FRÉDÉRICK THERRIEN
EFFET DE L’INHIBITION CHRONIQUE DE LA SYNTHÈSE DU MONOXYDE D’AZOTE SUR LA
PRESSION ARTÉRIELLE ET L’APPARITION DES DOMMAGES CARDIOVASCULAIRES ET RÉNAUX
CHEZ LE RAT HARLAN SPRAGUE-DAWLEY
Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en médecine expérimentale pour l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC
2005 © Frédérick Therrien, 2005
RÉSUMÉ L’hypertension et le déclin de la fonction rénale observés en insuffisance rénale sont
associés à une diminution de la biodisponibilité du monoxyde d’azote (NO) et à une
augmentation de la formation d’angiotensine II (AngII). L’objectif de notre première étude
est d’évaluer les altérations cardiovasculaires et rénales causées par l’inhibition chronique
de la synthèse du NO chez le rat Harlan Sprague-Dawley (Hsd : SD) ainsi que le rôle de
l’AngII. La synthèse du NO est inhibée par l’administration d’un analogue de la L-
arginine, le L-NAME (100 mg/kg/jour), administré dans l’eau à boire pendant 3 semaines.
Le rôle de l’AngII est évalué à l’aide d’un antagoniste des récepteurs AT1 de l’AngII, le
losartan (20 mg/kg/jour). À la fin de l’étude, les rats L-NAME ont une pression artérielle
systolique (PAS) élevée par rapport aux animaux témoins. Ils présentent une augmentation
de la créatinine sérique et de la protéinurie indiquant une atténuation importante de la
fonction rénale. Les dommages rénaux sont caractérisés par de l’ischémie glomérulaire, de
l’atrophie tubulaire et de la prolifération myointimale. Les animaux L-NAME présentent
une augmentation de l’expression de l’ET-1 et du TGF-β dans les vaisseaux et les reins.
On observe également une augmentation des taux d’anion superoxide (•O2-), une espèce
réactive de l’oxygène (ROS), dans la paroi des vaisseaux. Le traitement avec le losartan
freine l’élévation de la PAS, atténue l’élévation de la créatinine sérique et de la protéinurie.
Le losartan prévient également les dommages glomérulaires, tubulaires et vasculaires
observés dans le rein. En plus, le losartan normalise l’expression vasculaire et rénale de
l’ET-1 et du TGF-β ainsi que le taux des ROS dans l’aorte thoracique.
Afin de déterminer le rôle de l’ET-1, du TGF-β1 et des ROS chez le rat Harlan traité au L-
NAME, nous avons administré un antagoniste des récepteurs ETA de l’ET-1 (LU135252),
un anticorps monoclonal neutralisant le TGF-β (1D11) et un antioxydant (acide lipoïque).
L’effet de ces traitements sur la PAS, la créatinine sérique, la protéinurie et les dommages
cardiovasculaires et rénaux est évalué après 3 semaines. Malgré l’augmentation au niveau
vasculaire et rénale de l’expression de l’ET-1, du TGF-β et des ROS chez les animaux L-
NAME, le blocage individuel de chacun de ces facteurs avec soit le LU135252, l’anticorps
1D11 ou l’acide lipoïque n’a eu aucun effet sur l’élévation de la PAS, de la créatinine
sérique, de la protéinurie et l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux.
Dans une deuxième étude, nous avons évalué l’influence du degré d’inhibition de la
synthèse du NO sur le développement de l’hypertension et l’apparition des dommages
cardiovasculaires et rénaux chez le rat Hsd : SD et l’implication de l’AngII. L’inhibition de
la synthèse du NO est obtenue par le traitement au L-NAME à différentes doses (100, 30 et
5 mg/kg/jour). Le rôle de l’AngII est évalué à l’aide du losartan (20 mg/kg/jour). L’effet
de ces traitements sur le taux urinaire de nitrates/nitrites, la PAS, la créatinine sérique, la
protéinurie et les dommages histologiques vasculaires et rénaux est évalué après 3, 4 et 12
semaines. Les différentes doses de L-NAME diminuent les taux urinaires de
nitrates/nitrites de 95%, 91% et 80% comparativement aux animaux contrôles. Le L-
NAME aux doses de 100mg et 30mg/kg/jour augmente la PAS (p<0.01), la créatinine
sérique et la protéinurie en 3-4 semaines. Ces animaux présentent des lésions ischémiques
rénales associées à des dommages vasculaires sévères dont de la prolifération myointimale.
Par contre, à la dose de 5mg/kg/jour de L-NAME, l’hypertension se développe de façon
modérée et les dommages cardiovasculaires et rénaux apparaissent tardivement à 12
semaines. Le traitement avec le losartan atténue l’augmentation de la PAS, de la créatinine
sérique, de la protéinurie et des dommages cardiovasculaires et rénaux aux différentes
doses de L-NAME.
En conclusion, mes travaux démontrent l’importance du NO dans le maintien de la fonction
endothéliale. En effet, l’inhibition chronique de la synthèse du NO chez le rat Hsd : SD
cause une hypertension sévère et des dommages cardiovasculaires et rénaux majeurs qui
dépendent du degré d’inhibition. Ces effets pathophysiologiques sont causés, en partie, par
l’action accrue de l’AngII qui peut moduler, entre autres, la production d’ET-1, du TGF-β
et des ROS. Le blocage individuel de chacun de ces facteurs ne parvient cependant pas à
freiner l’élévation de la PAS, le déclin de la fonction rénale et l’apparition des dommages
cardiovasculaires et rénaux lors de l’inhibition chronique de la synthèse du NO à forte dose
(100 mg/kg/jour). Finalement, ces résultats démontrent une relation étroite entre l’AngII et
le NO dans la pathogenèse de l’hypertension et des dommages cardiovasculaires et rénaux.
ABSTRACT Impaired nitric oxide (NO) bioavailability and increased angiotensin II sensitivity has been
implicated in the pathogenesis of hypertension associated with chronic renal failure. The
present study was designed to investigate the cardiovascular and renal damages induced by
chronic NO synthesis inhibition in Harlan Sprague-Dawley rats (Hsd : SD) and the role of
AngII. NO synthesis inhibition is induced by treatment with the L-arginine analogue, L-
NAME (100 mg/kg/day), administered in the drinking water for 3 weeks. The role of
AngII is evaluated with the AT1 receptor antagonist losartan (20 mg/kg/day). At the end of
the study, L-NAME treated rats exhibited increased systolic blood pressure (SBP)
compared to control animals. They also showed increased serum creatinine and proteinuria
indicating a decline in the renal function. These changes were associated with the
development of glomerular ischemia, tubular atrophy and neointimal hypertrophy. L-
NAME treated rats also exhibited increased expression of ET-1 and TGF-β1 in the vessels
and the kidney. They also presented increased formation of superoxide anion, a reactive
oxygen species (ROS), in the thoracic aorta. Treatment with losartan attenuated the
increased in SBP, serum creatinine and proteinuria and prevented the glomerular, tubular
and vascular damages observed in the kidney. Losartan also normalized vascular and renal
expression of ET-1 and TGF-β1 and overproduction of ROS in the thoracic aorta.
To determine the specific role of ET-1, TGF-β1 and ROS in L-NAME treated rats, we
administered respectively an ETA receptor antagonist (LU135252), a monoclonal antibody
neutralizing TGF-β (1D11) and an antioxidant (α-lipoic acid). The effect of these
treatments on SBP, serum creatinine, proteinuria and cardiovascular and renal damages was
evaluated after 3 weeks. Despite increased level of vascular and renal expression of ET-1,
TGF-β and ROS in L-NAME treated rats, treatment with LU135252, the monoclonal
antibody 1D11 and the antioxidant α-lipoic acid taken each alone had no effect on the
elevation of SBP, serum creatinine, proteinuria and cardiovascular and renal damages.
In a second study, we evaluated the effect of different degrees of NO synthesis inhibition
on hypertension and cardiovascular and renal damages in Hsd : SD rats and the implication
of AngII. Chronic NO synthesis inhibition is induced by treatment with L-NAME at
different doses (100, 30, 5 mg/kg/day). The role of AngII is evaluated with losartan (20
mg/kg/day). The effect of these treatments on urinary nitrates/nitrites, SBP, serum
creatinine, proteinuria and vascular and renal damages are evaluated after 3, 4 and 12
weeks. The different L-NAME doses decreased urinary nitrates/nitrites by 95%, 91% and
80% as compared to control animals. L-NAME at a dose of 100 and 30 mg/kg/day
increased SBP (p<0.01), serum creatinine and proteinuria within 3-4 weeks. These animals
showed renal ischemic lesions associated with myointimal proliferation and lumen
obstruction. At a dose of 5 mg/kg/day of L-NAME, SBP increased moderately (p<0.01)
and cardiovascular and renal damages appeared later (week 12). Treatment with losartan
attenuated the increased in SBP, serum creatinine, proteinuria and cardiovascular and renal
damages at all doses of L-NAME utilized.
In conclusion, these studies demonstrate the importance of basal NO release in the maintain
of endothelial function. In fact, chronic NO synthesis inhibition in Hsd : SD rats cause
severe hypertension and cardiovascular and renal damages which depend on the degree of
inhibition. These pathological effects are caused, in part, by the action of AngII which can
modulate the production of ET-1, TGF-β and ROS. However, the individual blockade of
these factors do not attenuate the elevation of SBP, serum creatinine, proteinuria and the
apparition of cardiovascular and renal damages caused by chronic NOS inhibition at a high
dose (100 mg/kg/day). Finally, these results demonstrate a close relationship between NO
and AngII in the pathogenesis of hypertension and cardiovascular and renal damages.
AVANT-PROPOS D’entrée de jeu, il me convient de mentionner que ce travail de maîtrise a été réalisé
dans le cadre du programme de Maîtrise en médecine expérimentale de l’Université Laval.
J’ai la conviction, ô combien profonde, que les connaissances acquises au cours de ce
projet, qu’elles soient fondamentales, techniques ou appliquées, renforceront ma formation
scientifique et guideront la voie de mes projets futurs. Par ailleurs, c’est avec grand intérêt
que je débuterai à l’automne mes études de troisième cycle au Centre de recherche en
néphrologie et hypertension de l’Hôtel-Dieu de Québec.
Dans le cadre de cette étude, j’ai exécuté la majorité des protocoles animaux
comprenant les suivi des paramètres biologiques de même que les analyses biochimiques et
moléculaires subséquentes. Martin d’Amours ainsi que Geneviève Robitaille ont fourni des
résultats complémentaires à l’étude. Le Docteur Mohsen Agharazii a apporté son aide pour
relever et analyser l’ensemble des coupes histologiques. Le Docteur Marcel Lebel a
apporté sa contribution dans l’élaboration du projet, alors que le Docteur Richard Larivière
a dirigé l’ensemble de l’étude. Par ailleurs, j’aimerais souligner que j’ai eu l’immense
privilège de présenter une partie de ces travaux à plusieurs occasions dont à la 14e réunion
scientifique annuelle de la European Society of Hypertension à Paris au mois de juin 2004.
REMERCIEMENTS J’aimerais en tout premier lieu exprimer des remerciements spéciaux à mon
directeur de recherche, le Docteur Richard Larivière, un homme de science enthousiaste,
dévoué et perspicace, ayant à cœur la formation et la réussite de ses étudiants. Il a su voir
le potentiel en moi, y a cru et a permis la réalisation de ce projet. J’apprécie profondément
ses encouragements, son soutien, ses enseignements et ses conseils.
Merci au Docteur Marcel Lebel, au Docteur Darren Richard et au Docteur Mohsen
Agharazii qui ont su s’imposer par leur présence, leur appuie et leur dévouement. Merci
pour tout!
Aux membres de l’équipe : Marie-Ève Rodrigue, Philippe Lavoie, Sébastien Savard,
Patrick Taillon, Mélanie Nadeau, Sonia Lacasse, Nadia Chbinou, Claude Villeneuve et
Danielle Lizotte ainsi qu’à mes complices de tous les jours : Élisabeth Pagé, Guylaine
Soucy, Geneviève Robitaille, Marc-André Déry, Maude Michaud-Dumont et Marie-Claude
Lauzier. Merci pour votre accueil, votre collaboration, et surtout, votre amitié! J’ai
beaucoup de plaisir à travailler avec vous.
Je tiens également à remercier mes merveilleux parents, Renald Therrien et Nicole
Paradis, qui m’ont guidé et m’ont aidé depuis le premier jour ainsi qu’à ma sœur Valérie et
à son époux Hugo.
Finalement, j’aimerais remercier ma copine Marie-Josée Fortin pour son appui
constant, sa présence, ses nombreux encouragements et son amour.
À ceux qui m’entourent, vous êtes la lumière qui me montre le chemin
Impossible is nothing [Muhammad Ali]
TABLE DES MATIÈRES
Résumé.....................................................................................................................................i Abstract................................................................................................................................. iii Avant-propos ..........................................................................................................................v Remerciements.......................................................................................................................vi Table des matières .............................................................................................................. viii Liste des tableaux....................................................................................................................x Liste des figures .....................................................................................................................xi Liste des abréviations........................................................................................................... xii Chapitre 1- INTRODUCTION .............................................................................................13
1.1- Hypertension Artérielle..............................................................................................13 1.1.1- Généralités..........................................................................................................13 1.1.2- Prévalence et liens avec les MCV ......................................................................13 1.1.3- Facteurs de risques .............................................................................................14 1.1.4- Conséquences pathophysiologiques de l’HTA...................................................14 1.1.5- Hémodynamie de la pression artérielle ..............................................................15
A- Le débit cardiaque ...............................................................................................15 B- La résistance périphérique ...................................................................................15
1.1.6- Régulation de la pression artérielle ....................................................................16 A- Système nerveux, barorécepteurs et chimiorécepteurs........................................16 B- Facteurs neuro-humoraux ....................................................................................17 C- Système rénine angiotensine................................................................................18 D- Contrôle rénale de la pression artérielle ..............................................................19
1.2- Dysfonction endothéliale ...........................................................................................21 1.2.1- Généralités..........................................................................................................21 1.2.2- Définitions ..........................................................................................................21
1.3- Monoxyde d’azote......................................................................................................23 1.3.1- Généralités..........................................................................................................23 1.3.2- Biosynthèse et mode d’action du NO.................................................................23 1.3.3- Localisation des NOS.........................................................................................24 1.3.4- Mécanismes de régulation de la eNOS...............................................................24 1.3.5- Implications cardiovasculaires et rénales ...........................................................25 1.3.6- Effets sur la pression artérielle et la fonction rénale ..........................................25
1.4- Angiotensine II...........................................................................................................30 1.4.1- Système rénine angiotensine classique et tissulaire .........................................30 1.4.2- Mécanismes d’actions de l’AngII.......................................................................31
1.5- Endothéline ................................................................................................................37 1.5.1- Synthèse de l’ET-1 .............................................................................................37 1.5.2- Mécanismes d’actions de l’ET-1 ........................................................................37 1.5.3- Implications cardiovasculaires et rénales ...........................................................37
1.6- Transforming Growth Factor-β ..................................................................................39 1.6.1- Synthèse du TGF-β.............................................................................................39 1.6.2- Mécanismes d’action du TGF-β .........................................................................39
1.7- Espèces réactives de l’oxygène..................................................................................40 1.7.1- Biosynthèse.........................................................................................................40 1.7.2- Actions et implications cardiovasculaires ..........................................................40
1.8- Interactions entre les facteurs endothéliaux ...............................................................41 1.8.1- NO et AngII........................................................................................................41 1.8.2- NO et ET-1 .........................................................................................................42 1.8.3- NO et TGF-β.......................................................................................................43 1.8.4- NO et ROS..........................................................................................................43
Chapitre 2- Pertinences et objectifs de recherche.................................................................45 2.1- Hypothèse...................................................................................................................45 2.2- Objectifs de recherche................................................................................................46
Chapitre 3- Article scientifique.............................................................................................47 Chapitre 4- Degré d’inhibition de la synthèse du NO ..........................................................76
4.1- Pertinences et objectifs du projet ...............................................................................76 4.2- Hypothèse...................................................................................................................76 4.3- Objectifs de recherche................................................................................................76 4.4- Matériel et méthodes ..................................................................................................77
4.4.1- Protocole animal .................................................................................................77 4.4.2- Mesure des NO2
-/NO3-........................................................................................77
4.4.3- Analyses statistiques...........................................................................................78 4.5- Résultats .....................................................................................................................79
4.5.1- Effets du degré d’inhibition de la synthèse du NO.............................................79 A- Survie des animaux..............................................................................................79 B- Excrétion urinaire des métabolites du NO...........................................................80 C- Pression artérielle systolique ...............................................................................81 D- Créatinine sérique ................................................................................................82 E- Protéinurie............................................................................................................83 F- Histologie rénale ..................................................................................................84
4.5.2- Effets d’un bloqueur des récepteurs AT1............................................................86 A- Excrétion urinaire des métabolites du NO...........................................................86 B- Pression artérielle systolique ...............................................................................87 C- Créatinine sérique ................................................................................................88 D- Protéinurie ...........................................................................................................89
4.5.3- Effet du losartan sur l’histopathologie rénale.....................................................90 DISCUSSION.......................................................................................................................93 CONCLUSION.....................................................................................................................99 BIBLIOGRAPHIE..............................................................................................................100
LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Prévalence de l'hypertension selon l'âge et le sexe............................................13 Tableau 2 : Régulation hormonale de la pression artérielle..................................................18 Tableau 3 : Effets vasculaires directs de l’AngII..................................................................34
LISTE DES FIGURES Figure 1 : Facteurs vasoactifs de l'endothélium : un équilibre .............................................21 Figure 2 : Voie de signalisation du récepteur AT1................................................................32 Figure 3 : Signalisation du récepteur AT1 ............................................................................33 Figure 4 : Réduction de l’O2 en H2O ....................................................................................41 Figure 5 : Survie des animaux ..............................................................................................79 Figure 6 : Excrétion urinaire des métabolites du NO ...........................................................80 Figure 7 : Pression artérielle systolique................................................................................81 Figure 8 : Créatinémie ..........................................................................................................82 Figure 9 : Protéinurie ............................................................................................................83 Figure 10 : Analyse histopathologique du cortex rénal ........................................................84 Figure 11 : Analyse histopathologique de vaisseaux rénaux................................................85 Figure 12 : Effet du losartan sur l’excrétion urinaire des NO2
-/NO3- ...................................86
Figure 13 : Effet du losartan sur la pression artérielle..........................................................87 Figure 14 : Effet du losartan sur la créatinine sérique ..........................................................88 Figure 15 : Effet du losartan sur la protéinurie.....................................................................89 Figure 16 : Effet du losartan sur les dommages vasculaires et rénaux .................................91 Figure 17 : Effet du losartan sur les dommages vasculaires et rénaux .................................92
LISTE DES ABRÉVIATIONS
ADH Hormone anti-diurétique AGT Angiotensinogène AngII Angiotensine II ARA Antagoniste du récepteur AT1 de l’angiotensine BH4 Tétrahydrobioptérine DAG Diacylglycérol DS Dahl sensitive EDRF Endothelial derived relaxing factor eNOS Endothelial nitric oxide synthase (enzyme NO synthase endothéliale) ET-1 Endothéline-1 GFR Glomerular filtration rate HSD : SD Harlan Sprague Dawley HTA Hypertension artérielle systolique IECA Inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine iNOS Inducible nitric oxide synthase IP3 Inositol triphosphate IRC Insuffisance rénale chronique L-NAME NG-nitro-L-arginine méthyl ester MCV Maladies cardiovasculaires nNOS Neuronal nitric oxide synthase NO Monoxyde d’azote NO2
- Nitrites NO3
- Nitrates NOS Nitric oxide synthase O2
- Ion superoxyde ONOO- Peroxynitrite PAS Pression artérielle systolique PGC Pression glomérulaire capillaire PKC Protéine kinase C ROS Reactive oxygen species RVR Renal vascular resistance SOD Superoxyde dismutase SNC Système nerveux central SRA Système rénine-angiotensine TGF Transforming growth factor TNF Tumor necrosis factor
Chapitre 1- INTRODUCTION
1.1- Hypertension Artérielle 1.1.1- Généralités
Selon la Société canadienne d’hypertension (2001), l’hypertension artérielle (HTA) est définie
par une tension artérielle égale ou supérieure à 140/90 mmHg. Le diagnostic d’HTA est basé sur
la mise en évidence à plusieurs reprises d’une valeur anormalement élevée de la pression
artérielle (PA) systolique ou diastolique.
1.1.2- Prévalence et liens avec les MCV L’HTA est un facteur de risque majeur de maladies cardiovasculaires (MCV) qu’il est possible de
prévenir. Au Canada, les MCV représentent la première cause de décès expliquant près de 38%
de ceux-ci. Une étude pancanadienne1 réalisée entre 1986 et 1992 chez des individus de 18-74
ans révélait que 22% de la population générale (26% des hommes et 18% des femmes) étaient
hypertendus. La figure 1 présente les résultats de cette étude en fonction de l’âge et du sexe des
individus. On remarque que 57% de la population de 65-74 ans sont hypertendus.
Tableau 1 : Prévalence de l'hypertension selon l'âge et le sexe
Âge Sexe N Hypertension* %
18-34 Homme 5755 11 Femme 6041 2
35-64 Homme 3621 31 Femme 3741 21
65-74 Homme 2000 56 Femme 1971 58
Tous Homme 11 376 26 Femme 11 753 18
Total 23 129 22
Source : The Canadian Heart Health Surveys1 * L’hypertension correspond à des valeurs ≥140/90
14
1.1.3- Facteurs de risques En plus de l’âge et du sexe, les facteurs de risques coexistants pouvant influencer la survenue de
MCV chez les patients hypertendus sont l’ethnicité, la cholestérolémie, le tabagisme, la
sédentarité, l’obésité, le diabète, l’histoire familiale de maladie cardiovasculaire précoce,
l’atteinte des organes cibles et l’histoire personnelle de maladie cardiovasculaire ou rénale 2.
L’impact de ces facteurs de risque sur la morbidité et la mortalité tend à être multiplicateur plutôt
qu’additif. De plus, notons que l’incidence de MCV est augmentée chez les patients ayant une
pression normale élevée (130-139 mmHg) 3.
1.1.4- Conséquences pathophysiologiques de l’HTA L’HTA est associée à de nombreuses pathologies dont la maladie coronarienne, les accidents
cérébrovasculaires, l’athérosclérose, les arythmies, l’insuffisance cardiaque, les
cardiomyopathies, les maladies valvulaires et vasculaires périphériques et la maladie rénale avec
ultimement l’insuffisance rénale chronique 4. La relation entre la pression artérielle et le risque
de développer une MCV est continue, consistante et indépendante des autres facteurs de risques 2.
Ainsi, plus la pression artérielle est élevée, plus grande est la chance de développer une MCV.
Le principal bénéfice à traiter l’HTA consiste à diminuer les risques de complications
cardiovasculaires qui y sont intimement reliés. De fait, plus la PA se rapproche de la normale
(120/80 mmHg), plus les bénéfices sont importants. À long terme, le contrôle médical de l’HTA
prévient et retarde la survenue de la plupart des complications, améliorant la qualité de vie des
patients et diminuant la morbidité et la mortalité.
Au cours des dernières décennies, des succès considérables ont été réalisés dans la prévention de
l’HTA. Le pourcentage de patients hypertendus traités a augmenté et, pour la même période, le
pourcentage de patients ayant une hypertension qui est contrôlée a augmenté. Ces changements
ont eu pour résultat de diminuer la morbidité et la mortalité attribué à l’HTA. Cependant, ces
améliorations n’ont pas été étendues à l’ensemble de la population et le contrôle de l’HTA
demeure toujours insuffisant 5. En effet, dans la population des hypertendus canadiens, les
statistiques récentes indiquent que le diagnostic n’a pas été porté ou confirmé dans 43% des cas,
que le diagnostic a été confirmé mais le traitement n’a pas été initié dans 22% des cas et que le
traitement a été institué mais les valeurs cibles n’ont pas été atteintes dans 21% des cas. Par
conséquent, seulement 13% des hypertendus sont diagnostiqués, traités et ont atteint les valeurs
15
cibles de la pression artérielle (PA). De plus, la maîtrise de l’HTA des patients diabétiques est
atteinte dans seulement 9% des cas. Il est donc essentiel de poursuivre la recherche afin de
développer de nouvelles approches thérapeutiques et d’obtenir une meilleure maîtrise de cette
maladie 6,7.
1.1.5- Hémodynamie de la pression artérielle Par définition, la pression artérielle est la pression hydrostatique que le sang exerce sur la paroi
d’un vaisseau sanguin. Elle atteint son point le plus élevé dans l’aorte et les grosses artères
systémiques lors de la systole (contraction ventriculaire) et chute à son point le plus bas lors de la
diastole (relaxation ventriculaire). Deux facteurs fondamentaux déterminent la PA selon
l’équation ci-dessous : 1) le débit cardiaque (DC) et 2) la résistance périphérique (RP).
PA = DC × RP
A- Le débit cardiaque Le débit cardiaque est la quantité de sang propulsée par le ventricule gauche en une minute (5,5L
en moyenne). Il équivaut au volume systolique (VS), qui est la quantité de sang expulsée par la
contraction du ventricule gauche à chaque systole (70-80 mL), multiplié par la fréquence
cardiaque (FC), c’est-à-dire le nombre de battements cardiaques par minutes.
DC (mL/min) = VS (mL/battement) × FC (battements/min)
B- La résistance périphérique La résistance périphérique est, quant à elle, la résistance que les vaisseaux sanguins systémiques
opposent à l’écoulement du sang. Les plus petits vaisseaux tels que les artérioles sont ceux qui
offrent le plus de résistance. En changeant de diamètre, ils jouent un rôle important dans la
régulation de la résistance périphérique, de la pression artérielle et du débit sanguin tissulaire 8.
16
1.1.6- Régulation de la pression artérielle En condition physiologique normale, plusieurs mécanismes régissent la pression artérielle en
réglant la fréquence cardiaque, le volume systolique, la résistance périphérique et le volume
sanguin. Certains mécanismes ajustent rapidement la pression artérielle en fonction de
changements soudains, tandis que d’autres, plus lents, assurent la régulation à long terme.
A- Système nerveux, barorécepteurs et chimiorécepteurs Le système nerveux central (SNC) joue un rôle important dans le contrôle de la pression
artérielle. En régulant l’activité du système nerveux autonome et la relâche d’hormones dans le
sang, le SNC modifie rapidement la pression artérielle ainsi que la fréquence cardiaque
maintenant l’homéostasie cardiovasculaire. Le centre réflexe de son contrôle est situé dans le
noyau réticulaire rostral ventro-latéral (RVL) de la medulla oblongata, parfois appelé centre de
contrôle vasomoteur 9.
Réflexes des barorécepteurs : ce sont les barorécepteurs carotidiens et aortiques qui réagissent
aux variations de la pression artérielle pour stimuler ou inhiber la décharge sympathique et/ou
parasympathique du RVL 8. Lorsque la pression artérielle baisse, les barorécepteurs s’étirent
moins et émettent leurs influx nerveux plus lentement vers le RVL. Ce dernier réagit en
diminuant la stimulation parasympathique du cœur et en augmentant la stimulation sympathique.
Cette dernière est associée à la sécrétion d’adrénaline et de noradrénaline dans le sang. Ces
hormones favorisent ainsi l’homéostasie cardiovasculaire en accélérant la fréquence cardiaque, en
augmentant la force de contraction du cœur et en provoquant une vasoconstriction qui augmente
la résistance périphérique. À l’inverse, lorsque les barorécepteurs détectent une augmentation de
la pression dans l’aorte et les artères carotides, le RVL réagit en augmentant la stimulation
parasympathique et en diminuant la stimulation sympathique. S’observe alors une baisse de la
fréquence cardiaque, une diminution de la force de contraction du cœur, une vasodilatation et une
diminution de la résistance périphérique 8.
Chez les patients hypertendus, on observe un phénomène de resetting des barorécepteurs
attribuable à l’adaptation des barorécepteurs à l’élévation persistante de la pression artérielle. À
long terme, ce phénomène limite l’influence du système nerveux sur le maintien de la pression
artérielle 10. Une activation inappropriée du SNC est également observée chez les patients
17
hypertendus. En effet, certaines études ont démontré une élévation des taux de norépinéphrine
plasmatique chez les patients avec HTA essentielle démontrant l’importance du SNC dans le
maintien et la progression de l’HTA 11-13. Par ailleurs, le blocage des récepteurs β-adrénergiques
cardiaque tend à diminuer l’HTA chez ces patients.
Réflexes des chimiorécepteurs : les chimiorécepteurs qui surveillent la composition chimique du
sang peuvent également modifier l’homéostasie cardiovasculaire. Ils sont situés près des
barorécepteurs du sinus carotidien et de l’arc aortique. Ils ont pour fonction de détecter les
variations de la concentration sanguine d’O2, de CO2 et d’ions H+. Ainsi, l’hypoxie (baisse du
taux d’O2), l’acidose (augmentation de la concentration d’ions H+) ou l’hypercapnie (excès de
CO2) stimulent les chimiorécepteurs pour qu’ils transmettent des influx au RVL. Ce dernier
réagit en augmentant la stimulation sympathique du cœur et augmente la pression artérielle par le
fait même 8.
B- Facteurs neuro-humoraux Certains facteurs hormonaux contribuent également à la régulation de la pression artérielle et du
débit sanguin en modifiant le débit cardiaque, la résistance périphérique ou le volume sanguin
total 8. Ces facteurs sont présentés dans le tableau 2.
Adrénaline et noradrénaline : ces deux hormones de la médullosurrénale accroissent le débit
cardiaque en augmentant la fréquence et la force des contractions cardiaques. Elles stimulent
également la vasoconstriction des artérioles de la peau et des viscères abdominaux.
Hormone antidiurétique (ADH) : produite par l’hypothalamus et libérée par la neuro-hypophyse,
l’hormone antidiurétique, nommée également vasopressine, cause la vasoconstriction. À long
terme, elle favorise également la rétention d’eau (antidiurèse), l’augmentation du volume
circulant contribuant ainsi à l’élévation de la PAS.
Peptide natriurétique auriculaire (ANP) : libéré par des cellules dans les oreillettes du cœur, le
peptide natriurétique auriculaire abaisse la pression artérielle en causant une vasodilatation et en
favorisant l’excrétion de sodium et d’eau dans l’urine, ce qui réduit le volume sanguin.
18
Tableau 2 : Régulation hormonale de la pression artérielle
Facteur influant sur la pression artérielle Hormone Effet sur la pression artérielle
Débit cardiaque
Noradrénaline Augmentation Augmentation de la fréquence cardiaque et de la contractilité du coeur Adrénaline
Résistance périphérique
Vasoconstriction Angiotensine II Augmentation
Hormone antidiuéritique
Noradrénaline†
Adrénaline†
Vasodilatation Peptide natriurétique auriculaire Diminution
Adrénaline‡
Monoxyde d'azote
Volume sanguin
Augmentation du volume sanguin Aldostérone Augmentation
Hormone antidiuéritique
Diminution du volume sanguin Peptide natriurétique auriculaire Diminution
† Agit sur les récepteurs α1 dans les artérioles de l'abdomen et de la peau
‡ Agit sur les récepteurs β2 dans les artérioles du muscle cardiaque et des muscles squelettiques ; l'effet vasodilatateur de la noradrénaline est nettement moins élevé.
Source : Principe d’anatomie et de physiologie 8
C- Système rénine angiotensine Le système rénine angiotensine (SRA) est un système autocoïde qui joue un rôle clé dans le
contrôle de la PA. Il comprend un précurseur produit au foie, l’angiotensinogène, qui est clivé
par la rénine, synthétisée par les cellules juxtaglomérulaires rénales, pour conduire à la formation
d’AngI dans le sang. Celle-ci est convertie en AngII dans le poumon par l’action de l’enzyme de
conversion de l’angiotensine (ECA). L’AngII ainsi produite est distribuée aux tissus
périphériques par la circulation pour agir, entre autres, sur les vaisseaux, le cœur et les reins où
elle régule la pression sanguine et maintien l’homéostasie des électrolytes et de l’eau. En effet,
l’AngII cause une vasoconstriction, augmente la sécrétion d’aldostérone et la rétention
hydrosodée au niveau des tubules rénaux et favorise la sécrétion d’ADH. Sur le plan systémique,
le SRA circulant est donc apte à procurer une réponse homéostatique rapide et efficace à un
changement de volume sanguin et de concentration électrolytique détecté dans les reins 14.
19
D- Contrôle rénale de la pression artérielle Le rein est responsable de multiples fonctions de régulation, d’élimination et de synthèse
endogène. Il doit, entre autres, maintenir le volume et la composition ionique du plasma et des
autres fluides corporels en plus de devoir éliminer les déchets métaboliques endogènes et
exogènes. Considérant son rôle majeur dans l’homéostasie hydrosodée et la production de
facteurs vasoactifs comme la rénine, le rein joue un rôle majeur dans la régulation de la pression
artérielle systémique. Par ailleurs, le rein est aussi impliqué dans l’érythropoïèse via la
production d’érythropoïétine, dans l’équilibre acido-basique grâce au métabolisme des
bicarbonates de même que dans le métabolisme phosphocalcique par la synthèse de 1,25 OH-D3,
la vitamine D active 10.
L’unité fonctionnelle du rein est le néphron, lui-même constitué des appareils glomérulaire et
tubulaire. On estime qu’un rein humain en compte entre 0,8 et 1,2 million. Le néphron joue un
rôle crucial dans la filtration glomérulaire, la sécrétion tubulaire et la réabsorption tubulaire.
Physiologiquement, le débit de filtration glomérulaire est de l’ordre de 120 ml/min. Le
glomérule filtre le plasma et produit quotidiennement quelque 180 litres d’ultrafiltrat. Il importe
de savoir que le taux de filtration glomérulaire est directement proportionnel à la pression
intraglomérulaire et au débit sanguin rénal. Ces paramètres sont des déterminants majeurs de
l’hémodynamie rénale et sont modulés par la constriction ou la dilatation des artérioles afférentes
et efférentes du glomérule. L’appareil tubulaire est, quant à lui, formé du tubule proximal, de
l’anse de Henle (descendante et ascendante), du tubule distal et du tubule collecteur. De manière
fort réductrice, sa fonction est de modifier la quantité et le contenu de l’ultrafiltrat glomérulaire
pour conduire à la formation de l’urine. Ainsi, la grande majorité de l’eau sera absorbée avec les
électrolytes, au niveau du tubule proximal, alors que les déchets endogènes et exogènes, qui n’ont
pas été filtrés par le glomérule, y seront sécrétés. L’eau peut également être réabsorbée au niveau
de l’anse de Henle et du tubule distal, mais à un moindre niveau. Finalement, c’est au niveau du
tubule collecteur que l’ADH agit pour favoriser la réabsorption des électrolytes et de l’eau. Ces
actions confèrent à l’appareil tubulaire un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie hydro-
électrolytique et l’élimination des déchets métaboliques.
20
Régulation de la filtration glomérulaire : le rein contribue à la régulation de la pression artérielle
en maintenant un débit sanguin rénal et un volume de filtration glomérulaire (GFR) à un niveau
adéquat. D’un point de vue hémodynamique, 20% du débit cardiaque perfuse les reins. Ceci
représente un débit sanguin d’environ 1000 mL/min 10. En condition physiologique normale,
compte tenu des variations de la pression artérielle systémique, le rein possède de nombreux
mécanismes de régulation de la circulation dans le but de maintenir un débit sanguin et un GFR
adéquat. D’abord, la contraction ou la relaxation des fibres musculaires lisses des artérioles
afférentes et efférentes en réponse à leur distension, permet d’ajuster la pression glomérulaire à
un niveau adéquat. Deuxièmement, l’appareil juxtaglomérulaire, en réponse à une modification
de la composition du liquide tubulaire arrivant à la macula densa, est responsable de la
rétroaction tubulo-glomérulaire. Cette dernière implique la sécrétion de rénine par les cellules
juxtaglomérulaires qui permet une modification du GFR via l’augmentation de la formation
d’AngI et qui conduit ultimement à la formation d’AngII 8.
Régulation neuronale et hormonale de la filtration glomérulaire : Plusieurs facteurs neuro-
humoraux ont également le potentiel d’altérer le débit sanguin rénal et, par le fait même, le GFR.
Ce dernier est réduit par les catécholamines ou encore par la stimulation α-adrénergique des
vaisseaux ainsi que par les vasoconstricteurs rénaux tels que l’AngII, l’ET-1 et la vasopressine
(ADH). À l’inverse, les bradykinines, les prostaglandines et le monoxyde d’azote (NO)
provoquent une vasodilatation 8.
Régulation du volume sanguin : l’appareil tubulaire joue un rôle crucial dans le maintien de
l’homéostasie hydroélectrolytique et l’élimination des déchets métaboliques. En conservant ou
en éliminant l’eau, l’appareil tubulaire ajuste le volume sanguin et, de ce fait, assure la régulation
du volume sanguin. C’est à ce niveau que l’ADH agit pour recruter des canaux à eau et favoriser
la réabsorption d’eau. L’augmentation du volume sanguin qui s’ensuit provoque l’élévation de la
pression artérielle, alors qu’inversement, une diminution du volume sanguin fait baisser la
pression artérielle 8.
21
1.2- Dysfonction endothéliale 1.2.1- Généralités
L’endothélium vasculaire peut-être considéré comme le plus important « organe » endocrine du
corps humain. En effet, les cellules endothéliales vasculaires produisent de nombreux facteurs
vasoactifs qui jouent un rôle crucial dans la régulation du tonus vasculaire. Parmi les agents
vasodilatateurs produit par l’endothélium, on identifie le monoxyde d’azote (NO), les
prostacyclines et le facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium (EDHF). En contrepartie, les
vasoconstricteurs d’origine endothéliale comprennent l’ET-1, l’anion superoxide (•O2-), la
thromboxane A2 (TXA2) et l’AngII 15. Son dysfonctionnement est relié à de nombreuses MCV
dont l’HTA, le diabète, les maladies coronariennes, les maladies vasculaires périphériques,
l’insuffisance cardiaque et l’insuffisance rénale chronique 16.
1.2.2- Définitions En condition physiologique normale, il existe un équilibre entre la production des facteurs
vasoconstricteurs et vasodilatateurs locaux tel qu’illustré à la figure 1 ; la résultante détermine
alors le tonus vasculaire. Le concept de la dysfonction endothéliale réfère à un état où il y a
déficit de la relâche d’une substance vasodilatatrice ou excès de la relâche d’un vasoconstricteur.
La résistance à un vasodilatateur ou l’hypersensitivité à un vasoconstricteur est également mise
en cause.
Figure 1 : Facteurs vasoactifs de l'endothélium : un équilibre
Schéma représentant l’équilibre des facteurs vasoactifs endothéliaux observé en condition normale : (ET-1) endothéline-1, (Ang II) angiotensine II, (•O2
-) anion superoxide, (TXA2) thromboxane A2 ; (NO) monoxyde d’azote, (PGI2) prostacycline, (EDHF) facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium.
AngII, ET-1, TXA2, O2- NO, PGI2, EDHF
Vasoconstricteurs Vasodilatateurs
22
Initialement, la dysfonction endothéliale a été démontrée chez les patients avec une hypertension
essentielle. Chez ces sujets, on observait une diminution de la vasorelaxation endothélium
dépendante suite à une stimulation à l’acétylcholine (Ach) 17. Puisque l’Ach conduit à
l’augmentation de la production vasculaire de NO, il a été suggéré que la biodisponibilité du NO
puissent jouer un rôle crucial dans le maintien de la fonction endothéliale. De fait, la diminution
de la relâche de NO observée en hypertension est associée à l’augmentation de la production
d’inhibiteurs endogènes des NOS comme l’analogue méthylé de la L-arginine (ADMA) 18 et à
l’inactivation rapide du NO par les espèces réactives de l’oxygène (ROS) tel que l’anion
superoxide (•O2-).
L’AngII participe également à la dysfonction endothéliale en augmentant la production de
l’endothéline-1 (ET-1), des espèces réactives de l’oxygène et de cytokines tel que le transforming
growth factor-β (TGF-β). L’implication de ces facteurs dans la dysfonction endothéliale sera
cependant discutée dans une section ultérieure.
Plus récemment, le rôle de l’anion superoxide a été examiné en relation avec la dysfonction
endothéliale. Puisque que le NO peut réagir avec le •O2- pour former du peroxynitrite (ONOO-)
19, cette réaction contribue à la réduction de la biodisponibilité du NO et par le fait même au
développement des MCV. Des évidences récentes ont également démontré que la production
excessive d’•O2- stimule l’oxydation de la tétrahydrobioptérine, un cofacteur de la eNOS,
conduisant au découplage de la eNOS, qui réduit ainsi la production de NO et augmente la
production excessive d’•O2- par cette enzyme 20.
23
1.3- Monoxyde d’azote 1.3.1- Généralités
Depuis la découverte en 1980 par Furchgott et Zawadski 21 de l’endothelial derived relaxing
factor (EDRF), caractérisé ultérieurement par Palmer et al. 22 et Ignarro et al. 23 comme étant le
NO, l’intérêt suscité par cette molécule autocoïde capable de réguler de multiples fonctions
physiologiques n’a cessé de grandir. Parmi les différentes fonctions contrôlées par le NO, son
rôle significatif a été reconnu dans le maintien de la pression artérielle, la neurotransmission,
l’activité des macrophages, la thrombose, l’homéostasie et la fonction rénale 24.
Une fois généré, le NO est un gaz liposoluble capable de diffuser rapidement et librement à
l’intérieur, comme à l’extérieur, des cellules. Sa demi-vie est estimée entre 1 et 5 secondes étant
donné qu’il réagit rapidement avec le fer des noyaux hèmes, les dévirés de l’oxygène et les
groupements thiols. Sa réaction la plus importante est celle avec la guanylate cyclase soluble
(GCs) dont l’activation subséquente conduit à la conversion du guanosine triphosphate (GTP) en
guanosine monophosphate cyclique (GMPc). L’augmentation intracellulaire du GMPc, qui est le
second messager du NO, conduit à de nombreux effets tissus spécifiques incluant la relaxation
des cellules musculaires lisses et l’inhibition de l’agrégation plaquettaire 24.
1.3.2- Biosynthèse et mode d’action du NO Le NO est produit par l’enzyme nitric oxide synthase (NOS) qui possède une forte homologie
avec la famille des enzymes du cytochrome P450. Il existe trois isoformes de la NOS. Ces
isoformes utilisent l’acide aminé L-arginine, l’oxygène et le NAD(P)H comme substrats pour
synthétiser le NO et son coproduit, la L-citrulline. C’est dans l’extrémité C-terminale de
l’enzyme que se présente l’homologie avec la P450 25 et que les cofacteurs essentiels aux
processus catalytiques se lient. Parmi les cofacteurs essentiels, on note la tétrahydrobioptérine
(BH4), la Ca2+/calmoduline, le FAD et le FMN.
Parmi les trois isoformes de la NOS, deux sont retrouvés de façon constitutive, la forme
endothéliale et neuronale (eNOS et nNOS), alors que la troisième est inductible (iNOS). Les
formes constitutives sont Ca2+/calmoduline dépendante, continuellement exprimées et produisent
du NO en faible concentration. Contrairement, la iNOS est Ca2+-indépendante et est régulée de
façon transcriptionnelle. Son expression est stimulée par certains médiateurs inflammatoires dont
24
l’IL-1, le TNF-α, l’INF-γ et certaines endotoxines comme le LPS 26. Une fois induite, la iNOS
demeure active durant 4-24h, produisant près de 100 fois plus de NO que les NOS constitutives.
L’augmentation massive de NO produit suite à la stimulation de la iNOS expliquerait, en partie,
l’hypotension observée lors du choc septique 26.
1.3.3- Localisation des NOS Puisque le NO est un médiateur paracrine de courte durée d’action, le site d’expression des NOS
est étroitement relié à l’endroit où le NO exerce ses effets. La eNOS est présente dans toutes les
cellules vasculaires périphériques où elle joue un rôle crucial dans la régulation du tonus
vasculaire systémique. On la retrouve également dans la paroi des vaisseaux corticaux et
médullaires de tous les segments du rein ainsi que dans les cellules endothéliales glomérulaires
avec prééminence à la macula densa et au tubule collecteur. Sa localisation confirme son rôle
majeur dans le contrôle du débit sanguin rénal et dans l’excrétion rénale du sodium. Initialement
observée dans les tissus nerveux, l’expression de la nNOS a aussi été démontrée dans les cellules
épithéliales tubulaires et dans l’appareil juxtaglomérulaire du rein où elle participe à la régulation
du feedback tubuloglomérulaire. Quant à la iNOS, elle est retrouvée dans pratiquement tous les
segments du rein bien que son rôle précis dans la régulation de la fonction rénale n’ait pas encore
été précisé. On la retrouve cependant dans divers types cellulaires dont les macrophages et les
granulocytes où elle exerce un rôle dans les réactions immunitaires 24,27.
1.3.4- Mécanismes de régulation de la eNOS L’activité de la eNOS et la relâche subséquente de NO des cellules endothéliales vasculaires est
modulée par de nombreux stimuli physiques et humoraux. Parmi les stimuli physiques,
l’augmentation des forces de cisaillements et d’étirements, exercée par le flot sanguin, est le
principal régulateur de la synthèse du NO qui permet de maintenir un tonus vasculaire adéquat.
Plusieurs stimuli humoraux augmentent également la relâche du NO via l’activation de différents
récepteurs membranaires et par l’entrée intracellulaire du Ca2+. Parmi ceux-ci, on note les
catécholamines (α2-adrénorécepteurs) et la vasopressine qui, dans certains lits vasculaires
(circulation coronaire et cérébrale), favorisent la distribution du sang vers ces tissus. La
vasoconstriction excessive de l’AngII et de l’ET-1 est contrecarrée par la relâche respective du
NO via les récepteurs AT2 et ETB. La stimulation de la relâche du NO, par l’histamine et la
substance P, est responsable de la vasodilatation locale causant la rougeur de la peau lors d’une
25
réaction allergique. La sérotonine (récepteur 5-HT1D) et la thrombine, relâchées lors de
l’agrégation plaquettaire, provoqueraient une production locale massive de NO dont la
vasodilatation subséquente facilite l’élimination des microaggrégats, en plus d’inhiber l’adhésion
plaquettaire et d’empêcher la formation du thrombus. Finalement, la bradykinine, via le
récepteur β2, augmente la production du NO qui favorise la vasodilatation 28.
1.3.5- Implications cardiovasculaires et rénales Il est reconnu que le NO joue un rôle crucial dans divers processus physiologiques et
pathophysiologiques. Le développement de ces concepts a largement été établi par des évidences
obtenues suite à l’inhibition de la synthèse du NO. Ainsi, il est maintenant reconnu que le NO
joue un rôle majeur et irremplaçable dans le maintien de l’intégrité fonctionnel et structurale des
vaisseaux, du cœur et des reins.
Les actions cardiovasculaires du NO sont nombreuses. Dans la cellule endothéliale, le NO inhibe
la production d’ET-1, l’oxydation des LDL, l’expression de molécules d’adhésion et par
conséquent, l’adhésion des plaquettes et des leucocytes. Il favorise également la relaxation des
fibres musculaires lisses des vaisseaux, inhibe l’agrégation plaquettaire, empêche la prolifération
des cellules du muscle lisse en plus de moduler la perméabilité vasculaire de même que les
mécanismes inflammatoires 28. Dans le rein, le NO contrôle le débit sanguin rénal en s’opposant,
entre autres, à l’effet vasoconstricteur de l’AngII et de l’ET-1 sur l’artériole afférente 29. De plus,
il régule le volume de filtration glomérulaire, l’excrétion rénale de sodium et la relâche de la
rénine par les cellules juxtaglomérulaires 30.
1.3.6- Effets sur la pression artérielle et la fonction rénale En 1989, Rees et al. 31 ont démontré que l’inhibition aiguë de la synthèse du NO, avec un
analogue de la L-arginine, le L-NG-monométhyl arginine (L-NMMA), augmente de façon
significative la pression artérielle chez le lapin. D’autres investigateurs ont par la suite confirmé
le rôle crucial du NO dans la régulation du tonus vasculaire 32,33. Or, puisque l’hypertension
n’était pas complètement renversée suite à l’infusion de L-arginine ou à l’arrêt du traitement au
L-NAME, il a été suggéré que des altérations de types humorales ou structurales aient
contribuées à l’élévation de la pression artérielle dans ce modèle. De fait, la baisse de la
26
biodisponibilité du NO peut être en partie responsable de l’élévation de la résistance périphérique
et du maintien de l’hypertension artérielle 34.
En ce sens, les souris knock-out pour le gène de la eNOS sont hypertendus et développent de
l’hypertrophie néointimale caractérisée par la prolifération de cellules musculaires lisses. De
plus, elles ont un temps de saignement allongé et montrent plus d’interactions leucocytes-
endothélium que des souris wild-type, confirmant le rôle in vivo de la eNOS pour supprimer ces
interactions 35. Ces multiples fonctions confèrent au NO une influence majeure sur la fonction et
l’intégrité de l’endothélium.
En plus de l’élévation de la pression artérielle, l’inhibition chronique de la synthèse du NO par le
L-NAME (5 mg/kg/jour) conduit à l’apparition de dommages cardiovasculaires et rénaux
majeurs. En effet, Baylis et al. 33 ont démontré que l’inhibition chronique de la synthèse du NO
durant 8 semaines conduit à l’augmentation de la résistance vasculaire rénale en association avec
une élévation de la pression glomérulaire capillaire (PGC) et d’une réduction du GFR. En réponse
à cette modification profonde de leur hémodynamie rénale, les rats L-NAME développent de la
protéinurie ainsi que des dommages rénaux majeurs qui contribueraient au maintien de
l’hypertension artérielle. Dans le même ordre d’idées, Ribeiro et al. 32 ont démontré que
l’inhibition chronique de la synthèse du NO, avec une dose plus élevée de L-NAME
(65 mg/kg/jour vs 5 mg/kg/jour) mène à une élévation supérieure de la PAS et de la PGC. De
plus, ces résultats sont observés après deux semaines de traitement comparativement à 8
semaines pour le groupe de Baylis. L’élévation progressive de la PAS, de la résistance vasculaire
rénale, le déclin du GFR et le développement de la protéinurie se développeraient donc de façon
dose dépendante lors de l’inhibition chronique de la synthèse du NO. Ces effets dépendraient
cependant de la susceptibilité génétique aux dommages cardiovasculaires et rénaux.
En effet, les résultats obtenus par ces deux groupes contrastent avec ceux obtenus auparavant
dans notre laboratoire démontrant que le traitement des rats Sprague-Dawley avec le L-NAME à
la dose de 0.1% (~100mg/kg/jour) cause une HTA sévère sans dommages cardiovasculaires et
rénaux après 6 semaines de traitement 36. En ce sens, Van Dokkum et al. 37 ont reporté que la
sévérité des dommages cardiovasculaires et rénaux associée à l’hypertension induite par le L-
NAME est reliée à des variables génétiques plutôt qu’au degré d’hypertension.
27
Les effets de l’inhibition chronique de la synthèse du NO pourraient également être modulés par
l’activation SRA bien que cette relation soit controversée. En effet, l’activité de la rénine
plasmatique a été reportée comme étant élevée 32, inchangée 38, ou réduite 39 dans ce modèle
d’hypertension. Certaines études in vitro ont par ailleurs démontré que le NO agit à titre
d’inhibiteur de la relâche de la rénine 40 alors que d’autres suggèrent que le NO stimule la
synthèse et/ou la sécrétion de cette dernière 41. En fait, la dépendance à l’AngII lors de
l’inhibition chronique du NO serait associée à des taux normaux ou élevés d’AngII tissulaires 42,
à une sensitivité accrue à l’AngII 43 et/ou à l’interaction entre l’AngII et le SNC 44.
L’évidence que le SNC contribue à l’HTA lors de l’inhibition chronique de la synthèse du NO a
été démontrée par l’élévation des taux plasmatiques de catécholamines et la réduction marquée de
l’HTA suite à l’administration d’un bloqueur α-adrénergique. De façon intéressante, la
combinaison des bloqueurs des récepteurs α-adrénergiques et AT1 de l’AngII réduit de beaucoup
l’élévation de la pression artérielle alors que leur utilisation seule a un effet moindre. Ainsi, le
SRA et le SNC contribueraient tous deux à l’HTA induite par l’inhibition chronique de la
synthèse du NO 45.
L’implication de facteurs vasoactifs autres a également été démontrée dans l’hypertension induite
par le L-NAME. Notre laboratoire a effectivement mis en évidence l’implication de l’ET-1 dans
ce modèle : les taux plasmatiques et tissulaires d’ET-1 étant élevés suite à l’inhibition chronique
de la synthèse du NO 36. Cependant, la relation entre l’ET-1 et l’inhibition chronique de la
synthèse du NO reste toujours controversée. Certains auteurs ont démontré un effet bénéfique du
blocage des récepteurs ETA de l’ET-1 sur le développement de l’hypertension et l’apparition des
dommages cardiovasculaires et rénaux tandis que d’autres auteurs n’ont montré aucun effet
bénéfique du blocage des récepteurs ETA de l’ET-1 30. C’est pourquoi, l’implication
physiopathologique de l’ET-1 dans la pathogenèse de l’hypertension induite par l’inhibition
chronique de la synthèse du NO demeure toujours à élucider. La relation entre le NO, l’ET-1 et
l’AngII sera discutée à la section 1.8.2.
L’hypertension observée dans ce modèle pourrait également refléter un défaut dans le
métabolisme intracellulaire du calcium. En effet, certaines études ont démontré un effet positif
des inhibiteurs des canaux calciques lors de l’inhibition de la synthèse du NO 46. Des résultats
28
similaires obtenus par Ribeiro et al. 47 ont également démontré que la nifédipine prévenait non
seulement le développement de l’hypertension, mais aussi l’apparition des dommages
cardiovasculaires et rénaux chez les rats recevant du L-NAME pendant 4 semaines.
Contrairement, Erley et al. 48 ont démontré une atténuation de l’élévation de la pression artérielle
sans amélioration de la fonction rénale par le traitement à la félodipine chez le rat recevant du L-
NAME pendant 12 semaines.
Le NO en soi contribue également à la prévention de l’hypertension en régulant le débit sanguin
médullaire, la natriurèse et l’excrétion du sodium. En effet, la synthèse de NO est
particulièrement riche dans la médullaire rénale et ces taux de production sont de beaucoup
supérieurs à ceux retrouvés dans le cortex. Or, l’inhibition de la synthèse du NO conduit à des
changements importants du débit sanguin médullaire et modifie considérablement l’excrétion du
sodium et de l’eau. De fait, certaines études ont démontré chez le rat conscient, que le traitement
avec le L-NAME réduit de 30-70% le débit sanguin médullaire, provoquant la rétention de
sodium et d’eau et contribuant ainsi à l’élévation de la PAS. 49,50.
À ce niveau, la synthèse du NO servirait de mécanismes compensatoires importants. En effet, les
rats Dahl sensibles au sel (DS) ne réussissent pas à augmenter leur production de NO lorsqu’ils
reçoivent une diète riche en sel et développent, en conséquence, de l’HTA, des dommages
rénaux, de l’hypertrophie ventriculaire gauche et de l’hypertrophie vasculaire. Contrairement,
une diète riche en sodium, chez les rats Dahl résistants au sel, stimule la production de NO et
empêche le développement de l’HTA, l’apparition des dommages rénaux, l’hypertrophie
ventriculaire gauche et le remodelage vasculaire 51.
Par ailleurs, nous avons mis en évidence que la diminution de la biodisponibilité du NO, chez le
rat urémique avec néphrectomie 5/6, contribue au développement de l’hypertension et à la
progression de l’insuffisance rénale chronique 29. Or, le transfert adénoviral du gène de la eNOS
augmente la synthèse du NO chez l’animal urémique et freine l’aggravation de l’hypertension
artérielle et la progression de l’insuffisance rénale. On note également, suite au transfert
adénoviral du gène de la eNOS, une diminution marquée de la protéinurie et de la créatinine
sérique associée à une nette réduction des dommages rénaux vasculaires, glomérulaires,
interstitiels et tubulaires. Par ailleurs, nous avons également démontré des effets
29
cardioprotecteurs et rénoprotecteurs semblables, dans le même modèle animal, suite à une
supplémentation en L-arginine 29. En somme, ces études démontrent que l’augmentation de la
biodisponibilité du NO permet de corriger la dysfonction endothéliale observée en insuffisance
rénale et permet de préserver l’hémodynamie cardiovasculaire.
30
1.4- Angiotensine II 1.4.1- Système rénine angiotensine classique et tissulaire
Depuis sa découverte et jusqu’à tout récemment, on considérait le SRA à l’image d’un système
uniquement endocrine qui contrôle la pression sanguine et l’homéostasie des électrolytes et de
l’eau. C’est pourquoi on confère au SRA un rôle majeur dans le développement et l’entretien de
l’HTA et des MCV 52.
Plus récemment, il a été décrit que l’AngII pouvait être synthétisée localement dans de nombreux
tissus dont le cerveau, le poumon, l’hypophyse, les artères, le cœur, les surrénales, les reins, les
gonades, l’utérus, le pancréas et la peau 53, arborant une action autocrine, paracrine et
possiblement intracrine 54. Les taux d’AngII tissulaires étant souvent plus élevés que ceux du
plasma, il est permis de croire que le SRA tissulaire serait régulé indépendamment du SRA
circulant.
Cette synthèse locale implique que les composantes nécessaires pour la synthèse de l’AngII
soient présentes dans différents organes. En ce qui concerne l’angiotensinogène (AGT), son
expression a été décelée dans plusieurs tissus et peut donc être produit localement ou provenir du
foie, son lieu de synthèse majeur 55. Le rein est, quant à lui, la source majeure de la synthèse et
de la sécrétion de la rénine bien qu’elle soit exprimée dans plusieurs tissus, mais à des niveaux
plus faibles 56. Par ailleurs, il a été postulé que l’AGT et la rénine circulante puissent traverser
l’endothélium vasculaire par diffusion contribuant ainsi à la génération d’AngII tissulaire 57.
Pour ce qui est de l’ECA, elle est exprimée dans la lumière des vaisseaux avec une forte
concentration aux poumons et certaines cellules épithéliales auraient des concentrations encore
plus grandes, dont la bordure en brosse du tubule proximal du rein 58.
Parmi les organes cibles où agit l’AngII, on note, entre autres, les vaisseaux, le cœur et les reins.
Dans les vaisseaux, toutes les composantes moléculaires et cellulaires nécessaires à la synthèse
d’AngII sont présentes dans les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses 59.
Comme les vaisseaux sanguins, le tissu cardiaque possède toutes les composantes du SRA bien
que la majorité de son AngII soit produite par l’activité de chymases plutôt que par l’ECA. En
effet, au niveau tissulaire, l’AngII peut être synthétisée via d’autres protéases locales tel que la
tonine, la chymase et la cathepsine dépendamment de l’espèce 60. D’ailleurs, la distribution
31
relative de la chymase et de l’ECA laisse croire que la première produit la plus grande partie de
l’AngII cardiaque et la seconde, celle des vaisseaux. Toutes les composantes du SRA sont
également présentes dans les cellules mésangiales ainsi que dans les cellules du tubule proximal,
permettant une formation intrarénale importante 59.
Contrairement au SRA circulant, le SRA tissulaire procure une action plus tonique et localisée 14.
Son implication a été démontrée dans de nombreux processus physiopathologiques dont l’HTA,
l’athérosclérose, l’inflammation, la thrombose, l’hypertrophie ventriculaire et l’insuffisance
rénale 59. D’ailleurs, les effets bénéfiques des IECA et des ARA sont observés dans plusieurs
conditions pathologiques ou l’activité de la rénine plasmatique est normale ou même réduite.
1.4.2- Mécanismes d’actions de l’AngII L’AngII agit sur ses cellules cibles par l’intermédiaire de récepteurs à sept domaines
transmembranaires dont il existe deux types, AT1 et AT2 qui présentent une affinité égale pour
l’AngII. Ces récepteurs diffèrent de par leur distribution, leur signalisation et médient des effets
physiologiques différents.
Mécanisme d’action du récepteur AT1 : Le récepteur AT1 est le sous-type responsable de la
plupart des effets classiques attribués à l’AngII et est sélectivement bloqué par les antagonistes
des récepteurs de l’angiotensine (ARA), dont le losartan. Le récepteur AT1 fait partie de la
grande famille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G (classe
Gq/11). On le retrouve principalement dans les cellules musculaires lisses, les reins, les
surrénales, le cœur, le foie et le cerveau 52. Sa stimulation provoque l’activation de la
phospholipase C (PLC), résultant en une production accrue d’inositol triphosphate (IP3) et de
diacylglycérol (DAG), impliqués dans la mobilisation intracellulaire du Ca2+ et l’activation de la
PKC 61. L’augmentation du Ca2+ intracellulaire produit divers effets physiologiques dont
l’activation d’une kinase responsable de la phosphorylation de la myosine et par conséquent de la
contraction. En plus de la PLC, l’AngII stimule la phospholipase A2 et la production subséquente
de tromboxane A2 (TXA2) ainsi que la phospholipase D qui agit sur la phosphatidylcholine, une
source encore plus abondante de DAG qui active à son tour la PKC 62. Tous ces éléments
conduisent entre autres à la contraction, la prolifération et l’hypertrophie des cellules musculaires
lisses. Les voies de signalisation de l’AngII sont illustrées à la figure 2.
32
Figure 2 : Voie de signalisation du récepteur AT1
Tiré de «Recent advances in angiotensin II signalling in hypertension»63
La liaison de l’AngII au récepteur AT1 affecte aussi la transcription de gènes et l’activation de
protéines passant par la régulation de tyrosines kinases. Le récepteur AT1 possède des propriétés
semblables aux récepteurs de cytokines comme l’IL-2, IFN-γ et INF-α. À la manière de ces
récepteurs, l’AT1 stimule la phosphorylation de tyrosines et active la voie MAP kinase. On
rapporte 5 voies tyrosine kinases majeurs activées par l’AngII dans les cellules musculaires
lisses : (1) c-Src, (2) FAK, (3) des tyrosines kinases calcium dépendantes (Pyk2), (4) Janus
kinases JAK et TYK et (5) des récepteurs tyrosine kinase tels que EGF, PDGF et IGF, tel
qu’illustré à la figure 3. En définitive, l’activation de MAP kinase, de la PKC et l’élévation du
calcium intracellulaire induisent la transcription de gènes inductibles dont c-fos, c-myc et c-jun
qui conduisent à la croissance et à la prolifération cellulaire.
33
Figure 3 : Signalisation du récepteur AT1
Source : Touyz RM, Recent advances in intracellular signaling in hypertension 63
34
Effets physiologiques médiés par le récepteur AT1 : La plupart des actions aiguës médiées par
l’AngII visent à maintenir le tonus vasculaire et le volume sanguin circulant. Ces actions
incluent une vasoconstriction, une sécrétion d’aldostérone, une rétention hydrosodée et une
relâche d’ADH. De surcroît, l’AngII augmente l’activité du système nerveux sympathique et la
contractilité cardiaque en plus de stimuler la soif et la réabsorption intestinale d’eau 62. Au niveau
vasculaire, l’AngII contribue à l’épaississement, à la rigidité et au processus complexe qu’est
l’athérosclérose en plus d’être responsable, en partie, de la dysfonction endothéliale et du stress
oxydatif qui sont responsables du développement de l’HTA 52. L’AngII est également impliquée
dans la pathophysiologie de l’hypertrophie, du remodelage et de l’insuffisance cardiaque.
Tableau 3 : Effets vasculaires directs de l’AngII
Effet vasculaire Mécanisme Vasoconstriction Activation du récepteur AT1 Production d'ET-1, de norépinéphrine et de l'ADH Réduction de la biodisponibilité du NO par la production de radicaux libres Inflammation Activation de la NAD(P)H oxydase et production de superoxydes Induction de facteurs pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6) Activation de monocytes/macrophages Remodelage Stimulation de la migration, de l'hypertrophie et de la prolifération cellulaire Induction de PDGF, TGF-β Thrombose Stimulation de PAI-1 Activation de l'agrégation/adhésion plaquettaire par la diminution du NO
Source : Tissue angiotensin and pathobiology of vascular disease 64
En ce sens, il a été démontré que l’AngII induisait la production du transforming growth facteur
β (TGF-β), de la fibronectine et du collagène de type 1, tous impliqués dans l’expansion de la
matrice extracellulaire et de l’hypertrophie cardiovasculaire. Or, l’administration d’un ARA
freine l’élévation de l’ARNm du TGF-β, du collagène de type I et de la fibronectine, suggérant
que ces effets sont médiés par le récepteur AT1 65. C’est pourquoi, on attribue aux ARA et aux
IECA un effet cardioprotecteur et néphroprotecteur indépendamment de leur action sur la
pression sanguine.
35
De plus, l’AngII est le plus puissant stimulateur de la synthèse et de la relâche d’endothéline-1 66.
À ce niveau, l’ET-1 peut jouer non seulement un rôle dans les effets hémodynamique exercés par
l’AngII, mais contribue également à l’apparition des dommages cardiovasculaires. En effet,
l’ET-1 induit la vasoconstriction, réduit le débit sanguin rénal, participe à l’élévation de la
protéinurie ainsi qu’à l’hypertrophie des cellules musculaires lisses 67. Nous avons d’ailleurs
démontré que l’activation du SRA rénal module l’expression ainsi que la production de l’ET-1
chez l’animal urémique avec masse rénale réduite 68. Or, les effets cardioprotecteurs et
néphroprotecteurs des IECA et des ARA seraient dus, en partie, à la réduction de la formation et
de l’action de l’ET-1 et de l’AngII chez l’animal urémique.
Mécanisme d’action du récepteur AT2 : Le récepteur AT2 appartient à la classe des récepteurs
couplés à une protéine G (Classe Gi). La liaison de l’AngII à ce récepteur active trois cascades
intracellulaires majeures : activation de phosphatases, stimulation du système NO-GMPc par la
synthèse accrue de bradykinine 69 et la relâche d’acide arachidonique 70. De surcroît, l’activation
du récepteur AT2 mène à l’ouverture de canaux K+ et à l’inhibition du courant calcique,
contribuant à l’hyperpolarisation et à la diminution de la pression artérielle, contrant ainsi les
effets de l’AngII médiés par le récepteur AT1 62.
Effets physiologiques médiés par le récepteur AT2 : Il a été récemment établi que le récepteur
AT2 possédait un rôle dans les fonctions cardiovasculaires et rénales, dans le SNC et dans les
processus du développement 70. En effet, le récepteur AT2 est exprimé en grande concentration
lors du développement fétal, mais après la naissance, ses taux déclinent rapidement. Ainsi, chez
l’adulte normal, on ne le retrouve qu’à de faibles niveaux dans le cerveau, les reins, le cœur,
l’endothélium vasculaire, la surrénale et l’utérus 61. L’activation du récepteur AT2 est reconnue
pour antagoniser les effets médiés par le récepteur AT1. Son activation médie la relaxation des
cellules musculaires lisses via la production de bradykinine, de NO et de GMPc. D’ailleurs, il a
été démontré que les souris knock-out pour le gène du récepteur AT2 ont une pression artérielle
élevée 71. De plus, ces souris présentent une hypersensibilité à la natriurèse et à l’effet presseur
de l’AngII suggérant un rôle important du récepteur AT2 dans la contre régulation des effets
pathophysiologiques médiés via le récepteur AT1 72,73. Finalement, en stimulant la
déphosphorylation de protéines, le récepteur AT2 antagonise non seulement les effets
36
vasoconstricteurs du récepteur AT1, mais aussi ces effets prolifératif, hypertrophique et anti-
apoptotique 62.
37
1.5- Endothéline 1.5.1- Synthèse de l’ET-1
Découverte par Yanagisawa en 1988, l’endothéline-1 est un peptide fortement vasoconstricteur
composé de 21 acides aminés produit principalement par les cellules endothéliales 74. Il existe 3
isoformes d’endothéline : ET-1, ET-2 et ET-3. Toutes sont produites à partir d’un précurseur, la
préproendothéline, transformée en big-ET inactif puis en endothéline par l’enzyme de conversion
de l’endothéline 75. L’endothéline sécrétée par l’endothélium est l’ET-1 dont la production est
augmentée par plusieurs stimuli, tels que les forces de cisaillement et l’hypoxie de même que par
nombre de facteurs neuro-humoraux et de cytokines incluant l’AngII, la vasopressine, les
catécholamines et le TGF-β 76. L’ET-1 est sécrétée majoritairement du côté abluminal et exerce
ses effets de façon autocrine et/ou paracrine. Sa production par l’endothélium est contrebalancée
par la libération de NO et de prostacycline.
1.5.2- Mécanismes d’actions de l’ET-1 Il existe deux récepteurs, nommés ETA et ETB, qui médient les effets de l’ET-1. Ce sont des
récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G. Chaque récepteur active
les mêmes protéines G, donnant cependant des réponses différentes suivant le type cellulaire sur
lesquels ils sont exprimés. Leur voie de signalisation cellulaire implique l’activation de la
phospholipase C, la mobilisation du calcium intracellulaire, l’activation de la protéine kinase C,
la stimulation de l’anti-porteur Na+/K+ et l’alcalinisation intracellulaire 76.
1.5.3- Implications cardiovasculaires et rénales Les récepteurs de l’endothéline participent tous deux au maintien du tonus vasculaire, à la
pression artérielle ainsi qu’à l’hémodynamie rénale et au maintien du volume de filtration
glomérulaire. Sur les cellules musculaires lisses et les cellules mésangiales glomérulaires, le
récepteur ETA induit une puissante contraction qui contribue à l’augmentation du tonus
vasculaire, à la réduction du flot rénal et à la diminution du GFR 77. À long terme, l’ET-1 peut
induire la prolifération et l’hypertrophie cellulaire 76 puisqu’elle est un puissant agent pro-
fibrosant qui stimule la synthèse de la matrice extracellulaire via l’expression du TGF-β 78.
L’ET-1 stimule également la production de cytokines comme le tumor necrosis factor (TNF) de
même que l’interleukine-1 et 6 par les monocytes lui conférant une action dans le mécanisme de
38
l’inflammation 79. Le récepteur ETB, quant à lui, se retrouve principalement sur les cellules
endothéliales. Son activation conduit à la production de NO et de prostacycline, prévient
l’apoptose et augmente la clairance de l’ET-1 80. Le récepteur ETB est également retrouvé dans
les tubules distaux rénaux où il participe à la natriurèse et par le fait même à la diminution du
volume extracellulaire et de la pression artérielle 77. Les actions antagonistes des récepteurs ETA
et ETB suggèrent que l’ET-1 joue un rôle important dans le maintien du tonus vasculaire et la
pression artérielle en condition physiologique normale.
L’ET-1 joue également un rôle crucial dans le développement de l’hypertension artérielle et la
progression de l’insuffisance rénale chronique 68,81. L’utilisation d’un bloqueur des récepteurs
ETA freine la progression de l’hypertension et le déclin de la fonction rénale, démontrant
clairement l’implication de l’ET-1 dans ces processus pathologiques 81. Bien que les mécanismes
responsables de l’augmentation vasculaire et rénale d’ET-1 ne soient pas complètement
identifiés, nous avons démontré que l’AngII module l’expression ainsi que la production de l’ET-
1 dans ces tissus. D’ailleurs, le traitement avec un IECA ou un ARA prévient l’augmentation de
l’expression et de la production d’ET-1 chez l’animal urémique 68 On suggère également que le
récepteur ETB est exprimé en plus faible quantité en insuffisance rénale chronique contribuant à
l’élévation de la résistance vasculaire périphérique et à la diminution du flot sanguin rénal.
D’ailleurs, les souris knock-out pour le récepteur ETB ont une pression artérielle élevée 80.
39
1.6- Transforming Growth Factor-β 1.6.1- Synthèse du TGF-β
Trois isoformes du TGF-β ont été identifiés (TGF-β1, TGF-β2 et TGF-β3). Sa forme
prédominante est sans contredit le TGF-β1. Il s’agit d’un homodimère de 25 KDa associé de
manière non covalente à une protéine latente appelée latency-associated protein (LAP). Le LAP
agit comme un inhibiteur du TGF-β puisqu’il occupe les zones de haute affinité du TGF-β pour
ses récepteurs. Le clivage du LAP est l’étape régulatrice déterminante de la biodisponibilité et de
l’activité du TGF-β. Bien que plusieurs protéases puissent conduire à la libération de sa forme
active, la thrombospondine-1, une glycoprotéine de la matrice extracellulaire, est sans contredit
l’activateur majeur du TGF-β 78.
1.6.2- Mécanismes d’action du TGF-β Il existe deux récepteurs par lesquels agissent le TGF-β que l’on nomme TβR-I et TβR-II et qui
sont des récepteurs à activité sérine/thréonine kinase. En résumé, le TGF-β actif se lie au TβR-II
qui recrute et phosphoryle le TβR-I. Le complexe ligand-récepteur phosphoryle alors une série
de protéines appartenant à la famille des SMAD. Généralement, Smad 2 et Smad 3 se lient à la
Smad 4 et stimulent la transcription des gènes cibles dans le noyau alors que Smad 6 et Smad 7
agissent à titre de régulateur négatif 78,82.
Le TGF-β est reconnu pour stimuler la synthèse de la matrice extracellulaire en augmentant la
production du collagène de type I et IV et la fibronectine en plus d’inhiber sa dégradation. Il est
considéré comme étant un joueur majeur dans l’action pro-fibrosante de plusieurs peptides
vasoconstricteurs tels que l’AngII et l’ET-1. Le TGF-β est aussi reconnu comme un important
facteur hypertrophique au niveau des cellules musculaires lisses vasculaires contribuant ainsi à
l’augmentation de la résistance périphérique et à la progression de l’hypertension artérielle 78. De
plus, le TGF-β favorise la transformation des fibroblastes en myofibroblastes et participe à la
transdifférenciation des cellules épithéliales tubulaires en myofibroblastes 83. Ces phénomènes
contribuent à la production et à l’expansion de la matrice extracellulaire et à la fibrose rénale.
40
1.7- Espèces réactives de l’oxygène 1.7.1- Biosynthèse
L’anion superoxide (•O2-) est une espèce chimique instable qui possède un électron non apparié
produit par la réduction d’un électron sur la molécule d’oxygène 25. Il peut être produit dans les
mitochondries, dans le réticulum endoplasmique et dans la membrane de plusieurs types
cellulaires dont les macrophages et les cellules endothéliales. Ses sources principales incluent la
NADPH oxydase, la xanthine oxydase, la cyclooxygénase et la eNOS découplée 84. Dans le tissu
vasculaire, la NADPH oxydase est la source principale d’•O2-. La NADPH oxydase est formée
de plusieurs sous-unités membranaires (p22phox et gp91phox) et cytosoliques (p40phox, p47phox et
p67phox) qui, une fois phosphorylées, transloquent vers la membrane pour se lier aux sous-unités
membranaires. L’AngII est sans contredit l’activateur majeur de la NADPH oxydase vasculaire
et l’expression des ses différentes sous-unités est stimulée par celle-ci 84.
1.7.2- Actions et implications cardiovasculaires Les ions superoxyde (•O2
-) comme les autres radicaux libres de l’oxygène influencent la
signalisation cellulaire, l’expression de gènes et stimulent des changements structuraux tels que la
prolifération, l’hypertrophie et le remodelage de certains tissus 85. Au niveau vasculaire, les ROS
contribuent à la dysfonction endothéliale 34 et au maintien de l’hypertension par plusieurs
mécanismes dont l’inactivation du NO 86 et la déplétion du cofacteur BH4 conduisant au
découplage de la eNOS. De plus, ils conduisent à l’oxydation des lipides, des protéines et de
l’ADN contribuant aux dommages cellulaires 84. En condition physiologique normale, de
nombreux mécanismes existent pour permettre l’élimination des ROS et pour prévenir leurs
effets délétères. L’un de ces mécanismes, représenté à la figure 4, consiste à la réduction
complète des radicaux libres de l’oxygène en eau. La présence de nombreuses enzymes, dont les
SOD, la catalase et les peroxydases, laisse croire que la majeure partie des ions superoxydes sont
éliminés par cette voie métabolique 34.
41
Figure 4 : Réduction de l’O2 en H2O
Cascade de réduction de l’oxygène en eau par la voie du cytochrome. (e-) électron, (SOD) superoxyde dismutase. Tiré de « Endothelial function in hypertension : the role of superoxide anion »34
1.8- Interactions entre les facteurs endothéliaux L’endothélium vasculaire participe à la régulation du tonus vasculaire en contrôlant la relâche de
facteurs vasoactifs et de cytokines comme le NO, l’AngII, l’ET-1, les ROS et le TGF-β. En plus
de leur rôle sur le tonus vasculaire, ces agents peuvent modifier l’agrégation plaquettaire, la
thrombogénicité du sang, l’inflammation vasculaire et, à long terme, la migration et la
prolifération cellulaire contribuant ainsi au développement des maladies cardiovasculaires 15.
1.8.1- NO et AngII Au niveau de l’endothélium vasculaire, des cellules musculaires lisses vasculaires et des cellules
mésangiales, le NO et l’AngII peuvent être soit bénéfiques ou délétères ; les deux influençant le
tonus vasculaire, le volume circulant ainsi que le remodelage. D’ailleurs, la dysfonction
endothéliale se caractérise par le déséquilibre entre la production de NO et d’AngII et constitue
un facteur clé des maladies cardiovasculaires et rénales 87.
De nombreuses études ont confirmé que l’inhibition chronique de la synthèse du NO élève la
pression artérielle et altère la fonction rénale 32,33. En effet, l’inhibition de la synthèse du NO
mène à la contraction des cellules mésangiales, à la diminution du GFR et du débit plasmatique
rénale ainsi qu’à l’augmentation de la fraction de filtration et de l’excrétion urinaire du sodium
qui contribuent à l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux 24. L’administration
concomitante d’un antagoniste des récepteurs AT1 de l’AngII (ARA), le losartan, chez le rat traité
chroniquement au L-NAME, a prévenu à la fois l’hypertension et l’apparition des dommages
42
rénaux associés à ce modèle, suggérant un rôle majeur du système rénine angiotensine (SRA).
De plus, il a été démontré que le traitement avec un ARA renverse non seulement l’HTA établie 39 mais réduit également l’HTA persistante observée suite à l’arrêt du traitement au L-NAME 88.
Ces données suggèrent que le SRA joue un rôle causal et/ou permissif dans l’hypertension induite
par le L-NAME et ce même après l’interruption de son traitement.
D’ailleurs, De Nicola et al. 89 ont démontré que le NO antagonise les effets de l’AngII au niveau
glomérulaire et tubulaire en condition physiologique normale. Ces résultats confirment que
l’équilibre retrouvé entre la production de NO et d’AngII constitue un aspect critique pour le
maintien de la fonction rénale et du tonus vasculaire. D’ailleurs, le blocage du SRA prévient
l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux associés à l’inhibition de la synthèse du
NO 90. Finalement, la potentialisation des effets de la bradykinine expliquerait en partie les effets
vasodilatateur et cardioprotecteurs des inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine
(ECA).
En plus d’inhiber les effets presseurs de l’AngII, l’administration à long terme d’un donneur de
NO contribue à diminuer le nombre de récepteur AT1 de l’AngII dans les cellules musculaires
lisses vasculaires, suggérant que le NO régule l’expression du récepteur AT1 91. Or, Katoh et al. 92 ont démontré que l’inhibition chronique de la synthèse du NO augmente le nombre de
récepteurs AT1 et l’expression de son ARNm dans le cœur de rats traités au L-NAME,
contribuant aux effets hémodynamiques de l’AngII lorsque que la synthèse du NO est inhibée.
1.8.2- NO et ET-1 Différents travaux sont également en faveur d’une interaction entre le NO et l’ET-1 dans des
modèles in vitro et in vivo. Plusieurs auteurs croient que la balance NO/ET-1 est l’élément
crucial dans le maintien de l’homéostasie cardiovasculaire et que son dérèglement serait à la base
de la dysfonction endothéliale 93.
L’ET-1 et le NO sont deux facteurs vasoactifs dérivés de l’endothélium vasculaire qui possèdent
des effets opposés sur l’hémodynamie systémique et rénale 21,74. En condition physiologique
normale, la relâche d’ET-1 conduit à la contraction des cellules musculaires lisses vasculaires et
des cellules mésangiales, contribuant ainsi à l’élévation de la pression artérielle et à la diminution
du GFR – des effets opposées à ceux du NO 74. Il a d’ailleurs été démontré que la production
43
continue de NO, par les cellules endothéliales, inhibe la synthèse et les effets vasoconstricteurs de
l’ET-1 94,95. Confirmant ce rôle, l’hypertension induite par le traitement avec le L-NAME est
bloquée de façon spécifique par un antagoniste des récepteurs de l’endothéline suggérant que les
effets de l’ET-1 sont potentialisés dans ce modèle d’hypertension 96. Le rôle précis de l’ET-1
dans ce modèle reste cependant à élucider puisque certaines études ont démontré que les taux
circulants d’ET-1 demeurent inchangés lors de l’inhibition chronique de la synthèse du NO et que
le traitement avec un antagoniste des récepteurs de l’endothéline n’a aucun effet sur l’élévation
de la pression artérielle 97.
1.8.3- NO et TGF-β Le TGF-β est une cytokine pro-fibrosante jouant un rôle majeur dans le processus de la fibrose
tissulaire. En regard de sa relation avec le NO, il a été démontré que l’expression du TGF-β et la
synthèse de la matrice extracellulaire sont augmentés dans des fibroblastes cardiaques de rats
traités au L-NAME, suggérant que le NO contrecarre les effets du TGF-β 92. Les mécanismes
conduisant à l’augmentation de la production de TGF-β dans le modèle L-NAME semblent
impliquer l’activation locale du système rénine angiotensine puisque le traitement avec un ARA
prévient l’augmentation non seulement du TGF-β, mais aussi du collagène de type I et IV et de la
fibronectine 92. En effet, l’infusion d’AngII in vivo conduit à l’augmentation de l’expression du
TGF-β dans le cœur et les vaisseaux 98,99. De plus, nous avons démontré la production
endothéliale accrue de TGF-β chez le rat urémique et que le traitement avec le losartan prévient
l’augmentation de la production endothéliale vasculaire accrue du TGF-β.
1.8.4- NO et ROS Les interactions entre le NO et les ROS sont importantes dans la pathophysiologie de l’HTA.
L’effet vasoconstricteur des ROS est imputable au fait qu’ils inactivent le NO. De plus, le NO
réagit avec l’•O2- pour former du peroxynitrite (ONOO-) qui induit des dommages oxydatifs à
l’ADN, aux lipides et aux protéines des cellules vasculaires. Entre autres, la formation des ROS
semble être causée par l’AngII qui stimule la production de radicaux libres de l’oxygène via la
stimulation de la NAD(P)H oxydase membranaire 100. Suite à l’infusion d’AngII, on observe une
augmentation de la NAD(P)H oxydase et de ses différentes sous-unités dans des aortes de rats
hypertendus. Le rôle critique de l’•O2- dans l’hypertension causé par l’AngII a été confirmé dans
de nombreuses études démontrant que la SOD membranaire mène à une baisse de la pression
44
artérielle. De plus, les souris knock-out pour le gène de la p47phox, une sous-unité critique de la
NAD(P)H oxydase, montre une diminution de la pression artérielle suite à l’infusion chronique
d’AngII. Ces données démontrent l’importance de l’•O2- dérivé de la NAD(P)H oxydase dans
l’hypertension induite par l’AngII 101. À long terme, la relâche et l’action de l’AngII entraînent
une diminution de la biodisponibilité du NO et de son effet.
45
Chapitre 2- Pertinences et objectifs de recherche L’hypertension artérielle et ses complications cardiovasculaires et rénales associés sont des
facteurs majeurs de morbidité et de mortalité chez les patients hypertendus. Encore aujourd’hui,
les mécanismes responsables du développement de l’HTA ne sont pas clairement définis.
Cependant, le déséquilibre de la relâche des facteurs vasoactifs de l'endothélium constitue un
mécanisme majeur conduisant à l'hypertension. Nos travaux récents suggèrent que la dysfonction
endothéliale observée en IRC est reliée à une diminution de la biodisponibilité du NO et constitue
une cause majeure menant à l’élévation de la pression artérielle et à la diminution de la fonction
rénale. Ces effets peuvent être mimés, en partie, par l’inhibition chronique de la synthèse du NO
qui provoque non seulement une élévation de la pression artérielle mais également l’apparition de
dommages cardiovasculaires et rénaux majeurs. Cependant, de tels effets semblent dépendre de
la susceptibilité génétique des animaux aux dommages cardiovasculaires et rénaux.
2.1- Hypothèse Nous avons émis l’hypothèse que l’inhibition chronique de la synthèse du NO chez le rat Harlan
Sprague Dawley (Hsd : SD) provoque l’élévation de la pression artérielle systolique et
l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux majeurs. Ces effets peuvent être médiés,
en partie, par l’activation de l’AngII qui stimule à son tour la production d’ET-1, du TGF-β et des
ROS.
46
2.2- Objectifs de recherche
Les objectifs de ce travail pour valider l’hypothèse sont comme suit :
♦ Déterminer l’effet de l’inhibition chronique de la synthèse du NO sur la pression
artérielle, les paramètres sanguins et urinaires associés à la fonction rénale et
l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux chez le rat Harlan Sprague-
Dawley (Hsd:SD).
♦ Évaluer l’effet d’un antagoniste des récepteurs AT1 de l’AngII, le losartan, sur la
progression de la PAS, le déclin de la fonction rénale et l’apparition des dommages
cardiovasculaires et rénaux lors de l’inhibition chronique de la synthèse du NO.
♦ Mesurer la concentration et/ou l’expression tissulaire de l’ET-1, du TGF-β et des ROS
chez le rat Hsd : SD traités au L-NAME et le rôle causal de l’AngII sur ces facteurs.
♦ Finalement, vérifier l’effet du blocage de l’ET-1, du TGF-β et des ROS à l’aide d’un
antagoniste des récepteurs ETA de l’ET-1, le LU135252, d’un anticorps monoclonal
neutralisant le TGF-β (1D11) et d’un antioxydant, l’acide lipoïque, sur l’évolution de
la pression artérielle et l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux chez le
rat Hsd : SD traités au L-NAME.
47
Chapitre 3- Article scientifique
Nous présentons ici un article scientifique qui a été soumis récemment pour publication à la revue
Journal of Hypertension et intitulé « Nitric oxide synthesis inhibition in Harlan Sprague-Dawley
rats : A model of malignant hypertension ».
Contribution des auteurs Pour cette étude, j’ai effectué la majorité des protocoles animaux comprenant le suivi des
paramètres biologiques, de même que les analyses biochimiques, moléculaires, et histologiques
subséquentes. J’ai colligé tous les résultats, procédé à leur analyse scientifique et statistique de
même qu’à la rédaction du manuscrit. Martin d’Amours ainsi que Geneviève Robitaille ont
fourni des résultats complémentaires à l’étude. Le Docteur Mohsen Agharazii a apporté son aide
pour relever et analyser l’ensemble des coupes histologiques. Le Docteur Marcel Lebel a apporté
sa contribution dans l’élaboration du projet, alors que le Docteur Richard Larivière a supervisé
l’ensemble des travaux en plus de réviser le manuscrit.
48
OCTOBER 12, 2005
NITRIC OXYDE SYNTHESIS INHIBITION IN HARLAN SPRAGUE-DAWLEY RATS :
A MODEL OF MALIGNANT HYPERTENSION
Frédérick Therrien, Geneviève Robitaille, Martin D’Amours,
Mohsen Agharazii, Marcel Lebel and Richard Larivière
CHUQ Research Centre, Division of Nephrology & Hypertension, L’Hôtel-Dieu de Québec
Hospital and Department of Medicine, Université Laval, Quebec, Canada
Short title: L-NAME induces malignant hypertension
Key words: Hypertension, Nitric oxide, Blood vessels, Renal damage, Angiotensin II,
Endothelin-1, TGF-β1, Reactive oxygen species.
Correspondence and requests for reprints:
Richard Larivière, Ph.D. Tel: (418) 525-4444, ext. 15587 CHUQ Centre de recherche Fax: (418) 691-5562 L’Hôtel-Dieu de Québec Email: [email protected] 9, rue McMahon Québec (Québec) Canada G1R 2J6
49
ABSTRACT
Objective Different genetic susceptibility to hypertension induced by chronic nitric oxide
synthase (NOS) inhibition with L-NAME has been reported in Sprague-Dawley (SD). The
present study was designed to characterized cardiovascular and renal damage associated with
NOS inhibition in Harlan SD rats and the related mechanisms.
Design SD rats were divided into 3 groups and received; 1) no treatment; 2) L-NAME 0.1%; or
3) L-NAME + the angiotensin II (Ang II) AT1 receptor antagonist losartan (20mg/kg/day), for 3
weeks.
Results Systolic blood pressure (SBP) increased rapidly in L-NAME-treated SD rats, up to
207±5 mmHg at week 3, and was associated with increased serum creatinine, proteinuria and
endothelin-1 (ET-1) and transforming growth factor (TGF)-β excretion (p<0.01). Severe
myointimal proliferation and obliteration of small renal arteries and focal necrosis of glomeruli
were observed in L-NAME rats. L-NAME treatment also increased vascular and renal
expression of ET-1 and TGF-β1 and aortic reactive oxygen species (ROS) formation. Losartan
attenuated the rise in SBP in L-NAME rats and prevented the renal damage and the increase in
ET-1, TGF-β1 and ROS. The involvement of the latter factors was assessed using the ETA
receptor antagonist LU135252, the TGF-β neutralizing antibody 1D11 or the antioxidant α-
lipoic acid. Individually, these drugs had no cardiovascular nor renal protective effects in L-
NAME rats.
Conclusions Chronic NOS inhibition in Harlan SD rats causes malignant hypertension with renal
artery and glomerular damage. These adverse effects are mediated, at least in part, by Ang II
and, possibly, downstream mediators such as ET-1, TGF-β1 and ROS production. However,
blockade of the latter, individually, is ineffective suggesting a synergistic role.
50
INTRODUCTION
A major role for NO has been documented in the control of vascular tone and structure, and renal
function. In blood vessels, NO is a potent local vasodilator that counteracts the effects of
vasoconstrictor and growth promoting factors such as catecholamines, angiotensin II (Ang II) and
endothelin-1 (ET-1) 1-3. The role of NO in this vascular function has been confirmed in mice
lacking the endothelial NO synthase (eNOS), which develop hypertension and vascular
hypertrophy 4. On the other hand, the renal vasculature is highly sensitive to NO regulating renal
blood flow and glomerular filtration rate 5,6. NO is a potent vasodilator of afferent and efferent
arterioles where it counteracts the vasoconstrictor effects of Ang II and ET-1 7,8. Moreover, NO
release in the renal medulla increases sodium and water excretion attenuating, thereby, volume
expansion and the blood pressure 9.
Impaired NO release has been reported in a large number of diseases, if not all, with
cardiovascular components such as chronic renal failure 10. In patients with chronic renal failure,
the reduction in NO release has been associated, in part, with the accumulation in plasma of
asymmetric dimethyl-arginine (ADMA), an endogenous inhibit of eNOS 11. In the rat remnant
kidney model of chronic renal failure, improvement of NO release was shown to attenuate the
aggravation of hypertension and the progression of renal failure and damage; an effect that was
associated with a reduction in renal ET-1 production 12. Similarly, NOS inhibition with the L-
arginine analogue Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) in normal animals can induce
hypertension with cardiovascular and renal damage 13,14. However, the latter may depend on the
rat strains, which may have different genetic susceptibility to renal damage 15. For example, we
documented that treatment of intact and uninephrectomized Sprague-Dawley CD rats with L-
NAME at a dose of 0.1 % for 6 weeks induced hypertension, but no cardiovascular and renal
damage 16. In contrast, the hypertensive and renal hemodynamic responses to L-NAME have
51
been reported to be exaggerated in Harlan Sprague-Dawley rats suggesting a different genetic
susceptibility, which may lead to renal damage 17,18.
In the present study, we investigated whether long-term inhibition of NOS induces hypertension
with vascular and renal injuries in Harlan Sprague Dawley rats, and whether these effects are due
to the unopposed actions of Ang II. We also investigated the role of ET-1, TGF-β1 and reactive
oxygen species (ROS), which may be induced by Ang II, and participate, at different degrees, in
the pathogenesis of hypertension and renal insufficiency induced by L-NAME.
MATERIALS AND METHODS
Animal experiments All animals experiments were approved by the Animal Care Committee of
Laval University and were performed on 250g male Harlan Sprague-Dawley (SD) rats (Hsd:SD;
Harlan, Indianapolis, IN, USA). The animals were allowed free access to standard laboratory rat
chow and tap water, and were housed under controlled humidity and temperature conditions with
a 12-hour light-dark cycle. In a preliminary study, SD rats were divided into 2 groups; one group
of controls (n = 10) receiving tap water, and the second (n = 12) was given the NOS inhibitor L-
NAME 0.1 % (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in drinking water. Unexpectedly, L-
NAME treated rats rapidly developed severe hypertension and most animals died or underwent
hind-limb paralysis due to cerebrovascular lesions between weeks 3 to 4. This contrast with our
previous study in Sprague-Dawley CD rats, where all animals were still alive after 6 weeks of
treatment with L-NAME at the same dose 16. Thus, this confirms that Harlan Sprague-Dawley
rats are highly susceptible for cardiovascular and possibly renal damage. Based on these
findings, in the following experiments, the animals were studied at week 3. In the first series of
experiments, SD rats were divided into 3 groups; 1) control rats receiving tap water (n = 16); 2)
52
L-NAME-treated rats (n = 24); and 3) L-NAME rats treated with the AT1 receptor antagonist
losartan 20 mg/kg/day (n = 18; Merck & Co., Rahway, NJ, USA) given in drinking water.
Before the end of the study, 6 L-NAME rats died or underwent hind-limbs paralysis and were
discarded. The doses of losartan was selected according to our previous studies in uremic
hypertensive rats where it normalization of blood pressure and proteinuria 19,20.
In an additional study, SD rats were divided into 5 groups (n = 10 in each group); 1) control rats
receiving tap water; 2) L-NAME-treated rats (0.1 % for 3 weeks); and 3) L-NAME rats treated
with the endothelin ETA receptor antagonist LU135252 (50 mg/kg/day in drinking water; Knoll
AG, Ludwingshafen, Germany); 4) the pan-specific TGF-β neutralizing antibody 1D11 (0.5
mg/kg, 3 times/week, i.p.; Genzyme Corporation, Framingham, Massachusetts, USA); 5) the
antioxidant α-lipoic acid (30 mg/kg/day as food admix; Sigma). The doses of LU135252, 1D11
and α-lipoic acid were selected according to the antihypertensive and cardiovascular and renal
protective effects previous documented in uremic and hypertensive rats 21-23.
Systolic blood pressure was measured before the initiation of treatments and, thereafter, every
week by the tail-cuff method as described elsewhere 16,19-22. At week 3, the rats were placed in
metabolic cages and 24-hour urine samples were collected and stored at -20°C. The animals
were then anesthetized with pentobarbital (50 mg/kg, i.p.; MTC Pharmaceuticals, Cambridge,
ON, Canada) and exsanguinated by an abdominal aortic puncture. The thoracic aorta segment,
from the diaphragm to aortic arch, and the complete mesenteric vascular bed, from the aorta to
the intestinal border, were removed, cleaned of blood and surrounding adipose tissue, frozen
quickly and stored at -80°C. The heart was removed, cleaned of blood and weighed. The
kidneys were harvested, weighed and cut in halves longitudinally. One half was fixed in buffered
formalin solution (formaldehyde 3.7 % in phosphate buffer saline, pH 7.4) for histological
53
analysis, whereas the papilla and the medulla were dissected from the other half and the
remaining renal cortex was frozen quickly for mRNA expression studies.
Biochemical analyses Serum was obtained from 1-ml blood samples, incubated for 1 hour at
room temperature, and centrifuged for 2 min in a microcentrifuge. Serum creatinine and urinary
sodium, protein and creatinine were measured with an auto-analyzer system (Ilab 1800;
Instrumentation Laboratory, Lexington, MA, USA). Plasma renin activity was measured using a
radioimmunoassay kit for Ang I purchased from DuPont NEN. Urinary TGF-β1 concentrations
were assessed by an enzyme-linked immunoasorbant assay (ELISA) with the TGF-β1 Emax
Immunoassay system (Promega, Madison, Wisonsin, USA) after sample acidification.
Histological analysis Tissues were fixed for 48 hours, then dehydrated and embedded in
paraffin. 5 μm-thick sections were mounted on glass slides. After deparaffinization and
rehydration, the sections were stained with Masson trichrome, dehydrated and coverslipped.
Renal section preparation and analysis were performed in a blind manner.
Plasma, urine and tissue ET-1 One thoracic aorta segment was utilized per extraction tube and
assayed individually as previously described 19-21,24. Frozen tissues were weighed, homogenized
twice with a Tissue-Tearor (Biospec Products, Bartlesville, OK, USA) in 2 ml ice-cold extraction
solution containing 1 N HCl, 1 % acetic acid, 1 % trifluoroacetic acid (TFA) and 1 % NaCl, and
centrifuged at 3,000 g for 30 min at 4ºC. The supernatants were extracted on a C18 Sep-Pak
column (Waters, Milford, MA, USA). Similarly, plasma and urine (2 ml) were acidified with
TFA, and extracted on a C18 Sep-Pak column 25. ET-1 in the sample extracts was measured by a
specific radioimmunoassay and the concentrations were corrected for losses in the extraction and
54
purification steps using small amounts of 125I-ET-1 (~1000 cpm; DuPont NEN, Boston, MA,
USA).
Northern blot analysis Total RNA from the thoracic aorta and the mesenteric arterial bed was
isolated using a standard guanidine isothiocyanate-phenol-choroform method 19,22. Total RNA
samples (20 µg) were separated by electrophoresis in 1% agarose gel in denaturing conditions,
transferred onto a Hybond N membrane (Amersham Biotech, Piscataway, NJ, USA) and baked at
80°C for 2 hours. For the ET-1 probe, blots were prehybridized 1 hour at 60°C in 50 %
formamide, 400 mM NaPO4 (pH 7.2), 1 mM EDTA, 5 % SDS, 0.1 % BSA and hybridized
overnight. For the TGF-β1 and 18S probes, membranes were prehybridized 1 hour at 42°C in 50
% formamide, 10 % Denhart's solution, 50 mM NaPO4 (pH 7.0), 1 % SDS, 5X SSC, 100 µg/ml
yeast tRNA and 100 µg/ml denatured sheared salmon sperm DNA, and hybridized overnight.
The membranes were washed 3 times for 30 minutes at 68°C for the ET-1 probe, 62°C for the
TGF-β1 probe and 42°C for the 18S probe in 0.1X SSC and 0.1 % SDS. Blots were then
exposed to Biomax MS films (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA) with an intensifying screen
at -80°C. Experiments were carried on three different blots for each probe.
The rat ET-1 complementary RNA probe, which correspond to a 319 bp fragment of the rat ET-1
cDNA previously prepared by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) from
rat lung, was labeled using α[32P]-UTP (DuPont NEN) and the SP6 RNA polymerase Riboclone
Gemini II system (Promega, Madison, WI, USA). TGF-β1 cDNA probe (kindly provided by Dr
T. Nakamura) 26 was labeled using α[32P]-dCTP and the random oligonucleotide priming Ready-
to-go system (Amersham Biotech). The 18S ribosomal RNA antisense oligonucleotide probe
was labeled with [γ32P]-ATP (DuPont NEN) using the polynucleotide kinase (Amersham
Biotech).
55
Measurement of superoxide anions Some thoracic aorta were immersed in Optimal Cutting
Temperature Embedding Medium (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA, USA), quickly
frozen and stored at –80°C. Then, 30-µm transversal sections were obtained and mounted onto
glass slides. Tissue sections were washed in phosphate-buffered saline (PBS), then
dihydroethidium (2 X 10-6 M) was topically applied for 30 min at 37°C in a light-protected and
humidified chamber. Dihydroethidium freely enters cells where it reacts with superoxide anions,
which releases ethidium molecules that intercalate DNA and fluoresces upon excitation at 488
nm (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). After rinsing in PBS, tissue slices were mounted on
coverslipped. The fluorescence was detected and localized by confocal microscopy (MRC-1024
Confocal System, Bio-Rad, CA, USA) with the Laser Sharp image acquisition software 3.2.
Fluorescent images in the different experimental groups were obtained with a 585-nm long-pass
filter using the same conditions of laser exposure.
Analysis of data The results are expressed as means ± SEM. Mean values were compared by
ANOVA followed by Student-Newman-Keul’s test for multiple comparisons. Differences were
considered significant at a value of p < 0.05.
56
RESULTS
Effect of L-NAME and AT1 receptor blockade in SD rats
Blood pressure Systolic blood pressure increased rapidly after the initiation of L-NAME
treatment in SD rats (Figure 1), up to 207 ± 5 mmHg after only 3 weeks (Table 1). In fact, in a
preliminary study, we found that survival of L-NAME-treated rats dramatically dropped between
week 3 to 4. As depicted in Figure 1, treatment with the AT1 antagonist losartan significantly
attenuated the rise of systolic blood pressure in L-NAME rats suggesting a role for Ang II.
Blood and renal parameters Serum creatinine and plasma ET-1 levels were higher in L-NAME-
treated rats as compared to the controls (p < 0.01; Table 1), whereas plasma renin activity was
similar in the two groups of rats. However, urinary volume, proteinuria and ET-1 and TGF-β1
excretion were greater in L-NAME rats as compared to the controls, whereas creatinine clearance
and sodium excretion were reduced indicating a significant alteration of the renal function (Table
2). Renal insufficiency was significantly attenuated by the AT1 receptor blockade losartan
preventing the rise of serum creatinine, proteinuria, renal ET-1 and TGF-β1 excretion as well as
sodium retention and the decline in creatinine clearance (Table 1 and 2). However, losartan had
no significant effect on plasma ET-1, whereas it increased plasma renin activity as expected.
Cardio-renal hypertrophy At week 3, L-NAME-treated animals had lower body weight than the
controls (p < 0.01; Table 3), which was prevented by losartan. In contrast, the heart weight to
body weight ratio and the kidney weight to body weight ratio were increased in L-NAME rats as
compared to the controls (p < 0.01; Table 3), and these changes were also prevented by losartan.
57
However, since heart and kidney weights were similar in the three groups of rats (Table 3).
Therefore, the apparent cardio-renal hypertrophy may be related to weigh loss in L-NAME rats.
Renal morphology Although no significant structural change was seen in large renal vessels,
there was moderate medial hypertrophy of medium sized arteries in L-NAME rats as compared to
the controls (Figure 2). We also found extensive and severe myointimal proliferation leading to
focal partial or total obliteration of small arteries and preglomerular arterioles. Focal areas of
vascular fibrinoid necrosis was also seen in L-NAME animals. The glomerular capillary lumina
were narrowed or obstructed because of marked mesangial and endothelial cell swelling and
hypertrophy (glomerular capillary endotheliosis) associated with intraglomerular fibrin thrombi
(Figure 2), and focal and segmental necrosis of some glomeruli. Mild areas of striped fibrosis
was seen in the tubulointerstitium. Treatment of L-NAME rats with losartan significantly
attenuated the vascular and glomerular damage (Figure 2).
ET-1 and TGF-β1 expression Compared to the controls, the expression of both ET-1 and TGF-
β1 was significantly higher in the thoracic aorta, the mesenteric arterial bed and the renal cortex
of L-NAME rats (Figure 3). The heightened expression of ET-1 in L-NAME rats was associated
with increased ET-1 concentrations in the thoracic aorta as compared to the controls (0.61 ± 0.04
vs. 0.16 ± 0.02 pg/mg of tissue, p < 0.01). Treatment with losartan prevented vascular and renal
ET-1 and TGF-β1 overexpression in L-NAME rats (Figure 3) and reduced the thoracic aorta ET-
1 concentrations (0.42 ± 0.04, p < 0.05).
58
Superoxide anion prodcution Fluorescence confocal microscopy analysis with dihydroethidium
showed a significant increase in superoxide anion production in endothelial and smooth muscle
cells of thoracic aorta from L-NAME rats as compared to the controls (Figure 4). Superoxide
anion overproduction was prevented by losartan.
ET-1, TGF-β and ROS blockade in L-NAME-treated SD rats
Similarly as in the above experiment, treatment of SD rats with L-NAME significantly increased
systolic blood pressure and serum creatinine as well as urinary volume and proteinuria, and
reduced creatinine clearance (p < 0.01; Table 4), which were associated with marked renal
vascular and glomerular damage (not shown). Treatment of L-NAME rats with either the ETA
receptor antagonist LU135252, the TGF-β neutralizing antibody 1D11 or the antioxidant α-lipoic
acid had no effect on systolic blood pressure, blood and renal parameters (Table 4) and renal
morphological changes.
DISCUSSION
In the present study, we show that chronic NO synthesis inhibition with L-NAME in Harlan
Sprague-Dawley rats leads, within only 3 weeks, to malignant hypertension with renal
insufficiency and damage. The renal damage induced by L-NAME comprises extensive and
severe myointimal proliferation and focal obliteration of small arteries and preglomerular
arterioles as well as glomerular capillary narrowing and focal and segmental necrosis of some
glomeruli.
59
Similar lesions of small arteries, as found in the kidney, may also occur in other target organs
such as the heart and brain leading to heart failure and stroke leading to animal death. Indeed, in
a preliminary study we found that all animals treated with L-NAME died from week 3 to 4.
Among them, several underwent hindlimb paralysis as a consequence of cerebrovascular lesions.
This observation contrasts with our previous study in normal and uninephrectomized Sprague-
Dawley CD rats, purchased from Charles River Laboratories, showing that treated with L-NAME
for 6 weeks at the same dose induced hypertension, but no cardiovascular and renal damage 16.
Together, these observations indicate that Harlan Srague-Dawley rats are highly sensitive to
vascular and renal damage, due possibly to a different genetic susceptibility. In keeping with this
hypothesis, van Dokkum et al. 15 revealed that genetic susceptibility to renal damage in response
to L-NAME is determined by two genes, RF-1 and RF-2. As in the present study, treatment of
Fawn Hooded rats, which are homozygous for RF-1 and RF-2, with L-NAME induces severe
hypertension with renal insufficiency and glomerular damage with premature death. In contrast,
August Copenhagen Irish rats were resistant to renal damage following the same L-NAME
treatment 15. Similarly as in our former study 16, Pollock et al. 27 reported that treatment of
Sprague-Dawley rats with L-NAME induced no renal dysfunction. Thereafter, this group
showed that L-NAME treatment induced more severe hypertension in Harlan Sprague-Dawley
SD rats as compared to Sprague-Dawley CD rats indicating that NO may play a more significant
role in the former strain of rat 17. Consistently, L-NAME-induced hypertension in Harlan
Sprague-Dawley rats was associated with altered renal hemodynamics 17,18, which may lead to
the renal vascular and glomerular damage found in the present study. L-NAME-induced renal
damage has also been documented in Wistar and Wistar Kyoto rats 13,14,28,29.
60
Of note, the vascular and renal injuries present in Harlan Sprague-Dawley rats treated with L-
NAME were largely different to those normally observed in chronic renal failure conditions.
Histological alterations in chronic renal failure include cardiac and large and small arteries media
hypertrophy, focal and segmental glomerular sclerosis, tubular epithelial cell atrophy and renal
interstitial fibrosis 22,30. None of these structural changes were apparent in L-NAME-treated
Harlan Sprague-Dawley rats. Instead, small blood vessels predominantly presented myointimal
proliferation and focal obliteration of small arteries and preglomerular arterioles with evidence of
thrombosis. These vascular alterations resemble those seen in malignant hypertension rather than
in chronic renal failure. Similarly, the absence of glomerular sclerosis and tubular epithelial cell
atrophy with mild areas of tubulo-interstitial fibrosis contrast with the marked changes normally
seen in chronic renal failure 22. Taken together, these findings suggest that the vascular and renal
structural changes are related to different mechanisms. In L-NAME rats, the vascular and
glomerular damage appears to be related to the rapid rise in systemic and, possibly, renal blood
pressure leading within only 3 weeks to malignant hypertension, which has a significant impact
on blood vessel structure.
In the present study, we also report that AT1 receptor blockade with losartan significantly
attenuated the aggravation of hypertension, the decline in renal function and all renal vascular,
glomerular and tubular injuries. This is in agreement with studies documenting a role for Ang II
in the pathogenesis of hypertension induced by chronic NOS inhibition in different rat strains
suggesting that Ang II is a common contributing factor 27,31,32. Since plasma renin activity is
normal in L-NAME SD rats, the direct effects of Ang II on vascular tone and renal
hemodynamics as well as the vascular and renal structural changes are likely unopposed during
NOS inhibition 33,34. The effects of Ang II could be mediated, in part, by ET-1, TGF-β1 and
61
superoxide anion. In fact, the enhanced vascular and renal expression of ET-1 and TGF-β1 and
aortic formation of superoxide anion were prevented by AT1 receptor blockade in L-NAME rats.
However, treatment of L-NAME animals with an ETA receptor antagonist, a TGF-β neutralizing
antibody or an antioxidant was ineffective in even attenuating hypertension and renal failure and
damage. This indicates either a minor role for these factors or that blockade of these factors
individually is not sufficient. In fact, blockade of the AT1 receptor attenuated the pathological
effects of Ang II, as well as those related to the increased production of ET-1, TGF-β1 and ROS,
suggesting the possibility of synergistic effects of these factors. The lack of cardiovascular and
renal protective effects of ETA receptor antagonist, the TGF-β neutralizing antibody and the
antioxidant contrast, however, with recent studies showing beneficial effects of similar treatments
in other rat strains treated with L-NAME 31,35-38. This discrepancy may be related to a number of
experimental factors such as the genetic background of the rat strains, the dose of L-NAME and
the duration of the treatment, which remain to be investigated.
In conclusion, long-term NOS inhibition in Harlan Sprague-Dawley rats causes a rapid rise in
blood pressure leading to severe hypertension associated with renal vascular and glomerular
damage. These pathological effects are due, at least in part, to unopposed actions of Ang II,
which modulate the local production of ET-1, TGF-β1 and ROS. However, blockade of the latter
factors, individually, is ineffective suggesting a synergistic role.
62
ACKNOWLEDGMENTS
The authors thank Danielle Lizotte and Claude Villeneuve for their technical assistance. This
study was supported by a grant from The Kidney Foundation of Canada and the Canadian
Institutes of Health Research (MOP-57683) to RL. RL holds a research scholarship from the
Fonds de la Recherche en Santé du Québec.
63
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67
Table 1 Systolic blood pressure and blood parameters in control rats, L-NAME-treated rats and L-NAME-treated rats receiving losartan
Group
Systolic blood pressure (mmHg)
Serum creatinine (μmol/l)
Plasma ET-1 (pg/ml)
Plasma renin ctivity(ng Ang I/ml/hr)
Control 124 ± 4 49 ± 1 2.5 ± 0.1 27 ± 4 L-NAME 207 ± 5* 90 ± 9* 7.9 ± 0.9* 28 ± 8 L-NAME + losartan
177 ± 6*† 54 ± 1† 6.9 ± 0.5* 79 ± 9*†
Values are means ± SEM from 14 to 16 animals per group. ET-1, endothelin-1; Ang I, angiotensin I. *, p < 0.01 vs. control; †, p < 0.01 vs. L-NAME.
68
Table 2 Urine parameters in control rats, L-NAME-treated rats and L-NAME-treated rats receiving losartan
Group
Urinary volume (ml/day)
Urinary protein
(mg/day)
Creatinine clearance (ml/min)
Urinary sodium
(mmol/day)
Urinary ET-1
(pg/day)
Urinary TGF-� (pg/day)
Control 13.1 ± 0.7 32 ± 3 1.65 ± 0.05 2.6 ± 0.1 30 ± 2 3.8 ± 0.3 L-NAME 26.5 ± 2.4* 184 ± 16* 0.96 ± 0.11* 1.4 ± 0.2* 65 ± 8* 5.0 ± 0.3* L-NAME + losartan
14.3 ± 1.3† 59 ± 8† 1.45 ± 0.08† 2.4 ± 0.2† 28 ± 2† 4.2 ± 0.2‡
Values are means ± SEM from 14 to 16 animals per group. *, p < 0.01 vs. control; ‡, p < 0.05 and †, p < 0.01 vs. L-NAME.
69
Table 3 Body weight, heart and kidney weight to body weight ratio in control rats, L-NAME-treated rats and L-NAME-treated rats receiving losartan
Body Heart weight Heart weight/ Kidney weight Kidney weight/ Group weight
(g) (g) body weight
(10-3) (g) body weight
(10-3)
Control 372 ± 6 1.21 ± 0.02 3.25 ± 0.05 1.26 ± 0.03 3.35 ± 0.06 L-NAME 306 ± 12* 1.29 ± 0.04 4.14 ± 0.08* 1.18 ± 0.03 3.69 ± 0.06* L-NAME + losartan
378 ± 5† 1.29 ± 0.02 3.40 ± 0.07† 1.24 ± 0.06 3.31 ± 0.06†
Values are means ± SEM obtained from 14 to 16 animals per group. *, p < 01 vs. control; †, p < 0.01 vs. L-NAME.
70
Table 4 Systolic blood pressure and blood and renal parameters in control rats, L-NAME-treated rats and L-NAME-treated rats receiving the ETA receptor antagonist LU135252, the TGF-β neutralizing antibody 1D11 or the antioxidant lipoic acid
Group
Systolic blood pressure (mmHg)
Serum creatinine (μmol/l)
Urinary volume (ml/day)
Proteinuria (mg/24h)
Creatinine clearance (ml/min)
Control 125 ± 2 39 ± 2 10 ± 1 37 ± 4 2.13 ± 0.11 L-NAME 204 ± 5* 67 ± 5* 30 ± 3* 87 ± 11* 1.11 ± 0.12* L-NAME + LU135252
199 ± 5* 76 ± 6* 25 ± 3* 174 ± 22* 1.13 ± 0.12*
L-NAME + 1D11
199 ± 2* 70 ± 5* 30 ± 3* 115 ± 16* 0.92 ± 0.10*
L-NAME + Lipoic acid
203 ± 10* 73 ± 8* 33 ± 2* 107 ± 10* 0.93 ± 0.22*
Values are means ± SEM from 8 to 10 animals per group. *, p < 0.01 vs. control.
FIGURE LEGENDS Figure 1 : Time course of systolic blood pressure in control Harlan Sprague Dawley rats,
L-NAME-treated SD rats and in L-NAME rats treated with the AT1 receptor antagonist
losartan. *, p < 0.01 vs. control; +, p < 0.05 and ++, p < 0.01 vs. L-NAME rats.
Figure 2 : Representative photographs of renal sections stained with Masson-Trichrome
from control Harlan Sprague Dawley rats, L-NAME-treated SD rats and L-NAME rats
treated with the AT1 receptor antagonist losartan, at the week 3. Arrows in photographs on
the left column shows a small renal artery of similar size in kidneys from the different
groups of rats. Photographs on the middle and the right columns depict a glomerulus and a
tubular area, respectively. Magnification: left and middle photographs, 40X; right
photographs, 20X.
Figure 3 : Representative Northern blots show expression of ET-1 and TGF-β1 in the
thoracic aorta, the mesenteric arterial bed (MAB) and the renal cortex of control Harlan
Sprague Dawley rats (C), L-NAME-treated SD rats (N) and L-NAME rats treated with the
AT1 receptor antagonist losartan (N+L), at week 3.
Figure 4 : Representative confocal microscopy photographs show superoxide anion levels
measured with the fluorescent dye dihydroethidium in the thoracic aorta from control
Harlan Sprague Dawley rats, L-NAME-treated SD rats and L-NAME rats treated with the
AT1 receptor antagonist losartan, at week 3. Magnification: 40X.
72
Figure 1 : Time course of systolic blood pressure
* P <0.01 vs control; + p<0.05 and ++ p<0.01 vs L-NAME rats.
0 1 2 3100
125
150
175
200
ControlL-NAME
L-NAME + Losartan
+
*
*
*++
+
*
*
*
Time (weeks)
Sys
tolic
bloo
dpr
essu
re (m
mH
g)
0 1 2 3100
125
150
175
200
ControlL-NAME
L-NAME + Losartan
+
*
*
*++
+
*
*
*
Time (weeks)
Sys
tolic
bloo
dpr
essu
re (m
mH
g)
73
Figure 2 : Histological Analysis
A), B), C) Control; D), E), F) L-NAME; G), H), I) L-NAME+losartan.
A B C
D E F
G H I
A B C
D E F
G H I
74
Figure 3 : ET-1 and TGF-β expression
TGF-β1
Aorta MAB Renal Cortex
ET-1
18S
NC N+L NC N+L NC N+L
TGF-β1
Aorta MAB Renal Cortex
ET-1
18S
NC N+L NC N+L NC N+L
75
Figure 4 : Dihydroethidium Fluorescence
Control L-NAME L-NAME + LosartanControl L-NAME L-NAME + Losartan
76
Chapitre 4- Degré d’inhibition de la synthèse du NO
4.1- Pertinences et objectifs du projet L’étude précédente a démontré que l’inhibition chronique de la synthèse du NO avec le L-
NAME à la dose de 0.1% (~100 mg/kg/jour) provoque une augmentation très rapide de la
pression artérielle et qu’après seulement 3-4 semaines, les animaux décèdent, possiblement
dû à des complications cardiovasculaires majeures. En effet, à la semaine 3, des dommages
vasculaires et rénaux importants ont été observés. Toutefois, les dommages rénaux sont
différents de ceux observés en insuffisance rénale et sont associés à l’hypertension sévère et
des dommages aigus causés principalement dans les petits vaisseaux. Ces résultats
suggèrent une inhibition de la synthèse du NO trop importante.
4.2- Hypothèse Nous avons donc émis l’hypothèse que l’inhibition chronique de la synthèse du NO en
utilisant de plus faibles doses de L-NAME chez le rat Hsd : SD provoque une élévation
plus modérée de la pression artérielle et l’apparition des dommages cardiovasculaires et
rénaux semblables à ceux observés dans le cas d’insuffisance rénale chronique.
4.3- Objectifs de recherche
Le degré d’inhibition de la synthèse du NO sera évaluée avec différentes doses de
L-NAME (100, 30 et 5 mg/kg/jour) et ces effets seront évalués en fonction de :
♦ La pression artérielle systolique et la fonction rénale.
♦ Les dommages histologiques vasculaires et rénaux dans des coupes de cortex
rénal.
♦ Finalement, les effets protecteurs du blocage du récepteur AT1 avec le losartan
seront évalués.
77
4.4- Matériel et méthodes 4.4.1- Protocole animal
Les études ont été réalisées sur des rats mâles Sprague-Dawley Hsd : SD de 250g.
L’inhibition chronique de la synthèse du NO est induite par le traitement avec le L-NAME
aux doses de (100, 30 et 5 mg/kg/jour dans l’eau à boire pendant 3, 4 et 12 semaines. Pour
chaque dose de L-NAME, un groupe de rats reçoit en combinaison du L-NAME et du
losartan (20 mg/kg/jour). Un groupe d’animaux ne recevant aucun traitement est utilisé
comme groupe témoin.
La PAS est mesurée hebdomadairement de façon non invasive au niveau de la queue du rat
conscient et la moyenne de trois mesures différentes est enregistrée. À la fin du traitement,
une collecte des urines sur 24h est effectuée pour mesurer la créatininurie et la protéinurie.
Par la suite, les animaux sont anesthésiés au phénobarbital et exsanguinés par ponction de
l’aorte abdominale. Le sang recueilli est conservé pour déterminer la créatinine sérique.
Le rein est prélevé, nettoyé et pesé puis disséqué longitudinalement. Une section est
conservée dans une solution de formaldéhyde 4% puis fixée dans la paraffine pour
coloration et analyses histo-pathologiques. Des coupes de tissus de 5 μm sont montées sur
lames de verre puis colorées à l’aide d’une coloration Masson Trichrome qui permet de
mettre en évidence la fibrose rénale. Le rein restant est congelé sur glace sèche.
4.4.2- Mesure des NO2-/NO3
- Les métabolites du NO (NO2
-/NO3-) sont mesurés dans l’urine selon une méthode
colorimétrique. Les échantillons sont dilués dans un volume égal de tampon phosphate (pH
7.4) et déprotéinés par ultrafiltration dans des tubes Centrisart avec un potentiel filtrant de
20 000 Dalton (Sartorius, Goettingen, Allemagne) centrifugés à 3000rpm pendant 45
minutes à 4°C. 25μL d’ultrafiltrat pour un animal témoin et 50μL d’ultrafiltrat pour un
animal L-NAME sont ensuite dilués et complétés à 250μL à l’aide du tampon phosphate.
Les échantillons sont ensuite incubés dans la noirceur en présence de 0.4U/mL de nitrate
réductase, 150μg/mL de NADPH et 3μg/mL de FAD (Roche Diagnostics) pendant 30
minutes à 37°C afin de réduire les nitrates en nitrites. 150μL de cette solution est ensuite
78
incubé 5 minutes en présence d’un volume égal du réactif de Greiss préparé en combinant
une solution de sulfanilamide 1% dans HCl 10N et de N-(1-naphthyl)éthylènediamide 0.1%
dans H3PO4 5% selon une proportion 1:1. L’absorbance est mesurée à 550 nm et la
concentration de nitrites est déterminée à l’aide d’une courbe standard linéaire de 1.25 à
80μM.
4.4.3- Analyses statistiques À la fin des études, les données sont analysées à l’aide du logiciel GraphPad InStat
(graphPad Software, Mobile, CA, USA) et les résultats sont exprimés selon moyenne ±
SEM. Les moyennes sont traitées et comparées par analyse de variance ANOVA suivie du
test de comparaison multiple de Student-Newman-Keul. Le seuil α de signification
statistique est posé à 0,05.
79
4.5- Résultats 4.5.1- Effets du degré d’inhibition de la synthèse du NO
A- Survie des animaux La figure 5 représente le pourcentage de survie des animaux en fonction du temps pour les
différents doses de L-NAME utilisée. Ainsi, on observe 33% de décès à la fin de la 3e
semaine de traitement à la dose de 100 mg/kg/jour de L-NAME. La survie des animaux
L-NAME à la dose de 30 mg/kg/jour peut se prolonger jusqu’à 4 semaines de traitement où
l’on observe 38% de décès. À la dose de 5 mg/kg/jour de L-NAME, la survie des animaux
est de 100% après 4 semaines de traitement et peut se prolonger jusqu’à 12 semaines où
l’on observe 33% de décès (non montré).
Figure 5 : Survie des animaux
0 1 2 3 4 50
60
70
80
90
100
Control5 mg30 mg
Temps (Semaine)
100 mg
Pourcentage de survie (%)
80
B- Excrétion urinaire des métabolites du NO On constate une diminution marquée de 95% de l’excrétion urinaire des métabolites du NO
chez les animaux L-NAME 100 mg/kg/jour lorsque comparé aux animaux témoins. On
observe une réduction similaire (90%) de l’excrétion urinaire des nitrates/nitrites chez les
animaux L-NAME 30 mg/kg/jour. Cette diminution est beaucoup moindre (15%) à la dose
de 5 mg/kg/jour de L-NAME. La figure 6 présente l’excrétion urinaire des nitrates/nitrites
pour les différents groupes étudiés après 3-4 semaines de traitement.
Figure 6 : Excrétion urinaire des métabolites du NO
Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,01 et vs témoins ; † p<0,01 vs L-NAME 5 mg/kg/jour
Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0
25
50
75
100
125
††*
*
L-NAME
Nitr
ates
/Nitr
ites
(%)
Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0
25
50
75
100
125
††*
*
L-NAME
Nitr
ates
/Nitr
ites
(%)
81
C- Pression artérielle systolique On remarque une élévation marquée de la pression artérielle chez les animaux L-NAME
100 mg/kg/jour lorsque comparée aux animaux témoins (205±5 mmHg versus 125±2
mmHg ; p<0.001). Cette élévation de la PAS est similaire et atteint 212±3 mmHg
(p<0,001) chez les animaux L-NAME 30 mg/kg/jour. Finalement, on remarque une
élévation significative mais modérée de la PAS (165±3 mmHg ; p<0,001) chez les animaux
L-NAME 5 mg/kg/jour comparativement aux animaux témoins. La figure 7 montre
l’évolution de la PAS après 3-4 semaines de traitement pour les différents groupes étudiés.
Figure 7 : Pression artérielle systolique
Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0
50
100
150
200
250
300
†* †*
*
L-NAME
Pres
sion
arté
rielle
sys
toliq
ue (m
mH
g)
Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0
50
100
150
200
250
300
†* †*
*
L-NAME
Pres
sion
arté
rielle
sys
toliq
ue (m
mH
g)
Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,01 et vs témoins ; † p<0,01 vs L-NAME 5 mg/kg/jour
82
D- Créatinine sérique On constate une élévation marquée de la créatinine sérique chez les animaux L-NAME 100
mg/kg/jour lorsque comparé aux animaux témoins (66±4 μmol/l versus 39±2 μmol/l,
p<0.01). La créatinine sérique s’élève de façon similaire et atteint 71±4 μmol/l (p<0,001)
chez les animaux L-NAME 30 mg/kg/jour. Cependant, aucun changement significatif des
taux de créatinine sérique n’est détecté (40±1 μmol/l) chez les animaux L-NAME 5
mg/kg/jour pour cette période de traitement. La figure 8 illustre l’élévation de la créatinine
sérique après 3-4 semaines de traitement pour les différents groupes étudiés.
Figure 8 : Créatinémie
Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,01 vs témoins et L-NAME 5 mg/kg/jour
Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0
25
50
75
100
**
L-NAME
Cré
atin
ine
sériq
ue (u
mol
/l)
Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0
25
50
75
100
**
L-NAME
Cré
atin
ine
sériq
ue (u
mol
/l)
83
E- Protéinurie On constate une élévation significative de la protéinurie chez les animaux 100 mg/kg/jour
(87±11 mg/24h versus 21±2 mg/24h, p<0.01) comparativement aux animaux témoins. La
protéinurie s’élève de façon similaire et atteint 101±18 mg/24h (p<0,001) chez les animaux
L-NAME 30 mg/kg/jour. Cependant, aucun changement significatif de la protéinurie n’est
détecté (25±4 mg/24h) chez les animaux L-NAME 5 mg/kg/jour pour cette période de
traitement. La figure 9 illustre l’élévation de la protéinurie après 3-4 semaines de
traitement pour les différents groupes étudiés.
Figure 9 : Protéinurie
Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,01 vs témoins et L-NAME 5 mg/kg/jour
Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0
25
50
75
100
125
150
*
*
L-NAME
Prot
éinu
rie (m
g/24
h)
Témoins 100 mg 30 mg 5 mg0
25
50
75
100
125
150
*
*
L-NAME
Prot
éinu
rie (m
g/24
h)
84
F- Histologie rénale Les images suivantes présentent l’analyse morphologique des coupes de cortex rénal
colorées au Trichrome de Masson. On remarque que les doses de 100 mg/kg/jour et 30
mg/kg/jour provoquent l’apparition de lésions tubulo-interstitielles et glomérulaires
importantes caractérisées par de l’atrophie tubulaire et de l’ischémie glomérulaire après 3-4
semaines de traitement. De plus, on note une déformation de la membrane basale et une
hypertrophie néointimale chez les animaux L-NAME (Figure 11). Les reins des animaux
L-NAME 5 mg/kg/jour ne montrent cependant pas de dommages vasculaires et rénaux
significatifs après 4 semaines de traitement.
Figure 10 : Analyse histopathologique du cortex rénal
(A) Témoins ; (B) L-NAME 5 mg/kg/jour ; (C) L-NAME 30 mg/kg/jour ; (D) L-NAME 100 mg/kg/jour. Grossissement 40X.
A
D C
B
85
Figure 11 : Analyse histopathologique de vaisseaux rénaux
(E) Témoins ; (F) L-NAME 5 mg/kg/jour ; (G) L-NAME 30 mg/kg/jour ; (H) L-NAME 100 mg/kg/jour. Grossissement 40X.
E
H G
F
86
4.5.2- Effets d’un bloqueur des récepteurs AT1 A- Excrétion urinaire des métabolites du NO
Le traitement avec le losartan prévient, en partie, la diminution excessive de l’excrétion
urinaire des métabolites du NO aux doses de 100 et 30 mg/kg/jour de L-NAME.
Cependant, à la dose de 5 mg/kg/jour de L-NAME, l’excrétion urinaire des métabolites du
NO demeure inchangée suite au traitement avec le losartan. Or, lorsque le traitement est
prolongé jusqu’à la 12e semaine, les taux de nitrates/nitrites diminuent de 80% si l’on
compare aux animaux témoins. Le losartan atténue la diminution exagérée de l’excrétion
urinaire des métabolites du NO à la fin de la période de traitement à la dose de 5
mg/kg/jour.
Figure 12 : Effet du losartan sur l’excrétion urinaire des NO2-/NO3
-
Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,001 vs témoins et ‡ p<0,05 vs L-NAME (4) 4 semaines de traitement (12) 12 semaines de traitement
L-NAME
L-NAME + losartan
100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)0
25
50
75
100
125
150
**
*
‡
L-NAME
Nitr
ates
/Nitr
ites
(%)
TémoinsL-NAME
L-NAME + losartan
100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)0
25
50
75
100
125
150
**
*
‡
L-NAME
Nitr
ates
/Nitr
ites
(%)
Témoins
87
B- Pression artérielle systolique Le traitement avec le losartan atténue de façon significative l’élévation de la PAS aux doses
de 100, 30 et 5 mg/kg/jour de L-NAME (175±3 mmHg, 168±3 mmHg et 144±2 mmHg,
p<0.001) après 3-4 semaines de traitement. On remarque également l’élévation modérée et
progressive de la PAS de la 4e semaine de traitement (165±3 mmHg) à la 12e semaine
(184±9 mmHg) chez les animaux L-NAME 5 mg/kg/jour. Le losartan atténue de façon
significative l’élévation de la PAS (148±6 mmHg) à la fin de la 12e semaine de traitement à
cette dose. Finalement, on constate que le losartan atténue de façon plus prononcée
l’élévation de la PAS lorsque la dose de L-NAME utilisée est faible.
Figure 13 : Effet du losartan sur la pression artérielle
Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,001 vs témoins et † p<0,001 vs L-NAME (4) 4 semaines de traitement (12) 12 semaines de traitement
100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)50
100
150
200
250
* *
*
*†
†
††
L-NAME
Pres
sion
Arté
rielle
(mm
Hg)
L-NAME
L-NAME + losartan
Témoins
100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)50
100
150
200
250
* *
*
*†
†
††
L-NAME
Pres
sion
Arté
rielle
(mm
Hg)
L-NAME
L-NAME + losartan
Témoins
88
C- Créatinine sérique Le traitement avec le losartan prévient l’élévation marquée de la créatinine sérique aux
doses de 100 et 30 mg/kg/jour de L-NAME (50±3 μmol/l et 57±2 μmol/l, p<0.05) après 3-4
semaines de traitement. Or, aucun changement dans les taux de créatinine sérique n’est
observé pour cette période de traitement à la dose de 5 mg/kg/jour de L-NAME.
Cependant, lorsque le traitement est prolongé jusqu’à la 12e semaine, la créatinine sérique
s’élève progressivement pour atteindre 55 μmol/l. Le losartan atténue l’élévation de la
créatinine sérique après 12 semaines de traitement, bien que de façon non significative.
Figure 14 : Effet du losartan sur la créatinine sérique
Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,05 vs témoins et † p<0,05 vs L-NAME (4) 4 semaines de traitement (12) 12 semaines de traitement
100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)0
25
50
75
100
††
**
L-NAME
Cré
atin
ine
sériq
ue (u
mol
/l)
L-NAME
L-NAME + losartan
Témoins
100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)0
25
50
75
100
††
**
L-NAME
Cré
atin
ine
sériq
ue (u
mol
/l)
L-NAME
L-NAME + losartan
Témoins
89
D- Protéinurie Le traitement avec le losartan prévient l’élévation de la protéinurie aux doses de 100 et 30
mg/kg/jour de L-NAME (46±6 mg/24h et 28±3 mg/24h, p<0.05) après 3-4 semaines de
traitement. Or, aucun changement dans la protéinurie n’est observé pour cette période de
traitement à la dose de 5 mg/kg/jour de L-NAME. Cependant, lorsque le traitement est
prolongé jusqu’à la 12e semaine, la protéinurie s’élève progressivement pour atteindre
78±23 mg/24h. Le losartan atténue l’élévation de la protéinurie après 12 semaines de
traitement lorsque comparé aux animaux témoins (27±5 mg/24h versus 26±4 mg/24h,
p<0.05).
Figure 15 : Effet du losartan sur la protéinurie
Valeurs exprimées : moyenne ± SEM * p<0,05 vs témoins et † p<0,05 vs L-NAME (4) 4 semaines de traitement (12) 12 semaines de traitement
100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)0
25
50
75
100
125
150
*
*
*
†
† †
L-NAME
Prot
éinu
rie (m
g/24
h)
L-NAME
L-NAME + losartan
Témoins
100 mg 30 mg 5 mg (4) 5 mg (12)0
25
50
75
100
125
150
*
*
*
†
† †
L-NAME
Prot
éinu
rie (m
g/24
h)
L-NAME
L-NAME + losartan
Témoins
90
4.5.3- Effet du losartan sur l’histopathologie rénale Pour évaluer l’implication de l’AngII dans les altérations cardiovasculaires et rénales
induites par l’inhibition de la synthèse du NO, nous avons préparé des coupes histologiques
de cortex rénal colorées à la coloration au Trichrome de Masson. Les reins des animaux L-
NAME 100 et 30 mg/kg/jour présentent des dommages vasculaires et rénaux majeurs
similaires après 3-4 semaines de traitements (figure 16). Ceux-ci se caractérisent par de
l’atrophie tubulaire et de l’ischémie glomérulaire. De plus, on remarque de l’hypertrophie
néointimale. Pour la même période de traitement, les animaux L-NAME 5 mg/kg/jour
montrent des dommages vasculaires et rénaux mineurs. Or, lorsque le traitement est
prolongé jusqu’à 12 semaines, les dommages vasculaires et rénaux progressent et
ressemblent à ceux induits par les doses plus fortes de L-NAME (figure 17). Le traitement
avec le losartan prévient l’apparition des dommages vasculaires et rénaux aux différentes
doses de L-NAME.
91
Figure 16 : Effet du losartan sur les dommages vasculaires et rénaux
Figure 16 : Spécimens provenant de rats L-NAME 100 mg/kg/jour
Images histopathologiques de cortex rénaux avec coloration au Trichrome de Masson. Les dommages rénaux comprennent de l’atrophie tubulaire, de l’ischémie glomérulaire (gauche) et de l’hypertrophie néointimale (droite). Grossissement 40X. (A et B) Témoins ; (C et D) L-NAME 100 mg/kg/jour ; (E et F) L-NAME+losartan.
A
DC
B
FE
92
Figure 17 : Effet du losartan sur les dommages vasculaires et rénaux
Figure 17 : Spécimens provenant de rats L-NAME 5 mg/kg/jour après 12 semaines
Images histopathologiques de cortex rénaux avec coloration au Trichrome de Masson. Les dommages rénaux comprennent de l’atrophie tubulaire et de l’ischémie glomérulaire (haut) et de l’hypertrophie néointimale (bas). (A et C) L-NAME 5 mg/kg/jour ; (B et D) L-NAME+losartan. Grossissement de 40X.
A B
C D
93
DISCUSSION Ces travaux démontrent que l’inhibition chronique de la synthèse du NO chez le rat Harlan
Sprague Dawley (Hsd : SD) provoque l’augmentation de la PAS, confirmant le rôle majeur
du NO dans l’homéostasie de la pression artérielle. Nous avons également démontré que
l’inhibition chronique de la synthèse du NO est associée à une augmentation significative
de la créatinine sérique et de la protéinurie indiquant une insuffisance rénale. Or, le déclin
de la fonction rénale est associé à des dommages histologiques majeurs des petits
vaisseaux, des glomérules et des tubules. Ceux-ci se caractérisent par de l’inflammation
vasculaire et de l’hypertrophie néointimale et de l’ischémie glomérulaire et tubulaire. Par
ailleurs, l’hypertension et les lésions vasculaires et rénales se développent d’autant plus
rapidement que l’inhibition de la synthèse du NO est prononcée.
L’apparition des dommages vasculaires et rénaux chez le rat Harlan Sprague Dawley
contraste avec nos résultats précédents démontrant que le traitement des rats Charles River
Sprague Dawley avec le L-NAME cause une HTA sans dommages vasculaires et rénaux 36.
Il existerait donc une susceptibilité génétique au développement des dommages vasculaires
et rénaux associés à l’HTA induite par le L-NAME. En ce sens, Van Dokkum et al.37 ont
démontré que les rats Fawn Hooded (FHH), porteur des gènes Rf-1 et Rf-2 (pour renal
failure), développent des altérations rénales, structurelles et fonctionnelles, majeures si l’on
compare aux rats August&Copenhagen Irish (ACI). Par ailleurs, les rats F1, issus du
croisement des ces deux souches de rat, et qui sont hétérozygotes pour les gènes Rf-1 et Rf-
2, sont plus vulnérables aux dommages vasculaires et rénaux induits par le L-NAME que
les rats ACI, mais moins que les rats FHH. En accord avec nos résultats, Pollock et al.102
ont démontré que la réponse hypertensive induite par le L-NAME diffère chez les rats
Sprague Dawley obtenus de deux différents fournisseurs, soit en l’occurence Charles
Rivers et Harlan. En plus de présenter une pression artérielle basale supérieure, les rats
Harlan ont des taux de nitrates/nitrites urinaires inférieurs à ceux retrouvés chez les rats
Charles River, suggérant un défaut ou une altération dans la production du NO. Ainsi, il est
94
possible que la dysfonction endothéliale associée au traitement avec le L-NAME soit plus
importante chez le rat Harlan que chez le rat Charles River.
En condition physiologique normale, le NO joue un rôle crucial dans le maintien de la
pression artérielle. Il favorise la relaxation des fibres musculaires lisses 28 et maintient un
tonus vasculaire adéquat en s’opposant à l’effet vasoconstricteur de l’AngII et de l’ET-1 29.
Le NO empêche également la prolifération des cellules du muscle lisse 28. Confirmant le
rôle du NO dans l’homéostasie de la pression artérielle, les souris knock-out pour le gène de
la eNOS ont une pression artérielle élevée. Elles présentent également une hypertrophie
néointimale caractérisée par la prolifération et la migration de cellules musculaires lisses
vasculaires 35. Chez le rat Harlan Sprague Dawley, le traitement avec le L-NAME
augmente la pression artérielle en plus de causer une hypertrophie néointimale importante
et l’occlusion subséquente de certains petits vaisseaux. L’ischémie tissulaire qui s’ensuit
provoque la paralysie des membres inférieurs et le décès rapide des animaux, dû
probablement à des accidents vasculaires cérébraux. Au niveau rénal, l’inhibition de la
synthèse du NO et l’ischémie rénale réduisent le débit sanguin, le volume de filtration
glomérulaire et l’excrétion du sodium, contribuant ainsi à l’élévation de la pression
artérielle et au déclin de la fonction rénale 30.
Les effets pathophysiologiques de l’inhibition chronique de la synthèse du NO semblent
être associés à une sensibilité accrue à l’AngII 43. En effet, l’AngII provoque une puissante
vasoconstriction périphérique vasculaire et contribue à l’épaississement et à la rigidité
artérielle. L’AngII est également responsable, en partie, de la dysfonction endothéliale
causant l’hypertension 52. Or, le traitement avec le losartan atténue l’élévation de la PAS et
prévient l’apparition des dommages vasculaires et rénaux chez le rat Hsd : SD traités au L-
NAME. Dans le rein, l’AngII altère la fonction rénale en provoquant l’augmentation de la
résistance vasculaire rénale, l’élévation de la pression glomérulaire capillaire (PGC) et la
réduction du GFR. Ces effets observés lors de l’inhibition chronique de la synthèse du NO
sont médiés, en partie, par l’action de l’AngII puisque le traitement avec le losartan
prévient le déclin de la fonction rénale et les dommages vasculaires et rénaux induits par le
L-NAME 32,33.
95
Les effets pathophysiologiques de l’AngII peuvent également être modulés via
l’augmentation de la production de l’ET-168, des ROS 34 et du TGF-β 78. En effet, nous
avons observé l’augmentation de l’expression de l’ET-1 et du TGF-β dans les vaisseaux et
les reins d’animaux traités au L-NAME. Nous avons également observé une augmentation
des ROS dans la paroi des vaisseaux. Or, le traitement avec le losartan normalise
l’expression vasculaire et rénale de l’ET-1 et du TGF-β ainsi que le taux des ROS dans
l’aorte thoracique, confirmant l’implication majeure de l’AngII dans la production locale de
ces facteurs vasoactifs.
L’ET-1 jouerait non seulement un rôle dans les effets hémodynamique exercés par l’AngII,
mais contribuerait également à l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux.
Tout comme l’AngII, l’ET-1 induit la vasoconstriction, réduit le débit sanguin rénal,
participe à l’élévation de la protéinurie ainsi qu’à l’hypertrophie des cellules musculaires
lisses 67. Les ROS influencent, quant à eux, la signalisation cellulaire, l’expression de
gènes et stimulent les changements structuraux tels que la prolifération, l’hypertrophie et le
remodelage 85. De plus, ils contribuent à la dysfonction endothéliale en inactivant le NO 34.
Finalement, le TGF-β joue un rôle important dans l’action pro-fibrosante de plusieurs
peptides vasoconstricteurs, dont l’AngII et l’ET-1, et contribue ainsi à l’augmentation de la
résistance périphérique et à la progression de l’hypertension artérielle.
Or, malgré l’augmentation au niveau vasculaire et rénale de l’expression de l’ET-1, du
TGF-β et des ROS chez les animaux L-NAME, le traitement avec le LU135252, l’anticorps
1D11 et l’acide lipoïque n’ont eu aucun effet sur l’élévation de la PAS, de la créatinine
sérique, de la protéinurie et l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux.
Puisque le traitement avec le losartan prévient l’élévation de la production et de
l’expression de ces facteurs, l’AngII serait le facteur primaire responsable de l’élévation de
la pression artérielle et du déclin de la fonction rénale. Le blocage individuel de l’ET-1, du
TGF-β et des ROS ne serait donc pas suffisamment efficace pour contrer les actions
cardiovasculaires et rénales de l’AngII.
96
L’inefficacité du blocage des récepteurs ETA sur l’élévation de la pression artérielle peut
également s’expliquer par l’action accrue de l’AngII lors du traitement avec le L-NAME.
En effet, le NO pallie les effets constricteurs à la fois de l’ET-1 et ceux de l’AngII 81,103.
De plus, le blocage des récepteurs ETA détourne les effets de l’ET-1 sur le récepteur ETB,
mais puisque la synthèse du NO est inhibée, les effets bénéfiques du récepteurs ETB sur le
tonus vasculaire et la natriurèse77 ne peuvent avoir lieu.
Dans un autre ordre d’idées, nous avons démontré au laboratoire l’augmentation de
l’expression et de l’excrétion urinaire du TGF-β chez l’animal urémique par néphrectomie
5/6. Les dommages vasculaires et rénaux comprennent de l’hypertrophie vasculaire, de la
glomérulosclérose, de l’atrophie et de la dilatation tubulaire avec déposition de matrice
extracellulaire au niveau interstitiel. Les dommages vasculaires et rénaux observés chez le
rat Hsd : SD traité au L-NAME se caractérisent plutôt par de l’hypertrophie néointimale
avec oblitération complète de la lumière de certains vaisseaux causant de l’ischémie
glomérulaire et tubulaire. L’augmentation de l’expression et de l’excrétion urinaire du
TGF-β dans le modèle L-NAME pourrait résulter, en partie, de l’hypertension sévère et de
l’action accrue de l’AngII. Or, la même dose d’anticorps 1D11 utilisée chez l’animal
urémique ne procure aucun effet bénéfique chez le rat Hsd : SD traité au L-NAME. La
sévérité et la vitesse d’apparition des dommages vasculaires observés et qui sont typiques
chez le rat Hsd : SD limiteraient probablement l’influence du TGF-β dans cette souche de
rat. Kashiwagi et al.104 ont également démontré l’augmentation de l’expression et de
l’excrétion du TGF-β chez le rat Wistar traité au L-NAME (20-30 mg/kg/jour) pendant 12
semaines. Or, les dommages vasculaires, glomérulaires et tubulaires observés dans le rein
de cette souche ressemblent étrangement à ceux retrouvés chez l’animal urémique. En
utilisant une dose similaire de L-NAME chez les rats Hsd : SD, les animaux décèdent
rapidement en moins de 3 semaines, dû à des accidents vasculaires cérébraux résultant de
l’hypertrophie néointimale observée et de l’occlusion de certains petits vaisseaux. Dans ces
conditions, l’action pro-fibrosante du TGF-β pourrait ne pas avoir d’impact majeur sur
l’élévation de la pression artérielle et l’apparition des dommages vasculaires et rénaux.
97
Bien que l’impact du traitement avec l’acide α-lipoïque sur le stress oxydatif n’a pas été
directement mesuré dans ce protocole, les effets biologiques observés permettent de croire
que ses taux absolus n’influencent pas l’apparition de l’hypertension et les dommages
cardiovasculaires et rénaux. En effet, malgré l’augmentation des ROS dans l’aorte
thoracique, le traitement avec l’acide α-lipoïque n’a eu aucun effet sur l’élévation de la
PAS, le déclin de la fonction rénale et l’apparition des dommages cardiovasculaires et
rénaux, suggérant que la balance NO – ROS soit plus importante que leur niveau absolu 34.
À priori, l’acide α-lipoïque a été choisie parce qu’elle est un antioxydant puissant qui peut
traverser la membrane plasmique et qui a un effet protecteur sur d’autres antioxydants
endogènes dont la vitamine C et E 105. De plus, il a été démontré que l’acide α-lipoïque
atténue l’élévation de la PAS à des doses comparables utilisées chez les rats DOCA-sel 106,107 et SHR 108.
Nous avons vérifié l’effet du degré d’inhibition de la synthèse du NO sur la pression
artérielle et l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux chez le rat Hsd : SD
traité au L-NAME. Les doses de 100 et 30 mg/kg/jour de L-NAME diminuent les taux
urinaires de nitrates/nitrites de 95% et 91% comparativement aux animaux contrôles. Ils
augmentent la PAS, la créatinine sérique et la protéinurie. Ces animaux présentent des
lésions ischémiques rénales associées à des dommages vasculaires sévères, dont de
l’hypertrophie néointimale. On observe le décès des animaux en moins de 3-4 semaines,
probablement dû à des accidents vasculaires cérébraux. À la dose de 5 mg/kg/jour de
L-NAME, on observe une diminution de 15% de l’excrétion urinaire des nitrates/nitrites
après 4 semaines de traitement. Or, lorsque le traitement est prolongé jusqu’à la 12e
semaine, les taux de nitrates/nitrites diminuent de 80% si l’on compare aux animaux
témoins. Ces résultats peuvent être expliqués par l’étude de Ujiie et al.27 qui suggèrent que
le L-NAME inhibe l’activité de la eNOS à deux niveaux soit : (1) en inhibant directement
son activité, (2) en régulant à la baisse l’expression son ARNm. L’hypertension à la dose
de 5 mg/kg/jour se développe de façon plus modérée et les dommages cardiovasculaires et
rénaux apparaissent tardivement à 12 semaines. Le traitement avec le losartan prévient
l’augmentation de la pression artérielle, de la créatinine sérique, de la protéinurie et
prévient l’apparition des dommages vasculaires et rénaux aux différentes doses de
98
L-NAME utilisée. De plus, l’effet antihypertenseur du losartan est associé à une élévation
des taux de nitrates/nitrites urinaires, suggérant que le losartan ait un effet protecteur sur
l’activité de la eNOS ou bien qu’il empêche la formation excessive de ROS responsable de
l’inactivation du NO 45. Toutefois, puisque le losartan ne parvient pas à corriger totalement
la hausse de la pression artérielle, l’établissement de l’HTA pourrait également être
imputable à la diminution de la biodisponibilité du NO. L’équilibre entre la production du
NO et de l’AngII constituerait donc un aspect critique pour le maintien du tonus vasculaire
et de la fonction rénale. En ce sens, l’effet antihypertenseur du losartan est plus prononcé
lorsque le degré d’inhibition de la synthèse du NO est faible. De plus, une dose plus
élevée de losartan pourrait avoir un effet anti-hypertenseur plus efficace que la dose utilisée
dans cette étude.
99
CONCLUSION
En conclusion, cette étude démontre l’importance du NO dans le maintien tonus vasculaire
et de la fonction rénale. L’inhibition chronique de la synthèse du NO chez le rat Hsd : SD
cause une hypertension sévère et des dommages cardiovasculaires et rénaux majeurs qui
dépendent du degré d’inhibition. Ces effets pathophysiologiques sont causés en partie par
l’action de l’AngII qui module la production d’ET-1, du TGF-β et des ROS. Cependant, le
blocage seul de ces facteurs ne parvient pas à freiner l’élévation de la PAS, le déclin de la
fonction rénale et l’apparition des dommages cardiovasculaires et rénaux lorsque la
synthèse du NO est inhibée à forte dose (100 mg/kg/jour). Ces résultats démontrent
l’importance de facteurs vasoactifs majeurs tels que l’AngII et le NO dans le modèle L-
NAME.
100
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