Roseane Maria Ribeiro Costa
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DESENVOLVIMENTO DE MICROESFERAS DE PLGA CONTENDO
INTERLEUCINA-2 PARA APLICAÇÃO NA TERAPIA
ANTI-NEOPLÁSICA
ROSEANE MARIA RIBEIRO COSTA
RECIFE, 2008.
Roseane Maria Ribeiro Costa
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DESENVOLVIMENTO DE MICROESFERAS DE PLGA CONTENDO
INTERLEUCINA-2 PARA APLICAÇÃO NA TERAPIA ANTI-NEOPLÁSICA
ROSEANE MARIA RIBEIRO COSTA
RECIFE, 2008.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco
para obtenção do Título de Doutor em Ciências
Farmacêuticas.
Área de Concentração: Produção e Controle de Medicamentos
Orientadora: Drª. Maria Inês Ré
Roseane Maria Ribeiro Costa
iii
Ribeiro-Costa, Roseane Maria
Desenvolvimento de microesferas de PLGAcontendo interleucina-2 para aplicação na terapiaanti-neoplástica / Roseane Maria Ribeiro Costa. –Recife : O Autor, 2008.
xxii, 127 folhas ; il., fig., tab., quadros.
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2008.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Medicamentos – Sistema de liberação controlada. I. Título.
615 CDU (2.ed.) UFPE 615.014 CDD (22.ed.) CCS2006-078
Roseane Maria Ribeiro Costa
iv
Roseane Maria Ribeiro Costa
v
Dedico esta Tese com todo meu amor aos meus
queridos pais, Maria de Lourdes Ribeiro Costa e
José de Barros Costa, pelos verdadeiros
ensinamentos e pelo imenso amor dedicado
em minha formação.
Roseane Maria Ribeiro Costa
vi
AGRADECIMENTO ESPECIAL
A Drª Maria Inês Ré, minha querida orientadora, por ter tornado possível
a realização deste trabalho, tanto no IPT como na França, pelas
orientações e ensinamentos, apoio, confiança e por sua amizade.
A você Inês, meu muito obrigada!
Roseane Maria Ribeiro Costa
vii
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo. Muito obrigada!
Aos meus pais, Maria de Lourdes e José de Barros, e aos meus irmãos: Romero, Rômulo e Rinaldo, pelo apoio incondicional. Muito obrigada!
A Universidade Federal de Pernambuco, em especial a todos que fazem parte da Faculdade de Ciências Farmacêuticas que contribuíram pelo apoio e realização desse trabalho.
As pesquisadoras francesas, Elizabeth Rodier e Fabienne Espitalier, pela orientação, receptividade e toda atenção dispensada durante a realização do Doutorado-Sanduíche.
Ao Drº Pedro Michaluart Júnior, Cirurgião de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas do Estado de São Paulo e Coordenador desse Projeto sob apoio FAPESP, pela atenção e confiança.
Ao Drº Célio Lopes Silva, Coordenador do Laboratório de Vacinas Gênicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP, e as meninas: Giovanna Santos e Ana Paula Masson, pela realização dos ensaios in vivo com o Melanoma B16F10.
Ao Drº Luiz Carlos de Sá-Rocha, Professor do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP – São Paulo, por tornar possíveis os ensaios in vivo com o Carcinoma de Ehrlich, pelos seus ensinamentos e por toda sua atenção.
Ao Drº Mário Ricardo Gongora Rubio, Pesquisador do IPT responsável pelos Dispositivos Microfluídicos utilizados como Inovação Tecnológica neste trabalho, e Márcio Rodrigues da Cunha, pela excelente parceria de trabalho nos ensaios com os micromisturadores.
Aos Pesquisadores do Laboratório de Processos Químicos e Tecnologia de Partículas (LPP) - IPT, Marco Giulietti, Wagner Aldeia, João Poço, Modesto Danese, Marcelo Seckler pela convivência agradável, em especial Silas Derenzo, pela amizade, conversas e atenção.
Roseane Maria Ribeiro Costa
viii
A Família Zanin, Maria Helena Ambrósio Zanin e Antonio Carlos Zanin, pelo acolhimento afetuoso, confiança e valiosa amizade; as crianças, Laura e Sara, pelas brincadeiras e pelas gostosas gargalhadas que mim recordavam o quanto é bom ser criança; e a Neide Maria, por sua atenção. A vocês, meu muito obrigada especialíssimo!
A Jaqueline Rodrigues da Silva, Jaque, mais uma vez por sua amizade e constante incentivo, mesmo sem estar presente. E a sua mãe, D. Maria Rodrigues da Silva, pelas palavras de estímulo e abrigo essencial para conclusão da parte escrita do final da Tese.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas por todo apoio do início ao fim da realização da Tese.
Ao Instituto de Pesquisas Tecnológicas (IPT), pelo financiamento através da bolsa do “Programa IPT Novos Talentos”.
Ao órgão de fomento CAPES, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela oportunidade de desenvolver uma parte deste trabalho no Centro RAPSODEE da EMAC- Ecoles des Mines d’Albi Carmaux- França.
A todos os amigos da Ecoles des Mines d’Albi Carmaux, em especial Anne Marie, Marie Carria e Márcio Martins.
Existem várias pessoas a quem eu gostaria de dedicar especial atenção pela importância que representaram durante toda essa minha jornada no IPT: Adriana, Adriano, Alcione, Amélia, Bergson, David, Eduardo, Érika, Isilda, Izabela, Juliana, Klaus, Kleber, Lecsi, Lúcia, Marcelo, Maurício, Natália, Pierre, Priscila, Rosana, Shibuta, Shirley, Viviane, Sheila, Suênia, e Ana Letícia. Valeu pessoal, por toda ajuda e pelas boas risadas.
Aos demais colegas do Instituto de Pesquisas Tecnológicas que participaram e contribuirão ao longo dessa caminhada.
A toda minha família e amigos que acreditaram em mim. Muito obrigada!
Roseane Maria Ribeiro Costa
ÍNDICE
1.
2.
3.
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELA
LISTA DE QUADROS
LISTA DE EQUAÇÕES
ABREVIATURAS E SIGLAS
UNIDADES
NOMENCLATURA DAS EQUAÇÕES
RESUMO
ABSTRACT
INTRODUÇÃO
OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
2.2. Objetivos Específicos
CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA – INTRODUÇÃO
3.1. CÂNCER EPIDERMÓIDE AVANÇADO DE CABEÇA E PESCOÇO
3.2. TERAPIA BIOLÓGICA CONTRA O CÂNCER
3.2.1. Função do Sistema Imune
3.3. INTERLEUCINA-2 (IL-2) IMUNO-MODULADOR
3.3.1. Atividades Biológicas e Ação Imuno-imoduladora
3.3.2. Dose e Mecanismo de Ação
3.4. SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA PARA IL-2
3.4.1. Considerações Gerais sobre Sistemas de Liberação Controlada
3.4.1.1. Método de Emulsificação seguida de Extração (difusão) e Evaporação de
Solvente
3.4.2. Sistemas Biodegradáveis de Liberação Controlada
3.4.3. Sistemas Microparticulados na Terapia do Câncer
3.4.4. Sistemas Microparticulados com Interleucina 2
3.4.5. Sistemas de Liberação Controlada de Proteínas
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20
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4.
3.4.6. Inovação Tecnológica em Processos de Produção de Sistemas de Liberação
Controlada com a Introdução de Estruturas Microfluídicas
3.4.6.1. Microfluídica
3.4.6.2. Micromisturadores em Processos de Emulsão e Preparação de Micropartículas
Poliméricas
3.4.6.3. Métodos para Caracterização da Eficiência de Mistura em Micromisturadores
3.5. TUMORES EXPERIMENTAIS
3.5.1. Melanoma B16F10
3.5.2. Carcinoma de Ehrlich
CAPÍTULO II - DESENVOLVIMENTO FARMACOTÉCNICO
DESENVOLVIMENTO FARMACOTÉCNICO
4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
4.2. METODOLOGIA
4.2.1. Análise Preliminar da Solubilidade do PLGA 50:50 em Diferentes Solventes
4.2.2. Preparação das Micropartículas de PLGA
4.2.2.1. Micropartículas de PLGA sem Ativo (fase interna aquosa)
4.2.2.2. Micropartículas de PLGA contendo Albumina de Soro Bovino
4.2.2.3. Micropartículas de PLGA contendo Recombinante Humana IL-2
4.2.3. Caracterização Físico-química das Micropartículas
4.2.3.1 Análise Morfológica
4.2.3.2 Determinação do Tamanho de Partícula
4.2.3.3. Determinação Residual do Álcool Polivínilico (PVA)
4.2.3.4. Medida do Potencial Zeta (Análise Eletroforética)
4.2.3.5. Eficiência de Encapsulação da BSA
4.2.3.6. Eficiência de Encapsulação da IL-2
4.2.3.7. Cinética de Liberação In Vitro
4.2.3.8. Degradação In Vitro das Micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3.1. Análise Preliminar da Solubilidade do PLGA 50:50 em diferentes Solventes
4.3.2. Preparação das Micropartículas de PLGA
4.3.2.1. Caracterização das Micropartículas de PLGA sem Ativo
Agente emulsificante
Velocidade de rotação do impelidor
32
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48
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iii
5.
Tipo de solvente
Análise morfológica
Determinação residual do Álcool Polivinílico (PVA)
Potencial Zeta
4.3.2.2. Caracterização das Micropartículas de PLGA Contendo Albumina de Soro
Bovino
Determinação do tamanho de partícula
Eficiência de encapsulação
Cinética de liberação in vitro
4.3.2.3. Caracterização das Micropartículas de PLGA contendo Recombinante Humana
de Interleucina-2
Determinação do tamanho de partícula
Análise morfológica
Eficiência de encapsulação
Cinética de liberação in vitro
Degradação in vitro das micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2
4.4. CONCLUSÕES
CAPÍTULO III – TESTE DE CONCEITO
TESTE DE CONCEITO
5.1. MODELO TUMORAL MELANOMA B16F10
5.1.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
5.1.2. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
5.1.2.1. Linfoproliferação rhIL-2 livre e encapsulada
5.1.2.2. Avaliação do Nível de Endotoxinas presentes nas Mrh-IL2
5.1.2.3. Tratamento
5.1.2.4. Teste de Citotoxicidade
5.1.2.5. Dissociação da Massa Tumoral para Análise por Citometria de Fluxo (FACS)
5.1.2.6. Avaliação da Expressão de Marcadores de Superfície por Citometria de Fluxo
(FACS)
5.1.2.7. Anticorpos Monoclonais
5.1.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1.3.1. Linfoproliferação rhIL-2 livre e encapsulada
5.1.3.2. Avaliação do Nível de Endotoxinas presentes nas Formulações
50
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iv
6.
5.1.3.3. Estudo de Sobrevida
5.1.3.4. Estudo da Atividade Biológica da rhIL-2
5.1.3.5. Citotoxicidade
5.1.3.6. Avaliação da Expressão de Marcadores de Superfície
5.1.4. CONCLUSÕES
5.2. MODELO TUMORAL CARCINOMA DE ERLICH
5.2.1. OBJETIVO
5.2.2. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
5.2.2.1. Tratamento
5.2.2.2. Estudo Histológico
5.2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.2.3.1. Avaliação Tumoral
5.2.3.2. Estudo Histológico
5.2.4. CONCLUSÕES
CAPITULO IV – INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE
PRODUÇÃO DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA
INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE
SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA
6.1. MICROMISTURADORES UTILIZADOS
6.2.CARACTERIZAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE MISTURA EM
MICROMISTURADORES
6.2.1. Estudo da Transferência de Massa entre 2 Líquidos Imiscíveis nos
Micromisturadores
6.2.2. Cálculos das Medidas
6.2.2.1. Cálculo da Vazão Real
6.2.2.2. Cálculo do Balanço de Massa
6.2.2.3. Cálculo do Coeficiente de Partição
6.2.2.4. Calculo da Razão Concentração/ Concentração de Equilíbrio
6.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.3.1. Caracterização da Eficiência de Mistura em Micromisturadores
6.3.1.1. Dispositivos Microfluídicos BD1 e BD2
69
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v
7.
8.
9.
10.
6.3.1.2. Dispositivos Microfluídicos ED1 e ED2
6.4. CONCLUSÃO
6.5. Preparação de Micropartículas Poliméricas pelo Método Modificado de
Emulsificação e Extração de Solvente
PAPER ACEITO PARA PUBLICAÇÃO NO PERIÓDICO POWDER
TECHNOLOGY (IN PRESS)
PREPARATION OF PROTEIN-LOADED PLGA MICROSPHERES BY AN
EMULSION / SOLVENT EVAPORATION PROCESS EMPLOYING LTCC
MICROMIXERS
1. Introduction
2. Experimental
3. Results and Discussion
4. Conclusions
References
CONCLUSÃO GERAL
SUGESTÕES PARA CONTINUIDADE DAS ATIVIDADES
9.1. Sugestões para Desenvolvimento Tecnológico
9.2. Sugestões para Continuidade dos Ensaios Pré-clínicos
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANEXOS
Trabalhos enviados para congresso
Trabalho aceito na Powder Technology
Aprovação do Comitê de Ética
87
87
88
89
91
91
94
94
95
96
99
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104
106
108
108
108
110
125
126
127
Roseane Maria Ribeiro Costa
vi
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1. Configurações possíveis para sistemas de liberação microparticulados.
16
Figura 2. Esquema do método de emulsificação seguida de extração (difusão) e evaporação de solvente.
17
Figura 3. As diferentes interfaces de transferência de massa (solvente e substância sendo encapsulada) durante a microencapsulação por processo de emulsificação e difusão de solvente (extração ou evaporação).
19
Figura 4. Desenho esquemático de micromisturadores passivos fabricados com a tecnologia de LTCC (Cunha, 2006).
34
Figura 5 Esquema experimental do Método Villermaux/Dushman (adaptado de Pànic et al., 2004).
39
Figura 6. Transferência de massa entre solução água:metanol (50:50) e heptano: a absorbância do Nile Red no espectro do UV-visível ocorre em diferentes comprimentos de onda nestes diferentes meios: 489 nm em heptano e 581 nm para a mistura água: metanol (50:50). Adaptado de Pànic et al (2004).
40
CAPITULO II - DESENVOLVIMENTO FARMACOTÉCNICO
Figura 7. Microfotografias de micropartículas de PLGA obtidas sob agitação de 7000 rpm, a) PVA 3% e DCM; e d) PVA 0,5% e ACT (magnitude 1000×).
51
Figura 8. Efeito residual de diferentes concentrações do PVA associado à superfície das micropartículas (média ± desvio padrão, n =3).
52
Figura 9. Representação do mecanismo de ligação das moléculas de PVA e PLGA na superfície das partículas (Murakami et al., 1999).
52
Figura 10. Potencial zeta das micropartículas de PLGA obtidas com diferentes concentrações de PVA na fase externa da emulsão (média ± desvio padrão, n =7), em função do pH.
53
Figura 11. Perfil da cinética de liberação in vitro da BSA a partir das microesferas de PLGA (média ± desvio padrão, n = 3).
55
Figura 12. Micrografias da microscopia eletrônica de varredura (2000 ×); (a) Micro-BSA antes e (b) após cinética de liberação in vitro.
56
Roseane Maria Ribeiro Costa
vii
Figura 13. Microfotografias das microesferas de PLGA liofilizadas: a) Mrh-IL2, b) MPEG-IL2 e c) MBSA-IL2 (magnitude 1500×).
57
Figura 14. Perfil da cinética de liberação in vitro da IL-2 a partir das micropartículas de PLGA (média ± desvio padrão, n = 3).
59
Figura 15. Micrografias das partículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2, decorridos 7, 35 e 42 dias do ensaio de degradação em tampão PBS pH 7,4 (1500×).
60
CAPITULO III - ESTUDO PRÉ-CLÍNICO
Figure 16. Sala limpa de classificação ISO 7 montada no IPT (Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo) para desenvolvimento das micropartículas de PLGA contendo IL-2.
64
Figure 17. Linfoproliferação da forma encapsulada da interleucina 2, Mrh-IL2. 69
Figure 18. Porcentagem de sobrevivência de animais tratados com apenas 1 inoculação intra-tumoral. Camundongos C57Bl/6 foram inoculados por via s.c. com 5x104 células B16F10. Dez dias após a implantação do tumor os animais receberam 1 injeção intra-tumoral de 100 μl de acordo com o tratamento de cada grupo: Grupo 1 – microesferas sem ativo; Grupo 2 - Proleukin®/4,5x104 UI; Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI. Todos os animais foram acompanhados até sua morte para avaliação da taxa de sobrevida.
70
Figure 19. Peso do tumor (g) após tratamento de acordo com os grupos: Grupo 1 – microesferas sem ativo; Grupo 2 - Proleukin®/4,5x104 UI; Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI.
71
Figure 20. Citotoxicidade mediada por linfócitos TCD8, conforme cada grupo de tratamento: Grupo 1 – microesferas sem ativo; Grupo 2 - Proleukin®/4,5x104 UI; Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI.
72
Figure 21. Variação do peso corpóreo dos animais (peso final - peso inicial): Grupo 1 – controle – solução salina; Grupo 2 - microesferas sem ativo Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI; e Grupo 4 - Proleukin®/4,5x104 UI.
75
Figure 22. Peso tumor (g) após terapia em camundongos C57Bl/6 inoculados s.c. com 1x106 células de carcinoma de Ehrlich e com injeção intra-tumoral de acordo com o tratamento de cada grupo: Grupo 1 – solução salina (controle); Grupo 2 - microesferas sem ativo; Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI; Grupo 4 - Proleukin®/4,5x104 UI. Os dados representam a media ± desvio padrão plotados pelo programa Basic Statistics p > 0,05 (ANOVA, seguida pelo teste de múltipla comparação Tukey).
76
Figure 23. Lesão tumoral com a presença de extensa área de necrose (n) de acordo com os grupos: a) Grupo 1 – solução salina (controle); b) Grupo 2 - microesferas sem ativo; c) Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI; e d) Grupo 4 - Proleukin®/4,5x104 UI.
78
Roseane Maria Ribeiro Costa
viii
CAPITULO IV - INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA
Figure 24. Desenho geométrico de micromisturadores passivos fabricados com a tecnologia de LTCC utilizados nesse trabalho (Cunha, 2006).
82
Figure 25. Simulações somente do escoamento nos dispositivos realizadas por Cunha (2006), com aplicativo baseado no método de elementos finitos chamado ANSYS.
84
Figure 26. Esquema experimental para caracterização da eficácia de mistura dos micromisturadores.
85
Figure 27. Fases líquidas antes e após a realização do experimento de mistura: (a) Nile Red na fase água:metanol (50:50) (Violeta intenso) e (b) fase n-heptano (incolor), antes da passagem pelo micromisturador; (c) mistura líquida recuperada na saída do micromisturador, onde se observa a existência de 2 fases distintas: (d) fase inferior (água:metanol, violeta) e (e) fase superior (heptano, amarela).
87
Figure 28. Coeficiente de partição (CNRH/CNR
Água/MeOH) em função da vazão total para os dispositivos BD1 e BD2.
88
Figure 29. Coeficiente de partição (CNRH/CNR
Água/MeOH) em função da vazão total para os dispositivos ED1 e ED2.
89
Figure 30. Esquema do arranjo experimental para preparação de micropartículas de PLGA pelo processo modificado.
92
PAPER ACEITO PARA PUBLICAÇÃO NO PERIÓDICO POWDER TECHNOLOGY
(PREPARATION OF PROTEIN-LOADED PLGA MICROSPHERES BY AN EMULSION
/ SOLVENT EVAPORATION PROCESS EMPLOYING LTCC MICROMIXERS)
Fig. 1. Micromixers geometry. 97
Fig. 2. Experimental set-up for emulsion/solvent evaporation process with LTCC micromixers.
98
Fig. 3. SEM micrographs (750x) of PLGA microspheres generated by emulsion/solvent evaporation process, with a LTCC micromixer (BD1) at different flow rates: a) 1.1 l/h; b) 2.2 l/h.
100
Fig. 4. In vitro release profile of BSA from (■) micromixer ED2, (□) micromixer BD1 and (○) mechanical agitation PLGA microspheres generated by emulsion/solvent evaporation.
103
Roseane Maria Ribeiro Costa
ix
LISTA DE TABELAS
CAPITULO II - DESENVOLVIMENTO FARMACOTÉCNICO
Tabela 1. Distribuição granulométrica das micropartículas de PLGA preparadas com diclorometano.
50
Tabela 2. Tamanho médio das micropartículas PLGA contendo BSA. 54
Tabela 3. Eficiência de encapsulação da BSA. 54
Tabela 4. Tamanho médio das microesferas PLGA contendo rhIL2. 57
Tabela 5. Eficiência de encapsulação de IL-2. 58
CAPITULO III - ESTUDO PRÉ-CLÍNICO
Tabela 6. Grupos de tratamento de ensaio de sobrevida e de atividade biológica.
66
Tabela 7. Níveis de endotoxinas presentes nas microesferas de PLGA. 70
Tabela 8. Identificação do tipo de tratamento por grupo. 74
CAPITULO IV - INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA
Tabela 9 Propriedades dos micromisturadores do tipo Serpentina 3D. 83
Tabela 10. Propriedades dos micromisturadores ED1 e ED2. 83
Tabela 11. Coeficientes de partição obtidos com os micromisturadores. 90
Tabela 12. Características físico-químicas das micropartículas de PLGA com IL-2 através do micromisturador BD2.
93
PAPER ACEITO PARA PUBLICAÇÃO NO PERIÓDICO POWDER TECHNOLOGY
(PREPARATION OF PROTEIN-LOADED PLGA MICROSPHERES BY AN EMULSION
/ SOLVENT EVAPORATION PROCESS EMPLOYING LTCC MICROMIXERS)
Table 1. Particles size range for PLGA microspheres (without BSA) produced by the emulsion/solvent evaporation method, employing different LTCC microfluidics structures.
100
Table 2. Properties of BSA loaded-PLGA microspheres generated by emulsion/ solvent evaporation (under mechanical agitation and with micromixers as mixing elements).
102
Roseane Maria Ribeiro Costa
x
LISTA DE QUADROS
CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Quadro 1. Causas e mecanismos que podem comprometer a estabilidade físico-química de proteínas, no processo de microencapsulação por emulsificação e evaporação de solvente, armazenamento e teste dos sistemas de liberação controlada.
27
Quadro 2. Alternativas e mecanismos para manter a integridade da proteína durante o processo de microencapsulação.
28
Roseane Maria Ribeiro Costa
xi
LISTA DE EQUAÇÕES
CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Equação 1. Reações do Método Villermaux/Dushman. 38
CAPITULO IV - INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE
SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA
Equação 2. Cálculo da Vazão Real
86
Equação 3. Cálculo do Balanço de Massa
86
Equação 4. Cálculo do Coeficiente de Partição
86
Equação 5. Calculo da Razão Concentração/ Concentração de Equilíbrio
86
Roseane Maria Ribeiro Costa
xii
ABREVIATURAS E SIGLAS
ACT Acetato de etila
A1/O/A2 Emulsão múltipla
A1/O Emulsão simples
ANOVA Análise de variância
APC Células apresentadoras de antígenos
BSA Albumina de soro bovina
BSA-FITC Albumina de soro bovina com um marcador isotiocianato de fluoresceína
Ca++ Íon cálcio
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento
CEACP Carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço
CO2 Dióxido de carbono
CTPP Centro de Tecnologia de Processos e Produtos
CNRH/CNR
água/MeOH Relação Nile Red em heptano/ concentração do NR na mistura água:metanol
DC Células dendríticas
DPPC Dipalmitiol-fosfatidilcolina
DCM Diclorometano
DP Desvio padrão
E100 Eudragit
FACS Citometria de Fluxo
FDA Food and Drug Administration
FITC Isotiocianato de fluoresceína
Roseane Maria Ribeiro Costa
xiii
FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
FU-5 Fluoracil-5
GM-CSF Fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos
HSA Albumina de soro humano
Hep-2 Carcinoma de laringe
H2O Água
H2BO3- Íon borato
H3BO3 Ácido bórico
H&E Hematoxilina e Eosina
IO3- Íon iodato
I3- Íon monovalente do iodo
I2 Iodo
HCl Ácido clorídrico
HCFMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
IL-2 Interleucina-2
IFNγ Interferon-γ
IL-4 Interleucina-4
IL-6 Interleucina-6
IL7 Interleucina-6
IL-12 Interleucina-12
IL-1Ra Receptor antagonista da Interleucina-1
Roseane Maria Ribeiro Costa
xiv
IL-18 Interleucina-18
ISO Padrão Internacional designação ou classificação IPT Instituto de Pesquisas Tecnológicas
INCA Instituto Nacional do Câncer
KI Iodeto de potássio
KIO3 Iodato de potássio
KI Iodeto de potássio
KIO3 Iodato de potássio
LAK Células destruidoras ativadas por linfocinas
LTCC Low Temperature Co-Fired Ceramics
LDH Lactato desidrogenase
Mg++ Íon magnésio
MEMS Micro-Electro-Mechanical Systems
MeOH Metanol
Micro PLGA Micropartículas de PLGA sem ativo
Micro BSA Micropartículas de PLGA contendo albumina de soro bovina
MrhIL-2 Micropartículas de PLGA contendo recombinante humana de Interleucina-2
MPEG-IL2 Micropartículas de PLGA contendo recombinante humana de Interleucina-2 com polietilenoglicol
MBSA-IL2 Micropartículas de PLGA contendo recombinante humana de Interleucina-2 com albumina de soro bovina
M-CSF Fator estimulador de colônias de macrófagos
MHC Complexo principal de histocompatiblidade
NK Células destruidoras naturais
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xv
NaOH Hidróxido de sódio
NAD+ Forma oxidada da nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADH+ Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NR Nile Red
PLGA Copolímero e ácido láctico glicólico
PVA Álcool polivinílico
PCL Policaprolactona
PEG Polietilenoglicol
PH poli L-histidina
PEG-IL2 forma modificada da IL-2 succinyl (SIL-2) e polietilenoglicol (PEG IL-2)
PEG-PH Copolímero de bloco de polietilenoglicol e poli L-histidina
PVP Polivinil pirrolidina
PF68 Pluronic® F68
pDNA Plasmídeo do DNA
PMN Polimofornucleares
PBS Tampão fosfato de sódio
rhIL2 Recombinante humana de interleucina-2
RSA Albumina de soro de rato
RPMI Mistura de sais minerais enriquecidos com aminoácidos, vitaminas e outros componentes essenciais para crescimento celular
SIL-2 Succinyl Interleucina-2
SDS Dodecilsulfato de sódio
s.c. Via Subcutânea
SI Sistema imune
Roseane Maria Ribeiro Costa
xvi
SNC Sistema nervoso central
TNF Fator de necrose tumoral
Roseane Maria Ribeiro Costa
xvii
UNIDADES
ppm Parte por milhão
m/v Relação massa por volume
rpm Rotação por minuto
mg Miligrama
ml Mililitro
°C Grau Celsius
min Minuto
μg Micrograma
a1 Fase interna do sistema
a2 Fase externa do sistema
v/v Relação volume/volume
U Unidade
UI Unidade Internacional
μCi Micro-Curir
μl Microlitro
mmol Milimol
l Litro
kDa kilo Dalton
nm Nanômetro
UE/μg Unidades de endotoxina por miligrama de amostra
Roseane Maria Ribeiro Costa
xviii
NOMENCLATURA DAS EQUAÇÕES
Q Vazão real
ΔQv Variação da vazão real
Vágua/MeOH Volume real da fase aquosa água/metanol
ΔVágua/MeOH Variação do volume real da fase aquosa água/metanol
Vheptano Volume real da fase orgânica heptano
ΔVheptano Variação de volume real da fase orgânica heptano
t Tempo
Δt Variação do tempo
mNR, água/MeOH/ entrada Massa do Nile Red na entrada da fase doadora, fase água/metanol
mNR, água/MeOH/saída Massa do Nile Red na entrada da fase doadora, fase água/metanol
mNR, heptano/saída Massa do Nile Red na saída da fase receptora, fase heptano
CNR, água:MeOH/saída Concentração do Nile Red na saída da fase doadora, fase água/metanol
CNR, heptano/saída Concentração do Nile Red na saída da fase receptora, fase heptano
Vágua/MeOH/entrada Volume da fase aquosa água/metanol na entrada do micromisturador
Vágua/MeOH/saída Volume da fase aquosa água/metanol na saída do micromisturador
Vheptano/saída Volume da fase orgânica heptano na saída do micromisturador
BM Balanço de massa
�p Coeficiente de Partição
Ceq,NR, heptano Concentração de equilíbrio do Nile Red na fase heptano
Roseane Maria Ribeiro Costa
xix
RESUMO
Uma estratégia tecnológica para superar as limitações hoje encontradas na aplicação
clínica da Interleucina 2 (IL-2) para imunoterapia contra o câncer é o desenvolvimento de
um sistema de liberação controlada que mantenha a estabilidade da proteína encapsulada e
promova uma liberação sustentada dessa proteína, para estimular o próprio sistema imune
do paciente a combater a doença neoplásica, sem causar efeitos indesejáveis. Sistemas de
liberação controlada, microcápsulas ou microesferas, podem ser preparados através do uso
de polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tais como o copolímero de ácido láctico e
glicólico (PLGA) aprovado pela vigilância sanitária americana Food and Drug
Administration (FDA) para tratamento clínico. Estes sistemas poliméricos apresentam
como principal vantagem a possibilidade de modular características da partícula, como a
eficiência da microencapsulação e o perfil de liberação da proteína. O principal desafio
deste trabalho foi desenvolver microesferas biodegradáveis de PLGA contendo
Interleucina-2 pelo método de emulsificação/evaporação do solvente com propriedades
controladas como tamanho de partícula, eficiência de encapsulação e cinética de liberação
in vitro, para posterior ensaio pré-clínico. Investigou-se o efeito de variáveis do processo
como o efeito do agente emulsificante, o tipo de solvente e a velocidade de agitação,
encapsulando-se albumina de soro bovina (BSA), como proteína modelo, em microesferas
de PLGA. Neste estudo, foram definidas as condições de processo e formulação para a
obtenção de microesferas de PLGA contendo IL-2, onde também se explorou o efeito da
presença de agentes estabilizantes como polietilenoglicol e BSA na encapsulação de IL-2.
Inovando no processo de produção de micropartículas poliméricas, o uso de
micromisturadores desenvolvidos em LTCC (Cerâmica com baixa temperatura de
sinterização) foi explorado como alternativa tecnológica ao processo convencional que
envolve agitação mecânica na etapa de emulsificação. Microesferas de PLGA foram
produzidas utilizando diferentes tipos de dispositivos microfluídicos e os resultados
obtidos mostraram a viabilidade técnica desta inovação tecnológica, gerando microesferas
contendo IL-2, com eficiência de encapsulação e tamanho de partículas similares às
microesferas obtidas pelo processo convencional (eficiência de encapsulação da ordem de
80%, partículas menores que 40 µm).
As microesferas de PLGA contendo IL-2 foram desenvolvidas na tentativa de se
estabelecer um perfil cinético de liberação de IL-2 que possa solucionar problemas
Roseane Maria Ribeiro Costa
xx
relacionados à aplicação intra-tumoral da IL-2 livre, visando o desenvolvimento de terapias
biológicas para câncer avançado de cabeça e pescoço. O estudo pré-clínico das
microesferas de PLGA contendo IL-2 foi realizado em dois modelos experimentais de
tumor, Melanoma B16F10 e Carcinoma de Erlich. Os resultados obtidos no estudo pré-
clínico realizado com os dois modelos tumorais coloca em evidência a importância de
ajuste dos modelos experimentais utilizados no desenvolvimento de terapias biológicas de
câncer usando sistemas de liberação controlada, onde a velocidade de evolução do tumor e
o tempo de duração de ensaios são decisivos para o desenvolvimento da resposta biológica
desejada.
Palavras chaves: Interleucina 2; Microesferas de PLGA; Micromisturadores em LTCC
Roseane Maria Ribeiro Costa
xxi
ABSTRACT
The development of a controlled release system that maintains the stability of the
encapsulated protein, and that promotes a sustained release of this protein, for stimulating
the patient proper immune system against the neoplasic illness offers a technological
strategy to overpass the today limitations met with the clinical application of the
Interleukine 2 (IL-2) for the immunotherapy against cancer. Controlled release systems,
microcapsules or microspheres, can be prepared using biodegradable and biocompatible
polymers, such as the Poly (D,L lactic-co-glycolic) acids (PLGA), approved by the
American Food and Drug Administration (FDA) for clinical treatment. The main
advantage presented by these polymeric systems is the possibility of modulating the
characteristics of the particle, such as the microencapsulation efficiency and the protein
release profile. The main challenge of this work has been to develop biodegradable
microspheres of PLGA containing Interleukin-2, through the method of solvent
emulsification/evaporation, with controlled properties such as the particle size,
encapsulation efficiency, and in vitro kinetic release, for further pre-clinical test. The effect
of the variables of the process, such as the effect of the emulsifying agent, the type of
solvent, and the stirring speed have been investigated, using bovine serum albumin (BSA)
as model for the protein, within PLGA microspheres. In this study, the process and
formulation conditions were defined, for the production of microspheres of PLGA
containing interleukin-2. The effect of the presence of stabilizing agents like
polyethylenoglycol and BSA in the encapsulation of IL-2 has also been explored.
As an innovative part of the process for polymeric microparticules production, the use of
micromixers developed in LTCC (Low Temperature Co-fired Ceramics) has been analyzed
as an alternative technology to the conventional process involving mechanical stirring
during the emulsification stage. PLGA microspheres have been produced using different
types of microfluidics devices, and the obtained results show the technical viability of such
a technological innovation, since it allowed to produce microspheres containing IL-2 with
an encapsulation efficiency and particles size similar to those obtained for particles
produced through the conventional process (encapsulation efficiency of the order of 80%,
particles smaller than 40 µm).
The PLGA microspheres containing IL-2 were developed in an attempt to establish a
release kinetic profile of IL-2 that would be suitable to solve the problems linked to the
intra-tumoral application of the IL-2 alone, in order to develop biological therapies for
Roseane Maria Ribeiro Costa
xxii
advanced cancer of head and neck. The pre-clinical study of the PLGA microspheres
containing IL-2 has been performed with two experimental models of the tumor,
Melanoma B16F10 and Erlich Carcinoma. The results obtained in the pre-clinical study
performed with the two tumoral models have clearly shown the importance to adjust the
experimental models used in the development of cancer biological therapies using
controlled release system, where the tumor evolution rate and the time available for tests
are decisive factors for the development of the desired biological response.
Keywords: Interleukine 2; PLGA Microspheres; LTCC Micromixers
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2
1. INTRODUÇÃO
O câncer, cientificamente conhecida como uma doença neoplásica, caracterizada pela
proliferação descontrolada de células, indiferenciação e perda da função, é uma doença
difundida no mundo inteiro que causa temor na sociedade. Palavra de origem latina
“câncer” que significa “caranguejo” deve ter sido empregada em analogia ao modo de
crescimento infiltrante, que pode ser comparado às pernas do crustáceo, que as introduz na
areia ou lama para se fixar e dificultar sua remoção.
A existência de quase 200 tipos dessa neoplasia que diferem pela capacidade de
invadir tecidos e órgãos, vizinhos ou distantes, encurta anualmente, a existência de seis
milhões de indivíduos, superando em número todas as causas de morte, exceto os
problemas cardiovasculares. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer (INCA), no
Brasil cerca de 13,7% de pessoas morrem todos os anos vítimas de neoplasias malignas.
Porém, o INCA divulgou no Congresso de Controle de Câncer realizado no Rio de Janeiro
(26/11/2007) que a estimativa para 2008 e 2009 será de aproximadamente 470 mil novos
casos de câncer.
O carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço (CEACP), desenvolvido na
mucosa do trato aero-digestivo superior, corresponde ao quinto tumor maligno mais
comum no mundo. O câncer na região de cabeça e pescoço é um dos mais prevalentes em
nosso meio. Considerando-se apenas a cavidade oral, foram estimados no Brasil, 10.890
novos casos de câncer em 2000, em sua quase totalidade, correspondendo a carcinoma
epidermóide.
Pacientes portadores de tumores avançados de cabeça e pescoço sofrem de maneira
acentuada com dor, problemas de deglutição, respiração e desestruturação estética causada
pelo câncer. Na prática médica, o manejo de pacientes com estágios avançados de câncer é
um dos maiores desafios. As alternativas de tratamento hoje existentes são paliativas e
baseiam-se principalmente, na cirurgia seguida por seções de radio-quimio-terapia, como
modalidades isoladas ou associadas. Porém, apresentam alta toxicidade, piorando a
qualidade de vida, sem praticamente garantir nenhum aumento de sobrevida. Muitos
pacientes com recidiva do CEACP não apresentam condições para um novo tratamento,
sendo a analgesia o único paliativo para esses pacientes, o que evidencia a necessidade de
estudos e avanços científicos para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.
A terapia biológica, que vem se renovando pela revolução contra o câncer através da
estimulação do sistema imune, faz o uso de citocina, como a interleucina 2 (IL-2), para
estratégia de tratamento. No entanto, a administração da IL-2 está hoje limitada por uma
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série de dificuldades técnicas como necessidade de altas doses, curto tempo de meia vida,
injeções freqüentes e efeitos colaterais. Neste contexto, o desenvolvimento de sistemas de
liberação controlada para uma citocina como a IL-2 pode ser uma alternativa promissora
para permitir o estímulo cosntante do sistema imune, reduzir a freqüência de administração
e sustentar a proteína no nível terapêutico desejado, sem causar efeitos indesejados.
Sistemas de Liberação Controlada podem ser desenvolvidos para encapsular
fármacos e proteínas, a serem administrados por diferentes vias como parenteral, intra-
muscular, dentre outras. Estes sistemas (microcápsulas ou microesferas) podem ser
preparados através do uso de polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tais como o
copolímero de ácido láctico e glicólico aprovado pela vigilância sanitária americana Food
and Drug Administration (FDA) para uso clínico. O principal desafio deste trabalho de tese
foi desenvolver microesferas biodegradáveis, à base de copolímero de ácido láctico e
glicólico (PLGA), para liberação controlada da Interleucina-2 (IL-2). Essas microesferas
representam uma estratégia tecnológica para os problemas relacionados à aplicação intra-
tumoral da IL-2 livre, visando o desenvolvimento de terapias biológicas para câncer
avançado de cabeça e pescoço.
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4
OBJETIVOS
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5
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
O objetivo principal deste trabalho é o desenvolvimento farmacotécnico e a aplicação
de uma forma encapsulada de um imuno-modulador, recombinante humana interleucina-2,
para uso intra-tumoral no tratamento de pacientes com carcinoma epidermóide avançado
de cabeça e pescoço, tendo por meta tecnológica, aumentar o tempo de exposição de um
tumor a um fármaco sem o aumento do número de intervenções para sua administração
local, através de uma liberação lenta e programada a partir de microesferas biodegradáveis
desenvolvidas no projeto.
2.2. Objetivos Específicos
Otimizar formulações de IL-2 em microesferas biodegradáveis de PLGA, com tamanho
controlado, menor que 40 µm, eficiência de encapsulação superior ao apresentado por
sistemas de liberação similares apresentados na literatura (> 60%) e perfis cinéticos de
liberação superiores a 15 dias.
Prospectar inovações tecnológicas no processo convencional de microencapsulação por
emulsificação seguida de extração/evaporação de solvente, introduzindo conceitos de
microtecnologia e microfluídica.
Realizar testes de conceitos com as microesferas de PLGA contendo IL-2 utilizando-se
diferentes modelos tumorais.
Roseane Maria Ribeiro Costa
6
CAPITULO I
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Roseane Maria Ribeiro Costa
7
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA – INTRODUÇÃO
Nesta revisão da literatura são abordados os principais temas tratados nesse trabalho.
Inicia-se com informações sobre câncer epidermóide de cabeça e pescoço, terapia
biológica do câncer, função do sistema imune e sobre um imuno-modulador de nosso
interesse, Interleucina-2. A seguir, aspectos gerais da tecnologia de microencapsulação são
apresentados. Diferentes técnicas são citadas, com descrição de técnica específica
envolvendo a obtenção de micropartículas poliméricas a partir de uma etapa de
emulsificação seguida da remoção do solvente (difusão, extração, evaporação) e revisão do
estado da arte referente à microencapsulação de IL-2 e proteínas, abordando as principais
dificuldades relacionadas à estabilidade e manutenção da atividade biológica de proteínas.
Ainda com referência ao processo de microencapsulação, visando prospectar inovações
tecnológicas no processo de obtenção dos sistemas de liberação controlada de interesse do
trabalho com a introdução de micromisturadores, aspectos gerais ligados a microfluídica e
micromisturadores também são apresentados, assim como, estudos realizados envolvendo
preparação de emulsões ou micropartículas poliméricas em processos empregando
micromisturadores na etapa de formação da emulsão.
Por fim, considerações sobre modelos tumorais são também apresentadas nesta
revisão.
3.1. CÂNCER EPIDERMÓIDE AVANÇADO DE CABEÇA E PESCOÇO
O carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço desenvolvido na mucosa do
trato aero-digestivo superior, incluindo cavidade oral, orafaringe, hipofaringe e laringe,
caracteriza-se por ser um tumor agressivo, com freqüentes recidivas loco-regional e a
existência de metástases em linfonodos cervicais ou à distância (Amar et al., 2005; White
et al., 2007). Muitos pacientes com recidiva do câncer de cabeça e pescoço não apresentam
condições para um novo tratamento curativo, uma vez que já se submeteram às recessões
extensas e tratamento irradiante. Sendo assim, alguns dos principais determinantes de bom
prognóstico são o diagnóstico precoce, que infelizmente não é rotina, e a intervenção,
conduzida dentro de uma boa técnica oportuna, adequada e correta (Kroeff, 2004; Amar et
al., 2005; Karahatay et al., 2007; White et al., 2007).
Os principais fatores de risco relacionados ao câncer epidermóide de cabeça e
pescoço são, sobretudo, pessoas que fazem uso continuo do álcool e/ou do tabaco, falta de
Roseane Maria Ribeiro Costa
8
higiene bucal e diferentes infecções causadas por vírus (Heubeck et al., 2006; Rogers et
al., 2007).
No serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do HCFMUSP (Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo), aproximadamente metade dos
pacientes com câncer já apresenta metástases cervicais na primeira consulta. Esse é o
primeiro sítio de metástases desses tumores. Visto que, em geral, a sobrevida diminui pela
metade quando existe metástase cervical, é de máxima importância o tratamento dessas
lesões cervicais.
O tratamento do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço baseia-se
principalmente na ressecção cirúrgica da área afetada seguida por seções de radio-quimio-
terapia como modalidades isoladas ou associadas (Dadian et al., 1993; Heubeck et al.,
2006). Para metástases cervicais, o tratamento preferencial é a cirurgia seguida de
radioterapia. Em algumas situações como, por exemplo, a infiltração da artéria carótida
pelo tumor, a cirurgia não pode ser realizada. Nesses casos, associa-se quimioterapia à
radioterapia.
Por vezes, apesar do tratamento radical com intenção curativa, ocorre a recidiva do
tumor. Essa recidiva pode ser no sítio do tumor primário (local), no pescoço (regional) ou
em outros órgãos (à distância). A recidiva local é, usualmente, passível de resgate
cirúrgico, considerando também a braquiterapia e a re-irradiação de lesões residuais. A
doença em outros órgãos deve ser tratada sistemicamente. Na recidiva regional, quase
nunca é possível a re-intervenção cirúrgica nem o aumento da dose de radioterapia devido
à proximidade de estruturas nobres como a artéria carótida.
O tumor recidivado no pescoço piora muito a qualidade de vida dos doentes sendo,
freqüentemente, responsável pelo óbito. Os cuidados paliativos têm por objetivo promover
uma melhor qualidade de vida, apesar de não alterar o tempo de sobrevida (Amar et al.,
2005). Sendo assim, a analgesia é praticamente um dos únicos recursos disponíveis a
serem oferecidos a esses pacientes, que demonstra a necessidade de estudos e avanços
científicos para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para esses casos. Uma
alternativa atraente é o desenvolvimento de um sistema de liberação controlada que pode
ser utilizado para estimular o próprio sistema imune do paciente para combater o câncer.
Roseane Maria Ribeiro Costa
9
3.2. TERAPIA BIOLÓGICA CONTRA O CÂNCER
A terapia biológica, que é uma antiga forma de controlar o câncer pela estimulação
do sistema imune, vem se renovando incansavelmente pela busca da terapia contra doenças
neoplásicas (Rosenberg, 2000; Moingeon, 2001; Dasgupta et al., 2006; Roger et al., 2007).
O objetivo da imunoterapia é a erradicação das células tumorais através da manipulação ou
mobilização do sistema imune do paciente, resultando em longo tempo de imunidade e
poucos efeitos adversos decorrentes do tratamento (Kim et al., 2005; Cappuccio et al.,
2007). Os efeitos biológicos in vivo modulam a resposta imune, a estimulação ou inibição
da hematopoiese, regulam o crescimento e diferenciação celular, e modulam a
vascularização do tumor (Zwierzina, 1999; Moingeon, 2001).
Atualmente, o problema e o perigo potencial encontrado na terapia biológica é a
dificuldade ao se estabelecer a dose para os ensaios clínicos (Zwierzina, 1999; Moingeon,
2001; Dasgupta et al., 2006; Gravekamp, 2007). Numerosos ensaios clínicos têm mostrado
um grande potencial na resposta imunológica da vacina contra o câncer. Uma estratégia
que vêm sendo testada é a aplicação intralesional de substâncias que tenham efeito anti-
tumoral. Esta estratégia é baseada no desenvolvimento de vacinas anti-tumorais que
demonstram o papel principal das células T na resposta anti-cancerígena e atividade anti-
tumoral em ambos os modelos, animal e humano (Zwierzina, 1999).
A terapia biológica do câncer abrange proteínas, citocinas e fatores de crescimento
hematopoiéticos, bem como estratégias de tratamento usando anticorpos, vacinas ou vários
genes de interesse terapêutico (Rosenberg et al., 1998; Zwierzina, 1999; Zhang et al.,
2006). Devido à grande variedade funcional de várias famílias de citocinas, estas
moléculas podem influenciar tanto positivamente quanto negativamente o crescimento e a
metástase do tumor (Salazar-Onfray et al., 2007; Lavi et al., 2007).
O sucesso da imunoterapia é dado pela identificação de antígenos específicos de
tumores e na geração de uma resposta imune específica contra estes antígenos (Toubaji et
al., 2007). Apesar das células B e T serem direcionadas contra as estruturas presentes nas
células tumorais, ainda há células tumorais que se desprendem da massa tumoral e entram
na corrente sanguínea, escapando da defesa do sistema imune e ocasionando a metástase.
Esta falha, em limitar o crescimento do tumor pode ser explicada pela sua própria evolução
clínica que de certa maneira torna-se insensível para rejeição do mesmo através do sistema
imune. O estado de tolerância das células B e T tem sido demonstrado em vários modelos.
Em alguns casos, esta inibição pode ser reduzida pela administração de uma citocina como
Roseane Maria Ribeiro Costa
10
a interleucina 2 (IL-2), ativando o sistema imune e ampliando a imunidade anti-tumoral
(Rosenberg et al., 1998; Salazar-Onfray et al., 2007; Rescigno et al., 2007).
Referente à imuno-modulação, várias citocinas já foram testadas em aplicação intra-
tumoral em pacientes com câncer de cabeça e pescoço (Mattijssen, 1994; Clayman et al.,
1998; Moingeon, 2001; Xian et al., 2005; Pries and Wollenberg, 2006). No entanto, a
intervenção com agentes físicos tem como limitação, a proximidade com as estruturas
nobres do pescoço. A utilização de material geneticamente modificado, inclusive produtor
de citocinas, requer técnica complexa e dispendiosa, apresentando uma série de
dificuldades, tais como: a administração não pode ser feita por via oral, devido a problemas
relacionados à degradação no meio ácido do trato gastro-intestinal; curto tempo de meia-
vida, o que requer administrações freqüentes em doses altas para obter eficácia terapêutica;
uma administração sistêmica em doses altas pode conduzir a efeitos colaterais e apresentar
toxicidade; estes sistemas são também muito sensíveis às condições ambientais (Dai et al.,
2005; Dass and Choong, 2006).
3.2.1. Função do Sistema Imune
A função básica do sistema imune (SI) é proteger e defender o organismo da invasão
por substância estranha o que é feito de diferentes formas. Constituído de células e
moléculas, sua resposta aos invasores é chamada de resposta imune (Abbas et al., 2000). O
SI funciona 24 horas por dia e age de modos diferentes, porém trabalha quase sem ser
notado. A falha do SI só torna-se perceptível quando ele falha por alguma razão ou quando
ele faz alguma coisa que produza um efeito indesejado que pode ser visto ou sentido. Essa
defesa é mediada, primeiramente, pela reação da imunidade inata (barreiras físicas como:
pele, mucosa, certas enzimas e células fagocíticas) e, depois, pela resposta da imunidade
adaptativa (linfócitos T e B) (Rescigno et al., 2007).
Há muito tempo se reconhece a relação entre a competência imunológica e a
evolução da doença maligna. Mais especificamente, a redução da atividade das células
supressoras tem sido demonstrada em pacientes (Sakai, 2004, Rescigno et al., 2007). Esta
observação está mais relacionada à presença de doença avançada do que ao tipo
histológico do tumor e também oferece as bases para imunoterapia de pacientes com
câncer, sob a hipótese de que a restauração da função imunológica pode levar a um melhor
prognóstico do caso.
Roseane Maria Ribeiro Costa
11
Entre as células que fazem parte da defesa do sistema imune, avanços na biologia
demonstraram que as células dendríticas (DC), apresentadoras de antígenos, são
extremamente eficientes nas respostas imunes primárias, bem como, mediadoras da
ativação das células T (Abbas et al., 2000; Konemaka et al., 2004; Hagemann et al., 2007).
Os linfócitos T auxiliares (CD4) controlam o aspecto da tolerância imunológica e os
linfócitos T citotóxicos (CD8) atuam diretamente inibindo o tumor ou indiretamente
através da ativação das CDs (Engels and Uckert, 2007). Porém, essa interação apenas se
faz presente se as células tumorais além de expressarem antígenos tumorais, expressam
ainda, antígenos do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Sakai,
2004).
Também fazem parte da defesa imunológica contra tumores as células:
- Natural Killer (NK) que são células matadoras naturais que destroem as células tumorais
ou infectadas por vírus.
- Destruidoras ativadas por linfocinas (LAK), que diferem das NK, por apresentarem uma
atividade em amplo espectro de células alvos, mostrando-se promissoras contra vários
tipos de câncer (Colombo and Trinchieri, 2002).
O processo de iniciação do tumor maligno e a formação de metástase em humanos
podem levar anos ou décadas, dependendo do tipo de tumor. As células cancerígenas
evoluem das células normais adquirindo diversas mutações genéticas que eventualmente se
proliferam, aumentando o processo de mutação e reduzindo a sensibilidade aos sinais
apoptóticos e citotóxicos pelo SI. Neste processo, as células apresentadoras de antígeno
tornam-se alteradas por várias maneiras que promovem a resposta imune inata e, no estágio
final, algumas células se desprendem do tumor e escapam do reconhecimento do SI (Ben-
Eliyahu et al., 2007). Contudo, o SI pode detectar estes antígenos e iniciar uma resposta
humoral e celular para detectar e eliminar as células tumorais, inibindo assim, o
desenvolvimento do tumor (Rescigno et al., 2007).
3.3. INTERLEUCINA-2 (IL-2) IMUNO-MODULADOR
3.3.1. Atividades Biológicas e Ação Imuno-moduladora
A interleucina-2 é um polipeptídio natural de 130 resíduos de aminoácidos, 14 a 17
kDa (kilo Dalton), produzido principalmente por células T, embora também possa ser
sintetizada também por macrófagos e células teciduais (Merck Index, 1996; Thomas et al.,
2004)
Roseane Maria Ribeiro Costa
12
Além de possuir ações terapêuticas anti-neoplásica e imuno-moduladora, a IL-2
apresenta as seguintes atividades biológicas (Hora et al., 1990; Atkins et al., 1999; Zhang
et al., 2006):
Estimula o crescimento da célula destruidora natural (Natural Killer - NK);
Atua como principal fator de crescimento autócrino para os linfócitos T;
Age sobre as células B humanas como fator de crescimento e como estímulo para
síntese de anticorpos;
Pode também agir como um fator de morte para as células T ativadas por antígenos,
promovendo apoptose.
Na terapia contra o câncer o tratamento biológico com IL-2 difere-se dos tratamentos
convencionais, quimio e radioterapia, estimulando o sistema imune a exercer um efeito
diretamente no tumor.
IL-2 foi o primeiro agente imunológico que demonstrou um efeito anti-tumoral pela
ativação das células imune. Pacientes de carcinoma renal foram tratados com alta dose da
IL-2 e a sobrevida média para esses pacientes foi de 16,3 meses com sobrevivência de (10-
20%) 5 a 10 anos após o tratamento (Voss et al., 1989). A administração de IL-2 em baixa
dose em pacientes com câncer renal e melanoma também apresentou resultados benéficos,
sendo, neste caso, relatados índices de 18-23% de sobrevida sem níveis tóxicos elevados
(Salazar-Onfray et al., 2007).
Devido ao curto tempo de meia vida que a IL-2 apresenta, doses elevadas desta
citocina são, freqüentemente, injetadas em terapias biológicas de câncer para se manter um
tempo longo de eficácia anti-tumoral (Hora et al., 1990; Atkins et al., 1999; Thomas et al.,
2004, Zhang et al., 2006). A definição de um protocolo apropriado de uso da IL-2 em
tratamento imunoterápico virá de esforços que vão sendo realizados em estudos de
diferentes estratégias de administração da IL-2. Estratégias apontadas na literatura:
Combinação com a quimioterapia – pode ser promissora e selecionar diferentes
mecanismos para extinção do tumor (Sampath et al., 1999; Salazar-Onfray et al.,
2007; Rescigno et al., 2007);
Combinação com a radioterapia – tratamento mais efetivo e menos tóxico (Safwat et
al., 2004);
Combinação com outras citocinas – TNF, IFNγ, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, GM-CSF -
sugerindo um sinergismo no efeito anti-tumoral (Hill et al., 2000; Mitchell, 2003;
Toubaji et al., 2007; Salazar-Onfray et al., 2007);
Roseane Maria Ribeiro Costa
13
Combinação com anticorpos monoclonais – a IL2 pode facilitar a difusão intra-
tumoral de anticorpos monoclonais (Fridman and Tartour, 1997);
Combinações com vacinas tumorais (Overwijk et al., 2000; Shimizu et al., 1999;
Antonia et al., 2004);
Encapsulação da IL2 – para uma lenta e programada liberação da IL-2 no sítio de
ação desejado (Hora et al., 1990; Liu et al., 2000; Ozbans-Turan et al., 2002; Cadée
et al., 2002; Koten et al., 2003; Akbuga et al., 2004;Thomas et al., 2004).
3.3.2. Dose e Mecanismo de Ação
A interação entre células tumorais e o sistema imune é muito complexo e evolutivo
(Fridman and Tartour, 1997). O câncer difere em vários aspectos da maioria das doenças e
patógenos que interagem com o SI (Ben-Eliyahu et al., 2007) o que, por um lado, dificulta
a identificação precisa dos mecanismos que estão ativos em uma determinada situação,
bem como estabelecer uma hierarquia precisa dos diversos componentes da resposta imune
frente aos tumores (Sakai, 2004) e, por outro lado, estimula estudos de pesquisadores e
imunologistas tumorais.
Os mecanismos baseados para avaliar a imunoterapia com citocinas em células
tumorais ainda não estão bem definidos (Hill et al., 2002). Em trabalhos recentes, entre os
vários mecanismos que contribuem para a imunosupressão, muita ênfase tem sido dada em
às células mediadoras e reguladoras do processo inflamatório. A inflamação é uma
resposta natural dos organismos vivos a uma agressão sofrida capaz de causar uma lesão
celular ou tecidual. Em estágio de inflamação, as células imunologicamentes competentes
são acionadas e agem no sentido de inativar ou destruir microrganismos invasores,
remover substâncias irritantes e proteínas antígenas, além de estimular a renovação celular
e remodelagem do tecido (Hagemann et al., 2007; Salazar-Onfray et al., 2007).
Vários trabalhos evidenciam ações da IL-2:
IL-2 quando incubada in vitro com linfócitos gerou células capazes de lisar o tumor,
denominadas, células destruidoras ativadas por linfocinas (LAK), também identificadas
como células B e T que reconhecem as células cancerígenas (Dadian et al., 1993).
Tem sido demonstrado que a administração da IL-2 in vivo pode aumentar a
imunogenicidade de alguns tumores em camundongos, induzindo a secreção de vários
mediadores solúveis incluindo IL1, TNFα, IFNβ, IFNγ, IL6, GM-CSF e M-CSF
(Thompson et al., 1986). Esta indução depende da via de administração pela qual a IL2 é
aplicada. Neste estudo, observou-se que a aplicação de IL-2 em animais permitiu a
Roseane Maria Ribeiro Costa
14
detecção de linfócitos T citotóxicos específicos para tumor, não observados antes da
administração dessa citocina.
Para determinar o impacto do tratamento com a IL-2 em pacientes com câncer, têm
sido administradas pela via sistêmica altas doses sucessivas, por um extenso período de
tempo, para manter um alto nível sistêmico desta citocina (Lindsey et al., 2000; Atkins et
al., 2000). A terapia local da IL-2, intra-tumoral ou peritumoral, tem sido investigada tanto
na clínica como em vários modelos experimentais e também requer aplicações em dias
sucessivos (Liu et al., 1997; Qin et al., 2001; Greenwald et al., 2003).
A IL-2 quando administrada em alta dose produziu resposta clínica significativa em
alguns tipos de câncer (Rosenberg et al., 1998; Overwijk et al., 2000; Shimizu et al.,
1999). Contudo, a toxicidade do tratamento com IL-2 é um fator limitante. Assim, a alta
dose de IL-2 não é apenas inconveniente, mas pode resultar também em uma série de
efeitos colaterais e tóxicos, incluindo febre, náusea, vômito, diarréia, desorientação,
neurotocixidade, citopenia, dentre os mais graves como edema pulmonar (Salazar-Onfray
et al., 2007). Por outro lado, foi observado em pacientes portadores de melanoma que a
administração de baixa dose da IL-2 resultou na prolongada e persistente transferência das
células T. Conseqüentemente, a eficácia da vacina pode ser obtida com uma dose mínima
de toxicidade (Antonia et al., 2004).
Outro efeito adverso relatado quando ocorre alto nível de expressão da IL-2 é o
bloqueio da atividade desta citocina. Neste caso, o estímulo ao sistema imune pode ser
reduzido, de modo significativo, por causa de uma formação danificada de linfócitos T
citotóxicos específicos para tumor (Schmidt-Wolf and Schmid-Wolf Ingo, 1995), inibindo
ou promovendo o crescimento do tumor (Antonia et al., 2004).
Como parte dos efeitos colaterais estão relacionados à dose da IL-2, protocolos que
incluem baixa dose de IL-2 para manter a eficácia são de grande interesse (Tartour et al.,
1992; Schmidt-Wolf and Schmid-Wolf Ingo, 1995; Fridman and Tartour, 1997).
As diferenças fisiológicas entre modelo experimental (animal) e paciente, assim
como, a inadequação de vários modelos pré-clínicos, dificultam a determinação de um
protocolo clínico mais eficiente para tratamento de pacientes. Estes problemas podem ser
minimizados com o uso de sistemas apropriados de liberação controlada que possam
promover um constante estímulo do sistema imune através de uma liberação lenta e
controlada de IL-2.
Roseane Maria Ribeiro Costa
15
3.4. SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA PARA IL-2
3.4.1. Considerações Gerais sobre Sistemas de Liberação Controlada
Na área farmacêutica, os sistemas de liberação controlada (SLC) são sistemas
bastante promissores no que diz respeito ao aumento da eficácia terapêutica de um fármaco
através da manutenção de níveis do fármaco dentro da faixa terapêutica, diminuição
significativa da toxicidade minimizando os efeitos colaterais, redução na necessidade de
administração de várias doses e conseqüentemente, à melhor adesão do paciente ao
tratamento (Vila et al., 2002; Haider et al., 2004; Dai et al., 2005; Chen et al., 2006;
Daugherty and Mrsny, 2006; Sun et al., 2008).
Os principais sistemas de liberação controlada existentes são: lipossomas,
nanocápsulas, nanoesferas, microcápsulas, microesferas, microemulsões, cristais líquidos,
patches ou bioadesivos (Kallinteri et al., 2002; Pohlmann et al., 2002; Qvist et al., 2002;
Formariz et al., 2005; Andreadis and Geer, 2006; Dass and Choong, 2006; Dong and Feng,
2007).
Os sistemas microparticulados têm sido empregados com sucesso para grande
variedade de fármacos tanto lipofílicos como hidrofílicos, incluindo: enzimas, hormônios,
peptídeos, proteínas, antibióticos, antifúngicos, antiinflamatórios, analgésicos e
anticancerígenos (Johansen et al., 2000; Haider et al., 2004; Andreadis and Geer, 2006;
Daugherty and Mrsny, 2006; George and Abraham, 2006, Zhang and Gao, 2007; Lavi et
al., 2007).
Os sistemas microparticulados são gerados através de técnicas de microencapsulação,
correspondendo a produtos constituídos de partículas, geralmente esféricas, de tamanho
entre 1 e 1000 µm, denominados microcápsulas ou microesferas (Ré, 2000; Berkland et al.,
2001; Ré, 2002).
Microcápsulas (Figura 1a) consistem, em geral, em uma camada de polímero que
atua como um filme protetor, isolando a substância ativa (gotículas líquidas ou partículas
sólidas) e evitando os efeitos de sua exposição inadequada. Essa camada externa desfaz-se
sob estímulo específico, liberando a substância ativa. O material ativo também pode estar
incluso em uma matriz sólida de polímero, formando nesse caso, uma microesfera, como
ilustrado na Figura 1b.
Roseane Maria Ribeiro Costa
16
a) Microcápsula b) Microesfera
Figura 1. Configurações possíveis para sistemas de liberação microparticulados.
Inúmeras técnicas permitem a microencapsulação de um material ativo e o
desenvolvimento de sistemas microparticulados de liberação controlada, dependendo do
tipo de material, da aplicação e do mecanismo de liberação desejada para sua ação. A
diferença entre estas técnicas está no tipo de envolvimento ou aprisionamento do material
ativo pelo agente encapsulante, sendo que a combinação entre o material e o agente pode
ser de natureza física, química ou físico-química (Jackson and Lee, 1991; Jain, 2000; Ré,
2006), tais como:
Natureza física: spray drying (secagem de gotículas líquidas por aspersão em uma
corrente gasosa de ar quente, gerando partículas sólidas), spray cooling (secagem de
gotículas por resfriamento), leito fluidizado, extrusão;
Natureza físico-química: emulsificação seguida de evaporação/extração de solvente,
coacervação, separação por fase orgânica, pulverização em agente formador de reticulação;
Natureza química: polimerização interfacial, envolvendo uma reação de
polimerização na interface de duas soluções imiscíveis contendo monômeros, uma delas
contendo material ativo em suspensão, polimerização em emulsão, polimerização in situ,
inclusão molecular envolvendo a encapsulação de certas moléculas por outras.
No desenvolvimento de um sistema de liberação controlada microparticulado,
diversos fatores devem ser levados em conta, dentre eles: propriedades do princípio ativo
(especialmente a solubilidade), natureza do polímero (propriedades e concentração), uso da
partícula (tipo de terapia, via de administração, proteção do ativo, morfologia, estabilidade
e mecanismo de liberação), assim como, as condições do processo de obtenção do produto
(Jain, 2000; Andreadis and Geer, 2006; Chen et al., 2006; Dass and Choong, 2006).
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17
3.4.1.1. Método de Emulsificação seguida de Extração (difusão) e Evaporação de
Solvente
Dentre os vários métodos existentes, um dos mais utilizados para encapsular
fármacos solúveis em água, especialmente, proteína e peptídeo, é o método de emulsão
múltipla seguido de evaporação ou extração de solvente, ilustrado na Figura 2 (Igartua et
al., 1998; Yang et al., 2000; Yang et al., 2001; Wei et al., 2004).
Figura 2. Esquema do método de emulsificação seguida de extração (difusão) e
evaporação de solvente.
Etapas 1 e 2 - Formação de uma emulsão múltipla.
A substância a ser encapsulada (substância ativa) é, primeiramente, dissolvida,
dispersa ou emulsificada em uma solução polimérica de um solvente orgânico, formando
uma emulsão primária do tipo A/O (Etapa 1, Figura 2) a qual, por sua vez, é dispersa em
uma fase externa (óleo ou água, geralmente água), constituindo a Etapa 2 (Figura 2), com a
formação de uma emulsão múltipla (geralmente A/O/A).
O método mais comumente usado para formação das emulsões é a agitação
mecânica. O parâmetro mais importante para o controle do tamanho das gotas da fase
orgânica na fase aquosa é a velocidade de rotação do impelidor. Um aumento na
velocidade de agitação geralmente promove um aumento na turbulência e nas forças de
cisalhamento, gerando assim gotas menores e, conseqüentemente, micropartículas de
menor granulometria (Blanco-Prieto et al., 1998; Jain, 2000).
Roseane Maria Ribeiro Costa
18
Etapa 3 - Remoção do solvente da emulsão.
Uma vez formada a emulsão múltipla, o solvente orgânico deve ser extraído da fase
dispersa, o que levará à precipitação do polímero e formação das micropartículas. A
difusão do solvente orgânico para a fase aquosa pode levar à saturação desta dependendo
da relação de volume de fases (orgânica/aquosa). Neste caso, o solvente deve ser
evaporado da superfície da fase orgânica, através de agitação mecânica ou magnética, para
que se consiga eficiência na difusão do solvente orgânico para a fase aquosa, já que a
retirada contínua do solvente da fase orgânica mantém o gradiente de concentração entre as
duas fases, permitindo a extração do solvente da fase orgânica.
Quando se dilui a fase aquosa para facilitar a extração do solvente da fase orgânica,
o volume e composição da fase aquosa são definidos de forma que o volume total de
solvente orgânico possa ser difundido nessa fase. A velocidade de remoção do solvente
depende de vários fatores, dentre eles: concentração do material polimérico, composto
ativo e o próprio solvente, bem como o perfil de liberação desejado.
Etapa 4 - Separação e secagem de micropartículas.
No término do processo, as partículas são coletadas por filtração ou centrifugação, e
em seguida, são lavadas com água, para posterior processo de secagem a vácuo ou através
de liofilização, para obtenção do produto final (Jonhasen et al., 2000; Ungaro et al., 2006).
A taxa e as condições de secagem influenciam a quantidade de solvente e umidade
residuais nas partículas sólidas formadas, suas características morfológicas e porosidade,
fatores estes que podem afetar o perfil de liberação da substância encapsulada, podendo
assim, afetar o perfil de liberação do material ativo encapsulado.
Embora o princípio desta técnica seja simples, os fenômenos físico-químicos que
governam este método são complexos. O sistema é caracterizado pela existência de duas
interfaces líquido-líquido e uma interface líquido-gás através das quais ocorrem difusão e
transferência de massa durante o período de formação das microesferas (Figura 3). Desde o
início do método, o solvente orgânico se parte da interface L1/L2 para difundir na interface
L2/G onde se evapora. Esta partição não fica, no entanto, limitada ao solvente orgânico,
refere-se igualmente ao princípio ativo introduzido na fase dispersa, que pode se difundir
do interior da fase dispersa da emulsão primária para a fase externa aquosa, a partir da
interface L1/L3. A rapidez e a importância destes diferentes eventos de transferência de
massa vão afetar a estrutura final das micropartículas. Exemplificando, uma solidificação
Roseane Maria Ribeiro Costa
19
rápida das micropartículas é desejada se o material ativo a ser encapsulado migra
facilmente para a fase aquosa.
L1: fase orgânica dispersa L2: fase aquosa dispersante L2/G: interface L2 /gás L1/L2: interface entre fases dispersa e dispersante L1/L3: interface entre fase aquosa interna e dispersa e dispersante
Figura 3. As diferentes interfaces de transferência de massa (solvente e substância sendo
encapsulada) durante a microencapsulação por processo de emulsificação e difusão de
solvente (extração ou evaporação).
As partículas obtidas são do tipo matricial. Este método permite, por conseguinte, a
preparação de microesferas. A sua dimensão vai depender de condições operacionais como
a velocidade de emulsificação, a viscosidade da fase que dispersa, a concentração dos
agentes tensoativos. Deverá estar geralmente entre 0,5 e 200 µm. Pode-se citar, como
polímeros de revestimento classicamente utilizados, etilcelulose, o poliestireno, e
polímeros biodegradáveis como poli-epson-caprolactona (Igartua et al., 1998; Yang et al.,
2001; Daugherty and Mrsny, 2006; Sun et al., 2008), polihidroxialcanoatos (Maia et al,
2004) e os homopolímeros e copolímeros dos ácidos lácticos e glicólico (Kumar et al.,
2001; Kang and Schwendeman, 2002; Vila et al., 2002; Lagarce et al., 2006; Lavi et al.,
2007).
3.4.2. Sistemas Biodegradáveis de Liberação Controlada
A oferta de encapsulantes que são utilizados para produção dos sistemas de liberação
controlada, em sua maioria polímeros de origem natural e sintética, vem crescendo na
indústria farmacêutica (Alonso et al., 1998; Jain, 2001; Dai et al., 2005; George and
Abraham, 2006). Dentre estes, pode-se mencionar os poliésteres sintéticos biodegradáveis
e biocompatíveis constituídos por ésteres de ácido láctico e ácido glicólico, PLA e PLGA.
Devido à biocompatibilidade, estes polímeros foram aprovados pela vigilância
sanitária americana (FDA) para uso clínico e farmacêutico, como suturas, fixadores e
regeneradores de ossos, peles e cartilagens artificiais, materiais odontológicos e liberação
Roseane Maria Ribeiro Costa
20
de fármacos (Giunchedi et al., 1998; Kumar et al., 2001; Kang and Schwendeman, 2002;
Vila et al., 2002).
Para liberação de fármacos e proteínas vários tipos de PLGA, de natureza amorfa, são
utilizados, com diferentes razões monoméricas de ácido láctico: ácido glicólico (50:50 à
100:0), massa molecular (10-100 kDa) e grupo químico final (ácido carboxílico livre),
sendo assim, possível modificar as propriedades mecânicas, térmicas e biológicas pela
modificação na proporção dos ácidos láctico e glicólico. Estes três parâmetros determinam
a hidrofobicidade e a degradação cinética dos materiais, assim como, a eficiência da
microencapsulação e o perfil de liberação dos fármacos e proteínas.
A hidrofobicidade do PLGA também afeta interações das microesferas com as
células fagocíticas, como os macrófagos e células dendríticas. Estas interações são de
importância crucial para uso de sistemas de liberação controlada, constituídos por estes
polímeros, nas formulações de vacina (Johansen et al., 2000; Dass and Choong, 2006).
Os produtos da hidrólise destes polímeros, PLA e PLGA são, respectivamente, ácido
lático e ácidos lático/glicólico, produtos estes totalmente metabolizáveis no Ciclo de
Krebs, até CO2 e H2O.
A degradação de sistemas de liberação controlada à base de PLGA ocorre em dois
estágios: 1) O primeiro envolve a cisão hidrolítica da ligação éster, gerando oligômeros e
monômeros, o que reduz a massa molar do polímero; 2) O segundo estágio deve-se à
erosão desses sistemas, que perdem massa. A cisão hidrolítica pode ser auto-catalisada pela
presença dos produtos de degradação ácida (Faisant et al., 2002).
3.4.3. Sistemas Microparticulados na Terapia do Câncer
A liberação local e sustentada de moléculas biologicamente ativas, fármacos ou
imuno-moduladores, dentro do ambiente tumoral é essencial para o desenvolvimento de
uma resposta sistêmica efetiva com o mínimo de efeitos colaterais (Hill et al., 2002). A
microencapsulação de fármacos anti-cancerígenos em polímeros biodegradáveis é uma
estratégia promissora para modificar sua biodisponibilidade, reduzir a toxicidade e
aumentar a eficácia terapêutica desses agentes anti-tumorais (Manome et al., 2006;
Prokopowicz and Przyjazny, 2007; Xie et al., 2007). Além disso, os sistemas
microparticulados podem ter suas características físico-químicas ajustadas para diferentes
vias de administração, incluindo via intra-tumoral (Dass and Burton, 1999; Tinsley-Bown
et al., 2000; Lagarce et al., 2006; Lavi et al., 2007).
Roseane Maria Ribeiro Costa
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Vários fármacos microencapsulados em matriz polimérica, caracterizados como
sistemas de liberação controlada, foram propostos para uso em tratamento de tumores
malignos (Blanco et al., 2005; Manome et al., 2006; Son and Kim, 2007). O Fluoracil-5
(FU-5) é um anti-neoplásico que vem sendo utilizado para vários tipos de câncer: mama
(Earl and Iddawela, 2004), colo retal (Rothenberg et al., 2007), trato gastro-intestinal
(Dickson and Cunningham, 2004), pâncreas (Pasetto et al., 2004) e cabeça e pescoço (Kim
and Glisson 2003). Em conseqüência do seu uso extensivo para uma variedade de
tratamento de tumores malignos, o FU-5 foi encapsulado em microesferas de diferentes
sistemas poliméricos: Eudragit (Lamprecht et al., 2003), Quitosana (Denkbas et al., 1999);
PLA e PLGA (Fu et al., 2005; Siepman et al., 2004; Blanco et al., 2005).
Implantes de hidroxiapatita (Itokazu et al., 1996) e gelatina reticulada com
glutaraldeído (Fan and Dash, 2001) contendo doxorrubicina foram investigados como
potenciais sistemas de liberação deste fármaco para tratamento anti-cancerígeno de câncer
dos ossos. Especificamente, corroborando para o tratamento de câncer dos ossos,
Prokopowicz and Przyjazny (2007) encapsularam a doxorrubicina em uma matriz de gel
mesoporosa e observaram uma liberação controlada desse fármaco. Também há relatos na
literatura da microencapsulação deste anti-neoplásico em matrizes poliméricas de ácido
láctico e glicólico. Implantes de PLGA contendo doxorrubicina direcionada para outros
fins terapêuticos, como para terapia de tumores cerebral, especialmente gliomas, também
foram propostos na literatura (Manome et al., 2006).
Devido às limitações tóxicas do uso sistêmico do plaquitaxel, Xie et al. (2007)
produziram microesferas de PLGA contendo o mesmo, para tratamento de pacientes com
carcinoma avançado de laringe. A formulação obtida, quando comparada ao injetável
convencional, mostrou um aumento na eficácia terapêutica via intra-tumoral ou intra-
peritumoral em camundongos nude com carcinoma de laringe Hep-2 (Xie et al., 2007).
Igualmente, microesferas de PLA e PLGA contendo plaquitaxel foram desenvolvidas com
conjugado de anticorpos receptor endotelial vascular do fator de crescimento 2 na
superfície das partículas para tratamento de câncer de próstata. Tumores de próstata
humana foram inoculados em camundongos, os quais mostraram variabilidade, porém, o
grupo tratado com essas microesferas apresentou uma inibição significativa no crescimento
do tumor (Lu et al., 2004).
Para fins de terapia gênica, o gene da IL-12 modificado (p2CMVmIL12) foi
encapsulado em microesferas de PLGA apresentando uma inibição do adenocarcinoma em
camundongos, quando comparado ao grupo tratado com o controle DNA/IL-12. A
Roseane Maria Ribeiro Costa
22
combinação da terapia gênica do pDNA (plasmídeo do DNA) com o tratamento do
Fluoracil-5 inibiu significativamente o crescimento do tumor, quando comparado apenas
com a terapia gênica isolada (pDNA). Esses resultados sugerem que as formulações de
microesferas do pDNA podem prover um eficiente sistema de liberação em terapia gênica
(Son and Kim, 2007).
Microesferas biodegradáveis encapsulando citocinas representam uma alternativa
clínica interessante na imunoterapia contra o câncer. Hill et al. (2002) observaram que a
liberação de IL-12 e GM-CSF no ambiente tumoral, a partir de microesferas de PLA,
induziu uma persistente resposta inflamatória, evidenciada pelo aumento no nível
sistêmico de citocinas inflamatórias; subsequentemente, esta inflamação promoveu a morte
substancial das células tumorais, evidenciada pela necrose massiva dentro do tumor
primário.
Antagonista do receptor da inteleucina-1 (IL-1Ra) que apresenta um potencial para
tratamento do câncer em fase de metástase foi encapsulado em microesferas de PLGA
usando albumina e trealose, como agentes estabilizantes (Lavi et al., 2007). De acordo com
esses autores, o protocolo de ensaio pré-clínico por eles utilizado, para o tratamento
realizado em camundongos portadores de melanoma B16, apresentou uma inibição de
crescimento do tumor e um aumento na sobrevida dos animais. Além disso, observou-se
que os tumores foram menos vascularizados e que houve uma redução de metástase no
pulmão, em 70% dos animais tratados em comparação ao grupo controle (Lavi et al.,
2007).
Outro estudo foi realizado com microesferas de PLGA contendo IL-18 (Lagarce et
al., 2006), visando uma liberação local de proteínas bioativas no sistema nervoso central
(SNC). IL-18 tem ampla atividade de interesse ao SNC como anti-tumoral para erradicar
especificamente as células malignas de um glioma, diretamente no SNC.
3.4.4. Sistemas Microparticulados com Interleucina 2
O protocolo clínico utilizado com a IL-2 para a terapia contra o câncer requer a
hospitalização do paciente envolvendo dois ciclos da administração intravenosa de IL-2 a
cada 8 horas durante 5 dias, com um intervalo de 9 dias entre cada ciclo. Portanto, para
superar essa e outras dificuldades encontradas hoje na terapia com a IL-2, vários dados da
literatura têm confirmado o interesse no uso de sistemas de liberação controlada contendo
interleucina 2 em polímeros biodegradáveis, tanto de origem natural como sintética, como
alternativa promissora para superar tais limitações.
Roseane Maria Ribeiro Costa
23
A microencapsulação de IL-2 em hidrogéis de dextrana mostrou que a liberação pode
ser modulada pela densidade da reticulação e/ou pela degradação característica do
hidrogel, preservando sua atividade biológica entre 50 a 70% (Cadée et al., 2002). Em
outro estudo, microesferas de dextrana com IL-2 foram injetadas subcutaneamente em
ratos formando um depósito local, o qual gerou uma reação inflamatória inicial causada
pela infiltração de polimofornucleares (PMN) e migração dos macrófagos. Com a liberação
da IL-2 proveniente das microesferas de dextrana, as atividades das PMN e dos
macrófagos foram moduladas, induzindo uma necrose em massa das células tumorais
(aumento da fagocitose), dentre outros efeitos relatados pelos autores (Koten et al., 2003).
IL-2 também já foi encapsulada em microesferas de quitosana, de cerca de 1 μm de
tamanho médio, com uma eficiência de encapsulação entre 75 e 98% (Özbas-Turan et al.,
2002). A liberação in vitro destas partículas apresentou um perfil bifásico e observou-se
que a velocidade de liberação da IL-2 dependia das condições de preparação das
microesferas (formação por precipitação a partir da adição de um sal, Na2SO4, à uma
solução de quitosana), no entanto, de modo geral, a liberação ocorria por um período de
cerca de 200 dias. Segundo os autores, a captura celular destas microesferas feita em
culturas de células HeLa e L-strain apresentou-se como dose dependente. Outra
investigação foi feita com microesferas de quitosana contendo plasmídeo de IL-2, usadas
para aumentar a expressão e controlar a liberação do gene da citocina para células
cancerígenas (Akbuga et al., 2004).
IL-2 também foi encapsulada em microesferas formadas por um complexo de
polieletrólito de alginato e quitosana (Liu et al., 1997). As microesferas formadas por esses
dois polissacarídeos apresentaram estruturas porosas que, quando foram incubadas em
solução de PBS pH 7,2 contendo IL-2, adsorveram cerca de 95% da IL-2 do meio. Devido
às características aniônicas do alginato e catiônicas da quitosana, as interações iônicas
entre estes polímeros podem ser afetadas por suas cargas opostas, alterando a estrutura
porosa das microesferas o que, conseqüentemente afeta a incorporação da IL-2 nas
microesferas, bem como sua posterior liberação. Quando incubadas in vitro na presença de
células tumorais, a liberação da IL-2 a partir destas microesferas de alginato e quitosana
induziu uma produção mais eficiente de linfócitos T citotóxicos, em comparação a IL-2 em
sua forma livre (Liu et al., 1997).
Apesar de apresentarem resultados promissores, esses sistemas de liberação de IL-2
baseados em polímeros naturais de dextrana (Cadée et al., 2002; Koten et al., 2003) e
Roseane Maria Ribeiro Costa
24
quitosana (Liu et al., 2000; Ozbds-Turam et al., 2002; Akbuga et al., 2004) não são
aprovados pelo FDA para uso em terapia clínica.
Por outro lado, alguns estudos já foram realizados visando o desenvolvimento de
sistemas de liberação controlada de IL-2 à base dos co-polímeros de ácido lático e
glicólico, PLGA, aprovados pelo FDA (Food Drug Administration):
1. Hora et al. (1990) encapsularam duas formas modificadas da IL-2 succinyl (SIL-2) e
polietilenoglicol (PEG IL-2) em microesferas de PLGA (52:48). Estas formas modificadas
da IL-2 foram empregadas com a finalidade de melhorar a solubilidade da IL-2, já que esta
é uma proteína com solubilidade limitada em meio aquoso. Os resultados destes autores
mostraram que a forma SIL-2 apresentou baixa eficiência de encapsulação da proteína
(dado não relatado na literatura), sendo esta liberada nos dois primeiros dias no ensaio da
cinética de liberação in vitro. A formulação PEG IL-2 ainda foi associada à albumina
humana, utilizada como um excipiente mediador de IL-2. Esta associação resultou em
melhor solubilização e difusão da IL-2 das microesferas de PLGA nos ensaios de liberação
in vitro em meios fisiológicos simulados (meio contendo dodecilsulfato de sódio (SDS) e
meio constituído de soro fetal bovino), correspondendo a uma liberação em torno de 2% a
3% por dia, durante um período de 20 a 30 dias. Porém, a literatura também aponta que
esta modificação covalente da IL-2 com o polietilienoglicol, apesar de aumentar o tempo
de circulação dessa proteína, pode reduzir severamente sua atividade biológica (Thomas et
al., 2004).
2. Mais recentemente, IL-2 foi microencapsulada em microesferas de PLGA (50:50), pelo
método de emulsificação e evaporação de solvente (Thomas et al., 2004), a partir de
emulsões, simples e múltipla. Quando empregado o método de emulsão simples, os autores
associaram IL-2 a agentes estabilizantes como manitol (crioprotetor na etapa final de
liofilização das microesferas) e dodecil sulfato de sódio (SDS) com a finalidade de limitar
a agregação da proteína e melhorar sua estabilidade na re-suspensão em meio aquoso. No
caso da emulsão múltipla, onde IL-2 é primeiro solubilizada em meio aquoso em uma
emulsão primária, esta foi ainda associada à albumina de soro bovina (BSA) buscando-se
aumentar a estabilidade da IL-2 e melhorar sua liberação. Em ambas as preparações
(emulsão simples ou múltipla), as formulações apresentaram uma eficiência de
encapsulação da IL-2 de 40 a 60%, com um percentual de liberação de 15% por um
período de 30 dias para as partículas obtidas pelo método de emulsão simples e 30% para
Roseane Maria Ribeiro Costa
25
as partículas obtidas pelo método de emulsão múltipla por um período observado de 40
dias. Diferentes causas foram apontadas para explicar a liberação incompleta da IL-2
dessas formulações: - quantidades insuficientes dos agentes estabilizantes para re-
solubilização da proteína; - possível interação da IL-2 com a matriz polimérica; -
inativação da IL-2 durante a sua liberação devido ao micro-ambiente de baixo pH gerado
pelos produtos de degradação do PLGA.
Neste mesmo trabalho, os autores Thomas et al. (2004) encapsularam a IL-2 por
spray-drying usando como agentes encapsulantes um fosfolipídeo, dipalmitiol-
fosfatidilcolina (DPPC), e um polimetacrilato, Eudragit E100 (E100), produzindo
micropartículas finas de diâmetro médio de 4 µm, com uma eficiência de encapsulação
superior a 90%. O perfil cinético de liberação da IL-2 das partículas de DPPC/E100
apresentou uma fase inicial acelerada correspondendo a uma liberação de 80% da proteína
contida nas partículas já nos dois primeiros dias de ensaio. No entanto, segundo os autores,
este perfil pode ser ajustado pela modificação da proporção de DPPC e E100 nas
partículas.
Estes estudos já realizados referentes à encapsulação de IL-2 em microesferas de
PLGA colocam em evidência dificuldades em preservar a proteína durante o processo de
microencapsulação, manter uma eficiência elevada de retenção da IL-2 nas micropartículas
e no controle de sua velocidade de liberação em meios fisiológicos simulados. Um melhor
controle destes parâmetros demanda maiores investigações e continuidade dos estudos de
desenvolvimento de sistemas de liberação controlada de IL-2 usando PLGA como matriz
polimérica. De fato, os problemas e limitações observadas para IL-2 são comuns às
proteínas e principalmente ao processo de emulsificação e evaporação de solvente, que tem
sido o processo de microencapsulação mais utilizado para obtenção de microesferas
biodegradáveis. Um avanço no estado da arte relacionado ao desenvolvimento de sistemas
de liberação controlada de proteínas talvez tenha sido obtido até o presente momento com
proteínas modelo como, por exemplo, a albumina de soro bovina (BSA) e será o tema
tratado no item 3.4.5 a seguir.
Roseane Maria Ribeiro Costa
26
3.4.5. Sistemas de Liberação Controlada de Proteínas
Proteínas são macromoléculas que apresentam uma série de limitações: não podem
ser administradas por via oral, devido a problemas relacionados à degradação no meio
ácido do trato gastro-intestinal; são muito sensíveis às condições ambientais, apresentam
curto tempo de meia-vida e necessitam de freqüentes administrações em altas doses para
obter eficácia terapêutica o que, por sua vez, pode conduzir a efeitos colaterais de elevada
toxicidade na administração (Dai et al., 2005; Liu et al., 2005; Dass and Choong, 2006).
Um dos métodos de microencapsulação de proteína mais utilizados na literatura é o
método de emulsão múltipla seguida de evaporação ou extração de solvente, (Igartua et
al.,1998; Johansen et al., 2000; Yang et al., 2001; Kim et al., 2005; Daugherty and Mrsny,
2006; Feczko et al., 2007). A etapa crítica da microencapsulação de uma proteína está
associada à manutenção da sua estabilidade, que por sua vez, está diretamente relacionada
as suas propriedades como agente terapêutico. A instabilidade pode ocorrer nas várias
etapas do processo de produção, armazenamento e aplicação e, a análise das possíveis
causas que podem afetar a estabilidade das proteínas é fundamental para se minimizar estes
efeitos na proteína encapsulada. O Quadro 1 lista algumas das causas e mecanismos que
podem comprometer a estabilidade físico-química das proteínas no processo de
microencapsulação por emulsificação e evaporação de solvente, armazenamento e teste dos
sistemas de liberação controlada, geralmente empregados no desenvolvimento (Zhu et al.,
2000; Cadée et al., 2002; Tamber et al., 2005; Daugherty and Mrsny, 2006).
Roseane Maria Ribeiro Costa
27
Quadro 1. Causas e mecanismos que podem comprometer a estabilidade físico-química de proteínas, no processo de microencapsulação por emulsificação e evaporação de solvente, armazenamento e teste dos sistemas de liberação controlada.
Durante um processo de microencapsulação, a meta pretendida é evitar alterações na
proteína, controlando as variáveis de processo e formulação que possam favorecer
agregação irreversível, desdobramento reversível e degradação química da molécula
protéica, ao mesmo tempo em que se garante uma elevada incorporação da proteína nas
micropartículas geradas. O Quadro 1 aponta uma série de etapas do processo e de pós-
processamento como armazenamento e caracterizações e variáveis a elas ligadas que
devem ser controladas para fins de preservação da atividade protéica, tais como: utilização
de um co-encapsulante, um agente aditivo estabilizante, controle das condições de
Causas Mecanismos
Formação da emulsão simples (A1/O)
Desdobramento de proteína devido a forças de ultra-agitação durante emulsificação;
Degradação química na interface A1/O.
Congelamento e secagem das microesferas
Instabilidade ou agregação da proteína.
Armazenamento
Solvente residual pode induzir toxicidade;
Mudança nas características do polímero, como Tg e resistência hidrolítica, afetando a estabilidade e liberação da proteína.
Alteração nas características do polímero, como Tg e resistência hidrolítica, afetam estabilidade e liberação da proteína.
Incubação simulando meio fisiológico a 37°C
Agregação de proteína durante re-hidratação em ambiente aquoso;
Reações químicas: troca de tiol-dissulfídico, oxidação, acilação e hidrólise;
Adsorção de proteína na interface polímero/líquido;
Instabilidade e degradação devido a reações em meio ácido promovido pela hidrólise do polímero.
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encapsulação e escolha do material polimérico (Haider et al., 2004; Dai et al., 2005;
Daugherty and Mrsny, 2006; Peppas and Kavimandan, 2006).
O Quadro 2 reúne algumas alternativas para a manutenção da estabilidade da proteína
durante o processo de microencapsulação (Chen et al., 2006; Tamber et al., 2005; Dai et
al., 2005; Peppas and Kavimandan, 2006).
Quadro 2. Alternativas e mecanismos para manter a integridade da proteína durante o processo de microencapsulação.
Alternativas Mecanismos
Aumento da concentração de proteína
Quantidades limitadas de proteína adsorvem irreversivelmente na interface, resultando em uma modesta eficiência de encapsulação. Uso de concentrações elevadas tem papel de auto-proteção.
Adição de várias proteínas ou proteínas antigênicas
Adição de proteínas tem sido utilizada com uma significante atividade interfacial como co-encapsulante para estabilizar diversas proteínas. Proteínas mais utilizadas: albumina soro humano (HSA), albumina de soro bovina (BSA) e albumina soro de rato (RSA).
Adição de tensoativos
Os tensoativos oferecem proteção contra agregação irreversível de proteínas parcialmente desnaturadas. Contudo, este uso deve ser limitado ao nível mínimo exigido para evitar possíveis reações tóxicas e de hipersensibilidade.
Adição de outros excipientes e
estabilizantes
Aditivos são utilizados para estabilizar emulsões através do aumento de viscosidade da solução. Esta função pode ser importante na redução da perda de proteína por difusão na interface a1/o. Aditivos como álcool polivinílico, carboxi-metilcelulose, estearato de etila, acetato de sódio, glutamato de sódio e sorbitol têm sido empregados em diferentes estudos.
Pareamento de íon hidrofóbico
O processo aquoso pode ser evitado pelo uso de proteína ou peptídeo com um complexo de íon. O papel do complexo iônico é diminuir a solubilidade aquosa da proteína ou peptídeo e aumentar sua dissolução em meio não aquoso, como em solvente orgânico. Assim, a estabilidade estrutural da proteína é dada pela restrição da mobilidade da cadeia apenas dentro do complexo iônico.
Roseane Maria Ribeiro Costa
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A co-encapsulação de aditivos geralmente é a primeira tentativa para melhorar a
integridade durante o período de incubação e liberação da proteína (Peppas and
Kavimandan, 2006). Várias alternativas têm sido propostas, dentre elas:
A incorporação de sais na matriz polimérica
Quando os sistemas de liberação controlada são expostos em meio aquoso, as cadeias
laterais dos aminoácidos neles encapsulados podem interagir com o meio levando à
degradação e agregação da proteína e conseqüente perda da funcionalidade da mesma.
Neste caso, a incorporação de sais na matriz polimérica pode representar uma estratégia de
controle do pH evitando a acidificação do micro-ambiente na matriz polimérica que leva à
degradação da proteína (Tamber et al., 2005; Dass and Choong, 2006).
Complexação com íon metálico
A formação complexa reversível com íons metálicos representa outra alternativa para
estabilização de proteínas. Através dessa complexação, a integridade físico-química de
uma proteína pode ser preservada por períodos prolongados de tempo até a dissociação do
complexo, dissolução e liberação da proteína contida em sistemas de liberação controlada
(Peppas and Kavimandan, 2006).
Modificações química na proteína a ser encapsulada ou no polímero a ser
utilizado como encapsulante
Modificações químicas da proteína, como ligações inter ou intra-moleculares,
derivação ou conjugação covalente, podem gerar compostos imunogênicos mais estáveis
(FágáiRomero Página 29 19/06/2008Romero Página 29 19/06/2008Criado por
Romeron, 1995). Modificações com polietilenoglicol podem manter a bioatividade e
imunogenicidade de peptídeos e proteínas, representando uma alternativa interessante para
melhorar a liberação da proteína e prolongar seu tempo de meia vida in vitro e in vivo, o
que merece futuro desenvolvimento e exploração (Vila et al., 2002; Dai et al., 2005; Dass
and Choong, 2006).
No entanto, deve-se lembrar que alterações na formulação como estas mencionadas
podem se refletir na cinética de liberação da proteína de seus respectivos sistemas de
liberação controlada.
Roseane Maria Ribeiro Costa
30
Várias das alternativas apresentadas no Quadro 2 vêm sendo utilizadas na
encapsulação da albumina de soro bovina (BSA), como proteína modelo e também como
agente estabilizante de outra molécula bioativa, em microesferas de PLGA de diferentes
razões monoméricas e com uso de vários agentes tensoativos através da técnica de emulsão
múltipla.
Igartua et al. (1998) prepararam microesferas de PLGA (50:50) contendo BSA, como
proteína modelo, pela técnica de emulsão múltipla, utilizando o diclorometano como
solvente e o PVA como agente emulsificante. Eles investigaram algumas das condições de
processo que podem afetar a estabilidade da proteína como: contato com solvente e tipo de
agitação (uso de ultrassom e ultra-agitação). A estabilidade da proteína foi avaliada pelas
técnicas de eletroforese capilar e gel poliacrilamida. Os resultados obtidos por esses
autores mostraram que a integridade estrutural da BSA não foi comprometida pelas
variáveis do processo, obtendo-se partículas esféricas de superfície lisa com tamanho
médio da ordem de 1 µm, que apresentaram uma característica de perfil de liberação
trifásica, iniciado pela fase burst da liberação da proteína (≅ 15%) adsorvida na superfície
das micropartículas, seguida da liberação sustentada da proteína pela difusão da matriz e
finalizada pela bioerosão do polímero, com uma liberação total de 60% da BSA em cerca
de 30 dias.
Ainda na mesma linha, Yang et al. (2000) encapsularam a BSA em microesferas de
PLGA pela técnica de emulsão múltipla com PVA na fase aquosa externa, estudando a
influência do efeito da temperatura (5ºC a 42ºC ) na formação das micropartículas e através
das características e liberação da proteína a partir destas microesferas. Todas as
microesferas apresentaram poros tanto na superfície quanto na estrutura interna, bem
como, uma eficiência de encapsulação em torno de 60%. Os perfis de liberação da BSA a
partir das partículas produzidas nos dois extremos de temperatura estudados, 5ºC e 42ºC,
apresentaram menor burst de liberação da proteína (18%) no período de 24 horas; uma
liberação lenta e sustentada de 43% e 22% foi obtida no período subseqüente de 16 dias,
para as temperaturas de 5ºC e 42ºC, respectivamente. A eficiência de encapsulação para a
BSA pode ser encontrada na literatura em diferentes ordens de grandeza, devido às
condições de processo, características finais das microesferas e técnicas de caracterização.
Yang e outros colaboradores (2001) desenvolveram um dispositivo de liberação
controlada onde foram avaliados dois poliésteres o policaprolactona (PCL) e o PLGA
(65:35) na encapsulação da BSA. Eles observaram por técnica de microfotografia confocal
que a presença de PVA na fase aquosa externa influenciou na distribuição da proteína
Roseane Maria Ribeiro Costa
31
dentro da matriz polimérica. Já a presença desse emulsificante na fase aquosa interna
proporcionou maior estabilidade das gotas contra a coalescência, resultando em uma
distribuição mais uniforme da BSA na matriz do polímero e uma liberação lenta. As
partículas obtidas com o PLGA apresentaram uma eficiência que variou entre 55 e 79% de
acordo com a quantidade teórica da BSA encapsulada, sendo que a formulação de maior
quantidade de BSA o maior efeito burst (≅ 40%) durante as primeiras 36 horas de ensaio, e
uma liberação superior a 80% por um período de 15 dias.
Albumina de soro bovina também foi encapsulada em diferentes tipos de PLGA,
caracterizado por diferentes razões monoméricas de ácido láctico e glicólico, 50:50, 75:25
e 85:15, pela técnica de emulsão múltipla (Wei et al., 2004). Partículas foram preparadas
com os 3 diferentes tipos de PLGA utilizando diclorometano como solvente, solução
aquosa contendo 1% (m/v) de PVA como emulsificante e velocidade de rotação do
impelidor mantida no processo em 700 rpm. Estas apresentaram um tamanho médio de 20
a 50 µm, com uma eficiência de encapsulação de BSA na faixa de 74 a 82%.
Micropartículas de PLGA 50:50 também foram preparadas com solução de 5% (m/v)
PVA, apresentando um tamanho médio de 2 a 5 µm, com a eficiência de encapsulação de
BSA na mesma ordem de grandeza (86%) das demais. O perfil da cinética de liberação da
BSA foi semelhante para as formulações de PLGA 75:25 e 85:15 com uma liberação
inicial em torno de 10% e uma fase sustentada de 23%, por um período de 25 dias. Nas
mesmas condições, as microesferas de PLGA 50:50 apresentaram uma liberação inicial da
proteína de 20%, seguida de uma liberação sustentada de 32%, observada no mesmo
intervalo de tempo.
A estabilidade da BSA também já foi investigada no processo de encapsulação em
PLGA 50:50 com a adição de um novo excipiente, o copolímero de bloco de
polietilenoglicol (PEG) e poli L-histidina (PH) (PEG-PH), pelo método de emulsão
múltipla. A PH é um copolímero, de natureza base fraca, que pode neutralizar o micro-
ambiente ácido proporcionado pelos produtos de degradação das microseferas de PLGA,
os ácidos láctico e glicólico. O PEG, polímero hidrofílico, foi utilizado para prevenir as
interações inespecíficas entre a BSA e a matriz polimérica de PLGA. As moléculas do
PEG-PH e uma molécula da BSA coalescem para formar um complexo iônico na faixa de
pH 5 a 6. As microesferas de PLGA/BSA e PLGA/PEG-PH/BSA apresentaram um
tamanho de partícula de 27 a 35 µm e uma eficiência de encapsulação superior a 80% para
todas as formulações. Os perfis de liberação da BSA a partir das diferentes formulações
foram significativamente diferentes, com uma liberação controlada de 70% para as
Roseane Maria Ribeiro Costa
32
partículas de PLGA/BSA e, em torno de 90% para as formulações PLGA/PEG-PH/BSA
preparadas com diferentes proporções de PEG-PH, estas últimas, tendo apresentado uma
redução no burst de liberação inicial da proteína (Kim et al., 2005).
Feczko et al. (2007) prepararam nano e micropartículas de PLGA (50:50) contendo
albumina de soro bovina, também como proteína modelo, pela técnica de emulsão
múltipla, investigando o uso de três diferentes tipos de estabilizantes na fase aquosa -
álcool polivinílico (PVA), polaxamer, polivinil pirrolidina (PVP) – e o efeito no tamanho
das partículas, eficiência de encapsulação e cinética de liberação. Os resultados obtidos por
esses autores apontaram que o PVA mostrou-se ser o emulsificante mais eficiente, e que as
partículas assim preparadas apresentaram maior eficiência de encapsulação (> 90%) e
maior controle do tamanho de partícula, principalmente, para aquelas de escala
nanométrica. As micropartículas apresentaram, porém, um maior percentual de liberação
de BSA (65%) que as nanopartículas (40%), durante um período de 7 dias.
3.4.6. Inovação Tecnológica em Processos de Produção de Sistemas de Liberação
Controlada com a Introdução de Estruturas Microfluídicas
Como já discutido, os métodos mais utilizados para microencapsulação utilizando
polímeros envolvem geralmente extração, evaporação de solvente ou separação de fases,
com etapas de formação de emulsões simples ou múltiplas. A etapa crítica durante o
processo de formação das emulsões é a energia de dispersão bastante elevada fornecida
para a mistura de líquidos imiscíveis, normalmente obtida com ultra-agitação ou ultra-
homogeneizadores, que compromete a estabilidade de biomoléculas que podem degradar
ou ter a estrutura conformacional alterada, inativando o efeito terapêutico ou imunogênico.
Além de comprometer a estabilidade de biomoléculas, outro problema tecnológico
está no escalonamento do processo. Micropartículas poliméricas para uso em liberação
controlada são tipicamente produzidas em tanques agitados, com uma das fases
(geralmente oleosa ou uma emulsão água/óleo pré-formada) sendo dispersa na segunda
fase (geralmente aquosa, contendo emulsificantes) por variações de pressão ou forças de
cisalhamento para gerar pequenas gotas esféricas pela ação da tensão interfacial. Quando o
volume do tanque é aumentado para o aumento da produção, o controle da temperatura e
da geração das partículas sob dispersão mecânica, o ajuste da hidrodinâmica no reator
mediante variações de concentração de polímero, tipo de polímero ou solvente são
extremamente dificultados. Além disso, é um processo de difícil controle na dispersão
Roseane Maria Ribeiro Costa
33
granulométrica, que compromete a qualidade do produto, e difícil automação, requisito
requerido para uma produção asséptica em grande escala.
A produção de emulsões em micromisturadores representa hoje uma alternativa
tecnológica bastante interessante para superar limitações hoje encontradas em processos
convencionais de produção de sistemas de liberação controlada microparticulados, onde a
produção de emulsões é etapa crucial afetando características importantes do produto como
estabilidade, dispersão granulométrica e taxa de encapsulação (Freitas et al., 2003; Freitas
et al., 2005; Wischke et al., 2006). Para o entendimento desta nova abordagem de
processo, conceitos de microfluídica serão introduzidos no item 3.4.6.1.
3.4.6.1. Microfluídica Micromisturadores podem se tornar uma técnica simples e versátil para produção de
emulsões estáveis se estes forem devidamente projetados para explorar as vantagens da
hidrodinâmica. Para tanto é imprescindível entender o efeito de escala induzido pela
redução de tamanho: em microcavidades, as forças viscosas e a tensão interfacial se tornam
relativamente dominantes quando comparadas às forças inerciais. Particularmente, a razão
da tensão interfacial para a força inercial aumenta até 1018 quando o tamanho é reduzido
para a dimensão de um micrômetro (Mae et al., 2004). Isto sugere que operações
utilizando propriedades interfaciais tais como produção de emulsões pode ser
drasticamente melhorada utilizando-se microcavidades.
A microfluídica apresenta como principais vantagens técnico-econômicas:
eliminação de forças mecânicas para mistura de fluídos e formação de emulsões, baseando-
se em princípios de microfluídica; aumento da portabilidade e diminuição do volume do
equipamento de mistura e operação contínua em comparação a sistemas mecânicos
convencionais (tanques agitados); diminuição de custos de materiais (insumos de
fabricação) e fácil manutenção do equipamento; processo contínuo; facilidade de
escalonamento da bancada para a produção industrial devido à possibilidade de integração
em paralelo de um número suficiente de micromisturadores para um dado volume de
produção; facilidade de produção asséptica de sistemas micro- e nanoencapsulados (Freitas
et al., 2003).
Os dispositivos microfluídicos apresentam dimensões entre alguns milímetros e
dezenas de micrômetros, onde o número de Reynolds geralmente é menor que 2000. O
escoamento de fluidos está em regime laminar e a mistura de fluidos num microcanal reto
se realiza basicamente por difusão, que se revela um processo lento e ineficiente (Beebe,
Roseane Maria Ribeiro Costa
34
2000; Liu et al., 2000a). No entanto, é possível gerar distúrbios locais para induzir a
mistura de fluidos usando diversos mecanismos passivos ou ativos (Nguyen and Wu,
2005). Adicionando cotovelos ou ressaltos aos micro-canais ou projetando geometrias que
geram fluxos rotacionais é possível realizar mistura de fluidos de forma rápida e eficiente.
A Figura 4 ilustra o misturador passivo conhecido como Serpentina 3D (Liu et al., 2000a),
fabricado em LTCC (Low Temperature Co-Fired Ceramics) – tecnologia especializada na
produção de módulos eletrônicos miniaturizados, testado neste trabalho.
Figura 4. Desenho esquemático de micromisturadores passivos fabricados com a
tecnologia de LTCC (Cunha, 2006).
Em microcanais e microcavidades os números de Reynolds são baixos devido às
pequenas dimensões; assim os líquidos estão em regime laminar e a mistura se realiza
basicamente por difusão. É possível gerar turbulência local para induzir a mistura dos
fluidos usando diversos mecanismos passivos ou ativos.
Os micromisturadores passivos apresentam as seguintes características:
Tempos de mistura rápidos.
Processo de mistura definido pela geometria do dispositivo.
Possibilidade de integração com um microssistema fluídico.
Geração de dispersões com tamanhos de partícula pequenos e com distribuições
de partícula com desvio padrão baixo.
Roseane Maria Ribeiro Costa
35
Possibilita sínteses de partículas em forma de pó micro e nanoestruturadas.
Eles podem ser usados para realizar dispersões de fluídos imiscíveis como emulsões
em líquido-líquido, espumas em líquido-gás e suspensões de partículas em nano-escala.
Adicionando cotovelos, cantos e ressaltos em microcanais ou realizando geometrias
que geram fluxos rotacionais é possível realizar mistura de fluídos passivamente com
parâmetros de interesse como: custo de fabricação, complexidade da geometria, perda de
carga, volume de amostra e tempo de mistura com características favoráveis.
3.4.6.2. Micromisturadores em Processos de Emulsão e Preparação de
Micropartículas Poliméricas
Existem poucos relatos disponíveis na literatura com relação ao uso de
micromisturadores passivos como ferramenta para obtenção de emulsão, dentre estes:
Schiewe et al. (2000) obtiveram uma emulsão do tipo óleo/água para fins
dermatológicos através do uso de micromisturadores passivos com princípio de mistura de
escoamento em multilaminação (geração de mistura por difusão, através de um conjunto de
lamelas). O dispositivo foi fabricado em titânio e silicone termicamente oxidado e
composto de microcanais de 25 e 40 µm de largura, 2 × 15 µm de comprimento. Os
resultados obtidos mostraram a dependência do diâmetro de gota com relação à vazão de
mistura total. Além disso, não foi observada nenhuma alteração no diâmetro médio das
gotas com relação à largura do canal de mistura. Por fim, foi feito um estudo comparativo
do micromisturador com um misturador convencional de laboratório e, assim, algumas
vantagens foram apontadas, tais como: formação da emulsão em processo contínuo; menor
distribuição de tamanho de gotas e dispersão; alta qualidade do produto formado; e maior
estabilidade da emulsão (creme), com menor uso de agente emulsificante, consideração
importante para formulações dermatológicas devido à possibilidade de redução de irritação
na pele.
A dispersão de sistemas compostos por líquidos imiscíveis, silicone/água e n-
heptano/água, foi analisada por Löb et al. (2006). Para realização desses experimentos os
autores utilizaram dois tipos de micromisturadores interdigitais (dimensões do dispositivo:
2 x 15 canais de alimentação com 60 µm de largura e 150 µm de altura), os quais se
diferenciavam pela direção dos fluxos de mistura, um co-corrente e outro contra-corrente.
O primeiro, fabricado em vidro, permitiu a visualização da formação de emulsão. O
diâmetro médio das gotas foi investigado quanto ao efeito de vazão total de mistura,
proporção volumétrica entre as fases e a correspondente perda de carga para uma dada
Roseane Maria Ribeiro Costa
36
geometria de micromisturador. A avaliação desse estudo referiu-se, principalmente, aos
efeitos das características geométricas da câmara de mistura e do sistema de alimentação
na distribuição do tamanho de gotas. Os resultados indicaram que, o diâmetro médio das
partículas diminuiu significativamente, com a diminuição da altura e números de canais de
alimentação. Foi observada também a redução de diâmetro de gotas com o aumento da
vazão total de mistura, cujo resultado foi discutido em termos do aumento da energia gasta
no processo.
Kobayashi et al. (2007) prepararam emulsões de óleo de soja em água utilizando
microdispositivos fabricados em silicone (diâmetros entre 0,57 – 1,6 µm). As emulsões
geradas foram caracterizadas como monodispersas com diâmetros médios de gotas entre
1,4 – 3,5 µm.
No tocante à produção de micropartículas poliméricas:
O desempenho de micromisturadores (dimensões: 25 ou 40 µm de largura x 300 µm
de profundidade) foi investigado para a produção de micropartículas poliméricas de PLGA
contendo albumina de soro bovina, como proteína modelo, pelo método modificado de
emulsificação e extração de solvente (Feitas et al., 2003). A influência de alguns
parâmetros de processo e formulação nas características das microesferas foi estudada.
Foram obtidas microesferas com distribuição de tamanho na faixa entre 5-30 µm, com
reprodutibilidade. Os autores observaram que o tamanho das microgotas geradas pelo
micromisturador dependeu de parâmetros como geometria do canal, parâmetros de
processo como vazão total de mistura e proporção volumétrica entre os dois líquidos
imiscíveis e de formulação como tipo de solvente orgânico utilizado (diclorometano e
acetato de etila). Já parâmetros como a concentração da solução orgânica, o tipo de
polímero e a quantidade de proteína praticamente não afetaram a distribuição de tamanho
de partícula.
Na continuidade de suas pesquisas, o mesmo grupo (Freitas et al. 2005) produziu
microesferas de PLGA encapsulando a BSA, proteína modelo, através de uma combinação
entre uma célula ultra-sônica para obtenção da emulsão simples e, um micromisturador
para produção da emulsão múltipla. A combinação (ultra-sônica e micromisturador)
possibilitou a produção asséptica de microesferas com diâmetros entre 15 a 40 µm,
eficiência de encapsulação de 70% e boa reprodutibilidade.
Wischke et al. (2005) também encapsularam a BSA com um marcador isotiocianato
de fluoresceína (BSA-FITC) em microesferas de PLGA através do processo modificado de
emulsificação e evaporação do solvente, utilizando um micromisturador (25 µm de
Roseane Maria Ribeiro Costa
37
diâmetro hidráulico, baseado em laminação e fabricado em aço inoxidável). As
micropartículas produzidas apresentaram diâmetros entre 2 a 3 µm, a uma vazão total de
mistura de 25 mL/min, com boa reprodutibilidade.
3.4.6.3. Métodos para Caracterização da Eficiência de Mistura em
Micromisturadores
A agitação geralmente é o modo de iniciar, acelerar ou melhorar fenômenos físicos
de mistura ou fenômenos físico-químicos resultantes da mistura. A mistura é um processo
físico que tende a uma distribuição uniforme da concentração em um volume finito,
geralmente, desejada no menor tempo possível.
A qualidade da mistura obtida com um micromisturador é muito importante para
avaliação do seu desempenho, bem como, para otimização do seu potencial de uso.
Diferentes métodos têm sido usados para caracterização da eficiência de mistura em
micromisturadores, baseados em diferentes princípios: uso de traçadores (corantes) e
medição de produtos de reação resultantes da mistura (reações simples, paralelas ou
competitivas).
1. Variação de cor ou intensidade de cor na corrente líquida saindo do
micromisturador, por exemplo, em função de uma variação do pH, resultante da mistura de
duas correntes líquidas.
Corantes como azul de bromofenol, fluoresceína, permanganato de potássio,
rodamina e fenolftaleína têm sido citados na literatura. Dentre estes, pode-se citar o
trabalho de Liu et al. (2000a) que investigaram o grau de mistura de micromisturadores
passivos, do tipo serpentina 3D e de canal reto. Nos experimentos foram utilizadas
soluções de fenolftaleína e hidróxido de sódio para avaliar a capacidade de mistura desses
dispositivos (soluções variam de incolor para cor vermelha para valores pH > 8). Os
autores verificaram que micromisturadores tipo serpentina 3D foram mais eficientes para a
mistura que um micromisturador do tipo canal reto.
2. Quantificação de produtos de reações, simples, consecutivas ou competitivas.
Para determinar e caracterizar a eficácia de mistura de micromisturadores, tem-se
utilizado, com maior freqüência, as propriedades cinéticas de reações simples,
consecutivas ou competitivas. Reações químicas diferentes ocorrendo em um mesmo
Roseane Maria Ribeiro Costa
38
sistema produzem diferentes espécies químicas, as quais se formam em velocidades
diferentes. Conhecendo-se a cinética das reações em competição, pode-se calcular o tempo
de mistura quantificando-se a concentração das diferentes espécies formadas durante um
experimento de mistura de duas correntes líquidas em um elemento de mistura, por
exemplo, um dispositivo microfluídico.
Um dos métodos mais conhecidos é baseado na competição de duas reações
paralelas quando da mistura de duas correntes líquidas, miscíveis (sistema homogêneo), o
Método de Villermaux, adaptado para micromisturadores e então chamado de Método de
Villermaux/Dushman (Villermaux et al., 1992; Villermaux, et al., 1994).
Uma corrente líquida constitui-se de uma solução de ácido forte diluído (HCl ou
H2SO4), a outra, constitui-se de uma solução tampão de um ácido fraco (H3BO3,
CH3COOH) e uma base forte (NaOH) contendo KI e KIO3. Quando ácido bórico é usado
como ácido fraco para a solução tampão, as reações são as seguintes (Equação 1):
Equação 1. Reações do Método Villermaux/Dushman.
Nos experimentos, a solução tampão de KI/KIO3 é misturada com o ácido forte
diluído, geralmente ácido sulfúrico ou clorídrico, como ilustrado na Figura 5. No caso de
uma mistura ideal dos líquidos, o ácido é consumido pela reação rápida de neutralização
(R1). No entanto, se a mistura for ineficaz, a reação R2 passa a competir com a reação R1
pelo consumo de ácido, gerando o produto que é detectado por espectrofotometria de UV-
visível, como um complexo de iodo, cuja banda característica de absorção está entre 286 e
353 nm. A absorbância no comprimento de onda de 352 nm tem sido adotada como uma
medida da eficácia de mistura (medida na corrente de saída do elemento de mistura),
quantificando-se o produto da reação mais lenta que compete pelo consumo do ácido com
a reação mais rápida.
H2BO3- + H+ ⇔ H3BO3 (R1 – etapa extremamente rápida)
5 I- + IO3- + 6 H+ ⇔ 3I2 + 3 H2O (R2- etapa rápida)
I2 + I- ⇔ I3- (detecção UV/VIS)
Roseane Maria Ribeiro Costa
39
Figura 5. Esquema experimental do Método Villermaux/Dushman (adaptado de Pànic et
al., 2004).
3. Método de transferência de massa de um pigmento solvatocromático entre duas
fases líquidas imiscíveis.
O método de Villermaux/Dushman descreve um processo de mistura ocorrendo em
sistemas homogêneos, mistura de dois líquidos miscíveis. Mais recentemente,
pesquisadores alemães (Pànic et al., 2004) desenvolveram um método para avaliar a
extensão da mistura de duas correntes de líquidos imiscíveis (emulsões). O método é
baseado na transferência de massa de um pigmento solvatocromático (Nile Red) entre dois
líquidos imiscíveis: 1) uma mistura água e metanol (50:50); 2) heptano, como ilustrado na
Figura 6.
Roseane Maria Ribeiro Costa
40
Figura 6. Transferência de massa entre solução água:metanol (50:50) e heptano: a
absorbância do Nile Red no espectro do UV-visível ocorre em diferentes comprimentos de
onda nestes diferentes meios: 489 nm em heptano e 581 nm para a mistura água: metanol
(50:50). Adaptado de Pànic et al (2004).
3.5. TUMORES EXPERIMENTAIS
A qualidade dos estudos na fase pré-clínica depende muito da adequação dos
modelos de tumores experimentais (Saad-Hossne, 2002; Saad-Hossne et al., 2004). Um
grande avanço na área de oncologia experimental foi a introdução de tumores
transplantáveis ou transmissíveis. Estes tumores provenientes de animais são mantidos em
laboratório pelo transplante das células tumorais para hospedeiros susceptíveis (Sakai,
2004). Os tumores transplantáveis são utilizados como ferramentas úteis em cancerologia
para estudar a biologia tumoral básica, o desenvolvimento de novas formas farmacêuticas
e, ainda assim, a investigação potencial de novas estratégias terapêuticas. Diversos
modelos experimentais têm sido propostos no intuito de atender esse objetivo. Entre os
mais utilizados tem-se: tumor de Ehrlich, tumor de Walker e melanoma B16F10. Esses
estudos são considerados essenciais para uma correta aplicação dos ensaios clínicos em
seres humanos (Sava, 1987; Saad-Hossne et al., 2004).
Roseane Maria Ribeiro Costa
41
3.5.1. Melanoma B16F10
A classificação primária do câncer é feita de acordo com o tipo de célula normal que
o originou, sendo assim, o melanoma é originado das células da pele que produzem
pigmento, os melanócitos (Almeida et al., 2005). O melanoma foi descrito pela primeira
vez por Hipócrates no século V sendo o termo melanoma surgerido por Caswell em 1938,
que relatou as características malignas do tumor. O termo melanoma é sinônimo de um
processo maligno. O modelo B16 é um bom modelo para estudos de tumores metastáticos
(Hosaka et al., 2000; Saad-Hossne, 2002). O tumor pode ser mantido na forma de cultura
de células, sendo implantada uma suspensão de células no tecido subcutâneo dos ratos.
A linhagem murina B16F10 é bastante agressiva in vivo e apresenta baixa
imunogenicidade. Estas características são compartilhadas pela maioria dos melanomas
humanos, o que explica que, na maioria das vezes, a eliminação das células tumorais
através da resposta imune seja extremamente difícil. A imunidade inata (macrófagos, NK e
as LAK) é, contudo estimulada, assim como a imunidade adaptativa (anticorpos e
linfócitos T CD4+ e CD8+) para desenvolver uma resposta humoral e celular específica
para tumor em pacientes humanos, fatores que abrem maior possibilidade de estímulo para
as respostas do tratamento imunoterápico. Vários grupos de pesquisa têm demonstrado,
porém, que pela ativação da resposta imune inata pode-se eliminar as células tumorais e
melhorar a resposta imune adaptativa (Lavi et al., 2007; Li et al., 2007).
As citocinas têm um importante papel na evolução/ rejeição das células tumorais in
vivo, e principalmente, as interleucinas pro-inflamatórias que apresentam atividade
protetora contra melanoma murino (Colombo and Trinchieri, 2002). Smyth et al. (2000)
sugerem que a quantidade de IL-12 liberada via sistêmica ou de produção local da citocina
influencia o tipo de célula que vai mediar a resposta imune anti-tumoral: seus resultados
experimentais mostraram desde nenhuma atividade anti-tumoral nas células NK (baixas
doses) até indução da imunidade tumoral mediada por células NK na presença da proteína
citolítica, perforina (em maiores doses de IL-2). Autores como Colombo and Trinchieri
(2002) sugerem que, após a primeira resposta, as células efetoras entram em defesa e uma
cascata de citocinas amplifica a reação inflamatória responsável pelo resultado final.
Roseane Maria Ribeiro Costa
42
3.5.2. Carcinoma de Ehrlich
Carcinoma é o tipo mais comum de câncer, originando-se de células que revestem o
corpo, incluindo a pele e uma série de revestimentos internos como os da boca, garganta,
brônquios, esôfago, estômago, intestino, bexiga, útero e ovários, e os revestimentos dos
dutos mamários, próstata e pâncreas (Almeida et al.,2005).
Em 1896, Paul Ehrlich introduziu na pesquisa científica um tumor experimental,
descrevendo-o como uma neoplasia mal diferenciada, transplantável, originária de
adenocarcinoma mamário espontâneo de camundongas, transplantada entre animais desta
espécie em sua forma sólida. Dos inúmeros tumores experimentais utilizados para estudos
in vivo em diversos animais, o uso do tumor de Erlich, tem sido uma ferramenta muito útil,
pelas seguintes razões: facilidade na padronização do número de células a serem
inoculadas, facilidade de quantificação do crescimento ou da regressão da massa tumoral e,
também, por tornar possível – quando do estudo das células tumorais – os mesmos
métodos desenvolvidos para a pesquisa de células da corrente sanguínea e demais fluídos
orgânicos (Sava, 2004).
O tumor de Ehrlich é considerado um tumor bastante agressivo, composto por
células bastante indiferenciadas e pleomórficas, com intensa atividade proliferativa, além
de possuir capacidade de crescimento em qualquer linhagem de camundongos; provoca
uma reação inflamatória no local de sua inoculação alterando padrões de migração celular
e de exsudação, além de estimular/ ativar macrófagos inflamatórios (Sava, 2004).
Roseane Maria Ribeiro Costa
43
CAPITULO II
DESENVOLVIMENTO FARMACOTÉCNICO
Roseane Maria Ribeiro Costa
44
4. DESENVOLVIMENTO FARMACOTÉCNICO
Este capítulo apresenta os resultados obtidos em estudo de pré-formulação, de
microesferas de PLGA envolvendo produção e caracterização, com e sem ativo e presença
de agentes estabilizantes, com a finalidade de desenvolver condições de processo e de
formulação para encapsulação da proteína de nosso interesse, recombinante humana de
interleucina-2 (rhIL-2), para posterior estudo pré-clínico.
4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Produzir e caracterizar micropartículas de PLGA sem ativo (Micro PLGA),
investigando o uso de variáveis de processo (tipo de solvente, agente estabilizante) em
suas características como tamanho médio e distribuição de tamanho;
Produzir e caracterizar micropartículas biodegradáveis contendo albumina de soro
bovina (Micro BSA), como proteína modelo, avaliando o perfil da cinética de liberação
in vitro da albumina por diferentes períodos de tempo;
Obter e caracterizar micropartículas contendo recombinante humana de Interleucina-2
(MrhIL-2), avaliando o perfil da cinética de liberação in vitro da IL-2.
Associar polietilenoglicol e albumina de soro bovina, como agentes estabilizantes, ao
recombinante humana de Interleucina-2, gerando novas micropartículas (MPEG-IL2 e
MBSA-IL2), visando maior estabilidade da IL-2 e avaliar o perfil cinético de liberação
da IL-2 destas formulações.
4.2. METODOLOGIA
4.2.1. Análise Preliminar da Solubilidade do PLGA 50:50 em Diferentes Solventes
A solubilidade do polímero PLGA 50:50 foi avaliada em diferentes solventes,
diclorometano (DCM) e acetato de etila (ACT), através da adição de uma quantidade em
excesso do polímero, em cada solvente, a temperatura de 25°C e 35°C para o ACT e de
apenas 25°C para DCM, devido a alta solubilidade do PLGA neste último solvente, nestas
condições, cada sistema foi mantido sob agitação magnética por um período de 40 horas. A
solubilidade do polímero em cada um dos solventes foi avaliada após remoção do
sobrenadante, evaporação em estufa com circulação de ar a 70°C durante 12 horas, e
quantificação da massa seca de PLGA dissolvida no solvente, metodologia adaptada de
Roseane Maria Ribeiro Costa
45
Lambert and Peck. (1995). O ensaio de solubilidade foi realizado em triplicata para cada
temperatura.
4.2.2. Preparação das Micropartículas de PLGA
4.2.2.1. Micropartículas de PLGA sem Ativo (fase interna aquosa)
As micropartículas de PLGA (micro PLGA) foram obtidas através do método de
emulsão múltipla (A1/O/A2), seguida pelo método de evaporação de solvente (Crotts et al.,
1997; Jain, 2000; Youan et al., 2001; Rosca et al., 2004). Inicialmente, o PLGA foi
dissolvido em diclorometano ou acetato de etila (fase orgânica). A esta fase orgânica, foi
adicionado 1 mL de solução tampão pH 7,4 e a mistura das fases foi promovida sob ultra-
agitação de 7000 rpm durante 30 segundos, para formação da emulsão simples (O/A1). A
emulsão simples foi dispersa na fase contínua (A2) sob ultra homogeneização (7000 rpm)
por 1 minuto, sendo a fase (A2) constituída de uma solução aquosa de PVA 0,5% ou 3%
(m/v), obtendo-se assim, uma emulsão múltipla (A1/O/A2). A seguir, a emulsão múltipla
formada era mantida sob agitação de 800 rpm durante 4 horas, para evaporação do solvente
e conseqüentemente, solidificação das partículas. Na etapa final, a suspensão de
micropartículas era centrifugada e lavada com água, a 4000 rpm durante 5 minutos (3
vezes), e congelada em freezer -20ºC para posterior liofilização por 16 horas.
A escolha do tensoativo é muito importante para estabilizar a emulsão durante a
formação de partículas (Vandervoort and Ludwing, 2002). Assim, na tentativa de formar
microesferas com outros tensoativos Pluronic® F68 (PF68) e Àlcool Polivinílico (PVA),
ambos aprovados pelo FDA para o desenvolvimento dessas formulações, foram preparadas
micropartículas utilizando-se PF68 (300 ppm a 0,5% m/v) e PVA (0,1% a 3% m/v) como
agentes estabilizantes das emulsões.
4.2.2.2. Micropartículas de PLGA contendo Albumina de Soro Bovino
As micropartículas de PLGA contendo albumina de soro bovino (Micro-BSA), como
proteína modelo, foram obtidas pelo método de emulsão múltipla (A1/O/A2). Adicionou-se
à fase orgânica, 1 mL da solução aquosa de BSA (razão mássica 1:10, fármaco/ polímero),
sob ultra-agitação (7000 rpm), para formação da emulsão simples (O/A1). Seguiu-se o
mesmo processo da preparação das micropartículas de PLGA sem ativo (item 4.2.2.1).
Roseane Maria Ribeiro Costa
46
4.2.2.3. Micropartículas de PLGA contendo Recombinante Humana IL-2
As micropartículas de PLGA contendo recombinante humana de interleucina-2 (Mrh-
IL2) também foram obtidas pelo método de emulsão múltipla, através do mesmo processo
das Micro-BSA (Hora et al., 1990; Rosca et al., 2004). O PLGA foi solubilizado em
diclorometano, formando a emulsão simples (O/A1) com uma suspensão aquosa da rh-IL2
(razão 1:1000, fármaco/ polímero). As etapas posteriores foram executadas de acordo com
o item 4.2.2.1.
Também foram produzidas microesferas de PLGA e polietilenoglicol (PEG 4000)
encapsulando rhIL2 (MPEG-IL2) e microesferas de PLGA contendo a albumina de soro
bovina (BSA) como agente co-encapsulante da interleucina-2 (MBSA-IL2). Nestas
partículas, a recombinante humana IL2 foi adicionada em solução aquosa contendo PEG
ou BSA, resultando na fase aquosa interna (A1), seguindo assim, as etapas posteriores de
processo já descritas no item 4.2.2.1.
4.2.3. Caracterização Físico-química das Micropartículas
A caracterização físico-química foi realizada para todas as partículas obtidas neste
trabalho.
4.2.3.1. Análise Morfológica
As micropartículas de PLGA foram observadas em microscópio eletrônico de
varredura (JEOL JSM5200). As micropartículas foram inicialmente metalizadas, ou seja,
depositadas em fitas de cobre dupla face e recobertas por uma fina película de ouro e
analisados a 10 kV, em diferentes magnitudes.
4.2.3.2. Determinação do Tamanho de Partícula
A distribuição e o diâmetro médio das micropartículas de PLGA foram determinados
utilizando-se um analisador de tamanho de partículas Coulter (LS 230), que opera pelo
princípio de difração de raios laser. As micropartículas foram dispersas em solução de
Tween 80 a 0,01% (v/v) e sonicadas em banho ultra-som durante 20 minutos (Murakami et
al., 1999; Siepmann et al., 2004).
4.2.3.3. Determinação Residual do Álcool Polivínilico (PVA)
O teor residual de PVA associado às micropartículas foi analisado por
espectrofotometria UV-Visível (GBC - Cintra 10), através do método colorimétrico direto,
Roseane Maria Ribeiro Costa
47
baseado na formação do complexo colorido entre os dois grupos vizinhos de hidroxilas do
PVA e a molécula de Iodo (Murakami et al., 1999; Sahoo et al., 2002; Konan et al., 2002).
4.2.3.4. Medida do Potencial Zeta (Análise Eletroforética)
A técnica convencional de espalhamento de luz que mede a variação da freqüência de
um feixe laser (efeito Doppler) foi empregada para determinação experimental dos valores
de mobilidade eletroforética (μD), definida como sendo a razão entre a velocidade (v)
resultante e a magnitude do campo elétrico (E) aplicado. O equipamento utilizado foi um
analisador eletroforético modelo Malvern ZetaMaster S. A relação proposta por
Smoluchowsky foi aplicada para conversão dos valores de mobilidade eletroforética em
potencial zeta (ζ).
A medida do potencial zeta das micropartículas de PLGA foi realizada em função de
soluções aquosas com pH ajustado para 3, 5; 7, 8 e 10, utilizando ácido clorídrico (HCl)
0,1M ou hidróxido de sódio (NaOH) 0,1M. Em seguida, a suspensão resultante era
sonicada por 10 segundos e a carga superficial das partículas era determinada através do
ZetaMaster.
4.2.3.5. Eficiência de Encapsulação da BSA
Os métodos utilizados para determinação da eficiência de encapsulação da BSA, a
partir das micropartículas de PLGA, foram de Lowry e do Coomassie brilliant blue BG-
250 ou reagente de Bradford. As determinações baseiam-se em metodologias
espectrofotométricas (Peterson, 1977; Zaia et al., 1998). Os resultados apresentaram o
valor da eficiência da proteína encapsulada nas microesferas, em relação à quantidade total
de proteína utilizada no processo de obtenção das partículas.
4.2.3.6. Eficiência de Encapsulação da IL-2
As micropartículas Mrh-IL2 foram solubilizadas em acetonitrila e centrifugadas. O
sobrenadante foi descartado e o resíduo sólido foi tratado com tampão fosfato pH 7,4 e
solução de NaOH 0,1N, para extração da interleucina (Chen et al., 1997; Diwan and Park,
2001; Diwan and Park, 2003). Após esse processo de extração, a quantidade de IL2
encapsulada foi determinada através do Kit Elisa específico para IL-2 (R&D Systems) (Liu
et al., 1997).
Roseane Maria Ribeiro Costa
48
4.2.3.7. Cinética de Liberação In Vitro
Pesou-se 10 mg de micropartículas contendo BSA ou rhIL-2 em tubos de eppendorf e
adicionou-se 1 mL de tampão fosfato PBS pH 7,4. Em seguida, os eppendorfs foram
incubados em Shaker sob agitação de 110 rpm/min a 37°C, mantendo as condições “sink”.
A cada intervalo de coleta os eppendorfs foram submetidos à centrifugação de 10.000 rpm
por 5 min., o precipitado foi re-suspendido com tampão PBS pH 7,4 e o sobrenadante foi
congelado para posterior análise das proteínas (Rafati et al., 1997: Yang et al., 2001;
Youan et al., 2001; Ruan et al., 2002; Zheng et al., 2004).
4.2.3.8. Degradação In Vitro das Micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2
O ensaio de degradação in vitro das micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2 foi
realizado em tampão fosfato pH 7,4 contendo azida sódica 0,01% à 37°C, durante 11
semanas (Hausberg and DeLuca, 1995; Crotts et al., 1997). Pesou-se 10 mg das
micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2 em tubos tipo eppendorf. A cada tubo foi
adicionado 1 mL de PBS pH 7,4 e mantido em incubadora (Incubadora Selecta) à 37°C
com velocidade de 80 rpm. A cada semana, as amostras foram coletadas e centrifugadas a
10.000 rpm durante 5 min. Em seguida, o meio aquoso foi removido com a micropipeta e o
mesmo volume de água Milli-Q (1 mL) foi adicionado para lavagem das microesferas.
Após centrifugação, uma quantidade suficiente de partículas foi armazenada em
dessecador em temperatura ambiente, para posterior observação morfológica da superfície
das microesferas por microscopia eletrônica de varredura.
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3.1. Análise Preliminar da Solubilidade do PLGA 50:50 em diferentes Solventes
O diclorometano apresenta uma boa solubilidade para uma série de polímeros
encapsulantes (Jain, 2000). A quantidade total do PLGA utilizado no teste de solubilidade
frente ao DCM foi 7 vezes superior à concentração de PLGA utilizada para preparar
micropartículas (45 mg PLGA/ 1 mL DCM). A partir da quinta parte do polímero
adicionada (225 mg), a solução tornou-se visualmente muito viscosa. Portanto, a
concentração para melhor utilizar o PLGA em DCM foi menor que 315 mg do polímero/
mL do solvente. O interesse neste solvente para a preparação de microesferas pelo método
de emulsão múltipla é devido à sua volatilidade, que facilita a remoção por evaporação,
Roseane Maria Ribeiro Costa
49
minimizando assim, os problemas associados com o solvente residual (Singh and
O’Hagan, 1998).
Para o acetato de etila os parâmetros encontrados nas temperaturas de 25°C e 35°C
foram de 26,7 mg/mL e 30,6 mg/mL respectivamente.
4.3.2. Preparação das Micropartículas de PLGA
4.3.2.1. Caracterização das Micropartículas de PLGA sem Ativo
Primeiramente, investigou-se o efeito de variáveis de processo como o efeito do
agente emulsificante, o tipo de solvente e a velocidade de agitação, com a finalidade de
escolha do melhor sistema para o estudo posterior de preparação de micropartículas com os
princípios ativos (BSA e IL2).
Agente emulsificante. A Tabela 1 mostra o diâmetro médio e a distribuição de tamanho
das micropartículas de PLGA, sem ativo, obtidas com diferentes concentrações de PVA,
utilizando o DCM como solvente orgânico. Nota-se uma redução no tamanho médio das
micropartículas, de 31 a 5 μm, em função do aumento da concentração de PVA na fase
contínua. O PVA na fase externa do sistema (A2) aumenta a estabilidade da emulsão
formada, estabelecendo um melhor controle do diâmetro médio da emulsão, e
conseqüentemente, do tamanho das micropartículas, corroborando com resultados
anteriores encontrados na literatura para sistemas similares (Blanco-Pietro et al., 1998;
Murakami et al., 1999; Yang et al., 2001; Siepmann et al., 2004).
Não se evidenciou a formação de micropartículas de PLGA utilizando Pluronic®
F68 como agente emulsificante, pois o PF68 não estabilizou a emulsão simples quando
diclorometano foi utilizado como solvente. Entretanto, com o solvente acetato de etila foi
observada a formação da emulsão simples na escala nanométrica, através da miscroscopia
óptica. Neste processo, a recuperação das partículas foi difícil, devido ao tamanho
nanométrico das mesmas, que ficaram dispersas na água de lavagem. Pluronic® F68 deixou
de ser utilizado neste estudo, pelo interesse em partículas de tamanho micrométrico para
uso intra-tumoral.
Velocidade de rotação do impelidor. Avaliou-se também o efeito da velocidade de rotação
do impelidor nas formulações obtidas no processo utilizando DCM como solvente
orgânico e PVA 0,5% (m/v) como emulsificante na fase externa. A Tabela 1 mostra uma
Roseane Maria Ribeiro Costa
50
redução do tamanho médio das partículas de PLGA de 12,18 μm, 6,79 μm e 4,59 μm com
o aumento da velocidade de rotação do impelidor respectivamente para 7000 rpm, 11000
rpm e 15000 rpm. Contudo, como também mostra a Tabela 1 (span), a dispersão
granulométrica entre estas micropartículas também aumentou com o aumento da ordem de
grandeza desse parâmetro.
Tabela 1. Distribuição granulométrica das micropartículas de PLGA preparadas com
diclorometano.
Microesferas
PLGA
d(4,3)
(μm)
d(v, 0.1)
μm)
d(v, 0.5)
(μm)
d(v, 0.9)
(μm)
Span
(μm)
PVA 0,1% 31,05 13,05 37,66 76,67 1,69
PVA 0,3% 18,41 5,05 19,41 54,87 2,57
PVA 0,5%a 12,18 2,47 15,78 27,34 1,58
PVA 0,5%b 6,79 0,98 9,36 23,55 2,41
PVA 0,5%c 4,59 1,03 5,29 16,42 2,91
PVA 1% 7,06 1,16 10,34 18,71 1,70
PVA 3% 5,11 0,63 8,00 15,48 1,86 a Formulação obtida a 7000 rpm; b Formulação obtida a 11.001 rpm; c Formulação obtida a 15.330 rpm; d(4,3): Diâmetro médio em volume d(v, 0.1): Diâmetro da partícula correspondente a 10% da distribuição acumulada d(v, 0.5): Diâmetro da partícula correspondente a 50% da distribuição acumulada d(v, 0.9): Diâmetro da partícula correspondente a 90% da distribuição acumulada Span: Medida indireta da dispersão ou largura da distribuição granulométrica, igual a [d(v, 0.9) - d(v, 0.1)]/ d(v, 0.5)
Tipo de solvente. As micropartículas obtidas com ACT como solvente orgânico, PVA
0,5% (m/v) como emulsificante na fase externa e velocidade de rotação do impelidor de
7000 rpm apresentaram o diâmetro médio de 3 μm, ou seja, foi de aproximadamente 4
vezes menor que as micropartículas preparadas com DCM e PVA 0,5% na mesma
intensidade de agitação (12 μm). Isto se deve à diferença de solubilidade de DCM e ACT
em água (8,7% (v/v) para ACT contra 1,6% (v/v) para DCM), o que explica uma rápida
difusão do ACT na fase aquosa, reduzindo assim, o tamanho médio das micropartículas.
Roseane Maria Ribeiro Costa
51
Análise morfológica. Como evidenciado por microscopia eletrônica de varredura, as
microfotografias das micropartículas de PLGA apresentam formato predominantemente
esférico e superfície lisa para as partículas produzidas por ambos os solventes, acetato de
etila e diclorometano (Figura 7).
(a)
(b)
Figura 7. Microfotografias de micropartículas de PLGA obtidas sob agitação de 7000 rpm,
a) PVA 3% e DCM; e d) PVA 0,5% e ACT (magnitude 1000×).
Determinação residual do Álcool Polivinílico (PVA). O resíduo do PVA é um importante
parâmetro na formulação podendo ser utilizado para alterar ou modificar as diferentes
propriedades das micropartículas. A Figura 8 mostra o teor residual de PVA associado às
micropartículas, quando este foi introduzido no processo nas concentrações de 0,5%, 1% e
3% (m/v). O mecanismo da ligação de PVA tem sido proposto pela interpenetração das
moléculas de PVA e PLGA durante a formulação das partículas (Figura 9). As cadeias
hidrofóbicas do PVA penetram dentro da fase orgânica e permanecem presas na matriz
polimérica das partículas de PLGA, quando o solvente é removido (Boury et al., 1995;
Murakami et al., 1999). Os resultados encontrados aqui corroboram com os de Sahoo et al.
(2002). Contudo, os teores residuais de PVA observado nas micropartículas produzidas no
presente trabalho foram da ordem 0,1% a 0,4% (m/m) (Figura 8) menores que os obtidos
por estes autores (Sahoo et al., 2002), 2% a 4,8% (m/m).
Roseane Maria Ribeiro Costa
52
Figura 8. Efeito residual de diferentes concentrações do PVA associado à superfície das
micropartículas (média ± desvio padrão, n = 3).
Figura 9. Representação do mecanismo de ligação das moléculas de PVA e PLGA na
superfície das partículas (Murakami et al., 1999).
Potencial Zeta. As micropartículas obtidas foram caracterizadas quanto ao potencial zeta
em função do pH. Como mostra a Figura 10, o potencial zeta é negativo na faixa de pH 3 a
10, porém próximo do ponto isoelétrico em pH 3, com carga negativa que se acentua em
pH mais básico (-6 a -14 em pH 10), porém, sem tendência dependente da concentração de
PVA utilizada na fase externa (A2) no processo de produção das partículas. Fazendo apelo
à literatura, têm-se dados que reportam um potencial zeta das nanopartículas de PLGA,
sem nenhum resíduo de PVA em solução tampão neutro é aproximadamente –45 mV
(Stonilk et al., 1995; Sahoo et al., 2002). Esta alta carga negativa é atribuída à presença de
grupos carboxilícos de PLGA na superfície das partículas. No presente estudo, o potencial
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
PVA 0,5% PVA 1% PVA 3%
PVA (% m/v)
Teo
r re
sidu
al d
e PV
A
(% m
/m)
Roseane Maria Ribeiro Costa
53
zeta na faixa 0 a –14 mV, bem menos negativo pode ser devido ao PVA associado à
superfície das microesferas de PLGA.
-16,0
-12,0
-8,0
-4,0
0,00 3 6 9 12
pH
Pote
ncia
l Zet
a (m
V)
PVA 0,1% PVA 0,5% PVA 1% PVA 3%
Figura 10. Potencial zeta das micropartículas de PLGA obtidas com diferentes
concentrações de PVA na fase externa da emulsão (média ± desvio padrão, n =7), em
função do pH.
4.3.2.2. Caracterização das Micropartículas de PLGA contendo Albumina de Soro
Bovino
Albumina de soro bovino foi aqui utilizada como proteína modelo, numa pré-
avaliação do comportamento da proteína de nosso interesse, IL-2, em razão de seu baixo
custo. Estudou-se então a formulação e a obtenção das micropartículas poliméricas Micro-
BSA, mantendo-se as seguintes condições de processo:
Sistema acetato de etila como solvente/ PVA 0,5% (m/v) como agente emulsificante
na fase externa da emulsão múltipla (denominado Sistema ACT);
Sistema diclorometano como solvente/ PVA 3% (m/v) como agente emulsificante na
fase externa da emulsão múltipla (denominado Sistema DCM).
Determinação do tamanho de partícula. A Tabela 2 apresenta o tamanho das
micropartículas Micro-BSA preparadas pelos sistemas ACT e DCM. Nota-se que essas
micropartículas são caracterizadas por um tamanho médio de cerca de 20 μm, não afetado
pelo tipo de sistema/solvente utilizado na preparação dessas micropartículas carregadas
Roseane Maria Ribeiro Costa
54
com a albumina de soro bovina, BSA, correspondendo na verdade a uma variação da
distribuição granulométrica de um sistema para o outro (DCM com maior fração de
partículas maiores e com maior dispersão, span).
Tabela 2. Tamanho médio das micropartículas PLGA contendo BSA.
d(4,3): Diâmetro médio em volume d(v, 0.1): Diâmetro da partícula correspondente a 10% da distribuição acumulada d(v, 0.5): Diâmetro da partícula correspondente a 50% da distribuição acumulada d(v, 0.9): Diâmetro da partícula correspondente a 90% da distribuição acumulada Span: Medida indireta da dispersão ou largura da distribuição granulométrica, igual a [d(v, 0.9) - d(v, 0.1)]/ d(v, 0.5)
Eficiência de encapsulação. A dosagem do teor de BSA nas micropartículas foi
determinada por dois diferentes métodos analíticos, Lowry e Bradford (Tabela 3). As
partículas preparadas com o sistema DCM apresentaram elevada taxa de encapsulação (>
94%). Em contrapartida, a taxa de encapsulação da BSA do Sistema ACT apresentou uma
eficiência de encapsulação muito baixa (Tabela 3), como determinado pelo Método de
Bradford. Este resultado pode ser explicado pela rápida difusão do acetato de etila na fase
contínua, que, diferentemente do Sistema DCM, resultou na rápida extração do solvente
sem tempo suficiente para encapsulação de todo o ativo nas partículas em formação, que é
perdido na etapa final de separação das mesmas durante os processos de centrifugação e
lavagem. Devido à pouca sensibilidade do método de Lowry não foi possível quantificar a
BSA nas micropartículas de PLGA obtidas por esse Sistema ACT.
Tabela 3. Eficiência de encapsulação da BSA.
Microesferas
PLGA/BSA
d(4,3)
(μm)
d(v, 0.1)
(μm)
d(v, 0.5)
(μm)
d(v, 0.9)
(μm)
Span
(μm)
Sistema ACT 19,39 6,47 24,56 44,32 1,54
Sistema DCM 20,4 4,05 31,01 65,92 1,99
Microesferas PLGA/BSA Eficiência de Encapsulação (%)
Método de Lowry/ DCM 94,1
Método de Bradford/DCM 96,2
Método de Bradford/ACT 3,0
Roseane Maria Ribeiro Costa
55
Cinética de liberação in vitro. O perfil cinético da liberação in vitro (Figura 11) das
micropartículas de PLGA contendo BSA apresentou um modelo bimodal (fase 1: liberação
acelerada e fase 2: liberação lenta) (Rafati et al., 1997). Na primeira hora de coleta, houve
o efeito “burst” (fase 1) de cerca de 30% de liberação do conteúdo da BSA das
micropartículas, que pode ser explicado, em parte, pela dessorção da proteína adsorvida na
superfície das micropartículas durante o processo de formação (Blanco and Alonso, 1998).
Em comparação com dados da literatura, o perfil cinético aqui obtido mostra uma fase 1
melhor controlada. Zheng et al. (2004) obtiveram micropartículas similares, através do
mesmo método de preparação, com eficiência de encapsulação de 65% e liberação de 48%
de BSA nessa primeira fase, maior do que a quantidade liberada pelas micropartículas aqui
desenvolvidas (30%).
A segunda fase correspondeu a uma liberação sustentada de 60% da proteína até o
décimo dia do ensaio de liberação in vitro. Nesta fase, a liberação da BSA depende de
fatores como a degradação do polímero, das propriedades da proteína e de sua interação
com os produtos de degradação ácida da matriz de PLGA (Blanco and Alonso, 1998;
Carrasquillo et al., 2001). A Figura 12 ilustra a degradação do polímero, e
conseqüentemente, liberação da proteína.
Figura 11. Perfil da cinética de liberação in vitro da BSA a partir das microesferas de
PLGA (média ± desvio padrão, n = 3).
0
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250Tempo (h)
Libe
raçã
o A
cum
ulad
a (%
)
Roseane Maria Ribeiro Costa
56
(a) (b)
Figura 12. Micrografias da microscopia eletrônica de varredura (2000 ×); (a) Micro-BSA
antes e (b) após cinética de liberação in vitro.
4.3.2.3. Caracterização das Micropartículas de PLGA contendo Recombinante
Humana de Interleucina-2
As Mrh-IL2, MPEG-IL2 e MBSA-IL2 foram obtidas pelo sistema diclorometano
como solvente/ PVA 3% (m/v) como agente emulsificante. Uma dessas formulações será
utilizada em estudos pré-clínicos, visando como continuidade desse projeto, o ensaio
clínico, com aplicação intra-tumoral das Mrh-IL2 no tratamento de pacientes com
carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço.
Determinação do tamanho de partícula. A Tabela 4 apresenta a granulometria das
formulações de microesferas de PLGA encapsulando a rhIL2 com e sem aditivos. As
microesferas com BSA apresentaram menor diâmetro médio (8,3 μm), seguida das
partículas feitas com PEG (9,4 μm), sendo as partículas de maior diâmetro as Mrh-IL2
(14,6 μm). As Mrh-IL2 e MPEG-IL2 apresentam span menor que 2, considerado dentro da
faixa de tamanho adequada para sistemas de liberação controlada de fármacos (Span < 2)
(Poletto, 2006). Apesar de apresentarem partículas de menor tamanho, as micropartículas
MBSA-IL2 apresentaram uma distribuição de tamanho de partículas mais heterogênea com
span de 3,8.
Roseane Maria Ribeiro Costa
57
Tabela 4. Tamanho médio das microesferas PLGA contendo rhIL2.
Microesferas
PLGA/rh-IL2
d(4,3)
μm
d(v, 0.1)
μm
d(v, 0.5)
μm
d(v, 0.9)
μm
Span
μm
Mrh-IL2 14,6 4,2 18,6 36,6 1,7
MPEG-IL2 9,4 1,3 13,5 27,2 1,9
MBSA-IL2 8,3 1,4 5,3 21,5 3,8
d(4,3): Diâmetro médio em volume d(v, 0.1): Diâmetro da partícula correspondente a 10% da distribuição acumulada d(v, 0.5): Diâmetro da partícula correspondente a 50% da distribuição acumulada d(v, 0.9): Diâmetro da partícula correspondente a 90% da distribuição acumulada Span: Medida indireta da dispersão ou largura da distribuição granulométrica, igual a [d(v, 0.9) - d(v, 0.1)]/ d(v, 0.5)
Análise morfológica. A Figura 13 apresenta micrografias de microesferas Mrh-IL2,
MPEG-IL2 e MBSA-IL2 liofilizadas. Observa-se que as microesferas apresentaram forma
bem definida (esféricas) e de superfície lisa.
(a) (b) (c)
Figura 13. Microfotografias das microesferas de PLGA liofilizadas: a) Mrh-IL2; b)
MPEG-IL2 e c) MBSA-IL2 (magnitude 1500×).
Eficiência de encapsulação. O teor da interleucina-2 extraída das microesferas foi dosado
pelo método ELISA específico para IL2 como mostra a Tabela 5. O interesse em adicionar
em diferentes formulações, polietilenoglicol (PEG 4000) como agente aditivo e, albumina
de soro bovino (BSA) como agente co-encapsulante, foi de preservar a estabilidade da
molécula da interleucina-2 contra a desnaturação pelo contato com o solvente orgânico
Roseane Maria Ribeiro Costa
58
durante o processo de microencapsulação, visando também aumentar a eficiência de
encapsulação. De fato, como pode-se comprovar através da Tabela 5, houve tendência ao
aumento na eficiência de encapsulação das formulações MPEG-IL2 e MBSA-IL2, em
comparação à formulação sem aditivo na fase aquosa interna (Mrh-IL2). Horas et al.
(1990) e Thomas et al. (2004) produziram partículas de PLGA (50:50) encapsulando a IL-
2, por processo similar de microencapsulação, com taxa de encapsulação variando de 15 a
60%. Em comparação ao estado da arte, os resultados aqui obtidos, indicam o sucesso na
otimização do processo, atingindo-se uma eficiência de encapsulação de IL-2 da ordem de
80%.
Tabela 5. Eficiência de encapsulação de IL-2.
Cinética de liberação in vitro. A Figura 14 apresenta o perfil de liberação in vitro da
interleucina-2 a partir das microesferas de PLGA. Para todas as formulações, a fase de
liberação acelerada (Fase 1 - efeito “burst”), ocorreu no intervalo de coleta de 4 horas,
liberando 28%, 30% e 41% do conteúdo de IL2 das microesferas de PLGA, Mrh-IL2,
MPEG-IL2 e MBSA-IL2, respectivamente.
As micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2 apresentaram perfis cinéticos de liberação
semelhantes, liberando respectivamente cerca de 35% e 32% da citocina no sétimo dia do
experimento (168 h), ou seja, no final da Fase 1. Já as micropartículas com BSA associada
à IL-2 (MBSA-IL2) liberaram cerca de 50% do teor de IL-2 encapsulada, neste mesmo
intervalo de coleta.
Quanto às formulações de PLGA encontradas na literatura:
1) Micropartículas contendo a forma modificada PEG IL-2, quando associada à BSA,
apresentaram uma liberação de 10% na Fase 1 e, posteriormente, uma Fase 2 caracterizada
por uma liberação de 2 a 3% ao dia por um período de 30 dias (Horas et al., 1990);
2) Micropartículas de PLGA contendo IL-2 liberaram de 15 e 30% da IL2 em 40 dias
(Thomas et al., 2004).
Microesferas PLGA Eficiência de Encapsulação (%) ± DP
Mrh-IL2 72,6 ± 1,8
MPEG-IL2 80,4 ± 7,4
MBSA-IL2 83,4 ± 7,6
Roseane Maria Ribeiro Costa
59
Em comparação a estes dados, as micropartículas produzidas neste trabalho
apresentaram um melhor controle da liberação de IL-2 pelas micropartículas Mrh-IL2 e
MPEG-IL2 e uma liberação mais acentuada da IL-2, quando esta foi co-encapsulada com
BSA (micropartículas MBSA-IL2).
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Tempo (h)
Lib
eraç
ão a
cum
ulad
a (%
)
MBSA-IL2MrhIL-2MPEG-IL2
Figura 14. Perfil da cinética de liberação in vitro da IL-2 a partir das micropartículas de
PLGA (média ± desvio padrão, n = 3).
Degradação in vitro das micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2. Na tentativa de
interpretar o efeito da degradação das micropartículas de PLGA na cinética de liberação da
interleucina-2, avaliou-se a cinética de degradação in vitro das micropartículas Mrh-IL2 e
MPEG-IL2, através da observação de possíveis alterações morfológicas destas partículas
após incubação em solução tampão PBS pH 7,4. Micrografias de partículas Mrh-IL2 e
MPEG-IL2 incubadas após 7, 35 e 42 dias (Figura 15) exibem alterações morfológicas
semelhantes em função do tempo de incubação, para ambas as formulações, com e sem
PEG como aditivo. De fato, os perfis cinéticos de liberação da IL-2 destas diferentes
formulações também são semelhantes. Apesar da cinética de liberação in vitro ter sido
acompanhada por um período de 15 dias, o ensaio de degradação sugere que a liberação de
IL-2 prossegue, favorecida pelo aumento da porosidade das partículas decorrente da
degradação gradativa destas partículas no meio de liberação (ação da hidrólise no polímero
PLGA).
Roseane Maria Ribeiro Costa
60
Figura 15. Micrografias das partículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2, decorridos 7, 35 e 42 dias do ensaio de degradação em tampão PBS pH 7,4 (1500×).
Mrh-IL2 (7° dia de degradação) Mrh-IL2 (35° dia de degradação) Mrh-IL2 (42°dia de degradação)
MPEG-IL2 (7° dia de degradação) MPEG-IL2 (35° dia de degradação) MPEG-IL2 (42° dia de degradação)
Roseane Maria Ribeiro Costa
61
4.4. CONCLUSÕES
O estudo de pré-formulação, produção e caracterização, das microesferas de PLGA
sem ativo e com a proteína modelo, BSA, foi importante, para determinar as condições de
preparação de uma formulação de microesferas de PLGA para encapsulação da proteína de
nosso interesse, recombinante humana de interleucina-2, a ser utilizada em estudos pré-
clínicos, visando posterior ensaio clínico.
Pode-se constatar o efeito de condições de processo e de formulação como tipo de
solvente orgânico, tipo e concentração de agente emulsificante nas características das
micropartículas de PLGA obtidas, como tamanho médio e distribuição granulométrica,
carga superficial (potencial zeta) e teor de PVA residual na superfície das partículas.
O ativo de nosso interesse, recombinante humana de interleucina-2 foi encapsulado
em micropartículas de PLGA, em formulações sem e com aditivos como polietilenoglicol
(PEG) e albumina de soro bovina (BSA), com a finalidade de garantir melhor manutenção
da atividade biológica e estabilidade da IL-2.
As micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2 apresentaram perfis cinéticos da liberação
de IL-2 semelhantes, bem como sofreram alterações físicas similares na degradação do
polímero devido á ação do meio fisiológico simulado. Por outro lado, as micropartículas
contendo IL-2 co-encapsulada com BSA proporcionaram uma liberação mais acentuada da
IL-2.
Comparando-se as micropartículas geradas neste trabalho com resultados similares
apresentados na literatura, comprova-se um aumento da eficiência de encapsulação e o
controle cinético da liberação da IL-2, como pretendido.
Roseane Maria Ribeiro Costa
62
CAPÍTULO III
TESTE DE CONCEITO
Roseane Maria Ribeiro Costa
63
5. TESTE DE CONCEITO
Microsferas de PLGA contendo IL-2 sem aditivos, desenvolvidas no escopo do
trabalho, foram introduzidas em testes de conceitos, utilizando-se diferentes modelos
tumorais e protocolos terapêuticos. Os resultados serão apresentados neste capítulo.
5.1. MODELO TUMORAL MELANOMA B16F10
Microesferas de PLGA contendo rhIL-2, assim como, o Proleukin®, rhIL-2 em sua
forma livre, foram administradas, através de um protocolo terapêutico desenvolvido e
proposto especificamente para este trabalho, em camundongos C57Bl/6 portadores de
melanoma B16F10.
5.1.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Linfoproliferação rhIL-2 pura e encapsulada;
Verificar o índice de endotoxinas nas formulações do estudo pré-clínico;
Realizar o ensaio pré-clínico para avaliar a atividade anti-tumoral destas microesferas
de PLGA sem ativo e das microesferas de PLGA contendo IL-2, na terapia de
camundongos (C57Bl/6) portadores de melanoma (B16F10), bem como avaliação da
toxicidade deste tratamento em animais não-portadores de tumor.
Avaliar a resposta imune através da citotoxicidade específica de células de baço e das
células imunes infiltrantes no tumor.
5.1.2. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
5.1.2.1. Linfoproliferação rhIL-2 livre e encapsulada
Camundongos fêmeas C57Bl/6, entre 5 a 8 semanas, foram sacrificados para
remoção estéril do baço. Os baços foram colocados em meio RPMI (mistura de sais
minerais enriquecidos com aminoácidos, vitaminas e outros componentes essenciais para
crescimento celular) incompleto e em seguida divulssionados. As suspensões celulares
foram lavadas e o sedimento celular coletado por meio de centrifugação a 1500 rpm
durante 10 min. O número de células nas suspensões dos baços foi ajustado para 5 x 106
células/ mL em meio RPMI completo contendo os antibióticos penicilina (100.000 UI/
mL) e gentamicina (100.000 μg/ mL) e 10% de soro bovino fetal. As células foram
distribuídas (100 μL/ poço), em triplicata, em placas de 96 poços, fundo chato (Corning).
Posteriormente, a rhIL-2 pura foi adicionada em diferentes concentrações e Concanavalina
Roseane Maria Ribeiro Costa
64
A como controle positivo. Traço de timidina triciada (3H-timidina, 0,25 μCi) foi colocada
em cada poço após 54 horas de cultura à 37oC, em presença de CO2. As células
permaneceram em cultura por mais 18 horas e foram posteriormente coletadas em coletor
de células (Cell Harvester). A leitura foi realizada no contador de cintilação β.
Nos experimentos em que a rhIL-2 encapsulada foi utilizada como estímulo,
concentrações crescentes de rhIL-2 em microesferas foram colocadas em meio completo e
deixadas em estufa de CO2 a 37 oC por 120 h para permitir a liberação da rhIL-2. Após esse
período, as suspensões celulares de baço foram adicionadas em triplicata e o mesmo
protocolo (acima descrito) foi realizado.
5.1.2.2. Avaliação do Nível de Endotoxinas presentes nas Mrh-IL2
As Mrh-IL2 utilizadas para o ensaio de sobrevida foram preparadas de forma
asséptica, em sala limpa classificação Padrão Internacional designação ISO (International
Standards Organization) 7, manipuladas na Cabina de Segurança Biológica – BioSAFE
Plus Classe II tipo B2, assim como, todo material utilizado foi esterilizado e considerado
livre de endotoxinas.
Esta condição de trabalho foi especialmente montada para a realização deste estudo
(Figura 16).
(a) Ante-sala (b) Sala com Cabina de Segurança Biológica
Figura 16. Sala limpa de classificação ISO 7 montada no IPT (Instituto de Pesquisas
Tecnológicas do Estado de São Paulo) para desenvolvimento das micropartículas de PLGA
contendo IL-2.
Micropartículas de PLGA com IL-2
Roseane Maria Ribeiro Costa
65
O nível de endotoxinas presente nas formulações foi determinado através de ensaio
realizado com o Kit Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000® (Cambrex BioScience
Warkersville, United States). Em uma placa de 96 poços, curva padrão e amostras foram
incubadas com o Reagente LAL por 10 minutos e por 6 minutos com o substrato
cromogênico a 37o C. A reação foi interrompida com ácido acético 25% (v/v) e a leitura foi
realizada em espectrofotômetro µQuant (Biotek Instruments, United States) a 405 nm.
5.1.2.3. Tratamento
Camundongos fêmeas C57Bl/6, entre 5 a 8 semanas, provenientes do Biotério de
Animais Isogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São
Paulo (USP), onde foram realizados os experimentos.
A linhagem murina do melanoma B16F10 foi gentilmente cedida pelo Dr. Marcello
Barcinski do Instituto Nacional do Câncer (INCA) - Rio de Janeiro e a cultura de células
foi realizada em meio RPMI-1640 (Gibco) suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2
mM de L-glutamina (Sigma), 1 mM piruvato de sódio (Sigma) e 20 mg/mL de
gentamicina. As suspensões celulares foram descoladas das garrafas de cultura com
tripsina e após a inativação da tripsina com soro bovino fetal, em seguida, as células foram
padronizadas em solução salina para posterior aplicação nos animais.
Trinta camundongos C57Bl/6 foram aleatoriamente distribuídos em 3 grupos os quais
foram inoculados por via subcutânea (s.c.) no flanco, com 5 x 104 células de melanoma
B16F10. Dez dias após a implantação do tumor os animais receberam injeções
intratumorais de 100 μL das diferentes formulações vacinais (Tabela 6). Ao final de,
respectivamente 19 dias do início do experimento 5 animais de cada grupo foram
sacrificados por deslocamento da cervical para obtenção de células do lavado peritoneal,
remoção do baço e do tumor. As células do lavado peritoneal e o baço foram removidos de
forma estéril para realização de co-cultura e posterior teste de citotoxicidade. O tumor foi
removido, pesado e, quando possível, dividido em 2 fragmentos para análise histológica e
avaliação das células imunes infiltrantes por citometria de fluxo. Separadamente, 5 animais
de cada grupo foram acompanhados até sua morte* para avaliação da taxa de sobrevida.
Roseane Maria Ribeiro Costa
66
Tabela 6. Grupos de tratamento de ensaio de sobrevida e de atividade biológica.
* por questões éticas, os animais que se apresentavam debilitados ou sem locomoção foram
sacrificados por deslocamento da cervical.
5.1.2.4. Teste de Citotoxicidade
Após a morte dos animais, foram coletadas células do lavado peritoneal e baço. Os
macrófagos do lavado peritoneal, coletados em salina, foram contados, centrifugados e
ressuspendidos em meio RPMI completo. Os mesmos foram plaqueados em placa de
cultura de 24 poços (Corning NY, USA) na concentração de 2 x 105 células por poço e
deixados aderir por 1h. Paralelamente, os baços removidos foram macerados,
ressuspendidos em tampão de lise e centrifugados a 1500 rpm por 10 min. As células
foram ressuspendidas em meio RPMI completo, a concentração celular foi acertada e as
mesmas foram colocadas na concentração de 5 x 106 células/ poço em co-cultura com os
macrófagos previamente plaqueados. Em seguida, a co-cultura foi pulsada com 30 µg de
lisado total de células B16F10 e deixada em estufa a 37 °C com 5% CO2 por 4 dias.
Após esse período, o meio juntamente com as células foi removido com auxílio de
pipeta e os poços foram lavados com 4 mL de PBS estéril livre de endotoxinas. A partir
dessa suspensão, as células T CD8 (células efetoras) foram obtidas por separação com
esferas magnéticas.
Em seguida, foi avaliada a citotoxicidade específica mediada pelas células T CD8
contra as células tumorais B16F10 (células alvo).
A suspensão de células T CD8 (células efetoras) foi centrifugada por 10 min a 1500
rpm, ressuspendida em meio RPMI 1640 livre de Vermelho Fenol (Gibco-Invitrogen) com
1% de soro bovino fetal e sua concentração foi avaliada em câmara de Neubauer em 0,2%
de Trypan. Após a contagem, células T CD8 foram colocadas em placas de 96 poços de
fundo em “U” (Corning NY, USA). Paralelamente, as células B16F10 (células alvo)
mantidas em cultura foram removidas da garrafa, contadas em câmara de Neubauer com
Grupos Tratamento/dose N Experimento
5 Sobrevida 1 Microesferas sem ativo (Micro PLGA)
5 Atividade Biológica
5 Sobrevida 2 Proleukin® ( IL-2 livre)/4,5x104 UI
5 Atividade Biológica
5 Sobrevida 3 Microesferas de IL2 (Mrh-IL2)/4,5x104 UI
5 Atividade Biológica
Roseane Maria Ribeiro Costa
67
0,2% de Trypan e ressuspendidas no mesmo meio das células T CD8. As células B16F10
foram colocadas em co-cultura com os T CD8 previamente pipetados. O estudo foi
realizado em triplicata e a razão 20:1 entre células efetoras e alvo foi utilizada.
A co-cultura foi mantida em estufa a 37°C com densidade de 5% de CO2 por 18h.
Após esse período, as placas foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 min e os
sobrenadantes foram transferidos para uma placa de fundo chato. Os sobrenadantes foram
avaliados quanto à liberação de lactato desidrogenase (LDH) utilizando Cytotoxicity
Detection Kit (Roche Applied Science). Aos sobrenadantes foi adicionada uma mistura de
reação contendo diaforase (catalisador) e solução de revelação (sal tetrazolium). A seguir,
a placa foi incubada a temperatura ambiente sob proteção da luz e a leitura foi realizada
em leitor de ELISA a 490 nm após 10, 20 e 30 min para determinação do melhor tempo de
incubação.
O princípio do teste consiste na avaliação indireta da quantidade de LDH liberada
pela lise da célula-alvo. Primeiramente, a LDH liberada reduz NAD+ em NADH+ H+ pela
oxidação do lactato em piruvato. Na segunda reação enzimática, 2H são transferidos de
NADH+ H+ ao sal tetrazolium pelo catalisador dando origem ao sal formazan, o qual é
vermelho e solúvel. A intensidade da coloração vermelha é proporcional à quantidade de
LDH liberada pela lise celular.
A porcentagem de lise específica foi calculada segundo a fórmula:
Lise específica (%) = [(E – Le efet)– Le alvo)]/(L max – Le alvo) x 100
Na qual:
E - liberação experimental de LDH na co-cultura de células alvo e efetoras;
Le efet - liberação espontânea de LDH pelas células efetoras em meio de cultura;
Le alvo - liberação espontânea de LDH pelas células alvo em meio de cultura;
L max - liberação máxima de LDH pelas células alvo (células alvo incubadas na
presença de 1% de Triton X 100 em meio de cultura).
Além disso, foi feito um controle branco, também em triplicata, obtendo-se a
quantidade de LDH presente no meio de cultura. O valor de absorbância obtido desse
controle é subtraído de todos os demais valores.
Roseane Maria Ribeiro Costa
68
5.1.2.5. Dissociação da Massa Tumoral para Análise por Citometria de Fluxo (FACS)
Os fragmentos de tumor foram cortados em fragmentos ainda menores e transferidos
para tubos de 50 mL contendo 15 mL de meio Hanks livre de Ca++ e Mg++ (Invitrogen) e
Liberase (6 µg/µL) para cada amostra e, em seguida, incubados a 37°C, sob agitação
constante, durante 30 min.
Após o período de incubação, as células foram dispersas com o auxílio de uma
seringa de 10 mL. A suspensão contendo as células e os fragmentos de tumor foram
centrifugados a 1500 rpm, durante 5 minutos, e o precipitado ressuspendido em 10 mL de
meio RPMI com 10% de soro bovino fetal para bloquear a ação da Liberase. Em seguida,
as células e o restante dos fragmentos teciduais foram ressuspendidos em tampão de lise e
centrifugados a 1500 rpm para a coleta do precipitado. Este foi ressuspendido em 5 mL de
meio RPMI completo e transferido para uma peneira de aço inoxidável (malha no 100,
SIGMA) para a obtenção das células isentas dos fragmentos teciduais. Na seqüência, as
células foram coletadas por centrifugação a 1500 rpm, ressuspendidas em meio de cultura,
coradas com azul de trypan 0,2% e contadas em Câmara de Neubauer.
5.1.2.6. Avaliação da Expressão de Marcadores de Superfície por Citometria de Fluxo
(FACS)
As populações de células do tumor obtidas por meio do procedimento descrito acima
foram caracterizadas pela expressão de marcadores de superfície utilizando anticorpos
conjugados a isotiocianato de fluoresceína. O número de células nas suspensões foi
acertado para 1x106 células/ mL em PBS. A seguir, 100 µL de cada suspensão celular
foram distribuídos em tubos FACS. As células foram, então, incubadas com anticorpo anti-
CD16/CD32 (Fc BlockTM - PharMingen) na concentração de 0,5 µg/ 106 células durante
45 minutos a 4oC para evitar a ocorrência de ligações inespecíficas. Posteriormente, as
células foram incubadas com os respectivos anticorpos monoclonais de interesse (0,5 -
0,75 µg / 106 células) durante 30 minutos, a 4oC, no escuro. Após o tempo de incubação, as
células foram lavadas com PBS contendo 2% de soro bovino fetal por tubo, sendo o
precipitado celular coletado através de centrifugação a 1500 rpm durante 5 minutos. O
sobrenadante foi retirado e o sedimento celular ressuspendido em 500 µL de PBS contendo
1% de formaldeído, para a fixação das células. As preparações celulares foram adquiridas
no FACSort (Becton & Dickinson) e coletados 50.000 eventos das amostras.
Roseane Maria Ribeiro Costa
69
5.1.2.7. Anticorpos Monoclonais
A caracterização das populações de linfócitos T do infiltrado tumoral foi realizada
com anticorpos: anti-CD4, anti-CD8, e anti-CD44. Para caracterização das células
dendríticas no tumor, as células foram marcadas com anticorpos anti-CD11c e analisadas
quanto à expressão de CD86.
Foram utilizados anticorpos conjugados com FITC e isotipos controle em todos os
experimentos para o ajuste da fluorescências (FITC). A avaliação da expressão de
marcadores de superfície foi realizada por citometria de fluxo, como já descrito.
5.1.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1.3.1. Linfoproliferação rhIL-2 livre e encapsulada
A linfoproliferação induzida pela citocina recombinante humana IL-2 nas suas
formas livre e encapsulada em microesferas de PLGA (Mrh-IL2), foi avaliada in vitro para
verificação da capacidade de estímulo de resposta proliferativa de linfócitos de
camundongos C57Bl/6. A recombinante humana IL-2 na sua forma livre estimulou a
proliferação dos linfócitos de camundongos C57Bl/6 (dado não mostrado). No
experimento com as Mrh-IL2, observou-se que a IL-2 (Figura 17) foi capaz de induzir a
proliferação dos linfócitos quando comparado aos controles (negativo e positivo). Além
disso, a partir da dose de 1000 UI de IL-2, não ocorreu aumento de proliferação com
aumento da dose da citocina. Estes resultados sugeriram que poderíamos prosseguir nos
ensaios pré-clínicos.
0,0E+00
1,0E+04
2,0E+04
3,0E+04
4,0E+04
5,0E+04
meio Con A 10 25 50 250 1000 2500 5000 10000
Concentração
cpm
Figura 17. Linfoproliferação da forma encapsulada da interleucina 2, Mrh-IL2.
Roseane Maria Ribeiro Costa
70
5.1.3.2. Avaliação do Nível de Endotoxinas presentes nas Formulações
As microesferas de PLGA sem ativo e as Mrh-IL2 utilizadas para a realização dos
ensaios pré-clínicos, foram avaliadas quanto à presença de endotoxinas pelo teste de LAL.
Na Tabela 7, pode-se constatar que as mesmas puderam ser consideradas isentas de
endotoxinas, uma vez que as amostras são consideradas livres de endotoxina, para
injetáveis, quando apresentam valores menores que 0,1 UE/μg (Unidades de Endotoxina
por μg de amostra).
Tabela 7. Níveis de endotoxinas presentes nas microesferas de PLGA.
5.1.3.3. Estudo de Sobrevida
O estudo de sobrevida demonstrou que não houve diferença estatística significativa
na taxa de sobrevivência dos animais independentemente do tratamento realizado (Figura
18).
0 5 10 15 20 25 30 350
25
50
75
100Micro PLGAIL-2 livreMrh-IL2
dias
% s
obre
vivê
ncia
Figura 18. Porcentagem de sobrevivência de animais tratados com apenas 1 inoculação
intra-tumoral. Camundongos C57Bl/6 foram inoculados s.c. com 5x104 células B16F10.
Dez dias após a implantação do tumor os animais receberam 1 injeção intra-tumoral de 100
μL de acordo com o tratamento de cada grupo: Grupo 1 – microesferas sem ativo; Grupo 2
- Proleukin®/4,5x104 UI; Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI. Todos os animais
foram acompanhados até sua morte para avaliação da taxa de sobrevida.
Microesferas PLGA Endotoxinas (UE/μg)
Micro PLGA 0,00001
Mrh-IL2 0,00006
Roseane Maria Ribeiro Costa
71
5.1.3.4. Estudo da Atividade Biológica da rhIL-2
A avaliação da massa tumoral (Figura 19) demonstrou que apesar de haver uma
tendência à redução da massa de tumor nos animais tratados com Mrh-IL2, a mesma não é
estatisticamente significativa.
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
Micro PLGA IL-2 livre Mrh-IL2
Grupos
Mas
sa tu
mor
al (g
)
Figura 19. Peso do tumor (g) após tratamento de acordo com os grupos: Grupo 1 –
microesferas sem ativo; Grupo 2 - Proleukin®/4,5x104 UI; Grupo 3 - microesferas de
IL2/4,5x104 UI.
5.1.3.5. Citotoxicidade
O teste de citotoxicidade foi realizado para avaliar a capacidade dos tratamentos com
Micro PLGA, Mrh-IL2, assim como IL-2 livre em induzir uma resposta citotóxica
específica mediada por células T CD8 contra as células tumorais. Na Figura 20, pode-se
observar que não houve diferença entre grupos independentemente do tratamento
empregado. Isto pode ser explicado pelas células desse tipo de melanoma B16F10 são de
natureza bastante agressiva in vivo, apresentando baixa imunogenicidade, que são, na
verdade, características compartilhadas pela maioria dos melanomas humanos os quais, na
maioria das vezes, dificilmente são capazes de eliminar as células tumorais através da
resposta imune.
Roseane Maria Ribeiro Costa
72
0
4
8
12
16
20
Micro PLGA IL-2 livre Mrh-IL2
Grupos
Lise
esp
ecífi
ca (%
)
Figura 20. Citotoxicidade mediada por linfócitos TCD8, conforme cada grupo de
tratamento: Grupo 1 – microesferas sem ativo; Grupo 2 - Proleukin®/4,5x104 UI; Grupo 3 -
microesferas de IL2/4,5x104 UI.
5.1.3.6. Avaliação da Expressão de Marcadores de Superfície
Nos ensaios referentes a marcadores de superfície de expressão foram analisadas as
expressões das células CD4, CD8, CD11c (células dendríticas) e CD11b (macrófagos) dos
animais de todos os grupos que fizeram parte do ensaio in vivo, porém, os resultados
obtidos não apresentaram diferença estatística entre os grupos experimentais (dado não
mostrado).
5.1.4. CONCLUSÕES
Após a incorporação em microesferas de PLGA, a IL-2 manteve sua propriedade de
estimulação de proliferação de linfócitos in vitro e as formulações mostraram-se isentas de
endotoxinas para realização de ensaios in vivo.
Os resultados obtidos não colocaram em evidência nenhum aumento significativo de
sobrevida ou da resposta citotóxica dos grupos de animais submetidos ao tratamento
proposto. Nota-se, no entanto, que o modelo experimental de tumor para estudos de fase
pré-clínica depende muito da adequação do tempo necessário para se desenvolver uma
resposta terapêutica e a evolução do tumor, função de suas características específicas.
Os resultados aqui obtidos mostram, em um primeiro momento, que a resposta imune
que se pretende desenvolver com a administração da IL-2, feita de forma controlada pelo
Roseane Maria Ribeiro Costa
73
perfil cinético de liberação programado pelas características das microesferas de PLGA
desenvolvidas neste trabalho, pode não estar adequado ao estágio de desenvolvimento do
modelo tumoral Melanoma B16F10, impossibilitando sua regressão através do protocolo
de tratamento empregado. Acredita-se assim, que a otimização do modelo experimental é
fundamental para conclusões mais definitivas.
5.2. MODELO TUMORAL CARCINOMA DE ERLICH
5.2.1. OBJETIVO
Microesferas biodegradáveis de PLGA contendo rhIL-2 foram administradas
seguindo um protocolo de tratamento imunoterápico desenvolvido neste trabalho, aplicado
em camundongos C57Bl/6 portadores de carcinoma de Ehrlich.
5.2.2. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
5.2.2.1. Tratamento
Os animais, camundongos da linhagem C57BL/6, inoculados com o carcinoma de
Ehrlich, foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Luiz Carlos de Sá Rocha, do
Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP
(FMVZ), onde foi realizado todo o ensaio in vivo conforme as normas e procedimentos
relativos ao uso de animais do biotério dessa instituição. Os animais utilizados foram
camundongos fêmeas, entre 5 a 6 semanas.
O carcinoma de Ehrlich é mantido pelo Laboratório de Neuroimunologia da FMVZ
em camundongos C57BL/6, podendo ser transplantado entre animais da mesma espécie e
linhagem. As suspensões celulares foram padronizadas em solução salina de acordo com o
número de células a serem inoculadas nos animais.
O total de 24 animais foi distribuído de forma aleatória em 4 diferentes grupos
constituídos de 6 animais, conforme mostra a Tabela 8. A suspensão de células do
carcinoma de Ehrlich na concentração 1x106 células foi inoculada (volume total de 100
µL), por via subcutânea, na parte interior do membro traseiro esquerdo dos camundongos.
Após 3 dias da implantação do tumor, os animais receberam o tratamento (200 μL de
acordo com o tipo de tratamentos indicado na Tabela 8), aplicado no mesmo local da
inoculação da suspensão celular. As formulações liofilizadas (grupos 2 e 3) foram re-
suspensas em 200 μL de solução salina estéril. Tanto a IL-2 livre (grupo 4) quanto a IL-2
microencapsulada (grupo 3) foram injetadas com a dose de 4,5 x 104 UI/ camundongo. Os
Roseane Maria Ribeiro Costa
74
animais de cada grupo foram pesados diariamente a partir do sétimo dia de aplicação do
tratamento para avaliação de peso corpóreo. No 15° dia do experimento, os animais,
devidamente anestesiados, foram sacrificados por deslocamento da cervical e o tumor foi
retirado, pesado e fixado em meio apropriado para a realização dos estudos histológicos.
Tabela 8. Identificação do tipo de tratamento por grupo.
5.2.2.2. Estudo Histológico
O material coletado, depois de fixado em formol 10%, foi enviado para o
Laboratório de Histopatologia onde se procedeu a realização de lâminas que foram coradas
pela técnica de coloração hematoxilina e eosina (H&E).
O objetivo da técnica H&E é visualizar o núcleo e o citoplasma das células através
dos corantes Hematoxilina, que é um corante básico de coloração roxa que cora os
componentes de estruturas ácidas, como o núcleo. A Eosina, por sua vez, é um corante
ácido de cor vermelha que cora as estruturas básicas, como o citoplasma. O procedimento
para realização dessa técnica foi o seguinte: inicialmente, as lâminas foram colocadas
numa cuba contendo álcool a 95% durante 20 minutos, e em seguida, foram lavadas em
água corrente e coradas na solução de hematoxilina, sendo lavadas mais uma vez em água
corrente, e então, coradas na solução de eosina. Em seguida, as lâminas foram lavadas pela
terceira vez em água e lavadas em diferentes soluções alcoólicas, inclusive xilol, para
retirada do excesso dos corantes.
5.2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.2.3.1. Avaliação Tumoral
O peso dos animais foi acompanhado uma semana depois do tratamento até o dia
em que eles foram sacrificados. Observou-se que os animais dos 4 grupos ganharam peso
Grupos Tratamento/dose N (no de animais)
1 Controle solução salina 6
2 Microesferas sem ativo 6
3 Microesferas de IL2/4,5x104 UI 6
4 IL-2 pura (Proleukin®)/4,5x104 UI 6
Roseane Maria Ribeiro Costa
75
de forma progressiva (3,7g ± 0,4) ao longo de todo experimento, não apresentando
diferença significativa entre eles. A Figura 21 apresenta a diferença de pesos dos animais
por grupo, peso no último dia do tratamento (dia que os animais foram sacrificados) pelo
peso corpóreo do animal inicial.
0
1
2
3
4
5
6
salina micro-branca micro rhIL-2 IL-2 livre
Grupos
Var
iaçã
o do
pes
o co
rpór
eo d
os a
nim
ais (
g)
Figura 21. Variação do peso corpóreo dos animais (peso final - peso inicial): Grupo 1 –
controle – solução salina; Grupo 2 - microesferas sem ativo Grupo 3 - microesferas de
IL2/4,5x104 UI; e Grupo 4 - Proleukin®/4,5x104 UI.
Após 15 dias de ensaio, os animais foram sacrificados e os tumores foram
dissecados e pesados (peso úmido). Os outros órgãos como baço, pulmão e fígado foram
investigados durante a necropsia, porém, estes não apresentaram metástases visíveis. O
crescimento do tumor foi evidenciado em todos os grupos e, aparentemente, não houve
alteração no comportamento dos animais. Na análise estatística realizada com intervalo de
confiança de 95%, não foi identificada diferença significativa na análise entre cada grupo e
o controle, assim como, na análise de todos os grupos em conjunto (p > 0,05) (Figura 22).
Roseane Maria Ribeiro Costa
76
±Std. Dev.±Std. Err.Mean
Box & Whisker Plot: PESO_G_
GRUPOS
PE
SO
_G_
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4
Figura 22. Peso tumor (g) após terapia em camundongos C57Bl/6 inoculados por via s.c.
com 1x106 células de carcinoma de Ehrlich e com injeção intra-tumoral de acordo com o
tratamento de cada grupo: Grupo 1 – solução salina (controle); Grupo 2 - microesferas sem
ativo; Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI; Grupo 4 - Proleukin®/4,5x104 UI. Os
dados representam a media ± desvio padrão plotados pelo programa Basic Statistics p >
0,05 (ANOVA, seguida pelo teste de múltipla comparação Tukey).
Porém, a partir da Figura 22, as seguintes considerações podem ser enunciadas:
1. O Grupo 3 contendo a IL-2 microencapsulada (MrhIL-2) apresentou uma tendência de
redução de tamanho do tumor em comparação ao grupo controle (Grupo 1). Isto pode ser
explicado pelo princípio de ação de um sistema de liberação controlada, pela qual a forma
encapsulada de uma substância ativa controla a liberação do ativo para o meio de forma
lenta e sustentada. Aplicando este princípio no ensaio realizado, entende-se que,
provavelmente, tenha ocorrido a liberação da interleucina-2 proveniente das
micropartículas de MrhIL-2 de forma controlada no ambiente tumoral, durante um período
de 12 dias (tempo de duração do ensaio, após o terceiro dia de inoculação das células
tumorais, totalizando os 15 dias de ensaio). Além disso, algo também interessante que foi
encontrado neste grupo da IL-2 encapsulada foi a presença de uma secreção de coloração
esbranquiçada na região do tumor, quando não dentro do próprio tumor, o que levou a
pensar na possibilidade de um exsudado inflamatório como resposta da ativação do sistema
imune do hospedeiro, causado pela liberação da IL-2 no local. Pela complexidade entre o
Roseane Maria Ribeiro Costa
77
sistema imune e as células tumorais (Fridman and Tartour, 1997) não tem sido fácil
identificar com precisão os mecanismos envolvidos na resposta imunológica contra os
tumores (Sakai, 2004). Sendo assim, tem-se dado muita ênfase às células inflamatórias e
reguladoras, aos fatores solúveis que são associados com suas atividades e aos mediadores
inflamatórios. De acordo com a literatura, no estágio de inflamação avançada
primeiramente surgem os neutrófilos, em seguida, surgem vários tipos de leucócitos, o que
é seguido pela ativação de outras células inflamatórias ao local inflamado, através da
sinalização de um grande número de fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas. É
justamente nesse momento do processo de inflamação, que o fator de necrose tumoral
apresenta um papel importante na destruição do tecido tumoral, revertendo os danos
causados no local (Hagemann et al., 2007; Salazar-Onfray et al., 2007).
2. O grupo do Proleukin (Grupo 4) mostrou um acentuado crescimento do tumor em
relação ao grupo controle (Figura 22). Apesar da dose (4,5 x 104 UI/ camundongo) da IL-2
livre ter sido a mesma que a da forma encapsulada, dose essa fixada com base nos ensaios
in vivo com IL-2 encontrados na literatura, acredita-se na possibilidade que esta dose tenha
sido demasiadamente elevada em relação ao peso corpóreo do animal portador (16,0 ± 1,0
g, no momento da aplicação). De fato, a literatura sugere que doses elevadas da IL-2 não
são apenas inconvenientes pelos efeitos colaterais e tóxicos, mas também podem induzir a
atividade bloqueadora da citocina, o que acontece quando ocorre um elevado nível de
expressão da IL2, reduzindo completamente o estímulo do sistema imune por causa da
formação danificada de linfócitos T citotóxicos específicos para tumor, que pode levar a
efeitos adversos, tanto inibindo, como promovendo o crescimento do tumor (Wolf and
Schmid-Wolf Ingo, 1995; Antonia et al., 2004; Salazar-Onfray et al., 2007).
5.2.3.2. Estudo Histológico
Os estudos histopatológicos preliminares não evidenciaram diferenças significativas
entre os diferentes grupos (Figura 23). De fato, em todos os grupos estudados, verificou-se
uma intensa proliferação tumoral com a presença de células tumorais características do
carcinoma de Erlich (células grandes, com figuras de mitose e elevado pleomorfismo),
além de áreas de intensa atividade necrótica em especial no interior da massa tumoral. Este
fato deve-se, em grande parte, à incapacidade de suprimento sangüíneo adequado para o
rápido desenvolvimento do tumor. Estudos adicionais, possivelmente com o uso de
marcadores específicos deverão ser realizados visando uma melhor caracterização da
Roseane Maria Ribeiro Costa
78
evolução do tumor na busca de diferenças entre os diferentes grupos experimentais. Uma
destas marcações poderia investigar a presença, maior ou menor, de células NK na região
tumoral, pois sabe-se que a IL-2 tem a capacidade de recrutar e ativar estas células
importantes para o combate ao tumor.
Figura 23. Lesão tumoral com a presença de extensa área de necrose (n) de acordo com os
grupos: a) Grupo 1 – solução salina (controle); b) Grupo 2 - microesferas sem ativo; c)
Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI; e d) Grupo 4 - Proleukin®/4,5x104 UI.
(a) (b)
(c) (d)
n
n
n
n
Roseane Maria Ribeiro Costa
79
5.2.4. CONCLUSÕES
As microesferas contendo IL-2 apresentaram uma tendência para obtenção de uma
resposta intra-tumoral em camundongos C57Bl/6 portadores de carcinoma de Ehrlich. No
entanto, a falta de impacto do tratamento pode ter ocorrido devido à rápida evolução do
tumor e ao curto tempo de duração do experimento in vivo, 15 dias. Este período de tempo
pode ter sido demasiadamente curto para que efeitos de uma liberação controlada da IL-2
das microesferas pudessem ser observados no sítio de ação do tumor.
O modelo experimental utilizado nesse estudo mostrou-se de fácil execução, porém,
acredita-se que sejam necessários alguns ajustes, como uma inoculação de menor número
de células para se obter um crescimento lento do tumor, de maneira a melhor avaliar o
crescimento do tumor e a eficácia do tratamento imunoterápico proposto nesse trabalho e
um maior tempo de tratamento.
Roseane Maria Ribeiro Costa
80
CAPITULO IV
INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE PRODUÇÃO
DE SISTEMAS DE LIBERAÇÂO CONTROLADA
Roseane Maria Ribeiro Costa
81
6. INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE SISTEMAS
DE LIBERAÇÃO CONTROLADA
Com o intuito de prospectar inovações tecnológicas em processos de produção de
sistemas de liberação controlada de agentes terapêuticos, o processo de microencapsulação
aqui utilizado para a produção de micropartículas poliméricas (emulsificação/extração e
evaporação de solvente) foi testado com o uso de micromisturadores desenvolvidos no IPT
(Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo) como alternativa tecnológica
ao processo convencional que utiliza agitação mecânica na etapa de emulsificação.
Micropartículas de PLGA geradas nesta etapa foram caracterizadas em relação a
propriedades que afetam a liberação controlada de fármacos como distribuição
granulométrica.
No âmbito de um programa de cooperação internacional (CAPES), parte do trabalho
foi realizada no Centro RAPSODEE da EMAC- Ecoles des Mines d’Albi Carmaux-
França, envolvendo o desenvolvimento de metodologias de caracterização da eficácia de
mistura dos microdispositivos fabricados no IPT, visando a otimização da etapa de
emulsificação do processo de produção de micropartículas de PLGA. Os resultados serão
apresentados neste capítulo.
6.1. MICROMISTURADORES UTILIZADOS
Os micromisturadores estudados nesse projeto foram fabricados no IPT utilizando-se
uma abordagem híbrida com LTCC de cerâmicas verdes (Low Temperature Cofired
Ceramics), a qual associada à tecnologia de filmes espessos e de silício, surge como uma
alternativa interessante, viável e barata para a fabricação de dispositivos MEMS e micro-
sistemas em meso-escala.
Foram utilizados dispositivos microfluídicos que possuem geometria de canal do tipo
serpentina 3D, Figura 24. Esses dispositivos foram fabricados e, previamente,
caracterizados no Laboratório de Microfluídica do Centro de Tecnologia de Processos e
Produtos (CTPP) do IPT (Cunha, 2006).
Roseane Maria Ribeiro Costa
82
Figura 24. Desenho geométrico de micromisturadores passivos fabricados com a
tecnologia de LTCC utilizados nesse trabalho (Cunha, 2006).
Roseane Maria Ribeiro Costa
83
Os dispositivos microfluídicos BD1 e BD2 apresentam geometria 3D (Figura 24) e
propriedades hidráulicas mostradas na Tabela 9.
Tabela 9. Propriedades dos micromisturadores do tipo Serpentina 3D.
W: comprimento do canal (mm) H: altura do canal (mm) Dh: diâmetro hidráulico (mm) Vint - volume interno (mm3) Sint – área intrna (mm) Cef: comprimento efetivo = distância percorrida por dois fluidos a partir do ponto da mistura até a saída do micromisturador (mm) NE mistura – números de elementos de mistura
Os micromisturadores ED1 e ED2 apresentam geometrias diferentes (Figura 24) e
dimensões hidráulicas semelhantes, conforme podem ser visualizada na Tabela 10.
Tabela 10. Propriedades dos micromisturadores ED1 e ED2.
W: comprimento do canal (mm) H: altura do canal (mm) Dh: diâmetro hidráulico (mm) Vint: volume interno (mm3) Cef: comprimento efetivo = distância percorrida por dois fluidos a partir do ponto da mistura até a saída do micromisturador (mm) NE mistura: números de elementos de mistura
Dispositivo W
(mm)
H
(mm)
DH
(mm)
Vint
(mm3)
Sint
(mm2)
Cef
(mm)
NE
mistura
BD1 42,2 256,7 77 25
BD2 1,02 0,40 0,575
86,9 536,1 172 54
Dispositivo Geometria do
Canal
W
(mm)
H
(mm)
DH
(mm)
Vint
(mm3)
Cef
(mm)
NE
mistur
a
ED1 onda quadrada
XZ 0,61 0,64 0,625
23,257 48,5 10
ED2 ZigZag 3D 0,61 0,64 0,625 23,461 48,5 11
Roseane Maria Ribeiro Costa
84
Todas estas estruturas foram projetadas para apresentar diferentes geometrias, que
representam diferentes variações e perturbações no escoamento dos fluidos, o que afeta o
grau de mistura, como ilustrado na Figura 25, pela simulação do escoamento nos
microdispositivos ED1 e ED2.
Micromisturador ED1 Micromisturador ED2
Figura 25. Simulações somente do escoamento nos dispositivos realizadas por Cunha
(2006), com aplicativo baseado no método de elementos finitos chamado ANSYS.
6.2. CARACTERIZAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE MISTURA EM
MICROMISTURADORES
Um estudo de caracterização da qualidade de mistura de dois líquidos imiscíveis, foi
realizado visando possibilitar a seleção dos diferentes tipos de dispositivos microfluídicos
a serem introduzidos no processo de microencapsulação de nosso interesse.
Da literatura, selecionou-se o método recente proposto por Pànic et al. (2004),
envolvendo a transferência de massa de um pigmento solvatocromático (Nile Red) entre
dois líquidos imiscíveis, heptano (receptor) e uma mistura água:metanol 50:50 (doador).
Dependendo da intensidade de mistura entre estes dois líquidos, ocorre a difusão do Nile
Red (NR) da fase aquosa para a fase orgânica.
No método proposto, os autores avaliaram o potencial de mistura dos
micromisturadores pela medida direta da absorbância do NR. No entanto, o estudo aqui
realizado inovou esta metodologia existente na literatura pela introdução do coeficiente de
partição em função da concentração do Nile Red em heptano/ concentração do NR na
mistura água:metanol (CNRH/CNR
H2
O/MeOH), determinando-se assim, o grau de eficiência de
mistura obtido para cada micromisturador testado.
Roseane Maria Ribeiro Costa
85
6.2.1. Estudo da Transferência de Massa entre 2 Líquidos Imiscíveis nos
Micromisturadores
No estudo experimental, o corante Nile Red foi dissolvido na mistura água:metanol
(50:50) na concentração de 0,01 mmol/L, sendo a absorbância da solução ajustada em
0,536 ± 0,008. Em seguida, a solução era degaseificada (efeito de ultrassom). A solução
água:metanol contendo Nile Red e o solvente n-heptano eram então introduzidos em cada
micromisturador estudado (duas entradas, como ilustrado na Figura 26), por intermédio de
duas bombas, uma peristáltica (água:metanol) e uma HPLC (heptano).
Figura 26. Esquema experimental para caracterização da eficácia de mistura dos
micromisturadores.
A mistura resultante (saída do micromisturador) era coletada em uma proveta
graduada, que era então imediatamente pesada, o volume era mensurado e, as fases eram
então separadas para posterior análise espectrofotométrica (489 nm, para determinação do
NR na fase heptano, e 581 nm, para determinação do NR na fase água/metanol).
Além da geometria do micromisturador (4 micromisturadores foram testados),
variou-se para cada microdispositivo estudado, a vazão total de mistura ( 4, 8, 12, 16 e 20
mL/min), fixando-se uma razão volumétrica entre fases de 1:1.
Nile Red na fase
água:MeOH (50:50)
n-heptano
Micromisturador
Roseane Maria Ribeiro Costa
86
6.2.2. Cálculos das Medidas
6.2.2.1. Cálculo da Vazão Real
tt
VV
VV
ohep
ohep
MeOHágua
MeOHágua
v
v Δ+
Δ+
Δ=
Δ2
tan
tan
/
/ (Equação 2)
6.2.2.2. Cálculo do Balanço de Massa
O balanço de massa é dado:
0//,//,/tan, =−+ entradaMeOHáguaNRsaídaMeOHáguaNRsaídaohepNR mmm (Equação 3)
Seja,
BMVV
mVCVC entradaMeOHágua
MeOHágua
MeOHáguaNRsaídaMeOHáguasaídaMeOHáguaNRsaídaohepsaídaohepNR =−+ //
/
/,////,/tan/tan,
6.2.2.3. Cálculo do Coeficiente de Partição
saídaMeOHáguaNR
saídaohepNRp m
m
//,
/tan,=ε
Seja,
saídaMeOHáguasaídaMeOHáguaNR
saídaohepsaídaohepNRP VC
VC
////,
/tan/tan,=ε (Equação 4)
6.2.2.4. Calculo da Razão Concentração/ Concentração de Equilíbrio
ohepNReq
saídaohepNR
CC
tan,,
/tan, (Equação 5)
Roseane Maria Ribeiro Costa
87
6.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.3.1. Caracterização da Eficiência de Mistura em Micromisturadores
Nile Red é um pigmento que apresenta extensa faixa de solubilidade em diversos
solventes orgânicos e insignificante solubilidade em água (62 µg/ mL em heptano e menor
que 1 µg/ mL em água, sendo que o coeficiente de partição heptano/ água é de 58 a 4oC). A
absorção máxima do Nile Red depende fortemente da polaridade do meio, assim como, a
coloração da solução varia de acordo com a natureza do solvente. Para minimizar erros
experimentais, acompanhava-se também visualmente a absorção da solução do Nile Red, a
qual apresentava coloração violeta na fase aquosa composta da mistura água/ metanol, e
coloração amarela na fase orgânica n-heptano (Figura 27).
Fases líquidas antes do experimento Fases líquidas após experimento
Figura 27. Fases líquidas antes e após a realização do experimento de mistura: (a) Nile
Red na fase água:metanol (50:50) (Violeta intenso) e (b) fase n-heptano (incolor), antes da
passagem pelo micromisturador; (c) mistura líquida recuperada na saída do
micromisturador, onde se observa a existência de 2 fases distintas: (d) fase inferior
(água:metanol, violeta) e (e) fase superior (heptano, amarela).
A transferência de massa através dos micromisturadores foi quantificada pelo
coeficiente de partição (CP) em função da concentração do Nile Red em heptano/
concentração do NR na mistura água:metanol (CNRH/CNR
água/MeOH), Equação 4. Considera-
(a) (b) (c) (d) (e)
Roseane Maria Ribeiro Costa
88
se que a transferência de massa possa ser interpretada como uma medida direta do grau de
mistura nos micromisturadores, visto que a separação de fases na saída dos
micromisturadores é imediata, interrompendo a continuidade do processo de difusão, que
ocorre apenas no interior do dispositivo de mistura.
6.3.1.1. Dispositivos Microfluídicos BD1 e BD2
A Figura 28 apresenta a curva traçada a partir do cálculo do coeficiente de partição
de Nile Red entre as fases heptano e água:metanol, para os dispositivos BD1 e BD2, em
função da vazão total de mistura fixada para cada experimento (volumétrica).
Observa-se que a transferência de massa é melhorada com o aumento da vazão total
de alimentação dos fluidos em ambos os micromisturadores tipo serpentina 3D, BD1 e
BD2. Estes dispositivos apresentam mesma geometria e relação semelhante tanto de
Sint/Vint, BD1 = 6,08 e BD2 = 6,17, e Cef/NE mistura, BD1 = 3,08 e BD2 = 3,18 (Tabela
9). Estes resultados mostram que, para estes dispositivos tipo Serpentina 3D, a
transferência de massa depende sobretudo do comprimento efetivo do canal, sendo o
micromisturador BD2 de maior comprimento efetivo e com maior coeficiente de partição.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25
Vazão volumétrica total dos fluidos (ml/min)
Coe
ficie
nte
de p
artiç
ão
BD1
BD2
Figura 28. Coeficiente de partição (CNR
H/CNRÁgua/MeOH) em função da vazão total para os
dispositivos BD1 e BD2.
Roseane Maria Ribeiro Costa
89
6.3.1.2. Dispositivos Microfluídicos ED1 e ED2
A Figura 29 apresenta a evolução da transferência de massa, dada pelos coeficientes
de partição em função do aumento da vazão total das correntes líquidas introduzidas nos
micromisturadores ED1 e ED2.
Estes micromisturadores possuem propriedades hidráulicas semelhantes (vide Tabela
10), no entanto, o micromisturador ED2, que tem um elemento de mistura a mais (11) que
o micromisutrador ED1 (10, Tabela 10), proporcionou maior transferência de massa (maior
coeficiente de partição) em todas as vazões estudadas.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0 5 10 15 20 25
Vazão volumétrica total dos fluidos (ml/min)
Coe
ficie
nte
de p
artiç
ão
ED2
ED1
Figura 29. Coeficiente de partição (CNR
H/CNRÁgua/MeOH) em função da vazão total para os
dispositivos ED1 e ED2.
As Figuras 28 e 29 mostram a seguinte tendência de comportamento para todos os
micromisturadores: a transferência de massa é inicialmente favorecida pelo aumento da
vazão de fluidos, no entanto, aparece um ponto de mínimo e novamente a tendência de
aumento da transferência (coeficiente de partição) com novo aumento da vazão
volumétrica. Este comportamento já foi observado por outros autores em experimentos
similares de análise da eficiência de mistura em micromisturadores de outras geometrias
(Pànic et al., 2004; Lob et al., 2006) e tem sido assim interpretado em termos de dois
efeitos físicos - energia fornecida ao sistema para mistura e tempo de residência no
Roseane Maria Ribeiro Costa
90
micromisturador - , no que este trabalho também concorda: A difusão do pigmento Nile
Red da fase água:metanol para a fase heptano é um processo entrópico que pode ser
acelerado fornecendo-se maior energia ao sistema (potência de mistura); no entanto, o
aumento da vazão volumétrica não apenas proporciona aumento de energia mas também
implica em uma redução do tempo de residência dos fluidos no micromisturador. Em
vazões não muito elevadas, o aumento da energia deixa de ser suficiente para compensar o
menor tempo de residência dos fluidos na região de mistura, resultando em decréscimo da
transferência de massa do Nile Red da fase água:metanol para a fase heptano, em uma
região, onde observa-se redução deste coeficiente de partição em função do aumento da
vazão de líquidos (região de mínimo, observada nas vazões 4 e 12 mL/ min, Figuras 28 e
29). Aumentos maiores de vazão, além desta região de mínimo, representam um aporte de
energia ao sistema suficiente para acelerar a difusão do Nile Red da fase água:metanol para
a fase heptano que compensa o efeito de redução dos tempos de residência. Obviamente, a
posição do mínimo dependerá do tipo de geometria dos micromisturadores.
A Tabela 11 resume os resultados dos coeficientes de partição, parâmetro que foi
avaliado no estudo de transferência de massa para classificação da eficiência de mistura
dos dispositivos microfluídicos, apontando para cada micromisturador o CP máximo e
mínimo e em que vazões estes foram obtidos. Dos micromisturadores examinados, o
desempenho de mistura pode ser assim classificado: micromisturador BD2 > BD1 > ED1 >
ED2.
Para efeito de análise da eficiência do grau de mistura nos micromisturadores, o
coeficiente de partição entre estas 2 fases também foi determinado no equilíbrio. Para isto,
as fases foram deixadas em contato sob forte agitação magnética, durante 1 h, tempo
inferior ao tempo citado na literatura onde pode iniciar-se a degradação de Nile Red em
contato com água (Datta et al., 1997). O coeficiente de partição nesta condição, após
separação das fases, foi de 12.
Tabela 11. Coeficientes de partição obtidos com os micromisturadores.
Coeficiente de partição (CNR
H/CNRágua/MeOH)
Dispositivo microfluídico
Máximo Vazão total (mL/min)
Mínimo Vazão total (mL/min)
BD1 5,3 20 2,2 4 BD2 8,0 20 3,8 4 ED1 4,2 20 2,0 4 ED2 3,0 8 1,6 12
Roseane Maria Ribeiro Costa
91
6.4. CONCLUSÃO
O método recentemente desenvolvido e apresentado na literatura para quantificar a
transferência de Nile Red a partir de dois fluidos imiscíveis (Pànic et al., 2004) foi inovado
em termos de quantificação e tratamento de dados, para avaliar o desempenho de diferentes
dispositivos microfluídicos.
A eficiência de mistura, dada pela extensão da transferência de massa entre as fases
água:metanol (doador) e heptano (receptor) mostrou-se dependente do tipo de geometria
dos microdispositivos e de parâmetros de processo como a vazão total de mistura dos
fluidos introduzidos nos dispositivos de mistura. A boa mistura parece ser atingida por
mistura intensa e rápida (foco na energia de entrada, maiores vazões) ou mistura menos
intensa, porém mais longa (foco no tempo de residência).
6.5. Preparação de Micropartículas Poliméricas pelo Método Modificado de
Emulsificação e Extração de Solvente
Após os testes de eficiência de mistura realizados com os micromisturadores
fabricados com a tecnologia de LTCC e desenvolvidos para este trabalho, foram
selecionados os micromisturadores passivos, BD1 e ED2 para incorporação no processo de
microencapsulação, em substituição à etapa convencional de emulsificação (agitação
mecânica, processo descontínuo).
O processo de obtenção de micropartículas iniciou-se com a preparação de uma fase
orgânica e uma fase aquosa, separadamente. Para a preparação da fase orgânica o polímero
PLGA foi dissolvido em uma concentração de 25 mg/ mL de acetato de etila ou 45 mg/ mL
de diclorometano, sob agitação magnética e temperatura ambiente. A fase aquosa consistiu
em uma solução contendo o álcool polivinílico (PVA), em uma concentração de 3% (m/v).
Após a preparação das fases, iniciou-se a mistura das mesmas, de acordo com esquema
mostrado na Figura 30.
Roseane Maria Ribeiro Costa
92
Figura 30. Esquema do arranjo experimental para preparação de micropartículas de PLGA
pelo processo modificado.
Um estudo comparativo foi conduzido com agitador convencional (ultra
homogeneizador) para avaliação do desempenho da nova configuração de processo
concebida com os micromisturadores, na encapsulação da BSA, proteína modelo.
Todas as partículas geradas foram caracterizadas em relação a propriedades que
afetam a atuação como sistemas estruturados de liberação controlada de fármacos
(tamanho, morfologia, eficiência de microencapsulação e perfil farmacocinético de
liberação da proteína modelo, BSA).
Parte dos resultados obtidos foram aceitos em 2007 para publicação no periódico
Powder Technology e são apresentados a seguir, na forma do paper submetido (in press).
Também foram obtidas micropartículas poliméricas de PLGA encapsulando a
Interleucina-2 pelo método modificado de emulsificação e extração de solvente, utilizando
o micromisturador BD2 como processo contínuo de produção da emulsão. A Tabela 12
reúne os resultados de tamanho médio de partícula e a eficiência de encapsulação. O
tamanho médio de partículas, d(4,3), obtido foi reduzido pela metade do tamanho médio das
partículas de IL-2 produzidas pelo método convencional, porém, a distribuição mostrou-se
mais ampla, com span > 2. Quanto à eficiência de encapsulação da IL-2 nestas partículas,
esta foi da mesma ordem de grandeza das partículas obtidas pelo método convencional, ou
seja, da ordem de 80%.
Roseane Maria Ribeiro Costa
93
Tabela 12. Características físico-químicas das micropartículas de PLGA com IL-2 através
do micromisturador BD2.
Micropartícula
s por BD2
d(4,3)
μm
d(v, 0.1)
μm
d(v, 0.5)
μm
d(v, 0.9)
μm
Span
μm
Eficiência de
Encapsulação (%)
Mrh-IL2 7,6 1,6 9,1 26,4 2,7 84
d(4,3): Diâmetro médio em volume d(v, 0.1): Diâmetro da partícula correspondente a 10% da distribuição acumulada d(v, 0.5): Diâmetro da partícula correspondente a 50% da distribuição acumulada d(v, 0.9): Diâmetro da partícula correspondente a 90% da distribuição acumulada Span: Medida indireta da dispersão ou largura da distribuição granulométrica, igual a [d(v, 0.9) - d(v, 0.1)]/ d(v, 0.5)
Para a produção de micropartículas biodegradáveis de PLGA contendo a albumina de
soro bovina foram selecionados os micromisturadores BD1 e ED2 e para obtenção de
micropartículas com Interleucina-2 foi selecionado o micromisturador BD2, que
apresentou melhor eficiência de mistura.
Roseane Maria Ribeiro Costa
94
7. PAPER ACEITO PARA PUBLICAÇÃO NO PERIÓDICO POWDER
TECHNOLOGY (IN PRESS)
PREPARATION OF PROTEIN-LOADED PLGA MICROSPHERES BY AN
EMULSION / SOLVENT EVAPORATION PROCESS EMPLOYING LTCC
MICROMIXERS
R. M. Ribeiro-Costa 1, Márcio Rodrigues da Cunha 2, M. R. Gongora-Rubio 2,
P. Michaluart-Júnior3, M. I. Ré 1
1 Institute for Technological Research of São Paulo, CTPP, Laboratory of Chemical
Processes and Particle Technology, Av. Prof. Almeida Prado N° 532, Cidade Universitária,
CEP 05508-901 - São Paulo/SP, Brazil
2 Institute for Technological Research of the São Paulo State, CTPP, Microfluidics
Laboratory. *3 Hospital of the Clinics of the Faculty of Medicine of the University of São Paulo
Abstract
This study presents the possibilities offered by microfluidics structures for the
production of polymeric microspheres, using a process based upon the production of an
emulsion. LTCC (Low Temperature Co-fired Ceramics) micromixers have been used for
the preparation of polymeric microspheres. The effect of the geometry of the micromixers
have been studied, with a specific focus upon the size of the microspheres, as well upon the
control release properties of a model protein loaded within these microspheres.
Keywords: LTCC; Micromixer; Microchannel; Microspheres; Protein release
*Corresponding author: Tel./fax: + 55 11 37674739/+ 55 11 37674052 E-mail adress: [email protected] (Maria Inês Ré)
Roseane Maria Ribeiro Costa
95
1. Introduction
Microfabrication technologies have played a fundamental role in the development of
microfluidics devices that recently have influenced chemical micro processing, enabling
miniaturization of operations like mixing, dispersing, extracting, and heat transfer, among
others. An alternative to classical mixing processes are micromixers [1,2,3], which in
particular present a wide range of applications in industry and research [4].
Mixing of two fluids using a micromixer mainly relies on diffusion, which can be a
long-lasting process. This can be improved with active or passive micromixers. With active
micromixers, the flow is modified by an external disturbance source, although for passive
micromixers the mixing is improved through flow disturbance obtained by increasing the
surface of contact between the two fluids by generating chaotic movements and bi or tri-
dimensional velocity fields using as a basic idea the change of channels shape, length and
direction [5].
LTCC (Low Temperature Co-fired Ceramics) technology, as described in literature
[6,7,8,9], is a good option for microfluidic devices with several advantages when compared
with other microfabrication technologies. The Green tapes are glass-ceramic composite
materials. The usual composition also includes a glass frit binder to lower processing
temperature as well as rendering the material compatible with thick film technology, and
an organic vehicle for binding and viscosity control. One of the important features of green
tape technology is the possibility of fabricating (3D) three-dimensional structures using
multiple layers of green tapes. The processing of the green ceramic tapes is usually done in
three basic steps [Erro! Indicador não definido.]: 1) Patterning of individual layers with
via holes, resistors, conductors, dielectric pastes, depending on application; 2) Collation
and lamination of the tapes under pressure and temperature; 3) Co-firing of the entire
laminate to sinter the material.
In this paper, a microfluidic approach to prepare PLGA microspheres by means of
LTCC passive micromixers integrated to an emulsion/solvent evaporation process is
presented. Passive micromixers have been selected, considering their simple and less
expensive construction. LTCC micromixers are integrated to the encapsulation process in
two steps: in a first step the mixing of two immiscible liquids to generate an emulsion.
Secondly, sequential phenomena such as solvent diffusion and crystallisation generate
solid particles such as polymeric microspheres for drug delivery.
Roseane Maria Ribeiro Costa
96
2. Experimental
2.1. Materials
Poly (D,L lactic-co-glycolic) acids (PLGA, 50:50, inherent viscosity 0.83 dL/ g) from
PURAC Biochem (Netherlands). Bovine serum albumin (BSA) and polyvinyl alcohol
(PVA, hydrolyzed 88%, Mw range 13 000-17 000g/mol) from Sigma-Aldrich (St Louis,
USA). Dichloromethane (DCM) and all other chemicals reagents were of analytical grade
and used as received.
2.2. Micromixers
In this work, eight micromixers (Fig.1) were manufactured in LTCC:
- One micromixer with a straight channel (straight channel micromixer DD1) and five
micromixers with different 2D and 3D configurations:
Zig-zag 2D micromixer (DD2)
Square wave 2D-XY micromixer (DD3)
Square wave 3D-XZ micromixer (ED1)
Zig-zag 3D micromixer (ED2)
Serpentine 3D micromixer (ED3)
For comparison these structures have the same cross sections of 600 μm x 600 μm and the
same effective channel length of 48 mm.
- Two micromixers 3D configurations cross sections of 1020μmx400μm, effective channel
lengths of 77 mm (Serpentine 3D micromixer BD1) and 172 mm (Serpentine 3D
micromixer BD2).
2.3. Microspheres preparation by emulsion/solvent evaporation using mechanical
agitation method
Microspheres were prepared by a w1/o/w2 emulsion technique [10,11]. A primary
emulsion (w1/o) of aqueous solutions of BSA (1 mL; 4,5% w/v) and polymer solution of
PLGA in dichloromethane (10 mL; 45% w/v) was prepared by mechanical agitation
(Heidolph DIAX 900, Germany) at 7220 rpm for 30 seconds in an ice bath, corresponding
to a protein load of 9% wt. The secondary emulsification of w1/o in 50 mL of a 3% w/v
solution of polyvinyl alcohol (w2 phase) was carried under mechanical agitation at 7220
rpm for 1 minute. The w1/o/w2 emulsion was maintained under agitation at 500 rpm for 4
Roseane Maria Ribeiro Costa
97
hours to evaporate the dichloromethane. The microspheres were collected by
centrifugation, washed three times and then vacuum filtered. The residue was left
overnight in a desiccator and the microspheres were obtained as a dry powder.
Fig. 1. Micromixers geometry.
2.4. Microspheres preparation by emulsion/solvent evaporation using micromixers
The first emulsion (w1/o) was prepared as previously described and then transferred
into a 20 mL glass syringe. By means of a HPLC pump (Alliance), a 3% w/v solution of
polyvinyl alcohol (w2 phase) was fed into one of the two inlets of the micromixer, while
the previously prepared w1/o was fed into the other inlet of the micromixer using a syringe
pump (PHD 4400 Hpsi, Harvard Apparatus). Upon contact between the w1/o and the w2
phase, nascent microdroplets were formed inside the micromixer. For final hardening and
product collection, the same experimental procedure described above for the classical
DD2
DD3
DD1
ED2
ED1
ED3
BD1
BD2
Roseane Maria Ribeiro Costa
98
emulsion/solvent evaporation process was utilized. Fig. 2 shows the experimental set-up
for the PLGA microspheres production using passive micromixers.
Fig. 2. Experimental set-up for emulsion/solvent evaporation process with LTCC
micromixers.
2.5. Particles characterization
Size and morphology. A particle analyzer (Coulter Counter LS230) was used to determine
the particles size distribution of the resulting microspheres by laser light diffraction.
Samples of dried PLGA microparticles were dispersed in a 0.01%w/v solution of Tween
80 and ultrasonicated for 10 minutes. Calculated parameters were: volume mean diameter
(d(4,3)), span index which was calculated by (d(v,0.9) - d(v,0.1)) / d(v, 0.5 )) where d(v,0.9), d(v, 0.5 )
and d(v,0.1) are respectively the particle diameters determined at the 90th, 50th and 10th
percentile of particles undersized.
The shape and surface morphology of microspheres were determined from
micrographs taken with a scanning electron microscope (JEOL 5200M). Samples were
sputtered-coated with a thin layer of Au and examined at an intensity of 10 kV, using
various magnifications.
Encapsulation efficiency. The amounts of BSA encapsulated into microspheres were
determined by an extraction method, involving the dissolution of the polymer in an organic
solvent and further extraction of the protein into an aqueous medium [12]. Microspheres
(10 mg) were dissolved in 1 mL DCM and sonicated for 20 minutes. After 1 mL Milli-Q
water purification system (Millipore, USA) was added to extract the BSA. The mixture
Roseane Maria Ribeiro Costa
99
was centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes to separate the organic and aqueous phases.
After centrifuging, the aqueous solution was analyzed using protein assay by Bradford
method with GBC – Cintra 10 UV-Visible Spectrophotometer [13]. All experiments were
performed in triplicate and the encapsulation efficiency was expressed in percentage as the
ratio of the amount of BSA extracted from the microspheres to the amount of BSA
employed for the preparation of the microparticles.
In vitro BSA release. The in vitro release profile of BSA from microspheres was
determined according to Ref. [14]. Microspheres (10 mg) were placed in eppendorf tubes
and incubated in 1 mL release medium phosphate-buffered saline (PBS, pH 7,4) at 37oC
and under agitation at 220 rpm/min. At predetermined time intervals, the suspension of
microspheres was centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes. The supernatant (1 mL) was
withdrawn and replaced with 1 mL fresh release medium. The amount BSA released was
measured in the supernatant by Bradford method and was expressed in percentage as
fraction of the total BSA content.
3. Results and discussion
3.1. Influence of micromixer geometry and flow rate of mixed fluids on the microspheres
size
Initially, the experiments were conducted with eight different LTCC microfluidic
structures to characterize the effect of the micromixer geometry and the total flow of mixed
fluids (w1/o and w2 emulsion phases) on the PLGA microparticles size. A total volumetric
flow rate of mixed fluids of 1.1 or 2.2 l/h was utilized for the experiments, with a ratio
between the emulsion phases of 1:5 (w1/o/ w2).
In a second series, two micromixers were used for BSA encapsulation as a model
protein. In each series, one process parameter (micromixer geometry) was varied while the
remaining parameters were kept constant. The BSA loaded microparticles were
characterized with respect to the particles size, the surface morphology, the encapsulation
efficiency and the in vitro drug release.
Table 1 shows the particles size range for PLGA microspheres (without BSA)
produced by the emulsion/solvent evaporation method employing the eight LTCC
micromixers presented in Fig. 1. All resulting particles size distributions exhibited a
practically monomodal shape. SEM micrographs of the PLGA microspheres show that
they are spherically shaped as illustrated in Fig. 3.
Roseane Maria Ribeiro Costa
100
Table 1. Particles size range for PLGA microspheres (without BSA) produced by the
emulsion/solvent evaporation method, employing different LTCC microfluidics structures.
(a) (b)
Fig. 3. SEM micrographs (750x) of PLGA microspheres generated by emulsion/solvent
evaporation process, with a LTCC micromixer (BD1) at different flow rates: a) 1.1 l/h; b)
2.2 l/h.
PLGA Microspheres
d(4,3) μm d(v, 0.1) μm d(v, 0.5) μm d(v, 0.9) μm Span
BD1a 14.7 2.0 22.0 39.7 1.7 BD1b 9.9 1.5 13.6 26.1 1.7 BD2a 6.0 1.3 7.3 20.6 2.7 BD2b 4.6 1.1 5.8 13.3 2.1 DD1a 36.7 16.6 45.5 86.2 1.5 DD1 b 33.5 14.7 41.0 80.3 1.5 DD2a 26.0 9.9 35.2 63.0 1.5 DD2b 20.4 5.6 24.5 56.8 2.0 DD3a 33.6 15.8 42.1 74.0 1.3 DD3b 19.6 4.2 26.4 54.2 1.8 ED1a 26.7 8.5 36.0 70.0 1.7 ED1b 9.0 1.4 11.1 39.2 3.3 ED2a 23.7 8.7 31.1 57.4 1.5 ED2b 9.0 1.6 11.4 32.8 2.7 ED3a 30.8 15.5 38.6 61.9 1.1 ED3b 9.7 1.7 11.6 38.1 3.1
Roseane Maria Ribeiro Costa
101
Considering that hydraulic diameter, effective length and flow input are equal for
LTCC micromixers DD1, DD2, DD3, ED1, ED2 and ED3, it is possible to evaluate their
mixing quality by observing the particle size distributions of the polymeric microspheres
generated with these devices.
Particles size distribution can be analyzed using two parameters, mean diameter d(4,3)
and a polidispersity index, span. The results show that the LTCC micromixers could
generate PLGA microspheres with mean diameter d(4,3) from 4.7 to 36.7 µm and span
variation from 1.1 to 3.3.
When comparing 2D micromixers performance (DD2 and DD3) at the same
operating total flow rate at 1.1 l/h, the zig-zag micromixer (DD2) generated smaller
particle sizes than the square-wave 2D-XY (DD3). On the other hand, when comparing 3D
devices performance (ED1, ED2 and ED3), the serpentine micromixer ED2 generated
smaller particle sizes than those obtained with ED1 or ED3. In most experiments, the
increase of the total volumetric flow rate of mixed fluids from 1.1 to 2.2 l/h led to a
reduction on particle size, mainly for 3D structures.
Similar results were obtained with the two other LTCC micromixers, BD1 and BD2,
which have larger cross sections (1020µm x 400µm) and longer effective channel lengths
(77mm and 172mm, respectively for BD1 and BD2). Moreover, it seems that the longer
channel (BD2) could enhance mixing, allowing the generation of smaller particles,
although with a tendency to larger dispersion indexes (span). Therefore, depending on
channel geometry there is a flow dynamics that influences the generation of small particles,
or particles with narrow size dispersion.
3.2. Influence of the microencapsulation process with micromixers on the properties of
the BSA loaded-PLGA microspheres
In a second series, PLGA microspheres loaded with a model protein, bovine serum
albumin (BSA), were prepared using two of the LTCC micromixers tested in the first
series of experiments: 1) Zig-zag 3D micromixer (ED2), cross section of 600 μm x 600
μm, effective channel length of 48 mm; 2) Serpentine 3D micromixer (BD1), cross section
of 1020 μm x 400 μm, effective channel length of 77mm. A total volumetric flow rate of
mixed fluids of 2.2 l/h was fixed for the experiments and the same ratio between the
emulsion phases of 1:5 (w1/o: w2) was also kept constant.
Roseane Maria Ribeiro Costa
102
Particles size and encapsulation efficiency. Table 2 shows the particles size range for
BSA loaded PLGA microparticles produced with the LTCC micromixers ED2 and BD1, in
comparison to the particles size range of a similar product obtained by the “standard”
process, e.g., the emulsion/solvent evaporation method previously studied to generate the
same range of particle size.
The mean diameter and particle size distributions seem to be little influenced by the
geometry of the micromixers employed, BD1 and ED2, both of the same magnitude of
particle size generated by the “standard” process. However, the BSA loaded
microparticles (Table 2) are larger than the unloaded microparticles (Table 1) obtained
with the same micromixers and the total flow rate of 2.2 l/h. According to the d(v, 0.1) and
d(v, 0.9) diameters, most of the volume weighted particle diameters of the PLGA
microparticles obtained from the “standard “ process and with the micromixer ED2 ranged
from 18-19 µm to 53-56 µm, with a span values lower than 2, very appropriate for drug
delivery systems. PLGA microparticles generated with the micromixer BD1 are slightly
larger, ranging from 23 to 65 µm, span of 1.8.
Table 2 also shows that BSA encapsulation efficiencies were highly satisfactory in
the range of 61% to 75%. Batch-to-batch reproducibility of the encapsulation efficiency
presented standard deviations of 2-5%, comparable to variations of same magnitude
reported in the literature [2].
Table 2. Properties of BSA loaded-PLGA microspheres generated by emulsion/ solvent
evaporation (under mechanical agitation and with micromixers as mixing elements).
BSA release from the microspheres. Kinetic release profiles of BSA loaded-PLGA
microspheres produced with the micromixers BD1 and ED2 showed a similar biphasic
behavior (Fig. 4), comparable to that obtained for microspheres obtained by the ”standard
process”: - a burst release of BSA within the first 5 hours of 26% for ED2, 39% for BD1
Particles size PLGA Microspheres d(4,3) μm d(v, 0.1)
μm
d(v, 0.5)
μm
d(v, 0.9)
μm
Span Encapsulation efficiency (%
w/w)
Micromixer BD1 23.2 5.1 33.1 65.3 1.8 75.0 ± 5.3
Micromixer ED2 17.8 3.5 24.4 53.1 2.0 61.0 ± 3.9
‘Standard’
process
19.3 4.6 27.3 56.4 1.9 71.7 ± 1.7
Roseane Maria Ribeiro Costa
103
and 32% for the standard process, followed by a subsequent slower release phase observed
during the following 12 days (720 h) of incubation. At the end of this period, 41%, 57%
and 49% of BSA was released, for PLGA microspheres prepared with the micromixers
ED2, BD1 and by the standard process, respectively (data not shown in Fig. 4).
0
20
40
60
80
0 50 100 150 200 250
Time (hours)
% C
umul
ativ
e B
SA R
elea
se
Fig. 4. In vitro release profile of BSA from (■) micromixer ED2, (□) micromixer BD1 and
(○) mechanical agitation PLGA microspheres generated by emulsion/solvent evaporation.
4. Conclusions
We could see that the LTCC micromixers proved to produce protein-loaded PLGA
microspheres with encapsulation efficiencies satisfactory in the range of 61 to 75% and
narrow particle size dispersion. The results show that the two immiscible liquids were well
mixed and the size dispersion could be well controlled suggesting that LTCC micromixers
are suitable for the continuous production of polymeric protein delivery systems.
Acknowledgements
The authors are grateful to CNPq, CAPES and FAPESP for research funds
supporting this work.
Roseane Maria Ribeiro Costa
104
References
[1] S. Freitas, B. Rudolf, H.P. Merkle, B. Gander, Flow-through ultrasonic emuslfication combined with static micromixing for aseptic production of microspheres by solvent extraction, Eur. J. Pharm. Biopharm. 61 (2005) 181-187.
[2] S. Freitas, H.P. Merkle, B. Gander, Microencapsulation by solvent extraction/evaporation: reviewing the state of the art of microsphere preparation process technology, J. Control. Release 102 (2005) 313-332.
[3] C. Wischke, D. Lorezen, J. Zimmermann, H.H. Borchet, Preparation of protein loaded PLGA microparticles for the antigen delivery to dendritic cells using a static micromixer, Eur. J. Pharm. Biopharm. 62 (2006) 247-253.
[4] N.T. Nguyen and WU Z.G., Micromixers - a review, Journal of Micromechanics and Microengineering 15 (2005) R1-R16.
[5] S. Freitas, G. Hielscher, H. P. Merkle, B. Gander, Continuous contact- and contamination-free ultrasonic emulsification- a useful tool for pharmaceutical development and production, Ultrasonics Sonochemistry, 13 (2006) 76-85.
[6] M. R. Gongora-Rubio., J. J. Santiago-Aviles, L. Sola-Laguna, P. Espinosa-Vallejos, Overview of low temperature co-fired ceramics tape technology for mesosystem technology, Sensors and Actuators A, 89, (2001) 222-241.
[7] M. R. Gongora-Rubio, M. R. Cunha, A. P. O. Costa, R. M. Ribeiro-Costa, M. I. Ré, Microfluidic devices for micro & nanoparticle fabrication using LTCC technology, Proc. SHF - Microfluidics, Toulouse (2006) SHF 99.
[8] M.R. Gongora-Rubio, M.R. Cunha, A. P. O. Costa, M. I. Ré, Preparation of Polymeric Microspheres by an Emulsification/Solvent Diffusion Process Employing LTCC Microfluidic Structures, Proc. IMAPS/ACerS 1st International Conference and Exhibition on Ceramic Interconnect and Ceramic Microsystems Technologies (CICMT), Baltimore-Maryland (2005) 174-181.
[9] M. R. Gongora-Rubio, M. R. Cunha, A. P. O. Costa, R. M. Ribeiro-Costa, M. I. Ré. LTCC Microfluidic Structures for Micro & Nanoparticle Preparation, Proc. EUROSENSORS XIX Conference, Barcelona (2005).
[10] R. A. Jain, The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices, Biomaterials, 21(2000) 2475-2490.
[11] H. Tamber, P. Johansen, H. P. Merkle, B. Gancer, Formulation aspects of biodegradable polymeric microspheres for antigen delivery, Adv. Drug Delivery Reviews, 57 (2005) 357-376.
[12] U. Bilati, E. Allémann, E. Doelker, Strategic approaches for overcoming peptide and protein instability within biodegradable nano- and microparticles, Eur. J. Pharm. Biopharm., 59 (2005) 375-3880.
[13] D. A. M. Zaia, C. T. B. V. Zaia, J. Lichtig, Determinação de proteínas totais via espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes, Química Nova, 21(6) (1998) 787-793.
[14] B. B. C. Youan, T. L. Jackson, L. Dickens, C. Hernandez, G. Owusu-Ababio, Protein release profiles and morphology of biodegradable microcapsules containing an oily core, J. Control. Release, 76 (2001) 313-326.
Roseane Maria Ribeiro Costa
105
CONCLUSÃO GERAL
Roseane Maria Ribeiro Costa
106
8. CONCLUSÃO GERAL
Neste projeto cuja principal meta foi o desenvolvimento de micropartículas de PLGA
encapsulando a Interleucina-2 como uma estratégia farmacêutica para o tratamento de
pacientes com carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço, pode-se elencar as
principais conclusões:
Microesferas de PLGA contendo recombinante humano de interleucina-2, livre e
associado aos agentes estabilizantes polietilenoglicol e albumina de soro bovina,
apresentaram elevada taxa de eficiência de encapsulação e perfil cinético de liberação
controlada de IL-2. Frente ao estado da arte, obteve-se uma otimização da formulação, ou
seja, a meta do desenvolvimento tecnológico da formulação, que foi um dos desafios desse
projeto, foi alcançada.
Após a incorporação em microesferas de PLGA, a IL-2 manteve sua propriedade de
estimulação de proliferação de linfócitos in vitro.
Os cuidados de assepsia da metodologia utilizada na produção das micropartículas
foram satisfatórios para realização do ensaio in vivo.
Os resultados obtidos mostraram que o tratamento (microesferas sem ativo,
microesferas de PLGA contendo IL-2 e Proleukin®) aplicado em camundongos C57Bl/6
portadores de melanoma B16F10 não foi capaz de aumentar a taxa de sobrevivência dos
animais. Acredita-se que a dimensão inicial da neoplasia tenha sido demasiadamente
grande (em relação ao tamanho corpóreo do animal portador) quando a terapia foi iniciada,
podendo ter mascarado algum possível efeito terapêutico.
Frente ao carcinoma de Ehrlich em camundongos C57Bl/6, as micropartículas de
PLGA apresentaram uma tendência para resposta anti-tumoral em relação ao Proleukin®.
Porém, a falta de impacto do tratamento pode ter ocorrido devido à rápida evolução do
tumor e ao curto tempo de duração do experimento para observação da eficácia dessa nova
estratégia terapêutica.
Dispositivos microfluídicos representam uma alternativa tecnológica para inovação
no método de emulsificação/extração e evaporação de solvente para a produção de
micropartículas poliméricas, sendo que a eficiência de mistura para otimização da etapa de
emulsificação dependente da geometria do dispositivo e das condições hidráulicas do
sistema. Esses dispositivos microfluídicos podem ser utilizados como uma boa estratégia
tecnológica para inovação no processo de produção de partículas assépticas, de modo
contínuo e com boa reprodutibilidade.
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107
SUGESTÕES
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9. SUGESTÕES PARA CONTINUIDADE DAS ATIVIDADES
9.1. Sugestões para Desenvolvimento Tecnológico
Novas formulações de micropartículas com PLGA podem ser obtidas através da
inclusão de outras variáveis de estudo que afetam as características de encapsulação e
liberação de IL-2 como: PLGA de diferentes razões monoméricas (50:50 e 85:15);
variação da concentração dos agentes estabilizantes; adição de outros agentes co-
encapsulantes como, por exemplo, a proteína de soro humano (HSA).
Microencapsulação de um fator de crescimento junto com Interleucina-2, visando
investigar um possível efeito de sinergismo na formulação para recrutar um maior número
de células NK (Natural Killer) para o micro-ambiente tumoral.
Prosseguir a exploração do uso dos misturadores microfluídicos como ferramenta
tecnológica para implementação da produção de micropartículas poliméricas pelo processo
contínuo, controlando as características das partículas. Comparar as características físico-
quimicas e biológicas das partículas obtidas pelo processo modificado pela introdução de
micromisturadores com o processo convencional.
9.2. Sugestões para Continuidade dos Ensaios de Testes de Conceitos
Adequação dos modelos de tumores experimentais estudados, melanoma B16F10 e
carcinoma de Ehrlich, com ajuste da dose de células tumurais para provocar uma evolução
mais lenta do tumor que possa favorecer uma melhor investigação do potencial dessa nova
estratégia terapêutica.
Administrar diferentes doses da Interleucina-2, em sua forma livre e
microencapsulada, na presença de um agente co-encapsulante (albumina de soro bovina)
para avaliar os efeitos do tratamento.
Investigar as atividades biológicas da Interleucina-2, em sua forma livre e
microencapsulada, após ajuste dos modelos tumorais, e intensificar a obtenção de dados
experimentais como, por exemplo, com a atividade das células NK (Natural Killer).
Avaliar o tempo de sobrevida dos animais após adequação dos modelos dos
tumores experimentais, melanoma B16F10 e carcinoma de Ehrlich.
Roseane Maria Ribeiro Costa
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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110
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H,; POBER, J.S. Cellular and molecular immunology. 4. ed. Philadelphia: W.B.Saunders, 553, 2000.
AKBUGA, J.; OZBAS-TURAN, S.; ERDOGAN, N. Plasmid-DNA loaded chitosan microspheres for in vitro IL-2 expression. Eur. J. of Pharm. And Biopharm., 58, 501-507, 2004.
ALMEIDA, V., L.; LEITÃO, A.; REINA, L. C. B.; MONTANARI, C. A.; DONNICIC. L. Câncer e agentes antineoplásicos ciclo-celular específicos e ciclo-celular não específicos que interagem com o dna: uma introdução, Quim. Nova, 28 (1), 118-129, 2005.
ALONSO, M. J.; TOBÍO, M.; GUO, Y.; McIVER, J. A microencapsulated system based on a PLGA/Poloxamer blend as a tetanus toxoid delivery vehicle. 2nd World Meeting APGI/APV, 491-492, 1998.
AMAR, A.; ORTELLADO, A.K.; FRANZI, S.A.; CURIONI. O.A. Sobrevida após recidiva intratável do carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. Rev. Col. Bras. Cir., 32 (5), 267-269, 2005.
ANDREADIS, S. T. and GEER, D. J. Biomimetic approaches toprotein and gene delivery for tissue regeneration. Trends in Biotechnology 24 (7), 331-337, 2006.
ANTONIA, S.; MULE, J. J.; WEBER, J. S. Current developments of immunotherapy in the clinic. Current Opinion in Immunology, 16, 130–136, 2004
ATKINS, M. B.; KUNKEL, L.; SZNOL, M.; ROSENBERG, S.A. High-dose recombinant interleukin2 therapy for in patients with metastic melanoma: long-term survival update. Cancer J. Sci. Am., 6 suppl 1, S11-4, 2000.
ATKINS, M. B.; LOTZE, M. T.; DUTCHER, J. P.; FISHER, R. I.; WEISS, G.; MARGOLIN, K.; ABRAMS, J.; SZNOL, M.; PARKINSON, D.; HAWKINS, M.; PARADISE, C.; KUNKEL, L.; ROSENBERG, S. A. High-dose recombinant interleukin2 therapy for patients with metastic melanoma: analysis of 270 patients treated between 1985 and 1993. J. Clin. Oncol., 17(7), 2105-2116, 1999.
BEEBE, D. J. "Passive Mixing in a Three-Dimensional Serpentine Microchannel," Journal of Microelectromechanical Systems, 9(2), 190-197, 2000.
BEN-ELIYAHU, S.; PAGE, G.G.; SCHLEIFER, S.J. Stress, NK cells, and cancer: Still a promissory note. Brain Behav Immun., 21(7),:881-887, 2007.
BERKLAND, C.; KIM, K. K.; PACK, D. W. Fabrication of PLG microspheres with precisely controlled and monodisperse size distributions, Journal of Controlled Release, 73 (1), 59-74, 2001.
BLANCO, D. and ALONSO, M. J. Protein encapsulation and release from poly(lactide-co-glycolide) microspheres: effect of the protein and polymer properties and of the co-
Roseane Maria Ribeiro Costa
111
encapsulation of surfactants. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 45, 285-294, 1998.
BLANCO, M. D. ; SASTRE R. L.; TEIJÓN;C.; OLMO, R.; TEIJÓN, J. M.. 5-Fluorouracil-loaded microspheres prepared by spray-drying poly(D,L-lactide) and poly(lactide-co-glycolide) polymers: Characterization and drug release. J. Microencapsulation, 22(6), 671–682, 2005.
BLANCO-PIETRO, M. J.; FATTAL, E.; PUISIEUX, F.; COUVAEUR, P. Nouvelles approches pour encapsulation de peptides au sein de microspheres de PLG. Annales Pharmaceutiques Françaises, 56(6), 256-263, 1998.
BOURY, F.; IVANOVA, T.; PANAIOTOV, I. Dynamic properties of (DL-lactide) and polyvinyl alcohol monolayers at the air/ water and dichlorometane air/ water interfaces. Journal Colloids Interfaces Science, 169, 380-392, 1995.
CADÉE, J.A.; de GROOT, C.J.; JISKOOT, W.; den OTTER, W.; HENNINK, W.E. Release of recombinant human interleukin-2 from dextran-based hydrogels. Journal of Controlled Release, 78, 1-13, 2002.
CAPPUCCIO, A.; CASTIGLIONE, F.; PICCOLI, B. Determination of the optimal therapeutic protocols in cancer immunotherapy. Math Biosci., 209(1):1-13, 2007.
CARRASQUILLO, K. G.; STANLEY, A. M.; APONTE-CARRO, J. C.; DE JÉSUS, P.; COSTANTINO, H.R.; BOSQUES, C. J.; GRIEBENOW, K. Non-aqueous encapsulation of excipient-stabilized spray-freeze dried BSA into poly(lactide-co-glycolide) microspheres results in release of native protein. Journal of controlled Release, 76, 199-208, 2001.
CHEN, L.; APTE, R.N.; COHEN, S. Characterization of PLGA microspheres for the controlled delivery of IL-1α for tumor immunotherapy. Journal of Controlled Release, 43 (2-3), 261-272, 1997.
CHEN, L., REMONDETTO, G. E.; SUBIRADE, M. Food protein-based materials as nutraceutical delivery systems. Trends in Food Science & Technology, 17, 272-283, 2006.
CLAYMAN G. L.; EL-NAGGAR, A. K.; LIPPMAN, S. M.; HENDERSON, Y. C.; FREDERICK, M.; MERRIT, J. A.; ZUMSTEIN, L. A. Adenovirus mediated p53 gene transfer in patients with advanced recurrent head and neck squamous cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 16(6):2221-32, 1998.
COLOMBO, A. M. P. and TRINCHIERI B, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine & Growth Factor Reviews, 13, 155–168, 2002.
CROTTS, G.; SAH, H.; PARK, T. G. Adsorption determines in vitro protein release rate from biodegradable microspheres: quantitative analysis of surface area during degradation. Journal of Controlled Release, 47, 101-111, 1997.
CUNHA, M.R. Desenvolvimento de misturadores microfluídicos para fabricação de micro-esferas poliméricas. Dissertação de Mestrado em Engenharia Elétrica, Universidade de São Paulo, USP, 2006.
Roseane Maria Ribeiro Costa
112
DADIAN, G.; RICHES, P.G.; HENDERSON, K.; MACLENNAN, K.; LORENTZOS, A.; MOORE, J.; HOBBS, A.R.; GORE, M.E. Immune changes in peripheral blood resulting from locally directed interleukin-2 therapy in squamous cell carcinoma of the head and neck. Oral Onco. Eur. J. Cancer, 29B (1), 29-34, 1993.
DAI, C.; WANG, B.; ZHAO, H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 41, 117-120, 2005.
DASGUPTA, S.; TRIPATHI, P. K.; QIN, H.; BHATTACHARYA-CHATTERJEE, M.; VALENTINO, J.; CHATTERJEE, S. K. Identiifcation of molecular targets for immunotheraphy of patients with head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology, 42, 306-316, 2006.
DASS, C. R. and CHOONG, P. F. M. Carrier-mediated delivery of peptidic drugs for cancer therapy. Peptides, 27, 3020-3028, 2006.
DATTA, A.; MANDAL, D.; PAL, S.K.; BHATTACHARYYA, K. Intramolecular charge transfer processes in confirmed systems, nile red in reverse micelles. J. Phys. Chem. B, 101, 10221-10225, 1997.
DAUGHERTY, A. L. and MRSNY, R. J. Formulation and delivery issues for monoclonal antibody therapeutics. Advanced Drug Delivery Reviews, 58, 686-706, 2006.
DICKSON, J.L. and CUNNINGHAM, D. Systemic treatment of gastric cancer. Eur J Gastroenterol Hepatol. Mar;16(3), 255-63, 2004.
DIWAN, M. and PARK, T.G. Pegylation enhances protein stability during encapsulation in PLGA microspheres. Journal of Controlled Release, 73, 233-244, 2001.
DIWAN, M. and PARK, T.G. Stabilization or recombinant interferon-α by pegylation for encapsulation in PLGA microspheres. International Journal of Pharmaceutics, 252, 111-122, 2003.
DONG, Y. and FENG, S.S. Poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PLGA) nanoparticles prepared by high pressure homogenization for paclitaxel chemotherapy, Int. J. Pharm.342, 208–214, 2007.
EARL, H. and IDDAWELA, M. Epirubicin as adjuvant therapy in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 4(2),189-95, 2004.
EGILMEZ, N. K.; JONG. Y. S.; SABEL, M.; JACOB, J. S.; MATHIOWITZ, E.; and BANKERT, R. B. In Situ Tumor Vaccination with Interleukin-12-Encapsulated Biodegradable Microspheres: Introction of tumor Regression and Potent Antitumor Immnity. Cancer Research 60, 3832-3837, 2000.
ENGELS, B. and UCKERT W. Redirecting T lymphocyte specificity by T cell receptor gene transfer – A new era for immunotherapy. Molecular Aspects of Medicine, 28, 115–142, 2007.
Roseane Maria Ribeiro Costa
113
FÁGÁIN, C.O., Understanding and increasing protein stability, Biochim. Biophys. Acta, 1252, 1 – 14, 1995.
FAISANT, N.; SIEPMANN, J.; BENOIT, J. P. PLGA-based microparticles: evolution of mechanisms and a new, simple mathematical model quantifying drug release. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 15, 355-366, 2002.
FAN, H. and DASH, A. Effect of cross-linking on the in vitro release kinetics of doxorubicin from gelatin implants.Int. J. Pharma., 213, 103–116, 2001.
FECZKO, T.; T´OTH, J.; GYENIS, Comparison of the preparation of PLGA–BSA nano- and microparticles by PVA, poloxamer and PVP J.Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 2007, in press.
FORMARIZ, T. P.; URBAN, M. C. C.; SILVA JÚNIOR, A. A.; GREMIÃO, M. P. D.; OLIVEIRA, A. G. Microemulsões e fases líquidas cristalinas como sistemas de liberação de fármacos. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, 41 (3), 301-313, 2005.
FREITAS, S.; WALZ, A.; MERKLE, H. P.; GANDER, B. Solvent extraction employing a static micromixer: a simple, robust and versatile technology for the microencapsulation of proteins. Journal Microencapsulation, 20, 67-85, 2003.
FREITAS, S.; MERKLE, H. P.; GANDER, B. Microencapsulation by solvent extraction/ evaporation: reviewing the state of the art of microsphere preparation process technology. Journal of Controlled Release, 102, 313-332, 2005.
FRIDMAN, W. H.; and TARTOUR, E. The Use of Cytokines in the Treatment of Solid Tumours. Hematol Cell Ther 39, 105-108, 1997.
FU, Y.; SHYU, S.-S.; SU, F.-H.; YU, P.-C. Development of biodegradable co-poly(D,L-lactic/glycolic acid) microspheres for the controlled release of 5-FU by the spray drying method. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 25, 269-279, 2005.
GEORGE, M. and ABRAHAM, T. E. Polyionic hydrocolloids for the intestinal delivery of protein drugs: alginate and chitosan – review. Journal of Controlled Release, 114, 1-14, 2006.
GIUNCHEDI, P.; CONTI, B.; SCALIA, S.; CONTE, U. In vitro degration study of polyester microspheres by a new HPLC method for monomer release determination. Journal of Controlled Release, 56, 53-62, 1998.
GRAVEKAMP, C. Cancer vaccines in old age. Exp Gerontol., 42(5):441-450, 2007.
GREENWALD, R. B.; YANG, K.; ZHAO, H.; CONOVER, C. D.; LEE, S.; FILPULA, D. Controlled release of proteins from their poly(ethylene Glycol) conjugates: drug delivery systems employing 1,6-elimination. Bijoconjugate Chem., 74, 395-403, 2003.
HAGEMANN, T.; BALKWILL, F.; LAWRENCE, T. Inflammation and Cancer: A Double-Edged Sword. Cancer Cell 12, October 2007.
Roseane Maria Ribeiro Costa
114
HAIDER, M.; MEGEED, Z.; GHANDEHARI, H. Genetically engineered polymers: status and prospects for controlled release. Journal of Controlled Release, 95, 1-26, 2004.
HAUSBERGER, A.G. and DeLUCA, P.P. Characterization of biodegradable poly(D,L-lactide-co-glycolide) polymers and microspheres. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 13(6), 747-760, 1995.
HEUBECK, B.; WENDLER, O.; BUMM, K.; SCHÄFER, R.; MÜLLER-VOGT, U.; HÄUSLER, M.; MEESE, E.; IRO, H.; STEINHART, H. Tumor-associated antigenic pattern in squamous cell carcinomas of the head and neck – analysed by SEREX. European Journal of Cancer, 2006.
HILL, H. C.; CONWAY, Jr, T.F.; SABEL, M. S.; JONG. Y. S.; MATHIOWITZ, E.; BANKERT, R. B.; and EGILMEZ, N. Cancer Immunotherapy with Interleukin 12 and Granulocyte-Macrophage Colony-stimulating Factor-encapsulated Microspheres: Coinduction of Innate and Adaptive Antitumor Immunity and Cure of Disseminated Disease. Cancer Research 62, 7254-7263, 2002.
HILL, H.; SABEL, M.; EGILMEZ, N.; BANKERT, R. B. An in Situ Neoadjuvant Vaccination with IL-12 and GM-CSF in Biodegradable Microspheres with Systemic IL-2 Provides Protection Against Metastatic Disease. Surgical Forum Abstracts, 191 (4S), S19-S20, 2000.
HORA, M. S.; RANA, R. K.; NUMBERG, J. H.; TICE, T. R.; GILLEY, R. M.; HUDSON, M. E. Controlled release of interleukin-2 from biodegradable microspheres. Biotechnology, 8 (8), 755-758, 1990.
HOSAKA, Y.; HIGUCHI, T.; TSUMAGARI, M.; ISHII, H. Inhibition of invasion and experimental metastasis of murine melanoma cells by human soluble thrombomodulin Cancer Letters, 161, 231-240, 2000.
IGARTUA, M.; HERNA´NDEZ, R.M.; ESQUISABEL, A.; GASCO´N, A.R.; CALVO, M.B.; PEDRAZ, J.L. Stability of BSA encapsulated into PLGA microspheres using PAGE and capillary electrophoresis. International Journal of Pharmaceutics, 169, 45–54, 1998.
ITOKAZU, M.; KUMAZAWA, S.; WADA, E.; WENYI, Y. Sustained release of adriamycin from implanted hydroxyapatite blocks for the treatment of experimental osteogenic sarcoma in mice. Cancer Letters, 107, 11–18, 1996.
JACKSON, L.S. and LEE, K. Microencapsulation and the Food-Industry . Food Science and Technology-Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie, 24 (4), 289-297, 1991.
JAIN, R. A. The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices. Biomaterials, 21, 2475-2490, 2000.
JAIN, R. K. Delivery of molecular and cellular medicine to solid tumors.Adv. Drug Deliv. Rev., 46(1-3):149-168, 2001.
Roseane Maria Ribeiro Costa
115
JOHANSEN, P.; MEN, Y.; MERKLE, H. P.; GANDER, B. Revisiting PLA/PLGA microspheres: an analysis of their potential in parenteral vaccination. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 50, 129-146, 2000.
KALLINTERI, P.; ANTIMISIARIS, S. G.; KARNABATIDIS, D.; KALOGEROPOULOU, C.; TSOTA, I.; SIABLIS, D. Dexamethasone incorporating liposomes: an in vitro study of their applicability as a slow releasing delivery system of dexamethasone from covered metallic stents, Biomaterials, 23 (24), 4819-4826, 2002.
KANG, J. and SCHWENDEMAN, S. P. Comparison of the effects of Mg(OH)2 and sucrose on the stability of bovine serum albumin encapsulated in injectable poly(D,L-lactide-co-glycolide) implants. Biomaterials, 23, 239-245, 2002.
KARAHATAY, S.; THOMAS, K.; KOYBASI, S.; SENKAL, C. E.; ELOJEIMY, S.; LIU, X.; BIELAWSKI, J.; DAY, T. A.; GILLESPIE, M. B.; SINHA, D.; NORRIS, J. S.; HANNUN, Y. A.; OGRETMEN, B. Clinical relevance of ceramide metabolism in the phatogenesis of human head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC): attenuation of C18-ceramide in HNSCC tumours correlates with lymphovascular invasion and nodal metastasis. Cancer Letters, In press, 2007.
KIM JH, TALUJA A, KNUTSON K, HAN BAE Y. Stability of bovine serum albumin complexed with PEG-poly(l-histidine) diblock copolymer in PLGA microspheres . Journal of Controlled Release, 109, 86– 100, 2005.
KOBAYASHI, I.; UEMURA, K.; NAKAJIMA, M. Formulation of monodisperse emulsions using submicron-channel arrays. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 296, 285-289, 2007.
KOMENAKA, I.; HOERIG, H.; KAUFMAN, H. L. Immunotherapy for Melanoma. Clinics in Dermatology Y, 22:251–265, 2004.
KONAN, Y. N.; GURNY, R.; ALLÉMANN, E. Preparation and characterization of steriile and freeze-dried sub-200 nm nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics, 233, 239-252, 2002.
KOTEN, J. W.; VAN LUYN, M. J. A.; CADÉE, J. A.; BROUWER, L.; HENNINK, W. E.; BIJLEVELD, C.; DEN OTTER, W. IL-2 loaded dextran microspheres with attractive histocompatibility properties for local IL-2 cancer therapy. Cytokine, 24, 57-66, 2003.
KROEFF, M. O câncer é curável? Revista Brasileira de Cancerologia, 50(1), 5-6, 2004.
KUMAR, N.; RAVIKUMAR, M. N. V.; DOMB A. J. Biodegradable Block Copolymers. Advanced Drug Delivery Reviews, 53, 23-44, 2001.
LAGARCE, F.; GARCION, E.; FAISANT, N.; THOMAS, O.; KANAUJIA, P.; MENEI, P.; BENOIT, J.P. Development and characterization of interleukin-18-loaded biodegradable microspheres. International Journal of Pharmaceutics, 314, 179-188, 2006.
Roseane Maria Ribeiro Costa
116
LAMBERT, W. J.; PECK, K. D. Development of an in situ forming biodegradable poly-lactide-co-glycolide system for the controlled release of proteins. Journal of Controlled Release, 33, 189-195, 1995.
LAMPRECHT, A.; YAMAMOTO, H.; TAKEUCHI H.; KAWASHIMA, Y. Microsphere design for the colonic delivery of 5-fluorouracil Journal of Controlled Release, 90 (3), 313-322, 2003.
LAVI, G.; VORONOV, E.; DINARELLO, C. A.; APTE, R. N.; COHEN, S. Sustained delivery of IL-1Ra from biodegradable microspheres reduces the number of murine B16 melanoma lung metastases. Journal of Controlled Release 123, 123–130, 2007.
LI, B.; LIN, J.; VANROEY, M.; JURE-KUNKEL, M.; JOOSS, K. Established B16 tumors are rejected following treatment with GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy in combination with anti-4-1BB mAb. Clinical Immunology, 125 (1), 76-87, 2007.
LINDSEY, K. R.; ROSENBERG, S. A.; SHERRY, R.M. Impact of the number of treatment courses on the clinical response of patients who receive high-dose bolus interleukin-2. J. Clin. Oncol., 18 (9), 1954-1959, 2000.
LIU, L-S; LIU, S-Q; NG, S. Y; FROIX, M.; OHNO, T.; HELLER, J. Controlled release of interleukin-2 for tumour immunotherapy using alginate/chitosan porous microspheres. Journal Controlled Release, 43, 65-74, 1997.
LIU, R. H.; STREMLER, M. A.; SHARP, K. V.; OLSEN, M. G.; SANTIAGO, J. G.; ADRIAN, R. J.; AREF, H.; BEEBE, D. J. "Passive Mixing in a Three-Dimensional Serpentine Microchannel," Journal of Microelectromechanical Systems, Vol. 9, No. 2, 190-197, 2000.
LIU, R. H., STREMLER, M. A., SHARP, K. V., OLSEN, M. G., SANTIAGO, J. G., ADRIAN, R. J., AREF, H. AND BEEBE, D. J., “Passive Mixing in a Three-Dimensional Serpentine Microchannel,” Journal of Microelectromechanical Systems, Vol. 9, No. 2, 190-197, 2000a.
LIU, X.; SUN, Q.; WANG, H.; ZHANG, L.; WANG, J. Microspheres of corn protein, zein, for an ivermectin drug delivery system. Biomaterials, 26, 109-115, 2005.
LÖB, P.; PENNEMANN, H.; HESSEL, V.; MEN, Y. Impact of fluid path geometry and operating parameters on l/l-dispersion in interdigital micromixers. Chemical Engineering Science, 61, 2959-2967, 2006.
LU, Y.; SEGA, E.; LEAMONA, C. P.; LOW, P. S. Folate receptor-targeted immunotherapy of cancer: mechanism and therapeutic potential. Advanced Drug Delivery Reviews, 56, 1161– 1176, 2004.
MAE, K.; MAKI, T.; HASEGAWA, I.; ETO, U.; MIZUTANI, Y.; HONDA, N. Development of a new micromixer based on split/recombination for mass production and its application to soap free emulsifier. Chemical Engineering Journal, 101, 31–38, 2004.
Roseane Maria Ribeiro Costa
117
MAIA, J.L.; SANTANA, M.H.A.; RÉ, M.I. The effect of some processing conditions on the characteristics of biodegradable microspheres obtained by an emulsion solvent evaporation process. Brazilian Journal of Chemical Engineering, 21(01), 1-12, 2004.
MANOME, Y.; KOBAYASHI, T.;MORI, M.;SUZUKI,R.;FUNAMIZU, N.;AKIYANA, N.; INOUNE, S.; TABATA, Y.; WATANABLE, M. Local delivery of doxorubicin for malignant glioma by a biodegradable PLGA polymer sheet. Anticancer Res. 26(5A), 3371-3326, 2006.
MATTIJSSEN et al. Intratumoral PEG-interleukin-2 therapy in patients with locoregionally recurrent head and neck squamous-cell carcinoma. Ann. Oncol., 5 (10), 957-60, 1994.
MERCK INDEX. Merck & Co., Inc., 20ª edi., 858, 5020, 1996.
MITCHELL, M. S. Immunotherapy as part of combinations for the treatment of cancer. International Immunopharmacology, 3, 1051–1059, 2003.
MOINGEON, P. Cancer vaccines. Vaccine, 19, 1305-1326, 2001.
MURAKAMI, H.; KOBAYASHI, M.; TAKEUCHI, H. AND KAWASHIMA, Y. Preparation of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles by modified spontaneus emulsification solvent diffusion method. International Journal of Pharmaceutics, 187, 143-152, 1999.
NGUYEN, N. T.; WU, Z. “Micromixers – a review”. Journal of Micromechanics and Microengineering, 15 (2), R1-R6, 2005.
OVERWIJK, W.W.; THEORET, M.R.; RESTIFO, N.P. The future of interleukin-2: enhancing therapeutic anticancer vaccines. Cancer J Sci Am, 6 (Suppl 1), S76-S80, 2000.
OZBAS-TURAN, S.; AKBUGA, J.; ARAL, C. Controlled release of interleukin-s from chitosan microspheres. Pharmaceutical Science, 91(5), 1245-1251, 2002.
PÀNIC, S.; LOEBBECKE, S.; TUERCKE, T.; ANTES, J.; BOSKOVIC, D. Experimental approaches to a better understanding of mixing performance of microfluidic devices. Chemical Engineering Journal, 101, 409-419, 2004.
PASETTO L.M,; JIRILLO A.; STEFANI M.; MONFARDINI S. Old and new drugs in systemic therapy of pancreatic cancer. Crit Rev Oncol Hematol, 49(2), 135-51, 2004.
PEPPAS N.A. and KAVIMANDAN N.J. Nanoscale analysis of protein and peptide absorption: insulin absorption using complexation and pH-sensitive hydrogels as delivery vehicles. Eur J Pharm Sci. 29(3-4), 183-97, 2006.
PETERSON, G. L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. Which is more generally applicable. Analytical Biochemistry, 83, 346-356, 1977.
POHLMANN, A. R.; WEISS, V.; MERTINS, O.; SILVEIRA, N. P.; GUTERRES, S. S. Spray-dried indomethacin-loaded polyester nanocapsules and nanospheres: development,
Roseane Maria Ribeiro Costa
118
stability evaluation and nanostructure models, European Journal of Pharmaceutical Sciences, 16 (4-5), 305-312, 2002.
POLETTO, F. Estudo físico-químico de micropartículas compostas por P(HB-HV) e por blendas de P(HB-HV) e PCL contendo fármacos-modelo lipofílicos. Dissertação de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, 2006.
PRIES, R. and WOLLENBERG, B. Cytokines in head and neck cancer. Cytokine & Growth Factor Reviews, 17, 141-146, 2006.
PROKOPOWICZ, M. and PRZYJAZNY, A. Synthesis of sol-gel mesoporous silica materials providing a slow release of doxorubicin. J. Microencaps.; 24(7), 694–713, 2007.
QIN, H.; VALENTINO, J.; FOON, K. A.; CHATTERJEE, S. K. Gene therapy for head and neck cancerr using vaccinia virus expressing IL-2 in a murine model, with evidence of immune suppresion. Molecular Therapy, 4, n. 6, 551-558, 2001.
QVIST, M. H.; HOECK, U.; KREILGAARD, B.; MADSEN, F.; FROKJAER, S. Release of chemical permeation enhancers from drug-in-adhesive transdermal patches, International Journal of Pharmaceutics, 231 (2), 253-263, 2002.
RAFATI, H.; COOMBES, A. G. A.; ADLER, J.; HOLLAND, J.; DAVIS, S. S. Protein-loaded poly(DL-lactide-co-glycolide) microparticles for oral adminstration: formulation, structural and release characteristics. Journal of Controlled Release, 1997.
RÉ, M. I. Microencapsulação: em busca de produtos ‘inteligentes’, Ciência Hoje, 27, 162, 24-29, 2000.
RÉ, M.I. Formulation of Multiparticulate Delivery Systems by Spray Drying In: Cahier de l'AFSIA, Villeurbanne : AFSIA- ESCPE, 20, 147-158. , 2002.
RÉ, M. I. Formulating drug delivery systems by spray drying. Drying Technology, 24, 433–446, 2006.
RESCIGNO, M.; AVOGADRI, F.; CURIGLIANO, G. Challenges and prospects of immunotherapy as cancer treatment. Biochimica et Biophysica Acta, 1776, 108–123, 2007.
ROGERS, S. N.; PABLA, R.; McSORLEY, A.; LOWE, D.; BROWN, J. S.; VAUGHAN, E. D. An assessment of deprivation as a factor in the delays in presentation, diagnosis and treatment in patients with oral oropharyngeal squamous cell carcinoma. Oral Oncology, 43, 648-655, 2007.
ROSCA, I. D.; WATARI, F.; MOTOHIRO U.O. Microparticle formation and its mechanism in single an double emulsion solvent evaporation. Journal of Controlled Release, 99, 271-280, 2004.
ROSENBERG, S.A.; ZHAI Y.; YANG, J.C.; SCHWARTZENTRUBER, D.J.; HWU, P.; MARINCOLA, F.M.; TOPALIAN, S.L.; RESTIFO, N.P.; SEIPP, C.A.; EINHORN, J.H.; ROBERTS, B.; WHITE, D.E. Immunizing patients with metastatic melanoma using
Roseane Maria Ribeiro Costa
119
recombinant adenoviruses encoding MART-1 or gp100 melanoma antigens. J Natl Cancer Inst., 1998.
ROSENBERG, S.A. Biologic Theraphy of Cancer. 3rd Edition. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. 2000.
ROTHENBERG, M.; NAVARRO, M.; BUTTS, C.; BANG, Y.; COX, J.; GOEL, R.; GOLLINS, S.; SIU L.; CUNNINGHAM, D. 3012 ORAL Capecitabine + oxaliplatin (XELOX) vs. 5-FU/LV + oxaliplatin (FOLFOX4) as second-line treatment for patients with metastatic colorectal cancer (MCRC): Phase III trial resultsEuropean Journal of Cancer Supplements, 5, (4), 238-239,2007.
RUAN, G.; FENG, S.; LI, QIU-TIAN. Effects of material hydrophobicity on physical properties of polymeric microspheres formed by double emulsion process. Journal of Controlled Releas, 84, 151-160, 2002.
SAAD-HOSSNE, R. Tumor hepático experimental (VX-2) em coelho: implantação do modelo no Brasil. Acta Cir. Bras., 17 (4), 208-210, 2002.
SAAD-HOSSNE, R.; SAAD-HOSSNE, W.; PRADO, R. G. Efeito da solução aquosa de fenol, ácido acético e glicerina sobre o tumor ascítico de Ehrlich. Estudo experimental in vitro. Acta Cirúrgica Brasileira, 19 (1), 2004.
SAFWAT, A.; AGGERHOM, N.; ROITT, I.; OVERGAAD, J.; HOKLAND, M. Tumour Burden and Interleukin-2 Dose Affect the Interaction Between Low-Dose Total Body Irradiation and Interleukin 2. European Journal of Cancer 40, 1412-1417, 2004.
SAHOO, S. K.; PANYAM, J.; PRABHA, S.; LABHASETWAR, V. Residual polyvinyl alcohol associated with poly (DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles affects their physical properties aned cellular uptake. Journal of Controlled Release, 82, 105-114, 2002.
SAKAI, M. Efeitos do diazepam sobre o crescimento tumoral e imunidade de animais portadores do tumor ascítico de Ehrlich. Dissertação de Mestrado, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), USP-SP, 07 de dezembro de 2004.
SALAZAR-ONFRAY, F.; LO´PEZ, M. N.; MENDOZA-NARANJO; A. Paradoxical effects of cytokines in tumor immune surveillance and tumor immune escape. Cytokine & Growth Factor Reviews, 18, 171–182, 2007.
SAMPATH, P.; HANES, J.; DIMECO, F.; TYLER, B. M.; PARDOLL, D. M.; and BREM, H. Paracrime Immunotherapy with Interleukin-2 and Local Chemotherapy Is Synergistic in the Tretment of Experimental Brain Tumors. Cancer Research 59, 2107-2114, 1999.
SAVA, G. Tumor animal models used for evaluating the antineoplasic activity of platinum coordination complexes. Inorganica Chimica Acta, 137, 39-44, 1987.
SAVA, G.; F. FRAUSIN, M. COCCHIETTO, F. VITA, E. PODDA, P. SPESSOTTO, A. FURLANI, V. SCARCIA AND G. ZABUCCHI Actin-dependent tumour cell adhesion
Roseane Maria Ribeiro Costa
120
after short-term exposure to the antimetastasis ruthenium complex NAMI-A. European Journal of Cancer, 40 (9), 1383-1396, 2004.
SCHMIDT-WOLF, G.D.; SCHMID-WOLF INGO G.H. Cytokines and gene therapy. Immunol Today, 16, 173-175, 1995.
SCHWACH, G.; OUDRY, N.; DELHOMMEB, S.; LÜCK, M.; LINDNER, H.; GURNY, R. Biodegradable microparticles for sustained release of a new GnRH antagonist – part I: screening commercial PLGA and formualtion technologies. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, In Press, 2003.
SHIMIZU, K.; FIELDS, R.C.; GIEDLIN, M.; MULE, J. Systemic administration of interleukin 2 enhances the therapeutic efficacy of dendritic cell-based tumor vaccines. Proc Natl Acad Sci USA, 96, 2268-2273, 1999.
SIEPMANN, J.; FAISANT, N.; AKIKI, J.; RICHARD, J.; BENOIT, J. P. Effect of the size of biodegradable microparticles on drug release; experiment and theory. Journal of Controlled Release, 96, 23-134, 2004.
SINGH, M. and O'HAGAN, D. The preparation and characterization of polymeric antigen delivery systems for oral administration. Advanced Drug Delivery Reviews, 34 (2-3), 285-304, 1998.
SINGH, M.; SINGH, A.; TALWAR, G.P. Controlled delivery of diptheria toxoid using biodegradable poly(d,l-lactide) microcapsules, Pharm. Res., 8, 958– 961, 1991.
SINGH, M.; SINGH, O.; TALWAR, G.P. Biodegradable delivery system for a birth control vaccine: immunogenicity studies in rats and monkeys, Pharm. Res., 12, 1796–1800, 1995.
SMYTH, M.J.; TANIGUCHI, M.; STREET, S.E. The anti-tumor activity of IL-12: mechanisms of innate immunity that are model and dose dependent. J Immunol;165:2665–70, 2000.
SON, H.J. and KIM, J.S. Therapeutic efficacy of DNA-loaded PLGA microspheres in tumor-bearing mice.Arch. Pharm. Res. 30(8), 1047-1050, 2007.
STOLNIK, S.; GARNETT, M. C.; DAVIES M. C. The colloidal properties of surfactant-free biodegradable nanospheres from poly (β-malic acid-co-benzil malate)s and of poly (lactic acid-co-glycolide). Colloids and Surfaces, 97, 235-245, 1995.
SUN, B.; RANGANATHAN, B.; FENG, S.S. Multifunctional poly(d,l-lactide-co-glycolide)/montmorillonite (PLGA/MMT) nanoparticles decorated by Trastuzumab for targeted chemotherapy of breast cancer, Biomaterials, 29(4):475-48, 2008
TAMBER, H.; JOHANSEN, P.; MERKLE, H. P.; GANCER, B. Formulation aspects of biodegradable polymeric microspheres for antigen delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 57, 357-376, 2005.
Roseane Maria Ribeiro Costa
121
TARTOUR, E.; MATHIOT, C.; FRIDMAN, W. H. Current Status of Interleukin-2 Therapy in Cancer. Biomed & Pharmacother 46, 473-484, 1992.
THOMAS, T.T.; KOHANE, D.S.; WANG, A.; LANGER, R. Microparticulate formulations for the controlled release of interleukin-2. Journal of Pharmaceutical Sciences, 93 (5), 1100-1109, 2004.
THOMPSON, J.A.; PEACE, D.J.; KLARNET, J.P.; KERN, D.E.; GREENBERG, P.D.; CHEEVER, M.A. Eradication of disseminated murine leukemia by treatment with high dose interleukin-2. J. Immunol., 146, 1077, 1986.
TINSLEY-BOWN, A.M.; FRETWELL, R.; DOWSETT, A.B.; DAVIS, S.L.; FARRAR, G.H. Formulation of poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) microparticles for rapid plasmid DNA delivery. Journal of Controlled Release, 66, 229-241, 2000.
TOUBAJI, A.; HILL, S.; TERABE, M.; QIAN, J.; FLOYD, T.; SIMPSON, R. M.; BERZOFSKY, J. A.; KHLEIF S. N. The combination of GM-CSF and IL-2 as local adjuvant shows synergy in enhancing peptide vaccines and provides long term tumor protection. Vaccine, 25, 5882–5891, 2007.
UNGARO, F.; BIONDI, M.; D'ANGELO, I.; INDOLFI, L.; QUAGLIA, F.; NETTI, P. A.; LA ROTONDA, M. I. Microsphere-integrated collagen scaffolds for tissue engineering: effect of microsphere formulation and scaffold properties on protein release kinetics. Journal of Controlled Release, 113, 128–136, 2006.
VANDERVOORT, J ; LUDWING, A. Biocompatible stabilizers in the preparation of PLGA nanoparticles: a factorial design study. International Journal of Pharmaceutics, 238, 77-92, 2002.
VILA, A.; SÁNCHEZ, M.; TOBIO, M. CALVO, P.; ALONSO, M. J. Design of biodegradble particles for protein delivery. Journal of Controlled Release, 78, 15-24, 2002.
VILLERMAUX, J.; FALK, L.; FOURNIER, M.C.; DETREZ, C. Use of parallel competing reactions to characterize micromixing efficiency. AIChE Symp. Ser., 88, 286, 1992.
VILLERMAUX, J.; FALK, L.; FOURNIER, M.C. Potential use of a new parallel reaction system to characterize micromixing in stirred reactors. AIChE Symp. Ser., 90, 299, 1994.
VOSS, S.D.; HANK, J.A.; NOBIS, C.A.; FISCH, P.; SOSMAN, J.A. SONDEL, P.M. Serum levels of low affinity interleukin-2 recpetor molecule (TAC) during IL-2 therapy reflect systemic lymphoid mass activation. Cancer Immunol Immunother, 29, 261, 1989.
WEI, G.; PETTWAY, G. J.; MCCAULEY, L. K.; MA, P. X. The release profiles and bioactivity of parathyroid hormone from poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres. Biomaterials, 25, 345–352, 2004.
Roseane Maria Ribeiro Costa
122
WHITE, J. S.; WEISSFELD, J. L.; RAGIN, C. C. R.; ROSSIE, K. M.; MARTIN, C. L.; SHUSTER, M.; ISHWAD, C. S.; LAW, J. C.; MYERS, E. N.; JOHNSON, J. T.; GOLLIN, S. M. The influence of clinical and demographic risk factors on the establishment of head and neck squamous cell carcinoma cell lines. Oral Oncology, 43, 701-712, 2007.
WISCHKE, C.; LORENZEN, D.; ZIMMERMANN, J.; BORCHERT, H.-H. Preparation of protein loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) microparticles for the antigen delivery to dendritic cells using a static micromixer. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 1–7, 2005.
WISCHKE, C.; LOREZEN, D.; ZIMMERMANN, J.; BORCHET, H. H. Preparation of protein loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) microaprticles for the antigen delivery to dendritic cells using a static micromixer. Eur. J. Pharm. Biopharm., 62, 247-253, 2006.
XIAN M. D. J.; YANG, M. D. H.; LIN, M. D. Y.; LIU, M. D. S. Combination nonviral murine interleukin 2 and interleukin 12 gene theraphy and radiotherapy for head and neck squamous cell carcinoma. Arch Otolaryngol Head and Neck Surg., 131, 1079-1085, 2005.
XIE, M.; ZHOU, L.; HU, T.; YAO, M. Intratumoral delivery of paclitaxel-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres for Hep-2 laryngeal squamous cell carcinoma xenografts. Anticancer Drugs, 18(4), 459-466, 2007.
YANG, Y.; WAN, J.; CHUNG, T.; PALLATHADKA, P. K.; STEVE, N.; HELLER, J. POE-PEG-POE triblock copolymeric microspheres containing protein I. Preparation and characterization. Journal of Controlled Release, 75, 115-128, 2001.
YANG, YI-Y.; CHIA, HUI-H.; CHUNG, TAI-S. Effect of preparation temperature on the characteristics and release profiles of PLGA microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction / evaporation method. Journal of Controlled Release, 69, 81–96, 2000.
YOUAN, BI B. C.; JACKSON, T. L.; DICKENS, L.; HERNANDEZ, C.; OWUSU-ABABIO, G. Protein release profiles and morphology of biodegradable microcapsules containing an oily core. Journal of Controlled Release, 76, 313-326, 2001.
ZAIA, D. A. M; ZAIA, C. T. B. V, LICHTIG, J. Determinação de proteínas totais ia espectrofometria: vantagens e desvantagens dos determinação de proteínas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química Nova, 21(6), 787-793, 1998.
ZHANG, H. and GAO, S. Temozolomide/PLGA microparticles and antitumor activity against glioma C6 cancer cells in vitro. Int J Pharm., 329(1-2),122-128, 2007.
ZHANG, X.; FENG, J.; YE, X.; YAO, Y.; ZHOU, P.; CHEN, X. Development of an immunocytokine, IL-2-183B2scFv, for targeted immunotherapy of ovarian cancer. Gynecol Oncol., 103(3):848-852, 2006.
ZHENG, C. H.; GAO, J. Q.; ZHANG, P.; LIANG, W. Q. A protein delivery system: biodegradable alginate-chitosan-poly(lactic-co-glycolic acid) composite microspheres. Biochemical and Biophysical Research Communications, 323, 1321-1327, 2004.
Roseane Maria Ribeiro Costa
123
ZHU, G.; MALLERY, S.R.; SCHWENDEMAN, S.P. Stabilisation of proteins encapsulated in injectable poly(lactide-co-glycolide), Nat. Biotechnol., 18, 52–57, 2000.
ZWIERZINA, H. Biological therapy – Where do we stand?. European Journal of Cancer , 35, S1-S62, 1999.
Roseane Maria Ribeiro Costa
124
ANEXOS
Roseane Maria Ribeiro Costa
125
Trabalhos enviados para congresso
R. M. RIBEIRO-COSTA, M. R. DA CUNHA, M. R. GONGORA-RUBIO, M. I. RÉ.
Etude d´um procede d´obtetntion de microspheres polymériques a l’aide de
micromelangeurs. Science et Technologie des Poudres & Poudres et Materiaux, Ecole des
Mines d´Albi – França, p.114, 23 – 25 maio de 2007.
PINTO, E. F.; CRUZ, E. A.; LIMA, W. P.; PENA, L. M. R.; RIBEIRO-COSTA, R. M. ;
RE, M. I. ; BARTIRA, R. B. Comparative Study of Acute Toxicity and Allergenicityu of
Poly-Hydroxybutyrate-Valaerate (PHB-HV) and Poly-(Lactide-Co-Glycolide)
Microparticles. In: 3ª Reunião da Rede de Nanobiotecnologia, 2005, São Pedro - São
Paulo. Notebook of Summaries da 3ª Reunião da Rede de Nanobiotecnologia,. p. 110-111,
2005.
RIBEIRO-COSTA, R. M., RE, M. I., CUNHA, M. R., RUBIO, M. G. Preparation of
PLGA Microspheres by Emulsification/Solvent Evaporation Process Employing
Microfluidic Structures In: 5th Internacional Congress of Pharmaceutical Sciences -
CIFARP 2005, 2005, Ribeirão Preto - São Paulo. Brazilian Journal of Pharmaceutical
Sciences. Ribeirão Preto –SP, v.41, p.458, 2005.
RIBEIRO-COSTA, R. M.; RE, M. I. ; CUNHA, M. R.; RUBIO, M. G. . A Microfluidic
Approach to Produce Poly(Lactide-Co-Glycolide) Micro- and Nanospheres. In: 4ª Reunião
da Rede de Nanobiotecnologia, 2005, Campinas - São Paulo. Livro de Resumos 4ª Reunião
da Rede de Nanobiotecnologia, p. 41, 2005.
GONGORA-RUBIO, M.R., CUNHA, M.R., COSTA, A.P.O., COSTA, R.M.R.; RÉ. M.I.
LTCC microfluidic structures for micro & nanoparticle preparation. In: EUROSENSORS
XIX, Barcelona, 2005.
Roseane Maria Ribeiro Costa
126
Trabalho aceito na Powder Technology
Roseane Maria Ribeiro Costa
127
Aprovação do Comitê de Ética