T.C.
BİRUNİ ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSİTİTÜSÜ
HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI
İN VİTRO ANTİOKSİDAN UYGULAMASININ SPERM
FONKSİYONLARI ÜZERİNE ETKİSİ
Dilara KONK
DANIŞMAN
Prof. Dr. Tülay İrez
İSTANBUL
2019
I. Beyan
Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına
kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri
akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmasıyla elde edilmeyen
bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine
aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal
edici bir davranışımın olmadığını beyan ederim.
Dilara KONK
iii
II. TEŞEKKÜR
Yüksek Lisans tez çalışmam süresince, bilgi birikimini paylaşan, katkılarını ve
hoşgörüsünü hiçbir zaman esirgemeyen, tezimi hazırlama döneminde deneyimleri,
desteği ve sevgisiyle her zaman yanımda hissettiğim çok değerli hocam Sayın Prof.
Dr.Tülay İREZ’e
Tüm çalışmalarım süresince boyunca yanımda olan, bilgi birikimi ve yardımlarını
esirgemeyen değerli sorumlum Emb.Feridun YAKAR ve çalışma arkadaşım Bio.
Özge MENTEŞE’ye
Yüksek Lisans eğitimimin her aşamasında yardım, hoşgörüsünü ve sabrını
esirgemeyen sevgili arkadaşım Gizem GÜDER ve bölüm arkadaşlarıma
Yüksek Lisans eğitimim sırasında ve tez yazımı sırasında bana gösterdiği hoşgörü
ve sabır ile yaklaşan sevgili eşim Mehmet Emin AKINCI’ya
Her zaman yanımda olan, desteğini her an hissettiren ve üzerimde sonsuz bir emeğe
sahip sevgili annem, sevgili babam ve sevgili abime teşekkürü borç bilirim.
iv
III. İÇİNDEKİLER
İçindekiler Sayfa No
İç Kapak……………………………………………………………………. -
Onay Sayfası ………………………………………………………………. -
I.Beyan…………………………………………………………………….. iii
II.Teşekkür……………………………………………………………….….iv
II.Teşekkür…………………………………………………………….……..v
IV.Simge ve Kısaltmalar Listesi……………………………………….…….viii
V.Tablo listesi…………………………………………………………..…....xi
VI.Şekil listesi…………………………………………………………….....xiii
VII. Resim Listesi…………………………………………………………....xiv
1. Özet ve anahtar kelimeler…………………………………………………..1
2. Abstract………………………………………………………………….….2
3. Giriş ve Amaç……………………………………………………………....3
4. Genel Bilgiler…………………………………………………………..…...5
4.1. Spermin Yapısı……………………………………………………..…...5
4.1.1. Spermatozoon membranı…………………………………….…...…8
4.1.2. Kapasitasyon…………………………………………………..…….9
4.1.3. Erkek İnfertilitesinin Değerlendirilmesi………………………..….10
4.1.4. Semen……………………………………………………………….11
4.1.4.1. Semen Analizi……………………………………….……....12
4.1.4.2. Sperm Hazırlama Yöntemleri…………………………...…....30
4.2. Antioksidanlar……………………………………………...…………...33
4.2.1. Antioksidanların Sınıflandırılması………………………………....34
4.2.2. Antioksidan Savunma Sistemi…………………………………..….35
4.2.3. Sperm Antioksidan Sistemi…………………………………..….….36
4.2.4. Yardımcı Üreme Teknikleri ve Antioksidanlar………………..…...36
v
4.3. Reaktif Oksijen Türleri ……………………..………………………......37
4.3.1. ROS’un Hücresel Substratları………………………………...…....38
4.3.2. İnsan Semeninde ROS’un Kaynağı………………………….….….39
4.3.3. İnsan Semeninde ROS üretim alanları………………………....…..40
4.4. Oksidatif Stres………………………………………………………......40
4.4.1. Oksidatif Stres ve Erkek İnfertilitesi……………………..……..…41
4.5. Glutatyon peroksidaz……………………………………………..….…43
5. Gereç ve Yöntem………………………………………………..………….46
5.1. Kullanılan Gereçler………………..……………………………..…….46
5.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler……………………………………...…47
5.3. Deney Gruplarının Oluşturulması………………………………….…..47
5.4. Semen Toplanması ve Analizi………………………………………....48
5.5. Sperm Boyama Ve Morfoloji Değerlendirilmesi...………………...…48
5.6. Swim Up Yöntemi……………………………………………….....….49
5.7. Glutatyon Peroksidaz (GPX) Hazırlanama Protokolü………...……….49
5.8. Glutatyon Peroksidaz (GPX) Uygulama Protokolü…………...….…...49
5.9. Eosin Y Uygulama Portokolü…………………………………....…….50
5.10. Sperm Sayısı ve Motilite Değerlendirilmesi…………………..…..…50
5.11. İstatiksel Değerlendirmeler…………………………………..……....51
6. Bulgular………………………………………………………………..…..52
6.1. Yaş……………………………………………………...…………..….54
6.2. Semen Volümü………………………………………………….….….54
6.3. Konsantrasyon…………………………………..……………….….…54
6.4. İmmotilite………………………………………………………..….…54
6.5. İleri Hızlı Hareketli (+4) Sperm……………………………….……...55
6.6. Yavaş Hareketli (+3) Sperm…………………………………….….…56
6.7. Yerinde Hareketli (+2) Sperm…………………………………....…...56
6.8. Toplam Motil Sperm Sayısı ( TPMSS)…………….…………..……..57
6.9. Motilite…………………………….………………………..…….…..57
6.10.Vitalite………………………………………………………………..59
7. Tartışma……………………………………………………….….….…....63
8. Sonuç ve Öneriler………………………………………….…………..….68
9. Kaynakça………………………………………………...……………..…69
10. Ekler……………………………………………………………………...81
vi
Ek 2. Gönüllü Olur Formu…………………………………………….…..81
Ek 3. Etik Kurul Onayı……………………………………….……...……84
11. Özgeçmiş…………………………………………………………..……..86
İhtihal Raporu …………………………………………………….…….……87
vii
IV. SİMGELER VE KISALTMALAR
ATP Adenosine Triphosphate
cAMP Siklik Adenozin Monofosfat
CAT Katalaz cm Santimetre CO2 Karbondioksit
dk Dakika
DNA Deoksiribonükleik Asit
FSH Folikül Uyarıcı Hormon
GR Glutatyon Redüktaz
GPX Glutatyon Peroksidaz
GSH Glutatyon
GSSG Glutatyon Disülfit
GST Glutatyon -S Transferaz
HO2 Hidroperoksil radikali
H202 Hidrojen Peroksit
HOS Hipoosmotik Şişme
HOST Hipoosmotik Şişme Testi
ICSI İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu
IUI İntrauterin İnseminasyon
IVF İn Vitro Fertilizasyon(Döllenme)
L Lipid Serbest Radikali
viii
LOO Lipid Peroksit Radikali
ml Mililitre
mm Milimetre
μm Mikrometre
μl Mikrolitre
μg Mikrogram
NAD Nikotinamid Adenin Dinükleotid
NADPH Nikotin amid adenozin di nükleotid fosfat
NADP Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat
O2 Moleküler oksijen
O2
- Süperoksit radikali
ODF Outer Dense Fiber (Yoğun Dış Lifler)
OH-
Hidroksil radikali
PAS Proakrozomal Granüller pH Hidrojenin Gücü
PHGPX Selenoenzim fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz PHSS Hızlı Hareketli Spermatozoon Sayısı
RO Alkoksi radikali ROO Peroksil radikali
ROS Reaktif Oksijen Türevleri
RS Tiyil Radikali
ix
RSO Sülfenil Radikali
RSO2 Tiyil Peroksit Radikali
SOD Süperoksit Dismutaz
UV Ultraviole
YÜT Yardımcı Üreme Teknikleri
WHO Dünya Sağlık Örgütü
ZP Zona Pellusida
°C Santigrat derece
% Yüzde
< Küçük
> Büyük
x
V. TABLO LİSTESİ
Tablo No Tablo Adı Sayfa No
Tablo 1. Semen İçeriğinin Dağılımı…………………………………………..11
Tablo 2. Terminoloji…………………………………….……………….……14
Tablo 3. Semen Analizi Normal Referans Değerleri……………………….…19
Tablo 4. Ros Türlerinin Sınıflandırılması………………………… ……….…38
Tablo 5. GPX Türleri, Özellikleri ve Hücresel Lokalizasyonları………….…..44
Tablo 6. Kullanılan Gereçler, Firma Adı ve Alındığı Ülkeler…………..….…46
Tablo 7 . Kullanılan Kimyasal Maddeler, Firma adı ve Alındığı Ülkeler…..…47
Tablo 8. Semen Örneklerin pH, Viskozite ve Hacim Ortalama Değerleri.…...52
Tablo 9. Normospermik ve Oligospermik Grupların Bazal Değerleri, 1 Saatlik
ve 24 Saatlik GPX Uygulamasının Bazal Değerlere Etkisi…………………………53
Tablo 10. Normospermik Gruba Ait Motilite Verileri………………..………….58
Tablo 11. Oligospermik Gruba Ait Motilite Verileri……………………………59
Tablo 12. Normospermik Gruba Ait Vitalite Verileri…………………………...60
Tablo 13. Oligospermik Gruba Ait Vitalite Verileri………………………….….61
xi
VI. ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No Şekil Adı Sayfa No
Şekil 1. Spermatozoon Yapısı ……….…………….……….…….……….…..…6
Şekil 2. Spermin Kuyruk Yapısı ……………………………………..………..….7
Şekil 3. Farklı Sperm Aglütinasyon Derecelerinin Şematik Diyagramı..………..20
Şekil 4. Makler Kamerası İle Konsantrasyon Ölçümü …………………….......24
Şekil 5. Konsantrasyon Ölçümü………………………...……...…………….….24
Şekil 6. Eosin Y ile Boyanmış Spermatozoon……………………….……..…...26
Şekil 7. Hipoozmatik Strese Maruz Bırakılan İnsan Spermatozoasının Morfolojik
Değişiminin Şematik Görünümü…………………………..…...........................…...27
Şekil 8. İnsan Spermatozoasının Normal ve Anormal Formları ………………..29
Şekil 9. Swim- Up Yöntemi………………………….……………….…………31
Şekil 10. Dansite Gradient Santrifüjleme….………………..………….……..…33
Şekil 11. Antioksidanların Sınıflandırılması.………………………………..…..34
Şekil 12. Antioksidan Savunma Sistemi……………………………….….….…35
Şekil 13. ROS’un Sebep Olduğu Hücre Hasarı………………………...……….39
Şekil 14. Oksidatif Stres ve Koşullarının Oluşumu …………………………….41
Şekil 15. Oksidatif Stres ve İnfertilite …………………………………..……...42
Şekil 16. Antioksidan Enzimler ve Reaksiyonları ……………………….………45
Şekil 17. Normospermik Grup Motilite ve Vitalite Değerlerinin
Karşılaştırılması……………………………………………………………………..62
Şekil 18. Oligospermik Grup Motilite ve Vitalite Değerlerinin
Karşılaştırılması……………………………………………………………………..62
xii
RESİM LİSTESİ
Resim No Resim Adı Sayfa No
Resim 1. Spermac Stains ( A, B, C) ve Fiksatif ……………….………..….49
Resim 2. Makler Kamerası …………………………………..………...……51
xiii
1. ÖZET
Antioksidanlar, ROS’un meydana gelişi ve ROS’un sebeb olduğu hasarları
önleyebilen savunma mekanizmalarıdır. Spermatozoa hücreleri plazma
membranlarında poliansatüre yağ ve düşük konsantrasyonlarda sitoplazmalarında
antioksidan savunma enzimleri bulunmaktadır. Bu nedenle spermatozoa hücreleri
ROS’a karşı diğer hücrelere oranla daha fazla hassasiyet gösterir. Antioksidan sistem
ile ROS oluşumu arasında denge vardır. Spermatozoon, oksidatif hasara karşı
DNA’sını iki savunma sistemi ile korumaktadır. Birincisi seminal plazma, ikincisi
DNA’nın paketlenerek düzenlenmesidir. Glutatyon peroksidaz (GPX), seminal
plazma enzimlerindendir. İnsan spermatozoalarında, ROS’u etkisizleştirmek,
azaltılmış glutatyon yoluyla glutatyon peroksidaz\glutatyon redüktaz sistemine
bağlıdır. Bu çalışmada amaç GPX’in in vitro kullanımında sperm motilitesi ve
canlılığı üzerine etkilerinin araştırılmasıdır.
Gereç ve yöntem:Çalışma Bahçelievler MedicalPark Hastanesi IVF merkezine
spermiyogram testi için başvuran, normozoospermi ve oligozoospermi özelliği
gösteren 20’şer erkek olgunun semen örneği üzerinde yapıldı. Mikroskobik ve
morfolojik değerlendirmeler WHO kriterlerine uygun olarak yapıldı. Canlılık
değerlendirmesinde Eosin Y testi uygulandı. İn vitro ortamda 1 ve 24 saat GPX’e
maruz bırakılan semen örnekleri motilite ve vitalite değerlendirilmesi yapıldı ve
örnekler kontrol grubu ile karşılaştırılarak değerlendirildi.Verilerin değerlendirilmesi
Student’s- t Testi ile analizi yapıldı.
Bulgular:Çalışmamızda;1 ve 24 saatlik GPX’ e maruz bırakılan normozoospermik
ve oligozoospermik semen örneklerininin sperm motilitelerinde artış gözlendi.
Vitalitelerinde değişim gözlenmedi. 24 saat GPX e maruz normozoospermi ve
oligozoospermi semen örneklerinin vitalitelerinde düşüş gözlendi.
Tartışma:Çalışmada 1 ve 24 saatlik GPX uygulamasının normozoospermik ve
oligozoospermik gruplar arasında motiliteyi artırıdığını, 24 saatlik GPX
uygulamasının normozoospermik ve oligozoospermik gruplarda vitaliteyi negatif
etkilediği düşünülmüştür. Daha güvenilir sonuçlar elde etmek için;aynı gruplar ve
genel popülasyonda yapılacak büyük ölçekli çalışmalara ihtiyaç olduğu sonucuna
varılmıştır.
Anahtar kelimeler:Antioksidan, glutatyon peroksidaz, infertilite,in vitro,
spermatozoon
1
2.ABTRACT
THE EFFECT OF IN VITRO ANTIOXIDANT APPLICATION ON SPERM
FUNCTIONS
Antioxidants are the defense mechanisms that can prevent the damage caused by
ROS and ROS. Spermatozoa cells have antioxidant defense enzymes in the plasma
membranes of polyunsaturated fat and low concentrations of cytoplasm. Therefore,
spermatozoa cells are more sensitive to ROS than other cells. There is a balance
between the antioxidant system and ROS formation. Spermatozoon protects its DNA
against oxidative damage with two defense systems. The first is the seminal plasma
and the second is the packaging of the DNA. Glutathione peroxidase (GPX) is one of
the seminal plasma enzymes. In human spermatozoa, inactivation of ROS is
dependent on the glutathione peroxidase \ glutathione reductase system through
reduced glutathione. The aim of this study was to investigate the effects of GPX in in
vitro use on sperm motility and viability.
Materials and methods: This study was conducted on a semen sample of 20 male
patients with normozoospermia and oligozoospermia who were admitted to the IVF
center of Bahçelievler Medical Hospital. Microscopic and morphological evaluations
were performed according to WHO 2010 criteria. Eosin Y test was used for viability
evaluation. Semen samples that were exposed to GPX for 1 and 24 hours in vitro
were evaluated for motility and vitality and the samples were evaluated by
comparison with control group. The data were analyzed by Student maruzs- T Test.
Results: In our study, sperm motility of normozoospermic and oligozoospermic
semen samples exposed to 1 and 24 hour GPX was increased. No change in their
vitality. A decrease was observed in the vitalities of the normozoospermia and
oligozoospermia semen samples exposed to GPX for 24 hours.
Discussion: In this study, it was thought that 1-hour and 24-hour GPX application
increased motility among normozoospermic and oligozoospermic groups. In order to
obtain more reliable results, it was concluded that large-scale studies in the same
groups and the general population were needed.
Key words: Antioxidant, glutathione peroxidase, infertility, in vitro, spermatozoon
2
3. GİRİŞ VE AMAÇ
Canlı organizmada değişik metabolik yollar ile serbest radikal üretimi devam
ettiğinden organizma kendini savunmak için meydana toksik ürünlere karşı
antioksidan savunma sistemi geliştirirler (Valko, 2006).
Aşırı ROS üretimi spermatozoa ve seminal plazmanın antioksidan savunma
mekanizmalarını geçen kritik seviyeye ulaşırsa oksidatif strese neden olur (Aitken,
2012). Oksidatif stresin hedefleri lipidler, nükleik asitler, yağlar, proteinler ve diğer
tüm hücre yapı taşlarıdır (Smith et al., 1996). Spermatozoa hücreleri ROS’a karşı
diğer hücrelere göre daha fazla hassasiyet gösterir. Bu hassasiyetin sebebi, plazma
membranlarının yüksek oranda poliansatüre yağ asitleri içeriyor olmasıdır (Aitken,
2012).
Aşırı ROS artışı sperm fonksiyon bozukluğunda önemli rol oynamaktadır. Reaktif
oksijen türlerinin artmış düzeyi ve total enzimatik olmayan antioksidan düzeyindeki
düşme sperm plazma membranında artmış lipid peroksidasyonu ile beraberdir (Smith
et al.,1996).
Lipid peroksidasyonu sperm plazma membranının akıcılığına zarar vererek oosit
füzyonu yeteneği kaybına yol açar. Bazı çalışmalar orta kısım anomalisi ile birlikte
olan lipid peroksidasyonunun, sperm sayısı, sperm motilitesi, akrozom reaksiyonu
zayıflaması ile fertilizasyon kabiliyetinde azalma olduğunu göstermiştir (Sukcharoen
et al., 1996).
Glutatyon peroksidaz (GPX), GSH’ın indirgeyici gücünü kullanarak hidrojen
peroksitin ve doymamış yağlardan meydana gelen organik hidroperoksitlerin
deaktivasyonunu kataliz eder. Peroksitlerin indirgenmesini katalizleyen GPX enzimi,
hücredeki indirgenmiş glutatyonu (GSH) yükseltgenmiş glutatyona (GSSG)
dönüştürmektedir. GPX, glutatyonu hidrojen donör olarak kullanarak hidrojen
peroksiti elimine etmektedir. Bu reaksiyonlar, canlı organizmada oksidatif stresin
zararlı etkilerinden hücresel membranları korumaya yarar (Ursini and Maiorino,
2014). Glutatyon peroksidaz (GPX) sperm gelişiminin ilk aşamalarında aktif halde
bulunur (Arthur, 2000).
3
Glutatyon peroksidaz (GPX) ailesi, farklı dokularda dağılmış ancak türler arasında
farklılık gösteren 8 üyeden oluşmaktadır (Sies et al., 1997). Azaltılmış glutatyon
(GSH) kullanarak H2O2 ve diğer hidroperoksitlerin çıkarılması için gereken
reaksiyonu katalize etmektedir. Hidroperoksitleri uzaklaştırmaya devam etmek için,
oksitlenmiş glutatyonun (GS-SG), indirgeyici ajan olarak NADPH kullanılarak
glutatyon redüktaz (GR) enzimi tarafından GSH'ye düşürülmesi gerekir. Glutatyon
peroksidazlar ayrıca motilite ve sperm kapasitasyonunda yer alan proteinlerde tirozin
nitrasyonunu teşvik eden hücrelere zarar verebilen çok reaktif bir ROS olan ONOO−
'ü de azaltabilir (Sies et al.,1997; Vignini et al., 2006). Spermatozoa için büyük önem
taşıyan selenoprotein fosfolipid hidroperoksit GPX4'ün (PHGPX) varlığı,
mitokondriyal kılıfın normal oluşumu için gerekli olan ve mitokondriyal sarmalda
lokalize edilmiş olan sperm orta kısım protein içeriğinin yaklaşık %50'sini oluşturan
yapısal bir protein olmasıdır (Ursini et al., 1999). Mitokondrial PHGPX (mGPX4)
bulunmayan erkek fareler, vahşi tip hayvanlara göre anormal ve daha az hareketli
spermler ile kısırdır (Imai et al., 2009). İnfertil erkeklerde anormal morfoloji düşük
sperm motilitesi gösterdiği için, normal sperm fonksiyonunu sağlamak için mGPX4'e
olan ihtiyaç da insanlarda gösterilmiştir (Imai et al., 2006). Yapılan çalışmalarda
glultatyonun peroksidazın sperm motilitesini artırıcı bir özelliği olduğu da ortaya
konmuştur (De Lamirende, 2008).
Bu çalışmada glutatyon peroksidaz, normozoospermi ve oligozoospermik gruplara 1
ve 24 saat in vitro ortamda maruz bırakıldı ve motilite ve vitalite parametreleri
üzerinde glutatyon peroksidazın süreye bağlı etkisi olup olmadığını araştırmayı
amaçladık.
4
4. GENEL BİLGİLER
4.1. Spermin Yapısı
Erkek üreme hücresi 1677 tarihinde Johan Hamm ve Leeuwenhook tarafından
mikroskobik olarak gözlemlenmiştir. Ancak Johan Hamm ve Leeuwenhook
spermlerin fertilizasyondaki görevini yanlış anlamışlardır. Johan Hamm ve
Leeuwenhook’a göre spermler kadın üreme yollarında büyüyen minyatür insan
şekilleri idi (Hassa, 2003).
Karl Ernst V. Baer, 1827 yılında erkek üreme hücresini küçük bir hayvancığa
benzetmiş ve erkek üreme hücresine spermatozoon adını vermiştir (Hassa, 2003).
64 ile 72 gün arasında süren spermiyogenez olayı sonucu spermiasyon olayıyla
sertoli hücrelerinden ayrılan spermatozoonlar, seminifer tübül lümenine geçerler.
Fonsiyonel olarak olgunlaşmayan spermatozoonlar, mikroskobik olarak
incelendiğinde morfolojik olarak olgun gözlenirler. Spermatozoonlar motilite
yeteneklerini duktus epididimis ve yardımcı bezlerin salgıları ile fertilizasyon
yeteneklerini ise dişi genital kanallarında kapasitasyon olayını tamamlayarak
kazanırlar (Zülfikaroğlu ve ark, 2010).
Olgun bir spermatozoon hücresi, 50-60 μm uzunluğunda, serbest yüzebilen ve aktif
olarak hareket kabiliyetine sahip hücrelerdir (Karagöz, 2002).
Spermatozoon hücresi morfolojik olarak iki ana kısımda incelenir. Bu iki ana kısım
baş ve kuyruktur. Kuyruk bölgesi ise boyun parçası, orta parça, esas parça ve son
parça olmak üzere dört kısımda incelenir (Kahraman, 2008).
5
(Çoruh, 2010)
Şekil 1. Spermatozoon Yapısı
Baş kısmı; olgun spermatozoon hücresinin çekirdeği taşıyan yassı formda bir baş
kısmı bulunur. Olgun spermatozoon hücresinin baş kısmı 4-5 μm uzunluğunda ve
genişliği 2,5- 3,5 μm’dir . Çekirdek baş kısmının büyük bir bölümünü kaplar ve
anteriyör yarısını ise akrozom oluşturur. Akrozom, membranla çevrili, kep şekline
benzeyen bir formda organel olup fertilizasyon için gerekli hidrolitik enzimleri
(hiyaluronidaz, asit fosfatazlar, nöraminidaz ve proteazlar) içermektedir
(Kierszenbaum, 2006; Hassa 2003). Döllenme sırasında salınan akrozomal enzimler,
spermatozoa hücresinin oositi saran zona pellusida ve korona radiatadan geçişini
kolaylaştırır (Kierszenbaum, 2006).
Baş Kısmı
Kuyruk
Son Parça
Orta Kısım
Boyun Sentriyoller
Çekirdek
Akrozom
Mitokondri
Hücre Zarı
Hücre Membranı
Aksiyel filaman sil ve flagellum yapısı için tipik olan 9+2 şeklindeki ışınsal dizilimi olan mikrotübülleri içerir.
Aksiyal Filament
6
Kuyruk kısmı; sperm hücresinin hareket kabiliyetini sağlayan kuyruk kısmıdır.
Kuyruk kısmı uzunluğu 45 μm ve genişliği 0,4-0,5 μm’dir. Spermin kuyruk kısmı
kesintisiz tek parça ve ince bir yapıda olmalı. Sperm kuyruğunda bulunan yapı
aksonemdir ve mikrotübüler ikililerden oluşur bu yapının temel görevi sperm
kuyruğunda hareketi sağlamaktır (Erdemir ve ark., 2011).
Sperm kuyruğu 4 kısımdan oluşmaktadır. Uç kısımdan tabana doğru bu kısımlar; son
parça, esas parça, orta parça ve bağlantı parçasıdır (Kierszenbaum, 2006).
(Amann and Graham, 1993)
Şekil 2.Spermin Kuyruk Yapısı
Sperm bağlantı parçası (Connecting piece); yapı olarak dar bir yapıya sahip olan
sperm bağlantı parçasında bir çift sentriyol bulunur. Distal sentriyol, sperm
kuyruğunun hareketini sağlayan aksoneme kaynaklık yapmaktadır (Kierszenbaum,
2006).
Orta kısım (Middle piece); mitokondri ve yoğun dış fibrillerle sarılı aksonemden
meydana gelmektedir. Aksonem ise dokuz mikrotübül çiftinin iki kat sardığı
mikrotübüler bir yapıdan meydana gelir. Sperm kuyruğunun sertliği disülfit
7
bağlarının yoğun olarak bulunduğu dış fibrillerle sağlanır. Orta kısımda yer alan
mitokondriler hücre enerjisi ve oksidatif metabolizma için gerekli olan ATP
(Adenozin Trifosfat) üretiminden sorumlu enzimleri içerir. Aksonem, elde edilen
kimyasal enerjisi mekanik harekete (motiliteye) dönüştürebilmek için gerekli olan
yapısal proteinler ve enzim kompleksi içerir. Orta kısım kuyruğun sonuna doğru
incelmekte ve esas parçayı birleştiren annulus adı verilen bir yapı ile sonlanmaktadır
(Özdiler ve Aydos, 2000).
Esas parça (Principal piece); fibröz kılıf ile aksonemden meydana gelmektedir.
Terminal yapı ile annulus arasında kalır. Fibröz kılıf, aksonem ile yoğun dış lifleri
(outer dense fiber) sarmaktadır. Yüzeyde uzunlamasına iki kolon ve yarım daire
şeklinde ki yapılardan oluşur. Fibröz kılıf oldukça stabil bir yapıya sahiptir. Bu
stabilitesini yapısında bulunan disülfide borçludur. Bu stabiliteye bağlı olarak
spermatozoon hareketine yardımcı olur. (Kadıoğlu ve ark., 2004).
4.1.1. Spermatozoon membranı
Spermatozoon membranı; lipid, karbonhidrat ve protein yapısındadır. Lipidlerin ana
görevi membran yapısını meydana getirerek stabilizasyonu ve bütünlüğünü korumak,
fonksiyonel olarak olgunlaşmak, akrozom reaksiyonu ve sperm- oosit membran
temasında görev almaktadır. Spermatozoa hücreleri; yüksek miktarda fosfotidil
etanolamin, sfingomiyelin ve fosfotidil kolin içermeketedir. Kolesterol
fosfolipidlerle birlikte spermatozoon membranının bütünlüğünü ve geçirmezliği
sağlamada rol oynar. Spermatozoon membranının yapısında, monosakkaridler
(mannoz, glukoz gibi) ile disakkaridler bulunmaktadır. Esas aminoasit yapısını ise
tirozin, triptofan ve histidin oluşturmaktadır. Spermatozoon hücrelerinin
membranında; spesifik antijenler dışında, hücre - hücre veya hücre - matriks
etkileşimini gerçekleştiren matriks ve nonspesifik proteinlerle beraber,
immünoglobülinler, selektinler, integrinler ve kaderinler gibi adezyon moleküllerinin
de bulunduğu gösterilmektedir (Zülfikaroğlu ve ark., 2010).
Testiküler germ hücrelerinin glikoproteinleri, spermatozoon farklılaşması ve
spermatogenezde sertoli hücreleriyle etkileşimde görev alır. Aynı zamanda
glikokaliks, spermatozoa hücrelerinin dişi immün sistemine karşı korunmasında,
8
akrozom reaksiyonlarının gerçekleşmesinde ve spermatozoonun oositi dölleme
yeteneğinde ana rol oynamaktadır (Alibadi et al., 2013).
4.1.2.Kapasitasyon
Kapasitasyon, sperm hücrelerinin dişi genital kanalı içerisinde fertilizasyon yeteneği
kazanabilmesi için geçirdiği olgunlaşma sürecidir. Bu süreç sağlıklı bir erkek bireyde
yaklaşık 7 saat sürmektedir. Kapasitasyon sürecinin büyük bir bölümü dişi bireyin
fallop tüplerinde gerçekleşmektedir(Sadler, 2005). Kapasitasyon sürecinde rol alan
serin-treonin fosforilasyonunun rolü tam anlaşılamamıştır. Ancak kapasitasyonla
ilgili yapılan çalışmalar sonrasında tirozin fosforilasyonu ve kapasitasyon arasında
bir bağlantı olduğu sonucuna varılmıştır. Hücre faklılaşması ve çoğalmasında görev
alan en büyük düzenleyici prolin tarafından gerçekleşen fosforilasyondur.
Kapasitasyon olayı sperme kolesterol girişine bağlı olan prolin fosforilasyonun
artmasıyla bağlantılıdır (Gedikli ve ark., 2013). Kapasitasyon sırasında endometriyal
hücrelerden salgılan interlökin-6 (IL-6) sperm hücresinin fertilizasyon kabiliyetini
pozitif olarak etkiler ve kapasitasyonu artırıcı rol oynar. IL-6 kapasistasyon artıcı
etkilerini gösterebilmek için sperm hücresinde yer alan IL-6Rα reseptörüne
bağlanmalıdır (Gedikli ve ark., 2013).
Dişi ve erkek genital kanallarında kapasitasyon önleyici faktörler olarak adlandırılan
bazı maddeler bulunmaktadır. Bu faktörlerin esas amacı erken kapasitasyonu
önlemektir. Kapasitasyonu önleyen bu faktörlerden biri kolestroldur. Kolestrol sperm
hareketliliğini azaltır ve kapasitasyonun başlamasını bloke eder. Sonuç olarak
kapasitasyonun başlamasındaki en önemli etken sperm membranında yer alan
kolestrolün bağlanarak dışarıya atılmasıdır. Böylece spermler ancak ampulla
bölgesine ulaştığında fertilizasyon kabiliyetini kazanmış olurlar.
cAMP, G-protein, kalsiyum redoks ve kinaza bağımlı bir süreç olan kapasitasyonun
gerçekleşebilmesi için ortamda enerji kaynaklarının bulunması gerekir. Bu enerji
kaynakları; glikoz, kalsiyum, bikarbonat ve serum albümindir. cAMP kapasitasyon
olayında ikinci haberci olarak rol oynamaktadır. Hücre içerisinde gerçekleşecek olan
kapasitasyondan protein kinaz A sorumludur. Protein kinaz A’nın inhibisyonu
kapasitasyonu engeller. Kapasitasyon olayı gerçekleşirken gözlenen olaylardan biri
de tirozin fosforilasyonunun yükselmesidir. Tirozin fosforilasyonunun
9
yükselmesinde görev alan en önemli enzim cAMP’dir. Reaktif oksijen türleri ve
cAMP’ye bağlı sinyal mekanizması tirozin fosforilizasyonunu başlatır.
Fosforilasyonun başlaması ile birlikte Ca+2 artışı gözlenir. Tirozin ile fosforile olan
proteinler insan sperminde ZP3 için reseptör olarak görev alır. Reseptör olarak görev
alan proteinler akrozomda yer alır ve tirozin kinaz etkinliğini gösterir. Zona pellusida
da bulunan proteinler ile temas ettiğinde tirozin kinaz etkin hale gelir, tirozin
fosforillenir ve fosfotirozin oluşur. Sperm hücresinin membranında yer alan ve
AKAP (A-kinase anchor protein) adı verilen diğer bir protein ise kinazın etkinliğini
göstermekte ve zona pellusida proteinleri için reseptör görevi üstlenmektedir
(Gedikli ve ark., 2013). Spermatozoa hücreleri ile dişi üreme kanallarında bulunan
epitel hücreleri arasında bir etkileşim meydana gelir ve spermatozoa hücresinin
akrozomal bölgesini örten plazma membranı üzerindeki glikoprotein kılıf ve seminal
plazma proteinleri ortadan kaldırılır. Tüm bu gerçekleşen olaylar sonucunda
kapasitasyon sürecini başarıyla tamamlayan bir sperm hücresi korona radiyata
hücrelerini geçerek akrozom reaksiyonunu başlatabilir (Sadler, 2005).
4.1.3. Erkek İnfertilitesinin Değerlendirilmesi
Günümüzde en sık kullanılan infertilite tanımı; en az bir yıllık korunmasız, düzenli
ilişkiye rağmen gebelik elde edilememesi olarak tanımlanmaktadır (Agarwal and
Allamaneni, 2014).
Eskiden infertilite nedenlerinin sadece kadından kaynaklandığı düşünülüyordu.
Dünya Sağlık Örgütü (WHO) bunun üzerine 1993 tarihinde 7273 infertil çift
üzerinde infertilite nedenlerini araştıran bir çalışma yapmıştır. Bu çalışmanın
sonucuna göre toplumun yaklaşık % 15’inde infertilite sorunu gözlenmiş ve infertil
çiftlerin % 41’inde sadece kadın, % 24’ünde sadece erkek, % 24’ünde hem erkek
hem de kadın faktörü birlikte görülmüştür. Geriye kalan oranın ise infertilite nedeni
belirlenememiştir. WHO’ nun yaptığı çalışmalar sonrası erkek infertilitesi tek başına
ve kadın faktörü ile birlikte tüm infertil vakaların yaklaşık yarısını oluşturmaktadır
(WHO, 1993). Erkek infertilitesinin değerlendirilmesi anamnez, fiziksel muayene ve
ejakülatın laboratuvarda incelenmesi basamaklarını kapsamaktadır. Erkek
infertilitesinin değerlendirilmesinde ilk başvurulan yöntem spermiyogram (semen
analizi)’dır (Burrows et al., 2002).
10
4.1.4. Semen
Testiküler, epididimal ve aksesuar bezlerin salgılarının aksine ejakülat vücutta
bulunmamaktadır. Ejakülat, sadece ejakülasyon sırasında, bu organlardan gelen
salgıların birleşmesi sonucu oluşur (Cooper and Yeung, 2010).
Tablo 1. Semen İçeriğinin Dağılımı
Ejakülasyon Öncesi Bulbouretral bezden salgılanan açık renkli
birkaç damla sıvı
Semenin İlk Kısmı Prostat kaynaklı ve spermden sınırlı sıvı
Semenin Orta Kısmı Testis, epididimis ve vas deferens kaynaklı,
spermden çok zengin
Semenin Son Kısmı Seminal vezikül kaynaklı
(Sunderman and Boerner, 1950)
Ejakülasyon ile dışarı atılan; spermatozoonlar, epididimis ve seminal vezikül (%60),
prostat (%30) ve bulboüretral bezlerin (%10) salgılarından oluşan grimsi opak renkli
sıvıdır. Ayrıca yapısında bu salgılara ek olarak prostaglandinler, epitel döküntüleri,
bağ dokusu gezgin hücreleri, yuvarlak hiyalin cisimler, prostat taşları, lipitler,
proteinler ve pigment granülleri içermektedir.
Spermatozoon semenin yanlızca %1’ inde bulunmaktadır. Bu %1’lik kısım dışında
geriye kalanlar erkek genital bezlerinden salgılanan sıvılardır. Bu salgılanan sıvıların
içeriği spermatozoonu beslemek için früktoz, spermatozoonu immotil hale getiren
üretra ve vajina asit ortamını nötrleyen alkalin salgı, spermatozoonun motilitesini
sağlayan ve artıran, tamponlayan tuzlar ve fosfolipitlerdir. Semenin %90’nını su
oluşturur. Ancak bunun yanında pek çok madde de içermektedir. Bu maddelerden
en belirgin olanı enerji kaynağı olarakta kullanılan früktozdur. Bununla birlikte
vitamin C ve inositol gibi vitaminler ile Ca, Zn, Mg, Cu, sülfür gibi iz elementleri de
içermektedir. Prostaglandin konsantrasyonu vücutta en yüksek semende
bulunmaktadır.
11
Ereksiyon sırasında üretrayı kayganlaştıran bulboüretral bezlerin salgılarıdır.
Ejakülasyon başlangıcında asit fosfataz ve sitrik asitten zengin prostat sıvısı, bunun
arkasından duktus deferens ve duktus epididimisin distal kısmındaki kasların
kontraksiyon gücü ile spermiumlar ejakülata katılır. Son olarak ejakülata katılan
salgı, früktoz ve prostaglandinlerden zengin, koyu kıvamlı seminal vezikül salgısıdır
(Çoruh, 2010).
4.1.4.1. Semen Analizi
1677 yılında Van Leeuwenhoek ve Johan Hamm infertiliteye karşı bilimsel bir bakış
açısı oluşturabilmek amacıyla insan sperminin keşfini tamamladıklarını Londra
Royal Akademi’sine bir mektup ile bildirmişlerdir. İnsan sperminin keşfinden sonra
Schirren, sterilite şeklinde tanımlanabilen evlilik durumlarında bu sorunun erkek mi
yoksa kadından mı kaynaklandığını tespit etmek amacıyla mikroskobik inceleme
yapılmasının gerekliliğini ortaya koymuştur. Semen analizi ile ilgili daha bilimsel
yaklaşımlar 19. yüzyılın sonlarına doğru ortaya konulmuştur. Buna göre Lode,
semen sayımını hemositometre ile gerçekleştirmiştir. Lode yaptığı çalışma sonunda,
araştırılan dört erkek olgunun ortalama sperm konsantrasyonunu 68,88x106 olarak
bulmuştur. Bundan sonra 1941 yılında Hotchkiss sperm motilitesinin
değerlendirilmesi üzerine çalışmalar yapmış daha sonraları 1945 yılında Macleod ve
Heim’da sperm motilitesinin değerlendirilmesi için bir derecelendirme sistemi
bildirmiştir. Geliştirilerek elde edilen bu sistem de sperm hareket ve progresif
motiliteleri ayrı ayrı kaydedilerek ileriye doğru olan hareket; 0- 4 arasındaki skala ile
belirtilmiştir. Sonraki dönemler de Belding, günümüzde de kullanılmakta olan semen
analizine katkıda bulunmuştur. Semen analizine göre; spermdeki baş, orta kısım ve
kuyruk defektleri tek tek ya da kombine olarak belirtilmesi gerektiği ifade etmiştir.
Semen analizi ile ilgili yapılan bu çalışmayı 1934 yılında, Williams’ın spermin baş
kısmındaki vakuollerin varlığı ile akrozomu tanımlaması izlemiştir. Semen
analizinde en iyi standardizasyonu sağlamak amacıyla, Dünya Sağlık Örgütü (WHO)
ilk kitapcığını 1980 yılında yayınlamış sonra bunu sırası ile 1987, 1992, 1999 ve
2010 yıllarındaki farklı basımlı kitapcıklar takip etmiştir (Oehninger and Kruger,
2009).
Erkek infertilitesinde sperm yapı bozuklukları ve aksesuar cinsel bez salgı
bozuklukları %35-40 oranında gözlenmektedir. Erkek infertilitesine neden olan diğer
12
etkenler ise, genital traktüste obstrüksiyon ve sperm işlev bozukluklarıdır. İnfertil bir
çiftte ilk olarak araştırmalara semen analizi ile başlanması kabul gören bir
uygulamadır. (Hassa, 2003).
13
Tablo 2. Terminoloji
TERMİNOLOJİ
ASPERMİ Seminal sıvı yokluğu (retrograd ejakülasyon var
veya yok)
ASTENOZOOSPERMİ İleri hareketli spermlerin yüzdesi alt referans
limitinden düşük olması
ASTENOTERATOZOOSPERMİ Hem ileri hareketli spermlerin hemde morfoloji
bakımından normal spermlerin yüzdesinin alt
referans limitinden düşük olması
AZOSPERMİ Ejakülatta hiç spermatozoa bulunmaması
HEMOSPERMİ Ejakülatta eritrosit yüzdesinin alt referans
değerinden yüksek olması
LOKOSPERMİ Ejakülatta eşik değer üstünde lökosit bulunması
NEKROZOOSPERMİ Ejakülatta yüksek miktarda cansız spermler, düşük
miktarda canlı ve bulunması
KRİPTOZOOSPERMİ Taze preparatta sperm olamasına rağmen
santrifüjlenme sonra ejaküllatta sperm gözlenmesi
NORMOZOOSPERMİ Belirlenmiş referans limitlerine eşit veya yüksek
toplam sperm sayısı, ileriye doğru hareketli ve
morfolojik olarak normal spermatozoon yüzdeleri
OLİGOZOOSPERMİ Belirlenmiş referans değerlerinden düşük sperm
sayısı
OLİGOASTENOZOOSPERMİ Belirlenmiş referans değerlerinden düşük sperm
sayısı ve düşük ileri harekeli spermatozoa yüzdesi
OLİGOASTENOTERATOZOOSPERMİ Belirlenmiş referans limitlerinden düşük toplam
sperm sayısı, hem ileri hem morfolojik olarak düşük
yüzdeli spermler
OLİGOTERATOZOOSPERMİ Belirlenmiş referans değerlerinden daha düşük
sperm sayısı ve morfolojik olarak alt referans
değerinden düşük yüzdeli spermler
TERATOZOOSPERMİ Belirlenmiş referans limitinden düşük yüzdeli
14
TERMİNOLOJİ
morfolojik olarak normal spermler
HiPERSPERMİ Semen hacminin 6 ml’den daha fazla olması
HİPOSPERMİ Semen hacminin 1ml’den ve daha az olması
GLOBOSPERMİ Spermatozoada akrozom bulunmaması
(WHO, 2010)
Numune toplama
• Semen numunesinin değişen ortam sıcaklığındaki değişikliklere maruziyetini
minimuma düşürmek, numunenin alınmasıyla semen analizi arasındaki süreyi
kontrol edebilmek için numunenin laboratuar yakınındaki özel bir odada verilmesi
uygundur.
• Semen numunesi minimum iki maksimum yedi günlük cinsel perhizden sonra
alınmalı. Ekstra semen örneği gerekirse, her defasında cinsel perhiz süresi sabit
tutulmalıdır.
• Örnek verecek olan kişiye test ile ilgili anlaşılır sözlü ve yazılı bilgilendirme
yapılmalı. Semen örneğinin tümünün toplanmasının önemi anlatılmalı. Kısmı bir
kayıp yaşanması halinde durumun laboratuvar çalışanına bildirilmesi gereği
vurgulanmalıdır.
• Raporda yer alması gereken bilgiler: Kişinin adı-soyadı, yaşı, hastaya ait kod
numarası, cinsel perhiz süresi, numunenin laboratuvara teslim edildiği tarih ve saat,
kısmı bir kayıp yaşanılıp yaşanılmadığı, hastada örnek verme güçlüğü olup olmadığı,
numunenin likefikasyon süresi.
Tanısal veya araştırma amacıyla semenin toplanması;
• Semen örneği mastürbasyon yöntemi temin edilmeli, ejakülat spermatozoa için
toksik olmadığı kanıtlanmış tercihen plastik veya cam steril, geniş çaplı bir ağzı olan
kap içine alınmalıdır.
15
• Ejakülasyondan sonra temin edilen semen örneği değişen ortam sıcaklığına karşı
maruziyeti azaltmak için oda sıcaklığında bekletilmeli.
• Örnek verilecek kabın üzerine hastaya ait bilgiler doğru ve eksiksiz yazılmalı.
• Örneğin likefiye olması için numune kabı 37°C bir sıcaklığı olan inkübatörde
bekletilmeli.
• Hasta kısmi bir kayıp yaşadıysa, özellikle ilk spermden zengin kısım eksikse bu
durum raporda muhakkak bildirilmeli ve testin tekrarı önerilmeli (Kadıoğlu ve ark.,
2011).
Semen analizinde spermin makroskobik incelenmesi
Semen analizi (spermiyogram), örnek likefiye olduktan hemen sonra gözle muayene
ile başlamalıdır. Değişen ortam koşullarının semen kalitesi üzerine olumsuz etkilerini
en aza düşürebilmek için, ejakülasyondan sonra minimum 30 dakika, maksimum 60
dakika içerisinde sperm analizi gerçekleştirilmelidir (Kadıoğlu ve ark.,2011)
Renk ve Koku
Taze ve normal bir semen viskoz, homojen, rengi gri-beyaz ve opaktır. Spermin opak
görünümünde azalma konsantrasyonun az olduğuna işarettir. Sperm konsantrasyonu
yüksek ise rengin beyaz, cinsel perhiz süresinin uzunluğu veya enfeksiyon olması
halinde rengin sarı, ürogenital sistem kanamaları ve spermde eritrosit olması
durumunda semenin kırmızı veya kahverengi renkte olması beklenir. Semen kendine
özgü kestane çiçeği kokusundadır ve bu kokunun nedeninin prostat sıvıları olduğu
düşünülmektedir. Koku,perhiz süresi, enfeksiyona bağlı olarak değişir ve bilgi verir
(Çoruh, 2010).
Likefikasyon
Ejakülasyondan hemen sonra steril sperm toplama kabına alınan semen yarı katı bir
formdadır. Semenin oda sıcaklığında birkaç dakikada likefiye olması beklenir. Bu
sırada semen içerisinde heterojen topakların görülmesi normaldir. Likefikasyon
süresi minimum 15 dakika maksimum 1 saattir. 1 saat içerisinde likefikasyon
gerçekleşmezse bu durum raporda muhakkak bildirilmelidir (Kadığlu ve ark.,2011).
16
Semen Viskozitesi
Likefiye olan semen yavaşça 1,5 mm genişlikli tek kullanımlık steril plastik
pipetlerle al ver şeklinde aspire edilir. Pipet içine çekilen örnek damlamaya
bırakıldığında meydana gelen ipilikçikler gözlenerek semen örneğinin viskozitesi
belirlenir. WHO 2010 kriterlerine göre normal kabul edilen viskozite, semenin
pipetten küçük damlalar halinde damlamasıdır. Başka bir viskozite ölçümüde semen
örneğinin içine steril cam çubuk batırılır. Cam çubuk geri çekildiğinde meydana
gelen iplikçik uzunluğu viskozite hakkında bilgi verir. İplikciğin 2 cm’den uzun
olması viskozitenin normal olmadığı şeklinde kabul edilir. Likefiye olmamış semen
örneğine göre, viskoz semen örneği yapışkan, zaman ile kıvamı değişmeyen ve
esnemeyen bir yapıya sahiptir. Pipetle aspire edilmek istendiğinde yapışkan ve
kitlesine bağlı olduğundan aspire edilmez (Kadıoğlu ve ark., 2011).
Semen Hacmi
Ejakülat hacmini seminal keseden ve prostattan daha düşük oranla bulboüretral
bezler ve epididimden salgılanan sıvılar meydana getirmektedir. Semen analizinin
doğru bir sonuç verebilmesi için hacmin doğru ölçülmesi gerekmektedir. Çünkü
hacim ejakülatta bulunan sperm ve sperm dışı hücrelerin toplam sayısının
hesaplanmasında kullanılmaktadır. Kliniklerde en çok tercih edilen yöntem
piyasadan kolaylıkla temin edilebilecek derecelenmiş konik tüplerdir. Semen örneği
konik tübe eklenerek semen hacmi doğrudan okunabilir.
Hacim ölçülmesinde kullanılan bir diğer yöntem ise;
• Örnek ağırlığı önceden ölçülmüş steril bir kaba alınır.
• Kap semenle birlikte tartılır.
• Kabın ağırlığı çıkarılır.
• Semen yoğunluğunun 1 g/ml olduğunu kabul edilerek örnek ağırlığından hacmi
belirlenir. (Kadıoğlu ve ark., 2011).
17
Semen Ph’sı
Başlıca alkali seminal kese salgısı ile, asidik prostat salgısı ve farklı aksesuar bez
salgılarının pH değerleri arasındaki denge semen pH’sını ifade eder. Semen pH’sı,
tercihen 30 dakika içinde ölçülmelidir. Ancak değişen ortam koşullarının sonuçları
negatif bir etki göstermemesi için pH tayini bir saat içinde mutlaka yapılmış
olmalıdır. Fertil erkeklerin seminal pH’sına ait halen az sayıda referans değer
bulunmaktadır. WHO 2010 kriterlerine göre semenin ideal pH’sı 7.2’dir (Kadıoğlu
ve ark., 2011).
Semen analizinde spermin mikroskobik incelenemsi
Faz kontast mikroskobu, likefiye olmuş taze ejakülatlardan hazırlanan preparatların
incelenmesinde kullanılır. Örnek ilk olarak mikroskop altında X10’luk bir büyütme
altında taranmalı. Bu tarama ile örnekte sperm agregasyonu, sperm aglütinasyonu,
sperm hareketliliği, sperm dışında hücrelerin varlığı (lökositler ve immatür germ
hücreleri) ve izole sperm başları veya kuyrukları değerlendirilir (Kadıoğlu ve ark.,
2011).
Mikroskobik değerlendirmeye başlamadan önce dikkat edilmesi gereken en önemli
faktör örneğin iyice karıştırılmasıdır. Örnek steril plastik pipet ile nazikçe
karıştırılmalı, yüksek hızlı karıştırıcı kullanımından kaçınılmalıdır. Eğer semen iyi
karıştırılmamış ise aynı semen örneğinin iki farklı değerlendirilmesinde farklı
sonuçlar elde edilebilir (Gökçe, 2011).
18
Tablo 3. Semen Analizi Normal Referans Değerleri
Parametreler Değerler
Görünüm Homojen, gri-opak
Ph 7.2- 8.0
Viskozite < 3
Sperm sayısı (Spermatozoa / ml) >15 x 106 ( %95 CI: 12- 16)
Total Sperm Sayısı (Spermatozoa /
ml) > 39 x 106 ( %95 CI: 12- 16)
Total Hareketlilik (progresif +
nonprogresif)
> %40 (%95 CI: 38-42)
Progresif Hareketlilik > %32 (%95 CI: 31-34)
Progresif Hareketli SpermSayısı
(Spermatozoa / ml) 3 x 106
Morfoloji >%4 normal (%95 CI: 3-4)
Vitalite >58 (%95 CI: 55-63)
(WHO, 2010)
Sperm Aglütinasyonu
Aglütinasyon, vital ve motil spermlerin birbirine baş-başa, kuyruk-kuyruğa veya
karışık ve yapışık bir arada bulunması durumudur. WHO 2010 kriterlerine göre
aglütinasyon skalası aşağıda belirtilmiştir:
Grade 1 (İzole): Aglütinasyon başına ayrılmış sperm <10 sperm. Spermlerin çoğu
birbirinden ayrıdır.
Grade 2 (Orta): Aglütinasyon başına 10 ile 50 sperm birbirine yapışık halde görülür.
Grade 3 (Geniş): Aglütinasyon başına 50’ den fazla sperm birbirine yapışıktır, bazı
spermler serbest haldedir
Grade 4 (Bütün): Bütün spermler birbine yapışık haldedir ve bağlantılar arası yoğun
bir şekilde aglütinasyon görülür (Özçınar, 2014).
19
(WHO, 2010).
Şekil 3. Farklı sperm aglütinasyon derecelerinin şematik diyagramı
İlgili Kısım İZOLE ORTA GENİŞ YOĞUN
Baş-Başa
Kıyruk-
Kuyruğa
Kuyruk ucu -
Kuyruk
ucuna
Karışık; baş
başa ve
kuyruk
kuyruğa
Yumaklaşmış
; baş kuyruk
birbirine
karışmış
20
Yuvarlak Hücre ve Lökositlerin Ayrımı
Semende sperm hücresi dışında; ürogenital sistem kaynaklı epitel hücrelerine,
lökositlere, eritrositlere ve immatür germ hücrelerine rastlanabilmektedir. Semende
gözlenen yuvarlak hücreler lökositler ve immatür germ hücreleridir.
Laboratuvarlarda yapılan rutin semen analizinde bu iki hücrenin ayrımında
zorlanılmaktadır. Yuvarlak hücre konsantrasyonu semende 5 milyon/ml’yi geçtiği
zaman lökosit ve immatür germ hücrelerini birbirinden ayırmak gerekir.
WHO’ya göre semende 1 milyon/ml’den fazla lökosit bulunmasını anormal kabul
edilir ve semende lökosit sayısının artması lökospermi olarak adlandırılır. Bu durum
özellikle infetil erkeklerde yaygın görülür ve genel popülasyonda % 10-20’lik bir
yoğunluğa sahiptir. Bununla birlikte, seminal lökositlerin daha düşük
konsantrasyonlarının (0-1 milyon/ml) semende gözlenmesi yaygın bir durumdur ve
enfeksiyon yokluğunda bile rastlanabilir (Rodin et al., 2003; WHO, 2010).
Seminal lökositlerin semen kalitesini etkilediği günümüzde hala tartışılan bir
konudur. Lökospermi durumunda lökositlerin reaktif oksijen türlerini arttırarak
sperm hücresinin motilite ve vitalitesini negatif yönde etkilediği düşünülür. Semende
yüksek oranda lökosit gözlenmesi; genital sistem enfeksiyonu yada inflamasyon
ihtimalini düşündürmeli ve lökositleri immatür germ hücrelerinden ayırmak için özel
testler yapılmalıdır. Bu testler; intraselüler peroksidaz varlığına dayalı testler ve
lökosite spesifik olan antijen testleridir. Semende en sık gözlenen lökosit türü
nötrofillerdir. Nötrofiller intraselüler peroksidaz içerirler. Ortama benzidin ve
hidrojen peroksit ilave edildiğinde lökositler kahverengiye boyanırlar (Aktan, 2011).
LeucoScreen adındaki ticari kit peroksidaz içeren lökositleri kahverengiye boyayarak
ayrımı kolaylaştırır ve pratikte tercih edilmektedir. Bu yöntemle nötrofiller, immatür
germ hücrelerden ve peroksidaz içermeyen diğer lökosit türlerinden ayrılırlar.
Peroksidaz içeren veya içermeyen bütün lökositlerin immatür germ hücrelerden
ayrımı için daha pahalı ve zaman alan immune histokimyasal yöntemler
kullanılabilir. İmmune histokimyasal yönteme göre; lökositlerinin tümü uygun bir
monoklonal antikor ile belirlenmiş kendine özgü antijen olan CD45 içermektedir ve
kırmızı renge boyanırlar (WHO, 2010).
21
Sperm Motilitesi
Sperm hücresinin linner hızlı hareketliliği ile gebelik arasında doğrudan bir ilişki
vardır. Ejakülattaki sperm hareketliliğinin tayini, örneğin likefikasyonundan sonra
tercihen en kısa 30 dakikada, en uzun 60 dakika içerisinde mutlaka değerlendirilmeli.
Böylelikle, ortam ısı değişikliliği, sıvı kaybı (dehidratasyon) ve pH değişimlerinin
sperm hareketliliği üzerindeki negatif etkileri sınırlandırılmış olur.
Spermatozoonun motilite tayini yapılırken, spermatozoon hareketleri 4 gruba ayrılır:
1 ) +4 hareketli spermatozoonlar; düz bir şekilde ileri yönde hızlı hareket ederler.
2 ) +3 hareketli spermatozoonlar; ileri yönde yavaş hareket ederler.
3 ) +2 hareketli spermatozoonlar; bulundukları yerde hareket ederler.
4 ) +1 hareketli spermatozoonlar da oldukları yerde hareketsiz (immotil) halde
durmaktadırlar.
Motilite, hareketlilik anlamına gelir ve +2, +3, +4 hareketli spermatozoonların
toplam oranıdır. Hızlı hareketli spermatozoon sayısı (PHSS) sadece +4 ve +3
hareketli spermatozoonların oranını ifade etmektedir (WHO, 2002).
Ejakülattaki ileri hareketli spermatozoa sayısı; toplam sperm sayısının, ileri hareketli
hücrelerin yüzdesiyle çarpılması ile elde edilmektedir (Kadıoğlu ve ark., 2011).
Spermatozoona hareket enerjisini, orta kısımda yer alan mitokondrilerin ürettiği ATP
enerjisi ve kuyruğun anatomik ve işlevsel olarak sağlıklı olması verir (Kadıoğlu ve
ark., 2011).
Ejakülasyondan 2 saat sonra spermatozoanın %50’sinin hareketlerini devam
ettirmeleri beklenmektedir. Bu değer %30’un altına düşmemesi beklenir. Motilite
tayini özellikle düşük ısılardan etkilendiğinden, semen likefikasyonu süresince
semen örneğinin 37°C’ye ayarlı inkibatörde bekletilmesi, mikroskobik
incelemeninde tercihen ısı ayarlı objektifi bulunan mikroskopta yapılması
önerilmektedir. Hareketsiz her sperm ölü sperm olarak kabul edilmez. Spermatozoa
immotilitesi ile ölü spermatozoa birbirinden farklı kavramlardır (Kadıoğlu ve ark.,
2011).
22
Sperm Sayısı
Ejakülatta ki sperm konsantrasyonu ve toplam sperm sayısı, gebelik ve gebeliğe
kadar geçen süre ile belirleyicidir (Gökçe, 2011).
Semende var olan sperm sayısı, cinsel perhiz süresine ve testis hacmine bağlı olarak
değişiklik göstermektedir. Eğer bir erkeğin ejakülator kanal tıkanıklığı ve uzun bir
cinsel perhiz süresi yoksa total sperm sayısı testis hacmi ile bağlantılıdır. Total sperm
sayısı testis hacmi ile bağlı olması, testislerdeki sperm hücresi üretme kapasitesini
hakkında bilgi verir fakat sperm konsantrasyonu seminal vezikül ve prostat
sekresyonlarıyla seyreltildiği için testis işlevinin değerlendirilmesinde spesifik
değildir (Eliasson, 1975; Handelsman et al., 1984).
Spermatozoon sayısının belirlenmesinde, semenden alınan bir damla örnek ince bir
tabaka halinde, Makler kamerası, hemositometre, lam-lamel arası, Thoma lamı ve
Hoffman sayacında değerlendirilir. WHO kriterlerine göre 15 milyon/ml ve üzeri
olan sperm sayısı normal olarak kabul edilir. Spermatozoon konsantrasyonu
milyon/ml olarak değerlendirilmektedir (WHO, 2002).
Günümüzde spermatozoa sayımı yaygın olarak Makler sayım kamerası kullanılarak
yapılır. Bir damla semen derinliği 10 μm olan Makler kamerasının ortasına
damlatılır, kameranın üzerine her biri 0,1 x 0,1 mm boyutlarında 100 kareden oluşan,
1 mm2
boyutlarında grid camı kapatılır. Böylece, Makler kamerası yardımı ile sabit
hacimde semenin incelenmesi mümkün olur. Grid üzerinde 10 küçük kare sayılır ve
sonuç milyon cinsinden 1 ml’deki spermatozoa sayısını verir (WHO, 2010).
23
(Çoruh, 2010).
Şekil 4. Makler kamerası ile konsantrasyon ölçümü
(Çoruh, 2010)
Şekil 5. Konsantrasyon Ölçümü
24
Spermatozoon Vitalitesi
Ölü spermler ile hareketsiz ama canlı olan spermler birbirinden hücre membranı
varlığı ile ayrılır. Bu ayrımı yapmak klinik açıdan oldukça önemlidir. Çünkü çok az
sperm hareketi olan veya immotil spermleri olan hastalara ICSI tedavisi
uygulayabilmek için spermin canlı olup olmadığının belirlenmesi gerekir (Casper et
al., 1996).
WHO’nun 2010 kriterlerine göre ileri hareketin ≤ 40 olduğu durumlarda canlılık
testinin yapılması önerilmiştir. Spermde canlılık değerlendirilmesi, sperm
hücrelerinin dış ortamdan negatif olarak etkilenmemesi için en kısa 30 dakika veya
ejakülasyondan sonraki en uzun 60 dakika içerisinde mutlaka değerlendirilmeli.
Hastalara uygulanacak tedavinin kararında spermlerin canlı olup olmadığı oldukça
önemlidir. Spermde ki hareketli sperm sayısı ve sperm canlılığı ile birlikte
değerlendirilmesi önerilmektedir. Hareketsiz olarak gözlenen ancak canlı olan sperm
sayısının fazla olmasının sebebi kuyruktaki yapısal defektler olabilir. Spermlerin
hem ölü hem de hareketsiz spermlerin sayıca fazla olması epididimal bir patolojinin
göstergesidir (Gökçe, 2011).
WHO canlılık değerlendirilmesinde normal membran bütünlüğü olan spermlerin alt
referans sınır değerini 1999 kriterlerin de % 75 olarak bildirmiş, 2010 kriterlerinde
çalışmaya katılan örneklerin % 95 güven aralığı 55-63 olduğu için % 58’e
düşürmüştür. 2010 kriterlerin de canlılık belirlemek için 1106 semen örneğinde
eosin-nigrosin yöntemi kullanılmıştır. Canlılık belirlemede bu yöntemden başka
Eosin-Y ve hipoosmotik şişme (HOS) yöntemleride kullanılmaktadır (Chiles and
Schlegel, 2015).
Eosin-Y; pratik bir yoldur ancak lam lamel arası taze hazırlanan örnekler olduğu için
saklanamazlar. Ölü olan sperm hücrelerin membranları hasarlı olduğu için hücre
içine boya girişi olur ve ölü hücreler pembe renkte boyanırlarken, canlı hücreler
boyanmayarak ayırt edilir (WHO, 2010).
25
(Doğan, 2008)
Şekil 6. Eosin Y ile Boyanmış Spermatozoon
Eosin pozitif (ölü spermatozoon) ( ), Eosin negatif (vital spermatozoon)
( ).
Eosin-Nigrosin; Eosin Y’den farklı olarak arka planda kontrastı arttırarak sperm
başlarının daha kolay ayırt edilmesini sağlamak için nigrosin kullanılmaktadır.
Eosin-Nigrosin ile boyanan örnekler uzun yıllar saklanabilirler. Eosin-Y boyamada
olduğu gibi ölü sperm hücreleri pembe boyanırken, canlı hücreler boyanmazlar
(WHO, 2010).
Hipoosmotik şişme testi (HOST); ICSI yönteminde canlı sperm seçerken, sperm
boyanmasından kaçınılır ve bu test tercih edilir. Sağlam membranı olan sperm
hücreleri canlıdır ve hipoosmotik bir ortama konduğunda şişmesi ve sıvı membran
boyunca taşındıkça kıvrılması beklenir (WHO, 2010).
26
(WHO, 2010)
Şekil 7. Hipoozmatik Strese Maruz Bırakılan İnsan Spermatozoasının Morfolojik
Değişiminin Şematik Görünümü
Spermatozoon Morfolojisi
Semen analizinin en önemli basamaklarından biri olan morfolojik değerlendirme,
spermin yapısal özelliklerini ortaya koyar. Normal ya da anormal yapıya sahip olan
sperm hücresinin yapısal özelliklerinin değerlendirilmesinde; faz kontrast
mikroskobu, ışık mikroskobu, elektron mikroskobu ve çeşitli boyama teknikleri
kullanılmaktadır (Aydos, 2007). Morfoloji değerlendirilmesinde kullanılan
boyalardan başlıcaları Papanicolaou, Shorr ve DiffQuick boyalarıdır. Bu boyalarla
baş akrozomal bölge açık mavi, postakrozomal bölge koyu maviye boyanır. Orta
kısım kırmızıya, kuyruk kısmı mavi veya kırmızıya yakın bir renge boyanır. Başın
arka kısmı veya orta kısımda bulunan sitoplazmik artıklar Papanicolaou boyası ile
pembe yada kırmızı, Shorr boyası ile kırmızı ile turuncu arası bir renge boyanır.
Papanicolaou boyama yöntemi sperm ve diğer hücrelerin iyi boyanmasını sağlar.
Shorr boyama yöntemi normal formlu spermler için Papanicolaou boyamasına
benzer sonuçlar verir. Klinik laboratuarlarda özellikle gün içerisinde sonuç
verilebilmesinden dolayı kullanışlı kabul edilen DiffQuick boyama yöntemidir.
DiffQuick boyama yöntemi zemini çok fazla boyamaması sebebiyle Papanicolaou
boyaması kadar kaliteli sonuçlar vermez. Boyanmış preparatlar immersiyon yağı
kullanılarak X100’lük objektifte değerlendirilir (Gökçe, 2011).
27
Normal Sperm Morfolojisinin Sınıflandırılması
WHO, sperm morfolojisini değerlendirirken bir spermin normal mi yoksa anormal
mi olduğunu belirlemek için Kruger’in kesin ölçütlerini kullanmayı önermektedir
(Hassa, 2003).
Spermlerin morfolojik olarak normal olup olmadığını değerlendirirken sperm baş,
boyun, kuyruk bölgesi değerlendirilir.
Bir sperm hücresi; baş, boyun, orta kısım, ana kısım ve son kısımdan meydana
gelir. Son kısım ışık mikroskobu ile görülemediği için, sperm hücresi baş, boyun ve
kuyruktan oluştuğu kabul edilir. Sperm hücresinin normal olarak kabul edilebilmesi
için bu parçaların belirli kriterleri sağlaması gerekir.
Baş bölgesi düzgün, sınırları belirli ve oval şekilli olmalı. Akrozom bölgesi başın
%40-70’ini kaplamalı ve sınırları belli olmalıdır. Akrozom bölgesi vakuol
içermemeli, var olan vakuol sperm başının %20’sinden fazlasını kaplamamalıdır.
Post akrozomal bölge herhangi bir şekilde vakuol olmamalıdır.
Orta kısım sperm başı uzunluğunda, sınırları belirli ve ince yapılı olmalıdır. Orta
parçanın ana eksen ile sperm başının ana ekseni aynı hizada bulunmalıdır.
Ana kısım, yaklaşık 45 μm uzunluğunda, orta parçadan ince ve uzunluğu boyunca
genişliği değişmemelidir. Kuyruk kırık olmadığı sürece kendi üzerinde veya halka
şeklinde kıvrılıyor olması normaldir (Kadıoğlu ve ark., 2011).
Anormal sperm morfolojisinin sınıflandırılması
Ejakülattaki spermatozoonlar çeşitli anomaliler içermektedir. Anormal morfolojili
sperm sayısının artmasının sebebi defektif spermatogenez ve epididim patolojileridir.
Morfolojik defektler genellikle karma defektlerdir. Anormal sperm hücreleri anomali
tiplerine bağlı olarak düşük fertilizasyon oranı ve kötü embriyo gelişimi
sonuçlanırlar. Morfolojik olarak normal kabul edilmeyen spermlerin DNA’sıda
normal olmayabilir. Anormal morfolojinin sebebi, artan DNA parçalanma süreci,
28
yapısal kromozom anormallikleri, immature kromatin ve anöploidi insidansında artış
olabilir. Bu nedenle, sperm kuyruğu morfolojik olarak önemli olmasına rağmen,
başın şekli özellikle vurgulanmıştır (Kadıoğlu ve ark., 2011).
Baş defektleri; büyük, küçük, sivri şeklinde, akrozom içermemesi veya irregular
akrozomal dağılım gözlenmesi, vakuoller içermesi ve bunların çeşitliliği.
Boyun ve orta parça defektleri; orta parçanın baş kısmına simetrik bağlanmaması,
aynı hizada bulunmaması, kalın veya düzensiz, kıvrılmış ve kırık olması, normal
kabul edilemeyecek ölçüde ince veya bu defektlerin çeşitliliği.
Ana parça defektleri; çok sayıda kırık bulunması, normal kabul edilmeyecek
şekilde kısa veya kalın olması, keskin kıvrımlar içermesi, sarmal veya bu defektlerin
çeşitliliği (Kadıoğlu ve ark., 2011).
(Kadıoğlu ve ark., 2011).
Şekil 8. İnsan Spermatozoasının Normal ve Anormal Formları
29
4.1.4.2. Sperm Hazırlama Yöntemleri
Direkt yüzdürme tekniği (Swim-up)
Yüzdürme (swim-up) tekniği, spermlerin seminal plazmadan dışarı, kültür medyumu
içinde yüzme yeteneklerine göre seçilmesidir. Yüzdürme tekniğine başlamadan önce
örnek seyreltilmemelidir ve santrifüjlenmemelidir. Özellikle santrifüjleme işlemi
sperm membran hasarına neden olabilir (Aitken and Clarkson, 1988). Swim up
tekniği motil spermlerin ayrılmasında tercih edilmektedir (Mortimer, 1994). Likefiye
olan semen örneği üzerine kültür medyumu yayılarak swim up yöntemi uygulanır. 1
saat inkübe edilen örnekte bulunan motil spermlerin kültür medyumuna yüzmesi
beklenir. Bu yöntem IVF ve ICSI işlemi için çok fazla tercih edilmemektedir.
Motiliteye gore seçilim yapan bir tekniktir (WHO, 2010).
Direk Yüzdürme Tekniği Uygulama Prosedürü
1. Semen örneği tek kullanımlık steril bir pipetle nazikçe karıştırılır.
2. Steril 15 ml’lik konik santrifüj tübüne 1 ml semen eklenir ve semen örneği rahatsız
edilmeden üzerine 1,2 ml kültür medyumu eklenir. Alternatif olarak kültür medyum
altına dikkatle semen pipetlenebilir.
3. Semen-kültür medyumunun oluşturduğu ara yüzey alanını genişletmek amacıyla,
tüp yatay düzlemle 45 derecelik bir açı yapacak şekilde eğilir, 37°C’lik inkübatörde
1 saat bekletilir.
4. İnkübasyondan sonra tüp nazikçe dik konuma getirilir ve kültür medyumu
pelletten ayrılır. Bu kısım +4 ve +3 hareketli sperm hücrelerini içerir.
5. Bu kısım, kültür medyumunun 1,5–2,0 ml’siyle seyreltilir.
6. 300–500 g’de 5 dakika boyunca santrifüjlenir ve üst faz pellet rahatsız edilmeden
atılır.
7. Sperm konsantrasyonu, toplam motilite ve ileri hareketli sperm sayısını
değerlendirmek amacıyla, 0,5 ml kültür medyumu içinde sperm pelleti yeniden
süspansiyon haline getirilir.
30
8. Teşhis, tedavi ve araştırma amacıyla testlerde doğrudan işlenmemiş örnekler
kullanılabilir (WHO, 2010).
(Beydola et. al., 2013).
Şekil 9. Swim-up Tekniği
Kesintili dansite gradyanları (Gradient Yöntemi)
Kesintili dansite gradyanları; kaliteli sperm seçilimi, sperm hücrelerini diğer
hücrelerden ve hücre döküntülerden ayırt edilmesi için kullanılan sperm yıkama
yöntemidir. Swim up yöntemine göre daha tutarlı sonuçlar verir. Klinikte IVF ve
ICSI işlemlerinde gradient yöntemi tercih edilir.
Gradient yöntemi, seminal plazmanın yoğunluk gradyanlarına göre
santrifüjlenmesini kullanır. Gradient yönteminde piyasadan kolaylıkla temin
edilebilecek kolloidal silika kaplı silan içeren kültür medyumu kullanılmaktadır.
Kullanılan bu medyum hücreleri yoğunlukları bakımından ayrıştırır. Motil sperm
hücreleri gradyan materyalini aşarak konik tübün dip kısmında bir pellet meydana
getirir. Kliniklerde yaygın olarak iki aşamalı dansite gradyanı tercih edilir. Bu iki
aşamalı dansite gradyanın üst kısmında % 45 ‘lik katman alt kısmında % 90’lık
katman tercih edilir. Gradient yöntemi kullanılarak hazırlanan sperm preparatları;
31
hücre döküntülerini, immatür germ hücrelerini, kontamine edici lökositleri,
dejeneratif germ hücrelerini ayırır. Geriye +4 ve +3 hareketli spermler ile morfolojik
olarak normal kabul edilen spermler kalır.
Ejakülatın işlenmesi için uygun dansite gradyanları hazırlamak için piyasada pek çok
ticari ürün bulunmaktadır. Bu ürünler üretici firmanın önerdiği şekilde
kullanılmalıdır. Firmanın belirttiği prosedürlerin dışına çıkılmamasına dikkat
edilmelidir. Dansite gradyan medyumlarının genel özellikleri, yapısal olarak düşük
osmolaliteye sahip olmaları, göreceli yüksek moleküler kitleli bileşenleri içerdiği
için, çoğunlukla dişi üreme yolu sıvılarına benzer izoozmotik bir kültür
medyumunda hazırlanması önerilmektedir (WHO, 2010; Beydola et. al.,2013 ).
Gradient Yöntemi Prosedürü
1. 1 ml % 45 dansite gradyan medyumunu 1 ml % 90 dansite gradyan medyumu
üzerine yayarak 15 ml’lik konik tüp içerisinde dansite gradyan medyumu hazırlanır.
2. Semen örneği tek kullanımlık steril bir pipetle nazikçe karıştırılır
3. Dansite gradyan medyumu üzerine 1 ml semeni yerleştirip 20 dakika 300–400
g’de santrifüjlenir. Gerektiği durumlarda bir semen örneği için için birden fazla
sayıda tüp kullanılabilir.
4. Santrifüjleme işlemininden sonra sperm pelleti rahatsız edilmeden üst fazın çoğu
atılır.
5. Yavaşça pipetlenerek (kontamine edici dansite gradyan medyumunun dışarı
alınmasına yardımcı olmak için), 5 ml takviyeli medyum içinde sperm pelleti
yeniden süspansiyon haline getirilir ve 5 dakika 200 g’de santrifüjlenir.
6. Yıkama işlemini tekrarlanır.
7. Meydana gelen son pellet takviyeli kültür medyumu içinde yavaşça pipetlenir ve
süspansiyon haline getirilir.
8. Son olarak motilite ve konsantrasyon tayini gereçekleştirilir (WHO, 2010;
Beydola et. al.,2013).
32
(Beydola et. al.,2013).
Şekil 10. Dansite gradient santrifüjleme
4.2 Antioksidanlar
Antioksidanlar, yükseltgenebilen substratlara oranla daha düşük derişimlerde,
substratın prooksidanlarla (reaktif oksijen türleri, serbest radikaller ve azot türleri)
başlatılan oksidasyonu önemli ölçüde geciktirebilir ve engelleyebilirler. Böylelikle
meydana gelebilecek doku hasarının önüne geçebilirler. Prooksidanların hedefinde
lipitler, proteinler ve nükleik asitler vardır. Prooksidanlar oksidatif hasara sebep
olarak çeşitli patolojik olaylara ve hastalıklara sebeb olabilecek toksik maddelerdir.
Antioksidanlar, prooksidanların harabiyetini en aza indirebilmek için bu maddeleri
düşük toksiteli ve toksik olmayan maddelere dönüştürebilmektedirler (Cao and Prior,
1999).
33
4.2.1. Antioksidanların Sınıflandırılması
(Ugar, 2016)
Şekil 11. Antioksidanların Sınıflandırılması
Antioksidanlar, yapılarına göre enzimatik ve enzimatik olmayanlar olmak üzere 2
grupta sınıflandırılırlar.
Enzimatik olmayan antioksidanlar eksojendirler ve birçoğu dışarıdan diyetle
alınırlar. Bunlar; albumin, glutatyon, askorbik asid, tokoferol, karoten, koenzim Q10,
lutein, ürik asid, bilirubin, flavonoidler ve birçok polifenolik bileşiklerdir.
Enzimatik antioksidanlar, endojendirler ve antioksidan savunma sisteminde görev
almaktadırlar. SOD, GPX, GSSG-Red ve CAT gibi enzimleri içerirler (Sroka and
Crsowski, 2003).
34
4.2.2. Antioksidan Savunma Sistemi
Antioksidan savunma sistemi veya kısaca antioksidanların ana görevi oksidan
moleküllerin oluşturduğu hasarı etkisiz hale getirmektir. Organizmalarda, birçok
farklı endojen enzimatik antioksidan, hem hücre içi hem de hücre dışı ortamda
bulunmaktadır. Glutatyon peroksidaz (GPX), katalaz (CAT), glutatyon redüktaz
(GR), süperoksit dismutaz (SOD) ve glutatyon-S-transferaz (GST) bunlara örnek
olarak verilebilir. Antioksidan enzimler, ROS’un zararlı etkilerine karşı geliştirilen
antioksidan savunma sisteminin en önemli parçasıdırlar. Antioksidan savunma
sistemi hücrelere zarar veren reaktif oksijen türlerini etkili şekilde süpürerek düşük
toksiteli veya toksik olmayan ürünlere dönüştürebilmektedirler. Böylece organizma
reaktif oksijen türlerinden etkilenmez. Bu reaktif bileşiklerin varlığı, sağlıklı bir
yaşam için antioksidan enzimleri önemli kılar. Biyolojik yapılarda mevcut olan
enzimatik antioksidanlar çeşitli reaktif oksijen türlerinin (•OH, O2.- ve H2O2)
süpürücüleri olarak bilinirler. Ayrıca SOD, GPX, GSSG-Red ve CAT gibi
antioksidan enzimler, çeşitli hastalıkların tanısı ve tedavisinde de önemli rol oynarlar
(Cao and Prior,1998).
(Ugar, 2016)
Şekil 12 . Antioksidan Savunma Sistemi
35
4.2.3. Sperm antioksidan sistemi
Spermatozoon ve seminal plazma, oksidatif stresin neden olduğu harabiyete karşı
etkili ve koruyucu ve önleyici antioksidan savunma mekanizmalarına sahiptir.
Seminal plazma; süperoksit dismutaz, katalaz ve glutatyon peroksidaz gibi yüksek
molekül ağırlıklı enzimatik antioksidanları içermektedir. Seminal plazmada bulunan
enzimlerin eksikliği sperm DNA hasarına ve erkek infertilitesine sebebiyet verdiği
yapılan çalışmalarla ortaya konulmuştur (Karadağ ve Kendirici, 2013).
Son yıllarda yapılan çalışmalarda antioksidan savunma mekanizmasının sperm
hücrelerini ROS üreten anormal sperm hücrelerine karşı koruduğu, lökositler
tarafından üretilen ROS’u temizlediği, DNA kırılmalarının önüne geçtiğini, sigara
içen erkeklerin semen kalitesini yükselttiğini , soğuğun sperm hücreleri üzerinde
gösterdiği etkisini azalttığı, erken sperm matürasyonunun önlediğini ve sperm
hücrelerini destekleyerek yardımcı üreme tekniklerinin başarısını arttırdığı
gözlenmiştir. Seminal plazmada süperoksit dismutaz, katalaz, glutatyon peroksidaz
ve glutatyon redüktaza ilaveten askorbat, ürat, vitamin E, piruvat, glutatyon,
albumin, vitamin A, ubikinol ve hipotaurin gibi enzimatik olmayan antioksidanlar
yer almaktadır (Demirtaş ve Üntan, 2011).
4.2.4. Yardımcı üreme teknikleri ve antioksidanlar
Oksidatif stresin neden olduğu DNA hasarı, yardımcı üreme teknikleri (YÜT)
açısından büyük öneme sahiptir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda yardımcı üreme
teknikleri için hazırlan spermlerin hazırlanmasında yapılan hatalar sonucu yüksek
miktarda ROS meydana geldiği gözlenmiştir (Agarwal et al.,1994). Yardımcı üreme
tekniklerinde kullanılmak üzere seçilen sperm hücresi genellikle oksidatif strese
maruz kalmış bir ortamdan gelmektedir. Seçilen bu sperm hücrelerinin DNA’ları
hasarlıdır. İntrauterin inseminasyon (IUI) ve in vitro fertilizasyon (IVF) sonrası bu
hasarlar nedeniyle endişe duyulmaz çünkü sperm plazma membranına olan kollateral
peroksidatif hasar, DNA’sı hasarlı spermin fertilizasyonunu engellemektedir. Ancak
intrastoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI); bu doğal bariyerin aşıldığı ve hasarlı bir
DNA’ya sahip sperm hücresinin doğrudan oositin içine enjekte edilen bir tekniktir.
Yardımcı üreme tekniklerinin her basamağında ROS üretimi gerçekleşebilmektedir.
IVF sonrasında ROS’un fertilizasyon üzerinde anlamlı etkisi vardır. IVF öncesinde
36
semen örneklerinde ROS seviyesinin ölçümü, IVF’nin sonucunu tahminde oldukça
önemlidir. Kültür ortamındaki yüksek ROS seviyesi ICSI’de düşük fertilizasyon,
kötü embriyo gelişimi, düşük bölünme oranı, yüksek embriyo fragmantasyonu ve
düşük blastokist oranı ile ilişkili iken IVF’de değildir, ancak hem ICSI’de hem
IVF’de düşük gebelik oranları ile ilişkilidir. YÜT in vitro antioksidan eklenmesi ile
daha başarılı olmaktadır. H2O2’nin artan konsantrasyonlarında blastokist gelişim
oranında doz bağımlı bir düşüş gözlenmiştir. Klinikte YÜT sistemlerinde kültür
ortamına vitamin E, vitamin C, sistein, taurin ve hipotaurin gibi antioksidanlar
eklenerek embriyonun ROS ile savaşma kabiliyetinin arttırılması amaçlanır
(Demirtaş ve Üntan, 2011).
4.3. Reaktif Oksijen Türleri
Oksijen tüm canlılar için vazgeçilemez bir elementtir. Oksijen; hidrojen, karbon,
azot ve kükürt ile birlikte organik moleküllerin temel yapısını meydana
getirmektedirler. Aerobik canlılar yaşamlarını sürdürebilmek için moleküler oksijene
ihtiyaçları vardır, anaerobik canlılar ise büyüme ve çoğalmaları için oksijene ihtiyaç
duymamaktadırlar. Anaerobik canlılarda ki oksijenin toksik etkisinin nedeni,
oksijenden kaynaklanan bazı reaktif oksijen türlerin biyolojik molekülleri
oksitlemeleri ve bu reaktif oksijen türlerine karşı anaerobik canlılarda bir savunma
mekanizmasının bulunmamasıdır. Oksijen sadece anaerobik türlerde değil, yaşamları
için moleküler oksijene gereksinim duyan canlılarda da toksik etki göstermektedir.
Günümüzde oksijenin canlılar üzerinde gösterdiği toksik etki “oksijen radikalleri”
olarak tanımlanmaktadır. Oksijen radikalleri, oksijenin vücuttaki metabolizması
sırasında oluşan reaktif türlerden kaynaklandığı bilinmektedir (Guttridge et al.,1998).
Reaktif Oksijen Türleri (ROS), radikal olmayan bileşikler ve serbest radikaller
olmak üzere iki grupta incelenir.
37
Tablo 4. Ros Türlerinin Sınıflandırılması
Radikal Olmayan Bileşikler Serbest Radikaller
Hidrojen peroksit Süperoksit anyon radikali
Organik peroksit Hidroksil radikali
Singlet Oksijen Peroksil radikali
(Özveren, 2015)
4.3.1. ROS ‘un hücresel substratları
Serbest radikallerin zararlı etkilerine karşı en çok hassasiyet gösteren biyomoleküller
lipidlerdir. Lipidlerin hücre membranlarında yer alan kolesterol ve doymamış yağ
serbest radikaller ile rahatlıkla reaksiyon gösterip, lipit peroksidasyonu meydana
getirir. Hücre membranlarında bulunan lipit serbest radikalleri (L•) ve lipit peroksit
radikallerinin (LOO•) meydana gelişi, reaktif oksijen türlerinin neden olduğu hücre
hasarının önemli bir sonucu kabul edilir. Serbest radikallerin neden olduğu lipit
peroksidasyonuna nonenzimatik lipit peroksidasyonu da denmektedir. Nonenzimatik
lipit peroksidasyonu fagositik hücrelerin uyarılması, fosfolipaz ve protein kinazın
aktivasyonuna sebep olmaktadır. Böylece plazma membranından arşidonik asidin
serbestleşmesi sonucu serbest radikal üretimine, enzimatik lipit peroksidasyonu
denmektedir (Doğan, 2008).
Proteinler serbest radikallerin zararlı etkilerine karşı lipitlere oranla daha az
hassasiyet gösterirler. Proteinlerin serbest radikal harabiyetinden etkilenme derecesi
amino asit dizilimlerine bağlıdır. Doymamış bağ ve kükürt içeren triptofan, tirozin,
fenilalanin, histidin, metiyonin, sistein gibi amino asitlere sahip proteinler serbest
radikallerden rahatlıkla etkilenirler (Silva, 2006).
Nükleik Asitler ve DNA, iyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA'yı
etkileyerek hücre mutasyonuna, apoptozise ve hücre nekrozuna sebeb olurlar.
Hidroksil radikali (OH•) deoksiriboz ve bazlarla rahatlıkla reaksiyona girer ve
38
hücresel değişikliklere yol açar. Hidrojen peroksit (H2O2) aktive olmuş
nötrofillerden meydana gelmektedir ve membranlardan rahatça geçer ve hücre
çekirdeğine ulaşır. Sonunda DNA kalıcı oksidatif hasara uğrar. Eğer hidroksil
radikalleri DNA'ya yakın bir bölgede meydana gelirse, purin ve pirimidin bazlarına
karşı negatif bir etki göstererek mutasyonlara ve hücre ölümüne neden olurlar.
Karbonhidratlar; serbest radikallerin karbonhidratlarla olan etkileşimi sonrası çeşitli
ürünler meydana gelir ve bu ürünler patolojik süreçlerde önemli rol oynarlar (Silva,
2006)
(Ugar, 2016)
Şekil 13. Ros’un Sebep Olduğu Hücre Hasarı
4.3.2 . İnsan semeninde ROS’un kaynağı
Canlı hücreler hayatlarının devamı için nasıl oksijene gereksinim duyuyor ise,
serbest oksijen radikalleri de hücresel faaliyetlerini sürdürebilmek için oksijene
gerek duyarlar. Buna karşı oksijen yıkım ürünü olan reaktif oksijen türleri hücre
yaşamını olumsuz etkilemektedir. Her ejakülatın ROS ile kontamine olduğu da
varsayılmaktadır (De Lamirande and Gagnıon,1995).
Ejakülatta ROS’un iki kaynağı bulunmaktadır; immatür spermatozoa ile
lökositlerdir. Lökosit, ejakülatta primer ROS kaynağı olarak bilinmektedir. Büyük
bir bölümü nötrofiller ve makrofajlardan meydana gelen lökositler, aşırı ROS üretimi
39
sebebiyle sperm hücrelerinde gözlenebilen defektlerle doğrudan ilişkilidir.
Spermatozoanın ROS üretimi daha çok sitoplazmik damlacıkların sızmasıyla
sonuçlanan, spermatogenez sırasında meydana gelen bir defektle gerçekleşmektedir.
İmmatür spermatozoon ve ROS üretimi arasında, sperm kalitesini negatif olarak
etkileyen güçlü bir pozitif korelasyon gözlenmektedir (Karadağ ve Kendirici, 2013).
4.3.3. İnsan semeninde ROS üretim alanları
ROS üretimi insan semeninde iki ana alanda gerçekleşir. Bu alanlar mitokondri ve
sperm plazma membranıdır. Mitokondrinin, solunumun güç merkezi olması
sebebiyle ROS üretiminin önemli bir bölümü, NAD bağımlı oksidoredüktaz aracılığı
ile mitokondride meydana gelir. Bununla birlikte, sperm plazma membranı, ROS
üretimini NADP bağımlı oksidaz sistemi ile gerçekleştirir (Karadağ ve Kendirici,
2013)
4.4. Oksidatif Stres
Aerobik canlılar yaşamsal faaliyetlerini sürdürebilmek için oksijene gereksinim
duyarlar. Hücrede pek çok reaksiyona uğrayan oksijen suya dönüşerek kendisi için
gerekli olan enerjiyi elde eder. Ancak bu süreçte oksijenin %2-3’ü suya dönüşmeyip
oksijen kaynaklı radikallere dönüşür (Gürdöl ve Ademoğlu, 2010).
Oksijen, insan vücudun da solunum zinciri içinde süperoksit anyon radikali, singlet
oksijen, hidroksil radikali vb. türevlerini meydana getirir. ROS, normal hücre
fonksiyonları esnasında tüm aerobik organizmalar tarafından oluşturulmakta olup
miktarlarındaki artma veya antioksidan savunmadaki azalma oksidatif stres olarak
tanımlanır (Cnubben et al.,2001).
40
(Ugar, 2016; Sikka et al., 2004)
Şekil 14. Oksidatif Stres ve Koşullarının Oluşumu
4.4.1. Oksidatif Stres Ve Erkek İnfertilitesi
1943 yılında İskoç androlog John MacLeod yaptığı çalışma ile oksidatif stresin erkek
infertilitesi üzerine olan katkısını gözlemlemiş ve oksidatif stres üzerinde durulmaya
başlanmıştır. John MacLeod yaptığı bu çalışma, aerobik koşullarda inkübe edilmiş
insan spermazoonların motilitesinin katalaz eklenmesi ile arttığını göstermiştir
(Aitken and Krausz, 2001).
İnsan üreme sisteminde reaktif oksijen türleri üretimi ve bunları temizleyen
antioksidan sistem arasında bir denge vardır. Böyle bir denge sonucu reaktif oksijen
türleri minimum seviyede tutulur ve bu seviye sperm kapasitasyonu, akrozom
reaksiyonu ve sperm-oosit füzyonu gibi normal sperm fonksiyonlarının
düzenlenmesi için gereklidir (Özveren, 2015).
Oksidatif stres altında replikasyon ve onarım mekanizmaları bozulmakta, özellikle
DNA polimeraz enzimi, hidrojen peroksitten olumsuz bir şekilde etkilenmektedir.
Anormal kromatin paketlenmesi, artan ROS seviyesi ve apoptosis ile DNA hasarı
meydana gelir (Karatağ ve Kendirici, 2013). Yapılan çalışmalarda infertil erkeklerin
%25- %40’ının semeninde ROS seviyesinin yüksek olduğu gözlemlenmiş ve bunun
da spermatozoon motilitesi ile morfolojisini negatif yönde etkilediği gösterilmiştir.
İmmatür spermatozoonlar tarafından üretilen ROS’un matür spermatozoonlar
41
üzerinde oksidatif hasar yapabileceği ve bunun infertilite nedeni olabileceği
düşünülmektedir (Doğan, 2008).
Oksidatif stres varikosel, kronik prostatit gibi ürolojik patolojilerde gelişebilir.
Sperm fonksiyonları üzerine olan patolojide rol oynayabilir. Günümüzde infertil
erkeklerin %25 ile %40' ında semende yüksek miktarda reaktif oksijen türlerine
rastlanması bu konuya olan ilgiyi artırmaktadır (Özveren, 2015).
(Sikka et al., 2004)
Şekil 15. Oksidatif Stres ve İnfertilite
42
4.5. Glutatyon Peroksidaz
Glutatyon peroksidaz (GPX) 80 kDa ağırlığında, selenyum içeren tetramerik yapıda
olan bir peroksidaz enzimidir. GPX genel olarak sitozolde bulunmaktadır (Mates et
al., 1999).
1957 yılında Mills tarafından GPX kırmızı kan hücrelerinde tanımlamış ve GPX’in
hemoglobini oksidatif hasara karşı koruduğunu göstermiştir (Mills, 1957; Ursini et
al, 1985).
GPX seloenzim grubunda bir enzimdir, biyosentezinde selenyuma ihtiyaç vardır.
Enzimin her alt ünitesi bir selenosistein bileşiğini içermektedir. Bu nedenle,
selenyumun diyet ile alınması antioksidan enzim savunması için önemlidir
(Falandysz, 2008).
GPX aktivitesi azaldığında radyoaktif selenyumun GPX aktivitesiyle birlikte azaldığı
belirtilmiştir (Rotruck et al., 1973).
Glutatyon peroksidaz (GPX) iki adet substrata sahiptir; bunlardan biri redüklenmiş
glutatyon, diğeri ise peroksitlerdir (Rotruck et. al., 1973).
GPX, GSH’ın indirgeyici gücünü kullanarak hidrojen peroksitin ve doymamış
yağlardan meydana gelen organik hidroperoksitlerin deaktivasyonunu kataliz eder.
Peroksitlerin indirgenmesini katalizleyen GPX enzimi, hücredeki indirgenmiş
glutatyonu (GSH) yükseltgenmiş glutatyona (GSSG) dönüştürmektedir. GPX
glutatyonu hidrojen donör olarak kullanarak hidrojen peroksiti elimine etmektedir.
Bu reaksiyonlar, canlı organizmada oksidatif stresin zararlı etkilerinden hücresel
membranları korumaya yarar (Ursini and Maiorino,2014).
Bugüne kadar yapılan çalışmalarda canlı organizmasında 8 adet GPX var olduğu
bildirilmiştir ve çoğu farklı hücre tiplerinde görülen selenoproteinler (SecGPxs)
olarak adlandırılmıştır. Bunlardan sadece GPX4, GPX7 ve GPX8 monomerik
yapıdadır. Diğerleri tetrametrik yapıdadırlar (Ursini and Maiorino, 2014).
43
Tablo 5. GPX Türleri, Özellikleri ve Hücresel Lokalizasyonları
GPX1 GPX2 GPX3 GPX4 GPX5
Orijinal adı cGSH-Px GSH-Px-GI pGSH-Px PH-GSH-Px ep-GSH-Px
MEP24
Genel adı
Cellular
GPX
Gastro-
intestinal GPX
Plasma
GPX
Phospho-
hydroperoxid
e GPX
Epididymal
GPX
Bulunduğu
türleri
İnsan,
sıçan, fare,
at
insan, sıçan,
fare
insan,
sıçan, fare
insan, sıçan,
fare, domuz
insan,
fare,sıçan,
domuz, köpek,
maymun ve
boğa
Etkilediği
doku ve
hüceler
Akciğer,
böbrek
mide,
ince bağırsak
böbrek,
akciğer
testis,
spermatozoa
epididimis,
spermatozoa
Hücresel
lokalizasyonu
Cytosolic
mitochondria Cytosolic Secreted/
cytosolic
Membrane-
bound
(mitochondria
)
Secreted
membrane-
bound
(Drvet, 2006).
GPX, selenyum bağlı ve selenyum bağlı olmayan iki formda bulunabilir. Selenyum
bağlı grup, hidrojen peroksit ve diğer organik peroksitleri indirgeyen dört üyeden
meydana gelir. Bunlar GSH-Px1 (cGSH-Px), GSH-Px2 (GSH-Px-GI), GSH-Px3
(pGSH-Px) ve GSH- Px4 (PH-GSH-Px)’dür (Imai and Nakagawa, 2003).
GPX1 veya hücresel GPX (cGSH-Px), bütün hücrelerde bulunan, tetramerik yapıda
sitozolik bir enzimdir. GPX1, organik hidroperoksitler ve H2O2’e karşı aktiftir.
GPX1, germ hücrelerinde çok daha az olmakla birlikte, incelenen tüm dokularda
rastlanmıştır (Ursini and Maiorino, 2014).
GPX2 veya gastrointestinal GSH-Px (GSH-Px-GI) insanlarda karaciğer ve
gastrointestinal kanalda bulunurken böbrek, kalp ve akciğerde bulunmamaktadır.
44
Hidrojenperoksit veya yağ asidi hidroperoksitlerini hızla indirgerken fosfolipid
hidroperoksitleri indirgemezler (Imai and Nakagawa, 2003).
GPX3 veya plazma GSH-Px (pGSH-Px), plazmanın en önemli GSH-Px3 kaynağı
olan böbreklerde bulunur ve özellikle proksimal tübüllerin epitel hücrelerinde önemli
miktarda bulunmaktadır (Ursini and Maiorino).
GPX4 veya fosfolipit GSH-Px (PH-GSH-Px), sitozol, mitokondri ve hücre zarında
bulunmaktadır. Enzim fosfolipid hidroperoksitlerini alkollere indirgeyerek en önemli
antioksidan biri olan E vitamini eksikliğinde, membranı peroksidasyona karşı
savunmaktadır . Selenyum bağımsız GPX enzimi ise sadece lipid peroksitlerin
metabolizmasından sorumludur (Ugar, 2016).
(Ugar, 2016)
Şekil 16. Antioksidan Enzimler ve Reaksiyonları.
45
5. GEREÇ VE YÖNTEM
5.1. Kullanılan Gereçler
Tablo 6. Kullanılan Gereçler, Firma Adı ve Alındığı Ülkeler Kullanılan Malzemeler Firma Adı Alındığı Ülkeler
1 Falcon konik dipli tüp15ml B.D.Bioscinces USA
2 Falcon plastik pipet 1-2ml. B.D.Bioscinces USA
3 Falcon steril sperm toplama kabı B.D.Bioscinces USA
4 Laminar Flow ITM Danimarka
5 Işık mikroskopu Nikon Japan
6 Santrifuge Thermo Scientific USA
7 Herause Heracell 240 inkübatör Thermo Scientific USA
8 Buzdolabı Arçelik Türkiye
9 Pipet ucu 5-100 µl EppendorfGmbh Almanya
10 200 µl pipetör EppendorfGmbh Almanya
11 10 µl pipetör EppendorfGmbh Almanya
12 Steril mikro filtre GVS USA
13 Vortex Mixer Finepcr Kore
14 Makler kamerası SefiMedical İsrail
15 Lam
IsoLab.Gmbh Almanya
16 Lamel
IsoLab.Gmbh Almanya
17 Eldiven
Beybi Türkiye
18 Parafilm Bemis USA
46
19 Şale
20 Kronometre
21 10ml cam pipet
5.2. Kullanılan Kimyasal Malzemeler
Tablo 7. Kullanılan Kimyasal Maddeler, Firma Adı ve Alındığı Ülkeler
Kullanılan Malzemeler Firma Adı Alındığı Ülkeler
1 Spermac boyama Ferti Pro NV Belçika
2 Oil Vitrolife İsveç
3 G-IVF sperm yıkma medyumu Vitrolife İsveç
4 Glutathione Peroxdiase from bovine
erythrocytes
Sigma USA
5 Eosin Y Merck USA
6 İmmersiyon Yağı Merck Millipor Almanya
5.3.Deney Gruplarının Oluşturulması
Normozoospermi ve oligozoospermi olan semen örneklerinden elde edilen 21-41
yaş aralığındaki olgular çalışmaya dahil edildi. Bu çalışmada yer alan normospermi
erkek grubunun %50 motilite, 15 milyon üzeri sperm ve en az %4 Kruger’ e göre
normal morfoloji gösteren , oligospermi erkek grubunun , spermatozoon sayısının
15 milyonun altı ve olan spermler değerlendirildi. Yaş, sigara kullanımı , meslek
etkileri, ilaç kullanımı gibi özellikler dikkate alınmadı. Rutin morfolojik
preparatlarda üçlü boyamaları kullandığımız taktirde çekirdek , akrozom ve boyun
kuyruk kısmında bariz değişikleri belirlemekteyiz. Ayrıca rutin tedavilerde
spermiyogram testi haricinde aşılama ve mikroenjeksiyon uygulamalarında
47
hazırlanan spermatozoon morfolojileri değerlendirilmemektedir. Çalışmamıza dahil
edilen her örneğin bazal değerleri dikkate alınmıştır.
5.4. Semen Toplanması Ve Analizi
Semen örneği, 2 - 7 günlük cinsel perhizle spermiyogram testi amacıyla kliniğe gelen
hastalardan, hastanın ad ve soyadının, yaşının, yazılı olduğu steril plastik kaplara,
mastürbasyon yöntemi ile alındı. Semenin alındığı tarih ve saat not edildi. 30 dakika
boyunca oda ısısında likefiye olması beklendi. Cinsel perhiz süresi, viskosite, hacim,
renk ve semene ait likefaksiyon zamanı rapora not edildi. Spermatozoon sayısını
belirlemek üzere Makler sayma kamerası kullanıldı. Makler sayma kamerası küçük
bir damla semen örneği konuldu. Işık mikroskobunda x20’lik bir büyütme ile toplam
spermatozoon sayısı ve progresif hareketli, immotil spermatozoon sayısı ile motilite
değerlendirmesi yapıldı.
5.5. Sperm Boyama Ve Morfoloji Değerlendirilmesi
Morfolojik değerlendirme için bir lama bir damla semen örneğinden damlatıldı.
Damlatılan semenin miktarı spermatozoa sayısına bağlı olarak ayarlandı. İkinci bir
lam yardımı ile bu damla slayt üzerine yayılıp hava ile kurutuldu. Spermac boyama
(Ferti Pro NV, Industriepark Noord, Belçika) yöntemi ile boyandı.
Lam üzerine yayılıp kurutulan preparatlar, fiksatif solüsyonunda 10 dk bekletildi.
Fiksatif su ile arıtıldıktan sonra suyu süzülerek sırayla A ve B (Ferti Pro NV,
Industriepark Noord., Belçika) solüsyonlarından 1,5 dakika, C solüsyonunda 30
saniye bekletilerek boyama işlemi yapıldı. Kuruması için beklendi x100 büyütmede
immersiyon yağı kullanılarak incelendi. Morfoloji değerlendirilirken 100
spermatozoon dikkate alındı. Gözlenen her anomali ayrı ayrı not edildi.
48
Resim 1. Spermac Stains(A,B,C) ve Fiksatif
5.6. Swim Up Yöntemi
Normozoospermi ve oligozoospermi grupların ait sperm parametreleri (sayı,
hareketlilik, progresyon, morfoloji, aglütinasyon ve yuvarlak hücre) Makler
kamerasında ile değerlendirildikten sonra 15 ml Falcon yuvarlak dipli tüplere
eklenir üzerine 2 ml sperm hazırlama medyumu (G-IVF™ PLUS ) eklenir.
Hazırlanan tüp 37°C’de %5 CO2 ve %95 nem içeren Herause Heracell 240
inkübatörde 30-60 dk 45° açı ile inkübe edilir. Alttaki semene dokunmadan üstteki
medyum aspire edilir ve 5 ml sperm yıkama medyumu ilave edilip karıştırılır. 300g-
600g kuvvetinde santrifüjlenir. Santrifüjleme işleminden sonra süpernatant atılır.
5.7. Glutatyon Peroksidaz (GPX) Hazırlanama Protokolü
Glutatyon peroksidaz (Glutathione Peroxdiase from bovine erythrocytes, Sigma)
0.63mg solid -20 de saklanan üründür. GPX albümin içeren 10ml uygun medyumda
çözülür. Çözüldükten sonra vortex ile karıştırılır. Elde edilen medyum 33mm steril
mikro filtre(Steril Abluo Syrine Filtresb) ile filtrelendi. 0.5ml’lik 20 adet steril
tüplere stoklanıp, tüp ağızları parafilm ile kapatıldı. -20 de saklandı.
5.8.Glutatyon Peroksidaz (GPX) Uygulama Protokolü
Glutatyon peroksidaz seminal plazmada 1318 mU/ml ile 1600 mU/ml arasında
bulunmaktadır (Tavilani et. al, 2008). Çalışmamızda 1500 mU/ml GPX eklenmiştir.
Bu doz Tavilani ve ark.(2008) çalışmalarına göre belirlenmiştir.
49
Örnekler 1 ve 24 saat 37°C’de %5 CO2 ve %95 nem içeren Herause Heracell 240
inkübatörde 30-60 dk 45° açı ile inkübe edildi. İnkübasyondan sonra motilite ve
vitalite değerlendirmeleri yapıldı.
5.9. Eosin Y Uygulama Protokolü
Canlılık değerlendirmesi için kullanılan Eosin Y (Merck Eosin Y) uygulama protokü,
5 g/l Eosin Y solüsyonu, 9 g/l sulu sodyum klorid solüsyonu içine alınır. Bir damla
taze semen 1 damla Eosin Y solüsyonu ile lam üzerinde karıştırılır. 30 sn. sonra X40
büyütmede ışık mikroskobu altında incelenir. Canlı hücreler boyanmazken ölü
hücreler kırmızıya boyanır. Canlılık değerlendirmesi yapılırken 100 spermatozoon
dikkate alındı.
5.10. Sperm sayısı ve motilitesinin değerlendirilmesi
Semen örneklerindeki sperm sayısını ve motilitesini belirlemek için standart manuel
teknikler (WHO laboratory manual 2010) kullanıldı. Makler sayım kamarasına
(Resim. 2) 10 μl semen koyulduktan sonra kamera ataçmanlı ışık mikroskobuna
yerleştirilerek X20 objektif büyütmesinde sperm sayısı ve motilitesi değerlendirildi.
Motilite bakımından spermler hızlı ileri hareketli, yavaş ileri hareketli ve hareketsiz
sperm olmak üzere üç ayrı hareketlilik kategorisine göre gruplandırıldı.
Spermatozoon konsantrasyonu, motilite ve morfolojisi için standart manuel teknikler
uygulandı. Motilite ve konsantrasyon ışık mikroskobunda X20 büyütmede WHO
(World Health Organization) kriterlerine göre en az 100 spermatozoon sayılarak
yapıldı. Makler sayma kamarasına semen koyularak ve X20 büyütme altında 10 kare
sayılarak konsantrasyon ve motilite belirlendi.
50
Resim 2. Makler Kamerası
5.11. İstatiksel Değerlendirmeler
Üzerinde durulan özellikler için tanımlayıcı istatistikler; Ortalama, Standart Sapma,
Minimum ve Maksimum değer olarak ifade edildi. Bu özellikler bakımından sürekli
değişkenlerin iki grup ortalama karşılaştırması için Student’s t testi ve varsayımları
oluşmayan değişkenlerin grup karşılaştırmaları için Mann Whitney U testleri
kullanıldı. Tekrarlamalı gruplar arası ortalama karşılaştırmalarında Tekrarlamalı
ANOVA testi (Repeated ANOVA) testi uygulandı. Hipotezlerimiz çift yönlü olup
p≤0,05 olduğunda sonuç önemli olarak kabul edildi. Değerlendirmeler R
programında yapıldı.
51
6. BULGULAR
Çalışmamızda 40 gönüllüden alınmış olan normozoospermi (sayı 15 milyonun
üzerinde, motilite %40 ve üzerinde, morfoloji >4 ) ve oligozoospermi (sayı 15
milyon ve altı) semen örnekleri değerlendirmeye alındı. Bu iki gruba ait
spermatozoonlar glutatyon peroksidaz (GPX) ile muamele edidi. Spermatozoonlar
farklı maruziyet sürelerinde 1 saat (n=40) ve 24 saat (n=40) sonra motilite ve
vitalite açısından değerlendirildi.
Tablo 8. Semen Örneklerin pH, Viskozite ve Hacim Ortalama Değerleri
DEĞERLENDİRME
Normal Değerler
(WHO laboratory
manual 2010 )
Normozoospermi
Hasta Grubu
Oligozoospermi
Hasta Grubu
pH 7.2-8 7.3 7.3
Viskozite + ++ ++
Hacim 2-6 ml 3.2ml 2.9ml
Normozoospermi hasta grubu ile oligozoospermi hasta grubu semen analizleri WHO
laboratory manual 2010 kriterlerine göre yapıldı. Hasta semen örneklerinde motilite
ve morfoloji değerlendirmeleri öncesi yapılan pH, viskozite ve hacim incelemelerine
ait ortalama değerler Tablo 8’de verildi.
52
Tablo 9. Normospermik ve Oligospermik Grupların Bazal Değerleri ve 1 Saatlik ve
24 Saatlik GPX Uygulamasının Bazal Değerlere Etkisi
Gruplar
Normospermik Grup
Oligospermik Grup t* p
Mean (Medya
n)
SD Mean (Medyan
)
SD
Yaş 31,50 5,206 33,20 4,862 1,067 ,293 Semen Volüm 3,250 1,070 2,925 ,8472 1,065 ,294 Konsantrasyon 38,30 16,25 9,20 3,318 7,849 <0,001 Hareketsiz sperm (%)
47,25 3,462 72,00 12,07 -8,812 <0,001
+4 hareketli sperm(%)
8,30 2,736 3,25 2,197 6,436 <0,001
+3 hareketli sperm(%)
31,65 6,580 16,35 8,940 6,164 <0,001
+2 hareketli sperm(%)
13,30 7,987 8,40 5,295 2,287 0,028
TPMS (%) 9,932 (8,820)
6,703 ,9045 (0,810)
0,760 (5.00)** <0,001***
1saatlik GPX uygulaması sonrası hareketsiz sperm(%)
7,70 (5,00)
7,313 22,75 (18,50)
16,22 83,00** 0,001***
1saatlik GPX uygulaması sonrası +4 hareketli sperm(%)
39,25 (35,00)
21,02 23,0 (15,50)
20,72 103,0** 0,008***
1saatlik GPX uygulaması sonrası +3 hareketli sperm(%)
38,95 12,32 38,95 13,34 0,000 1,000
1saatlik GPX uygulaması sonrası +2 hareketli sperm(%)
13,60 8,678 15,25 8,472 0,608 0,547
1 saatlik GPX uygulaması sonrası TPMS (%)
52,39 (34,80)
45,64 6,41 (3,85)
6,840 23,00** <0,001***
24saatlik GPX uygulaması sonrası hareketsiz sperm(%)
37,80 16,56 59,30 18,79 -3,840 <0,001
24saatlik GPX uygulaması sonrası +4 hareketli sperm(%)
8,85 (7,00)
9,416 4,05 (4,00)
4,571 93,5** 0,003***
24saatlik GPX uygulaması sonrası +3 hareketli sperm(%)
34,00 12,33 19,00 12,86 3,766 0,001
24saatlik GPX uygulaması sonrası +2 hareketli sperm(%)
18,80 9,070 17,65 6,706 0,456 0,651
24 saatlik GPX uygulaması sonrası TPMS (%)
11,02 (8,40)
9,2993 1,005 (0,84)
1,1232 7,00** <0,001***
*Student t test ** Mann Whitney U değeri *** Mann Whitney p değeri
53
6.1. Yaş
Spermiyogram testi amacıyla Medicalpark Bahçelievler Hastanesi Tüp Bebek
Merkezine başvuran hastaların yaş ortalamaları normozoospermi grupta 31.5 (±5.2)
iken, oligozoospermi grupta 33.2 (±4.8) ‘dir . Normozoospermi ve oligozoospermi
gruplar arasında istatiksel bir fark yoktur (p>0.05).
6.2. Semen Volümü
Semen volümü, normozoospermi grupta oligozoospermi gruba göre daha yüksektir
(3.25±1.06; 2.92±0.8). Normozoospermi ve oligozoospermi grupların semen volumü
karşılaştırması için yapılan istatiksel test sonrası normozoospermi ve oligozoospermi
gruplar arasında arasında istatiksel bir fark olmadığı bulunmuştur (p>0.05).
6.3. Sperm Konsantrasyonu
Sperm konsantrasyonları (milyon/ml), normozoospermi grupta ortalama
38.30(±16.245), oligozoospermi grupta ortalama 9.20(±3.318)’dir. Normozoospermi
ve oligozoospermi grupların konsantrasyonlarının karşılaştırılması için yapılan
istatiksel test sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının
konsantrasyonunun birbirinden farklı olduğu sonucuna varılmıştır (p<0.05).
Normozoospermi grubun konsanstrasyon değeri oligozoospermi grubun
konsantrasyon değerinden daha yüksektir.
6.4. İmmotilite
İmmotilite ortalaması normozoospermi grupta 47.25(±3.62), oligozoospermi grupta
72(±12.074) idi. Normozoospermi ve oligozoospermi grupların immotilitelerinin
karşılaştırılması için yapılan istatistik testi sonrasında normozoospermi ve
oligozoospermi gruplarının immotilitelerinin arasında anlamlı bir fark vardır.
Oligozoospermi gruba ait veriler normozoospermi gruba göre daha yüksektir
(p<0.05). 1 saatlik GPX uygulaması sonucu gruplar arasında immotilitede gözle
görünür bir düşüş gözlendi. Grupların ortalamaları normozoospermi grupta
7.70(±7.313), oligozoospermi grupta ise 22.75(±16.222) idi. Normozoospermi ve
oligozoospermi grupların immotilitelerinin karşılaştırılması için yapılan test
54
sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının immotilitelerinin
arasında anlamlı bir fark vardır. İstatiksel olarak oligozoospermi gruba ait veriler
normozoospermi gruba göre daha daha yüksektir (p<0.05). 24 saatlik GPX
uygulaması sonucu normozoospermi grubun ortalaması 37.8(±16.555),
oligozoospermi gruba ait ortalama 59.3(±18.79) idi. Normozoospermi ve
oligozoospermi grupların immotilitelerinin karşılaştırılması için yapılan test
sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının immotilitelerinin
arasında anlamlı bir fark vardır. Oligozoospermi gruba ait veriler normozoospermi
gruba göre daha yüksektir (p<0.05).
6.5. İleri Hızlı Hareketli (+4) Sperm
+4 hareketli ileri hızlı sperm sayısı normozoospermi grupta 8.30(±2.736),
oligozoospermi grupta ortalama 3.25(±2.197) idi. Grupları istatiksel olarak
değerlendirdiğimizde %95 güvenle grupların varyansları homojendir.
Normozoospermi ve oligozoospermi grupların +4 hareketli sperm sayısı
karşılaştırılması sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +4
hareketli sperm sayısı arasında anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba ait
veriler oligozoospermi gruba ait verilerden daha yüksektir (p<0.05). 1 saatlik GPX
uygulaması sonucu normozoospermi gruba ait ortalama 39.25(±21.021)
oligozoospermi gruba ait ortalama 23.05(±20.715) idi. Normozoospermi ve
oligozoospermi grupların +4 hareketli sperm sayısı karşılaştırılması için yapılan test
sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +4 hareketli sperm sayısı
arasında anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba ait veriler oligozoospermi
gruba ait verilerden daha yüksektir (p<0.05). 24 saatlik GPX uygulaması sonucu
normozoospermi gruba ait ortalama 8.85(±9.416), oligozoospermi gruba ait ortalama
4.05(±4.571) idi. Normozoospermi ve oligozoospermi grupların +4 hareketli sperm
sayısı karşılaştırılması sonrası normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +4
hareketli sperm sayısı arasında anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba ait
veriler oligozoospermi gruba ait verilerden daha yüksektir (p<0.05).
55
6.6. Yavaş Hareketli (+3) Sperm
+3 Yavaş hareketli sperm sayısının normozoospermi grup ortalaması 31.65(±6.58),
oligozoospermi grup ortalaması 16.35(±8.94) idi. Grupları kendi aralarında istatiksel
olarak değerlendirdiğimizde %95 güvenle normozoospermi ve oligozoospermi
grupların varyansları homojendir. Normozoospermi ve oligozoospermi grupların +3
hareketli sperm sayısı karşılaştırılması için yapılan istatistik testi sonrasında
normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +3 hareketli sperm sayısı arasında
anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba ait veriler oligozoospermi gruba ait
verilerden daha yüksektir (p<0.05). 1 saatlik GPX uygulaması sonucu, yavaş
hareketli sperm sayısının normozoospermi grup ortalaması 38.95(±12.318),
oligozoospermi grupta ortalama 38.9 (±13.336) idi. Normozoospermi ve
oligozoospermi grupların +3 hareketli sperm sayısı karşılaştırılması için yapılan test
sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +3 hareketli sperm sayısı
arasında anlamlı bir fark yoktur (p>0.05). 24 saatlik GPX uygulaması sonucu, yavaş
hareketli sperm sayısının normozoospermi grup ortalaması 34(±12.329),
oligozoospermi grupta ortalama 19(±12.855) idi. Normozoospermi ve
oligozoospermi grupların +3 hareketli sperm sayısı karşılaştırılması için yapılan
istatiksel test sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +3 hareketli
sperm sayısı arasında anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba ait veriler
oligozoospermi gruba ait verilerden daha yüksektir (p<0.05).
6.7. Yerinde Hareketli (+2) Sperm
+2 yerinde hareketli sperm sayısının normozoospermi grup ortalaması 13.3(±7.987),
oligozoospermi grup ortalaması 8.4(±5.295) idi. Normozoospermi ve oligozoospermi
grupların +2 hareketli sperm sayısı karşılaştırılması için yapılan istatiksel test
sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +2 hareketli sperm sayısı
arasında anlamlı bir fark vardır (p0.05). 1 saatlik GPX uygulaması sonucu yerinde
hareketli sperm sayısının , normozoospermi grup ortalaması 13.6(±8.678).
Oligozoospermi gruba ait ortalama 15.25(±8.472) idi. Normozoospermi ve
oligozoospermi grupların +2 hareketli sperm sayısı karşılaştırılması sonrası
normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +2 hareketli sperm sayısı arasında
anlamlı bir fark yoktur (p>0.05). 24 saatlik GPX uygulaması sonucu yerinde
hareketli sperm sayısının , normozoospermi grup ortalaması 18.8(±9.07),
56
oligozoospermi gruba ait ortalama 17.65(±6.706) idi. Normozoospermi ve
oligozoospermi grupların +2 hareketli sperm sayısı karşılaştırılması sonrasında
normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının +2 hareketli sperm sayısı arasında
anlamlı bir fark yoktur (p>0.05).
6.8. Toplam motil sperm sayıları (TPMSS)
Toplam motil sperm sayıları (TPMSS) ortalamaları normozoospermi grupta
9.9345(±6,70371)milyon, oligozoospermi grupta 0.9045(±0,75998) milyon olarak
hesaplandı. Normozoospermi ve oligozoospermi grupların toplam motil sperm
sayıları karşılaştırılması sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının
toplam motil sperm sayıları arasında anlamlı bir fark vardır (p<0.05). 1 saatlik GPX
uygulaması sonucu toplam motil sperm sayıları ortalamaları normozoospermi grupta
52.39(±45.63793)milyon, oligozoospermi grupta 6.4163(±6.84036)milyon idi.
Normozoospermi ve oligozoospermi grupların toplam motil sperm sayıları
karşılaştırılması sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının toplam
motil sperm sayıları arasında anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba ait
değerler oligozoospermi gruba göre daha yüksektir (p<0.05). 24 saatlik GPX
uygulaması sonucu toplam motil sperm sayıları ortalamaları normozoospermi grupta
11.063(±9.29911) milyon, oligozoospermi grupta 1.005(±1.12313)milyon olarak
hesaplandı. Normozoospermi ve oligozoospermi grupların toplam motil sperm
sayıları karşılaştırılması sonrasında normozoospermi ve oligozoospermi gruplarının
toplam motil sperm sayıları arasında anlamlı bir fark vardır. Normozoospermi gruba
ait değerler oligozoospermi gruba göre daha yüksektir (p<0.05).
6.9. Motilite
Tekrarlamalı ANOVA Testi (Repeated ANOVA Test) ile normospermik ve
oligospermik grupların motilitelerinin kontrol grubu motilitesi, 1 saatlik GPX
uygulama sonrası motilite ve 24 saatlik GPX uygulama sonrası motilite değerleri
analiz edildi. Fark önemli bulundu (p < 0.001). İleri analiz yöntemi ( Pairwise
Comparisons) ile devam edildi. Hangi grupta farklılık olduğu belirlendi. Sonuçlar
Tablo 10 ve Tablo 11’ de verildi.
57
Tablo 10. Normospermik Gruba Ait Motilite Verileri
Gruplar Ortalama Standart Hata
%95 güven aralığında Alt Sınır Üst Sınır
I. Normospermik Grup Motilitesi
53,250 ,624 51,945 54,555
II. 1 saatlik GPX Uygulama Sonrası Normospermik Grup Motilitesi
92,300
1,635
88,877
95,723
III. 24 saatlik GPX Uygulama Sonrası Normospermik Grup Motilitesi
62,200
3,702
54,452
69,948
Pairwise Comparisons
Grupların karşılaştırılması
Ortalama Fark Standart Hata p
I-II -39,050 1.850 <0,001
I-III -8,950
3.870
<0,001
II-III -30.100
3.010
<0,001
58
Tablo 11. Oligospermik Gruba Ait Motilite Verileri
Gruplar Ortalama Standart Hata
%95 güven aralığında Alt Sınır Üst Sınır
I Oligospermik Grup Motilitesi
28,000 2,700 22,349 33,651
II 1 saatlik GPX Uygulama Sonrası Oligospermik Grup Motilitesi
77,250
3,627
69,658
84,842
III 24 saatlik GPX Uygulama Sonrası Oligospermik Grup Motilitesi
40,700
4,202
31,906
49,494
Pairwise Comparisons
Grupların Karşılaştırılması
Ortalama Fark Standart Hata p
I-II -49,250 3,485 <0,001
I-III -12,700
4,108
<0,018
II-III 36,550
3.061
<0,001
6.10. Vitalite
Tekrarlamalı ANOVA Testi (Repeated ANOVA Test) ile normospermik ve
oligospermik grupların vitaliteleri kontrol grubu vitalitesi, 1 saatlik GPX uygulama
sonrası vitalite ve 24 saatlik GPX uygulama sonrası vitalite değerleri analiz edildi.
Fark önemli bulundu (p < 0.001). İleri analiz yöntemi ( Pairwise Comparisons) ile
devam edildi. Hangi grupta farklılık olduğu belirlendi. Sonuçlar Tablo 12 ve Tablo
13’ de verildi.
59
Tablo 12. Normospermik Gruba Ait Vitalite Verileri
Gruplar Ortalama Standart Hata
%95 güven aralığında Alt Sınır Üst Sınır
I Normospermik Grup Vitalitesi
89,450 1,923 85,425 93,475
II 1 saatlik GPX Uygulama Sonrası Normospermik Grup Vitalitesi
89,450
1,923
85,425
93,475
III 24 saatlik GPX Uygulama Sonrası Normospermik Grup Vitalitesi
77,300
2,089
72,928
81,672
Pairwise Comparisons
Grupların Karşılaştırılması
Ortalama Fark Standart Hata p
I-II 0,000 - -
I-III 12,150 1,415 <0,001
II-III -12,150 3.061 <0,001
60
Tablo 13. Oligospermik Gruba Ait Vitalite Verileri
Gruplar Ortalama Standart Hata
%95 güven aralığında Alt Sınır Üst Sınır
I Oligospermik Grup Vitalitesi
80,400 2,884 74,364 86,436
II 1 saatlik GPX Uygulama Sonrası Oligospermik Grup Vitalitesi
80,400
2,884
74,364
86,436
III 24 saatlik GPX Uygulama Sonrası Oligospermik Grup Vitalitesi
66,900
4,942
56,556
77,244
Pairwise Comparisons
Grupların Karşılaştırılması
Ortalama Fark Standart Hata p
I-II 0,000 - -
I-III 13,500
2,587
<0,001
II-III -13,500
2,587
<0,001
61
Şekil 17. Normospermik Grup Motilite ve Vitalite Değerlerinin Karşılaştırılması
Şekil 18. Oligospermik Grup Motilite ve Vitalite Değerlerinin Karşılaştırılması
62
7.TARTIŞMA
Erkek infertilitesine sebep olan varikosel, kriptorşidizm, enfeksiyonlar, tıkayıcı
lezyonlar, kistik fibrozis, travma ve tümörler gibi bilinen sebeplerin dışında son
dönemde ilgi çeken bir yeni infertilite sebebi eklenmiştir; oksidatif stres. Vücuttaki
antioksidanlar ve serbest oksijen radikalleri arasındaki dengesizlik sonucu ortaya
çıkan oksidatif stres, spermlere zarar verir ve infertiliteye sebep olabilmektedir
(Purvis, 1992).
İnfertilite sebebiyle başvuran çiftler üremeye yardımcı tekniklere yönelmektedirler.
Bunlardan günümüzde en çok tercih edilenleri IUI, IVF ve ICSI yöntemleridir
(ASRM, 2011). Klasik IVF, çocuk sahibi olmak isteyen pek çok çift için etkili bir
tedavi yöntemidir ancak şiddetli erkek faktörünün sebep olduğu vakalarda etkili
değildir (Wilkes et al, 2009). Böyle durumlarda bireyin spermatozoonunun direkt
oosit içine enjekte edildiği ICSI tekniği uygulanmaktadır. Bu tekniğe rağmen, halen
ICSI sikluslarının % 1-5’i başarısızlıkla sonuçlanmaktadır. Bu başarısız sonuçlar
bilim adamlarını döllenme oranlarını arttırmaya yönelik pek çok tedavi yoluna
sevketmiştir (Nasr- Esfahani et al., 2010). Erkek infertilitesinde kalıcı iyileşmenin
sağlanması amacıyla spesifik medikal ve cerrahi tedaviler uygulanabilmektedir
(Özveren, 2015).
Yapılan son çalışmalara kadar reaktif oksijen türlerinin insan spermatozoası üzerinde
toksik olduğu düşünülmekteydi fakat elimizde düşük miktarda ROS’un
spermatozoanın fertilizasyonu gerçekleştirebilmesi için gerekli olduğuna dair veriler
bulunmaktadır (Aitken, 1999). Düşük miktardaki ROS’un fertilizasyon, akrozom
reaksiyonu, hiperaktivasyon, motilite ve kapasitasyon için gerekli olduğu
gösterilmiştir (Agarwal et al., 2004). Süperoksit (O2-) ile hidrojen peroksit (H2O2)
son derecede reaktif olan, yakındaki moleküllerle etkileşime girebilen ve hücre
organellerinde oksidatif stres hasarına sebebiyet veren oksijen metabolitleridir
(Coyle and Kader, 2007). Spermatozoonun eser miktarda hidrojen peroksitte
bekletilmesi ile sperm kapasitasyonu, hiperaktivasyonu, akrozom reaksiyonu ve
oosit füzyonunu uyarmaktadır (Aitken, 1995). Süperoksit anyonu da kapasitasyon ve
akrozom reaksiyonunu arttırmaktadır (Griveou et al., 1995).
63
ROS; radikal (hidroksil iyonu, süperoksit, NO, peroksil) ve radikal olmayan (ozon,
tekli oksijen, lipit peroksit, hidrojen peroksit) molekülleri içeren geniş bir dağılım
gösterir. Reaktif nitrojen metabolitleri (nitröz oksit, peroksinitrit, nitroksil iyonu)
serbest nitrojen metabolitleridir ve ROS’un alt sınıfı oldukları düşünülür (Darley-
Usmar et al., 1995). NO’nun normal sperm üzerine hem hareketi hem de zona
birleşmesini engelleyen zararlı etkileri ortaya konmuştur (Wu et al., 2004).
Her ejakulatın ROS ile kontamine olduğu varsayılmaktadır (Aitken, 1995).
Sitoplazmik damlacıklar, düşük sperm kalitesi ve artmış ROS miktarı arasındaki
bağlantıyı ortaya koyar. Hatalı spermiyogenezin sonucu meydana gelen yapılar,
ROS’un esas kaynağı olduğu bilinmektedir (Gomez et al., 1996). Muhtemelen
sitozolik bir enzim olan glukoz-6- fosfat dehidrojenaz vasıtasıyla, sitoplazmik
kalıntılar ve artmış ROS üretimi paralellik göstermektedir (Aitken, 1999). Oksidatif
stresin neden olduğu harabiyetin derecesi; ROS miktarı, ROS maruziyet süresi ve
diğer birtakım hücre dışı faktörlere bağlıdır.
Yağlar sperm plazma zarında doymamış yağ asitleri şeklinde bulunduran ve
oksidasyondan en fazla etkilenen biyomoleküllerdir. Artmış ROS seviyeleri, azalmış
sperm motilitesi ile ilgili bulunmuştur ancak tam mekanizması anlaşılamamıştır
(Agarwal et al., 1994). Bir hipoteze göre, H2O2 hücre membranını geçmekte ve daha
sonra spermatozoa tarafından ROS üretimini arttırmak için elektron kaynağı olarak
NADPH oksidaz olarak bilinen enzim sistemi tarafından kullanılacak olan
NADPH’nin hücre içinde elde edilmesini sağlayan heksoz monofosfat şantı yolu ile
glukoz-6-fosfat dehidrojenaz gibi bazı vital enzimlerin işlevini engellemektedir
(Aitken et al., 1997). Bir diğer hipotez ise aksonemal proteinlerin fosforilasyonunda
ve sperm hareketliliğinde azalma ile sonuçlanan bir dizi olaya dayanır ki, her ikisi de
sperm-oosit füzyonunda gerekli olan membran akışkanlığında azalmaya neden
olmaktadır (De Lamirande, 1992).
Yapılan çalışmalarda antioksidan savunma sisteminin sperm hücrelerini ROS üreten
anormal sperm hücrelerinden koruduğunu, lökositlerin ortaya çıkardığı ROS’u
temizlediği, DNA kırılmalarının önüne geçtiğini, sigara içenlerde semen kalitesini
gözle görülür bir iyileşme sağladığı, soğuğun sperm hücresine olan zararlı etkisini
azalttığı, erken sperm olgunlaşmasını önüne geçtiğini ve sperm hücrelerini
destekleyerek yardımla üreme tekniklerinin başarısını arttırdığı gösterilmiştir.
64
Seminal plazmada süperoksit dismutaz, katalaz, glutatyon peroksidaz ve glutatyon
redüktaza ilaveten askorbat, ürat, vitamin E, piruvat, glutatyon, albumin, vitamin A,
ubikinol ve hipotaurin gibi enzimatik olmayan antioksidanlar vardır.
Son yıllarda infertilite üzerine yoğunlaşan çalışmalar, herhangi bir neden tespit
edilemeyen idiyopatik infertilitede serbest oksijen radikallerinin önemi bir rolü
olduğunu göstermiştir (Alkan et al., 1997). Bu konu popüler bir konudur ve ayrıntılı
olarak ele alınmaya başlanmıştır. Glutatyon peroksidazın sperm parametrelerine
etkisini gözlemlemek için in vivo ve in vitro çalışmalar yapılmaktadır .
Bu çalışma Bahçelievler Medical Park Hastanesi Tüp Bebek Merkezine
spermiyogram testi için başvuran, normozoospermi ve oligozoospermi 20’şer,
toplam 40 gönüllü erkek vakaya ait semen örneği üzerinde yapıldı. Mikroskobik
incelemeler ve morfolojik değerlendirmeler WHO kriterlerine uygun olarak yapıldı.
Canlılık değerlendirmesi için Eosin Y testi uygulandı. İn vitro ortamda 1 saat ve 24
saat glutatyon peroksidaz’a (GPX) maruz bırakılan semen örnekleri motilite ve
vitalite değişimlerinin değerlendirilmesini amaçladık ve bu örnekler kontrol grubu ile
karşılaştırılarak değerlendirilmiştir .
Safarinejad ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada glutatyon peroksidaz enziminin
kofaktörü olan eser element selenyumu N-asetil sistein ile kombine olarak alan
infertil erkeklerde FSH düşmüş, ve tüm sperm parametreleri ile birlikte testosteron
ve inhibin B yükseldiği gözlenmiştir (Safarinejad et al., 2009).
Yaptığımız çalışmamızda elde ettiğimiz veriler doğrultusunda oligozoospermi ve
normozoospermili hasta gruplarında 1 saatlik ve GPX uygulaması sonucu motilitede
istatiksel bir artış gözlenmiştir. 24 saatlik GPX uygulaması sonucu normozoospermi
ve oligozoospermili hasta gruplarının motiliteleri kontrol grubu ile
karşılaştırıldığında istatiksel bir artış gözlenmiştir.
Imai ve arkadaşları spermatozoa üzerinde immünoblotlama analizi
gerçekleştirmişlerdir. Yapılan çalışmada insan spermatozoasında GPX4’e
rastlanmıştır. Spermatozoanın orta kısmında GPX4’e ait floresan gözlenmiştir.
GPX’e bağlı spermatozoanın mitokondrisinde lokalize olan markerlarla
özdeşleşmiştir. Imai ve arkadaşlarının Kitasaito Üniversitesinde yaptığı çalışmaya 31
65
fertil, 73 infertil gönüllü çalışmaya katılmıştır. 31 fertil erkekten 23’ü
normozoospermi, 7’si astenozoospermi, 1’i oligozoospermi tanısı konmuştur.
73 infertil bireyden 18’ü normozoospermi, 23’si astenozoospermi, 7’si
oligozoospermi ve 25’ine oligoastenozoospermi tanısı konmuştur.
31 fertil örnekten alınan spermatozoon örnekleri incelenmiş ancak bir kusur
gözlenememiştir. 73 infertil gönüllüden 7 oligozoospermi infertil bireyin
sonuçlarında çarpıcı bir sonuçla karşılaşmışlardır. Bu 7 infertil bireye ait
spermatozoon örneklerinde GPX4 seviyesinde düşüş ve mitokondri sayısında azalma
gözlenmiştir (Imai, 2003).
Garolla ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada memeli spermatozoasında, ATP’nin ana
kaynağı olan mitokondrinin dış zarı kapsül adı verilen keratin bir yapı ile sarılıdır.
Bu yapının ana bileşeni selenoenzim fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidazdır
(PHGPX). Glutatyon peroksidaz ailesinin bu monomerik üyesi özellikle testiste
bulunması, sperm mitokondrial kapsülü oluşturması ve spermatogenezde rol
oynamaktadır. PHGPX (GPX4)’in düşük aktivitesi in vitro inkübasyon sırasında ileri
hareketli sperm sayısının düştüğünü göstermektedir. Garolla ve arkadaşlarının 30
astenozoospermili hastalar üzerinde yaptığı 3 aylık çalışmada PHGPX’in sperm
sayısı, morfoloji ve vitalitede bir değişim göstermediğini gözlememişlerdir (Garolla
et al., 2005).
Yaptığımız çalışmada elde ettiğimiz veriler doğrultusunda normozoospermi’li ve
oligozoopermi’li hasta gruplarında 1 saatlik GPX uygulaması sonucu vitalitede bir
değişim gözlenmezken 24 saatlik GPX uygulaması sonucu normozoospermi ve
oligozoospermi hasta gruplarının vitalitesinde istatiksel bir değişim gözlendi .
Ülkemizde yapılan çalışmada Taşdemir ve arkadaşlarının dondurulmuş boğa sperma
kalitesi değişik antioksidanların etkisini incelemişlerdir. Taşdemir ve arkadaşları
ejakülatları 5 eşit parçaya ayırdı ve milimetrede 15x106 spermatozoa olacak şekilde
ayırmışlardır. Spermalar otomatik sperma dondurma makinasında -196 °C ‘de sıvı
nitrojende dondurulmuştur. Dondurulan sperma hücreleri 37 °C’de 30 sn’de
çözülerek plazma membran bütünlüğü yanı sıra sperma hareketi değerlendirilmiştir.
Biyokimyasal analizler ve ölçümler için ticari kitler kullanılmıştır.Yapılan çalışmalar
doğrultusunda GPX’in boğa spermaları üzerinde herhangi bir pozitif etkisi olmadığı
gözlenmiştir (Taşdemir ve ark., 2014).
66
Tavilani ve arkadaşlarının 2008 de yaptıkları bir çalışmada seminal plazma
antioksidan enzim aktivitelerinin normospermik ve astenospermik hastalarda
değerlendirmişler ve lipid peroksidasyonu ile her iki grupta karşılaştırmışlardır. Bu
çalışmada seminal plazma katalaz (CAT), süperoksit dismutaz (SOD) ve glutatyon
peroksidaz (GPX) aktivitesi ile lipid peroksidasyonu belirteci olan MDA arasındaki
ilişki incelenmiştir.Normospermik örneklerde seminal plazma antioksidan enzimleri
ile total MDA miktarı arasında pozitif korelasyon bulunurken, astenospermik
örneklerde sadece SOD ve CAT aktivitesi ile MDA korelasyonu bulunmuştur
(Tavilani et al., 2008). Araştırıcılar normospermik ve astenospermik olguların GPX
aktivitesinin de benzer olduğunu göstermişlerdir.
Tomar ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada infertile kişilerde semen antioksidan
sistemi araştırılmış ve normal kişilerle karşılaştırılmıştır (Tomar et al., 2017).
Oligospermik ve astenospermik kişiler arasında seminal antioksidan enzimler ile
MDA ilişkisine bakılmıştır. Astenospermik hastalarda seminal antioksidan enzim
düzeylerinde azalma görünürken MDA konsantrasyonununun arttığı gözlenmiştir.
Bu durum normo ve oligospermik olgularda görülmemiştir. Özetle seminal plazma
GPX’in oligo ve normospermik olgularda farklı olmadığı gösterilmiştir.
GPX’lerin ROS'a karşı korunmalara katkısı, insan spermatozoasında, kemirgenlerin
aksine, insan spermatozoalarında, testislerin veya seminal plazma GPX2, GPX3'ün
ve GPX5'in bulunmadığından ve GPX4'ün olgunlaşmamış olarak çözünmez ve
enzimatik olarak inaktif olması nedeniyle sınırlı olduğu ileri sürülmektedir (Crisol et
al., 2012). Çalışmamızda elde ettiğimiz veriler ışığında GPX ‘in normo ve
oligospermik örneklerde inkübasyon süresi ile sınırlı bir etki yaptığı görülmüştür.
Çalışmanın hücresel düzeydeki etkilerinin ayrıca incelenmesi gerektiği
düşünülmektedir.
67
8. SONUÇLAR VE ÖNERİLER
• Yaptığımız çalışmada spermler üzerinde 1 saatlik GPX uygulamasının
sperm vitalitesi üzerinde herhangi bir etkisi olmadığı sonucuna varıldı.
• 24 saatlik GPX uygulamasının oligozoospermi ve normozoospermi
gruplarında sperm vitalitesi üzerinde olumsuz bir etkisi olduğu sonucuna varıldı.
• 1 saatlik ve 24 saatlik GPX uygulanması sonucu hem normozoospermi hem
de oligozoospermi gruplarında sperm motilitesini arttırdığı sonucuna varıldı.
• 24 saatlik GPX uygulamasının hem normozoospermi hemde oligozoospermi
gruplarında progresif motilite üzerinde negatif bir etkisi olduğu sonucuna varıldı.
Elde etmiş olduğumuz bulguların 1 ve 24 saatlik GPX uygulamasının sperm
motilitesini artırdığı ancak bireysel farklılıkların açıklanabilmesi için vaka sayılarının
artırılarak klinik anlamda da katkı sağlanabilmesi amacıyla ileri çalışmalarla
genişletilmesi gerektiğini söyleyebiliriz.
68
9. KAYNAKÇA
Agarwal, A., Ikemoto, I., Loughlin, K.R. (1994), Relationship of sperm parameters
with levels of reactive oxygen species in semen specimens. Journal of Urology, 152,
107-110.
Agawa, Y. (1996), Overexpression of phospholipid hydroperoxide glutathione
peroxidase suppressed cell death due to oxidative damage in rat basophile leukemia
cells (RBL-2H3). Biochemical and Biophysical Research Communications, 222,
432– 438.
Agarwal, A., Nallella, K.P., Allamaneni, S.S., Said, T.M. (2004), Role of
antioxidants in treatment of male infertility: An overview of the literature. Reprod
Biomed Online, 8, 616-27.
Agarwal, A., Allamaneni, S.S. (2011), Free radicals and male reproduction. Journal
of the Indian Medical Association, 109(3), 184-7.
Aitken, R.J. (1999), The Amoroso Lecture. The human spermatozoon-a cell in
crisis?. Journal of reproduction and fertility,115, 1-7.
Aitken, R.J., Clarkson, J.S. (1988), Significance of reactive oxygen species and
antioxidants in defining the efficacy of sperm preparation techniques. Journal of
Andrology, 9(6), 367-76.
Aitken, R.J. (1995), Free radicals, lipid peroxidation and sperm function.
Reproduction, Fertility and Development,7, 659-68.
Aitken, R.J., Fisher, H.M., Fulton, N., Gomez, E., Knox, W., Lewis, B. (1997),
Reactive oxygen species generation by human spermatozoa is induced by exogenous
NADPH and inhibited by the flavoprotein inhibitors diphenylene iodonium and
quinacrine. Molecular Reproduction and Development, 47, 468-82.
Akkuş, M. Embriyolojiye giriş ve tarihçe. Dicle Üniversitesi. Erişim tarihi:
05.09.2018.http://www.dicle.edu.tr/Contents/6f518fce-fda0-4da1-8c35-
2d2bd119279f.pdf.
69
Alkan, I., Şimşek, F., Haklar, G., et al. (1997), Reactive oxygen species productıon
by the spermatozoa of patients with idiopathic infetility: Realitionship to seminal
plazma antioxidants. Journal of Urology, 157, 140-143.
Aksoy, Y. (2002), Antioksidan metabolizmada glutatyonun rolü. Türk Klinik Tıp
Bilimleri Dergisi, 22, 442-446.
Aktan, G. (2011), WHO-2010 kriterlerine göre semen parametreleri neler değişti?.
Uroturk, doğu_anadolu_mayıs_sunum_pdf.
Aliabadi, E., Karimi, F., Talaei- Khozani, T. (2013), Effects of L-carnitine and
pentoxifylline on carbohydrate distribution of mouse testicular sperm membrane. The
Iranian Journal of Medical Sciences, 38 (2), 107-115.
Arthur, J.R. (2000), The Glutathione Peroxidases. Cellular and Molecular Life
Sciences, 57, 1825-1835.
Aydos K.,(2007), Temel Üroloji Kitabı. İçinde: Erkek infertilitesi. Anafarta K,
Bedük Y, Arkan N, (eds.), Ankara: Güneş Tıp Kitabevi, Üçüncü baskı, s: 989.
Aytekin Y, Solakoğlu S. (Çev.) (2009), Temel Histoloji Text&Atlas, Junqueira, L.C.,
Carneiro J., İstanbul: Nobel Tıp Kitapevi.
Beydola, T., Sharma, R.K., Lee, W., Agarwal, A. (2013), Male Infertility Practice.
In: Sperm preparation and selection techniques.Rizk B, Aziz N, Agarwal A. (eds.),
New Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers, s: 244-251.
Bozhan, N. (2017), Bazı Schıff bazlarının Saccharomyces cerevisiae Kültür
Ortamlarında Bazı Biyokimyasal Parametreler Üzerine Etkileri, Yüksek Lisans Tezi,
Bitlis Eren Üniversitesi ve Fırat Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji
Anabilim Dalı, Bitlis, (Danışman: Doç. Dr. Ayşe Dilek ÖZŞAHİN KİREÇCİ).
Burrows, P.J., Schepterman, C.G., Lipshultz, L.I. (2002), Comprehensive office
evaluation in the newmillennium. Urologic Clinics of North America, 29, 873-894.
70
Büyükuslu, N., Yiğitbaşı, T. (2015), Reaktif Oksijen Türleri ve Obezite Oksidatif
Stres MÜSBED, 5,197-203.
Cao, G., Prior, R.L. (1998), Comparison of different analytical methods for assesing
total antioxidant capacity of human serum. Clinical Chemistry, 44, 1309-1315.
Cao, G., Prior, R.L. (1999), In vivo antioxidant capacity: Comperison of different
analytical methods. Free Radical Biology & Medicine, 27, 1173-1181.
Casper, R.F., Meriano, J.S., Jarvi, K.A., Cowen, L., Lucato, M.L. (1996), The
hypoosmotic swelling test for selection of viable sperm for intracytoplasmic sperm
ınjection in men with complete asthenozoospermia. Fertility and Sterility, 65, 972.
Chiles, K.A., Schlegel, PN. (2015). What do semen parameters mean? How to define
a normal semen analysis. Archives Of Andrology, 4(2), 1-4.
Cnubben, N.H.P., Rietjens, I.M.C.M., Wortelboer, H., Van Zanden, J., Van
Bladeren, P.J. (2001), The interplay of glutathione related processes in antioxidant
defense. Environmental Toxicology and Pharmacology, 10, 141-152.
Cooper, T.G., Yeung, C.H. (2010), Physiology of Sperm Maturation and
Fertilization. In: Nieschlag E, Behre HM, Nieschlag S, (eds). Springer-Verlag Berlin
Heidelberg, s:61-85.
Coyle, C.H., Kader, K.N. (2007), Mechanisms of H2O2-induced oxidative stress in
endothelial cells exposed to physiologic shear stress. ASAIO J, 53, 17-22.
Crisol, L., Matorras, R., Aspichueta, F., Expósito, A., Hernández, M.L., Ruiz-Larrea,
M.B., Mendoza, R., Ruiz-Sanz, J.I. (2012), Glutathione peroxidase activity in
seminal plasma and its relationship to classical sperm parameters and in vitro
fertilization-intracytoplasmic sperm injection outcome. Fertil Steril. 97(4), 852-7.
Çayla, E. (2011), Hayvan ve bitkilerde oksidatif stres ile antioksidanlar. Tıp
Araştırmaları Dergisi, 9(1), 73-83.
Çoruh, D. (2010). Cep Telefonu Kulanımının In Vitro Düzeyde Bazı Sperm
Parametrelerine Etkileri, Yüksek Lisans Tezi, Selçuk Üniveristesi, Sağlık Bilimleri
71
Enstitüsü, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Konya, (Danışman: Prof. Dr.
Selçuk DUMAN).
Dağdeviren, A., Müftüoğlu, F.S., Karabay, G. (Çev.) (2009), Renkli Histoloji Atlası.
Gartner L.P., Hiatt J.L., Color Atlas of Histology, Ankara: Güneş Tıp Kitapevi.
Darley-Usmar, V., Wiseman, H., Halliwell, B.(1995). Nitric oxide and oxygen
radicals: a question of balance. FEBS Letters ,369,131-135.
Davet, J.R. (2006), The antioxidant glutathioneione proxydase family and
spermatozoa: A complex story. Molecular and Cellular Endocrinology, 250, 70-79.
De Lamirande, E., Gagnon, C. (1992), Reactive oxygen species and human
spermatozoa. II. Depletion of adenosine triphosphate plays an important role in the
inhibition of sperm motility. Journal of Andrology, 13, 379-386.
De Lamirande, E., Gagnon, C. (1995), Impact of reactive oxygen specieson
spermatozoa: A balancing act between beneficial and detrimental effects. Hum
Reprod, 10, 15-21.
De Lamirande, E., O’Flaherty,C. (2008), Sperm activation: Role of reactive oxygen
species and kinases. Biochimica et Biophysica ActaProteins and Proteomics,
1784(1), 106–115.
Delilbaşı, L., Balaban, B., Ayaş, B. (2001), Gametler Fertilizasyon ve Embriyoner
Gelişim. 1. baskı. İstanbul: Serono Yayınları, s: 50-51.
Demirtaş, A., Üntan İ. (2011), Seminal sıvı ve spermde oksidatif stres ve
antioksidanlar. Türk Üroloji Seminerleri, 2, 26-27.
Doğan, Ş. (2008), Seminal Plazmada Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) Sperm DNA
Fragmantasyonu ve Apopitozu Sürecinde İnfertiliteye Olan Etkisinin
Değerlendirilmesi. Yüksek Lisans Tezi, Dokuz Eylül Üniversitesi, Sağlık Bilimleri
Enstitüsü, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, İzmir, (Danışman: Yrd. Doç.Dr.
Çetin PEKÇETİN).
Elder, K., Dale, B. (2000), In vitro fertilization. 2.Baskı, Cambridge:Cambridge
University Press., s: 27-151
72
Eliasson, R. (1975), Analysis of semen. In: Progress in infertility. Behrman S.J,
Kistner R.W, (eds.), İkinci baskı, New York : Little Brown,s: 691-713.
Erdemir, F., Fırat, F., Gençten, Y. (2011), Sperm morfolojisinin değerlendirilmesi ve
klinik önemi. Türk Üroloji Seminerleri, 2, 11-7.
Eşrefoğlu, M. (2004), Genel ve Özel Histoloji. 1.baskı, Malatya: Pelikan Yayıncılık.
Falandysz, W. (2004), Chemotherapy associated oxidative stress: Impact on
chemotherapeutic effectiveness. Integr Cancer Ther, 3(4), 294-300.
Garolla, A., Maiorino, M., Roverato, A., Roveri, A., Ursini, F., Foresta, C. (2005),
Oral carnitine supplementation ıncreases sperm motility in asthenozoospermic men
with normal sperm phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase levels.
Fertility and Sterility, 83, 355-361.
Gedikli, S., Özbek, E., Demirci, T. (2013), Fertilizasyonun Moleküler Temeli. Van
Tıp Dergisi, 20(4), 294-301.
Giannottasio, A., Rosa, De M., Smeroglia, R., Zarrilli, S., Cimmino, A., Rosario Di.,
B., Ruggiero, R., Colao, A., Lombardi, G. (2002), Glutathione Peroxidase (GPX)
activity in seminal plasma of healthy and infertile males. Journal of
Endocrinological Investigation, 25, 983-986.
Gomez, E., Buckingham, D.W., Brindle, J., Lanzafame, F., Irvine, D.S., Aitken, R.J.
(1996), Development of an image analysis system to monitor the retention of residual
cytoplasm by human spermatozoa: Correlation with biochemical markers of the
cytoplasmic space, oxidative stress and sperm function. J Androl, 17, 276-87.
Griveau, J.F., Dumont, E., Renard, P., Callegari, J.P., Le Lannou, D. (1995),
Reactive oxygen species, lipid peroxidation and enzymatic defence systems in
human spermatozoa. The Journal of Reproduction and Fertility ,103, 17-26.
73
Gutteridge, J.M.C., Rowley, D.A., Halliwell, B. (1981), Superoxide dependent
formation of hydroxyl radicals in the presence of iron salts. Biochemical Journal,
199,263-265.
Güçtaş, A.Ö. (2006), Bilgisayar Destekli Semen Analiz Sistemi (CASA) İle Yapılan
Sperm Morfolojisi İncelemelerinin Tekrarlanabilirliği, Değişken Analizleri ve
Laboratuar İçi Manuel Yöntemle Karşılaştırılması. Uzmanlık Tezi, Sağlık Bakanlığı
Taksim Eğitim Ve Araştırma Hastanesi, İstanbul, (Danışmanlar: Doç. Dr. H. Mete
ÇEK ve Op. Dr. Muammer AYDIN).
Gümüş, B., Uyanık, B.S., Lekili, M., Yiğitoğlu, M.R., Temeltaş, G., Büyüksu, C.
(2001), Varikoselli hastaların semen plazmasında antioksidan seviyesi, Türk Uroloji
Dergisi. 27(1), 73-76.
Gürdöl, F., Ademoğlu, E. (2010), Biyokimya. 1. Baskı, İstanbul: Nobel Tıp
Kitabevleri, s:829-836.
Hassa, H. (2003), İnfertil Olgulara Klinik Yaklaşım ve IVF Laboratuar
Uygulamaları. 1. Baskı, Eskişehir: Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Yayınları, s:
127-165.
Handelsman, D.J., Conway, A.J., Boylan, I.M., Turtle, J.R. (1984), Testiküler
function in potential sperm donors: Normal ranges and the effects of smoking and
varicocele. International Journal of Andrology, 7, 369-382.
Hill, J.A., Cohen, J., Anderson, DJ. (1989), The effects of lymphokines and
monokines on human sperm fertilizing ability in the zona free hamster egg
penetration test. American Journal Of Obstetrics And Gynecology,160, 1154-1159.
Hull, M.G., Willams, J.A., Ray, B., Mc Laughlin, E.A., Akande, V.A., Ford, W.C.
(1998), The contribution of subtle oocyte or sperm dysfunction affecting fertilization
in endometriosis-associated or unexplained infertility: a controlled comparison with
tubal infertilitiy and use of donor spermatozoa. Human Reprod, 13, 1825-1830.
74
Imai, H., Nakagawa, Y. (2003), Biological significance of phospholipid
hydroperoxide glutathione peroxidase (Phgpx, Gpx4) in mammalian cells. Free
Radical Biology &Medicine, 34, 145-169.
Imai,H., Hakkaku,N., Iwamoto R., Jyunko S., Toshiyuki S., Tojima Y., Konishi K.,
et al. (2009), Depletion of selenoprotein GPx4 in spermatocytes causes male
infertility in mice. Journal of Biological Chemistry, 284(47), 32522–32532.
Junqueira, L.C., Carneiro, J., Kelley, R.O. (1993), Temel Histoloji . İçinde: Erkek
Üreme Sistemi. Aytekin Y, Solakoğlu S, Ahıshalı B,(eds.), İstanbul: Barış Kitapevi.
Kadıoğlu, A., Çayan, S., Semenci, B., Orhan, İ.(2004), Erkek Reprodüktif Sistem
Hastalıkları ve Tedavisi. 1. Baskı, İstanbul: İstanbul Medikal Yayıncılık, s: 91-102.
Kadıoğlu, A., Kendirci, M., Aktan, G., Yaman, Ö., Çayan, S. (2011), WHO
Laboratuar El Kitabi. İçinde: İnsan Semeninin İncelenmesi Ve İşlemlerden
Geçirilmesi. Türk Üroloji Derneği, ISBN:978-975-00112-4-5.
Kahraman, S. (2008), Erkeklerde Kan Ve Seminal Plazmada Kurşun Ve Kadmiyum
Düzeylerini Parametreleri Üzerine Etkileri, Tıpda Uzmanlık Tezi, Eskişehir
Osmangazi Üniversitesi, Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Tıp Fakültesi, Kadın
Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı, Eskişehir, (Danışman: Prof. Dr. Atilla
YILDIRIM).
Karadağ, T., Kendirici, M. (2013), Erkek infertilitesinde antioksidan tedavinin yeri.
Erkek Üreme Sağlığı, 55, 263-264.
Karaöz, E. (2002), Özel Histoloji. SDÜ Yayın No: 29, Isparta :SDÜ Basımevi.
Keskin, M.Z., Budak, S., İlbey, Y.Ö. (2016), İdiopatik erkek infertilitesi güncel
medikal tedavi yaklaşımı. Androloji Bülteni, 18(64), 40-43.
Kierszenbaum, A.L. (2006), Histoloji ve Hücre Biyolojisi, Patolojiye Giriş. In:
Üreme Sistemi. Demir R,( Eds.), Ankara: Palme Yayıncılık, s531-564.
Konukoğlu, D., Akçay, T. (1995), Glutatyon metabolizması ve klinik önemi. Türk
Klinik Tıp Bilimleri, 15, 214-218.
75
Koyuncu, H. (2011), Methods for the determination of sperm DNA damage. Turk
Urol Sem, 2, 18-23.
Krausz, C.S., Gervasi, G., Forti, G., Baldi, E. (1994), Effect of platelet activating
factor on motility and acrosome reaction of human spermatozoa. Human
Reproduction, 9(3), 471-476.
Kumar, R. (2002), Oxidative stress associated DNA damage in testis of mice:
Induction of abnormal sperms and effects on fertility. Mutat Res, 513(1-2), 103-11.
Lecture Fertilization, Erişim Tarihi: 30.09.2017:
https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Lecture-Fertilization.
Lenzi, A., Culasso, F., Gandini, L., Lombardo, F., Dondero, F .(1993), Placebo-
controlled, double-blind, cross-over trial of glutathione therapy in male infertility.
Human Reproduction, 8, 1657–1662.
Mates, J.M., Perez-Gomez, C., De Castro, I.N. (1999), Antioxidant enzymes and
human diseases. Clinical Biochemistry, 32, 595-603.
Meister A.(1995), Glutathione Metabolism. Methods in Enzymology, 251, 3-7.
Moore, K.L., Persaud, T.V.N. (2009), Klinik Yönleriyle İnsan Embriyolojisi. In:
İnsan Gelişiminin Başlangıcı. Dalcık H, Yıldırım M,(eds.), İstanbul:Nobel Tıp
Kitapevi.
Mortimer, D. (1994), Sperm recovery techniques to maximize fertilizing capacity.
Reprod Fertil Def, 6, 25-31.
Nasr- Esfahani M.H., Deemeh M.R., Tavalaee M. (2010), Artificial oocyte activation
and intracytoplasmic sperm injection. Fertil steril, 94(2), 520-526.
Oehninger, S.C., Kruger, T.F.(2009), Erkek İnfertilitesi Teşhis ve Tedavi. Kilciler
M,(Çev. Eds.), İstanbul: Habitat Matbaası, s:1-240.
Ovalle, W.K., Nahirney, P.C.(2009),Netter Temel Histoloji. In: Erkek Üreme
Sistemi. Müftüoğlu S, Kaymaz F, Atilla P, (Çev. Eds.), Ankara: Güneş Tıp Kitapevi,
76
s:377-398.
Özçınar, E. (2014), Semen Analizi: 2010 Dünya Sağlık Örgütü Kriterlerine Göre
Spermiyogram. İzmir Üniversitesi Tıp Dergisi, 1, 48-51.
Özdiler, E., Aydos, K. (2000), Klinik Androloji. 1. Baskı, Ankara,:Ankara
Üniversitesi Basımevi, s: 253-284.
Özveren, H. (2015), İdiopatik İnfertil Hastalarda Semen ve Kan Plazmasında
Malondialdehit- Katalaz- Glutatyon Peroksidaz – Süperoksit Dismutaz Düzeyi ve
Semen Parametleri İle İlişkisi. Uzmanlık Tezi, Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp
Fakültesi, Üroloji Anabilim Dalı, Van, (Danışman: Dr. Mustafa GÜNEŞ).
Pelit, E.S., Katı, B., Akın, Y.,Yeni, E. (2017), Çevresel stres faktörlerinin sperm
hücreleri üzerine etkisi, Androloji Bülteni, 19(2), 61-64.
Purvis, K., Christiansen, E. (1992), Male infertility: Current concepts. Ann Med, 24,
258-72
Rodin, D.M., Larone, D., Goldstein, M.(2003), Relationship Between Semen
cultures, leukospermia and semen analysis in men undergoing fertility evaluation.
Fertil Steril, 8, 1555-1558.
Ross, M.H., Pawlina, W. (2011), Histology: A Text and Atlas: with Correlated Cell
and Molecular Biology. In: Male Reproductive System. Philadelphia:Lippincott
Williams & Wilkins, 6. Baskı, s: 788-802.
Rotruck, J.T., Pope, A.L., Ganther, H.E., Swanson, A.B., Hafeman, D.G., Hoekstra,
W.G. (1973), Selenium: Biochemical role as a component of glutathione peroxidase.
Science, 179, 588-590.
Sadler, T.W.(2005),Langman’s Medikal Embriyoloji. 9. BaskıAnkara: Palme
Yayıncılık,s: 7-38.
Safarinejad, M.R., Safarinejad, S. (2009), Efficacy of selenium and/or N-acetyl-
cysteine for improving semen parameters in infertile men: A double-blind, placebo
controlled, randomized study. J Urol, 181,741-51.
77
Sharlip, I.D., Jarow, J.P., Belker, A.M., Lipshultz, L.I., Sigman, M., Thomas, A.J.,
Schlegel, P.N., Howards, S.S., Nehra, A., Damewood, M.D., Overstreet, J.W.,
Sadovsky, R. (2002), Best practice policies for male infertility. Fertil Steril, 77,
873.
Sies, H., Sharov,V.S., Klotz,L., Briviba, K.(1997), Glutathione peroxidase protects
against peroxynitrite-mediated oxidations: A new function for selenoproteins as
peroxynitrite reductase. Journal of Biological Chemistry, 272(44), 27812–27817.
Sikka, S.C., Rajasekaran, M., Hellstrom, W.J. (1995), Role of oxidative stress and
antioxidants in the male infertility. Jornal Of Andrology, 16, 464-468.
Sikka, C.S. (2004), Role of Oxidative stress and antioxidants in andrology and
assisted reproductive technology. Jornal Of Andrology, 25, 1.
Silva, P.F.N., Physiology of peroxidation processes in mammalian sperm. Erişim
Tarihi:(15.07.2018),http://igitur-archive.library.uu.nl/dissertations/2006-0710-
200029/full.pdf. 2006,Utrecht University.
Smith, R., Vantman, D., Ponce, J., Escobar, J., Lissi, E. (1996), Total antioxidant
capacity of human seminal plasma. Hum Reprod, 11, 1655-1660.
Sukcharoen, N., Keith, J.,Irvine, D.S.,Aitken, R.J. (1996), Prediction of the in vitro
fertilizasyon(IVF) potential of humanspermatozoa usıng sperm function tests: Teh
effect of the delay between testing and IVF. Hum Reprod, 11, 1030-1034.
Sunderman, W.F., Boerner, F.(1950), Normal Values in Clinical Medicine, In:
Seminal fluid. 1. Baskı. Philadelphia: WB Saunders Company, s:385.
Sroka, Z., Cisowski, W. ( 2003), Hydrogen peroxide scavenging, antioxidant and
anti-radicalactivity of some phenolic acids. Food and Chemical Toxicology, 41, 753-
758.
Şener G., Yeğen B. (2009), İskemi Reperfüzyon Hasarı. Klinik Gelişim Dergisi, 22,
5-11
78
Taşdemir, U., Tuncer, B.P., Büyükleblebici, S., Özgürtaş, T., Durmaz, E.,
Büyükleblebici, O. (2014), Effects of various antioxidants on cryopreserved bull
sperm quality. Kafkas Üniveristesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 20(2), 253-258.
Tavilani, H., Goodarzi, M.T.,Vaisi-raygani, A., Salimi, S., HassanzadehT.
(2008), Activity of antioxidant enzymes in seminal plasma and their relationship
with lipid peroxidation of spermatozoa. International Braz J Urol, 34 (4), 485-491.
Ugar M. (2016), Glutatyon Peroksidaz Aktivite Ölçümü İçin Yeni Bir
Spektrofotometrik Yöntem Geliştirilmesi, Yüksek Lisans Tezi, İstanbul Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, İstanbul, Danışman:Doç. Dr.
Mustafa Özyürek).
Ursini, F., Maiorino, M., Gregolin, C. (1985), The seleoenzyme phospholipid
hydroperoxide glutathione peroxidase. Biochimica et Biophysica Acta, 839, 62-70.
Ursini,F., Heim,S., Kiess M., Maiorino M. (1999), Dual function of the
selenoprotein PHGPx during sperm maturation. Science, 285(5432), 1393–1396.
Ursini, F., Maiorino, M. (2014), Glutathione Peroxidase, Reference Module in
Biomedical Sciences, Encyclopedia of Biological Chemistry, 399-404.
Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M.T., Mazur, M. (2007), Telser Free
radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. J Int
J Biochem Cell Biol, 39(1), 44-84.
Vignini, A., Nanetti, L., Buldreghini, E., Moroni, C., Ricciardo – Lamonica, G.,
Mantero, F., Boscaro, M., Mazzanti, L., Balercia G. (2006), The production of
peroxynitrite by human spermatozoa may affect sperm motility through the
formation of protein nitrotyrosine. Fertil Steril, 85(4), 947-53.
79
Wilkes, S., Chinn D.J., Murdoch A., Rubin G.(2009).Epidemiology and management
of infertility: a population-based study in UK primary care. Fam Pract, 26(4), 269-
247.
World Health Organization (WHO) (1993), WHO Manuel For Standarized
Investigation and Diagnosis Of The Infertile Couple, 7. Baskı, Cambridge:
Cambridge University Press.
World Health Organisation (WHO) (2002), Laboratuar El Kitabı. In: İnsan semen
ve sperm sevikal mukus etkileşimi değerlendirilmesi. Günalp S, (Eds.), Ankara: Tıp
Teknik Kitapevi.
World Health Organisation (WHO) (2010), WHO Laboratory Manual for the
Examination and Processing of Human Semen, 5. Baskı, Geneva: World Health
Organization.
Wu, T.P., Huang, B.M., Tsai, H.C., Lui, M.C., Liu, M.Y. (2004), Effects of nitric
oxide on human spermatozoa activity, fertilization and mouse embryonic
development. Arch Androl, 50, 173-9.
Zülfikaroğlu, G., Özgür H., Polat S. (2010), Kapasitasyonun Moleküler Temelleri.
Arşiv Kaynak Tarama Dergisi, 19(1), 12-21.
80
10.EKLER
EK 1. Gönüllü Olur Formu
BİRUNİ ÜNİVERSİTESİ
“ GİRİŞİMSEL OLMAYAN KLİNİK ARAŞTIRMALAR”
İÇİN BİLGİLENDİRİLMİŞ GÖNÜLLÜ OLUR FORMU
ARAŞTIRMA PROJESİNİN ADI: İn vitro antioksidan uygulamasının sperm
fonksiyonları üzerine etkisi
Sizi “İn vitro antioksidan uygulamasının sperm fonksiyonları üzerine etkisi”
başlıklı bir araştırmaya davet ediyoruz. Bu araştırmaya katılıp katılmama kararını
vermeden önce, araştırmanın neden ve nasıl yapıldığını bilmeniz gerekmektedir. Bu
nedenle bu nedenle bu formun okunup anlaşılması büyük önem taşımaktadır.
Aşağıdaki bilgileri dikkatlice okumak için zaman ayırınız. Eğer anlamadığınız ve
sizin için açık olmayan şeyler varsa, ya da daha fazla bilgi isterseniz bize sorunuz.
Bu anket çalışmasına katılmak tamamen gönüllülük esasına dayanmaktadır.
Çalışmaya katılmama hakkına sahipsiniz. Anketi yanıtlamanız, araştırmaya
katılım için onam verdiğiniz biçiminde yorumlanacaktır Size verilen anket
formlarındaki soruları yanıtlarken kimsenin baskısı veya telkini altında olmayın. Bu
formlardan elde edilecek bilgiler tamamen araştırma amacı ile kullanılacaktır.
Sorumlu Araştırmacı : Prof. Dr. Tülay İREZ
Yardımcı Araştırmacı : Bio. Dilara KONK
Çalışmanın Amacı nedir; bendan başka kaç kişi bu çalışmaya katılacak?
Sizi davet ettiğiniz çalışmanın amacı, antioksidan (vücudumuzda halihazırda
bulunduğu gibi beslenme ile de alabildiğimiz bir kimyasal maddedir.) olarak bilinen
glutatyonun, insan vücudu dışındaki koşullarda sperm hücrelerine pozitif ya da
negatif bir olup olmadığı incelenmektedir. Spermiyogram tahlili amacıyla vermiş
81
olduğunuz örnek değerlendirilip, çalışılıp ve sonuçlandırıldıktan sonra arda kalan
örnek tıbbi atığa atılıp imha edilecekken sizin izninizle örneğiniz araştırma için
kullanılacak ve sonrasında imha edilecektir. Örneğiniz değerlendirilme sonrası
kalan materyaliyle çalışılması planlandığı için sizin sağlık durumumunuz ve
spermiyogram analizinize herhangi bir negatif etkisi olmayacaktır. Çalışmanın
ortalama 2 ay sürmesini ve yaklaşık 40 kişinin katılması planlanmaktadır.
Bu çalışmaya katılmanın maliyeti nedir?
Bu çalışmaya katılmanız halinde hem araştırmacı hemde siz hiçbir maddi sorumluluk
altına girmeyeceksiniz.
Kişisel bilgilerim nasıl kullanılacak ?
Araştırma sorumlusu, kişisel bilgilerinizi, araştırmayı ve istatiksel analizleri
yürütmek için kullanılacaktır ancak kişisel bilgileriniz gizli tutulacaktır. Yanlızca
gereği halinde, sizinle ilgili bilgileri etik kurullar ya da resmi makamlar inceleyebilir.
Çalışma sonuçları çalışma bitiminde resmi yanlıca bu araştırmada olmak üzere tıbbi
literatürde yayınlabilcektir ancak kimliğiniz kesinlikle açıklanmayacaktır.
DAHA FAZLA BİLGİ İÇİN KİME BAŞVURABİLİRİM ?
Çalışma ile ilgili ek bir bilgiye ihtiyaç duyduğunuzda lütfen aşağıdaki kişi ile
iletişime geçiniz
ADI: Dilara KONK GÖREVİ : ARAŞTIRMA SORUMLUSU
TELEFON: 05374041816
Medical Park Bahçelievler Tüp Bebek Bölümü’nde Biyolog Dilara Konk tarafından
tıbbi bir araştırma yapılacağı belirtilerek bu araştırma ile ilgili yukarıdaki bilgiler
bana aktarıldı ve ilgili metni okudum. Bu bilgilerden sonra böyle bir araştırmaya
“katılımcı” olarak davet edildim.
Araştırmaya katılmam konusunda hiçbir zorlayıcı davranışla karşılaşmadım. Eğer
katılmayı reddersem, bu durumun tıbbi bakımıma ve hekim ile olan ilişkime
herhangi bir zarar getirmeyeceğinide biliyorum. Araştırmanın yürütülmesi sırasında
herhangi bir neden göstermeden araştırmadan çekilebilirim. ( Ancak araştırmacıları
zor durumda bırakmamak için araştırmadan çekileceğimi önceden bildirmemin
82
uygun olacağı bilincindeyim.) Ayrıca tıbbi durumuma herhangi bir zarar verilmemesi
koşuluyla araştırmacı tarafından araştırma dışı da tutulabilirim.
Araştırma için yapılacak harcamalarla ilgili herhangi bir parasal sorumluluk altına
girmiyorum. Bana da bir ödeme yapılmayacaktır.
Araştırmadan elde edilen benimle ilgili kişisel bilgilerin gizliliğinin korunacağını
biliyorum.
Araştırma uygulamasından kaynaklanan nedenlerle meydana gelebilecek herhangi
bir sağlık sorunumun ortaya çıkması halinde, her türlü tıbbi müdahalenin sağlanacağı
konusunda gerekli güvence verildi. ( Bu tıbbi müdahalelerle ilgili olarak da parasal
bir yük altına girmeyeceğim.)
Araştırma sırasında bir sorun ile karşılaştığımda ; Bio. Dilara KONK’ u
05374041816 nolu telefondan arayabileceğimi biliyorum.
Bana yapılan tüm açıklamaları ayrıntıyla anlamış bulunmaktayım. Bu koşullarla söz
konusu klinik araştırmaya kendi rızamla, hiçbir baskı ve zorlama olmaksızın
gönülülük içerisinde katılmayı kabul ediyorum.
KATILIMCI
ADI SOYADI:
TELEFON
İMZA:
83
Ek 2. Etik Kurul Onayı
84
85
11.ÖZGEÇMİŞ
Adı Soyadı: Dilara Konk
Doğum Tarihi ve Yeri : 10.12.1992 / İstanbul
Mail Adresi: [email protected]
Unvanı: Biyolog
Öğrenim Durumu: Lisans
Derece Okul Adı ve Bölümü Mezuniyet Yılı 2.92 Eskişehir Osmangazi Üniversitesi /
Biyoloji Bölümü 2014
Beşiktaş Etiler Lisesi / Sayısal 2010 50. Yıl Süheyla Artam İ.Ö.O 2006
86
87