pentear ou escovar o cabelo vigorosamente
pode ocasionar a abrasão das fibras capilares, quebrando as extremidades das
escamas cuticulares e criando outras irregularidades, que contribuem para aumentar
o espalhamento difuso e tornar o cabelo mais opaco (FREIRE, 2015).
Com o intuito de melhorar as propriedades visuais e sensoriais do cabelo, podem
ser incorporados aos cosméticos capilares diversas proteínas, peptídeos e
aminoácidos capazes de ampliar a força e reduzir os danos causados às proteínas
do fio durante repetidas lavagens e tratamentos químicos (CRUZ et al., 2016).
Xampus são os cosméticos capilares mais comumente usados. Devido aos
surfactantes contidos em sua formulação, o xampu pode remover partículas de
sujeira e sebo do cabelo e do couro cabeludo, mas essa ação deve ser suave a fim
de evitar a remoção completa de óleos naturais e sebo da pele. Muitos desses
produtos possuem pH alcalino, o que provoca abertura das cutículas, favorecendo o
dano. Condicionadores são utilizados após o uso do xampu, para diminuir o “frizz” e
aumentar a maciez e o brilho do cabelo. Podem ser usados também afim de reduzir
um trauma químico ou mecânico, como os provocados por tinturas permanentes,
descolorações ou por escovação excessiva. Agentes condicionadores tem cargas
positivas (comumente surfactantes catiônicos) que neutralizam as cargas negativas
da superfície da fibra, além disso são capazes de lubrificar a cutícula e baixar suas
escamas, resultando na redução da hidrofilicidade e aumento da suavidade e do
brilho do cabelo (ALESSANDRINI; PIRACCINI, 2016).
As tinturas capilares modernas tornam possível que homens e mulheres troquem
a cor dos seus cabelos, de acordo com suas preferências ou tendências de moda,
sendo necessários apenas alguns minutos. Estas tinturas podem ser classificadas
18
como temporárias, semi-permanentes ou permanentes, de acordo com seu tempo
de permanência na fibra capilar, que depende da capacidade das moléculas de
pigmentos atingirem o córtex do cabelo e ali permanecerem. A coloração
permanente penetra no córtex capilar, onde sofre reações, gerando corantes de alta
massa molar, que ficam permanentemente presos no interior da fibra capilar
(BOLDUC; SHAPIRO, 2001). A modificação da cor dos cabelos também pode ser
feita através de técnicas de descoloração, usando substâncias como amônia,
peróxido de hidrogênio e sais de persulfato. O pH alcalino da solução levanta as
escamas das cutículas, facilitando a penetração do agente oxidante no córtex onde
irá reagir com grânulos de melanina, dissolvendo-os.
Através de tratamentos químicos também é possível alisar permanentemente o
cabelo usando soluções com pH elevado (9,0 – 14,0), que incham a fibra capilar,
abrindo as escamas cuticulares. O produto reage com a queratina pela quebra e
rearranjo das pontes dissulfeto (ALESSANDRINI; PIRACCINI, 2016).
Os produtos capilares podem ser apresentados em diversas formas, entre elas
estão os géis. Géis hidrossolúveis vêm sendo amplamente usados em produtos
cosméticos e bases dermatológicas, uma vez que apresentam fácil espalhamento,
permitem a veiculação de princípios ativos hidrossolúveis e não são oleosos. Trata-
se de sistemas semissólidos que consistem na dispersão de moléculas, como
polímeros, em meio aquoso, adquirindo uma consistência semelhante à gelatina. O
tipo de polímero empregado pode influenciar no comportamento reológico e,
portanto, na estabilidade física da formulação. O comportamento reológico dos géis
hidrossolúveis, em geral, é do tipo pseudoplástico e tixotrópico, ou seja, durante a
aplicação o produto torna-se mais fluido, devido à redução da viscosidade e
aumento do cisalhamento, facilitando o espalhamento e, ao cessar a aplicação,
recupera sua viscosidade inicial, evitando escorrimento do produto. Géis fixadores
de penteado são muito utilizados para ajudar a modelar os fios sem afetar sua
estrutura. Estes géis são, basicamente, dispersões coloidais com viscosidade alta o
suficiente para fixar as mechas de cabelo. Em geral, apresentam em sua
composição poliuretano, silicones, poli(acetato de vinila) ou poli(vinil pirrolidona).
Existem atualmente diversos géis capilares com variados graus de fixação e
diferentes aditivos, como glitter e pigmentos (VELASCO et al.,2014; OLIVEIRA,
2013; QUEIROZ, 2008).
19
3.4.3. Produtos antienvelhecimento
O envelhecimento capilar compreende a degeneração da fibra por processos
químicos, mecânicos e biológicos, o ressecamento e o decaimento da função dos
melanócitos e da produção de novos fios, devido ao envelhecimento do folículo.
Muitos estudos sugerem que estes efeitos estão relacionados a danos sofridos no
DNA mitocondrial, à produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e ao
decaimento da função antioxidante (GIORGI et al., 2018; DAVALLI et al., 2016;
KAMMEYER, LUITEN, 2015). Em geral, antioxidantes endógenos, como superóxido
dismutase (SOD), catalase, glutationa S-transferase (GST) e glutationa peroxidase
(GPX), são responsáveis pela neutralização dos radicais livres (TRUEB, 2006;
FUJIMOTO, YAMASOBA, 2014).
A perda de cabelo progressiva, relacionada com a idade, é um sintoma bastante
comum na população idosa. O cabelo grisalho, um dos mais visíveis sinais de
envelhecimento, é mais grosso e menos maleável que o cabelo pigmentado, além de
ser mais resistente a incorporação de tinturas. O cabelo seco, ou seja, que não
possui umidade suficiente, apresenta perda do brilho natural e torna-se mais difícil
de ser estilizado. Normalmente, isso ocorre devido a extrema danificação e
porosidade da cutícula, deixando o córtex exposto, o que o impede de manter a
umidade. O tratamento do cabelo seco e danificado é feito normalmente através de
condicionadores contendo moléculas grandes que se depositam nas bordas das
escamas danificadas da cutícula, ajudando a alisar e preencher as fraturas e fissuras
(TRUEB, 2006; FUJIMOTO, YAMASOBA, 2014).
A aplicação de substâncias antioxidantes em produtos cosméticos é uma das
estratégias mais efetivas para combater o envelhecimento capilar, sendo capaz de
interromper a reação em cadeia gerada pelo radical livre, além de ajudar a reparar a
pele e os cabelos e proteger contra danos oxidativos (FERNANDÉZ et al., 2012).
Segundo NASIR & SETAPAR (2018), conhecidos antioxidantes como vitamina E,
fitoesteróis, compostos fenólicos e α-tocoferol, apresentam potencial atividade
fotoprotetora e eficácia antirrugas, além de prevenir o dano capilar e aprimorar o
brilho do cabelo.
20
Um estudo realizado por Fernandéz et al. (2012) avaliou os efeitos do tratamento
de mechas de cabelo com os extratos de arroz (Oryza sativa L.) e de folhas de
alcachofra (Cynara scolymus L.), rico em substâncias antioxidantes, sobre a fibra
capilar. Os principais componentes presentes no extrato de folhas de alcachofra
foram os ácidos hidroxicinamicos e flavonoides enquanto no extrato de arroz foram
encontrados, majoritariamente, peptídeos e aminoácidos bifuncionais,
polissacarídeos e ácido fítico. Os resultados encontrados mostraram que as fibras
tratadas com os extratos contendo antioxidantes levaram ao aumento da resistência
mecânica, redução da oxidação de proteínas e lipídeos e melhor conservação da cor
e do brilho do fio, mesmo após expostos à radiação UV-Vis. Além disso, imagens de
MEV mostram que as cutículas das fibras tratadas com antioxidantes permaneceram
oclusas após exposição à radiação UV-Vis, ao contrário das mechas tratadas com
formulação sem antioxidante.
3.4.4. Fotoprotetores capilares
Em geral, fotoprotetores são preparações cosméticas que podem conter filtros
UV inorgânicos (físicos) e orgânicos (químicos), que são moléculas ou complexos
moleculares capazes de absorver, refletir ou dispersar a radiação UV. Filtros
químicos UVA e UVB, como o metoxicinamato de etilhexilo, salicilato de etilhexilo,
ácido tereftalideno dicânfora sulfônico, drometrizol trisiloxano, 4-etilbenzilideno
cânfora, ácido sulfônico fenilbenzimidazol, triazona de etilhexil,
metoxidibenzoilmetano butílico e algumas benzofenonas, são incorporados em
produtos capilares, como géis, “leave-on”, xampus e condicionadores a fim de
proteger a estrutura do cabelo da luz solar. No entanto, a maioria desses filtros
iônicos não aderem bem à fibra capilar, sendo facilmente removidos, o que reduz
sua capacidade fotoprotetora. Devido ao ponto isoelétrico da queratina, a superfície
do cabelo tende a ter carga negativa. Portanto, moléculas carregadas positivamente
terão maior afinidade com a fibra capilar e, consequentemente, maior capacidade de
proteger o cabelo contra danos foto-oxidativos causados pela radiação solar, uma
vez que não são facilmente removidas durante a lavagem. Alguns exemplos dessas
substâncias são: cloreto de cinamidopropil trimônio, tosilato de dimetilpabamidopropil
21
laurdimônio e tosilato de dodecil dimetilaminobenzamidopropil dimetilamônio
(DARIO, 2015).
Alguns silicones (polímeros de silício, carbono, hidrogênio e oxigênio, podendo
conter nitrogênio e enxofre) também têm sido utilizados com a finalidade de proteger
os cabelos dos efeitos danosos da radiação solar, formando uma película ao redor
da fibra, além de fornecer brilho e facilitar o ato de pentear. Além dos silicones e dos
filtros solares comumente usados para cuidados da pele, moléculas com
propriedades antioxidantes poderiam impedir a formação de radicais livres e
proteger as estruturas do cabelo (pigmentos, proteínas e lipídios) da oxidação,
auxiliando na proteção da cor de cabelos louros e tingidos. Neste sentido, os
polifenóis vêm ganhando grande interesse, por se tratarem de substancias
antioxidantes que podem ser facilmente obtidas de frutas e legumes em altas
concentrações (DARIO, 2015; FERNANDÈZ et al, 2012).
Campo, Zhang e Wakeford (2017) realizaram um estudo onde foi avaliada a
redução da quebra do fio de cabelo após tratamento com óleo de Synsepalum
dulcificum. Os autores atribuíram aos constituintes antioxidantes e antiinflamatórios
do óleo (como o esqualeno e álcoois triterpênicos) a proteção do fio contra
agressões ambientais, como a radiação ultravioleta. Estudos semelhantes foram
realizados por Leite e Campos (2018), onde uma formulação para cabelos contendo
extratos botânicos de Camellia sinensis, Vitis vinífera e Euterpe orleacea foi testada
quanto a seus efeitos fotoprotetores. Os extratos testados apresentaram alta
atividade antioxidante e grande concentração de compostos fenólicos. No fio, a
formulação se mostrou eficaz na prevenção de danos por UV, com melhora da
resistência mecânica, redução na força de penteabilidade e aumento do brilho.
Os resultados publicados na literatura são difíceis de serem comparados, uma
vez que não existem parâmetros regulados para a avaliação da eficácia de produtos
de cuidados com os cabelos, como existem para a fotoproteção da pele. Por essa
razão, é de extrema importância que os pesquisadores se atentem para a aplicação
de condições experimentais semelhantes a um nível real de exposição solar.
22
3.4.5. Utilização de organismos marinhos em cosméticos
Os oceanos abrigam uma enorme biodiversidade de espécies e, dentre elas,
diversos microrganismos. Estas espécies vêm sofrendo, ao longo dos anos, uma
série de adaptações biológicas, levando à produção de um amplo espectro de
moléculas bioativas. Além disso, a demanda dos consumidores por produtos
naturais e ambientalmente sustentáveis tem aumentado, dadas as preocupações
com a saúde individual e do meio ambiente. Nesse sentido, organismos e
microrganismos marinhos, têm atraído grande atenção como produtores de
compostos bioativos que podem ser explorados para fins comerciais, incluindo fins
cosméticos, uma vez que exibem atividade fotoprotetora, antienvelhecimento,
antimicrobiana, antioxidante e hidratante. As bactérias são tipicamente os membros
mais abundantes e diversos da microbiota marinha, englobando as cianobactérias,
microrganismos fotossintéticos cujas atividades benéficas em produtos e alimentos
têm sido amplamente reportadas na literatura (CORINALDESI et al., 2017; WANG,
2015).
Com a crescente conscientização dos riscos advindos da exposição à radiação
UV, deu-se um aumento da produção e do consumo de produtos de proteção solar
em todo o mundo. Com o passar dos anos, um conjunto de mecanismos de proteção
contra os efeitos nocivos da radiação UV foi sendo desenvolvido por diversos
organismos marinhos, através da produção de compostos absorvedores de UV, tais
como carotenoides, micosporinas, aminoácidos semelhantes à micosporina (MAA –
Mycosposrine-like amino acids), citoneminas (que ocorrem em cianobactérias) e
melanina. Dessa forma, estes compostos apresentam um grande potencial para o
desenvolvimento de novos filtros UV naturais. A busca por novos fotoprotetores
alternativos, principalmente de origem natural, tem crescido, uma vez que os filtros
orgânicos e químicos comumente utilizados para este fim podem ter efeitos nocivos,
não só para o consumidor, mas também para a vida marinha (CORINALDESI et al.,
2017).
Micosporinas e MAA são moléculas hidrossolúveis de baixo peso molecular
sintetizadas e acumuladas por uma vasta gama de organismos, tais como
cianobactérias, procariontes e algas. As micosporinas possuem em sua estrutura
uma aminociclohexenona ou um anel aminocicloheximina com substituintes de
nitrogênio ou álcool imino e absorvem na faixa de 310 a 320 nm. MAA são derivados
23
imina de micosporinas que contêm um anel amino-ciclohexenimina ligado a um
aminoácido, amino álcool ou grupo amino com absorção na faixa de 320 a 360 nm,
sendo mais favoráveis a ter ação fotoprotetora devido ao seu amplo espectro de
absorbância e capacidade de dissipar a radiação UV sem produzir ERO. Além disso,
as MAA possuem atividade antioxidante, eliminando ânions superóxidos e inibindo a
peroxidação lipídica (WANG, 2015; CORINALDESI et al., 2017).
Suspeita-se que muitos dos pigmentos sintéticos conhecidos atualmente sejam
carcinogênicos e seu uso contínuo seja capaz de causar danos aos rins e fígado
(SAINI, 2018). Por essa razão, observa-se um crescente interesse do mercado pelos
pigmentos naturais, especialmente pigmentos microbianos. Estes últimos podem
possuir diversas propriedades benéficas como anticancerígeno, antiproliferativo,
imunossupressor e antibiótico, além de apresentar biodegradabilidade, sendo de
ampla aplicação, principalmente nas indústrias alimentícia, farmacêutica e têxtil. Na
indústria farmacêutica, pigmentos de origem microbiana, como a antocianina, a
prodigiosina e a violaceína, vêm sendo amplamente utilizadas no tratamento de
doenças (KUMAR et al., 2015).
Os carotenoides são os pigmentos mais comuns encontrados na natureza,
sendo responsável pela coloração de diversas frutas, vegetais, flores e até alguns
pássaros, insetos e animais marinhos. Estes pigmentos possuem uma ampla gama
de atividades biológica e, por isso, além de seu uso como corante, podem ser
utilizados como suplementos alimentares e para fins médicos, biotecnológicos e
cosméticos. Além disso, os carotenoides marinhos apresentam efeitos antioxidantes
e antiinflamatórios significativos e podem contribuir para a fotoproteção da pele e
inibição de diversos processos induzidos ou mediados pela radiação solar.
Astaxantina, o principal carotenoide encontrado na microalga Haematococcus
pluvialis, é também um excelente agente antioxidante, mais poderoso que as
vitaminas C e E e outros carotenoides. O β-caroteno, conhecido por ser precursor de
vitamina A, é um dos principais corantes alimentares, normalmente extraído de
Dunaliella spp. ou Arthrospira platensis ou obtido por síntese química. β-caroteno
também apresenta alta capacidade antioxidante, ajudando a conter os radicais livres
envolvidos no câncer intestinal, artrite e envelhecimento precoce (CORINALDESI et
al., 2017; WANG, 2015).
24
Em geral, os produtos anti-envelhecimento contêm substâncias hidratantes,
visando manter as funções da pele. Os organismos marinhos produzem várias
moléculas de alto peso molecular, como polissacarídeos, ácidos graxos e proteínas
que são amplamente utilizados nos cuidados da pele pelos seus efeitos suavizantes
e hidratantes. Entre as substâncias bioativas com ação anti-rugas de origem
marinha, os polissacarídeos, principalmente os exopolissacarídeos, são os mais
utilizados. Estes últimos constituem uma classe de produtos com propriedades
espessantes, de formação de gel e emulsificante (CORINALDESI et al., 2017).
Produtos para clareamento da pele vêm ganhando o interesse do público
impulsionados por necessidades dermatológicas, como hiperpigmentação da pele
devido a condições auto-imunes, exposição à radiação UV, fatores genéticos e
alterações hormonais que podem induzir a superprodução de melanina, além de
fatores estéticos. A biossíntese da melanina pode ser reduzida pela inibição da
enzima tirosinase e pela inibição do metabolismo e da proliferação de melanócitos.
Neste sentido, diversos compostos naturais originados de organismos marinhos,
como hidroquinonas, ácido kóijico, ácido azeláico e fenóis já foram empregados
como inibidores de tirosinase. Recentemente, uma patente baseada em crisofanol,
extraído do fungo marinho Microsporum sp., foi desenvolvida para fins de
clareamento da pele (patente dos EUA 0140056834A1). Também foi descoberta a
produção de cloreto de metileno por uma espécie de bactéria marinha
Pseudomonas, que reduz a pigmentação dos melanócitos humanos e inibe a
expressão da tirosinase. Além disso, há evidências de que a astaxantina
cetocarotenóide, produzida por leveduras marinhas e outros táxons, pode reduzir a
produção de melanina em 40% e proteger a pele de manchas da idade
(CORINALDESI et al., 2017).
3.5. Arthrospira platensis
Arthrospira platensis é uma cianobactéria verde-azulada fotossintetizante e
filamentosa, pertencente a ordem Oscillatoriales, família Cyanophyceae. Sob o
microscópio óptico, aparece como filamento verde-azulado, composto por células
cilíndricas não ramificadas ligadas umas às outras formando um filamento helicoidal
(Figura 7). A forma de hélice é mantida apenas em meio líquido (CRUCHOT, 2008;
SHIMAMATSU, 2004; BENELHADJ et al., 2016). Ao contrário de outras microalgas,
25
seu cultivo apresenta baixa susceptibilidade a contaminação por outros
microrganismos devido ao alto pH necessário ao seu desenvolvimento, estando
inicialmente em torno de 8,0 e podendo atingir pH 11,0 (BARROS; SASSI, 2007;
VONSHAK, 1997).
Figura 7: Arthrospira platensis, aumento de 200x e 400x (BARROS, 2010).
Comercialmente, a Arthrospira platensis é denominada Spirulina, assim como
outras espécies de Arthrospira. Esta espécie apresenta potencial produção de
substâncias bioativas para o consumo humano e para o desenvolvimento de
cosméticos (NUHU, 2013).
A Spirulina é utilizada há séculos por diversas populações. Os Astecas e os
Maias usaram A. platensis como parte central de sua dieta. Na África, os povos de
Kanembu, na República do Chade, alimentam-se dessa biomassa até hoje. Além
disso, a NASA – National Aeronautics and Space Administration – já utilizou a
Spirulina como fonte de alimento em missões espaciais (CIFERRI, 1983; SILVA,
2008; HABIB et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2013). Apesar de ser utilizada como
alimento há muito tempo, cientistas constataram os benefícios desta cianobactéria
somente no final do século passado, quando começou a ser usada como
suplemento nutricional por conter diversas substâncias benéficas para o ser humano
(BEZERRA, 2006).
Esta cianobactéria têm atraído a atenção de cientistas e da indústria devido a
sua importância nutricional, por conter não apenas uma alta concentração de
proteínas (60-70% no extrato seco), mas também aminoácidos essenciais, algumas
26
vitaminas (principalmente vitamina B12) e diversos minerais, além de antioxidantes
naturais, como pigmentos hidrossolúveis, carotenoides, compostos fenólicos e
enzimas antioxidantes, como superóxido dismutase, catalase e peroxidase (ISMAIEL
el al., 2016). Ademais, vários relatos associam preparações de Arthrospira sp. a
resultados terapêuticos significativos, como efeito hipolipidêmico, protetor contra
diabetes, obesidade e falência dos rins, supressor de hipertensão, estimulador do
sistema imune e inibidor de anemia (WANG, 2015; BENELHADJ et al., 2016;
ISMAIEL et al., 2016). Acredita-se que essas atividades resultem dos compostos
antioxidantes produzidos pela Arthrospira sp. (ISMAIEL el al., 2016).
Mendonça, Druzian e Nunes (2012) verificaram a distribuição de patentes com
utilização desta cianobactéria, de acordo com a área de aplicação no setor industrial,
e concluíram que as principais atividades de utilização envolvem formas de cultivo
de microalga (29,5%), indústria farmacêutica (18,9%), indústria de alimentos (15,5%)
e área médica (14,0%). Apenas 3% destinam-se às atividades voltadas para a
indústria de cosméticos (Figura 8).
Figura 8: Distribuição de patentes de acordo com a área de aplicação de biomassa de
Spirulina (MENDONÇA; DRUZIAN; NUNES, 2012).
Segundo um estudo realizado por Sahin (2018), o extrato bruto de A. platensis
ou seus principais componentes podem ser potenciais candidatos no
27
desenvolvimento de cosméticos seguros e eficazes para o clareamento de pele. Os
resultados deste estudo revelaram efeito inibitório da tirosinase, enzima que
desempenha papel vital na síntese de melanina, pelos extratos aquoso e etanólico
de A. platensis, sendo superior a atividade do extrato etanólico. Este efeito foi
associado aos ácidos vanílico, cafeico e ferúlico, os dois últimos encontrados apenas
na porção etanólica do extrato.
Nas cianobactérias, os pigmentos fotorreceptores são a clorofila, os
carotenoides e as ficobiliproteínas. As ficobiliproteínas englobam um grupo de
proteínas com cor intensa, solúveis em água e que podem ser divididas em três
grupos, de acordo com a sua estrutura: ficocianinas (azul escuro), aloficocianinas
(azul esverdeado) e ficoeritrinas (vermelho) (ANTELO, 2007). Nuhu (2013)
demonstrou as diversas funções dos metabólitos extraídos da A. platensis,
principalmente ficocianina e aloficocianina, como potencial nutricional, antioxidante,
antitumoral, antiviral, antibacteriano e antifúngico, entre outros. O complexo
pigmento-proteína chamado ficobilissoma, é composto por ficobiliproteínas
heterodiméricas unidas por polipeptídeos.
A ficocianina vem despertando interesse devido ao seu uso como biocorante
natural e por suas propriedades antioxidantes, anti-inflamatória e antitumoral, além
de agir como estimulante do sistema imunológico (GANTAR et al., 2012; ICHIMURA
et al., 2013). Essa ficobiliproteína já é utilizada comercialmente no Japão, Tailândia e
China como corante em alimentos (bebidas, chicletes, gelatinas, produtos de
confeitaria e laticínios) e em cosméticos (VONSHAK, 1997; SARADA et al., 1999;
SANTIAGO-SANTOS et al., 2004; PATEL et al., 2005). Grandes indústrias, como a
Dainippon Tintas & Produtos químicos (Sakura) desenvolveram um produto
chamado Lina Blue que é usado na indústria alimentícia em gomas, sorvetes, doces
e bebidas e na indústria de cosméticos naturais em batons e sombras de olho. Além
disso, as ficobiliproteínas são extensamente usadas na indústria e laboratórios
imunológicos, devido aos seus altos coeficientes de absorbância, alta produção de
fluorescência e fotoestabilidade (SPOLAORE et al., 2006; ANTELO, 2007; SILVA,
2008).
A Figura 9 apresenta a estrutura química do grupo cromóforo da ficocianina, a
ficocianobilina, formada por uma cadeia linear tetrapirrólica (MACCOL, 1998).
28
Figura 9: Estrutura química do pigmento ficocianobilina (adaptado de SPOLAORE et al., 2006).
Estudos realizados por Ismaiel et al. (2016) avaliando o efeitos das alterações
de pH sobre a atividade antioxidante e a produtividade da A. platensis, mostraram
uma atividade antioxidante superior à do controle positivo (BHT) em uma faixa de pH
variando de 7,5 a 11,0, tendo sido registrada a maior atividade sequestradora de
radicais em pH 9,0. Zaid, Hammad e Sharaf (2015) determinaram a atividade
antioxidante de extratos aquosos de A platensis e a sua citotoxicidade e concluíram
que a biomassa de A. platensis apresentou considerável conteúdo de compostos
fenólicos totais, explicando a alta capacidade antioxidante de seus extratos aquosos.
Além disso, estes extratos também demonstraram propriedades antiproliferativas em
células de carcinoma de cólon humano (HCT116) e células de carcinoma
hepatocelular (HEPG2), sugerindo a possibilidade da utilização da A. platensis em
novos produtos naturais anticancerígenos promissores.
Outro estudo envolvendo o uso de extrato aquoso obtido de A. platensis em
cosmecêuticos foi realizado por Gunes et al (2017). Neste estudo, a citotoxicidade in
vitro e os efeitos de cicatrização foram investigados para avaliar o potencial de uso
na área biomédica e farmacêutica. Segundo os autores, o extrato contém uma
mistura de proteínas e carotenoides com efeito sinérgico na proliferação de células
da pele, cicatrização de feridas e regeneração de tecidos. Os resultados mostraram
que concentrações de extrato entre 0,1 e 0,05% apresentaram efeito significativo
sobre a proliferação da linhagem celular de fibroblastos L929, e que a proliferação
celular e a migração foram aumentadas pela incorporação dos extratos brutos. Um
creme de uso tópico contendo 1,125% do extrato exibiu o maior efeito proliferativo
nas células da pele, apoiado em resultados de ensaios imuno-histoquímicos,
mostrando potencial valor em aplicações cosmecêuticas e biomédicas.
29
4. METODOLOGIA
4.1. Materias-primas e reagentes
● Ácido cítrico monoidratado – Vetec Química Fina Ltda (Rio de Janeiro, Brasil).
● Ácido Trifluoroacético - Sigma-Aldrich Corporation (São Paulo, Brasil).
● Ágar – Kasvi (São José dos Pinhais, Paraná).
● Álcool etílico absoluto – Labsynth produtos para laboratório Ltda (Diadema,
SP, Brasil).
● Ampicilina - Sigma-Aldrich Corporation (São Paulo, Brasil).
● Benzofenona-3 - Sigma-Aldrich Corporation (São Paulo, Brasil).
● Butil Hidroxitolueno – Comércio e Indústria Farmos Ltda. (Rio de Janeiro,
Brasil).
● Bicarbonato de sódio – Isofar Indústria e comércio de produtos químicos Ltda
(Duque de Caxias, Rj, Brasil).
● Biotina - Sigma-Aldrich Corporation (São Paulo, Brasil).
● Cepas de Salmonella typhimurium das linhagens TA102 e TA104 obtidas do
Laboratório de Mutagênese Ambiental da Universidade do Estado do Rio de
Janeiro.
● Cloreto de cálcio – VETEC química fina Ltda (Duque de Caxias, RJ, Brasil).
● Cloreto de sódio – Isofar Industria e comércio de produtos químicos Ltda.
(Duque de Caxias, Brasil).
● Extrato de levedura – Becton, Dickinson and Company – BD (Sparks, Estados
Unidos da América).
● Fosfato de potássio dibásico – Isofar Industria e comércio de produtos
químicos Ltda. (Duque de Caxias, Brasil).
● Fosfato de sódio dibásico anidro – Sigma-Aldrich Corporation (São Paulo,
Brasil).
● Fosfato de sódio e amônio tetraidratado – Vetec Química Fina Ltda (Rio de
Janeiro, Brasil).
● Fosfato de sódio monobásico monoidratado – Sigma-Aldrich Corporation (São
Paulo, Brasil).
30
● Glicose – Sigma-Aldrich Corporation (São Paulo, Brasil).
● Hidróxido de sódio – Proquimios (Bangu, RJ, Brasil).
● Hidroxietilcelulose - Comércio e Indústria Farmos Ltda. (Rio de Janeiro,
Brasil).
● Histidina - Sigma-Aldrich Corporation (São Paulo, Brasil).
● Lauril sulfato de sódio - Vetec Química Fina Ltda (Rio de Janeiro, Brasil).
● Metilparabeno – Comércio e Indústria Farmos Ltda. (Rio de Janeiro, Brasil).
● Mitomicina C - Sigma-Aldrich Corporation (São Paulo, Brasil).
● Nitrato de sódio – Proquímios (Bangu, RJ, Brasil).
● Óleo de coco – Ferquima (SP, Brasil).
● Óleo de rícino hidrogenado Peg-40 – LaBelle ativos Especialidades químicas
Ltda (Curitiba, PR, Brasil).
● Propilenoglicol – All Chemistry do Brasil Ltda. (São Paulo, SP, Brasil).
● Sorbitano monooleato/Span® 80 – LaBelle ativos Especialidades químicas
Ltda (Curitiba, PR, Brasil).
● Propilparabeno – Isofar Industria e comércio de produtos químicos Ltda.
(Duque de Caxias, Brasil).
● Sulfato de magnésio heptahidratado – Vetec Química Fina Ltda (Rio de
Janeiro, Brasil).
● Sulfato de potássio - Isofar Industria e comércio de produtos químicos Ltda.
(Duque de Caxias, Brasil).
● Sulfato ferroso heptahidratado) - Isofar Industria e comércio de produtos
químicos Ltda. (Duque de Caxias, Brasil).
● Tetraciclina - Sigma-Aldrich Corporation (São Paulo, Brasil).
● Triptona – Himedia Laboratories (Mumbai, Índia).
● Monooleato de polioxietileno (20) sorbitano, Polissorbato 80 - LaBelle ativos
Especialidades químicas Ltda (Curitiba, PR, Brasil).
4.1.1. Microorganismo
A cianobactéria Arthrospira platensis foi obtida da Coleção de Culturas do
Laboratório de Fisiologia e Cultivo de Algas do Instituto de Biologia da Universidade
Federal Fluminense (UFF).
31
4.1.2. Cabelo
Para o desenvolvimento deste trabalho foram recebidas doações de mechas de
cabelo feminino, preto caucasiano, sem tratamento químico. As mechas de cabelo
humano loiro (descolorido), 50 cm de comprimento, foram adquiridas
comercialmente da empresa Beauty Spread Comércio Eireli ME (Rio de Janeiro,
Brasil).
4.1.3. Protetor solar para cabelos
Nos ensaios de radiação da fibra capilar, utilizou-se como controle positivo um
produto capilar comercial, contendo etilhexil metoxicinamato (EHMC) como filtro
solar. A escolha deste produto foi baseada nas características da formulação, que
além de conter filtro solar, apresenta aminoácidos hidrolisados e antioxidantes em
sua composição.
4.2. Equipamentos e acessórios
● Agitador magnético sem aquecimento 761-5 – Fisatom (São Paulo – Brasil)
● Autoclave Q190.23 série 802668 – Quimis Aparelhos Científicos Ltda
(Diadema, Brasil).
● Balança analítica AG-200 – Gehaka (São Paulo, Brasil).
● Bancada de Fluxo Laminar Vertical Pachane – Pachane Equipamentos para
Laboratório (Piracicaba, Brasil)
● Banho de ultrassom – USC-800 – Unique (São Paulo, Brasil).
● Banho seco Equatherm Temp-Blok Module Heater 137-455 – Curtin Matheson
Scientific, Inc. (Texas, Estados Unidos da América)
● Crosslinkers UV UVP CL-1000 365 nm (UVA) e 302 nm (UVB), modelo CL-
1000 L – Ultraviolet Products Ltd, (Upland, Estados Unidos da América).
● Cubeta de quartzo de 1,0 cm de caminho óptico – Prolab (São Paulo, Brasil).
● Destilador de água NT 425 – Quimis Aparelhos Científicos Ltda (Diadema,
Brasil).
● Espectrofotômetro BYK-Gardner, modelo Colorview 9000 (Arizona, Estados
Unidos da América)
● Espectrofotômetro no infravermelho por Refletância Total Atenuada (ATR) -
Thermo Scientific modelo Nicolet iS50 ATR (Madison, Estados Unidos da
América)
32
● Espectrofotômetro UV-Visível modelo 2600 – Shimadzu (Kioto, Japão).
● Estufa para cultura bacteriológica DeLeo – De Leo Equipamentos
Laboratoriais (Porto Alegre, Brasil)
● Filtro de membrana em nylon, 0,45 µm – Allcrom (São Paulo, Brasil)
● Fita indicadora universal de pH – Merck (Kenilworth, Estados Unidos da
América).
● Microscópio eletrônico de varredura TESCAN VEJA 3LMU (Brno -
Kohoutovice República Tcheca)
● Microscópio estereoscópio binocular Zeiss, modelo Stemi 2000-C com
sistema de luz artificial Zeiss KL 1500LCD e câmara digital AxioCam MRcS
Imagens obtidas tratadas pelo software Axio Vs 40 V4.4 Carl Zeiss Vision
GmbH (Jena, Alemanha)
● pHmetro digital SP 1800 – Sensoglass (São Paulo, Brasil).
4.3. Métodos
4.3.1. Cultivo de Arthrospira platensis
Antes de iniciar os experimentos, foram produzidos inóculos através do cultivo do
microrganismo em meio Zarrouk, cuja composição é descrita na Tabela 1. Os meios
de cultivo foram inoculados com concentração inicial padronizada de inóculo de 50
mg/L.
33
Tabela 1: Composição do meio Zarrouk para cultivo de A. platensis.
Constituinte Concentração (g/L)
NaHCO3 18,0
NaNO3 2,5
K2SO4 1,0
NaCl 1,0
K2HPO4 0,5
MgSO4 ·7 H2O 0,2
Na2EDTA 0,08
CaCl2 0,04
FeSO4∙7 H2O 0,01
H3BO3 2,86 x 10-3
MnCl2 ∙4 H2O 1,8 x 10-3
ZnSO4∙7H2O 0,22 x 10-3
Cu2SO4 0,08 x 10-3
(NH4)6Mo7O24∙4H2O 0,02 x 10-3
Vitamina B12 5 x 10-9
O cultivo da cianobactéria A. platensis foi realizado em frascos erlenmeyer de 2
L contendo 900 mL de cultivo (meio Zarrouk e inóculo). O meio de cultivo e todos os
materiais necessários à inoculação da A. platensis foram previamente esterilizados
em autoclave a 120ºC ± 2 por 30 min., sob pressão de 1 atm.
Os cultivos foram mantidos sob agitação promovida por insuflamento de ar
filtrado, com vazão específica de aeração de 1,5 volume de ar por volume de meio
(vvm), por meio de bombas de aquário (Figura 10). A temperatura foi mantida a 32
ºC ± 2. A iluminação foi fornecida continuamente, através de lâmpadas fluorescentes
frias. A intensidade de luz incidente sobre a superfície dos frascos de cultivo foi
ajustada com medidor de radiação luminosa para 70 µmoles de fótons/m2.s.
34
Figura 10: Cultivo de Arthrospira platensis em meio Zarrouk
4.3.2. Obtenção do pigmento natural Ficocianina (FC)
No 21º dia de cultivo, a biomassa (Figura 11) produzida foi determinada através
da medida do peso seco. Para isso, foram retiradas alíquotas de 10 mL do meio,
que foram centrifugadas a 8.000 rpm por 30 minutos a 5ºC. O sobrenadante (meio
de cultura) foi retirado com auxílio de pipeta Pasteur e o volume foi completado com
água destilada. O conteúdo foi levado novamente à centrífuga, nas mesmas
condições, para lavagem das células e remoção dos sais do meio. Após a lavagem,
a água foi removida com auxilio de pipeta Pasteur e o pellet (biomassa sedimentada)
transferido para balão de 10 mL, para retornar ao volume inicial. A solução resultante
foi filtrada sob vácuo em membrana de 0,22 µm, seguida de secagem em estufa a
105°C ± 2, até peso constante.
A biomassa cultivada foi filtrada sob vácuo em papel de filtro (Figura 11) e
submetida a dois ciclos de congelamento lento, para promover o rompimento da
parede e das membrana celulares e liberar o conteúdo intracelular, rico em
ficobiliproteínas. Após esse processo, a amostra foi descongelada a temperatura
ambiente e 10 mL foram transferidos para cada tubo de centrífuga e diluídos em 20
35
mL de água destilada. As amostras foram centrifugadas a 8.000 rpm por 20 minutos
a 25ºC ± 2. O sobrenadante, que constitui o extrato aquoso, rico em ficobiliproteínas,
foi cuidadosamente retirado com o auxílio de uma pipeta Pasteur e filtrado em papel
de filtro qualitativo de 45 µm para retirada de fragmentos celulares e posterior
quantificação das ficobiliproteínas. O processo de centrifugação foi repetido mais
duas vezes, após nova diluição do conteúdo celular restante no tubo de centrífuga
em água destilada.
Figura 11: Biomassa obtida por filtração a vácuo, após 21 dias de cultivo da cianobactéria
A. platensis (A), e diluída em tubo de centrífuga (B).
O extrato filtrado foi levado ao espectrofotômetro para quantificação das
ficobiliproteínas, através da medida da absorbância nos máximos de absorção de
cada ficobiliproteína avaliada, que ocorrem nos comprimentos de onda de 620
(ficocianina - FC) e 650 nm (aloficocianina - AFC). Foi utilizada água destilada como
branco. As concentrações de FC e AFC foram estimadas através das equações
cromáticas de Bryant, descritas por Chapman e Kremer (1988). Os resultados
obtidos expressam as estimativas das concentrações de cada ficobiliproteína. Nas
equações (1 e 2) abaixo, A620 e A650 representam os valores de absorbância em 620
e 650 nm, respectivamente, e CFC e CAFC representam as concentrações de FC e
AFC, em mg/mL, respectivamente.
A B
36
Equação 1: 𝐹𝑖𝑐𝑜𝑐𝑖𝑎𝑛𝑖𝑛𝑎 (𝑚𝑔/𝑚𝐿) = {𝐴620−(0,72 𝑥 𝐴650)}
6,29
Equação 2: 𝐴𝑙𝑜𝑓𝑖𝑐𝑜𝑐𝑖𝑎𝑛𝑖𝑛𝑎 (𝑚𝑔/𝑚𝐿) = {𝐴650−(0,191 𝑥 𝐴620)}
5,79
Adicionalmente foi obtido o espectro de varredura no UV-vísivel (200 a 750
nm) para caracterização do perfil do extrato de ficobiliproteínas. As leituras pontuais
nas absorbâncias em 620 nm e 650 nm e os espectros de varredura dos extratos
foram determinados em espectrofotômetro. A concentração das ficobiliproteínas na
biomassa foi expressa em mg%. Os resultados foram analisados utilizando o
programa STATISTICA 12.0.
4.3.3. Preparação das microemulsões
Foram desenvolvidas microemulsões pelo método de titulação descrito por
Falcão (2007), a partir da construção de diagramas de fases pseudoternários. A fase
oleosa, contendo o óleo e a quantidade de tensoativos e cotensoativos requeridos
para o preparo de todas as razões dos diagramas de fases, foi pesada em um
béquer e mantida em agitação magnética. Após a homogeneização da fase oleosa,
com obtenção de uma mistura turva, a fase aquosa, composta por água destilada, foi
adicionada por gotejamento sob constante agitação magnética até a obtenção de
uma solução límpida. A quantidade de água utilizada nesse processo foi calculada e,
em seguida, manteve-se a adição de água até a turvação da mistura, calculando-se
novamente a quantidade de água utilizada. Caso a mistura da fase oleosa fosse
límpida, adicionava-se água destilada apenas até a turvação da mesma. A região de
microemulsão foi caracterizada pela variação no aspecto físico do sistema, fazendo-
se atravessar um feixe de laser a fim de determinar a obtenção de um sistema
isotrópico.
A massa total da fase oleosa pesada foi de 20g. Foram construídos cinco
diagramas, conforme mostra a Tabela 2, com dois sistemas tensoativo/cotensoativo
(TA/CoTA), utilizados em diferentes proporções a fim de determinar o melhor
sistema microemulsionado utilizando óleo de coco virgem.
37
Tabela 2: Componentes utilizados nos diferentes diagramas ternários desenvolvidos e seus
respectivos valores de equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL).
Diagrama Tensoativo Cotensoativo
Razão
Tensoativo:
Cotensoativo
EHL
A
PEG 40 óleo de
rícino
hidrogenado
Monooleato de
sorbitano 1:3 5,5
B
PEG 40 óleo de
rícino
hidrogenado
Monooleato de
sorbitano 1:1 6,6
C Polissorbato 80 Monooleato de
sorbitano 1:3 7,0
D Polissorbato 80 Monooleato de
sorbitano 1:1 9,6
E Polissorbato 80 Monooleato de
sorbitano 3:1 12,3
4.3.4. Preparação do gel de hidroxietilcelulose
Foi preparada uma base galênica gelificante de característica hidrofílica,
utilizando como componente modificador de viscosidade e reologia, a
hidroxietilcelulose. Trata-se de polímero não-iônico derivado de celulose que vem
sendo amplamente estudado como veículo para diversos fármacos (ABBAS et al.,
2018, AMIN et al., 2015). Todos os componentes da formulação foram pesados
separadamente, conforme Tabela 3. Em um béquer, adicionou-se o propilparabeno e
o propilenoglicol, que foram mantidos em agitação magnética até completa
dissolução do conservante. Em um segundo béquer, a hidroxietilcelulose e o
metilparabeno foram dissolvidos em água recém destilada e esta solução foi
38
gotejada sobre o primeiro béquer, sob agitação magnética constante e temperatura
ambiente. À esta mistura foram adicionadas gotas de trietanolamina até atingir pH
igual a 6,5. Após completa dispersão dos componentes, a agitação foi mantida por
mais 5 minutos.
Tabela 3: Componentes e percentuais das concentrações empregadas para a preparação
do hidrogel.
Componentes Concentração (%)
Hidroxietilcelulose 2,0
Propilenoglicol 5,0
Metilparabeno 0,2
Propilparabeno 0,2
Trietanolamina q.s.
Água destilada q.s.p. 100
4.3.5. Desenvolvimento das formulações contendo extrato e avaliação da
estabilidade
A partir dos resultados encontrados com os diferentes diagramas de fase, foram
selecionadas três formulações para a incorporação do extrato liofilizado, obtido a
partir de A. platensis, nas concentrações de 0,25%, 0,5% e 1,0% (p/p). O extrato foi
adicionado à fase aquosa nas emulsões e na solução de hidroxietilcelulose e
metilparabeno do hidrogel. As formulações foram preparadas (25,0 g) conforme
descrito anteriormente, acondicionadas em frascos de vidro, protegidas da luz e
mantidas em geladeira (5ºC ± 2).
As formulações foram avaliadas durante 15 dias segundo os seguintes
parâmetros:
● Características sensoriais (aspecto visual, homogeneidade, cor e odor);
● pH: Realizado em temperatura ambiente, utilizando pHmetro previamente
calibrado com soluções tampão de fosfato (pH 7) e biftalato (pH 4) (TAS et al.,
2003);
39
● Viscosidade: Avaliada com o viscosímetro rotacional de Brookfield, no qual a
viscosidade é medida através da velocidade de rotação de eixos metálicos
(spindle) imersos na amostra (BROCK et al, 2008). O tipo de spindle foi
escolhido de forma que os valores de torque se encontrassem entre 10% e
90% nas velocidades selecionadas (Namburu et al., 2007). Esta avaliação foi
realizada em temperatura ambiente (25ºC ± 1), com leitura em centiPoise
(cP). Para a leitura da viscosidade, a amostra foi colocada em um bécher de
vidro, utilizou-se o spindle R6 com rotação de 20, 30, 50, 60 e 100 rpm e
intervalo de 3 minutos entre as leituras em cada velocidade de rotação.
Com base nos resultados obtidos foi eleita uma formulação contendo o extrato
para o tratamento da fibra capilar e demais análises. Esta formulação foi novamente
preparada (60g, em triplicata) e armazenada conforme descrito anteriormente por 48
horas, tempo necessário para estabilização da formulação, segundo Capucho
(2007). Após esse período, foram realizadas as análises no chamado “tempo zero”
(T0) e as amostras foram mantidas em refrigeração por mais 60 dias, sendo
avaliadas em triplicata, nos intervalos de 1, 15, 30, 45 e 60 dias segundo os
seguintes parâmetros:
● Características sensoriais (aspecto visual, homogeneidade, cor e odor);
● pH utilizando pHmetro conforme descrito anteriormente;
● Viscosidade utilizando viscosímetro de Brookfield conforme descrito
anteriormente. A análise estatística dos resultados foi feita com base nos
valores de viscosidade obtidos com 50 rpm, pois estes apresentaram um
percentual de torque do aparelho mais próximo a 50%, possibilitando maior
precisão na medida.
● Teor de ficobiliproteínas: As formulações foram analisadas por
espectrofotometria nos comprimentos de onda: 620 e 650 nm (RASTOGI,
SONANI, MADAMWAR, 2015), utilizando como branco a formulação isenta do
extrato. As concentrações de ficobiliproteínas foram calculadas utilizando as
equações cromáticas de Bryant (Equações 1, 2 e 3) e comparadas com as
concentrações encontradas em T0.
40
4.3.6. Avaliação da capacidade antioxidante
O extrato aquoso de A. platensis e a formulação contendo o extrato foram
avaliadas quanto ao potencial antioxidante pelo método de captura do radical livre
DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila). Este método baseia-se na transferência de
elétrons onde, por ação de um antioxidante ou uma espécie radicalar, o DPPH, que
possui cor púrpura, é reduzido formando difenil-picril-hidrazina, de coloração
amarela, podendo essa reação ser monitorada pelo decréscimo da absorbância
(NASCIMENTO et al, 2011; KUMAR et al., 2018). A absorbância foi medida
utilizando um espectrofotômetro UV-Vis no comprimento de onda 518 nm, tendo
como controles positivos Trolox® e Butilhidroxitolueno (BHT).
A solução de DPPH 0,3 mM foi preparada com metanol em balão volumétrico
âmbar e mantida ao abrigo da luz. Para a realização do teste, foram preparadas 5
diluições, em triplicata, da formulação escolhida em metanol. Em ambiente escuro,
transferiu-se 1,0 mL da solução de DPPH em um tubo contendo 2,5 mL da amostra
diluída. Após homogeneizadas, as amostras foram incubadas por 30 minutos em
temperatura ambiente (25ºC ± 2), ao abrigo da luz e procedeu-se a leitura no
espectrofotômetro a 518 nm. Os controles negativos foram preparados
imediatamente antes da leitura em frasco de vidro e ao abrigo da luz, utilizando 0,5
mL da formulação sem extrato (branco) ou 0,5 mL de água destilada, 2,0 mL de
metanol e 1,0 mL de DPPH.
Após a realização da leitura, a capacidade da amostra de eliminar o radical
DPPH (% de atividade antioxidante) foi calculada segundo a Equação 3 (AKPINAR-
BAYIZIT et al., 2016):
Equação 3: Atividade Antioxidante (%) = (AControle(-) – AAmostra) x 100
AControle(-)
Onde:
AControle(-): valor de absorbância do controle negativo
AAmostra: valor de absorbância da amostra
A curva padrão de DPPH foi construída plotando-se o valor médio da
atividade antioxidante (%) x concentração final do analito (mg/mL) e identificando-se
a região de linearidade. Os dados foram tratados por regressão linear simples e a
41
concentração necessária do analito para reduzir em 50% a concentração inicial do
radical DPPH (CE50) foi determinada a partir das equações das retas obtidas (y = ax
+ b), através da Equação 4 (AKPINAR-BAYIZIT et al., 2016):
Equação 4: CE50 (µg/mL) = (50 − b)
a
4.3.7. Determinação in vitro do fator de proteção solar (FPS)
A formulação contendo extrato foi diluída em álcool etílico absoluto na
concentração final de 0,2 µg/mL para leitura no espectrofotômetro UV-Vis, tendo
como branco a formulação sem extrato. As leituras foram realizadas em triplicatas e
as absorbâncias das soluções das amostras foram medidas na faixa de 290 a 320
nm com intervalos de 5 nm, conforme descrito por Mansur (1984) (Equação 5). Os
resultados foram calculados pelos valores originais e expressos como a média de
todos os valores.
Equação 5: FPS espectrofotométrico = FC . Σ EE (λ) . I (λ) . abs (λ)
Em que:
FC = Fator de correção (=10)
EE (𝛌) = Efeito eritematogênico da radiação de comprimento de onda (𝛌)
I (𝛌) = Intensidade do sol no comprimento de onda (𝛌)
Abs (𝛌) = leitura espectrofotométrica da absorbância da solução do filtro solar no
comprimento de onda (𝛌)
As constantes EE e I foram pré-definidas por Mansur (1984), conforme Tabela 4.
42
Tabela 4: Efeito eritematogênico (EE) versus intensidade do Sol (I) em função do
comprimento de onda (𝛌) pré-definindos por Mansur (1984) para o cálculo do FPS in vitro.
𝛌 (nm) EE (𝛌) x I (𝛌)
290 0,0150
295 0,0817
300 0,2874
305 0,3278
310 0,1864
315 0,0839
320 0,0180
𝚺 1,0000
4.3.8. Ensaios toxicológicos: Testes de mutagenicidade e de
fotomutagenicidade utilizando Salmonella
Este ensaio foi realizado no Laboratório de Mutagênese Ambiental (LABMUT) da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Foram utilizadas duas cepas
padrão preconizadas pela Organização para Cooperação e Desenvolvimento
Econômico (OECD, 1997): TA102 e TA104. Estas cepas apresentam características
genéticas adicionais que lhe conferem maior sensibilidade na detecção de diversos
tipos de agentes mutagênicos (Tabela 5). A cepa TA102 possui um par de bases
extra no locus hisG428, o qual foi inserido com o plasmídeo pAQ1, que lhe confere
resistência à tetraciclina, além da capacidade de detectar mutações por substituição
de pares de base A:T por C:G, enquanto a cepa TA104 apresenta uma mutação no
locus hisG46 e é capaz de reverter combinações de pares de bases, por
substituições/transversões e pares A:T por C:G. O gene uvrB é deletado na cepa
TA104, levando à deficiência no sistema de reparo por excisão de nucleotídeos,
resultando em aumento da sensibilidade na detecção de mutágenos. Além disso, as
cepas possuem uma mutação no gene rfa, importante na síntese dos
43
polissacarídeos que compões a parede celular de bactérias gram negativas,
facilitando a permeação de grande moléculas (OECD, 1997; AIUB et al., 2004.
STANKEVICINS et al., 2008).
Tabela 5: Características genéticas das linhagens de Salmonella typhimurium e controles
positivos (mutágenos ou fotoprotetores) utilizados para cada fenótipo.
Cepa TA102 TA104
Mutação his pAQ1 (hisG428)1 hisG461
Plasmídeo pKm 101, pAQ1 pKM 101
Outras mutações Rfa2 rfa2, Δ(uvrBbio) 3
Tipo de mutação
detectada Substituição A:T por G:C Substituição A:T por G:C
Controle positivo
Sem UV
Mitomicina C (CAS: 50-07-7)
0,5 µg/placa
Metilmetano sulfonato (CAS:
66-27-3)
250 µg/placa
Controle positivo
Com UV
8-Metoxipsoraleno
10 µg/placa
Benzofenona
400 µg/placa
Legenda: 1his = mutação na síntese da histidina; 2rfa = alteração de permeabilidade da
membrana; 3uvrB = Deleção do gene uvrB.
Fonte: Adaptado de MORTELMANS e ZEIGER, 2000.
Para o procedimento de ensaio foi utilizado o protocolo de pré-incubação
desenvolvido por Maron e Ames (1983). As cepas de S. typhimurium foram
incubadas em 10 mL de meio lisogênico (meio LB) (10 g/L triptona; 5,0 g/L extrato de
levedura; 10 g/L NaCl), contendo 8 μg/mL de ampicilina e/ou 2 µg/mL de tetraciclina
(ambas para TA102 e apenas ampicilina para TA104), à 37°C ± 2 sob agitação de
150 a 170 rpm até as suspensões bacterianas alcançarem fase estacionária de
crescimento (1-2 x 109 células/mL). Em tubos previamente esterilizados foram
adicionados 500 μL de tampão fosfato (27,6 g/L NaH2PO4.H2O e 28,4 g/L
Na2HPO4.H2O; 0,2 mol/L, pH 7,4) 100 μL de cultura da linhagem e 100 μL da
44
amostra teste (GFC) em diferentes concentrações, do controle negativo (GB) ou do
controle positivo (de acordo com cada linhagem).
Os tubos foram homogeneizados e incubados a 37°C ± 2 por 20 minutos com
agitação (shaker). Após esse tempo, foram adicionados aos tubos 2,0 mL de ágar de
superfície contendo solução de histidina e biotina (7 g/L ágar; 5 g/L NaCl; 0,0105 g/L
L-histidina; 0,0122 g/L D-biotina, pH 7,4) mantidas a 45ºC ± 2, e a mistura final foi
vertida sobre uma placa de Petri com 20 mL de Meio Mínimo Glicosado (15 g/L ágar,
meio Vogel-Bonner 10X [10 g/L MgSO4.H2O; 100 g/L C6H8O7.H2O; 500 g/L K2HPO4;
175 g/L Na2NH2PO4.4H2O, contendo 40 g/L glicose). Em seguida, as placas foram
incubadas a 37ºC ± 2 por 72 horas e as unidades formadoras de colônia (UFC)
revertentes His+ foram contadas manualmente (Figura 12) (FERNANDES, et al.,
2017; ARAUJO-LIMA, et al., 2018).
Figura 12: Placas incubadas em estufa a 37ºC para teste de Ames.
Para o ensaio de fotomutagenicidade foram seguidos os passos de pré-
incubação, tais como descritos acima e em outros estudos (WANG et al., 2003;
GOCKE et al, 2003; WATANABE-AKANUMA et al., 2007) utilizando-se as cepas
TA102 e TA104. Amostras do gel branco (GB) e de diferentes concentrações (0,031
%, 0,062 %, 0,125 %, 0,25 %, 0,5 % e 1,0 %) da formulação contendo extrato (GFC)
foram utilizadas neste ensaio, obedecendo ao mesmo processo descrito para o
Teste de Ames. Após o endurecimento da mistura vertida em placas de Petri
contendo ágar mínimo, as placas foram submetidas à radiação UVA, utilizando o UV
45
Crosslinker (365nm), nas doses de 1,3 J/cm2/s e 0,04 J/cm2/s, para as cepas TA102
e TA104, respectivamente. Estas doses foram selecionadas com base em ensaios
realizados por Fernandes e colaboradores (2018). Em seguida, as placas foram
incubadas a 37°C ± 0,5 e ausência de luz por 72 horas e o número de colônias
revertentes foi contado manualmente. O teste foi realizado em triplicata, utilizando-se
como controles positivos o mutágeno 8-metoxipsoraleno (8-MOP) (10 µg/placa) para
a linhagem TA102 e o protetor contra radiação UV, benzofenona-3 (BZE) (400
µg/placa) para TA104 (CAMPOS, 2015; FERNANDES, et al., 2017).
A amostra foi considerada mutagênica quando o número de revertentes His+
foi significativo em relação ao controle negativo (p ≤ 0,05) e o índice de
mutagenicidade (razão do número de revertentes da amostra pelo número de
revertentes do controle negativo) foi igual ou superior a dois (I.M. ≥ 2)
(MORTELMANS & ZEIGER, 2000; FERNANDES et al., 2018).
Para cada ensaio foi realizado o teste de viabilidade (titulação), cujo propósito
foi avaliar se o número de bactérias encontrava-se na faixa de 1,0 – 2,0 x 109
células/mL. O teste consistiu na transferência de 10 µL de suspensão para um
microtubo contendo 990 µL de solução de cloreto de sódio (0.9 %, m/v). Foram feitas
mais duas diluições seriadas 10² e do último tubo, 100 µL foram transferidos para
uma placa de ágar nutriente, constituído de extrato de levedura, triptona, cloreto de
sódio, bacto ágar e água destilada. A suspensão foi distribuída de forma uniforme
sobre a placa, com o auxílio de pérolas de vidro em movimentos circulares (diluição
10-7), conforme Figura 13. Este teste foi realizado em triplicata e as placas foram
incubadas a 37°C por 24 horas para posterior contagem das UFCs.
Figura 13: Teste de viabilidade das células bacterianas (FERRAZ, 2015).
46
4.3.9. Tratamento da fibra capilar
Para este estudo, foram seccionadas mechas de cabelo humano da porção mais
próxima à raiz, preto natural e loiro descolorido, com 20 cm de comprimento e 0,5 g,
que foram divididas em 12 grupos (Tabela 6).
Tabela 6: Descrição dos grupos de mechas de cabelo humano.
Mechas Sem
tratamento Formulação sem extrato
Formulação com 0,5% de extrato
Filtro Solar
Não irradiadas
STN GBN GFCN CPN
Radiação UVA
STA GBA GFCA CPA
Radiação UVB
STB GBB GFCB CPB
As mechas selecionadas foram previamente lavadas com solução de lauril sulfato
de sódio (LSS) (2,0% p/p), para a remoção do sebo natural e outros resíduos da
superfície do cabelo, e secas naturalmente em temperatura ambiente (25ºC ± 2). O
procedimento de lavagem seguiu as seguintes etapas propostas por Richena, 2015
(Figura 14):
a) Molhar a mecha com água corrente de torneira à temperatura ambiente;
b) Aplicar 0,5 mL da solução de LSS à mesma;
c) Lavar delicadamente por 1 minuto;
d) Deixar a mecha mergulhada em água corrente por 30s.;
e) Repetir os passos b) e c);
f) Deixar a mecha em água corrente por mais 2 minutos;
g) Pentear a mecha 4 vezes com pente de polietileno comum para
desembaraça-la;
h) Secar a mecha em temperatura ambiente e armazená-la.
47
Figura 14: Esquema de limpeza das mechas de cabelo.
As mechas de cabelo dos grupos GFCA, GFCB e GFCN foram tratadas com a
formulação contendo o extrato de ficobiliproteínas que apresentou maior estabilidade
nos estudos de pré-formulação (GFC). As mechas dos grupos GBA, GBB e GBN,
foram tratadas com a formulação isenta do extrato, também chamada de branco
(GB). Nos grupo CPA, CPB e CPN, as mechas foram tratadas com protetor solar
comercial para cabelos, enquanto nos grupos STA, STB e STN não houve aplicação
de formulações para o tratamento, procedendo-se apenas as sequências de
lavagem.
As formulações, assim como o produto comercial, foram aplicadas manualmente
da raiz para a ponta das mechas na proporção de 0,2 g de produto por grama de
cabelo (NOGUEIRA, 2003) e reaplicadas após o término de cada ciclo de exposição
das mechas à radiação UVA/UVB e nas mechas não irradiadas. No entanto, antes
de cada nova aplicação, foi precedida a limpeza das mechas com solução de LSS
2% (p/p) conforme descrito anteriormente.
(a) (b)
(c)
(d)
(e) (f) (g)
48
4.3.10. Exposição das mechas à radiação UV
As mechas de cabelo dos Grupos STA, GBA, GFCA e CPA foram expostas à
radiação UVA, utilizando o UV Crosslinker. Por sua vez, as dos Grupos STB, GBB,
GFCB e CPB foram submetidas à radiação UVB. As mechas foram distribuídas na
plataforma interna do equipamento e rotacionadas na metade do tempo de
irradiação, de forma que ambos os lados fossem expostos à mesma quantidade de
radiação. Esta etapa foi realizada no Laboratório de Mutagênese Ambiental
(LABMUT) da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ).
As amostras de cabelo foram expostas em condições que simulam o espectro
solar. Para tal simulação, foi calculada a intensidade de radiação necessária para
cada aparelho. Em estudos realizados por Richena (2015), mechas de cabelo foram
irradiadas durante cinco horas (entre 9 h e 14 h, durante o horário de verão, período
em que a intensidade da radiação ultravioleta é maior). A intensidade da luz emitida
pelo sol foi medida com um radiômetro e os valores de intensidade obtidos foram:
UVB = 2,3 ± 0,3 W/m2, UVA = 31 ± 8 W/m2, Vis = 148 ± 14 W/m2 e IV = 557 ± 19
W/m2, com temperatura média de 33 ± 4 °C e umidade relativa média do ar (UR) de
44 ± 13%. A dose de radiação em J/m2 é igual à intensidade (W/m2) x tempo de
exposição (s). Desta forma, 5 horas de exposição das mechas ao sol correspondem
a 1 dia ou 1 ciclo, cuja dose de radiação UVA equivale a 55,8 J/cm2 e radiação UVB
a 4,14 J/cm2. Portanto, as mechas foram irradiadas no equipamento durante 23
ciclos, correspondendo à 115 h de exposição solar. Ao término de cada ciclo, todas
as mechas foram lavadas com solução de LSS 2% (p/p), inclusive as pertencentes
aos Grupos STN, GBN, GFCN e CPN.
4.3.11. Caracterização capilar
Após o término dos 23 ciclos de tratamento e irradiação, as mechas de cabelo
foram caracterizadas quanto a diferentes parâmetros físicos e químicos e
comparadas com amostras sem tratamento.
A composição química do cabelo foi avaliada por espectroscopia de
reflectância total atenuada na região do infravermelho com transformada de Fourier
(ATR-FTIR). Esta técnica é capaz de fornecer uma rápida identificação qualitativa e
quantitativa de constituintes orgânicos e inorgânicos em biomateriais (MOHAMMED,
JALEELI, AHMAD, 2017). Os espectros das amostras foram obtidos na faixa de 500
49
a 4000 cm-1 com resolução de 0,01 cm-1, utilizando o espectrômetro Thermo
Scientific modelo Nicolet iS50 ATR. As medidas foram realizadas após os 23 ciclos
de lavagem e exposição à radiação UV. Antes de qualquer medição foi coletado um
espectro de fundo e subtraído pra zerar o equipamento (BOLL et al. 2017). A Tabela
7 apresenta os valores das principais bandas encontradas na fibra capilar através
desta técnica.
Tabela 7: Valores das principais bandas encontradas na fibra capilar obtidos por FTIR
(MONTEIRO, 2003).
BANDAS (cm-1) ATRIBUIÇÃO DOS GRUPOS
1650 – 1630 C = O Amida primária
1520 – 1510 C – H e N – H Amida secundária
1453 – 1443 CH2 e CH3 Amida terciária
1384 – 1350 CH3 Amida secundária
1235 – 1230 C – N e N – H Amida terciária
1180 – 1170 S = O monóxido de cistina
1042 – 1038 S = O Ácido sulfônico
Para o método, pesou-se em triplicata, em um papel de seda isento de
nitrogênio, 0,050 g de amostra de cabelo misturada com 0,5 g de catalisador
formado pela mistura de sulfatos de cobre e de potássio. Esta mistura foi depositada
em um tubo de digestão contendo 2,0 mL de ácido sulfúrico concentrado e digerida,
em bloco digestor, a 420ºC por cerca de 6 horas ou até a solução tornar-se límpida
no tubo digestor. Depois de arrefecer, foram adicionados ao tubo 5,0 mL de água
recém destilada e o mesmo foi acoplado a um aparelho de destilação por arraste de
vapor (semi-microKjeldahl). Durante a destilação, gotejou-se no tubo uma solução de
hidróxido de sódio 40% (p/v) até alcalinização da solução, que reage com o sulfato
de amônio formado na etapa anterior para formar amônia (substância volátil). A
amônia foi recolhida em um erlernmeyer contendo 5,0 mL de ácido bórico e duas
gotas de solução indicadora de pH (vermelho de metila / verde de bromocresol) e
50
quantificada através de titulação volumétrica, utilizando ácido sulfúrico de título
conhecido até a viragem do indicador de pH de verde para vermelho, anotando-se o
volume de ácido utilizado. A concentração de nitrogênio determinada foi convertida
em proteína, considerando-se que cada 1,0 g de nitrogênio corresponde a 6,25 g de
proteína (BAKER, WARD, 2018). Esta análise foi realizada no Laboratório de
Bromatologia da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense
(UFF).
A morfologia do fio capilar foi analisada por microscopia eletrônica de varredura
com captação de imagem (NOGUEIRA, 2008). Para tal, após os 23 ciclos de
lavagem e/ou exposição à radiação UV, um fio de cabelo de cada grupo de mechas
foi seccionado em região próxima à raiz e fixado em um stub metálico com fita de
carbono. Estas amostras foram revestidas por uma fina película de ouro e
analisadas em Microscópico Eletrônico de Varredura (MEV) para avaliação das
cuticulas. As imagens foram geradas com aumentos de 2.000 e 5.000 vezes e barra
de escala de 50 µm e 20 µm, respectivamente. Esta análise foi realizada no
Laboratório de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) –
Polo Xerém.
Adicionalmente, foi avaliada a variação de cor das mechas de cabelo após os
ciclos de irradiação, utilizando o Espectrofotômetro BYK-Gardner, modelo Colorview
9000 com o sistema CIE-Lab. Este sistema permite a representação gráfica dos
parâmetros de cor em diagramas cromáticos Yxy no espaço colorimétrico L* a* b*
através do tratamento matemático das intensidades das radiações correspondentes
às cores vermelho, verde e azul, onde L* indica o grau de luminosidade, que varia de
0 (preto) a 100 (branco), e a* e b* são coordenadas cromáticas que indicam
vermelho/verde e amarelo/azul, respectivamente (Figura 15).
51
Figura 15: Coordenadas do espaço de cor L*, a*, b* do sistema CIE-Lab de cores
oponentes onde L* é a coordenada de luminosidade, a* é a coordenada vermelho-verde e
b*, a coordenada amarelo-azul (Adaptado de U.S. Department of Transportation, 2013).
A partir da medição dos parâmetros L*, a* e b* pelo espectrofotômetro,
calculam-se as diferenças de cor:
DL* - parâmetro de diferença de luminosidade, sendo positivo se mais claro e
negativo se mais escuro
Da* - parâmetro de diferença de cor na coordenada vermelho-verde, sendo positivo
se mais vermelho e negativo se mais verde
Db* - parâmetro de diferença de cor na coordenada amarelo-azul, sendo positivo se
mais amarelo e negativo se mais azul.
Os valores dos parâmetros de diferença correspondem à subtração entre os
valores obtidos para uma amostra e uma referência, onde DE é o parâmetro de
diferença de cor total (Equação 6). Como referência, foi usada a própria mecha
antes de passar por qualquer tratamento, sendo considerada como padrão para a
obtenção da diferença de cor após o tratamento (WAGNER, 2006).
Equação 6: DE = (DL*2 + Da*2 + Db*2)1/2
Foram obtidas triplicatas de medidas, alterando a posição dos fios no porta-
amostras do equipamento. Os ensaios foram realizados utilizando-se as mechas de
L* = 100
(Branco) Amarelado
Avermelhado
- b*
Azulado
L* = 0
(Preto)
Esverdeado a*
- a*
b*
52
cabelo após 23 ciclos de lavagem e/ou irradiação. Os resultados foram considerados
significativos quando os valores de DE* > 1,2; DL* > 1,1; Da* > 0,3 e Db* > 0,3, pois
valores menores que estes podem ser obtidos devido à variabilidade intrínseca
(Tabela 8) de cor da própria mecha de cabelo (RICHENA, 2011).
Tabela 8: Resultados da variação intrínseca de cor obtida para as mechas utilizadas neste
trabalho.
Tipo de Mecha DL* Da* Db* DE*
Cabelo caucasiano
preto natural 0,12 ± 0,10 0,05 ± 0,15 0,12 ± 0,17 0,43 ± 0,01
Cabelo loiro
descolorido 0,37 ± 0,06 0,10 ± 0,26 0,04 ± 0,10 0,38 ± 0,16
4.3.12. Análise Estatística
As análises foram realizadas em triplicata e os dados foram avaliados
estatisticamente com o auxílio do programa GraphPad Prism 5.01 (GraphPad
Software Inc., San Diego, USA), analisados por one-way ANOVA, seguido do pós-
teste correlativo de Tukey. Em todas as análises, as diferenças foram consideradas
significativas quando p < 0,05.
53
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Determinação da biomassa e do conteúdo de ficobiliproteínas (FB)
O peso seco calculado para a biomassa foi de 2,25 g/L, rendimento superior
aos obtidos por Barros (2010) e Pelizer et al. (2003), onde os pesos secos
encontrados foram de 1,41 g/L e 1,3 g/L, respectivamente. Estima-se, portanto, que
com o cultivo de 12,0 L da cianobactéria Arthrospira platensis em meio Zarrouk,
foram obtidas 27,0 g de biomassa. Esta foi filtrada sob vácuo em papel de filtro e
congelada para posterior processo de extração (PEPE; RIZZO, 2011). As
concentrações de ficobiliproteínas estimadas através da equação cromática de
Bryant estão dispostas na Tabela 9.
Tabela 9: Estimativa da concentração (mg/mL) de cada ficobiliproteína presente no extrato
aquoso de A. platensis.
Pigmento Concentração (mg/mL)
Ficocianina (FC) 2,24
Aloficocianina (AFC) 1,00
Adicionalmente, foi obtido o espectro de varredura no UV-visível (200 a 750
nm) do extrato aquoso a fim de verificar a presença de pigmentos fotossintéticos
(Figura 16). Dessa forma, foi possível confirmar a ocorrência do pigmento azul da
ficocianina (FC) pela presença do pico característico em 620 nm. Também foram
observados picos entre 300 e 400 nm decorrentes da fluorescência, causada nesta
região pelo triptofano e por resíduos de tirosina e fenilalanina. O pico com
comprimento de onda de emissão de 450 nm, presente no espectro, é atribuído à
Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato (NADPH), um produto primário da
fotossíntese. Além disso, o espectro exibiu dois picos de proteína característicos, o
primeiro localizado em 228 nm reflete as cadeias laterais de aminoácidos
(particularmente tirosina, triptofano, fenilalanina, histidina e metionina) que absorvem
luz fortemente nesta região do espectro. O segundo pico de absorção, mais fraco
que o primeiro, entre 240-300 nm, é atribuído aos resíduos de aminoácidos
aromáticos (triptofano, tirosina e fenilalanina) e à ligação dissulfeto, que constituem
54
os cromóforos que absorvem nessa região (BENELHADJ et al., 2016). Espectros
semelhantes foram obtidos por Benelhadj et al. (2016) em estudos que avaliaram o
efeito do pH nas propriedades funcionais de um isolado proteico obtido da A.
platensis.
Figura 16: Espectro de varredura no UV-visível (200 – 750 nm) do extrato de
ficobiliproteínas obtido da Arthrospira platensis, em destaque o pico característico
da ficocianina (FC) em 620 nm.
5.2. Desenvolvimento das formulações microemulsionadas
As microemulsões foram preparadas utilizando-se diferentes proporções de
agentes emulsionantes, óleo e água a partir da construção dos diagramas de fases
pseudoternário. As zonas de microemulsão encontradas para os diferentes
diagramas de fase construídos com óleo de coco estão apresentadas na Figura 17.
FC
55
Figura 17: Zona de microemulsão delimitada nos diagramas de fase pseudoternários A
(PEG 40 óleo de rícino hidrogenado / Monooleato de sorbitano (1:3), B (PEG 40 óleo de
rícino hidrogenado / Monooleato de sorbitano 1:1), C (Polissorbato 80 / Monooleato de
sorbitano 1:3), D (Polissorbato 80 / Monooleato de sorbitano 1:1) e E (Polissorbato 80 /
Monooleato de sorbitano 3:1).
Entre os sistemas testados, o diagrama E apresenta maior proporção do
agente polar (polissorbato 80) em relação ao apolar (monooleato de sorbitano)
B A
C D
E
56
representando, portanto, o sistema com maior EHL (EHL = 12,3) conforme mostra a
Tabela 2. A maior zona de microemulsão foi identificada para esse sistema, sendo
por isso, selecionados pontos deste diagrama para a incorporação do extrato em
diferentes concentrações. As formulações contendo PEG 40 óleo de rícino
hidrogenado apresentaram dificuldades durante a etapa de homogeneização da fase
oleosa, por esse motivo, não foram desenvolvidas emulsões com PEG 40 óleo de
rícino hidrogenado / monooleato de sorbitano na razão de 3:1.
Em estudos realizados por Rukmini et al. (2012), visando o desenvolvimento
de microemulsões com óleo de coco virgem e tensoativos não iônicos ternários, foi
formulada com sucesso uma microemulsão contendo 75% de óleo e uma proporção
de surfactante e água de 4,5:1 ou superior. Os tensoativos utilizados nesse estudo
foram monooleato de sorbitano, monolaurato de sorbitano e polissorbato 20, com
variação do EHL de 6,0 a 8,0. No presente estudo, foram obtidos resultados
semelhantes para o mesmo intervalo de EHL, no entanto, foi observado aumento da
zona de microemulsão com o aumento do EHL.
5.3. Incorporação do pigmento nas formulações microemulsionadas
Do diagrama E (Figura 17), foram selecionados três pontos (Tabela 10 e
Figura 17), que continham maior proporção da fase aquosa, com o intuito de
solubilizar maior quantidade do extrato hidrofílico, e baixo percentual do sistema
TA/CoTA, a fim de evitar possíveis irritações dérmicas que podem ser causadas por
estes agentes.
Tabela 10: Microemulsões desenvolvidas com óleo de coco e Polissorbato 80 / Monooleato
de sorbitano (3:1).
Formulação Água (%) Óleo (%) TA/CoTA (%)
M1 14,0 34,5 51,5
M2 15,0 42,5 42,5
M3 10,0 36,0 54,0
57
As formulações microemulsionadas apresentaram estabilidade visual durante o
tempo analisado, no entanto, a incorporação do extrato levou à instabilidade visível
após 48 horas em temperatura ambiente (Figura 18). Apesar de serem consideradas
termodinamicamentes estáveis, microemulsões podem tornar-se instáveis sob
determinadas condições, como quando algum de seus componentes sofre
alterações químicas ou se as condições ambientais, a que está exposta, são
alteradas (McClements, 2012). Portanto, acredita-se que a adição do extrato tenha
resultado em alterações químicas na composição, o que também é evidenciado pela
mudança de coloração do produto, com visível alteração da cor característica do
extrato de A. platensis, rico no pigmento azul ficocianina.
Figura 18: Microemulsões M1, M2 e M3 contendo 0,5% (p/p) de extrato, após 48 horas
em temperatura ambiente.
5.4. Incorporação do pigmento no gel
O gel hidrofílico contendo 0,25% e 0,5% (p/p) do extrato aquoso de A. platensis
apresentou estabilidade visual durante o estudo. No entato, as formulações
contendo 1,0% (p/p) de extrato apresentaram precipitação dentro dos primeiros 15
dias, em temperatura de geladeira. O gel hidrofílico com concentração de 0,5% (p/p)
(Figura 19) foi selecionado para a continuação do estudo, por se tratar do maior teor
de ficocianina que se mostrou estável na formulação testada.
M1 M2 M3
58
A estabilidade do gel foi avaliada durante um período de 60 dias, quanto às
características sensoriais, pH, viscosidade e teor de ficocianina. Todas as
formulações apresentaram aspecto homogêneo e odor característico do gel durante
os 60 dias. As formulações branco se mantiveram incolores durante todo o período
avaliado, enquanto as formulações contendo 0,5% (p/p) de extrato mantiveram
coloração azul, sem alteração visual perceptível do tom. As amostras não
apresentaram variação de pH, mantendo-se 6,5 ± 0,1, conforme ajustado com a
trietanolamina durante a etapa de preparação. É importante que as características
sensorias do produto, como cor e odor, por exemplo, se mantenham sem alterações
durante o período de estocagem, uma vez que essas características podem
influenciar na eficácia e qualidade do produto e ainda na aceitação pelo consumidor.
Figura 19: (A) Gel branco de hidroxietilcelulose (GB) e (B) gel de
hidroxietilcelulose contendo 0,5% (p/p) de extrato de A. platensis (GFC).
5.5. Avaliação da estabilidade
As formulações branco e contendo o extrato, foram analisadas quanto à
viscosidade, entre 20 e 100 rpm, em viscosímetro do tipo Brookfield. A viscosidade
A B
59
de uma formulação é definida como a resistência de um determinado material a um
fluxo e, desta forma, a resistência é proporcional à viscosidade (MANÇO et al.,
2015). Os resultados obtidos estão apresentados nas Figuras 20 e 21.
Figura 20: Gráfico de viscosidade x velocidade do gel branco (GB) após 2, 15, 30 e 60
dias de preparo.
Figura 21: Gráfico de viscosidade x velocidade do gel contendo 0,5% (p/p) de extrato de
A. platensis (GFC) após 2, 15, 30 e 60 dias de preparo.
Como visto nas Figuras 20 e 21, todos os géis apresentaram comportamento
pseudoplástico (não-Newtoniano), onde a viscosidade aparente não é constante,
pois observa-se um decréscimo de viscosidade gradualmente, à medida que
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0 20 40 60 80 100 120
Vis
cosi
da
de
(m
Pa
.s)
Velocidade (rpm)
Viscosidade GB
Dia 2
Dia 15
Dia 30
Dia 60
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 20 40 60 80 100 120
Vis
cosi
da
de
(m
Pa
.s)
Velocidade (rpm)
Viscosidade GFC
Dia 2
Dia 15
Dia 30
Dia 60
60
aumenta a velocidade de cisalhamento. Portanto, eles atendem ao comportamento
mais comum e desejável para uma formulação semissólida de uso externo,
facilitando o espalhamento do produto sem que ocorra escorrimento (AULTON,
2005). O comportamento pseudoplástico ocorre porque no repouso, a partículas e/ou
cadeias poliméricas que compõem o liquido encontram-se desorientadas,
entrelaçadas ou enoveladas, mantendo uma ordem irregular que gera uma alta
viscosidade. Com o aumento da taxa de cisalhamento as partículas se orientam e se
alinham, facilitando o escoamento e, diminuindo assim a sua viscosidade
(SCHRAMM, 2006).
Não foi possível observar diferença significativa (p > 0,05, ANOVA e Tukey’s) entre
os valores de viscosidade dos géis em relação ao tempo, na velocidade de 50 rpm.
No entanto, é possível observar que as formulações contendo o extrato de A.
platensis (GFC) apresentaram viscosidades menores em relação ao gel branco
(GB), o que pode vir a influenciar na espalhabilidade do produto, uma vez que a
redução da viscosidade aumenta a facilidade de aplicação (MELO et al., 2013). Este
decréscimo da viscosidade pode ter sido causado por um aumento no alinhamento
das cadeias poliméricas do gel, devido à presença do extrato de A. platensis, ou
ainda pela degradação dos polissacarídeos de alta massa molecular, produzindo
polissacarídeos de menor massa ou monossocarídeos (Wu et al., 2010).
Resultados semelhantes foram obtidos em estudos realizados por Coelho et al.
(2016), onde foi desenvolvida uma formulação em gel de hidroxietilcelulose contendo
o extrato hidroetanólico das folhas de goiabeira (Psidium guajava L.) para posterior
avaliação da estabilidade e da capacidade antioxidante. Neste estudo, as amostras
também foram classificadas como pseudoplásticas e observou-se um decréscimo da
viscosidade nas formulações contendo o extrato, quando comparadas ao gel puro.
A análise de viscosidade aparente foi realizada a fim de avaliar o sistema quanto
à estabilidade nas condições de armazenamento e pelo tempo proposto. Dessa
forma, outras avaliações de reologia seriam importantes para caracterizar o
comportamento da formulação em diferentes condições.
A fim de avaliar o teor de ficocianina presente na formulação, ao longo do tempo,
foram realizadas medidas da absorbância (λ = 620 nm e 650 nm) nos tempos 2, 15,
30 e 60 dias após o preparo. As médias da concentração de ficocianina foram
calculadas utilizando a equação cromática de Bryant. O teor de FC da formulação
em gel GFC não apresentou alteração significativa (p > 0,05, ANOVA e Tukey’s) após
61
60 dias (Tabela 11). Adicionalmente, foi realizado o espectro de varredura das
formulações (Figura 22) que corrobora com os resultados encontrados, mostrando
manutenção do perfil, com discreta redução do pico referente à FC (seta)
proporcional ao tempo decorrido.
Tabela 11: Concentração de Ficocianina (FC) (mg/L) nas formulações em gel contendo
0,5% (p/p) de extrato de A. platensis, após 2, 15, 30 e 60 dias de preparo.
Tempo (dias) Concentração de FC (mg/L)
2 0,13 ± 0,0
15 0,13 ±0,1
30 0,12 ± 0,1
60 0,11 ± 0,1
Figura 22: Comparação entre as varreduras, obtidas por espectrofotometria no UV-vis
(200-800 nm), para os géis de hidroxietilcelulose contendo 0,5% (p/p) de extrato de A.
platensis nos dias 2 (azul escuro), 15 (rosa), 30 (roxo) e 60 (azul claro) após o preparo.
62
5.6. Determinação da capacidade antioxidante
O método fotocolorimétrico do DPPH foi utilizado para avaliar a propriedade
sequestrante de radicais livres do extrato de A. platensis e da formulação
desenvolvida. Como controles positivos utilizou-se o Trolox® e o BHT. Os gráficos
que relacionam a porcentagem da atividade antioxidante com a concentração final
do analito de Trolox®, BHT, extrato aquoso obtido de A. platensis e formulação
contendo o extrato na concentração de 0,5% encontram-se nas Figuras 23, 24, 25 e
26, respectivamente.
Figura 23: Inibição do radical DPPH pelo Trolox® (controle).
Figura 24: Inibição do radical DPPH pelo BHT (controle).
y = 8,4118x + 20,53R² = 0,988
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 2 4 6 8 10Ati
vid
ade
anti
oxi
dan
te (
%)
Concentração (µg/mL)
Atividade antioxidante de Trolox
y = 5,7374x + 23,007R² = 0,9853
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 2 4 6 8 10Ati
vid
ade
anti
oxi
dan
te (
%)
Concentração (µg/mL)
Atividade antioxidante de BHT
63
Figura 25: Inibição do radical DPPH pelo extrato aquoso rico em FC, obtido de A. platensis.
.
Figura 26: Inibição do radical DPPH pelo gel 0,5% (p/p) de extrato aquoso de A. platensis.
O CE50 obtido para o extrato, após liofilizado, foi de 2,35 µg de extrato por mL.
Tendo o gel hidrofílico como veículo, a formulação contendo 0,5% (p/p) do extrato
liofilizado apresentou CE50 igual a 0,75 mg/mL, ou seja, 3,75 µg expressos em
extrato liofilizado por mL. Os controles positivos, Trolox® e BHT, apresentaram CE50
superiores aos do extrato, 3,50 µg/mL e 4,70 µg/mL, respectivamente. Esses
resultados sugerem que o extrato apresenta atividade sequestradora do DPPH
superior aos antioxidantes sintéticos utilizados como controle positivo.
y = 0,5359x + 51,259R² = 0,9809
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 10 20 30 40 50 60 70 80Ati
vid
ade
anti
oxi
dan
te (
%)
Concentração (µg/mL)
Atividade antioxidante do Extrato de FB
y = 34,138x + 24,5R² = 0,9721
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6Ati
vid
ade
anti
oxi
dan
te (
%)
Concentração (µg/mL)
Atividade antioxidante de Gel 0,5%
64
Em estudo realizado por Shalaby & Shanab (2013) para determinar o
potencial antioxidante de extratos aquosos e metanolicos de A. platensis, o extrato
aquoso demonstrou atividade antioxidante superior pelo método do DPPH. Este
comportamento foi atribuído pelos autores à alta concentração de pigmentos de
ficobiliproteínas (8,23 mg/g) e fenóis no extrato, devido aos altos níveis de
substâncias biologicamente ativas, tais como, esteróis, flavonoides, açúcares
redutores, taninos e antraquinonas.
Os resultados obtidos no presente estudo para a atividade antioxidante do
extrato de A. platensis foram superiores aos encontrados por Golkamani et al.
(2018). Em estudo com o objetivo de aprimorar a estabilidade oxidativa do óleo de
Clupeonella cultrientris caspia através do uso do extrato de Arthrospira platensis
como um antioxidante natural, os autores concluíram que o extrato reduziu
significativamente o radical DPPH (CE50 = 0,78 ± 0,09 mg/mL). Este resultado foi
relacionado ao teor fenólico total, que foi de 38,04 ± 3,07 mg equivalente ao ácido
gálico/g. Estudo semelhante foi realizado por Omidi, Sarhadi e Shahdadi (2018),
visando a melhora da estabilidade oxidativa do óleo de gergelim pelo uso do extrato
metanólico de A. platensis, onde foi observado menor (40 ppm) CE50 para o BHT e
maior (100 ppm) para o extrato metanólico de A. platensis. Neste mesmo estudo, o
conteúdo fenólico total encontrado na cianobactéria foi de cerca de 68,72 mg/g de
ácido gálico por grama da cianobactéria.
5.7. Determinação do FPS in vitro
O fator de proteção solar é um indicador universal, usado para representar o
nível de proteção provido pelo filtro solar contra queimaduras que podem ser
causadas por energia solar UV (STERVANATO; BERTELLE; FABRIS, 2014). No
presente trabalho, o método espectrofotométrico desenvolvido por Mansur (1986) foi
usado para mensurar o FPS da formulação contendo 0,5% de extrato de A.
platensis. Este método foi escolhido por se tratar de um teste rápido e facilmente
reprodutível.
O valor de FPS calculado para o gel desenvolvido foi de 0,15 ± 0,02. A
formulação não demonstrou ação fotoprotetora significativa (p < 0,05, ANOVA e
Tukey’s) em relação ao gel branco.
65
Resultados semelhantes foram obtidos por Mansur et al. (2016), visando avaliar a
eficácia in vitro e in vivo de formulações fotoprotetoras contendo extratos
antioxidantes de Bauhinia microstachya var. massambabensis Vaz. O estudo
mostrou que formulações contendo filtros solares sintéticos associadas ao extrato
não apresentaram diferença significativa no FPS quando comparadas à formulações
contendo apenas filtro solar (16,9 ± 0,62 e 17,0 ± 0,25, respectivamente). Ao passo
que as formulações contendo apenas extrato apresentaram valor de FPS muito
baixo (0,70 ± 0,06) e não foram consideradas formulações fotoprotetoras. No
entanto, em estudos in vivo, os produtos associados ao extrato apresentaram maior
FPS em relação aos que continham exclusivamente filtro solar (17,90 ± 3,35 e 13,48
± 1,99, respectivamente). O maior FPS in vivo das formulações contendo extrato,
quando comparado com a formulação sem extrato, poderia ser atribuído à atividade
sequestradora das moléculas antioxidantes presentes nos extratos vegetais que
atuam capturando as ERO. No presente estudo, apesar de identificada a atividade
antioxidante pelo método do DPPH do extrato de A. platensis, sua concentração na
formulação é baixa, reduzindo assim não só essa atividade, como também o FPS.
5.8. Ensaios toxicológicos de mutagenicidade e fotomutagenicidade
O ensaio de Salmonella/microssoma (ou teste de Ames) é reconhecido
mundialmente por comunidades científicas e agências governamentais e
amplamente utilizado como uma triagem inicial para determinar o potencial
mutagênico de novos produtos e fármacos, uma vez que há um alto valor preditivo
para a carcinogenicidade de roedores (FERNANDES et al., 2018). Trata-se de um
ensaio de curta duração que emprega cepas de Salmonella typhimurium derivadas
da parental LT2, tais como TA97, TA98, TA100, TA102 e TA104, cada um dos quais
carrega uma mutação diferente em um dos vários genes do operon que codifica a
biossíntese de histidina, levando à deficiência na síntese desse aminoácido e
inviabilizando seu crescimento em meio pobre em histidina. Entretanto, essas
mutações podem ser revertidas quando as cepas entram em contato com
mutágenos, levando ao crescimento dessas linhagens, mesmo em meio pobre em
histidina (FERRAZ, 2011; THORNE et al., 2016; FERNANDES et al., 2017).
As linhagens usadas nesse trabalho podem reverter espontaneamente a
auxotrofia para histidina (His-) e assim crescer em um meio pobre no referido
aminoácido, o que pode ser observado no controle negativo dos ensaios. Esta é uma
66
reversão espontânea relativamente fraca que pode ser aumentada através de
mutações. Cada linhagem tem uma faixa característica de reversão espontânea e o
aumento desta taxa permite a avaliação da mutagenicidade das substâncias
analisadas (MARON; AMES, 1983; FERRAZ, 2011). A Tabela 12 mostra a faixa de
reversão espontânea para as linhagens TA102 e TA104.
Tabela 12: Taxa de reversão espontânea, em número de colônias revertentes/placa,
esperada para as cepas de S. typhimurium (TA102 e TA104) utilizadas neste trabalho
(MORTELMNS, ZEIGER, 2000).
Linhagens Taxa de reversão esperada
TA102 100 – 300
TA104 200 - 300
Este ensaio é uma ferramenta útil para identificar substâncias capazes de
produzir danos genéticos, resultando em mutações (FERRAZ, 2011). As Figuras 27
e 28 apresentam os resultados obtidos (números de revertentes) para diferentes
concentrações do gel contendo extrato aquoso de A. platensis, avaliado pelo ensaio
de Salmonella/microssoma na ausência de metabolização exógena, seguindo o
protocolo de pré-incubação e utilizando cepas TA102 e TA104, que detectam
mutações de substituição de pares de bases. O gel isento de extrato foi utilizado
como branco. Os respectivos índices de mutagenicidade (I.M.) estão apresentados
acima das barras verticais, sendo que valores superiories a 2,0 indicam
mutagenicidade positiva.
67
TA 102
Branco MTC 0,062 0,125 0,25 0,5 1,00
1000
2000
3000
Concentração (%)
Nú
mer
o d
e re
vert
ente
s
Figura 27: Gráfico da relação dose-resposta do gel contendo 0,5 % (p/p) de extrato de A.
platensis no ensaio de Salmonella/microssoma usando a linhagem TA102 de S.
thyphimurium. *p < 0,05 relativo ao controle negativo por ANOVA e Tukey’s HSD; MTC =
Mitomicina C (0,5 µg/placa).
TA 104
Branco MMS 0,062%0,125% 0,25% 0,5% 1%0
100
200
300
400
Concentração (%)
Nú
mer
o d
e re
vert
ente
s
Figura 28: Gráfico da relação dose-resposta do gel contendo 0,5 % (p/p) de extrato de A.
platensis no ensaio de Salmonella/microssoma usando a linhagem TA104 de S.
thyphimurium. *p < 0,05 relativo ao controle negativo por ANOVA e Tukey’s HSD; MMS =
Metilmetano sulfonato (250 µg/placa).
* 0,8
* 0,9
* 0,8
* 0,6
* 0,7
* 1,4
* 0,8
0,9
* 0,8
* 0,7
* 0,6
* 10,72
Concentração da amostra (%)
Concentração da amostra (%)
68
De acordo com as Figuras 27 e 28, a formulação contendo o extrato de A.
platensis apresentou resultados estatisticamente significativos na redução do
número de colônias revertentes das amostras analisadas tanto para a cepa TA102
(com exceção da concentração de 0,125%) quanto para TA104, quando comparado
ao controle negativo (gel branco).
O sistema de teste de fotomutagenicidade (FotoAmes) tem ajudado na
detecção precoce de substâncias potencialmente fotocancerígenas. No entanto,
ainda não existem requisitos regulamentares para o ensaio de fotomutagenicidade,
exceto uma diretriz emitida pelo Comitê Científico de Cosmetologia (SSC) sobre o
teste de protetores solares para a genotoxicidade fotoquímica, na qual este ensaio
foi baseado. Para determinar a fotomutagenicidade do extrato, foram utilizadas
estrategicamente as cepas TA102 e TA104. Ambas as cepas são geneticamente
semelhantes, contendo pares de bases AT na mutação hisG428 e uma mutação
ocre, TAA. O hisG428 pode ser revertido por transições e transversões ou por
agentes causadores de dano oxidativo. No entanto, a cepa TA102 é proeficiente em
reparo de excisão e isso aumenta o potencial de detecção de reticulação
(FERNANDES et al., 2017).
As Figuras 29 e 30 apresentam a relação dose-resposta do extrato de A.
platensis associado à formulação em gel no ensaio de fotomutagenicidade utilizando
as cepas TA102 e TA104, irradiadas na dose de 1,3 J/cm² e 0,04 J/cm²,
respectivamente.
69
TA 102 UV
Sem UV Branco 8-MOP 0,062% 0,125% 0,25% 0,5% 1%0
1000
2000
Concentração (%)
Nú
mero
de r
evert
en
tes
Figura 29: Gráfico da relação dose-resposta do gel contendo 5,0 % (p/p) de extrato de A.
platensis no ensaio de Salmonella/microssoma após irradiação UVA de 0,04 J/cm² usando a
linhagem TA102 de S. thyphimurium. *p < 0,05 relativo ao controle negativo por ANOVA e
Tukey’s HSD; 8-MOP = 8-metoxipsoraleno (10 µg/placa).
TA 104 UV
Sem UV Branco Benzofenona0,031% 0,062% 0,125% 0,25% 0,5%0
1000
2000
Concentração (%)
Nú
mero
de r
evert
en
tes
Figura 30: Gráfico da relação dose-resposta do gel contendo 5,0 % (p/p) de extrato de A.
platensis no ensaio de Salmonella/microssoma após irradiação UVA de 0,04 J/cm² usando a
linhagem TA104 de S. thyphimurium. *p < 0,05 relativo ao controle negativo por ANOVA e
Tukey’s HSD; BZE = Benzofenona-3 (400 µg/placa).
BZE
0,9
0,9
0,8 0,9
0,9 0,9
* 0,8 0,9
* 0,4
Concentração da amostra (%)
* 6,1 0,9
* 0,7 0,9
* 0,5 0,9
* 0,8 0,9
* 0,7 0,9
* 0,6 0,9
Concentração da amostra (%)
70
Na dose de radiação UVA utilizada para a linhagem TA102 de S. thyphimurium,
as amostras analisadas não induziram aumento das colônias revertentes (Figura 28),
diferentemente do controle positivo. Ao invés disso, foi observada redução
estatisticamente significativa (p < 0,5) no número de revertentes em relação ao
controle negativo, sugerindo um grau de proteção contra mutações do tipo
substituições/transversões, sob condições de exposição à radiação UVA.
Para as cepas TA104 (Figura 29), não foi constatada redução significativa no
número de colônias revertentes em baixas concentrações da amostra. Porém, a
maior concentração testada (0,5 ug/placa), demonstrou reduzir significativamente (p
< 0,5) o número de colônias revertentes quando comparada ao controle negativo.
Este número, no entanto, foi superior ao encontrado com o controle positivo,
Benzofenona-3 (BZE). A BZE é um filtro solar químico presente nos principais
produtos fotoprotetores comercializados no Brasil, cujo uso e concentração são
definidos pela ANVISA através da RDC nº 69 de 23 de março de 2016 (BRASIL,
2016) e foi utilizado neste estudo para fins comparativos em relação ao efeito
fotoprotetor. De acordo com os resultados apresentados, a formulação demostrou
potencial atividade fotoprotetora, porém esta atividade foi menor que a oferecida
pelo filtro químico, BZE.
5.9. Morfologia das fibras capilares
A radiação UV representa uma potente fonte de dano à fibra capilar, gerando
modificações em sua estrutura, principalmente na cutícula, e que resultam em
redução do brilho, ressecamento, textura áspera, alteração da cor e fragilidade.
Neste estudo, foi utilizada a microscopia eletrônica de varredura com captura de
imagem para investigar alterações na morfologia da cutícula capilar por
fotodegradação. Essa técnica é muito conveniente para o mapeamento de amostras,
uma vez que é capaz de produzir imagens de alta resolução e amplificação da
superfície, permitindo avaliar a aparência geral da fibra capilar, suas alterações
morfológicas e estruturais, além da ocorrência de depósitos de partículas na
superfície do fio (ARAÚJO, 2015; RICHENA, 2015).
As imagens de microscopia eletrônica de varredura da fibra capilar sem
tratamento e não irradiada (STN) submetida a 23 ciclos de lavagem, demonstraram
cutículas predominantemente inteiras para o cabelo virgem (Figura 30 (I)), porém
uma área de descamação cuticular severa (retângulo), provavelmente decorrente de
71
agressões durante a lavagem do cabelo ou no ato de pentear. As cutículas
analisadas nesse trabalho são da região central do fio capilar e, por esse motivo, é
esperado que apresentem algumas partes danificadas, uma vez que a região central
do fio deve ter sido submetida a cuidados diários anteriores. Os cuidados diários
com os cabelos, tais como o ato de pentear de maneira repetida ou lavagens
sucessivas, são fatores que contribuem para a fragmentação, quebra e perda de
células cuticulares (REICH et al., 2009). No cabelo descolorido foi possível observar
cutículas com bordas irregulares (setas) e levantadas, conforme exibido na Figura 31
(II).
Figura 31: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) não tratada e não irradiada, submetida a 23 ciclos de lavagem com LSS (2%). O
retângulo em (I) destaca uma área de extensa descamação cuticular; as setas em (II)
indicam cutículas com bordas irregulares.
As amostras sem tratamento e submetidas à radiação UVA (STA) por 115h,
simulando 23 ciclos de exposição solar, foram apresentadas na Figura 32. Em
ambos os tipos de mechas, foi observado um maior número de cutículas irregulares,
fragmentadas ou parcialmente retiradas (seta). Além disso, a superfície cuticular do
cabelo descolorido (Figura 32 (II)) encontra-se mais levantada, em comparação com
a fibra que não recebeu radiação. Resultados semelhantes foram encontrados por
Richena (2015), onde foi observada, em cabelo castanho comum, remoção de
camadas e formação de rachaduras nas cutículas e aparecimento de cavidades na
endocutícula, como efeito da fotodegradação.
I II
72
Figura 32: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) não tratada (ST) e submetida a 23 ciclos de radiação UVA. A seta em (II) indica cutícula
parcialmente retirada.
As amostras sem tratamento e submetidas à radiação UVB (STB) por 115h
estão apresentadas na Figura 33. Tanto o cabelo natural quanto o descolorido
apresentaram cutículas quebradas, levantadas (setas) e com bordas com formato
irregular. A extensa remoção das células cuticulares leva, consequentemente, à
exposição das camadas subjacentes, deixando o córtex menos protegido contra
fatores externos prejudiciais e contra a perda de água do fio. Esses efeitos foram
mais pronunciados na fibra capilar descolorida (Figura 33 (II)), onde foi observada
extensa descamação da cutícula, com exposição da endocutícula e do córtex
capilar. Segundo estudos realizados por Richena (2015), quando a endocutícula é
exposta, ela tende a ser a região mais danificada pela radiação. O estudo observou
que, quando irradiada por 230 horas com lâmpada de mercúrio, essa camada se
torna mais desigual e apresenta formação de cavidades. Os resultados também
mostraram que, sob estas condições, ocorrem alterações nas características da
endocutícula, que apresenta aspecto bem mais liso e ausência de cavidades no
cabelo que foi danificado por processo de lavagem sem exposição à radiação,
enquanto nos fios irradiados, apresenta-se porosa e de superfície irregular.
II I
73
Figura 33: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) não tratada (ST) e submetida a 23 ciclos de radiação UVB. As setas indicam cutículas
levantadas; C indica o córtex e E a endocutícula.
Avaliando-se a fibra capilar tratada com a formulação GFC, não irradiada e
submetida a 23 ciclos de lavagem (GFCN) foi possível identificar uma película
formada na superfície dos fios. Esta película foi mantida mesmo após a lavagem das
mechas com solução de LSS 2% (p/p). As células da cutícula mantiveram-se
sobrepostas, indicando preservação da integridade cuticular, mesmo após
sucessivas lavagens, conforme apresentado na Figura 34.
Figura 34: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação GFC e não irradiadas, submetidas a 23 ciclos de lavagem.
I II
II I
C
E
74
As amostras tratadas com a formulação GFC e submetidas à radiação UVA
(GFCA) e UVB (GFCB) por 115h, simulando 23 ciclos de exposição solar, estão
apresentadas nas Figuras 35 e 36, respectivamente. Em ambas as amostras foi
observada sobreposição das células cuticulares e formação de uma película que se
manteve mesmo após lavagem. Os cabelos apresentaram cutículas fechadas em
geral, embora seja possível encontrar algumas cutículas não uniformes, que
parecem ter sido quebradas (setas). No entanto, não foi observada remoção de
cutículas ou levantamento das mesmas. A manutenção das características
cuticulares é fundamental, uma vez que influencia diretamente na percepção de
brilho superficial e maciez do cabelo (REICH et al., 2009).
Figura 35: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação GFC e submetidas a 23 ciclos de radiação UVA. As setas
indicam cutículas com bordas irregulares
I II
75
Figura 36: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação GFC e submetidas a 23 ciclos de radiação UVB. As setas
indicam cutículas com bordas irregulares.
As micrografias eletrônicas das amostras não irradiadas e tratadas com a
formulação em gel isenta do extrato (GBN), indicam que também ocorreu formação
de película envolvendo a fibra capilar mesmo após lavagem (Figura 37), o que pode
vir a contribuir para a proteção do fio e redução da perda de água por oclusão.
Figura 37: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação GB e não irradiadas, submetidas a 23 ciclos de lavagem.
Quando expostas à radiação UVA (GBA) e UVB (GBB), as fibras naturais
tratadas com o veículo em gel sem extrato, mostraram preservação das células
I II
II I
76
cuticulares e do filme formado ao redor do fio, porém os cabelos descoloridos
apresentaram intensa remoção da camada cuticular com exposição da endocutícula
(setas) e do córtex (C) como podemos observar nas Figuras 38 e 39, principalmente
na fibra descolorida irradiada por UVB.
Figura 38: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação GB e submetidas a 23 ciclos de radiação UVA. As setas
indicam áreas de exposição da endocutícula e C do córtex.
Figura 39: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação GB e submetidas a 23 ciclos de radiação UVB. As setas
indicam áreas de exposição da endocutícula e C do córtex.
II I
II
C
C
C
I
C
C
77
As fibras capilares não irradiadas, tratadas com o produto contendo filtro solar
e submetidas a 23 ciclos de lavagem (CPN) encontram-se na Figura 40. Conforme
observado na imagem, a cutícula se manteve preservada, com células sobrepostas
ao longo de todo o fio. Esses efeitos podem ser atribuídos aos agentes
condicionadores presentes no produto com filtro solar, tais como silicone, ácidos
graxos e extratos vegetais, que atuam formando um filme de revestimento superficial
mantendo as células cuticulares mais unidas e sobrepostas (ARAÚJO, 2015).
Figura 40: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação CP e não irradiadas, submetidas a 23 ciclos de lavagem. As
setas indicam cutículas lentadas.
As amostras tratadas com o produto contendo filtro solar e submetidas a
radiação UVA (CPA) e UVB (CPB), simulando 23 ciclos de exposição à radiação
solar, encontram-se nas Figuras 41 e 42, respectivamente. As imagens obtidas das
fibras descoloridas submetidas à radiação UVA demonstraram extensos danos
cuticulares, com remoção de células da cutícula e exposição das camadas
subjacentes. Sob radiação UVB, no entanto, o cabelo descolorido demonstrou
poucos danos, com manutenção da sobreposição das camadas cuticulares e poucos
pontos de remoção e levantamento (seta) dessas células. Contudo, para o cabelo
natural, não foram observados danos pela exposição à radiação UVA, enquanto que
após exposição à radiação UVB, foi observado um maior número de cutículas
irregulares, levantadas (seta), e retiradas, além de exposição da endocutícula (E).
II I
78
Figura 41: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação CP e submetidas a 23 ciclos de radiação UVA. A seta indica a
endocutícula e C o córtex.
Figura 42: Micrografia Eletrônica de Varredura de fibra capilar preta natural (I) e descolorida
(II) tratadas com a formulação CP e submetidas a 23 ciclos de radiação UVB. As setas
indicam cutículas levantadas; E indica a endocutícula.
É importante ressaltar que as imagens obtidas por microscopia eletrônica de
varredura são realizadas a partir da observação de um fio de cabelo único,
representativo da mecha em análise. Desta forma, a avaliação da eficácia da
II I
II I
C
E
E
79
formulação GFC para proteção e/ou reparação das fibras capilares após exposição à
radiação UV foi baseada no conjunto das análises desenvolvidas neste estudo.
Nos estudos realizados por Richena (2015), concluiu-se que o efeito de remoção
de camadas e formação de rachaduras nas cutículas é causado pelas lavagens, mas
o aparecimento de cavidades na endocuticula é um efeito da fotodegradação. Com
base nisso, pode-se inferir que a formulação contendo o extrato demonstrou
fotoproteção do fio capilar descolorido, uma vez que em todos os demais
tratamentos foi observada a exposição do córtex neste tipo de cabelo, exceto nas
mechas tratadas com o gel contendo 0,5% (p/p) do extrato de A. platensis.
O cabelo natural, em geral, não demonstrou tantos danos decorrentes da
irradiação. Os resultados observados podem ser explicados pela presença de
pigmentos, muito mais abundantes na fibra natural, e que são capazes de absorver a
radiação UV e agir como fotoprotetor, ajudando a preservar as demais estruturas
capilares. No tratamento com a formulação desenvolvida a cutícula mostrou-se
predominantemente inteira e com células sobrepostas. Além disso, ocorreu
formação de uma película ao redor dos fios tratados com a formulação em gel, o que
pode contribuir para a manutenção da hidratação por mecanismo de oclusão.
Sabe-se que alguns dos mecanismos induzidos pela luz UV capazes de danificar
a fibra capilar envolvem a formação de ERO, a lipoperoxidação e a redução de
antioxidantes presentes naturalmente na estrutura capilar. Dessa forma, a
manutenção do aspecto do fio, observada nas mechas tratadas com GFC, pode ser
relacionada aos resultados da atividade antioxidante obtidos para o gel, sugerindo
que a ação fotoprotetora do produto seja resultado do efeito antioxidante exercido
pelo extrato na formulação, apesar de não ser identificado FPS pelo método de
Mansur.
5.10. Avaliação da composição química dos fios após tratamento e
irradiação UV
A composição dos aminoácidos no cabelo humano pode sofrer variações entre
indivíduos por influência de diversos fatores, tais como, genética, raça, tratamentos
químicos e radiação solar (COLENCI, 2007). Uma técnica utilizada para a rápida
avaliação sobre a natureza da fibra e sua composição é a espectroscopia de
80
reflectância total atenuada na região do infravermelho com transformada de Fourier
(ATR-FTIR). No entanto, esta técnica deve ser realizada em paralelo a métodos
visuais, como a microscopia eletrônica de varredura, para a interpretação dos dados,
a fim de contribuir para uma melhor definição dos resultados (COLENCI, 2007).
Os componentes de oxidação da cistina podem ser observados na banda
característica em 1040 cm-1 referente à vibração de estiramento assimétrico da
ligação S = O. A banda em 1076 cm-1 é referente às vibrações do esqueleto C – C,
enquanto a amida terciária aparece em 1237 cm-1. Os picos em 1395 cm-1 e 1451
cm-1 são inerentes às vibrações de curvatura C – H de grupos CH3 e CH2, ambos
encontrados em proteínas e lipídios. As amidas primárias e secundárias apresentam
pico característico em 1633 cm-1 e 1518 cm-1, respectivamente. Os picos em 2853
cm-1 e 2926 cm-1 são atribuídos ao alongamento das vibrações C – H dos grupos
CH2 e em 2877 cm-1 e 2958 cm-1 para os grupos CH3. A banda encontrada em 3287
cm-1 é característica do alongamento das ligações O – H, indicando a presença de
água na amostra. As bandas encontradas em 2350 cm-1 referem-se ao forte
estiramento assimétrico C = O do dióxido de carbono presente no ambiente
(RICHENA, REZENDE, 2015).
Dessa forma, cabelos expostos à radiação solar intensa terão índices de ácido
cisteico mais elevados do que os cabelos não expostos, uma vez que a radiação
promove a clivagem oxidativa das pontes dissulfídicas na queratina para grupos
sulfônicos (FERNÁNDEZ, 2012). Para entender as mudanças químicas na superfície
do cabelo em consequência da fotodegradação, as bandas em 1041 cm-1 (devido ao
estiramento S = O) e 2926 cm-1 (devido ao estiramento CH2) foram analisadas.
Essas bandas foram usadas como indicadoras de mudanças no grau de oxidação da
cistina e na quantidade de lipídeos presentes, respectivamente.
As Figuras 43, 44 e 45 apresentam os espectros ATR-FTIR das mechas naturais
não tratadas (ST) e tratadas (GFC, GB e CP), após 23 ciclos de lavagem com LSS
2,0% (Figura 43) e/ou exposição à radiação UVA (Figura 44) ou UVB (Figura 45). Os
espectros apresentaram perfis semelhantes, não sendo encontradas diferenças
significativas entre eles.
81
Figura 43: Espectro ATR-FTIR das mechas de cabelo preto natural não irradiadas sem
tratamento (STN - cinza), tratada com gel branco (GBN – rosa), com gel com 0,5% (p/p) de
extrato de A. platensis (GFCN – verde) e com filtro solar (CPN – azul) após 23 ciclos.
Figura 44: Espectro ATR-FTIR das mechas de cabelo preto natural irradiadas com radiação
UVA sem tratamento (STA - cinza), tratada com gel branco (GBA – rosa), com gel com
0,5% (p/p) de extrato de A. platensis (GFCA – verde) e com filtro solar (CPA – azul) após 23
ciclos.
82
Figura 45: Espectro ATR-FTIR das mechas de cabelo preto natural irradiadas com radiação
UVB sem tratamento (STB - cinza), tratada com gel branco (GBB – rosa), com gel com
0,5% (p/p) de extrato de A. platensis (GFCB – verde) e com filtro solar (CPB – azul) após 23
ciclos.
As Figuras 46, 47 e 48 apresentam os espectros ATR-FTIR das mechas
descoloridas não irradiadas (Figura 46) ou expostas à radiação UVA (Figura 47) ou
UVB (Figura 48), após 23 ciclos de tratamento.
Figura 46: Espectro ATR-FTIR das mechas de cabelo descolorido não irradiadas sem
tratamento (STN - cinza), tratada com gel branco (GBN – rosa), com gel com 0,5% (p/p) de
extrato de A. platensis (GFCN – verde) e com filtro solar (CPN – azul) após 23 ciclos.
83
Figura 47: Espectro ATR-FTIR das mechas de cabelo descolorido irradiadas com radiação
UVA sem tratamento (STA - cinza), tratada com gel branco (GBA – rosa), com gel com 0,5%
(p/p) de extrato de A. platensis (GFCA – verde) e com filtro solar (CPA – azul) após 23 ciclos
Figura 48: Espectro ATR-FTIR das mechas de cabelo descolorido irradiadas com radiação
UVB sem tratamento (STB - cinza), tratada com gel branco (GBB – rosa), com gel com
0,5% (p/p) de extrato de A. platensis (GFCB – verde) e com filtro solar (CPB – azul) após 23
ciclos.
Os resultados de ATR-FTIR mostraram um aumento significativo na quantidade
de cistina oxidada nas mechas de cabelo descolorido, quando comparadas ao
cabelo natural, o que é evidenciado pelo aumento de intensidade do pico em 1040
cm-1 (ácido cisteico, -SO3H). Esse resultado era esperado, uma vez que o processo
de descoloração por oxidação química do cabelo é, conhecidamente, responsável
pela quebra de ligações dissulfeto presentes na queratina. A oxidação da cistina
84
pode estar relacionada à degradação da endocutícula e da epicutícula (camada mais
externa da cutícula, rica em cistina), cuja oxidação pode causar protuberâncias na
superfície do fio (RICHENA, REZENDE, 2015). Nos espectros referentes às mechas
tratadas com a formulação comercial contendo filtro solar (CP) é possível observar
um pico em 2850 cm-1, devido ao conteúdo lipídico presente na formulação
comercial com filtro solar que permanece no cabelo mesmo após lavagem com LSS
2%.
5.11. Determinação do teor de proteínas nas fibras capilares
A quantidade de cabelo a ser pesada foi calculada com base na sensibilidade do
método, cuja detecção é de 0,7 a 1,4 mg de nitrogênio. Desta forma, considerando-
se que a porcentagem de nitrogênio no cabelo é de 15%, a quantidade mínima a ser
pesada deverá ser de 4,6 mg e a quantidade máxima de 9,3 mg. Portanto, cerca de
5 mg de cabelo foram utilizados para a realização dos ensaios. Os resultados da
análise referentes a 23 ciclos de lavagem e/ou exposição à radiação UV foram
apresentados nas Tabelas 13 e 14.
Tabela 13: Determinação de proteína total em mechas de cabelo preto natural, após 23
ciclos de lavagem e/ou exposição à radiação UV.
Mechas de cabelo preto
natural
Não irradiadas
(% p/p)
UVA
(% p/p)
UVB
(% p/p)
Sem tratamento 86,63 ± 0,2 84,00 ± 1,3 82,69 ± 0,4 *
Produto comercial 84,24 ± 0,5 84,13 ± 0,7 83,23 ± 0,5 *
Gel Branco 85,31 ± 0,3 77,25 ± 0,5 * 83,50 ± 0,5 *
GFC 86,50 ± 0,2 84,87 ± 0,3 84,32 ± 0,4
* Diferença significativa em relação às amostras sem tratamento e não submetidas à radiação UV
(p>0,05, ANOVA e Tukey’s).
Após 23 ciclos de lavagem e/ou exposição à radiação UV, não foram
observadas diferenças significativas (ANOVA e Tukey’s, p > 0,05) quanto ao teor
proteico entre o branco (sem tratamento e não irradiado – STN) e as amostras
85
tratadas com o gel contendo 5,0% (p/p) do extrato de A. platensis (GFC) na fibra de
cabelo natural. No entanto, as demais mechas apresentaram redução significativa no
teor de proteínas quando expostas à radiação UVB, incluindo a amostra tratada com
a formulação comercial contendo filtro solar. Sob radiação UVA, apenas as mechas
tratadas com o gel branco (GB) apresentaram redução estatisticamente significativa
(p < 0,05) no teor de proteínas.
Tabela 14: Determinação de proteína total em mechas de cabelo descolorido, após 23 ciclos
de lavagem e/ou exposição à radiação UV.
Mechas de cabelo
descolorido
Não irradiadas
(% p/p)
UVA
(% p/p)
UVB
(% p/p)
Sem tratamento 85,25 ± 0,2 81,25 ± 0,2 * 79,94 ± 0,4 *
Produto comercial 84,70 ± 0,5 84,81 ± 0,2 82,44 ± 0,4 *
Gel Branco 85,38 ± 0,2 82,31 ± 0,3 * 82,43 ± 0,4 *
GFC 85,50 ± 0,5 86,88 ± 0,2 84,13 ± 0,3
* Diferença significativa em relação às amostras sem tratamento e não submetidas à radiação UV
(p>0,05, ANOVA e Tukey’s).
De acordo com os resultados apresentados utilizando o cabelo descolorido, não
foram observadas diferenças significativas (ANOVA e Tukey’s, p > 0,05) após 23
ciclos de lavagem e/ou exposição à radiação UV, entre o branco (STN) e as
amostras tratadas com o gel contendo o extrato (GFC). As amostras sem tratamento
apresentaram redução significativa do seu teor proteico quando expostas a ambas
as radiações, UVA e UVB, assim como as mechas tratadas com a formulação sem
extrato (GB). O produto contendo filtro solar (controle positivo) não apresentou
proteção quanto à perda de proteínas causada pela radiação UVB sob a fibra
capilar, no entanto, quando exposta a radiação UVA, não foi observada diferença
significativa em comparação com o cabelo tratado com a formulação branco.
5.12. Variação de cor das mechas capilares
A cor e o brilho são propriedades importantes relacionadas à aparência do
cabelo, sendo a espectrofotometria de reflectância difusa (ERD) um dos métodos
86
mais utilizados para a sua medição. A ERD aplica o sistema de cor CIELab
(Commision International de L’éclairg) que fornece os parâmetros de cor pela
reflexão difusa, simulando as condições de percepção de cor do olho humano
(WAGNER, 2006). Assim, as medidas de reflectância difusa foram obtidas para
verificar, quantitativamente, se a cor do cabelo tratado com a formulação GFC sofre
alteração quando as mechas são expostas à radiação ultravioleta. O objetivo foi
verificar se o tratamento com esta formulação cosmética poderia ser eficaz na
manutenção da cor dos fios durante exposição solar. Desta forma, nas Tabelas 15 e
16 estão descritos os valores obtidos a partir da diferença entre os dados de análise
das mechas de cabelo após 23 ciclos de lavagem e/ou exposição à radiação UV,
comparadas com as mechas não tratadas e não irradiadas (STN), cujos valores de
referência são L* = 18,92; a* = 0,9, b* = 7,8 para o cabelo natural (Tabela 15) e L* =
78,5, a* = 0,7 e b* = 7,8 para o cabelo descolorido (Tabela 16).
Tabela 15: Valores dos parâmetros de diferença de cor (CIELab) obtidos para as mechas de
cabelo preto natural após 23 ciclos de tratamento e/ou exposição à radiação UV.
Grupo DL Da Db DE
GFCN -0,42 ± 0,0 -0,12 ± 0,2 -0,25 ± 0,2 0,50 ± 0,1
GBN 0,63 ± 0,3 0,21 ± 0,1 -0,38 ± 0,3* 0,76 ± 0,2
CPN -1,2 ± 0,4* -1,04 ± 0,1* -0,13 ± 0,3 1,59 ± 0,3*
GFCA -0,64 ± 0,3 0,07 ± 0,2 -0,15 ± 0,1 0,66 ± 0,2
GBA -0,05 ± 0,8 0,17 ± 0,1 -0,21 ± 0,1 0,27 ± 0,3
CPA -1,17 ± 0,3* -0,71 ± 0,2 * -0,38 ± 0,3* 1,42 ± 0,3*
STA -0,16 ± 0,6 -0,22 ± 0,3 0,14 ± 0,3 0,30 ± 0,4
GFCB 0,32 ± 0,7 0,09 ± 0,1 0,05 ± 0,2 0,34 ± 0,3
GBB -0,53 ± 0,1 -0,09 ± 0,1 -0,20 ± 0,0 0,57 ± 0,1
CPB -1,29 ± 0,3 * -0,44 ± 0,4* -0,30 ± 0,3* 1,39 ± 0,3*
STB -0,43 ± 0,0 -0,29 ± 0,3 -0,37 ± 0,9* 0,64 ± 0,4
* Diferença significativa em relação às amostras sem tratamento e não submetidas à radiação UV
(p>0,05, ANOVA e Tukey’s).
87
Tabela 16: Valores dos parâmetros de diferença de cor (CIELab) obtidos para as mechas de
cabelo descolorido após 23 ciclos de tratamento e/ou exposição à radiação UV.
Grupo DL Da Db DE
GFCN - 0,36 ± 0,7 -0,09 ± 0,1 -0,16 ± 0,2 0,40 ± 0,3
GBN 0,48 ± 1,1 -0,06 ± 0,1 -0,24 ± 0,4 0,54 ± 0,5
CPN -1,75 ± 0,1* -0,06 ± 0,0 0,34 ± 0,6* 1,78 ± 0,2*
GFCA -0,35 ± 0,8 0,01 ± 0,0 -0,07 ± 0,2 0,35 ± 0,3
GBA 0,10 ± 0,1 -0,46 ± 0,4* 0,19 ± 0,3 0,51 ± 0,3
CPA 0,73 ± 0,7 -0,11 ± 0,1 0,04 ± 0,2 0,74 ± 0,3
STA 0,16 ± 0,2 -0,26 ± 0,0 -0,26 ± 0,1 0,40 ± 0,1
GFCB -0,48 ± 0,5 -0,13 ± 0,1 -0,09 ± 0,3 0,50 ± 0,3
GBB -0,91 ± 0,1 0,02 ± 0,1 -0,09 ± 0,2 0,91 ± 0,1
CPB 0,14 ± 0,0 -0,06 ± 0,0 0,04 ± 0,2 0,16 ± 0,1
STB -0,17 ± 0,6 -0,36 ± 0,2* 0,00 ± 0,1 0,40 ± 0,3
* Diferença significativa em relação às amostras sem tratamento e não submetidas à radiação UV
(p>0,05, ANOVA e Tukey’s).
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 15 é possível observar
que o produto comercial contendo filtro solar é responsável por uma alteração
significativa (p < 0,05, ANOVA, Tukey’s) na cor dos cabelos naturais em todas as
situações testadas, mesmo quando não expostos à radiação UV. O cabelo
descolorido mostrou menor variação nos parâmetros L* a* b*, como mostrado na
Tabela 16, de forma que só foi observada mudança significativa (DE* > 1,2) na cor
das mechas tratadas com a formulação contendo filtro solar e não expostas à
radiação UV. O parâmetro DL* foi o que mais contribuiu para esta alteração na cor.
Não foram observadas mudanças significativas (DE* < 1,2) na cor das mechas
submetidas ao tratamento com GFC após 23 ciclos de lavagem e/ou exposição à
radiação UVA e UVB, tanto no cabelo natural quanto no descolorido (Tabelas 15 e
16). De acordo com Nogueira (2003), a variação na cor é observada em todos os
88
tipos de cabelo após 91 horas de exposição à radiação solar, sendo a variação de
luminosidade das mechas o parâmetro que mais contribui para a variação na cor, no
entanto, os resultados encontrados nesse estudo não identificaram alteração de cor
significativa advinda da exposição à radiação UV.
Os sinais captados pelo olho são decodificados pelo cérebro como impressões
claro-escuro, vermelho-verde e amarelo-azul (ROWE, 2018). Os valores dos
parâmetros de diferença de cor das mechas testadas, nas coordenadas amarelo-
azul e vermelho-verde (Db* e Da* < -0,3) refletem uma tendência à uma coloração
mais azulada e esverdeada, principalmente nos cabelos naturais tratados com a
formulação contendo filtro solar. Os cabelos descoloridos tratados com filtro solar
apresentaram uma tendência ao amarelamento do fio (Db* > 0,3) após 23 ciclos de
lavagem e tratamento, sem exposição à radiação solar.
6. CONCLUSÕES
Neste estudo foi possível a produção do extrato aquoso de Arthrospira
platensis com rendimento de 2,25 g/L, contendo concentrações de pigmentos
naturais estimadas em 2,24 mg/mL de ficocianina e 1,00 mg/mL de
aloficocianina.
Foi desenvolvida uma formulação contendo 0,5% (p/p) de extrato, composta
por 2,0% (p/p) de hidroxietilcelulose, 5,0% (p/p) de propilenoglicol e 0,2 %
(p/p) de metilparabeno e propilparabeno, que se mostrou estável durante 60
dias em temperatura de geladeira (5ºC ± 2). Durante este período, o gel
apresentou comportamento pseudoplástico, o que é desejável para uma
formulação semissólida de uso externo, por facilitar o espalhamento e evitar
que o produto escorra. Além disso, não foi observada alteração significativa
no teor de ficocianina na formulação no período estudado.
Tanto o extrato liofilizado de A. platensis como o gel contendo 0,5% (p/p) de
extrato apresentaram maior atividade antioxidante que os controles positivos
(Trolox® e BHT), com valores de CE50 de 2,35 µg/mL e 0,75 µg/mL,
respectivamente, sugerindo que o extrato tem uma atividade sequestradora
do radical DPPH superior aos antioxidantes sintéticos testados.
89
O extrato avaliado não absorve na região UV do espectro, não apresentando,
portanto, FPS in vitro. No entanto, a atividade antioxidante desempenhada
pelo mesmo tende a aumentar a atividade fotoprotetora, pela inativação das
ERO produzidas pela radiação UV, que são responsáveis por causar danos à
fibra capilar, tornando-a mais porosa e ressecada, alterando o brilho, cor e
flexibilidade.
Nos testes de mutagenicidade e fotomutagenicidade, a formulação contendo
extrato não induziu aumento das colônias revertentes das cepas TA102 e
TA104 de S. typhimurium. Ao invés disso, observaram-se resultados
estatisticamente significativos em comparação com o gel branco. Tais
resultados sugerem o efeito protetor, com ou sem exposição à radiação UVA,
contra mutações do tipo substituições/transversões de pares de bases A:T por
C:G.
Pela análise da morfologia capilar, foi possível observar que a formulação gel
contendo extrato apresentou atividade fotoprotetora para os cabelos
descoloridos, uma vez que não foi observada exposição do córtex,
diferentemente dos outros tratamentos. O cabelo preto natural teve poucos
danos morfológicos quando comparado ao cabelo descolorido, o que pode ser
explicado pela maior quantidade de pigmentos de melanina encontrados
nesse fio e que são capazes de agir como protetor solar, ajudando a
preservar as estruturas capilares remanescentes. O cabelo tratado com o gel
apresentou cutículas predominantemente inteiras e com células sobrepostas.
Além disso, observou-se que um filme foi formado ao redor do fio, o que pode
contribuir para a proteção do cabelo contra a entrada e saída de substâncias
e para a manutenção da hidratação pelo mecanismo de oclusão.
Quanto à composição química, não foram observadas diferenças
significativas entre os grupos. Entretanto, os cabelos descoloridos
apresentaram maiores sinais de oxidação da cistina quando comparados aos
cabelos naturais, o que é esperado devido ao processo de clareamento, que
leva à degradação dessas estruturas.
Nenhuma das mechas de cabelo não irradiadas mostrou redução no teor de
proteína, sugerindo que este fator é influenciado pela exposição à radiação
UV, mas não pela lavagem.
90
Não houve perda significativa de proteína ou variação de cor em nenhuma
das mechas tratadas com a formulação desenvolvida.
Os resultados encontrados demonstram-se promissores, viabilizando a obtenção
de um gel estável contendo 0,5 % (p/p) de extrato de A. platensis, com elevada
atividade antioxidante e potencial de proteção da fibra capilar contra os efeitos
provocados pela radiação UV, podendo vir a ser uma alternativa viável na redução
da concentração de filtros solares sintéticos em formulações fotopretoras capilares.
Como perspectivas futuras, almeja-se a realização de outros estudos reológicos
do gel desenvolvido, a fim de avaliar o comportamento da formulação em diferentes
condições. Além disso, a avaliação da estabilidade a longo prazo e testes in vivo
devem ser realizados para garantir a qualidade e segurança da formulação
cosmética.
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