DNA synthesis and repair
รั�ชนี�กรั ก�ลลปรัะวิ ทธ์2557
Outline
• DNA replication
• DNA polymerase and other proteins in DNA replication
• Telomere and telomerase
• DNA synthesis using RNA template
• Damage to DNA and mutation
• DNA repair
• DNA repair defect
2
ควิามสำ�าค�ญของการัสำ�งเครัาะห์ DNA
1 .ถ่�ายทอดข�อม ลทางพั�นีธ์"กรัรัมจาก cell เด มไปให์� cell ให์ม� ท�&จะเก ดข'(นี (DNA replication ) เพั)&อให์� cell ให์ม� ม�ล�กษณะ และค"ณสำมบั�ติ ติ�างๆ เห์ม)อนี cell เด ม parental cell daughter cell
(diploid) (diploid)
2. ซ่�อมแซ่ม DNA (DNA repair) เพั)&อรั�กษาข�อม ลทางพั�นีธ์"กรัรัมของ cell ไวิ�ให์�คงเด ม
3
DNA replication
• เก ดในี S-phase (synthesis phase) ของ cell cycle
• เรั &มด�วิยการัคลายเกล�ยวิของ DNA สำายค �
• DNA แติ�ละสำายท�าห์นี�าท�&เป1นี template ในีการัสำรั�าง DNA สำายให์ม� โดยเบัสำท�&จ�าเพัาะก�นีจะจ�บัค �ก�นี ค)อ A จ�บัค �ก�บั T และ G จ�บัค �ก�บั C
• เม)&อเสำรั3จสำมบั รัณ จะได� DNA สำายค � 2 โมเลก"ล ท�&ม�ล�าด�บัเบัสำเห์ม)อนี DNA ติ�(งติ�นี
• เรั�ยกวิ�า semiconservative replication
4
Semiconservative replication
ในีแติ�ละ molecule ของ DNA ท�&เก ดข'(นีให์ม� ปรัะกอบัด�วิย polynucleotide เด ม 1 สำาย และสำายให์ม� 1 สำาย
6
1 A A C T G G G G T T C C A
2 T T G A C C C C A A G G T
1 A A C T G G G G T T C C A
2 T T G A C C C C A A G G T
Semiconservative replication
C G
T A
T T G A C C C C A A G G T
A A C T G G G G T T C C A
7
ป4จจ�ยสำ�าค�ญท�&ใช�ในีการัสำ�งเครัาะห์ DNA
• DNA template
• dNTP : dATP, dGTP, dCTP และ dTTP
• RNA primer :– polyribonucleotide สำายสำ�(นี ๆ– ใช�เป1นีจ"ดเรั &มติ�นีการัสำ�งเครัาะห์ DNA
• Enzyme และ protein ชนี ดติ�าง ๆ เช�นี DNA polymerase, DNA ligase, DNA gyrase, primase, SSB, DnaC เป1นีติ�นี
• พัล�งงานี (ในีรั ป ATP) ท�&ใช�ในีการัคลายเกล�ยวิและติ�อสำาย DNA 8
Origin of replication
• เป1นีจ"ดเรั &มติ�นีของ DNA replication
• Replication process จะเคล)&อนีท�&จาก origin of replication ออกไปท�(ง 2 ท ศทาง (bidirectional)
• Prokaryotic cells จะม� origin of replication ติ�าแห์นี�งเด�ยวิ
• Eukaryotic cells ม�ห์ลาย origin of replication บันี chromosome เด�ยวิก�นี จ'งเก ดการัสำ�งเครัาะห์ DNA สำายสำ�(นี ๆ ห์ลายสำายพัรั�อมก�นี ท�าให์�การัถ่อดแบับัเสำรั3จเรั3วิข'(นี
9
DNA replication
• Unwinding of DNA helix : helicase
• Relaxation of supercoiled DNA : DNA gyrase
• RNA primer synthesis : primase
• DNA synthesis : DNA polymerase III– Leading strand– Lagging strand
• Removal of RNA primer & filling gaps : DNA polymerase I
• Sealing of DNA chain : DNA ligase
10
Replication begins with the unwinding of the Ori C (origin site)
Ori C locus - 245 bp
- tandem array of three 13-mers with nearly identical sequences (AT rich)
Dna A binds to Ori C
initiate sequence of steps of DNA synthesis
Tandem array of 13-mer seq.
Binding site for DnaA protein
E.coli
5' GATCTNTTNTTTT 3'
3' CTAGANAANAAAA 5'
11
HU : histone like protein stimulates initiation
12
Bidirectional replication of a circular chromosome Replication เรั &มเก ดท�& origin of replication โดยเก ดท�(ง 2 ท ศทางในีขณะเด�ยวิก�นี
Origin of replication
Replication forks
New strands
Parental strands
13
OO
O
O
O
O
สำ�วินีของ DNA ท�&ติ� (งติ�นีจากจ"ดเด�ยวิก�นีเรั�ยกวิ�า repliconO
+
Eukaryotic cells ม� origin of replication ห์ลายแห์�ง
O = origin
14
Unwinding of DNA helix
• เอนีไซ่ม helicase (Dna B) ท�าให์�เก ดการัคลายเกล�ยวิ DNA โดยข�(นีติอนีนี�(ติ�องใช�พัล�งงานีจาก ATP
• จ"ดท�& DNA คลายเกล�ยวิออกจะม�ล�กษณะเป1นีง�าม เรั�ยกวิ�า replication fork
• DNA สำายเด�&ยวิท�&เก ดจากการัคลายเกล�ยวิจะม�โปรัติ�นีช)&อ single stranded DNA binding protein มาจ�บัเพั)&อป6องก�นี DNA พั�นีเป1นีเกล�ยวิให์ม�
15
Relaxation of supercoiled DNA
• การัคลายเกล�ยวิ DNA จะท�าให์�เก ด supercoil ในี DNA บัรั เวิณถ่�ดไป (DNA บัรั เวิณใกล�เค�ยงก�บั DNA ท�&คลายเกล�ยวิจะพั�นีก�นีแนี�นีกวิ�าปกติ )
• DNA gyrase ท�าห์นี�าท�&ติ�ดเกล�ยวิออกแล�วิห์ม"นีให์� supercoil คลายติ�วิและติ�อปลายท�&ติ�ดออกให์�เช)&อมก�นีด�งเด ม
16
DNA gyrase (DNA topoisomerase II)
• ท�าห์นี�าท�&คลายเกล�ยวิของ DNA ท�&ขดก�นีแนี�นี (supercoil) ซ่'&งเก ดจากการัท�& DNA ติ�าแห์นี�งข�างเค�ยงม�การัคลายเกล�ยวิโดย DNA helicase ติามข�(นีติอนีด�งติ�อไปนี�(– DNA gyrase ติ�ด DNA duplex สำ�วินีท�&ม� supercoil ออก– เก ดการัห์ม"นีของ DNA duplex เพั)&อให์� supercoil คลายออก– ติ�อปลาย DNA duplex ท�&คลายออกแล�วิเข�าก�บั DNA ข�างเค�ยงด�งเด ม
• Porkaryotic DNA gyrase จะถ่ ก inhibit โดยสำารัติ�าง ๆ ได�แก�– Streptomyces derived novobiocin– Oxolinic acid, Nalidixic acidท�าให์� bacteria ไม�สำามารัถ่แบั�งเซ่ลลเพั &มจ�านีวินีได�
17
RNA primer synthesis
• การัสำ�งเครัาะห์ DNA จะเรั &มติ�นีได�ติ�องม�การัสำ�งเครัาะห์ RNA primer ท�&ม�ควิามยาวิปรัะมาณ 50-100 nucleotide ข'(นีมาก�อนี
• Primase ซ่'&งเป1นี RNA polymerase ชนี ดห์นี'&ง ท�าห์นี�าท�&สำ�งเครัาะห์ RNA primer จาก DNA template โดยม�ท ศทาง การัสำ�งเครัาะห์จาก 5’ 3’
18
DNA synthesis
• การัสำ�งเครัาะห์ DNA จะเก ดติ�อจากปลายของ RNA primer ในีท ศทาง 5’ 3’ (และติรังข�ามก�บัสำาย DNA template ซ่'&งม�ท ศทางจาก 3 ’ 5’ โดยใช� DNA polymerase III holoenzyme และ dNTP เป1นี substrate
• nucleotide ท�&มาติ�อก�นีเป1นีสำายให์ม� จะม�เบัสำท�& complementary ก�บั template ห์รั)อกล�าวิได�วิ�า สำาย nucleotide ท�&สำ�งเครัาะห์ข'(นีมาให์ม�ม�ล�าด�บัเบัสำเห์ม)อนีก�บั DNA สำายเด�&ยวิท�&แยกออกไป
• การัสำ�งเครัาะห์ DNA สำายให์ม�จะเก ดข'(นีสำองสำายในีท ศทางติรังก�นีข�าม โดยสำายห์นี'&งเรั�ยกวิ�า leading strand สำ�วินีอ�กสำายเรั�ยกวิ�า lagging strand
19
DNA synthesis
• Leading strand เป1นี DNA สำายให์ม�ท�&เก ดการัสำ�งเครัาะห์ติ�อก�นีเป1นีสำายยาวิไปในีท ศทางเด�ยวิก�นีก�บัการัเคล)&อนีท�&ของ replication fork
• Lagging strand เป1นี DNA ท�&ปรัะกอบัด�วิย DNA สำายสำ�(นี ๆ (fragment) จ�านีวินีมาก ท ศทางการัสำ�งเครัาะห์จะสำวินีทางก�บั replication fork โดยแติ�ละ fragment เรั�ยกวิ�า Okasaki fragment
• Okasaki fragment เก ดจาก DNA polymerase สำ�งเครัาะห์ nucleotide ได�เฉพัาะในีท ศทาง 5’ 3’ เท�านี�(นี
20
Removal of RNA primer and filling gaps• RNA primer ถ่ กติ�ดออกโดย DNA polymerase I จะติ�ด
nucleotide ทางปลาย 5’ ออกท�ละติ�วิ
• ช�องวิ�างท�&เก ดจากการัติ�ด RNA primer ออก จะถ่ กแทนีท�&ด�วิย deoxyribonucleotide ท�&ม�เบัสำ complementary ก�บั template โดย DNA polymerase I
• ในี leading strand ห์ล�งการัติ�ดสำาย RNA primer ออกแล�วิ จะได� DNA สำายยาวิสำายเด�ยวิ สำ�วินีในี lagging strand จะได� DNA สำายสำ�(นี ๆ ห์ลายสำาย
21
Sealing of DNA chain
• DNA ligase ท�าห์นี�าท�&เช)&อมปลาย 3’-OH ของ Okazaki fragment ก�บัปลาย 5’-phosphate ของ Okazaki fragment ท�&อย �ติ ดก�นี
• นีอกจากนี�( DNA ในี leading strand ท�&เก ดจาก origin of replication คนีละจ"ดก�นี สำามารัถ่ติ�อก�นีเป1นีสำายยาวิด�วิย DNA ligase เช�นีก�นี
• การัท�างานีของ DNA ligase ในี eukaryotic cells ติ�องใช� ATP
22
3'
3'
5'
5'
A
A A
A
T
C
C
G
GT
T T
3'
3'
5'
5'
A
A A
A
T
C
C
G
GT
T T
OH
H2O3 PO
O O
OOP
H
DNA ligaseATPAMP +PPiH2O
23
DNA polymerase
• catalyzes a template-directed synthesis of DNA from dNTP
• requires free 3'-OH group
• synthesis in the 5' 3' direction
• Uses dATP, dGTP, dCTP, and dTTP as substrates 24
DNA polymerase
• DNA polymerase in prokaryotes (E. coli)– DNA polymerase I– DNA polymerase II– DNA polymerase III
• DNA polymerase in eukaryotes
25
DNA polymerase I
• 10 nucleotides / sec / mol-enzyme
• Polymerase activity (5’ 3’)
• 3’ 5’ exonuclease activity ท�าห์นี�าท�& proofreading
• 5’ 3’ exonuclease activity ท�าห์นี�าท�& error-correcting
• ใช�ในี DNA synthesis (ติ�อ Okazaki fragment), remove primer, filling gaps, DNA repair
26
DNA polymerase I ม� activity ของ enzyme 3 ชนี ด อย �ในีติ�วิเอง
3' 5' exonuclease
5' 3' exonuclease polymeraseN C
small fragment large fragment( Klenow fragment )
3. polymerase
1. 3' 5' exonuclease proof-reading
AAAAAAAA
TTTTT
C
HO
5'
5'
3'
3'
H2O site^ C AAAAAA
C
TTTTT
C5'
5'
3'
3'
^H2O site
2. 5' 3' exonuclease error-correcting, remove primer
27
DNA polymerase II
• Multisubunit enzyme (>4 subunits)
• 40 nucleotides/ sec/ mol-enzyme
• 3' 5’ exonuclease activity ท�าห์นี�าท�& proofreading
28
DNA repair
DNA polymerase III holoenzyme
• multisubunit enzyme
• 1000 nucleotides / sec / mol-enzyme
• highly possessive เนี)&องจาก β subunit ช�วิยย'ด core enzyme ให์�ติ ดก�บั DNA template ท�าให์� enzyme ไม�ห์ล"ดจาก DNA template ง�ายๆ ท�าให์�ม�การั form phosphodiester bond จ�านีวินีห์ลายแสำนี bond ก�อนีท�& enzyme จะถ่ กปล�อยออกจาก template เม)&อ replicate เสำรั3จ
• Replicative chain elongation (leading & lagging strand)
29
30
DNA polymerase III3' 5’ exonuclease activity ท�าห์นี�าท�& proofreading activity ช�วิยป6องก�นีไม�ให์�เก ดการั mutation รัะห์วิ�างท�&ม� DNA replication
DNA polymerases in eukaryotes (e.g. humans)
1. DNA polymerase α (replication)* – สำ�งเครัาะห์ short primer (RNA or DNA) for Okazaki fragments on a lagging strand
2. DNA polymerase β (repair)*
3. DNA polymerase γ (replication of mitochondrial DNA)* ทั้��ง 3 ชนิ�ดไม่�ม่ 3 ' 5' exonuclease or proofreading activity
4. DNA polymerase δ (replication) อย �ในี nucleus ม� 3 ' 5' exonuclease or proofreading activity – สำ�งเครัาะห์ leading และ lagging stand (คล�าย DNA pol III ในี prokaryote)
5. DNA polymerase (repair, replication – RNA primer removal คล�าย DNA pol I ในี prokaryote)
ห์ล�งจากสำ�งเครัาะห์จะม� modification ของ DNA โดยการัเติ ม methyl groupให์�ก�บัเบัสำ เช�นี C5 ของ cytosine ด�วิย SAM
31
DNA synthesis using RNA template
• เก ดโดยเอนีไซ่ม reverse transcriptase (RNA dependent DNA polymerase)
• พับัในีไวิรั�สำบัางชนี ด เช�นี ไวิรั�สำท�&ท�าให์�เก ดโรัคมะเรั3ง (Rous sarcoma, Avian myeloblastosis, Raucher murine leukemia), ไวิรั�สำท�&ท�าให์�เก ดโรัคเอดสำ (HIV)
32
RNA dependent DNA polymerase
retrovirus RNAreverse transcriptase (RNA depentdent DNA polymerase)
RNADNA
สำลายสำ�วินีท�&เป1นี RNA ออกไป โดย RNaseH
DNADNA
การัสำ�งเครัาะห์ DNA ท�&ใช� RNA เป1นี template
33
34
DNA REPLICATION
สำรั"ป : ป4จจ�ยสำ�าค�ญท�&ใช�ในีการัสำ�งเครัาะห์ DNA ในี prokaryote
• DNA template
• dNTP : dATP, dGTP, dCTP และ dTTP
• RNA primer :- polyribonucleotide สำายสำ�(นีๆ- ใช�เป1นีจ"ดเรั &มติ�นีการัสำ�งเครัาะห์ DNA
• Enzyme และ protein ชนี ดติ�างๆ เช�นี DNA polymerase, DNA ligase, DNA gyrase, primase, SSB, DnaC เป1นีติ�นี
• พัล�งงานี (ในีรั ป ATP) ท�&ใช�ในีการัคลายเกล�ยวิและติ�อสำาย DNA
Telomere shortening and telomerase• Telomere ค)อ DNA สำ�วินีท�&อย �ปลาย chromosome
• โดยท�&วิไป DNA replication จะเก ดในีท ศทาง 5’ 3’ เท�านี�(นี ด�งนี�(นีเม)&อเก ด DNA replication ติ�อไปเรั)&อยๆ จะท�าให์�ปลาย chromosome ด�านี 5’ สำ�(นีลงเรั)&อย ๆ เรั�ยกวิ�า telomere shortening ซ่'&งอาจท�าให์�สำ ญเสำ�ย gene ท�&อย �ใกล� telomere
35
36
การัถ่อดแบับั DNA ของโครัโมโซ่มท�&เป1นีเสำ�นีติรังได�เป1นีสำาย DNA ให์ม� 2 สำาย ค)อ สำาย leading และ สำาย lagging
3' 3' 3' 3'5'5' 5' 5'
Parental Leading
Parental Lagging
New DNA
Area where gap is generated upon replication
37
• Telomerase เป1นี enzyme ท�&ท�าห์นี�าท�&รั �กษา telomere ไม�ให์�ห์ดสำ�(นีลง
• Telomerase ปรัะกอบัด�วิย RNA oligonucleotide ท�&ท�าห์นี�าท�&เป1นี template และเอนีไซ่ม reverse transcriptase ท�&สำามารัถ่สำ�งเครัาะห์ DNA จาก RNA ได�
• ในีบัรั เวิณ telomere ของมนี"ษย จะม� tandem repeat ของ AGGGTT ซ่'&ง telomerase จะเพั &มสำ�วินี tandem repeat เข�าไป เพั)&อท�&จะให์�เป1นี template ให์� primer เข�ามาจ�บั ผลท�&ได�ก3ค)อ DNA ท�&สำ�งเครัาะห์ข'(นีมาจะม�ควิามยาวิเท�าเด มห์รั)อไม�ห์ดสำ�(นีลงเม)&อม� DNA replication
38
Telomerase
Telomere shortening and telomerase
AGGGTT AGGGTT AGGGTT
TCCCAA
Parental strand Short repeats making up telomere
3'
Newly synthesized lagging strand1 Telomerase
binds
AGGGTT AGGGTT
TCCCAA
AGGGTT AGGGTT
UCCCAA
2 Telomerase extends 3' end
RNA template
Telomerase
reverse transcriptase
New telomere repeat
UCCCAA
AGGGTT AGGGTT AGGGTT
TCCCAA
AGGGTT
3 Telomerase released
Extended telomere permits completion of lagging strand
AGGGTT AGGGTT AGGGTT
TCCCAA TCCCAA UCCCAA
4 Primer is bound.DNA polymerase completes lagging strand
Primer
DNA polymeraseAGGGTTAGGGTT
39
Telomerase
• ในีเซ่ลลบัางชนี ดท�&ติ�องม�การัแบั�งติ�วิอย�างติ�อเนี)&อง เช�นี germ cell จะม�เอนีไซ่ม telomerase ป6องก�นีการัเก ด telomere shortening
• สำ�วินี somatic cell ไม�ม� telomerase ด�งนี�(นี เม)&อเซ่ลลผ�านีวิงจรัการัแบั�งติ�วิมาถ่'งจ"ดห์นี'&งท�& telomere สำ�(นีลงมาก เซ่ลลนี�(นีก3จะแก� และติาย
• ควิามผ ดปกติ ในีการัท�างานีของ telomerase สำ�งผลให์�เก ดโรัคได� เช�นี การัท�างานีไปมาก telomerase ท�าให์� cell ไม�ติายซ่'&งพับัได�ในี cancer cell บัางชนี ด
• ป4จจ"บั�นีม�การัพั�ฒนีาสำารัท�&ย�บัย�(งการัท�างานีของ telomerase มาใช�รั�กษามะเรั3งบัางชนี ด
40
Telomere shortening and telomerase
DNA repair
41
Damage to DNA
• Force distortion, bending, breaking
• X-rays, γ -rays , ionized radicals
• activated oxygen
• ultraviolet light - thymine dimer
• intercalation, cross-link by foreign compound (some chemicals, drugs)
• accident of replication
• spontaneous decay of DNA (loss of base)
42
Mutation• base substitution
– transition : Pu1 Pu2, Py1 Py2
– transversion : Pu Py, Py Pu
• frameshift mutation– deletion– Insertion
ATC GTA TTA ATA …
ATC GTA TTA ATA …
ATC GAT TAA TA …
ATC GTT ATT AAT A..
T
43
AGCTA
TCAAT
AGCTA
TC
AT
AGCTA
TCTAT
AGC
TA
TCG
AT
C
(G) (G)
transition
deletion
transversion
insertion
44
Gene mutation
• missense mutation : base substitution ท�าให์� mRNA เปล�&ยนีไป (รัห์�สำของ amino acid เปล�&ยนีแปลงไป ) ท�าให์�โปรัติ�นีผ ดปกติ
• nonsense mutation : ถ่�า codon ซ่'&งเคย code ให์� amino acid เปล�&ยนีไปเป1นี stop codon ท�าให์�ได� polypeptide สำายสำ�(นีลง อาจจะไม�สำามารัถ่ท�าห์นี�าท�&ได� (truncated polypeptide chain)
• silent mutation : mutation ไม�ม�ผลติ�อ function ของ gene ห์รั)อย�งคง code ให์� amino acid ติ�วิเด ม ท�าให์�โปรัติ�นีชนี ดเด ม เช�นี AAA (Lys) AAG (Lys)
45
Trinucleotide repeat expansion (triplet repeats)
• การัเก ดข'(นีซ่�(า ๆ ก�นีของ nucleotide 3 ติ�วิ ท�&พับับั�อยค)อ CGG, CAG และ CTG
• Triplet repeat อาจอย �ใกล�ก�บั gene ห์รั)ออย �ในี gene
• ม�กท�าให์�เก ดโรัคทางรัะบับัปรัะสำาท
• ติ�วิอย�างโรัคท�&เก ดจาก triplet repeat ได�แก� fragile-X symdrome, spinobulbar muscular dystrophy, myotonic dystrophy และ Huntington’s disease
46
47
Fragile-X syndrome
• เก ดจากควิามผ ดปกติ ท�& FMR-1 gene
• คนีปกติ จะม�จ�านีวินี triplet repeat CGG มากสำ"ดปรัะมาณ 50 copies แติ�ในีผ �ป:วิยจะม�จ�านีวินี copies มากกวิ�า 200 copies
• ท�าให์�เก ด mental retardation
• ผ �ป:วิยท�&ม�จ�านีวินี CGG copy repeat มาก จะม�อาการัท�&รั"นีแรังกวิ�าผ �ป:วิยท�&ม�จ�านีวินี copies นี�อย
48
Fragile X syndrome 49
DNA repair
• เซ่ลลท"กเซ่ลลจะม�รัะบับั DNA repair เนี)&องจากขบัวินีการั DNA replication ม�โอกาสำท�&จะเก ด mispaired base ข'(นีมาได�
• โดยท�&วิไป การัซ่�อมแซ่ม DNA จะเรั &มติ�นีด�วิยการัติ�ด DNA ท�&ผ ดปกติ ออกไป จากนี�(นี DNA polymerase จะเติ ม nucleotide ให์ม�เข�าไปโดยใช� DNA ท�&ปกติ ของอ�กสำายห์นี'&งเป1นี template แล�วิป;ดช�องวิ�างท�&เห์ล)อด�วิย DNA ligase
• DNA repair systems : – Mismatch repair– Base-excision repair– Nucleotide-excision repair– Transcription-coupled repair
50
OH P
OH P
Normal DNA
Damaged DNA
DNA with damaged region
removed
Repaired DNA (normal)
Endo and exonuclease
s
Repaired DNA
polymerase
DNA ligase
Common steps in DNA repair mechanisms.
excinuclease
Nick
51
Mismatch repair
• โดยท�&วิไป DNA ท�&เป1นี parental strand จะม� methyl group เกาะท�&เบัสำ แติ� daughter strand จะย�งไม�ม�การัเติ ม methyl group ท�&เบัสำของม�นี
• Daughter strand บัรั เวิณท�&ม� mismatched base จะถ่ กติ�ดออกไปและม�การัเติ มเบัสำท�&ถ่ กติ�องเข�าไปแทนี
• ติ�วิอย�างโรัคท�&เก ดจาก mutation ของ mismatch repair gene ได�แก� hereditary nonpolyposis colorectal cancer
52
CH3 CH3
CH3 CH3
3'
5'
5'
5'
5'
3'
3'
3'
methylated parental strand
unmethylated newly- synthesized strand
DNA segment replaced
Mismatch repair
53
Base-excision repair
• ซ่�อมแซ่มควิามผ ดปกติ ของเบัสำท�&ผ ดไปเพั�ยงห์นี'&งเบัสำ
• DNA glycosylase จะติ�ด N-glycosidic bond ท�&เช)&อมรัะห์วิ�างเบัสำท�&ผ ดปกติ ก�บั deoxyribose ท�าให์�ขาดเบัสำท�&ติ�าแห์นี�งนี�(นี เก ดเป1นีช�องวิ�างเรั�ยกวิ�า AP (apurinic ห์รั)อ apyrimidic) site
• AP endonuclease จะติ�ดสำายท�&ม� sugar-phosphate ออก ห์ล�งจากนี�(นีจะใช�เอนีไซ่มอ)&นีมาซ่�อมแซ่มบัรั เวิณด�งกล�าวิ
54
Nucleotide-excision repair
• การัซ่�อมแซ่มโดยใช�เอนีไซ่ม endonuclease ติ�ด DNA บัรั เวิณท�&ผ ดปกติ เก ดเป1นีช�องวิ�าง แล�วิอาศ�ยเอนีไซ่มอ)&นีซ่�อมแซ่ม
• เอนีไซ่มท�&สำ�าค�ญในีขบัวินีการันี�(ม� 4 ชนี ด ค)อ Uvr ABC exinuclease (excision nuclease : ติ�ดสำ�วินีท�&ม�ควิามผ ดปกติ ออก), Uvr D (helicase : คลายเกล�ยวิ DNA), DNA polymerase I (เติ ม nucleotide โดยใช� DNA อ�กสำายเป1นี template) และ DNA ligase (เช)&อมปลายเข�าด�วิยก�นี )
• ติ�วิอย�างของควิามผ ดปกติ ท�&ใช�การัซ่�อมแซ่มวิ ธ์�นี�( ค)อ pyrimidine dimer
55
Repaired (normal) DNA
Normal DNA
Damage to
basesglycosylase
incision endonuclease
excision endonuclease
DNA polymerase
DNA ligase
AP site
base excision repair
AP site – Apurinic site – Apyrimidinic site
nucleotIde excision repair56
N
N
O
O
H CH3
H
deoxyribose
P
N
N
O
O
H CH3
H
deoxyribose
P
N
N
O
O
H CH3
H
deoxyribose
N
N
O
O
H CH3
H
deoxyribose
P
P
U.V.
การัเก ด thymine dimer
(cyclobutane ring) เม)&อ DNA ถ่ กแสำง UV
57
thymine dimer
58
Repair of thymine dimerRepair of thymine dimer5'
3'
3'
5'excision of a 12 nt fragment by Uvr ABC excinuclease
DNA synthesis by DNA polymerase 1
joined by DNA ligase
59
Transcription-coupled repair
• การัซ่�อมแซ่มควิามผ ดปกติ ของ gene ในีขณะท�&ม�การัสำ�งเครัาะห์ mRNA
• RNA polymerase จะห์ย"ดการัท�างานีเม)&อม�นีมาถ่'งบัรั เวิณท�&ม�ควิามผ ดปกติ ของ DNA template
• จากนี�(นีโปรัติ�นีท�&ท�าห์นี�าท�& excision repair จะซ่�อมแซ่ม DNA บัรั เวิณนี�(
• เม)&อซ่�อมแซ่มเสำรั3จแล�วิ RNA polymerase จะท�างานีติ�อติามปกติ
60
Direct repair
• การัซ่�อมแซ่ม DNA โดยไม�ติ�องติ�ดเบัสำห์รั)อนี วิคล�โอไทดออก
• พับัในี bacteria ไม�พับัในีมนี"ษย
• ติ�วิอย�างได�แก� การัซ่�อมแซ่ม cyclobutane pyrimidine dimer โดยเอนีไซ่ม photolyase (photoreactivating enzyme) และ visible light ติ�ด dimer โดยไม�สำลาย phosphodiester bond
T TAA
^
T TAA
photoreactivating enzyme (photolyase)and visible light
61
DNA repair defect
• ท�าให์�เก ดโรัคทางพั�นีธ์"กรัรัมได�ห์ลายโรัค
• ติ�วิอย�างโรัคท�&เก ดจากควิามผ ดปกติ ของ DNA repair
– Xeroderma pigmentosum
– Chromosomal breakage syndrome• Bloom’s disease• Fanconi anemia• Progeria
62
Xeroderma pigmentosum
• Defect in excision repair (exinuclease)
• Prevalence 1 : 250,000
• ผ �ป:วิยจะไวิติ�อ UV light (UV light hypersensitivity)
• ผ วิห์นี�งของผ �ป:วิยจะแห์�ง (dry skin) อาจพับั skin atrophy, keratosis, ulceration และ skin carcinoma (cancer) ได�
• ท�&ติาอาจเก ด corneal ulcer (แผลท�& cornea)
• การัป6องก�นี : ห์ล�กเล�&ยงการัถ่ กแสำง UV เช�นี สำวิมเสำ)(อผ�าม ดช ด ใช�ครั�มก�นีแดด ใช�แวิ�นีก�นีแดด
63
RECOMBINATION REPAIR (post-replication RECOMBINATION REPAIR (post-replication repair)repair)
Replication
Recombination repair
Fill in and ligation
DNA containing a pyrimidine dimer
Damaged parental strand
Gapped daughter strand
Normal duplex DNA
Damaged parental strand
Gapped parental strandNormal daughter strandRepaired daughter strand
DNA containing a pyrimidine dimerNormal duplex DNA
5'
5'3'3'
64
Recommended
