UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
SONIA CRISTINA MEDEIROS SANTOS
AVALIAÇÃO DO SISTEMA DESCONTÍNUO ALIMENTADO REPETIDO PARA A PRODUÇÃO DE
2,3-BUTANODIOL A PARTIR DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE EUCALIPTO
Lorena – SP
2007
SONIA CRISTINA MEDEIROS SANTOS
Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para a produção de 2,3-butanodiol a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto
Tese apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de
Doutor em Biotecnologia Industrial.
Área de Concentração: Conversão de Biomassa
Orientador: Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata
Lorena – SP
2007
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Catalogação na Publicação Biblioteca Universitária
Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo
Santos, Sonia Cristina Medeiros
Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para a produção de 2,3-butanodiol a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto / Sonia Cristina Medeiros Santos ; orientador Arnaldo Márcio Ramalho Prata. -- 2007
130 f. : fig.
Tese (Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Área de Concentração: Conversão de biomassa) – Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo
1. Biotecnologia 2. Hidrolisado hemicelulósico 3. Butanodiol 4. Sistema descontínuo alimentado repetido 5. Klebsiella pneumoniae 6. Inibidores microbianos 7. Fermentação. I. Título.
574.6 - CDU
Sonia Cristina Medeiros Santos
Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para a produção de
2,3-butanodiol a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.
Tese apresentada à Escola de Engenharia de
Lorena da Universidade de São Paulo para
obtenção de título de Doutor.
Área de Concentração: Conversão de Biomassa
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr.____________________________________________________________
Instituição:______________________Assinatura:___________________________
Prof. Dr.____________________________________________________________
Instituição:______________________Assinatura:___________________________
Prof. Dr.____________________________________________________________
Instituição:______________________Assinatura:___________________________
Prof. Dr.____________________________________________________________
Instituição:______________________Assinatura:___________________________
Prof. Dr.____________________________________________________________
Instituição:______________________Assinatura:___________________________
AGRADECIMENTOS
A Deus que está em tudo!
Ao Rodrigo meu marido e companheiro e as nossas famílias, pelo amor, dedicação,
apoio e força.
Ao meu Orientador Arnaldo Márcio Ramalho Prata, que acreditou no meu trabalho e
esteve sempre presente, pela orientação, amizade e confiança.
Ao meu Padrinho Eduardo Sales, Walter Dias, Ana Maria, Morena, Zé Brazão e a
todos que contribuíram em muito na minha jornada.
A Escola de Engenharia de Lorena/USP pela oportunidade da realização deste
trabalho.
Aos amigos Adriana, Andréa Doria, Andrezinho, Dani Borba, Dani Cortez, Daniel,
Denise, Fran, Gilvani, Júlio, Larissa, Lili, Marcos Paulo, Martica, Marton, Pérola,
Priscila, Priscila Brazil, Rita, Rogérios, Rodrigo (IC), Solange, Taís, Waltinho e a
todos os colegas pela amizade, brincadeiras e sugestões.
A todos os Professores e funcionários do Departamento de Biotecnologia, em
especial, Djalma, Fabrício, Jussara, Paulinho, Rita, Zé Cobrinha e Zé Moreira, pela
força, trabalho e amizade.
A todos os funcionários da EEL que colaboraram para a realização deste trabalho.
À CAPES, pelo apoio financeiro.
A todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste
trabalho. Pela força e amizade, muito obrigada!!!
RESUMO
SANTOS, S.C.M. Avaliação do Sistema Descontínuo Alimentado Repetido para a Produção de 2,3-Butanodiol a partir de Hidrolisado Hemicelulósico de Eucalipto. 2007. 130f. Tese (Doutorado em Biotecnologia Industrial) - Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, São Paulo, 2007. Os materiais lignocelulósicos, como as aparas de eucalipto, são uma abundante e renovável fonte de celulose e hemicelulose que podem servir como matéria-prima para a produção de diversos compostos químicos. Esses materiais contêm açúcares polimerizados que podem ser liberados por hidrólise, e, subseqüentemente, fermentados por diversos microrganismos. O emprego desses materiais tem sido considerado de interesse na área de conversão de biomassa em combustíveis líquidos e substâncias químicas de interesse industrial, como é o caso do 2,3-butanodiol. Um dos principais problemas relativos à utilização de hidrolisados hemicelulósicos é a presença de vários compostos tóxicos, inibidores do metabolismo microbiano. Este trabalho teve como objetivo avaliar a estratégia de vazões crescentes de alimentação com meio preparado com hidrolisado hemicelulósico de eucalipto para produção fermentativa de 2,3-butanodiol em sistema descontínuo alimentado por Klebsiella pneumoniae, proporcionando, assim, uma maior adaptação da cultura aos inibidores, uma vez que estes serão adicionados progressivamente ao meio de fermentação. Além disso, avaliou-se o sistema descontínuo alimentado repetido, com a reutilização das células já adaptadas ao meio contendo hidrolisado e em fase de produção, visando um aumento de produtividade do processo. Avaliou-se este sistema empregando-se hidrolisado tratado com carvão ativo e hidrolisado tratado com resinas de troca iônica. O aumento da vazão foi realizado de forma a se preencher o biorreator com o meio em 3 tempos: 7, 10 e 13 horas, com diferentes valores de concentração de substrato (Si) no meio de alimentação: 100, 150 e 200 g/L. O aumento do tempo de adição de meio melhora os resultados, assim como com a diminuição de Si. Porém, a estratégia de vazão crescente não apresentou vantagem em relação aos parâmetros fermentativos avaliados, quando comparados aos encontrados na literatura que empregaram vazão constante. Os valores de vazão de alimentação constante e de Si iguais a 72 mL/h e 100 g/L, respectivamente, foram empregados tanto para o hidrolisado tratado com carvão ativo (HCA) quanto para o tratado com resina de troca iônica (HRI) para a realização do processo em sistema descontínuo alimentado repetido. Com o emprego deste sistema para o hidrolisado tratado com carvão obteve-se 14,84 g/L de produto, YP/S de 0,27 g/g e Qp de 0,62 g/h no 1o ciclo, enquanto que para o hidrolisado tratado com resina os valores foram de 30,4 g/L de produto, YP/S de 0,32 g/g e Qp de 1,22 g/h até o 4ociclo. Conclui-se que o tratamento com resinas de troca iônica para remoção dos compostos tóxicos é mais eficiente que o tratamento com carvão ativo, e a reutilização das células favorece o processo, por estarem com seu metabolismo em plena atividade produtiva no momento do corte, ou seja, para o próximo ciclo. Palavras-chave: Hidrolisado hemicelulósico. Butanodiol. Sistema descontínuo alimentado repetido. Klebsiella pneumoniae. Fermentação. Inibidores microbianos.
ABSTRACT SANTOS, S.C.M. Evaluation of the repeated fed-batch system for the 2,3-butanediol production from Eucalyptus hemicellulosic hydrolysate. 2007. 130f. Thesis (Doctoral in Industrial Biotechnology) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2007.
Lignocellulosic materials, like eucalyptus chips, are an abundant and renewable cellulose and hemicellulose source that can serve as raw material for the production of several chemical compounds. These materials contain polymerized sugars that can be released by hydrolysis process, and, subsequently, fermented by several microorganisms. These materials has been converted, by biotechnological route, into liquid fuels and chemical substances of industrial interest, like 2,3-butanediol. One of the main problems related to the use of hemicellulosic hydrolysate is the presence of several toxic compounds, inhibitors of the microbial metabolism. This work aimed to evaluate the increasing feeding rate strategy with medium prepared with eucalyptus hemicellulosic hydrolysate for fermentative production of 2,3-butanodiol in fed-batch system by Klebsiella pneumoniae. This system provides higher adaptation of the culture to the inhibitors, wich will be added progressively to the fermentation medium. Besides, the repeated fed-batch system was evaluated with the recycle of the cells already adapted to the medium containing hydrolysate in order to increase the productivity of the process. This system was evaluated by using hydrolysate treated with active charcoal and hydrolysate treated with ionic exchange resins. The increase of the feeding rate was accomplished by filling out the biorreator with the medium at 3 times: 7, 10 and 13 hours, with different values of substrate concentration in the feeding medium (Si): 100, 150 and 200 g/L. The time increase of medium addition improves the results, as well as the decrease of Si. However, the strategy of increasing feeding rate did not present better results of the evaluated fermentative parameters, in relation to the values for constant feeding rate found in the literature. The 72 mL/h constant feeding rate and 100 g/L Si were used for the hydrolysate treated with active charcoal (HCA) as for that treated with ionic exchange resins (HRI) in order to accomplish the process in repeated fed-batch system. Using this system it was obtained 14,84 g/L of product, 0,27 g/g YP/S and 0,62 g/h Qp in the first cycle with the hydrolysate treated with active charcoal, while for the hydrolysate treated with resin the values were 30,4 g/L of product, 0,32 g/g YP/S and 1,22 g/h Qp until fourth cycle. The treatment with ionic exchange resins for the toxic compounds removal is more efficient than the treatment with actived charcoal, and the recycle of the cells favors the process, due to their metabolism be in productive activity at the moment of the cut, for the next cycle. Keywords: Eucalyptus hemicelullosic hydrolysate. 2,3-Butanodiol. Repeated fed-batch. Klebsiella pneumoniae. Fermentation. Microbial inhibitors.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 2.1 Reações que ocorreram durante a hidrólise do material lignocelulósico............................20 Figura 2.2 Classificação das principais bactérias produtoras de 2,3-butanodiol (MAGEE e
KOSARIC, 1987)...............................................................................................................37 Figura 2.3 Vias metabólicas de formação dos produtos da fermentação de carboidratos
por Klebsiella pneumoniae.................................................................................................39 Figura 3.1 Picador de madeira..............................................................................................................44 Figura 3.2 Reator de hidrólise (capacidade útil de 50L).......................................................................45 Figura 3.3 Evaporador a vácuo de coluna capacidade de 4L, operando a 70 ± 2oC...........................46 Figura 3.4 Sistema de 4 colunas de vidro encamisadas na seqüência A-180S; A-500, C-150 e
A103S.................................................................................................................................48
Figura 3.5 Variação exponencial do volume de meio no reator nos ensaios.......................................51 Figura 3.6 Variação linear da vazão de alimentação nos ensaios com adição do meio de
alimentação em 4, 7, 10 e 13 horas...................................................................................51 Figura 4.1 Aspecto do hidrolisado concentrado e sem tratamento (HC), e após tratamento
com resinas de troca iônica A860, A500, C150 e A103S.................................................61 Figura 4.2 Concentração de células (-■-), de substrato (-●-) e de produto (-▲-), em função do
tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 10 horas (C) com valor de Si=200 g/L....................................................................................................63
Figura 4.3 Massa de células formada Mxf (-■-), de substrato consumido Msc (-●-) e de
produto formado Mpf (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 10 horas (C) com valor de Si=200 g/L.........................................64
Figura 4.4 Velocidades de formação de células (-■-), de consumo de substrato (-●-) e de
produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 10 horas (C) com valor de Si=200 g/L...................................................65
Figura 4.5 Velocidades de específicas de formação de células (-■-), de consumo de substrato
(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 10 horas (C) com valor de Si=200 g/L.................................66
Figura 4.6 Concentração de células (-■-), de substrato (-●-) e de produto (-▲-), em função do
tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C) com Si=150 g/L............................................................................................................69
Figura 4.7 Massa de células formada Mxf (-■-), de substrato consumido Msc (-●-) e de
produto formado Mpf (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C) com Si=150 g/L...............................................................70
Figura 4.8 Velocidades de formação de células (-■-), de consumo de substrato (-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 10 horas (C) com Si=150 g/L.................................................................71
Figura 4.9 Velocidades de específicas de formação de células (-■-), de consumo de substrato (-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C) com Si=150 g/L.............................................72
Figura 4.10 Concentração de células (-■-), de substrato (-●-) e de produto (-▲-), em
função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C) com Si=100 g/L.............................................................................................75
Figura 4.11 Massa de células formada Mxf (-■-), de substrato consumido Msc (-●-) e de produto formado Mpf (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C) com Si=100 g/L...............................................................76
Figura 4.12 Velocidades de formação de células (-■-), de consumo de substrato (-●-) e de
produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 10 horas (C) com Si=100 g/L.................................................................77
Figura 4.13 Velocidades de específicas de formação de células (-■-), de consumo de substrato
(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C) com Si=100 g/L.............................................78
Figura 4.14 Concentrações de células (-■-), de substrato (-●-) e de produto (-▲-), em
função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando vazão de alimentação constante de 72 mL/h com Si=100 g/L........80
Figura 4.15 Massa de células formadas (-■-), de substrato consumido (-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando vazão de alimentação constante de 72 mL/h com Si=100 g/L....................................................................................................81
Figura 4.16 Velocidades de formação de células (-■-), de consumo de substrato (-●-) e de
produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando vazão de alimentação constante de 72 mL/h com Si=100 g/L...............................................................................................81
Figura 4.17 Velocidades de específicas de formação de células (-■-), de consumo de substrato
(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando vazão de alimentação constante de 72 mL/h com Si=100 g/L..........................................................82
Figura 4.18 Concentrações de células (-■-), de substrato (-●-) e de produto (-▲-), em
função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HCA em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h.........................................................................................................................86
Figura 4.19 Massa de células formadas (-■-), de substrato consumido (-●-) e de produto
formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HCA em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h....................................................................................86
Figura 4.20 Velocidades de formação de células (-■-), de consumo de substrato (-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HCA em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h...............................................................................87
Figura 4.21 Velocidades de específicas de formação de células (-■-), de consumo de substrato
(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HCA em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h...............................................87
Figura 4.22 Concentrações de células (-■-), de substrato (-●-) e de produto (-▲-), em função
do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HRI em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h........89
Figura 4.23 Massa de células formadas (-■-), de substrato consumido (-●-) e de produto
formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HRI em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h....................................................................................89
Figura 4.24 Velocidades de formação de células (-■-), de consumo de substrato (-●-) e de
produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HRI em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h.....................................................................90
Figura 4.25 Velocidades de específicas de formação de células (-■-), de consumo de substrato
(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HRI em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h...............................................90
Figura 4.26 Concentrações de células (-■-), de substrato (-●-) e de produto (-▲-), em
função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi, R1 e R2, empregando hidrolisado HCA.................................................................................................................93
Figura 4.27 Massa de células formadas (-■-), de substrato consumido (-●-) e de produto
formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e R1, empregando hidrolisado HCA............................................................................................94
Figura 4.28 Velocidades de formação de células (-■-), de consumo de substrato (-●-) e de
produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e R1, empregando hidrolisado HCA............................................................................................95
Figura 4.29 Velocidades de específicas de formação de células (-■-), de consumo de substrato
(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e R1, empregando hidrolisado HCA.....................................................................96
Figura 4.30 Concentrações de células (-■-), de substrato (-●-) e de produto (-▲-), em
função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e os ciclos empregando hidrolisado HRI...................................................................................................................99
Figura 4.31 Massa de células formadas (-■-), de substrato consumido (-●-) e de produto
formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e os ciclos, empregando hidrolisado HRI............................................................................................101
Figura 4.32 Velocidades de formação de células (-■-), de consumo de substrato (-●-) e de
produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e os ciclos, empregando hidrolisado HRI............................................................................................103
Figura 4.33 Velocidades de específicas de formação de células (-■-), de consumo de substrato
(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e os ciclos, empregando hidrolisado HRI.....................................................................105
LISTA DE TABELAS Tabela 2.1 Classificação das resinas de troca iônica em função do grupo funcional e da
força iônica.........................................................................................................................29 Tabela 2.2 Ordem de afinidade de diferentes resinas por íons em soluções diluídas
(HARLAND, 1994)..............................................................................................................30 Tabela 2.3 Aplicações do 2,3-butanodiol e alguns derivados...............................................................36 Tabela 3.1 Composição do meio empregado por Frazer e McCaskey, (1989).....................................49 Tabela 3.2 Valores de vazão e volume para os ensaios com adição do meio
750 mL de alimentação......................................................................................................52 Tabela 4.1 Composição do hidrolisado hemicelulósico de aparas de eucalipto...................................59 Tabela 4.2 Composição do hidrolisado hemicelulósico concentrado tratado com carvão
(HCA) e resina de troca iônica (HRI)..................................................................................60 Tabela 4.3 Parâmetros fermentativos dos ensaios para definição do tempo de adição do
meio de alimentação com Si=200 g/L: 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C)..............62
Tabela 4.4 Parâmetros fermentativos dos ensaios para definição do tempo de adição do meio de alimentação com Si=150 g/L: 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C).........68
Tabela 4.5 Parâmetros fermentativos dos ensaios para definição do tempo de adição do
meio de alimentação com Si=100 g/L: 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C)..............79 Tabela 4.6 Parâmetros fermentativos dos ensaios com Si=100 g/L e vazão constante de 72 mL/h....82 Tabela 4.7 Parâmetros fermentativos dos melhores ensaios para definição do tempo de
adição do meio de alimentação..........................................................................................83 Tabela 4.8 Composição dos hidrolisados HCA e HRI...........................................................................85 Tabela 4.9 Parâmetros fermentativos dos ensaios para definição do tempo de corte (TC) para
adição do meio de alimentação para HCA e HRI..............................................................91 Tabela 4.10 Parâmetros fermentativos dos ensaios em sistema descontínuo alimentado
repetido, empregando hidrolisado HCA.............................................................................97 Tabela 4.11 Parâmetros fermentativos dos ensaios em sistema descontínuo alimentado
repetido, empregando hidrolisado HRI............................................................................107
SUMÁRIO
1 Introdução.................................................................................................................................13
2 Revisão Bibliográfica................................................................................................................15
2.1 Materiais Lignocelulósicos........................................................................................................15
2.1.1 Hidrolisados de biomassa vegetal............................................................................................17
2.1.2 Tratamento do hidrolisado........................................................................................................24
2.1.3 Adaptação do microrganismo...................................................................................................32
2.2 2,3-Butanodiol...........................................................................................................................35
2.2.1 Características e aplicações.....................................................................................................35
2.2.2 Microrganismos produtores......................................................................................................36
2.2.3 Fatores que influenciam a formação de 2,3-butanodiol............................................................38
2.2.4 Recuperação do produto..........................................................................................................42
3 Material e Métodos...................................................................................................................44
3.1 Obtenção do Hidrolisado Hemicelulósico.................................................................................44
3.2 Concentração do hidrolisado....................................................................................................45
3.3 Tratamento do hidrolisado........................................................................................................46
3.3.1 Precipitação e adsorção por carvão ativo (HCA)......................................................................46
3.3.2 Extração com resinas de troca iônica (HRI).............................................................................47
3.4 Fermentação.............................................................................................................................48
3.4.1 Microrganismo..........................................................................................................................48
3.4.2 Meio de preparo do inóculo......................................................................................................48
3.4.3 Meios de Fermentação.............................................................................................................49
3.4.3.1 Meio da Fase Descontínua.......................................................................................................49
3.4.3.2 Meio de Alimentação................................................................................................................49
3.4.4 Condições de fermentação.......................................................................................................50
3.5 Seqüência experimental...........................................................................................................50
3.5.1 Teste da vazão crescente de alimentação e do valor de Si, empregando hidrolisado tratado
com carvão ativo (HCA)............................................................................................................50
3.5.2 Definição da vazão de alimentação e do valor de Si para posterior utilização no
sistema descontínuo alimentado repetido................................................................................52
3.5.3 Definição do tempo de corte para os hidrolisados tratados HCA e HRI...................................52
3.5.4 Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para os hidrolisados tratados
HCA e HRI................................................................................................................................53
3.6 Métodos analíticos....................................................................................................................53
3.6.1 Concentração de Açúcares e Ácido Acético.............................................................................53
3.6.2 Concentração de produtos........................................................................................................53
3.6.3 Concentração de Furfural e Hidroximetilfurfural.......................................................................54
3.6.4 Determinação de fenóis totais..................................................................................................54
3.6.5 Concentração celular................................................................................................................55
3.6.6 Coeficiente Volumétrico de Transferência de Oxigênio (kLa)...................................................55
3.7 Parâmetros Fermentativos........................................................................................................56
3.8 Metodologia de análise dos resultados.....................................................................................57
4 Resultados e Discussão...........................................................................................................58
4.1 Obtenção e Concentração do Hidrolisado................................................................................58
4.2 Tratamento com carvão ativo e resinas de troca iônica...........................................................59
4.3 Teste da vazão crescente de alimentação e do valor de Si, empregando hidrolisado tratado
com carvão ativo.......................................................................................................................61
4.4 Definição da vazão de alimentação e do valor de Si para posterior utilização no
sistema descontínuo alimentado repetido................................................................................83
4.5 Definição do tempo de corte para o hidrolisado HCA e HRI.....................................................84
4.6 Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para hidrolisado tratado com
carvão ativo..............................................................................................................................92
4.7 Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para hidrolisado tratado com
resina de troca iônica................................................................................................................97
5 Conclusões.............................................................................................................................108
6 Sugestões para Trabalhos Futuros.........................................................................................110
7 Referências Bibliográficas......................................................................................................111
8 Apêndices...............................................................................................................................123
13
1. INTRODUÇÃO Os materiais lignocelulósicos, como os resíduos agrícolas e florestais, são
uma abundante e renovável fonte de celulose e hemicelulose que pode servir como
matéria-prima para a produção de diversos compostos químicos.
Nas últimas décadas, o eucalipto tem sido o gênero florestal mais utilizado
para aumentar a área de plantações utilizadas com fins industriais no Brasil,
contribuindo assim para o desenvolvimento da indústria madeireira e de polpa e
papel. O Brasil é um dos líderes na plantação florestal, com uma área plantada de
6,7 milhões de hectares, os quais representam 22% do total mundial. Conforme
dados da literatura, somente 50% do peso seco total do eucalipto é aproveitado pela
indústria, permanecendo o restante no campo, na forma de folhas, galhos, e cascas
(BERNARDO et al, 1998).
Esses materiais contêm açúcares polimerizados que podem ser liberados por
hidrólise, e, subseqüentemente, fermentados por diversos microrganismos. O
emprego desses materiais para a produção de butanodiol tem sido considerado de
interesse na área de conversão de biomassa em combustíveis líquidos e
substâncias químicas de interesse industrial.
Um dos principais problemas relativos à utilização do hidrolisado
hemicelulósico é a presença de vários compostos tóxicos, normalmente formados
durante sua obtenção. Existe uma variedade de tratamentos cujo objetivo é reduzir
as concentrações dos compostos tóxicos presentes nos hidrolisados a níveis não
inibitórios ou até mesmo eliminá-los, visando a melhoria da fermentabilidade dos
hidrolisados. Outra forma de contornar o problema é a adaptação do microrganismo
ao meio que contém tais compostos.
A produção de butanodiol por via fermentativa se justifica por ser um
importante intermediário químico, podendo ser transformado em diversas
substâncias de interesse para a indústria. Entre essas destacam-se o 1,3-butadieno,
principal componente da borracha sintética, e a metil-etil-cetona (MEC), um solvente
amplamente empregado na indústria química. Pode ser também utilizado como
anticongelante, devido ao baixo ponto de congelamento e como crioprotetor. Suas
características físico-químicas conferem a este composto, um grande potencial como
combustível líquido, o qual tem despertado grande interesse nos últimos anos,
sobretudo por não ser proveniente do petróleo.
14
A maioria das substâncias nas quais o butanodiol pode ser convertido,
atualmente são obtidas a partir do petróleo. Porém, a atividade industrial baseada
nessa matéria-prima encontra-se sempre ameaçada por problemas de esgotamento
ou políticos. Assim, o desenvolvimento de uma tecnologia para produção de
butanodiol por fermentação, resultando num custo mais baixo para sua obtenção,
constitui uma alternativa estratégica para a obtenção dos compostos mencionados.
O desenvolvimento do processo de produção por via fermentativa, no que diz
respeito ao aumento da concentração final de produto, é fundamental não apenas
sob o aspecto comercial, como também sob o ponto de vista de recuperação do
produto do meio fermentado. A extração se torna mais viável economicamente à
medida que se obtém maiores concentrações de produto no meio.
Vários trabalhos realizados no Departamento de Biotecnologia da EEL/USP
empregaram hidrolisado de cavacos de eucalipto para a produção de butanodiol,
obtendo-se resultados considerados satisfatórios comparados aos encontrados na
literatura. Prata (1997) empregou o sistema descontínuo alimentado para produzir
2,3-butanodiol a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, obtendo uma
produtividade e eficiência de 4 g/h e 80%, respectivamente, porém com uma
concentração relativamente baixa, comparando com os dados da literatura. Entende-
se que esta concentração pode ser aumentada fornecendo-se uma maior
quantidade de substrato, uma vez que a eficiência de conversão apresentou um
valor próximo do teórico. Além disso, com base nos resultados de Garcia (1999),
verificou-se que com uma vazão de 72,0 mL/h e uma concentração inicial de
substrato Si de 90 g/L não houve acúmulo de substrato durante a produção de
2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae. Isso possibilita a utilização de uma vazão
de alimentação maior, o que resultaria em maiores valores de produtividade.
Assim, propõe-se neste trabalho estudar a produção fermentativa de
butanodiol utilizando como matéria-prima as aparas de eucalipto, consideradas
resíduos florestais, que são acumuladas na natureza durante o corte da madeira, e
testar um novo sistema de condução do processo, o descontínuo alimentado
repetido, com a reutilização das células já adaptadas ao meio contendo hidrolisado
em fase de produção, visando um aumento de produtividade do processo.
15
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Materiais Lignocelulósicos
Os materiais lignocelulósicos são importantes fontes de substrato, uma vez
que grandes quantidades de resíduos florestais e agro-industriais são gerados e
acumulados na natureza, decorrentes de atividades industriais e agrícolas. Estes
resíduos constituem reservas naturais renováveis e representam uma importante
fonte de matérias primas de baixo custo que podem ser utilizadas para obtenção de
produtos de alto valor agregado, podendo ser convertidos em energia, produtos
químicos e alimentos (KERN et al., 1998; SHAN e LEE, 1994).
Os três maiores constituintes da biomassa lignocelulósica são a celulose, a
hemicelulose e a lignina, em proporções que variam de 40 a 50%, 15 a 30% e 10 a
30%, respectivamente (DEKKER, 1985). Como exemplo tem-se o eucalipto, com
cerca de 40 a 62% de celulose, 12 a 22% de hemicelulose e 15 a 22% de lignina
(VITAL, DELLA LUCIA, 1986). Garcia (2006) encontrou para o resíduo constituído
por folhas, cascas e galhos de eucalipto, os valores de 31,2% de celulose, 15,07%
de hemicelulose e 28,3% de lignina.
A celulose principal componente da parede celular da fibra vegetal é um
polímero linear formado por unidades de glicose unidas por ligações glicosídicas
β-1,4 com estrutura cristalina altamente ordenada e alta massa molecular (FAN et
al., 1982; KUHAD e SINGH,1993).
A hemicelulose é um polímero complexo, constituído das pentoses xilose e
arabinose, e das hexoses manose, glicose, galactose e ácidos urônicos (FENGEL e
WEGENER, 1989; KUHAD e SINGH,1993). O principal componente da fração
hemicelulósica dos resíduos agro-industriais é a xilana, polímero constituído por
unidades de xilose que pode ser hidrolisado usando-se ácidos minerais. A xilana
possui estrutura linear constituída de unidades xilopiranosídicas unidas por ligações
β-1,4, é encontrada em todas as plantas terrestres e compreende 30% do material
da parede celular (VILKARI, et al, 1993).
A lignina é composta de um conjunto de polímeros amorfos reticulares de alta
massa molecular, geralmente associados com a celulose e a hemicelulose. Tem
estrutura química fortemente aromática, composta por anéis de benzeno que contém
16
grupos fenólicos livres e metilados (FENGEL e WEGENER, 1989; KUHAD e
SINGH,1993).
Os constituintes menores da biomassa vegetal incluem extrativos e não
extrativos. As madeiras contêm 1-8% de extrativos, em base seca, que consistem de
gomas, alcalóides, amidos, graxas, gorduras, resinas e óleos essenciais, entre
outros. Os não extrativos compreendem a 0,2-0,8% da madeira, em base seca, e
incluem compostos inorgânicos como sílica, carbonatos e oxalatos (FENGEL,
WEGNER, 1989).
O emprego da biotecnologia é uma maneira de fazer com que a biomassa
agrícola e florestal, rica fonte de carboidratos (MOHANDAS et al., 1995) se torne um
substrato utilizado pelos microrganismos para a produção de insumos úteis como a
acetona, o ácido acético, o butanol e o ácido butírico (SADDLER et al., 1983), dentre
outros.
O eucalipto é originário da Austrália, pertence à família Myrtacea e é a
principal matéria-prima da indústria brasileira de papel e celulose. Nas últimas
décadas, o eucalipto tem sido o gênero florestal mais utilizado para aumentar a área
de plantações utilizadas com fins industriais no Brasil, contribuindo assim para o
desenvolvimento das indústrias madeireiras e de polpa e papel. O crescimento
rápido torna a madeira muito rentável, sendo utilizada para embalagens, fabricação
de postes de luz e telefonia e como combustível industrial (ENCARTA, 2001).
Segundo a FAO (2000) somente em 2000, foram plantados 2,96 milhões de
hectares, representando 59,5% da área total de plantações florestais no país.
As maiores áreas reflorestadas com eucalipto estão localizadas nos Estados
de Minas Gerais (51,8%), São Paulo (19,4%), Bahia (7,2%) e Espírito Santo (5,1%).
Segundo a Sociedade Brasileira de Silvicultura (SBS), o Brasil é atualmente
responsável por 2% do comércio mundial de papel (11º produtor mundial) e 5% do
comércio de celulose (7º produtor mundial), isto contabilizado os produtos obtidos de
outras espécies de madeira utilizadas, como pinus e araucária. (SELING et al.,
2001). De acordo com o Inventário Florestal das Áreas Reflorestadas do Estado de
São Paulo (2002) 79,4% da área média das plantações é de Eucalyptus, com
predominância das espécies E. grandis (26%) e E. saligna (15%). Segundo a SBS, a
produtividade média das plantações de Eucalyptus é de 34 m3/ha.ano (SELING et
al., 2001).
17
Uma grande quantidade de resíduos é gerada durante o corte da madeira,
geralmente esses resíduos não são aproveitados no momento da colheita. De 50 a
75% dos ramos, folhas e raízes das árvores ficam no campo e a isto são
adicionados os resíduos gerados em operações de polpação e moagem (SINGH e
MISHRA, 1995). De acordo com Dale (1987) o custo de vários produtos de fermentação
dependem do custo da fonte de carboidrato. Segundo este autor, a conversão de
materiais lignocelulósicos oferece potencial para a obtenção de açúcares
fermentescíveis de baixo custo. Para isto é de fundamental importância o uso
integrado de todos os componentes dos materiais lignocelulósicos e o
desenvolvimento de pré-tratamentos que possibilitem o aumento do rendimento da
hidrólise da celulose.
2.1.1 Hidrolisados de biomassa vegetal
Vários processos foram desenvolvidos e adaptados visando o fracionamento
da biomassa vegetal em seus principais constituintes, para a posterior utilização da
fração hemicelulósica, que apresenta como principal componente a xilose (GARCIA
et al., 2004; LARSSON et al., 1999; ROBERTO et al., 1991a; SILVA et al, 1998).
De acordo com McMillan (1992) citado por Kim et al. (2000), a hidrólise ácida
é um dos métodos mais utilizados para a separação da hemicelulose da biomassa
lignocelulósica. Normalmente a hidrólise ácida é realizada em temperaturas entre
120 e 200 oC, com a adição de pequenas quantidades de ácidos como H2SO4,
promovendo a separação de açúcares e da lignina (GRETHLEIN e CONVERSE,
1991; TOREGET e HSU, 1994), citados por Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2000b).
Neste processo, a concentração de ácido e a temperatura são fatores cruciais
para formação de compostos tóxicos. Temperaturas moderadas (
18
Segundo Harris (1975) citado por Jeffries et al. (1984), a hemicelulose tal
como xilana tem mais ramificações, estrutura menos cristalina que a celulose, e as
ligações glicosídicas entre os resíduos anidro-D-xilose nas xilanas são menos
estáveis e mais rapidamente rompidas pelo ácido do que as ligações entre os
resíduos de D-glicose na celulose. Como conseqüência as pentoses podem ser mais
facilmente extraídas do material lignocelulósico através deste método de hidrólise.
O pré-tratamento empregado deve ser energeticamente e quimicamente
eficiente, ou seja, o processo de conversão de biomassa deve ser economicamente
vantajoso. Deve propiciar a conversão eficiente do carboidrato disponível em
açúcares fermentescíveis, para se obter alto rendimento do produto de interesse.
Logo, a degradação ou a perda de carboidratos deve ser evitada, bem como a
formação de compostos inibidores do metabolismo celular (McMILLAN, 1994a). Esta
condição também é mencionada por Garg e Jain (1995) em sua revisão sobre
produção fermentativa de 2,3-butanodiol. Como exemplo pode-se citar o trabalho de
Shan e Lee (1994), que desenvolveram um processo de produção de
acetona-butanol a partir de madeira, através do sistema de fermentação extrativa e
sacarificação associadas. Neste estudo foram empregadas enzimas que
hidrolisavam a fração celulósica e hemicelulósica da madeira.
GONG et al. (1997), utilizando material lignocelulósico, empregaram um
processo de sacarificação e fermentação simultâneas para a produção de
2,3-butanodiol. Neste processo as frações de celulose e hemicelulose foram
hidrolisadas pela celulase obtendo-se glicose, xilose e uma mistura de outros
açúcares em menor quantidade, predominando arabinose. Simultaneamente estes
açúcares foram convertidos a 2,3-butanodiol pela bactéria Klebsiella oxytoca ATCC
8724. Neste processo, obtiveram-se maiores velocidades de hidrólise e rendimento
em produto quando comparados com aqueles envolvendo hidrólise e fermentação
separadas.
Um dos principais problemas relativos à utilização de hidrolisados
hemicelulósicos é a presença de substâncias inibidoras do metabolismo dos
microrganismos fermentadores (FRAZER e McCASKEY, 1989; YU et al., 1982). Tais
inibidores são liberados ou formados durante o processo de hidrólise ácida dos
materiais lignocelulósicos (FRAZER e McCASKEY, 1989). A composição dos
inibidores varia com as condições de hidrólise empregadas e a fonte de materiais
lignocelulósicos. A temperatura do processo de hidrólise, o tempo e a concentração
19
de ácido utilizada são fatores que influenciam na formação dos inibidores da
fermentação (OVEREND e CHORNET, 1987), citados por Taherzadeh et al. (2000).
O hidrolisado obtido por hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos necessita
ser concentrado, para aumentar o teor de açúcares, antes de ser utilizado como
substrato num processo fermentativo como o de produção de 2,3-butanodiol. Isto
porque a concentração de açúcar do meio deve estar em torno de 100 g/L
(JANSEN et al, 1984; SILVEIRA, 1991) e os hidrolisados contêm de 25 (ALMEIDA e
SILVA, 1996) a 40 g/L de carboidratos fermentescíveis (GARCIA, 2006).
Os compostos tóxicos presentes no hidrolisado podem causar inibição do
crescimento celular e limitação do consumo dos açúcares presentes, inibindo assim,
a formação do produto e o rendimento do processo (PARAJÓ et al., 1998c).
Ocasionalmente, a inibição é o resultado do efeito sinergístico, ou seja, interação
dos efeitos negativos dos compostos tóxicos proporcionando um aumento da
inibição existente. Os inibidores também aumentam o “stress” químico do meio até
um certo limite, porém podem proporcionar a morte celular, se a capacidade da
célula de resposta ao “stress” for excedida (PALMQVIST & HAHN-HÄGERDAL,
2000b).
Leonard & Hajny (1945), citados por Parajó et al. (1998c), consideraram os
seguintes inibidores: (i) minerais ou metais pesados contidos no material
lignocelulósico ou resultantes da corrosão do equipamento de hidrólise; (ii) produtos
derivados da hidrólise da hemicelulose, como o ácido acético (formado pelos grupos
acetil da matéria-prima) ou furfural e hidroximetil-furfural (formados pela degradação
dos açúcares); (iii) produtos derivados da degradação da lignina (compostos
fenólicos, ácidos aromáticos e aldeídos) e (iv) compostos derivados de extrativos.
Ácidos como vanílico, siringílico, capróico, caprílico, pelargônico e palmítico têm sido
citados entre os ácidos orgânicos com capacidade inibitória presente nos meios de
fermentação formulados com hidrolisados de materiais lignocelulósicos. O processo
de hidrólise, o qual envolve o tratamento do material lignocelulósico à alta
temperatura sob condições ácidas, leva à formação e liberação de vários compostos.
a principal via de degradação está esquematizada na Figura 2.1 (PALMQVIST &
HAHN-HÄGERDAL, 2000b).
20
CH3COOH Compostos
Ácido acético Fenólicos
CHO CHO CHO CHO
H C OH HO C H H C OH H C OH
HO C H HO C H HO C H HO C H
H C OH H C OH HO C H H C OH
CH2OH H C OH H C OH H C OH
CH2OH CH2OH CH2OH
Xilose Manose Galactose Glicose
O CHO HOH2C O CHO
Furfural Hidroximetilfurfural
O
HCOOH H3C C CH2 CH2 COOH
Ácido Fórmico Ácido Levulínico
Figura 2.1 Reações que ocorreram durante a hidrólise do material lignocelulósico.
De acordo com Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2000b), o efeito inibitório do
furfural tem sido relacionado com a redução da velocidade de crescimento específica
do microrganismo. PARAJÓ et al. (1997) verificaram que em concentrações de 1,3 a
3,2 g/L, o furfural apresenta efeito inibitório sobre a levedura Pichia stipitis. Porém,
em concentrações inferiores a 1,0 g/L, este efeito pouco influencia o processo
fermentativo. Nigan (2001) verificou que a adição de 0,27 g/L de furfural ao meio de
fermentação não reduziu significantemente o rendimento e a produtividade em
etanol, porém a adição de 1,5 g/L de furfural reduziu notoriamente o rendimento e a
produtividade em 90,4 e 85,1%, respectivamente. Isto mostra que a alta
MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS
HEMICELULOSE CELULOSE LIGNINA
21
concentração de furfural inibiu diretamente a respiração e o crescimento da levedura
P. stipitis. O autor verificou ainda, que o furfural é reduzido a álcool furfurílico, o qual
também diminui a velocidade de crescimento, bem como a velocidade específica de
produção de etanol.
Em relação ao hidroximetilfurfural, Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2000b)
relataram que seu mecanismo de inibição é muito similar ao do furfural, causando
uma longa fase lag durante o crescimento do microrganismo. Porém, o
hidroximetilfurfural é considerado menos tóxico que o furfural, e sua concentração no
hidrolisado hemicelulósico é normalmente baixa devido a 3 fatores: (1) baixa
quantidade de hexose na hemicelulose, (2) as condições empregadas no processo
de hidrólise, o qual normalmente não degrada hexoses em grande quantidade e (3)
a alta reatividade dos compostos. De acordo com Delgenes et al. (1996), o
crescimento P. stipitis foi reduzido em 43, 70 e 100%, quando a concentração de
HMF no meio foi de 0,5; 0,75 e 1,5 g/L, respectivamente.
Martinez et al. (2000) verificaram que a produção de etanol por E. coli em
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana foi afetada somente em presença de
concentrações maiores que 900 mg/L de furanos (furfural e HMF), sendo que estes
não foram os principais compostos que determinaram a toxicidade dos hidrolisados
hemicelulósicos para a produção de etanol. De acordo com Vogel-Lowmeier et al.
(1998), a toxicidade do furfural e do HMF pode estar relacionada ao efeito
sinergístico, quando estes dois compostos são combinados com outros compostos,
incluindo uma variedade de compostos fenólicos e aromáticos derivados da
degradação da lignina, e outros tipos de ácidos como, acético, fórmico e levulínico
(MUSSATO e ROBERTO, 2004).
O efeito tóxico do ácido acético (pka=4,75) está relacionado com a inibição do
crescimento do microrganismo. Este ácido pode ser, portanto, utilizado como
preservativo em alimentos. Os ácidos fracos, em valores de pH baixo, apresentam-
se na forma não-dissociada. Sendo lipossolúveis, têm sua passagem facilitada
através da membrana plasmática. Ao entrar na célula e encontrar um pH interno
neutro, este ácido se dissocia no citossol liberando prótons H+. A enzima ATPase
existente na membrana da célula tem a função de expulsar os prótons do interior
desta, de forma a manter a integridade da célula. Quando a concentração de ácido
aumenta, a atividade da enzima ATPase também aumenta, porém, dependendo da
concentração do ácido, esta enzima pode não conseguir bombear os prótons para
22
fora da célula. Em conseqüência, cada vez mais o pH intracelular vai se acidificando
e inibindo a atividade da célula, o que pode levá-la à morte (LARSSON et al., 1999b;
PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2000b). A toxicidade do ácido acético varia de
acordo com as condições de cultivo empregadas no processo fermentativo. Van Zyl
et al. (1991) utilizaram P. stipitis para produção de etanol a partir de hidrolisado
hemicelulósico de bagaço-de-cana e concluiram que o grau de inibição causado pelo
ácido acético depende não somente da sua concentração, mas também da
concentração de oxigênio e do pH do meio. Verificaram que em pH 6,5 e com
concentração de ácido acético acima de 4 g/L a produção de etanol caiu,
descrescendo até 50% quando a concentração do ácido alcançou 15 g/L. Em pH 5,1
o mesmo decréscimo de 50% na concentração de etanol foi observado quando a
concentração de ácido acético foi de somente 1,0 g/L e nenhum etanol foi produzido
na concentração de ácido de 10 g/L no hidrolisado.
Segundo Felipe et al. (1995) a produção de xilitol por Candida guilliermondii,
utilizando meio semi-sintético, foi favorecida em baixa concentração de ácido acético
(até 1,0 g/L), enquanto que em níveis superiores a 3,0 g/L foi inibida. Virgínio da
Silva (2001) constatou que a inibição do ácido acético é dependente da sua
concentração bem como da fase de crescimento da levedura. Segundo o autor, o
maior efeito tóxico do ácido acético ocorreu quando, após 12 horas de cultivo, as
células foram expostas a 5,0 g/L deste ácido, no tempo que corresponde à fase de
atividade máxima metabólica da levedura C. guilliermondii. Assim, relacionou a
toxicidade a uma possível interação do efeito inibidor do ácido acético com outros
compostos tóxicos como, furfural, 5-HMF e fenóis, já que os maiores valores de
rendimento e produtividade em xilitol foram obtidos com a utilização de meio
simulando a composição de açúcares do hidrolisado, tendo apenas o ácido acético
como composto inibidor. A assimilação de ácido acético pela levedura C.
guilliermondii, foi observada por outros autores em hidrolisado de bagaço-de-cana
(MARTON, 2002), eucalipto (GINORIS, 2001) e palha de trigo (CANILHA, 2002).
Rossi et al. (2006) estudou o comportamento da bactéria K. pneumoniae para
a produção de butanodiol em meio sintético contendo diferentes concentrações de
ácido acético. Concluiu que o ácido acético favorece o processo em termos de
velocidade quando a adição de ácido acético no meio foi de 2 g/L e em termos de
conversão de substrato em produto quando a adição foi de 6 g/L de ácido acético. O
23
mesmo autor verificou que a bactéria consome ácido acético mesmo antes do
esgotamento do substrato do meio.
A influência de outros ácidos fracos foi verificada por Larsson et al. (1998),
que concluiram que existe uma clara diferença entre a toxicidade dos ácidos acético,
fórmico e levulínico nas mesmas concentrações de suas formas não dissociadas. É
provável que isto ocorra devido a diferenças de permeabilidade da membrana ou da
toxicidade da forma aniônica dos ácidos, uma vez no interior da célula (PALMQVIST
e HAHN-HÄGERDAL, 2000b).
Uma grande variedade de compostos aromáticos, poliaromáticos, fenólicos e
aldeídicos são liberados durante a degradação da estrutura da lignina dos materiais
lignocelulósicos. Os compostos fenólicos têm sido considerados por exercerem
grande efeito inibitório na fermentação de hidrolisados hemicelulósicos, sendo
considerados mais tóxicos, os compostos fenólicos de baixa massa molecular
(LARSSON et al., 1998; LUO et al., 2002; MACIEL et al., 2001). De acordo com
Heipieper et al. (1994), citados por Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2000b), os
compostos fenólicos causam uma perda da integridade da membrana celular,
afetando sua habilidade de atuar como barreira seletiva e matriz enzimática. Estes
autores utilizaram como base o estudo de Larsson et al. (1998), que observaram que
o hidrolisado hemicelulósico de madeira é consideravelmente mais inibidor do que
um meio sintético contendo concentrações correspondentes de ácidos alifáticos,
furfural e 5-HMF, porém sem compostos fenólicos. Contudo, o mecanismo do efeito
de inibição destes compostos ainda não foi elucidado, devido, em grande parte, à
falta de exatidão das análises quantitativas e qualitativas.
Tran e Chambers (1986) testaram o efeito de nove fenólicos, a maioria dos
quais foram compostos benzílicos, em Klebsiella pneumoniae, e concluiram que os
compostos fenólicos foram mais tóxicos que os compostos de extrativos
não-fenólicos, os quais foram também testados. Nishikawa et al. (1988) estudaram o
efeito de sete compostos benzílicos em K. pneumoniae. Como resultado destes
estudos, foi proposto que os álcoois aromáticos são menos tóxicos que seus
correspondentes ácidos, os quais são menos tóxicos que seus correspondentes
aldeídicos (LARSSON et al., 2000).
Lee et al. (1999) estudaram o efeito de compostos inibidores do hidrolisado de
madeira na produção de etanol por Sacharomyces cerevisiae. O produto da
degradação da lignina, p-hidroxibenzóico aldeído foi o composto mais inibidor
24
testado neste estudo. Os compostos com grupo metil adicional apresentaram
toxicidade menor e os ácidos aromáticos foram menos tóxicos do que seus aldeídos
correpondentes. Os autores concluiram que os produtos da degradação da lignina
foram mais inibitórios do que os produtos derivados de açúcares, como o furfural e o
HMF.
Fitzgerald (2004) conclui que o efeito inibitório da vanilina consiste
principalmente na sua habilidade de afetar a integridade da membrana
citoplasmática, resultando na perda de gradientes de íons, pH de homeostase e
inibição da atividade respiratória. A inibição por vanilina depende da concentração,
do tempo de exposição e do microrganismo utilizado.
Os íons de metais pesados podem ser provenientes da corrosão dos
equipamentos de hidrólise (íons ferro, cromo, níquel e cobre). Watson et al. (1984)
estudaram os efeitos dos íons Fe, Cu, Cr e Ni (em concentrações similares às
encontradas nos hidrolisados) sobre o crescimento de Cândida tropicalis em meio
sintético. Segundo estes autores, a presença dos íons cobre e cromo em
concentrações de 0-0,004 e 0-0,10 g/L, respectivamente, não tiveram efeito
significativo sobre μmáx, porém, 60% de redução foi notada para o meio contendo
0,10 g Ni+2/L. Existem poucos estudos sobre o efeito de cátions metálicos na
atividade das enzimas envolvidas no metabolismo de xilose. Girio et al. (1996),
citados por Parajó (1998c), verificaram que os íons Ca+2, Mg+2 e Mn+2 não afetam a
atividade da enzima XDH, ao passo que os íons Zn+2, Cd+2 e Co+2 inibiram
fortemente esta enzima.
Rodrigues et al. (2001) detectaram a presença de alguns minerais no
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, bem como de metais, provavelmente
derivados da matéria-prima lignocelulósica ou da corrosão dos equipamentos de
hidrólise. Segundo os autores, as concentrações de alguns íons encontrados no
hidrolisado não foram consideradas inibitórias da atividade microbiana quando
comparados aos resultados obtidos por Watson et al. (1984).
2.1.2 Tratamento do hidrolisado
A fermentação de hidrolisados não destoxificados é caracterizada por uma
cinética lenta, com rendimentos e produtividades limitadas, quando comparada à
fermentação realizada a partir de açúcares comerciais ou hidrolisados
25
destoxificados. Isto é devido à presença de uma variedade de compostos que atuam
como potentes inibidores do metabolismo microbiano. Muitos estudos têm sido
realizados para identificar os compostos inibidores do hidrolisado hemicelulósico,
sendo de grande importância o conhecimento destes inibidores e como minimizar
seus efeitos negativos para se obter uma grande eficiência num processo
fermentativo (PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2000b).
De acordo com Taherzadeh et al. (2000a) existem quatro diferentes
alternativas para contornar o problema dos inibidores dos hidrolisados
hemicelulósicos: (1) Evitar a formação dos inibidores durante hidrólise; (2)
Destoxificar o hidrolisado antes da fermentação; (3) Desenvolver espécies de
microrganismos capazes de tolerar os inibidores; (4) Converter os compostos tóxicos
em produtos que não interferem no metabolismo microbiano. Segundo estes
autores, novas espécies de microrganismos metabolicamente engenheiradas para
aumentar sua tolerância aos inibidores podem diminuir a necessidade de
destoxificação dos hidrolisados. Porém, não se tem totalmente definido contra quais
compostos é requerida esta resistência.
Vários tratamentos vêem sendo propostos com o objetivo de reduzir as
concentrações dos compostos tóxicos presentes nos hidrolisados a níveis não
inibitórios ou até mesmo eliminá-los, visando a melhoria da fermentabilidade dos
hidrolisados (DOMINGUEZ et al., 1996; GARCIA, 2006; MATOS, 2004; PALMQVIST
e HAHN-HÄGERDAL, 2000b; PRATA, 1997; ROBERTO et al., 1991a; VILLARREAL
et al., 2006; VIÑALS, 2001). Estes tratamentos podem ser classificados em função
da forma de realização (individual ou combinado) e da natureza dos agentes
empregados (físico, químico e biológico). A eficiência do método de destoxificação
depende do tipo de hidrolisado hemicelulósico e da espécie de microrganismo
empregada, uma vez que cada tipo de hidrolisado apresenta diferente grau de
toxicidade, e cada espécie de microrganismo apresenta diferente grau de tolerância
aos inibidores (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000a). Antes da escolha do método
deve-se considerar a composição do hidrolisado, a qual varia de acordo com a
matéria-prima e as condições de hidrólise empregadas (LARSSON et al., 1999b).
O método físico de destoxificação do hidrolisado baseia-se no processo de
concentração por evaporação à vácuo, que reduz a concentração de compostos
voláteis presentes como ácido acético, furfural e vanilina. Porém, este método
também aumenta moderadamente a concentração de compostos tóxicos
26
não-voláteis como extrativos e derivados de lignina e, conseqüentemente, seu grau
de inibição (PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2000a). Esta situação pode ser
contornada associando a evaporação a outro método de destoxificação
(LARSSON et al, 1999; PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2000b).
Converti et al. (2000) e Rodriguez et al. (2001) relataram que o método de evaporação é capaz de remover ácido acético, furfural e outros compostos voláteis
do hidrolisado hemicelulósico, aumentando a produtividade do processo
fermentativo para produção de xilitol.
Converti et al. (2000) estudaram os processos de explosão à vapor e pré-
hidrólise com ácido sulfúrico diluído para a hidrólise de Eucalyptus globulus para a
produção de xilitol. Os autores concluiram que o processo de explosão à vapor é
capaz de hidrolisar mais rapidamente a madeira, mas o hidrolisado produzido desta
maneira requer fortes tratamentos de destoxificação. A precipitação através da
elevação e abaixamento do pH e a adsorção com carvão ativo foram mais
adequados para a remoção dos compostos derivados da lignina.
Os métodos químicos baseiam-se na precipitação de compostos tóxicos e na
instabilidade de alguns inibidores em determinado valor de pH (MARTINEZ et al.,
2000; SILVA et al., 1998;), na extração com solventes orgânicos (CRUZ et al., 1999),
na adição de substâncias redutoras (PARAJÓ et al.,1997b), na adsorção com carvão
ativo (DANNER et al., 2003; GINORIZ, 2001; MARTON, 2002b), na utilização de
resinas de troca iônica (CANILHA et al., 2003, GARCIA, 2006; LARSSON et al.,
1999b; NILVEBRANT et al., 2001; VIÑALS, 2001) e na combinação deles
(ALVES et al., 1998; KULKARNI et al., 1998b; MARTON, 2005; PRATA e HISS,
1998; VILLARREAL, 2005).
O processo de precipitação pela alteração do pH causa efeitos benéficos
como uma parcial remoção de ácidos (acético e tânico) e compostos fenólicos,
precipitação de íons metálicos pesados e conversão de furfural em ácido furfurílico.
No entanto, os açúcares podem ser parcialmente degradados (ROBERTO et al.,
1994; SILVA et al., 1991). Nesse processo, óxido de cálcio (CaO), hidróxido de
cálcio Ca (OH)2 ou outro hidróxido é adicionado ao meio até se alcançar valores de
pH entre 7 e 10,5 e logo é adicionado ácido para abaixar o pH. O precipitado
formado, constituído principalmente por sais de cálcio de baixa solubilidade, como o
sulfato, é eliminado por filtração à vácuo. Este método foi realizado sob condições de
calor, uma vez que a solubilidade do sulfato de cálcio diminui em alta temperatura.
27
Em estudos realizados com hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana-de-
açúcar tratados pelo método de alteração de pH observou-se uma eliminação total
do furfural, no entanto, a redução do ácido acético no meio foi parcial (FELIPE et al.,
1993).
De acordo com Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2000a), o ajuste do pH até 10
com NaOH ou Ca(OH)2 tem sido relatado como capaz de diminuir a concentração
das cetonas de Hibbert presentes no hidrolisado ácido diluído de madeira, em cerca
de 22%, e as concentrações de furfural e de HMF em cerca de 20%. Porém, a
concentração de ácido acético não foi afetada por nenhum dos tratamentos.
O tratamento com carvão ativo é um método eficiente e econômico para
redução das concentrações de compostos fenólicos (PARAJÓ et al., 1996a),
compostos aromáticos (PARAJÓ et al., 1997b), furfural e HMF (MUSSATO et al.,
2001), encontrados nos hidrolisados hemicelulósicos, e tem sido capaz de melhorar
a fermentabilidade do hidrolisado (GINORIZ, 2001).
Rodrigues et al. (1995) verificaram a influência da elevação do pH e do uso de
carvão ativo sobre a redução dos níveis de inibidores e de Carboidratos Redutores
Totais (CRT) presentes no hidrolisado hemicelulósico de eucalipto obtido por
hidrólise ácida. Os autores constataram que a elevação do pH para 8,0 e a adição
de carvão ativo é o procedimento que proporciona uma menor perda de açúcares
associada a uma maior redução de impurezas do hidrolisado hemicelulósico de
eucalipto.
Prata e Hiss (1998) verificaram que o tratamento por elevação de pH com
CaO e abaixamento com H2SO4 combinado com adsorção por carvão ativo
proporcionaram melhores resultados de crescimento da bactéria
Klebsiella pneumoniae em meio preparado com hidrolisado hemicelulósico de
eucalipto, obtido por hidrólise ácida.
Ginoriz (2001) encontrou como melhor condição de tratamento do hidrolisado
hemicelulósico de eucalipto (fator de conversão de xilose em xilitol por C.
guilhermondii de 0,52 g/g e formação de xilitol de 42,9 g/L), a elevação do pH deste
para 3,5 com CaO seguida da adsorção em carvão ativo pulverizado SYNTH (2,4%,
m/v) sob agitação de 200 rpm, 30 oC por 34,5 min. Mussato e Roberto (2001)
utilizaram hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz para o estudo do efeito do
tratamento com carvão ativo na bioconversão de xilose em xilitol por
C. guilhermondii e encontraram que o grau de remoção dos compostos fenólicos
28
aumentou quando a razão hidrolisado:carvão foi diminuída de 120 para 24 g/g.
Contudo, os melhores valores de rendimento (0,72 g/g) e produtividade volumétrica
(0,61 g/L.h) do processo fermentativo foram alcançados com a razão de 40 g/g, a
qual removeu 27% dos compostos fenólicos. Estes estudos demonstraram ainda que
esses parâmetros tiveram um aumento de 22 e 45%, respectivamente, em relação
àqueles obtidos sem tratamento com carvão.
MARTON (2002b) avaliou, para quatro marcas de carvões ativos pulverizados
nacionais (SYNTH, BRASILAC, CARBOMAFRA e CARVORITE), os parâmetros
temperatura (T), tempo de contato (tc), agitação (A), pH e concentração de carvão
(CC), e não foram observadas diferenças significativas em relação à produtividade
volumétrica de xilitol (QP) para os diferentes carvões usados no tratamento. Porém, o
carvão ativo CDA da BRASILAC foi selecionado entre os avaliados por apresentar a
maior relação área superficial/custo do produto. A condição estabelecida de
tratamento (T=60 ºC, tc=30min, A=100 rpm, pH 2,5 e CC=1%) permitiu remoção
média de 44,18% de ácido acético, 76,22% de fenóis, 58,27% de furfural e 59,69%
de 5-hidroximetilfurfural, além da clarificação do hidrolisado. A fermentação deste
hidrolisado, com 64 horas, resultou em um consumo de 94,14% de D-xilose, fator de
conversão de D-xilose em xilitol de 0,66 g/g e produtividade volumétrica de xilitol de
0,51g/L.h, embora esta produtividade seja ainda considerada baixa em relação à
desejada em processos de bioconversão.
Outro método de tratamento químico é o de adsorção por resinas de troca
iônica, contudo, seu custo é alto quando comparado com outros tratamentos
(LEE et al., 1999).
As resinas de troca iônica são compostos macromoleculares constituídos por
um esqueleto tridimensional no qual fixam-se os grupos ativos. Estas permitem
trocar os íons não desejáveis da solução problema por aqueles que se encontram
saturando os grupos funcionais da resina. Este processo de equilíbrio pode ser
representado pela seguinte equação: RA + B → RB + A, onde RA e RB representam
as resinas na forma A e B respectivamente, e A e B os íons trocados. As reações de
troca iônica são estequiométricas, reversíveis e possíveis com qualquer composto
ionizável. A natureza reversível da reação permite o repetido uso das resinas, desde
que estas não sofram mudanças substanciais da sua estrutura. A velocidade da
reação depende da seletividade da resina (DECHOW, 1989).
29
Uma reação de troca iônica pode ser definida como uma troca reversível de
íons entre uma fase sólida (matriz) e uma fase líquida (solução problema). Os
trocadores carregados positivamente têm contra íons carregados negativamente
(ânions) disponíveis para serem trocados, e são denominados trocadores aniônicos.
Logo, os trocadores carregados negativamente têm contra-íons positivos (cátions) e
são denominados de trocadores catiônicos. Como características principais das
resinas encontram-se a não-solubilidade em água e em solventes orgânicos e
inorgânicos mais comuns. Possuem uma estrutura hidrofílica de forma regular e
reproduzível, rápida velocidade de troca e estabilidade física em termos de força
mecânica e resistência à atrição. As resinas, ao contrário do carvão ativo, podem ser
regeneradas com solventes polares como metanol, acetona e eletrólitos, inclusive a
água (HARLAND, 1994).
A capacidade de troca máxima das resinas é um parâmetro importante no
processo de troca iônica e varia segundo as características das resinas,
relacionando o tamanho dos poros e a área superficial com as características das
soluções a serem tratadas (densidade e viscosidade). Esta capacidade é
influenciada também pelos canais preferenciais que podem formar-se no leito das
resinas, pelo fluxo de alimentação empregado, pelas obstruções e pela eficiência da
regeneração (NÁPOLES et al., 1998).
As resinas de troca iônica são classificadas segundo os grupos ativos em,
catiônica ácido forte (fortemente ácida), catiônica ácido fraco (fracamente ácida),
aniônica base forte (fortemente básica) e aniônica base fraca (fracamente básica)
(Tabela 2.1). Segundo a estrutura polimérica, as resinas podem ser classificadas em
estirênicas (copolimerização de monômeros divinilbenzeno e de estireno) ou
acrílicas (copolimerização de monômeros divinilbenzeno e de ácido acrílico ou de
ácido substituído).
Tabela 2.1 Classificação das resinas de troca iônica em função do grupo funcional e da força iônica
Classificação Grupo funcional Forma iônica
Catiônica ácido forte -SO3- -SO3-H+ ; -SO3-Na+
Catiônica ácido fraco -COO- -COO-H+
Aniônica base forte TipoI -CH2N(CH3)3+ -CH2N(CH3)3+Cl-
Aniônica base forte Tipo II -CH2N(CH3)2(CH2CH2OH)+ -CH2N(CH3)2(CH2CH2OH)+Cl-
Aniônica base fraca -CH2NH(CH3)2+ -CH2NH(CH3)2+Cl-
30
A seletividade das resinas depende de fatores como a valência e o tamanho
do íon trocado, a forma iônica da resina, a força iônica total da solução,
entrecruzamento das resinas, o tipo de grupo funcional e a natureza dos íons não
trocados. A Tabela 2.2 apresenta a seletividade para cada um dos tipos de resinas,
de acordo com DANDEL e ANDEN (1989), citados por Harland (1994).
Tabela 2.2 Ordem de afinidade de diferentes resinas por íons em soluções diluídas (HARLAND, 1994).
Segundo Frazer e McCaskey (1989), o emprego de resina de troca iônica é o
processo que leva aos melhores resultados na conversão de substrato em produto
(96% do rendimento teórico). Além das resinas, estes autores obtiveram valores de
conversão de substrato em produto (Yp/S) em torno de 0,3 g/g, empregando carvão
ativo, etil-acetato, clorofórmio, tricloroetileno, benzeno e hexano, após neutralização
do hidrolisado com hidróxido de cálcio, indicando serem esses tratamentos
promissores para a remoção dos inibidores do metabolismo microbiano.
Dominguez et al. (1996) avaliaram a combinação de resina catiônica (DOWEX
50WX4) e neutralização com CaCO3 para tratamento do hidrolisado hemicelulósico
de bagaço de cana com vistas à obtenção de xilitol. Os resultados demonstraram
que o tratamento reduziu a atuação dos agentes tóxicos e favoreceu a formação de
xilitol, que aumentou de 10 g/L para 28 g/L em 96 h de fermentação com a levedura
mutante Candida sp 11-2, comparado ao tratamento em que se fez somente a
neutralização com CaCO3.
Kulkarni et al. (1998) utilizaram as resinas DUOLITE catiônica C-20 (H+) e a
aniônica A-368 (OH-) para purificação de xarope de D-xilose obtido de casca de
algodão em rama. Foram empregadas diferentes temperaturas (30, 40 e 50 oC) e
Resina Seletividade
Catiônica ácido forte Ag+>Cs+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+, Ba2+>Pb2+>Ag2+>Sr2+>Ca2+
Catiônica ácido fraco H+>>Cu2+>Pb2+>Ni2+>Co2+>Fe2+>Ca2+>Mg2+>Na2+>K+ > Cs+
Aniônica base forte
TipoI SO42->HSO4->I ->NO3->Br ->Cl ->HCO3->HSiO3->F ->HO-
TipoII SO42->HSO4->I ->NO3->Br ->Cl ->HCO3->HO->HSiO3->F -
Aniônica base fraca OH- >> SO42- > HSO4- > I - > NO3- > Br - > Cl - > F -
31
vazões de alimentação (5, 10 e 15 VL/h, VL/h: volume de leito por hora). Observou-se
que a temperatura de 30 oC e o fluxo de alimentação de 10 VL/h com a resina C-20
combinada com a resina A-368 a 40 oC e fluxo de alimentação de 15 VL/h, resultou
na remoção de 93,6% de fenóis e 100% da coloração. Segundo os autores o fluxo
de alimentação influencia na difusão das moléculas, porém a remoção dos fenóis
permaneceu com valores de 89,93, 90,97 e 92,97% para os respectivos fluxos de 5,
10 e 15 VL/h.
Nápoles et al. (1998) compararam o tratamento com carvão ativo e com uma
série de resinas de troca iônica catiônica e aniônica do hidrolisado hemicelulósico de
cana-de-açúcar concentrado 3 vezes. Obtiveram uma redução dos inibidores ácido
acético e fenóis de 15,2 e 54,7% usando carvão ativo e de 92,5 e 98,9% usando
resinas de troca iônica. Ainda obtiveram, com as resinas, um aumento de 36,5% na
conversão de xilose em xilitol e de 85,6% na produtividade em xilitol, em relação ao
tratamento com carvão ativo.
Nilvebrant et al. (2001) trataram hidrolisado de madeira com resinas de troca
iônica catiônica e aniônica para a produção de etanol. As resinas de troca aniônica
foram mais eficientes, removendo altas quantidades de fenóis, furanos, aldeídos e
ácidos alifáticos do hidrolisado, obtendo produtividade e rendimento em etanol de
1,71 g/L.h e 0,46 g/g, respectivamente. As resinas de troca catiônica apresentaram
rendimento similar (0,45 g/g), porém, baixa produtividade (0,65 g/L.h). Para o
hidrolisado não tratado a produtividade e rendimento obtidos foram de 0,21 g/L.h e
0,42 g/g, respectivamente.
Viñals (2001) utilizou diferentes resinas de troca iônica no tratamento do
hidrolisado hemicelulósico de bagaço-de-cana para obtenção de xilitol, e a máxima
produtividade volumétrica em xilitol e concentração de produto obtidas foram de
0,679 g/L.h e 25 g/L, respectivamente, quando utilizou a seqüência de resinas
aniônicas A-860S e A-500, seguida da catiônica C-150 e finalizada com a resina
aniônica fraca A-103S, todas da PUROLITE. Para esta condição de melhor
produtividade, obteve-se 100% na remoção de ácido acético, 100% na remoção de
furfural, 100% na remoção de hidroximetilfurfural, 86,44% na remoção de fenóis e
97,48% na remoção de cor.
Villarreal et al. (2006) estudaram dois métodos de destoxificação do
hidrolisado de aparas de eucalipto, um empregando carvão ativo e outro um sistema
de resinas de troca iônica para a produção de xilitol por C. guilliermondii. Os dois
32
tratamentos apresentaram melhoras na fermentabilidade do hidrolisado de aparas
de eucalipto, porém, o tratamento com resinas de troca iônica foi mais eficiente
proporcionando uma produtividade volumétrica (Qp) de 1,04 g/L.h e formação de
xilitol de 50,18 g/L, utilizando a seqüência de resinas Applexon catiônica, A-860,
C-150 e Applexon aniônica no hidrolisado concentrado até 80 g/L de xilose. Os
baixos valores dos parâmetros fermentativos obtidos com o tratamento com carvão
(Qp=0,25 g/L.h e xilitol 29,5 g/L) podem ser explicados pelo efeito dos inibidores,
que não foram removidos a um nível considerado não tóxico para a levedura
C. guilliermondii.
Garcia (2006) comparou dois métodos de destoxificação do hidrolisado
hemicelulósico de aparas de eucalipto nos parâmetros fermentativos para a
produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae. O autor concluiu que o
tratamento com resinas de troca iônica (seqüência A-860S, A-500, C-150 e A-103S)
foi mais eficiente que o tratamento com carvão ativo, pois removeu 100% dos
inibidores dosados, resultando numa produtividade de 2,8 g/L.h e uma formação de
produto de 29,80 g, enquanto que com o tratamento com carvão obteve-se
1,28 g/L.h e 15,8 g, respectivamente. Em estudo subseqüente, Rossi (2006)
constatou que a resina A-103S pode ser eliminada do processo de tratamento do
hidrolisado quando este for empregado para a produção de butanodiol em sistema
descontínuo alimentado.
Os métodos biológicos de tratamento envolvem o uso de enzimas específicas
ou microrganismos que agem sobre o composto tóxico presente no hidrolisado. A
utilização de microrganismos tem sido proposta para remoção seletiva de compostos
inibidores presentes nos hidrolisados hemicelulósicos (JÖNSSON et al., 1998;
SCHNEIDER, 1996).
2.1.3 Adaptação do microrganismo
Outra forma de minimizar o problema da toxicidade dos inibidores é a
utilização de células adaptadas (AMARTEY e JEFFRIES, 1996; FELIPE et. al., 1996;
FRAZER e McCASKEY, 1989; SENE, 2001). Este método é baseado em
fermentações sucessivas, onde o microrganismo de cada experimento é utilizado
como inóculo para o próximo ensaio. Frazer e McCaskey (1989) concluíram que a
adaptação possibilita obter um inóculo capaz de se desenvolver e produzir maior
33
quantidade de 2,3-butanodiol quando comparado com o inóculo obtido em meio
sintético. Além disso, estudos realizados com diversos inibidores oriundos do
processo de hidrólise ácida demonstram que pelo menos alguns desses compostos
podem ser metabolizados ou modificados por Klebsiella pneumoniae ou ter seu
efeito inibidor atenuado com o prolongamento do tempo de incubação (NISHIKAWA
et al., 1988). Frazer e McCaskey (1991) verificaram que os compostos fenólicos
seringaldeído e vanilina são os maiores inibidores do crescimento e da produção de
2,3-butanodiol.
Adaptação de células foi utilizada por Amartey e Jeffries (1996) na
bioconversão de hidrolisado de palha de milho por Pichia stipitis para produção de
xilitol, os quais destacaram a reciclagem de células adaptadas como a forma mais
econômica para aument