Enzimas – Parte 2
JANAINA DUARTE BAUMERSIANNAH MARIA MAS DIEGO
Estágio em Docência
Prof. Agenor Furigo Jr.Setembro/2008
Enzimas
Atividade enzimática
Produção industrial de enzimas O processo fermentativo; Separação de enzimas intra e
extracelulares; Purificação; Controle de pureza; Produto final.
Atividade Enzimática
As medidas de [ ] em m/V, não tem aplicação para soluções enzimáticas
O que importa não é a massa, mas a atividade
Proteínas desnaturadas
Conserva a massa protéica
Sem atividade catalítica
Atividade Enzimática Dosagem: através da medida de sua atividade
Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza ([S] ou
[P])
uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.)
Pro
duto
µm
ol/m
L
Tempo (min.)
velocidade constante
Atividade Enzimática Dosagem: através da medida de sua atividade
Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza
uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.)
Pro
duto
µm
ol/m
L
Tempo (min.)
↓ [ ] de substrato:
-inativação parcial da enz.,
-inibição por produto.
velocidade decresce
Atividade Enzimática Dosagem: através da medida de sua atividade
Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza
uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.)
Pro
duto
µm
ol/m
L
Tempo (min.)
velocidade constante
↓ [ ] de substrato: inativação parcial da enz., inibição por produto e deslocamento do equilíbrio (reação reversível).
velocidade decresce
Para evitar a influência destes fatores associar- se:atividade medida da velocidade
de reação em condição inicial
(Veloc. Constante)
Atividade Enzimática
A velocidade da reação é medida e expressa em Unidades Internacionais (UI).
1 UI é a quantidade de enzima capaz de formar
1µmol de produto por minuto em condições ótimas
Atividade Enzimática
Métodos para a determinação da atividade de enzimas: Conhecimento prévio da faixa de [ ] enzimática que
permite obter uma variação linear da [P] (ou [S]) com o tempo.
Métodos para avaliar as [ ] das espécies:
Muito diretos: - Espectrofotometria, - Titulometria...
Menos diretos: - Medida da Viscosidade.
Atividade Enzimática A medida da atividade enzimática é imprescindível
para monitorar a purificação de uma enzima.
A atividade específica:número de Unidades de enzima
miligramas de proteína
Portanto se a etapa de purificação for bem sucedida a atividade específica deve
Significa que o procedimento adotado eliminou proteínas indesejáveis.
Atividade Enzimática Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase
(hidrolisa o amido) em um caldo.
2 mL8 mL: Solução de Amido (4%) a pH 4,2 e 60ºC
Após 10 min dosa-se glicose: 20 mg
20 mg em 10 min 2 mg/min ou 120 mg/h
A = 120/2 = 60 U/ml
Caldo contendo a enzima
Atividade Enzimática Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase
(hidrolisa o amido) em um caldo.
2 mL8 mL: Solução de Amido (4%) a pH 4,2 e 60ºC
Após 10 min dosa-se glicose: 20 mg
20 mg em 10 min 2 mg/min ou 120 mg/h
A = 120/2 = 60 U/ml 1 mL - 60mg amido – 1 h
Caldo contendo a enzima
Produção Industrial de Enzimas
Fonte
Animais
Vegetais
Microrganismos
Lípase Pancreática, Pepsina
Bromelina, Papaína
Lactase: S.fragilis,
Lipase: A.niger
Produção Industrial de Enzimas
A produção se faz majoritariamente por fermentação submersa
Nos países orientais há uma tradição estabelecida de utilização da fermentação semi-sólida.
Interessante para países que dispõem de resíduos
agroindustriais - baixo custo
Produção Industrial de Enzimas
Processo importantes prévios à fermentação
preparo do inóculo.
Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado com a cultura estoque liofilizada.
Decorrido o tempo suficiente, essa cultura é inoculada no fermentador principal.
Quantidade de inoculo: 1 a 10% (p/v) A produção da enzima pode ser afetada por esse
parâmetro.
Produção Industrial de Enzimas
Linhagem microbiana
Composição dos meios de cultivo
Sigilosamente protegida
Quimicamente conhecidos (sintéticos)
Matérias-primas naturais
Fontes de carbono e energia, nitrogênio, substâncias minerais e fatores de crescimento
Produção Industrial de Enzimas
Fermentadores Mecanicamente agitados; 10.000 a 100.000 litros; Operados de modo descontínuo (batelada); Munidos de camisas ou serpentinas internas
para as necessidades de aquecimento e refrigeração;
Sistemas de medidas (sensores de pH, temperatura, oxigênio dissolvido e espuma);
As fermentações em batelada para produção de enzimas tem duração da ordem de 30 a a150 h.
Produção Industrial de Enzimas
Processo a jusante (downstream) da fermentação
As operações que se seguem ao processo fermentativo
Dependem da localização da enzima de interesse
Intracelular Extracelular
Extração – Enzimas Extracelulares
O caldo é resfriado a cerca de 5°C, o Estabilidade do produto eo Evitar o crescimento de microrganismos
contaminantes.
O pH é geralmente ajustado para o valor ótimo de atuação da enzima.
A separação das células Centrifugação
Filtração
Extração – Enzimas Extracelulares
Solução clarificada contendo a enzima (livre de células)
Concentração
Ultrafiltração (utiliza a tecnologia de processos
com menbranas)
Evaporação a vácuo (conduzida a T > 35°C)
Extração – Enzimas Extracelulares
Solução clarificada contendo a enzima (livre de células)
Concentração
Ultrafiltração (utiliza a tecnologia de processos
com menbranas)
Evaporação a vácuo (conduzida a T > 35°C)
Esta solução diluída a níveis convenientes e acondiciona com estabilizantes da atividade
enzimática pode ser embalada para comercialização.
Extração – Enzimas Intracelulares
Centrifugação
Romper as Células
Caldo de Cultivo
Biomassa
Extração – Enzimas Intracelulares
Romper as Células
Moagem com Esferas de Vidro Homogeneização
em Alta Pressão
Sonificação
Tratamentos Químicos
Tratamentos Enzimáticos
Extração – Enzimas Intracelulares
A ruptura das células libera inúmeras substâncias para o meio aquoso
Ácidos Nucléicos Precipitação Mn II
Filtração Sobrenadante
Concentrado
Ultrafiltração
Concentração à vácuo
Purificação
Concentrado Enzimático Processo Iguais
Forma de apresentação e pureza
Purificação
Concentrado Enzimático Processo Iguais
Forma de apresentação e pureza
diluída pode ser um produto
comercializável
Forma sólida: seco a vácuo ou por atomização
(spray drying)
Purificação
Concentrado Enzimático Processo Iguais
Forma de apresentação e pureza
diluída pode ser um produto
comercializável
Forma sólida: seco a vácuo ou por atomização
(spray drying)
Padronização da atividade com material sólido inerte
Peletizacao ou aglomeração
Purificação Quando pretende-se obter uma preparação
enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação.
Concentrado Enzimático
Precipitação
(NH4)2SO4
Centrifugação
Moléculas Proteicas
Purificação Quando pretende-se obter uma preparação
enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação.
Concentrado Enzimático
Precipitação
(NH4)2SO4
Centrifugação
Moléculas Proteicas
solventes (etanol,
metanol)
Purificação Quando pretende-se obter uma preparação
enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação.
Concentrado Enzimático
Precipitação
(NH4)2SO4
Centrifugação
Moléculas Proteicas
solventes (etanol,
metanol)
ultrafiltração, microfiltração
e osmose inversa
Purificação Quando busca-se um alto grau de pureza do
produto, técnicas cromatográficas são empregadas
Cromatografia de Troca Iônica Carga das Moléculas
Cromatografia de partição ou de filtração em gel Tamanho da Moléculas
Cromatografia de Afinidade
Ligação bio-específica da enzima com os ligantes
(substratos ou inibidores)
Purificação A concentração pode ser obtida das seguintes
formas:
Adição de um polímero tipo Sephadex G-25
Ultrafiltração
Purificação por Cromatografia
Remoção de água sob vácuo
Concentração
Poros pequenos. Remove cerca de 70% da H2O
Remoção do solvente por membrana semi-permeável
Liofilização
Purificação Controle de Pureza:
Eletroforese. o Técnica de separação de moléculas que
envolve a migração de partículas com a aplicação de uma diferença de potencial
o As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, forma ou carga.
Das muitas técnicas de análise de proteínas, a eletroforese em gel é a + versátil e facilmente aplicável,o é tão sensível que se podem detectar
proteínas que só diferem em um aa.
Purificação
O grau de purificação almejado esta relacionado à aplicação do produto. No mercado estão disponíveis:
Preparações pouco purificadas, para uso técnico ou industrial;
Preparados de alto grau de pureza para uso analítico ou farmacêutico.
Purificação
Produção Industrial de EnzimasCaldo Fermentado
Enzima ExtracelularEnzima Intracelular
Separação sólido/líquido
Concentração
Separação sólido/líquido
Rompimento Celular
Precipitação Ác. Nucléicos
Purificação
Concentração
Produção Industrial de Enzimas
Benefícios ambientais de trabalhar com enzimas:
- São produzidas de fontes renováveis.
- São completamente degradáveis.
- Propiciam economia de energia, água, (condições brandas de temperatura, pH e pressão minimizando a degradação térmica dos produtos finais).