2003 A - 2008 A 395081088
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS
BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES
ESTANDARIZACIÓN DE UNA TÉCNICA DE IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE
LEVADURAS AISLADAS DE LA FERMENTACIÓN DE MEZCAL
TRABAJO DE TITULACIÓN EN LA MODALIDAD DE TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE LICENCIADO EN BIOLOGÍA
PRESENTA PATRICIA BERENICE RAMÍREZ RODRÍGUEZ
Las Agujas, Zapopan, Jal., de Abril 2009
o
Universidad de Guadalajara Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias
Coordinación de Titulación y Carrera de Licenciatura en Biología
1256/ C. e.BIOLOGÍA C. Patricia Berenice Ramírez Rodríguez
PRESENTE
Manifestamos a usted que con esta fecha ha sido aprobado su tema de titulación en la modalidad de: Tesis e Informes, opción Informe de Práctica Profesional: con el titulo: "Estandarización de una técnica molecular de identificación de levaduras aisladas de la fermentación de mezcal" para obtener la Licenciatura en Biología.
Al mismo tiempo le informamos que ha sido aceptado como Director I a de dicho trabajo el/la: Dra. Anne Christine Gschaedler Mathis y como asesor el /la Dr. Liberato Portillo.
Sin más por e! momento, le envío un afectuoso saludo.
ATENTAMENTE "PIENSA Y TRAB
Las Agujas,
DR. FRANCISCO ARTÍN HUERTA MARTÍNEZ PRESIDENT EL COMITÉ DE TITULACIÓN
M en C. GLORIA PARADA BARRERA SECRETARIO DEL COMITÉ DE TITULACIÓN
Dr. Feo. Martín Huerta Martínez. Presidente del Comité de Titulación. Licenciatura en Biología. CUCBA
Presente
Nos permitimos informar a usted que habiendo revisado el trabajo de titulación, modalidad tesis, opción tesis con el titulo: "ESTANDARIZACIÓN DE UNA TECNICA DE IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS AISLADAS DE LA FERMENTACIÓN DE MEZCAL" que realizó la pasante PATRICIA BERENICE RAMiREZ RODRÍGUEZ con número de código 395081088 consideramos que ha quedado debidamente concluido. por lo que ponemos a su consideración el escrito final para autorizar su impresión.
Sin otro particular quedamos de usted con un cordial saludo.
" ' ) Aten.tam921te •) , r:
C(1\l ,(1.c\ t..?, LCl•"'1·.;; 'Y Patricia Berenice Ramírez Rodríguez
Las Agujas, Zapopan .. 24 de marzo de 2009
Dra. Anne Christir;ie Gschaedler Mathis Directora del trabajo
~,,.¿ /(;;r:tt(i DR. Liberato Portillo Martínez
Ll .... -c .· O.F.B. Luis Eduardo Segura Garcia
Asesores
Nombre completo de los Sinodales asignados por el Comité Finna de aprobado de Titulación
Dra. Ofelia Vargas Ponce
Dra. Olivia Rodríguez Alcantar
Dra. Anne Marguerite Helene Santerre
Supl. Dra. Ana Lilia Vigueras Guzmán
· Fecha de aprobación
Tesis realizada en el Laboratorio de Biología Molecular del Área de Biotecnología del
CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.
Guadalajara, Jalisco, México.
Dirigida por: Dra. Anne Christine Gschaedler Mathis
(CIATEJ)
Asesorada por:
Dr. Liberato Portillo Martinez (CUCBA-UDG)
Q.F.B. Luis Eduardo Segura Garcia (CIATEJ)
1
AGRADECIMIENTOS
A CIATEJ por darme la oportunidad de realizar mi tesis en esta institución, lo cual contribuye en mi formación profesional. A CONACYT por el apoyo económico que recibí como estudiante de la tesis.
A la Dra. Anne Gschaedler por aceptarme en su proyecto como estudiante, y por enseñarme que hay momentos donde uno debe de resolver los problemas que se presentan solo. Por ser tan generosa, digna de ser un ejemplo de constancia y dedicación al trabajo en la investigación.
A mis sinodales por haber aceptado serlo. Y por todas las aportaciones que tan generosamente me sugirieron hacer al documento para el enriquecimiento del mismo.
A mi mejor amiga Sarai por estar siempre en !os mejores momentos de mi vida, a Luis Segura por todos los coscorrones que me dio, y por los que me perdonó, a Manuel Kirchmayr. por compartir los momentos donde parecía que no podría estandarizar !a técnica, a Alma por ser amiga a parte de compañera y a Memo por ser tan idealista y compartir sus ideas conmigo.
Al Dr. Rodolfo Hemández por todos sus consejos para mi formación como profesionista, a la Dra. Érika Flores Berrios por ser tan sincera y a veces dura, al Dr. Abe] por su buen humor siempre. al Dr. Ortuño por ser tan generoso y al Mtro. Melchor.
A mi queridísimo asesor Liberato por enseñarme que todos somos parte de este gran todo, a la Dra. Lilia por hacer lo difícil más fácil. a mis profesores Miguel Magaña, Miguel Vazquez, Héctor Romero. Sergio Guerrero, Miguel Carvajal y Arie! por ser tan buenos docentes y por confiar siempre en mí.
A Montse. Gaby. José 1nóvil, Pedro, Juve. Sergio. Gris. Alonso. Octavio y a mi querido amigo Julio.
2
RESUMEN
ABREVIATURAS
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE CUADROS
l. INTRODUCCIÓN
2. ANTECEDENTES
2.1 Agaves.
ÍNDICE
2.1.1 Generalidades del agave mezcalero.
2.1.2 Clasificación taxonómica de Agave salmiana Otto ex Salm.
2.1.3 Distribución.
2.1.4 Usos del Agave.
2.2 Producción de mezcal.
2.2.1 El mezca!.
2.2.2 Denominación de Origen y Nonna Oficial Mexicana.
2.3 Proceso de producción del mezcal.
2.3.1 Extracción de las piñas o cabezas de agave.
2.3.2 Cocción de las piñas.
2.3.3 Molienda.
2.3.4 Preparación de inóculo.
2.3.5 Fermentación.
2.3.6 Destilación.
2.4
2.4.1
2.4.2
2.5
Fermentación alcohólica.
Definición.
Microorganismos implicados.
Levaduras.
2.5. l Características generales y de interés económico.
2.5.2 Levaduras en la fermentación de bebidas alcohólicas.
2.5.2.1 Levaduras en vinos de uva.
2.5.2.2 Levaduras en la elaboración de la cerveza.
IV
V
VII
XI
3
3
3
3
4
5
6
6
6
8
8
8
9
9
10
10
10
10
11
11
11
13
13
17
2.5.2.3 Levaduras en bebidas destiladas del tequila y mezcal.
2.6 Métodos de identificación de especies de levaduras.
2.6.1 Importancia de la identificación.
2.6.2 Métodos tradicionales.
2.6.3 Métodos moleculares.
2.6.3.l Métodos basados en el análisis del genoma ribosomal.
2.6.3.2 Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP).
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
4. JUSTIFICACIÓN
5. HIPÓTESIS
6. OBJETIVOS
6.1 Objetivo genera!.
6.2 Objetivos específicos.
7. MATERIAL Y MÉTODOS
7.1 Método general.
7.2 Levaduras y medios de cultivo.
7 .2.1 Levaduras de colección de Italia.
7.2.2 Levaduras de inóculo de San Luis Potosí.
7 .2.3 Medios de cultivo.
7.3 Muestreo.
7.4 Identificación bioquímica.
7 .5 Identificación molecular.
7 .5.1 Extracción de ADN genómico.
7.5.2 Electroforesis en gel de agarosa.
7.5.3 Espectrofotometría a A= 260nm.
7.5.4 Amplificación de la región 5.8S ribosomal con iniciadores ITS.
7.5.5 Digestión enzimática.
8. RESULTADOS
18
19
19
19
21
21
24
27
28
29
30
30
30
31
31
32
32
33
34
35
36
37
37
38
38
39
41
42
11
8.1 Descripción morfológica de las cepas de levaduras en cultivo en placa. 42
8.2 Caracterización bioquímica. 44
8.3 Análisis molecular. 47
8.3.1 Extracción de ADN genómico. 47
8.3.2 Concentración y pureza de ADN.
8.3.3 Amplificación de la región ITSM5.8MITS2.
8.3.3.1 Amplificación de ADN.
8.3.3.2 Amplificación directa de las colonias.
48
51
51
52
8.4 Digestión enzimática. 53
8.4.1 Resultados de cepas SLP091007 aisladas de inóculo de San Luis Potosí. 58
9. DISCUSIÓN 61
10. CONCLUSIONES 64
11. LITERATURA CITADA 65
"'
RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue identificar levaduras aisladas del proceso
fennentativo del mezcal a nivel de especie, de una zona de San Luis Potosí (mezcalera
··La Perla .. ), mediante el empleo de una técnica molecular basada en el análisis del
polimorfismo de longitud de !os fragmentos de restricción (RFLP) del gen que codifica
para el ARN ribosomal 5.8s. Además, contribuir al conocimiento sobre las levaduras
que intervienen en la fermentación del mezcal e, implementar el análisis molecular
como un método confiable para la identificación de los microorganismos participantes.
Una vez realizada la amplificación del fragmento de! gen ITS l-5.8-ITS2. se realizó
la digestión con las enzimas de restricción Hha !, Hae 111 y Hin/ l. Se obtuvieron los
siguientes perfiles: siete grupos de levaduras diferentes. de !as cuales las siguientes
cinco se identificaron a nivel de especie: Kluyveromyces lactis. Pichia fi:rmentan,s.
Rhodo1orufa n1ucilaginosa. Saccharomyces cerevisiae y Hansen1'aspora guil!iermondii
y dos a nivel de género que fueron: Pichia e Issatchenkia.
El método de RFLP permitió identificar levaduras hasta nivel de especie con
95.455o/() y con 4.455o/() a nivel de género con los patrones de polimorfismo reportados
hasta el momento, y se consiguió establecer y estandarizar un protocolo corto para la
identificación de levaduras presentes en el inóculo muestreado.
IV
ATP
AFLP
APD
ARA
ADO
APIC
A
ADN
ADN~
CEL
C02
e •e DI
Dl
EDTA
ETS
GLJ
GL>
G
GAL
\:"O
ITS
JA
kb
LAC
_\<IDG
MAL
MLZ
mtDNA
·" NAG
nM
J\"TS
nAD;>;
02
PCR
PM
Pb
DGGE
PBS
RARP
RFLP
RAF
•pm
ABREVIATURAS
Adenosin tnti:;islato
Pohmortismo de la longitud de los fragmentos amph!icados
Agar papa dextrosa
L-Arabmosa
AOOmlOI
Prueba de 1dent1flcac10n automat1ca
Adenma
Ac1do desox1mbonucle1co
Ac1do desox1mbonucle1co nbos6m1co
D-celobiosa
D16x1do de carbono
C.tosma
Centigrados
l)om1mo 1
Dom1mo ~
Ac1do et1leno d1am1no tetraceuco
bpac1ador transcnb1ble externo
U-UIL1cosa
lilicerol
Guanina
D-Galacto>a
HorJ
lnosnol
l:spac1ador lrnnscnbcblc mterno
Agar Jugo de agave
Kilo bases
[)-Lactosa
:vtd1l-aU-<.ilucop1ranosKla
[)-Maltosa
D-Mclernosa
AON m1tocondnal
Molar
N-Acet1 l-Glucosam1na
Nanómetro
Espaciador no transcflb1ble
AüN nuclear
Oxigeno
Reacc•ón en cadena de la pollmerasa
Peso molecular
Pares de bases
Electrot0res1s en gel por gradiente desnaturahzante
Solución arnon1guadora de ti:lsfatos
Ampliticac1ón de secuencias repetidas aleatoriamente
Pollmortismos en la longitud de los fragmentos de restncc1ón
0-Rafinosa
Revoluciones por mmuto
V
AR.J-.:r
SLP
SAC
SOR
SDS
'PP TRE
TBE
T
TE
TAE
l'V
ufc/mL
WL
XYL
XLT
YPD
2KG
Ac1do desox1mbonucle1co nbosomal
San Luis Potosi
O-Sacarosa
D-Sorb1tol
D<;dec1I Sulfato de Sodio
Sin especies espect!icas
1)-Trehalosa
Tns-Borato-EDTA
Tris-EDTA
rns acetato- COTA
Ultravioleta
Unidades !Orrnadoras de colonia por m1illnro
Agar Walerstcm laboratono
0-Xylosa
Xylttol
Agar extracto de levadura peptona y dextrosa
2-ceio-Uluconato de calcio
VI
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura l. Especies de agaves utilizados para la elaboración de mezca\: Izq. Agave. 3
sa/miana Otto ex Salm-Dyck ssp crassispina (Trel.) Gentry (maguey verde o
mezcalero). Der. Agave angustifolia Haw. (maguey espadín).
Figura 2. Agave salmiana Otto ex Salm-Dyck ssp crassispina (Trel.) Gentry en 4
hábitat natural en San Luis Potosí, México. Foto Ran1írez-Rodríguez.
Figura 3. Número de especies de Agavaceae que se encuentran en cada Estado de 5
la República Mexicana (García-Mendoza. 1998).
Figura 4. Especies más utilizadas para la elaboración de mezcal: Agave 5
angusllfolia, A .. \·a/miana. A. tequilana. A. cupreata, A. karwinskii (CONABIO.
2005).
Figura 5. Estados de la República \!lexicana con denominación de origen Mezcal: 6
1) Durango. 2) Tan1aulipas. 3) Zacatecas. 4) San Luis PotosL 5) Guanajuato. 6)
Ciuerrero y 7) Oaxaca.
Figura 6. Piñas del Agave salnliana Ono ex Sa!in-Dyck ssp crassispinu (Tre!.) 8
Gentry utilizadas para la producción de 1nezcal.
Figura 7. Horno de mampera en el cual se cocen las piñas para el proceso del 8
mezcal en San Luis Potosí.
Figura 8. Molino de piedra para la trituración del agave cocido. 9
Figura 9. Tinas con inóculo para !a fermentación del mezca\ en San Luis Potosí. 9
Figura 10. Tina de fermentación para proceso del mezcal de San Luis Potosí. 11
Figura 11. Levaduras aisladas del proceso fermentativo de San Luis Potosí: Izq. 11
Rhodotorula mucilaginosa. Der. Saccharomyces cerevisiae.
VII
Figura 12. Esquema de la estructura nuclear de AONr. 21
Figura 13. Galería APJ 20 C AUX (bioMérieux) con 20 cúpulas con sustratos 36
deshidratados: O-glucosa. gliceroL 2-ceto-gluconato cálcio, L-arabinosa, D-Xylosa.
Adonitol, Xylitol, O-galactosa, Inositol, 0-sorbito!, Metil-a:D-Glucopiranosida. N
Acetil-Glucosamida, 0-celobiosa. O-lactosa, D-ma!tosa, O-sacarosa, D-trehalosa.
0-melezitosa y D-rafinosa.
Figura 14. Aspecto de las colonias de !evaduras cultivadas en medio WL. 1: 42
levaduras del grupo 1: 2: levaduras del grupo 11; 3: levaduras del grupo lll; 4:
levaduras de! grupo IV: 5: levaduras del grupo V; 6 lcvaduras antes del aislamiento
por grupos.
Figura 15. Gel de electroforesis con el perfil de migración de la extracción del 47
ADN de las cepas aisladas del proceso fennentativo de 1nezcal de San Luis Potosí.
Carriles 1-20: (A, B. CD. E. F. G. H. L J_ K. M. N, O. P, R, S. T y U).
Figura 16. Gel de electroforesis con el perfil de migración de la extracción del 47
ADN de las cepas aisladas del proceso fermentativo de mezcal de San Luis Potosí
y colección de Italia. Carriles 1-20: (V, \V. X. Y. Z. A!. B l. C L O l. El, l. 2. 3. 4.
6.9. I0, 12y 13).
Figura 17. Gel de electroforesis con el perfil de migración de la extracción de 47
ADN de cepas de colección de Italia. Carriles 1-11: (15. 17.18, 19. 20. 21. 25, 26.
28. 29 y 33).
Figura 18. Gel de electroforesis para visualizar la amplificación de la región ITSl- 51
5.8S-ITS2 de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-19:(Al, E, F, K, L, R, S, CI,
G, H, O, V, Z DI, El, I, J y M). Carriles M indican: marcador de peso molecular
de 100 pares de bases.
Figura 19. Ge! de electroforesis para visualizar la amplificación de la región ITSl- 52
VIII
5.8S-JTS2 de las cepas de San Luis Potosí. Carrilesl-9: (N, P, U, X, Y, T, W, A y
B 1 ). Carril M indica: marcador de peso molecular de l 00 pares de bases (MPM).
Figura 20. Gel de electroforesis para visualizar amplificación a partir de colonias 52
de cepas representativas de cada grupo de San Luis Potosí. Carriles 2-6: (E, Cl, !,
W y U). Carriles l y 7 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases
(MPM).
Figura 21. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha l, Hae III y HinfI 53
de cepas de San Luis Potosí. Carriles 1-19: (A l. E, F, K, L y B). Carriles 4 y 20
indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).
Figura 22. Gel de electroforesis de digestión con enzima Hha 1, Hae JI! y Hinfl de 53
las cepas de San Luis Potosí. Carriles 1-19: (R, S, SLP2, SLP5. SLP8 y SLP15).
Carriles 4 y 20 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).
Figura 23. Gel de electroforesis de digestión con enzima Hha l. Hae 111 y !iinfl de 54
cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-13: (CL G. H y Z). Carril l indica: marcador
de peso molecular de 100 pares de bases (MP.M). E! recuadro marcado con rojo
señala la banda que diferencia las cepas de la posible especie Pichia
men1branaefanciens y las cepas de Pichiafermentans.
Figura 24. Ge! de electroforesis de digestión con enzimas Hha l. Hae 111 y Hinfl 55
de las cepas de San Luis Potosí. Carriles J-6 y 9-26: A, DI, V, O, SLPl. SLP4.
SLPJ J y SLP12. Carriles 7, 8 y 27 indican: marcador de peso molecular de 100
pares de bases (MPM).
Figura 25. Gel de electroforesis con digestión con enzimas Hha I, Hae 111 y Hinfl 55
de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-10: El, SLP14 y V./. Carril !indican:
marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).
Figura 26. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha I, Hae III y Hifl de 56
las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-19: N, J, C, Y, T y SLP6. Carriles l y 20
IX
indican: marcador de peso molecular de l 00 pares de bases (MPM).
Figura 27. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha 1, Hae III y Hinf I 56
de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2, 3, 4, 5, 6 y 7: SLP9 y SLP13 y carriles
13,14,15, 16, 17 y 18: I y M. Carriles 1, 9 y 19 indican: marcador de peso
molecular de l 00 pares de bases (MPM).
Figura 28. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha I, Hae IJI y Hinfl 57
de cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-19: P, U, X, D, SLP7yB1. Carril 1 indica:
marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).
Figura 29. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hhaf, Haelll y Hinfl con 58
!a cepa de San Luis Potosí. Carriles 1-3: SLP3
X
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro l. Levaduras presentes en las etapas de fennentación del jugo de uva. 14
(Tomado de Romano y col., 2006).
Cuadro 2. Papel bioquímico y efecto causado por levaduras en vino. (Tomado de 14
Romano y col., 2006).
Cuadro 3. Levaduras presentes en la fermentación de la cerveza. (Tomado de 17
Romano y col., 2006).
Cuadro 4. Levaduras de bebidas destiladas elaboradas con agave. (Tomado de 18
Lappe y col.. 2008; Esca!ante-Minakata y col.. 2008; Romano y col., 2006).
Cuadro 5. Técnicas moleculares para la identificación y caracterización en 22
levaduras. (Tomado de Fernández-Espinar y col., 2001 ).
Cuadro 6. Trabajos que utilizan métodos moleculares de identificación y 23
caracterización en levaduras.
Cuadro 7. Levaduras aisladas identificadas por técnica de análisis de restricción de 25
los fragmentos.
Cuadro 8. Colección de Italia, de cepas utilizadas como control positivo para la 32
identificación.
Cuadro 9. Levaduras de mezcalera La Perla (inóculo) 040907SLP, 091007SLP y 33
SLP091007.
Cuadro 10. Reactivos para medios de cultivo. 34
Cuadro 11. Cajas petri con diluciones de jugo de agave con agua fisiológica. 35
Cuadro 12. Procedimiento para inocular galería API 20 C. 36
XI
Cuadro 13. Equipo y reactivos para la extracción de ADN. 37
Cuadro 14. Descripción morfológica de los grupos de las levaduras de SLP en 43
medio WL.
Cuadro 15. Perfiles bioquímicos de las colonias por galerías API 20 C 44
(bioMérieux).
Cuadro 16. Levaduras identificadas por prueba bioquímica (galerías API 20 C). 45
Cuadro 17. Espectrofotometría de levaduras de la colección de Italia y San Luis 48
Potosí, los números indican las muestras de la colección de Italia y las letras las
cepas de San Luis Potosí.
Cuadro 18. Tamaño del amp!icón y de Jos fragmentos de digestión de [as cepas del 54
Grupo 1: AL E, F, K. L, B, R. S. SLP2. SLP5. SLP8 y SLP15.
Cuadro 19. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestion de las cepas del 54
Grupo 11 a: CI, G, H y Z.
Cuadro 20. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestion de las cepas del 55
Grupo 11 b: cepas A, DI, V, O, SLPI, SLP4, SLPI 1 y SLP12.
Cuadro 21. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestion de las cepas del 56
Grupo lll: El, W y 14.
Cuadro 22. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestion de las cepas del 57
Grupo IV: N, J, C, Y, T, 1, M, 6, 9 y 13.
Cuadro 23. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestion de las cepas del 57
Grupo V: P, U, X, D, 7 y Bl.
XII
Cuadro 24. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestion de las cepas del 58
Grupo Grupo VI: cepas SLP3.
Cuadro 25. Referencia de los articulos publicados con los que se compararon las 59
cepas para la identificación de levaduras.
Cuadro 26. Tamaño de pares de bases (pb) de los productos de PCR y fragmentos 60
de restricción.
XIII
INTRODUCCIÓN
En México existe una amplia gama de bebidas alcohólicas que se obtienen por
medio de la fermentación de maíz y de algunas especies de agaves. Entre éstas y
dependiendo de la región, las de mayor tradición, son el pulque, mezcal, tepache,
tejuino y curados; muchas de ellas, han sido consumidas desde la época prehispánica
(García-Mendoza, 1998).
En los últimos años, las bebidas destiladas de agave se han revalorado como bebidas
tradicionales de importancia cultural y económica. Éstas son obtenidas a partir de
mostos fermentados de diferentes especies de agaves. Las presentaciones más comunes
son el tequila, mezcal, bacanora y raicilla (Lachenmeier y col.. 2006).
En generaL el proceso de elaboración de estas bebidas es muy similar. Se basa en la
cocción de las piñas de agave para hidro!izar los fructanos y generar azúcares simples
como fructosa y glucosa: y en !a molienda de las piñas cocidas para obtener el jugo
(mosto). El mosto es sometido a fermentación (los azúcares son convertidos a etanol y a
otros compuestos organolépticos como ésteres. ácidos orgánicos. alcoholes superiores y
otros metabolitos) y finalmente a destilación. En algunos casos la bebida resultante se
añeja o reposa.
La fermentación es un proceso bioquímico donde participan microorganismos que
emplean el mosto como sustrato para sus necesidades metabólicas. La calidad del
mezcal está relacionada con la microbiota involucrada (levaduras y bacterias). que
determinan !as características del producto final. Las levaduras tienen importancia
económica dado el papel que cumplen en la producción de esas bebidas alcohólicas.
Para detenninar las características particulares de una bebida, es necesario reconocer
que microorganismos intervienen en el proceso. Para este reconocimiento se han
empleado técnicas clásicas que se basan en la descripción morfofisiológica de especies
y géneros, éstas dependen de las condiciones de cultivo de las cepas lo que puede
ocasionar errores en la determinación taxonómica, tales como dualidad en la
nomenclatura.
1
Se ha demostrado que las técnicas moleculares son eficaces para llevar a cabo
identificaciones confiables y contribuyen a la solución de este problema. Esteve
Zarzoso y col. (1999) utilizaron la técnica molecular del análisis de polimorfismo de
longitud de los fragmentos (RFLP) para identificación de levaduras en vino
reconociendo obtuvo 132 especies.
El objetivo de este trabajo fue identificar levaduras aisladas del proceso
fermentativo del mezcal, de una zona de San Luis Potosí. Mediante el empleo de una
técnica molecular basada en el análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos
de restricción (RFLP), Así como, contribuir al conocimiento de levaduras que
intervienen en la fermentación del mezcal e, implementar el análisis molecular como un
método confiable para la identificación de los microorganismos participantes.
Este estudio fue realizado dentro del proyecto de .. Diversidad y Actividad de las
Comunidades Microbianas Asociadas al Proceso Fermentativo del Mezcar. Financiado
por el fondo SEP-CONACYT.
2
2. ANTECEDENTES
2.1. Agaves
2.1.1. Generalidades del agave mezcalero
Los agaves mezcaleros son aquellos magueyes utilizados para la producción de
bebidas alcohólicas destiladas (Blomberg, 2000). Junto con las yucas o izotes y amoles
pertenecen a la familia Agavaceae. Son plantas suculentas típicas de las zonas
semiáridas de México con gran importancia biológica, ecológica y económica para el
país (García-Mendoza y Galván, 1995) (Figura 1 ).
f igura l. Especies de agaves uti lizados para la elaboración de mezcal: Izq. Agal'es salmiana Ouo e:-. Salm-Dyck ssp crassispisna (Trel.) Gentry (maguey verde o mezcalero) Der. Agave angustifolia lla\\ . (maguey espadín).
2.1.2. Clasificación taxonómica del Agave salmiana Otto ex Salm-Dyck
Gentry ( 1982) reconoce dos subgéneros Agave y Liuaea. El subgénero Agave
está dividido en doce grupos con 83 especies. Agave. salmiana ha sido clasificado
dentro del grupo Salmianae.
Del A. salmiana, se producen varias bebidas alcohólicas, entre ellas el
mezcal, y el pulque que es obtenido a partir de la fermentación del aguamiel. Sin
embargo, en la actualidad tienen mayor consumo las bebidas obtenidas de la destilación
de los fermentos (Figura 2) (García-Mendoza, 1998).
3
Figura 2. Agave salmiana Ono ex Salm-Dyck ssp crassispina (Trel.) Gentry en hábitat natural en San Luis Potosí. México. Foto Ramirez-Rodriguez.
2.1.3. Distribución del género Agave
Maguey verde ó mezcalero
Agave salmiana Clasificación cientifica
Reino: Subreino: División: Clase: Orden: Familia: Género: Especie:
Plan tac Embryobionta Magnoliophyta Liliopsida Liliales Agavaceae Agave salmiana Ono Ex Salm ssp crassispina (Trel) Gentry.
El género Agave está constituido por aproximadamente 200 especies de las
cuales 150 existen en México, con una amplia distribución ya que se encuentra en más
de 75% del territorio (Figura 3). En México hay regiones que poseen más especies que
otras; tienen mayor presencia en las provincias áridas y semiáridas del centro y norte.
Su número disminuye drásticamente hacia las provincias húmedas y cálidas del sur, por
lo que su ausencia es notoria en estados como Tabasco, Campeche y Quintana Roo. Son
abundantes en las provincias tlorísticas de las Serranías Meridionales del centro de
México y Sierra Madre Oriental (García-Mendoza, 2002).
En lo que se refiere a la especie de interés para este trabajo (A. salmiana) se
presenta en las tierras altas del centro de México. Generalmente en elevaciones entre
5,000 y 8,000 pies ( l ,520-2,460 msnm) (Gentry, 1982).
4
Fig ura 3. Número de especies de de la familia Agavaceae que se encuentran en cada estado de la República Mexicana (García-Mendoza 1998).
2.1.4. Usos del Agave
En la actualidad en México aún se señalan más de 70 fo rmas de empleo en los
magueyes. entre ellas la elaboración de fibras textiles, papel, forraje, delimitación de
terrenos y parcelas, med icinal, re ligioso. plantas ornamentales y bebidas fermentadas
(como el pulque), bebidas destiladas (Figura 4) (como el tequi la y el mezcal) (García
Mendoza, 1998; Gallardo y col., 2008) .
• Figu ra 4. Especies de Agave más utilizadas para la elaboración de mezcal: A. angusrifolia, A. salmiana, A. tequilana, A. cupreata, A . korwinskii (CONABIO, 2005).
5
2.2. Producción de mezcal
2.2.1. El mezcal
La palabra mezcal proviene del náhuatl mexcalli, que significa maguey cocido.
El mezcal es una bebida alcohólica destilada que se obtiene de la fermentación de las
cabezas o piñas de la planta de agave (Aguirre-Rivera y col., 2001 ). Para su elaboración
pueden utilizarse las diferentes especies de Agave, que se encuentran en los estados de
la República Mexicana. Las diferencias organolépticas entre los mezcales radican en las
especies utilizadas para su elaboración y en la forma artesanal o semi-industrial de
obtención del producto.
2.2.2. Denominación de Origen Mezcal y Norma Oficial Mexicana
La Denominación de Origen Mezcal fue publicada el 28 de noviembre de 1994,
en el Diario Oficial de la Federación (D.O.F.). En el que se estableció como región
geográfica la comprendida por los estados de Oaxaca, Guerrero. Durango, San Luis
Potosí y Zacatecas. En 2001 se incorporaron algunos municipios de Guanajuato y en
2003 otros de Tamaulipas (Figura 5). La denominación ind ica el lugar geográfico de un
país para designar un producto originario, cuyas características se deben exclusivamente
a ese med io geográfico, resultado de factores naturales y humanos.
Figura S. Estados de la República Mexicana con Denominación de Origen Mezcal: 1) Durango. 2) Tamaulipas, 3) Zacatecas. 4) San Luis Potosi, 5) Guanajuato, 6) Guerrero y 7) Oaxaca.
6
La Norma Oficial Mexicana aplicable y vigente (NOM-070-SCFI-1994),
publicada en el D.0.F. el 17 de agosto de 1994, establece las características y
especificaciones que deben cumplir los usuarios autorizados para producir y/o
comercializar mezcal, donde especifica las principales especies utilizadas para la
elaboración:
> Agave angustifolia Haw.
> Agave esperrima Jacobi
> Agave weberi Cels ex Poisson
> Agave potatorum Zucc
;;.. Agave salmiana Otto ex Salm ssp crassispina (Trel.) Gentry
También se pueden utilizar otras especies de agave. siempre y cuando no sean
utilizadas como materia prima para otras bebidas con denominaciones de origen dentro
del mismo estado. Además. se protege a los productores de bebidas elaboradas mediante
la destilación de magueyes de las especies mencionadas. La norn1a tainbién establece el
porcentaje de los carbohidratos provenientes del agave que deben utilizarse en !a
elaboración de! mezcaL !os cuales se clasifican en:
Tipo 1.- Mezcal 1 OOo/o agave es aquel producto que se obtiene de la destilación y
rectificación de mostos preparados directa y originalmente con los azúcares de las
cabezas maduras de los agaves. previamente hidrolizadas o cocidas y sometidas a
fermentación alcohólica con levaduras. cultivadas o no. Este tipo de mezcal puede ser
joven, reposado o añejo y susceptible de ser abocado (procedimiento para suavizar e!
sabor).
Tipo IJ.- Mezcal es aquel producto que se obtiene de la destilación y rectificación de
mostos en cuya formulación se han adicionado hasta un 20o/o de otros carbohidratos
permitidos, este tipo de mezcal puede ser joven, reposado o añejo y susceptible de ser
abocado.
7
2.3. Proceso de producción del mezcal en el estado de San Luis Potosí
El proceso de producción de esta bebida consta de varios pasos básicos, cuyos
detalles pueden variar de una mezcalera a otra, o de un estado o región a otra. El
procedimiento general es el siguiente:
2.3.1. Extracción de la piña: Como materia prima se emplean tallos de plantas
maduras (6-1 O años), desprovistos de sus hojas y raíces, a los que se les
llama piñas o cabezas (Figura 6).
Figura 6. Piñas del Agave salmiana Otto ex Salm-Dyck ssp crassispina (Trcl.) Gentry utilizadas para la producción de mezcal.
2.3.2. Cocción de las piñas: Se realiza durante un día en hornos de piedra
calentados con leña. En esta etapa es donde se hidrolizan los azúcares de
los agaves principalmente a fructosa (Figura 7).
Figura 7. Homo de mampera en el cual se cocen las pin:is para el proceso del mezcal en San Luis Potosí.
8
2.3.3. Molienda: Las cabezas se desmenuzan en pedazos con una hacha y se
pasan a l molino llamado tahona (molino chileno), usando una rueda,
movida por un animal de carga. Esta trituración permite que los
monosacáridos obtenidos de la cocción sean disponibles a la acción
microbiana. El agave molido o pulpa se coloca en tinas de fermentación
(Figura 8).
Figura 8. Molino de piedra para la trituración del agave cocido.
2.3.4. Preparación de inóculo: El j ugo de agave es colocado en contenedores
para que se inicie el proceso de fermentación (Figura 9).
Figura 9. Tinas con inóculo para la fermentac ión del mezcal en San Luis Potosí.
9
2.3.5. Fermentación: Es el proceso de transfonnación de los azúcares en
alcohol etílico. Se deposita el inóculo en las tinas de fennentación, dura
alrededor de 17 h para el caso de San Luis Potosí (Figura 1 O).
Figura 1 O. Tina de fermentación del proceso del mezcal de San Luis Potosi.
2.3.6. Destilación: Concluida la fermentación se pasan los jugos a destiladores,
de cobre o de barro llamado alambique que consta de tres partes: la olla o
la caldera, donde se deposita el mosto para su calentamiento; la columna,
que recoge y conduce los vapores, y e l serpentín de enfriamiento, en donde
de condensan los vapores. Aquí se efectúa la separación del alcohol del
agua por medio de sus diferentes puntos de ebullición. Debido a su
estructura molecular el etanol, tiene un punto de ebullición más bajo que el
agua (78.5° Ca nivel del mar).
2.4. Fermentación alcohólica
2.4.1. Definición
Es un proceso biológico originado por la actividad de algunos microorganismos
que procesan los hidratos de carbono (glucosa, fructosa, sacarosa o almidón), para
obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (CH3-CH2-0H), dióxido
de carbono (C0 2) en forma de gas y unas moléculas de ATP que consumen los propios
microorganismos en su metabolismo celular energético anaeróbico. El etanol resultante
se emplea en la elaboración de bebidas alcohólicas.
10
2.4.2. Microorganismos implicados
La fermentación alcohólica es realizada por microorganismos como levaduras y
algunas clases de bacterias. Las levaduras son el grupo más importante que se explota
para los propósitos comerciales; se han utilizado por milenios en la fabricación de pan y
en la producción de bebidas alcohólicas. La d iversidad de las bebidas fermentadas que
se producen a través del mundo, varía según su área geográfica y cultural. Sus
características individuales y pecul iares determinadas por la expresión de la
biodiversidad de los microorganismos que están presentes en el mosto, de los cuales se
van se leccionando aquellos que son más competitivos en cada fase de la fermentación
(Pretorius, 2000).
2.5. Levaduras
2.5.1. Características generales y de interés económico
Las levaduras son hongos microscópicos unicelulares, se clasifican dentro el
reino Fungi. Una levadura se define como un hongo basidiomiceto o ascomiceto que se
multiplica de manera vegetativa, principalmente por gemación o fisión y que no
presenta durante su fase sexual cuerpos fructíferos internos o externos (Kurtzman y
Ronen, 1998) (Figura 11 ).
Figura 1 J. Levaduras aisladas del proceso fermentativo muci/a inosa. Der. Saccharom ces cerevisiae.
11
La taxonomía de levaduras ha transitado por dos períodos. El primero
caracterizado por estudios de morfología comparativa, fisiología y genética
convencional. El segundo, que se extiende hasta la actualidad, identificada por una
ampliación en los estudios de morfología a nivel ultramicroscópico, la aplicación de
criterios bioquímicos e introducción de los estudios de la biología molecular.
Las levaduras han colonizado una gran parte del planeta, se pueden aislar del
aire, agua y tierra. Dependen de la presencia de una forma orgánica de fuente de
carbono, por ejemplo: azúcares simples, ácidos orgánicos y grasos, alcoholes alifáticos,
etcétera. No poseen capacidad de desplazamiento por sus propios medios, por lo que
dependen de vectores como el viento, los animales (principalmente los insectos) o la
misma actividad humana (Frazier y Westhoff, 1993). En el caso de la elaboración de
bebidas alcohólicas, provienen de dos hábitats diferentes: las materias primas
(principalmente vegetales) y las fábricas donde éstas se procesan.
Los dos principales géneros de levaduras de interés comercial son C'andida y
Saccharomyces. Especialmente S. cerevisiae y especies cercanas han sido empleadas en
la panadería y producción de alcohol (Cavazzan. 1985).
El impacto de las levaduras en e! alimento y la producción de la bebida se
extienden más allá de las nociones originales de las fermentaciones del pan, cerveza y
vino con S. cerevisiae. En un contexto positivo, contribuyen a la fermentación de una
amplia gama de otras materias, donde varía la especie de levadura que puede trabajar en
conjunto con bacterias y hongos filamentosos.
La importancia comercia! de la comunidad de las levaduras en la producción de
bebidas y alimentos es: la elaboración de fermentos, fabricación de ingredientes y
aditivos para la industria alimenticia, desperdicio de productos de aliment.ación y
bebidas, fuente de levaduras oportunistas patógenas, probióticos y agentes terapéuticos
(Fleet, 2006).
12
2.5.2. Levaduras en la fermentación de bebidas alcohólicas
La implicación de las levaduras en la fennentación alcohólica es fundamental,
ya que este proceso es realizado y completado por un número limitado de cepas
dominantes asociadas a un número variable de cepas secundarias, donde va
aconteciendo una sustitución secuencial de cepas durante la fennentación. En la medida
que ésta va progresando, los niveles de alcohol aumentan, centrándose en Ja especie
dominante y su efecto sobre la calidad del producto (Capello y col., 2004).
En este contexto, resulta necesario conocer las relaciones ecológicas que se
establecen en cada fase, tomando en consideración que existe un gran número de
especies de levaduras que se diferencian por su aspecto, sus propiedades, sus modos de
reproducción y por !a forma en Ja que transforman el azúcar.
2.5.2.1. Levaduras en vinos de uva
Las levaduras del vino pertenecen a una docena de géneros, que incluyen varias
especies como: Saccharon1yces ellipsoideus. K!oeckera apicu!a1a y Hanseniaspora
11varun1. las cuales representan el 90o/o de las levaduras utilizadas para la fermentación
de! vino, que se encuentran en su etapa inicial en bayas maduras de la uva. Los cuadros
1 y 2 muestran las levaduras que se encuentran implicadas en la fermentación del jugo
de uva y sus efectos al producto.
13
Cuadro l. Levaduras presentes en las etapas de fennentación del jugo de uva (Tomado de Romano y
col.. 2006).
Levaduras más abundantes en la primera etapa
de la fermentación
Saccharomyces ef/ipsoideus, Kloeckera apiculata,
Hanseniaspora uvarum en 90o/o de las bayas
maduras
Levaduras más abundantes en la etapa
intermedia de la fermentación
Hanseniasporu. l\./oeckera. Candida. Pichiu.
l\.h(vrerontvces: /'vlelschnikowia
Levaduras más abundantes en la etapa final de
la fermentación
Saccharomyces sensu stricto (S cerevisiae, S.
paradoxus, S. bayanus y S. pastorianus)
Levaduras menos abundantes en la primera
etapa de la fermentación
Candida spp. Brettanomyces spp. Cryptococcus,
Kfuyveromyces. Metschnikowia spp. Pichia spp,
Hansenu/a spp. Rhodotorula spp
En bayas inmaduras predominado
Rhodotorula, Cryptococcusy Candida con la
levadura-como hongo Aureobasidium pullu!ans
Las poblaciones de S. cerevisiae son bajas al
inicio de las fermentaciones
Levaduras menos abundantes en la etapa
intermedia de la fermentación
//anseniaspora. l\.loeckera. Candida. Piclua,
Kfuyreromyce.1· J . .\1etschnikowia. comienzan a
disminuir cuando la producción de etanol excede
de 5-7%
Levaduras menos abundantes en la etapa final
de la fermentación
Breuanomyces, Kluyveromyces.
Schi:osaccharomyces, Torulaspora y
Zygosaccharomyces
Son más tolerantes al etanol y más competitivas Pocas veces se ha informado su presencia ya que
para el crecimiento en medios con e! alto contenido su crecimiento es más lento en comparación con la
del azúcar. se convierten en predominantes y de otras levaduras o por la producción inhibitoria
complementan la fermentación de otros factores de levaduras
14
Cuadro 2. Papel bioquímico y efecto causado por levaduras en vino. (Tomado de Romano y col., 2006).
Levaduras
Hanseniaspora-Candida
S cerevisiae. S. paradoxus. S. bayanus y S
pastorianus
Brertanomyces, K!uyveromyces.
Schi::osaccharomyces. Torulaspora, y
Z;-gosaccharomyces
C. apiculato
S. cererisiae
;.:_ apiculata:: H uvarum ·H_ pu/cherrimo. A
apicu/ura y /i 111·ar11111
Cepas Kiiler de S cerevisiae
Cepas Killer Candida, Pichia y Hanseniaspora
Candida, Debaryomyces, Hanseniaspora,
Kloeckera, Hansenu!a, Metschnikowia, Pichia.
Schi::osaccharomyces, T onilaspora y
Zygosaccharomyces
Efectos y papel bioquimico
Contribución al sabor del vino
Complementan la fermentación. Características
enológicas
Afectan !a cinética de levaduras no-Saccharomyces
así como e! metabolismo de Saccharomyces
Influyen negativamente en la calidad sensorial
Produce glicerol. ésteres y acetona.
\1ejora el aroma en el vino
Producción de etanol
Afecta el crecimiento de levaduras no
.\'aa·hm·on1y,·es
U etanol determina b viscosidad del vino:: lH;túa
como fijador de aroma
Produce tiamina )' sustancia~ nutritivas.
Actividad proteolitica. Provoca crecimiento
deficiente de S cerevisiae. además generan
aminoácidos útiles para S. cerevisiae
Secreción de toxinas polipeptídicas. reprimen la
microflora indígena de no-Saccharomyces y S
cerevisiae dominando la fermentación
Ejercen acción inhibitoria contra cepas de vino de
S cerevisíae
Pectinasa, proteasas, glicosidasas, esterasas.
Contribución a la formación del color, aroma y
sabor
15
Candida, Debaryomyces,
Hanseniaspora Kloeckera, Kluyveromyces,
Afetschnikowia. Pichia. Saccharomycodes,
Schi=osaccharomyces y Zygosaccharomyces
K. apicufata y H. gui!/iermondii
Actividad ~glicosidasa
Características y sabor del vino
Glicerol, ácido acético, alcoholes, alcoholes
superiores, acetaldehído, acetona y acetato de eti!ío,
otorgan características enológicas siendo el glicerol
el que contribuye al dulzor, cuerpo y plenitud del
vino
16
2.5.2.2. Levaduras en la elaboración de la cerveza
Como en el vino, las levaduras de la cerveza están involucradas en la
fennentación del mosto en el cual las cepas cerveceras son las que varían las
propiedades tecnológicas de la bebida, incluyendo producción de aroma, velocidad,
grado de atenuación, floculación y requerimiento de oxígeno (Cuadro 3).
Cuadro 3. Levaduras presentes en la fermentación de la cerveza. (Tomado de Romano y coL, 2006).
En la fcnnentación de la cerveza están implicadas dos tipos de levaduras Saccharomyces lager y Sale,
ambas especies pertenecen Saccharomyces sensu stricto
S. ale
S. !oger
Saccharomyces y no-Saccharomyces (levaduras
salvajes)
Breffanomyces. Candida, DebOl}'omyces.
Fi!obasidium. Hanseniaspora. K!uy;eromyces.
Torulaspora y Z..vgosaccharomyces, Pichia
membranifaciens y P. anoma!a
Las levaduras P. membramfanfciem
Los géneros Pichia. Hansenula y Debaryomyces
En la superficie de la fermentación
Crecimiento a 37 ºC
F crmentadoras del fondo
Fermenta melibiosa
Crecimiento a -37 ºC
Se C()noccn como S car/sbergensis. S uvarum y S
Ci!/"i!l'/.\/01!
Recientemenk se clasilican como S pus1orian11s
Contaminantes en el proceso de elaboración.
Causantes de malos gustos feno!icos al tinal de la
fermentación idcscarboxilan diversos ácido~
fenolicos)
Producen etanol y carbohidratos
Produce desperdicios. la película. la calina y malos
gustos tales como fenoles. esteres y notas ácidas
Son asociadas con condiciones aerobias. aunque
son capaces de crecimiento anaerobio
17
2.5.2.3. Levaduras en bebidas destiladas del tequila y mezcal
Las levaduras Saccharomyces y no-Saccharomyces aisladas de la uva y del
agave, han revelado una correlación entre la aptitud tecnológica de las cepas y el origen,
explicados como condiciones especificas a las adaptaciones de Ja fermentación, que
determinan probablemente diversas características enológicas y fisiológicas. El cuadro 4
muestra levaduras involucradas en la fermentación de bebidas destiladas del agave.
Cuadro 4. Levaduras de bebidas destiladas elaboradas del agave. (Tomado de Lappe y col.. 2008:
Escalante-Minakata y col., 2008 y Romano y col.. 2006).
Levaduras
·Vo-Saccharomyces: (Candida spp., C magnolia. C
parapsilosis. C krusei. Hanseniaspora guillermondii. H
uvarum, f/. vinae K/uyveromices marxianus. Pichia
membranifaciens. Torulaspora de!brueckii,
/Jebaryomyces hansenii. C/avispora /usitaniae)
Pichiafermen/as )) Klr~Vl'eromyces marxion11s
Candida krusei Cundida magnolia. K/11yveromy(:e.'
l!fricamrs
Soccharomyces. S. cerevisiae
Productos y efectos
Etanol. ácidos orgánicos. esteres, terpenos.
furanos. compuestos nitrogenados. aceite
combustible. hidrocarburos y cetonas
Desempeñan un papel importante en las
primeras etapas de la fermentación. en la
generacion de compuestos volátiles que
participan en el perfil arom:ltico del
producto !inal
Resistencia al etanol y sulfato lo cual
permite una fermentación más eficiente
Producen alcohol
18
2.6. Métodos de identificación de especies para levaduras
2.6.1 Importancia de la identificación
La identificación de levaduras hasta nivel de especie es necesaria para generar
conocimiento sobre la biodiversidad, y por su aplicación industrial, así como por el
interés económico y cultural. Estos organismos forman parte de la microflora natural
presente en los alimentos y bebidas fermentadas y/o participan en los respectivos
procesos de la obtención de estos.
Respecto a las bebidas alcohólicas, es de fundamental relevancia la presencia de
tantas especies en la fennentación para !a elaboración, en este caso específico del
mezcal. que deja entrever la complejidad del proceso, ya que cada levadura tiene
necesidades diferentes y sobre todo es susceptible de producir diversos compuestos.
algunos de ellos importantes en el aroma y sabor fina! de bebidas.
2.6.2 Métodos tradicionales
Para !a identificación de microorganismos. las técnicas convencionales se
fundamentan con la descripción morfológica y fisiológica de especies y géneros, que se
basan en sus características y requiere de unas 100 pruebas. !o cual es laborioso.
complejo y requiere tiempo. Las principales desventajas que han mostrado estas pruebas
morfológicas se manifestaron con el descubrimiento del estadio sexual de reproducción
de la clase [evaduriforme de los ascomicetes y basidiomicetes. lo cual ha generado !a
!!amada dualidad de nomenclatura, que no es más que una misma especie sea nombrada
de una forma en el estado vegetativo (anamorfo) y de otra en el estado sexual
(teleomorfo) (Orberá-Ratón, 2004).
Las principales pruebas morfológicas y fisiológicas utilizadas en la
identificación son:
Morfológicas.- reproducción vegetativa (gemación o bipartición), reproducción
sexual (cigoto, esporas), morfología celular en medios sólido y líquido, aspecto de la
colonia, fonnación de pseudomicelio, fonnación de velo.
19
Fisiológicos.- fennentación y asimilación de azúcares, desarrollo en presencia de
etanol, poder fermentativo, asimilación de ácidos orgánicos, escisión de arbutina,
necesidades en vitaminas, crecimiento a diferentes temperaturas, fenotipo ki!!er;
asimilación de compuestos nitrogenados. requerimientos vitamínicos, resistencia a
cicloheximida y termoto!erancia. Pero éstas no siempre son estables ni reproducibles,
debido a que las fuentes de carbono y nitrógeno pueden metabolizarse por rutas
comunes y en ocasiones su metabolismo es controlado por varios genes. La prueba de
fermentación de azúcares no es muy exacta debido a que las levaduras de fermentación
lenta no liberan el C02 de fonna tan inmediata para que sea atrapado en tubo Durham.
lo cual ha provocado que especies consideradas durante mucho tiempo fermentativas,
hayan tenido que reclasificarse. Estos métodos en genera!, producen ambigüedades y
resultados incorrectos, debido a que las características 1norfológicas y fisiológicas están
fuerte1nente influenciadas por las condiciones de cultivo (Orberá-Ratón, 2004).
20
2.6.3 Métodos moleculares
2.6.3.l Métodos basados en el análisis del genoma ribosomal
Las regiones ribosomales poseen una característica especial, éstas muestran un
bajo polimorfismo intraespecífico y una alta variabilidad interespecífica. Por ello, el
análisis de la región ribosomal de los genes 5.8s, l 8s y 26s, es una herramienta útil para
establecer las relaciones filogenéticas e identificar especies de levaduras. (Fernández
Espinar y col., 2006) (Figura. 12).
:;·~!5.8S rDN1\l ITS2
Ll ___ 2_,,_-,_"2_8_S_cD_N_/\ __ ~f- 3·
Figura 12. Esquema de b estructura nucleai· de AD~r.
El más amplio uso que se le ha dado a la técnica de RFLP ha sido en estudios de
identificación y filogenia de levaduras de interés industriaL utilizando la región del
rDNA 5.8S y los espaciadores transcritos internos JTS 1 e ITS 2 (5.8S - ITS). Además
esta 1nisma región ha sido utilizada por Esteve-Zarzoso (1999) para identificar una serie
de levaduras involucradas en la fennentación del vino.
Algunas de las técnicas 1nás utilizadas parn !a identificación y caracterización de
levaduras en alimentos y bebidas. se 1nencionan en el cuadro 5. De las cuales existen las
que son dependientes de cultivo (que es necesario tener las colonias aisladas). e
independientes de cultivo. (es decir, que el aislamiento no es necesario. ya que se parte
de la muestra original).
21
Cuadro S. Técnicas moleculares para la identificación y caracterización en levaduras. (Tomado de
F ernández-Espinar y col., 2006 ).
Identificación de especies Diferenciación a nivel cepa
Dependientes de cultivo Dependientes de cultivo
Secuenciación de la región ribosomal Cariotipo por electroforesis de campo pulsado
*Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de Análisis de la restricción del ADN mitocondrial
restricción (RFLP)
Amplificación de secuencias repetidas
aleatoriamente (RARP)
PCR de las regionc~ repetidoras del genoma
(Microsatélites;. :vlinisaklitcs)
i>olimorti~mo de la longitud di;- los lfagm.:ntu.\
amrlificados (AFl,l'J ~~~~~~~~~~,~~~~
No dependientes de cultivo No dependientes de cultivo
l".lectrnl(1rc~ís en gel pur gradientc 1.k~naturo.li1an!c PCR en tiempo real
(PCR-DGGE¡
*Técnica empkw.fa en el presente trabajo
22
Las técnicas moleculares mencionadas antes han sido utilizadas para la identificación y
caracterización de levaduras en alimentos, vino y mezcal desde 1999 hasta 2005
(Cuadro 6).
Cuadro 6. Trabajos que utilizan métodos moleculares de identiticación y caracterización en levaduras.
Técnica
PCR-RFLP 5.8s ITS
PCR-Rl·LP -DGGI·: 5.8 JTS
RFLll-mtlJNi\
PCR-DUGE
Géneros y especies 132 especies de diferentes géneros 27 cepas Hanseniaspora
Hanseniaspora) Kloeckera.
Saccharomyces y /1!0-Saccharom.vces
8 Candida y Saccharom_vce.1·
Sacdwromyces cereri1·i11e
Srn:charomyci:.1
Cl<11· ispo1·a. Pidlio A."l11_1·rerom)'L"l!.1·
.\'acdwromy,·es _1 ( "0111/Jda
Saccharomyces cere1·i.1iue
,\acdmrrimyces )- \o,\'accharomyces
Fuente Vino
Cepario español
Alimentos. bebidas. suelo : otros l\"aranja y jugo de naranja
Jnfccciones en humano>.
Vino
Vino
Vino
Vinu
Autores Esteve-Zarzoso) col. (19991 Esteve-Zarzoso y col. (200]) Cadcz y col. (2002)
Las Heras-VazqueL y col. {2003)
Trost y col. (2004)
Carel lo: c,11. (20041
Ariturio1 l<:..c. > col. { 2005 J
1-.~cal;inLc-IVlinak~\\a: cPI (2008J
DiHil) cul. {20061
Martíne1) c::ol. (20041
Cm,;olin: Milis. {20031
23
2.6.3.2 Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)
De los métodos moleculares anteriormente mencionados, la técnica de análisis
de la región ITSI-5.8s rRNA-lTS2 por polimorfismo de la longitud de los fragmentos
de restricción (RFLP). es !a que se seleccionó para la identificación de levaduras en el
inóculo de San Luis Potosí.
El término se refiere a secuencias específicas de nuc!eótidos en el ADN que son
reconocidas y cortadas por enzimas de restricción y que varían entre organismos. Las
secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia diferentes en el
ADN de varios individuos de una población. Esto muestra que la población es
polimórfica, para estos fragmentos de restricción.
De esta fonna. en un gel de electroforesis aparece un patrón de bandas
polimórficas correspondientes a los fragmentos de diferentes tamaños. que se generan
con el corte de cada endonucleasa. La similitud de los patrones generados permite
establecer correlaciones entre especies y cepas. y la existencia de patrones únicos. que
permite Ja identificación (Orberá-Ratón. 2004).
Esteve-Zarzoso y col. ( 1999). encontraron que las formas ana1nórficas y
tc!eoinórficas de !as 1nis1nas especies de levaduras generan el inisino patrón. Esto
debido a que las regiones riboso1nales tienen la característica de exhibir un bajo
polimorfismo intraespecífico y una a!ta variabilidad interespecífica. Con los resultados
presentados por Esteve-Zarzoso y col.. 1999. es posible constituir una base de datos
inicial. que puede complementarse con más especies reportadas o nuevas especies que
no han sido analizadas por esta técnica. Que deberán probarse bajo las mismas
condiciones, como se menciona más adelante, en algunas publicaciones de trabajos
realizados para la identificación con el análisis de restricción de los fragmentos (RFLP)
(Cuadro 7).
24
Cuadro 7. Levaduras aisladas identificadas por la técnica de análisis de restricción de los fragmentos.
Técnica-RFLP
Fuente
Vino
Vino
Cepario español
l\m
.1\lirncntns. bchiJas. suclu;
.Jugo de naranja
Naranja y jugo de naranja
lníecciones en humanos
Vino
Vino
Vino
Algunos géneros de levaduras
identificados
Hanseniaspora. Candida, Saccharomyces. 1\1erschnikowia
Candida, Debaromyces. Dekkera. Hansenula, lssatchenkia. Kluy,,eron1yces, lodderomyces. 1V/e1schnikowia. Pie hia. Saccharomyces, Schi=osaccharomyces. Torulaspora, VVickerhamiel!a. farrowia. Zygoascus. Zygosaccharomyces. /lanseniaspora. C1yptococc11s. Filobasidium. Rhodo/ol"///a, Sporidiobolw. Sporobolomyces y Trichosporon ( 132 especies)
Hc111se11iaspora ( 27 ccpiisJ
( "undidu /.1·.1'111d11!11ki11;. .\'aé .,. haron~i ·cr: s / !ansenias¡)(11·0: f.."/occkr;:r(I
Referencia
Guillamón y col. ( 1998)
Estevc-Zarzoso y col. (1999)
l·:stcvc-Zarzoso y col. ( 2001)
l'uh·in.::nti : col. (2001 J
CaJc;; col. (2002J
Cfarispora. Pichio. Arias;. col. (2002) S(lccharomycopsis (~eo11·ich11m) !!anseniaspora
Saccharom.i·ces '.'-JaumO\'a;. col. (2003)
Candido. Clal'i~pora 1-!anseniaspora. Pichia, Rhodotonda, Saccharomyccs y Tricho.1poron (9 especies)
Las I-leras-VaLqueL y col. (2003)
Candida y Saccharomyc·es Trost y col. (2004)
Saccharomyces Capello y col. (2004)
Candida. Hanseniaspora. Clemente-Jimenez (2004) !ssatchenkia. A1etschnikowia, Pichia y Saccharomyces
Saccharomyces Antunovics y col. (2005)
25
Sidra Candida. Citeromyces. Coton y col. (2006) Debaryomyces, Dekkera. Hanseniaspora, Kluyveromyces, Lachancea, Merschnikowia. Pichia, Saccharomyces, Saccharomycopsis y Zygoascus (27 especies)
Vino Candida, Hanseniaspora, Hierro y col. (2006) Jssatchenkia, Zygoascus y Zygosaccharomyces (11 especies)
Vino Brettanomyces, Candida Renoufy col. (2006) Debaryomyces y Saccharomyces
Vino Aureobasidium. Candida. Nisiotou y col. (2007) Metschnikowia, Pichia Hanseniaspora, Jssarchenkia) Zygosaccharomyces
Mezcal Cf(n·ispora. Pichia Escalante-Minakata y col. Kluyveromyces
(2008)
26
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
De manera tradicional, la identificación de levaduras se realizaba con base en la
descripción morfológica y fisiológica de especies y géneros. Estas requieren de la
realización de unas l 00 pruebas, lo que resulta muy laborioso, complejo y consume
mucho tiempo (Guillamón y col., 1998). Además, estas pruebas son dependientes de las
condiciones de cultivo de cepas, y pueden ocasionar errores en la determinación
taxonómica, que conlleva también a la dualidad en la nomenclatura.
La aplicación de técnicas moleculares contribuye a la solución de este problema.
y se consideran como una alternativa más precisa a los métodos tradicionales, puesto
que analizan el genoma independientemente del estado fisiológico de !a célula. Se han
desarrollado técnicas usando las herramientas ofrecidas por la biología molecular y
algunas de ellas son úti!es para identificar y caracterizar las levaduras a nivel molecular.
Sin embargo, la mayoría de los trabajos realizados para la identificación de levaduras
involucradas en los procesos de fermentación. se han realizado en vinos y otras bebidas.
En el mezcal sólo se han realizado dos trabajos de identificación de especies, Lachance
{ 1995) con catorce especies reconocidas y tres por Escalante~Minakata y col. {2008).
27
4. JUSTIFICACIÓN
El mezcal es una bebida tradicional de importancia cultural y económica, que
presenta diversidad en aroma, sabor y otras propiedades organolépticas que dependen de
varios factores. Uno de estos tiene relación directa con las levaduras específicas que
participan en la fermentación debido a que ellas forman parte de la microflora natural
involucrada, como parte del proceso de producción y que repercuten directamente en las
características del producto final. La identificación de dichas levaduras hasta nivel de
especie, es necesaria para caracterizar a los mezcales producidos.
Se requiere disponer de métodos rápidos y precisos, que puedan ser aplicados a
la identificación de las especies de levaduras implicadas en la fermentación del mezcal,
con e! fin de realizar un control del proceso y, asegurar que los organismos presentes
sean los mismos para garantizar la calidad del producto final.
Los métodos de identificación de levaduras que emplean criterios morfológicos,
fisiológicos y bioquímicos, tienen limitaciones que pueden ser solucionadas por
aquellos que emplean técnicas de biología molecular. Estos últimos no han sido
empleados para identificar las levaduras que participan en la producción de! mezcal, con
excepción del trabajo de Escalante-Minakata y col. (2008) que identificó tres especies,
por lo que se hace necesario estandarizar estos procedimientos para verificar si son
útiles para este caso.
28
5. HIPÓTESIS
El análisis del polimorfismo del gen que codifica para el ARN ribosomal 5.8s
pennitirá identificar las levaduras que participan en la fermentación del mezcal.
29
6. OBJETIVOS
6.1 Objetivo General
Identificar levaduras aisladas del proceso fermentativo del mezcal a nivel de especie,
mediante el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)
del gen que codifica para el ARN ribosomal 5.8s.
6.2 Objetivos específicos
:;... Seleccionar y estandarizar una técnica de extracción de ADN en
levaduras de diferentes especies que intervienen en el proceso de
producción del mezca\.
~ Estandarizar un método para el análisis RFLP's del gen que codifica para
e! ARN 5.8s de levaduras en mezcal.
,.. Identificar las levaduras aisladas de la fennentación de! mezcal con la
1nisma técnica.
30
7. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1.Método General.
Identificación bioquímica
por API 20 C
Galerías API C
Muestreo mezcalera ··1a
Perla·· SLP
Siembra en placa y
descripción
Obtención de cultivos puros
Identificación molecular
Amplificación directa de las colonias por
PCR de ADNr 5.Ss
Digestión enzimática
Extracción de ADN
Amplificación por PCR de ADNr 5.Ss
Digestión enzimática
31
7.2 Levaduras y medios de cultivo
7.2.1 Levaduras de colección de Italia
Cuadro 8. Colección de Italia, de cepas utilizadas como control positivo para la identificación.
l. Saccharomyces cerevisiae DBVPG 6173 22. Candida srellata
3. Saccharomyces bayanus CBS 380 24. Candida sake
9. Sacharomyces exiguus DBVPG 6252 25. Candida saitoana
10. Zygosaccharomycesjlorentinus DBVPG 6186 26. Kfuyi·eromyces loe/is
12. Zygosacharomyces jermentai DBVPG 6297 28. Schi:osaccharomyces pombe
15. Debaromyces hansenii CBS 767 29. Schi:osaccharomyces japonicus
17. f!anseniaspora osmophila CBS 106 30. Torulaspora de!brueckíi
18. Hanseniaspora gui/fiermondii 31. Saccharomycodes /udw1gii CBS 2591
19. Hanseniaspora vineae CBS 8031 32. ,11/etschnikowia pulcherrima
20. Candida lypofitica CBS 612..t 33. Pichia anómala
21. ("andidu boidinii DBVPG 6799 3..t. Pichia membrani/aciens
DBYPG 6714
DVPG 6154
DBVPG 6916
DBVPG 6075
DBVPG 6280
DBVPG 6274
DBYPG 6168
DBYPG 6721
DBVPG 6184
DBVPG 6781
CBS 107
32
7.2.2 Levaduras aisladas del inóculo de San Luis Potosí (Cuadro 9).
Cuadro 9. Levaduras de la mezcalera ··La Perla·· (inóculo) 040907SLP, 091007SLP y SLP091007. A 040907SLP P 091007SLP SLP1091007
B 040907SLP R 091007SLP SLP2091007
C 040907SLP S 091007SLP SLP3091007
D 040907SLP T 091007SLP SLP4091007
E 040907SLP U 091007SLP SLP5091007
F 091007SLP V 091007SLP SLP6091007
G 091007SLP W 091007SLP SLP7091007
H 09I007SLP X 091007SLP SLP809!007
! 091007SLP Y 091007SLP SLP9091007
J 091007SLP Z 091007SLP SLP10091007
K 091007SLP Al 091007SLP SLPl 1091007
L 091007SLP Bl 09!007SLP SLP12091007
M 091007SLP C! 091007SLP SLP13091007
N 091007SLP Dl 091007SLP SLP14091007
0091007SLP El 091007SLP SLP15091007
Nota: Se utilizó el abecedario y la !'echa. para otorgar una da\C o bs ci.:pas aisladas del muestreó de San Luis Potosí.
33
7 .2.3 Medios de cultivo
Se utilizaron cuatro medios de cultivo, agar extracto de levadura peptona y dextrosa
(YPD) sólido y líquido, agar papa dextrosa (APD), Wallerstein agar laboratorio (WL). y
jugo de agave (JA). Los últimos tres en sólido, (Cuadro 10). A todos los medios se les
adicionó O.O 1 o/o de cloranfenicol.
Cuadro 10. Reactivos utilizados para preparar medios de cultivo. Caldo YPD Peptona Glucosa Extracto de pH
20g!L 20g/L levadura 4.5 \Og/L
Agar YPD Peptona Glucosa Extracto de pH Agar 20g/L 20g/L levadura 4.5 20g/L
10 L
AgarWL Hidrolizado Extracto de Fosfato de Dextrosa Cloruro de enzimático de levadura monopotasio
50g/L potasio
caseína 4g/L 0.55g 0.425g 5g!L Cloruro de Cloruro Sulfato de Verde de Agar calcio férrico magnesio bromocresol 20g 0.125 0.0025g 0.0025 0.022g
Agar APD Almidón de Dextrosa Agar pll papa 20g/L 15g/L
4.5 4Q/L
Agar JA Sulfato de i\gar pll amonio 35g/L 4.5 1' L
34
7 .3 Muestreo
Se tomó una muestra de inóculo del fondo de una tina de fermentación. Se
determinó la concentración de azúcares y la temperatura. A continuación, se realizaron
diluciones seriadas 1 :50 y 1: l 00 en solución salina fisiológica (0.9%) según se indica el
cuadro 11. Para cada muestra. En cada caja petri se tomaron cuatro cajas petri por cada
medio de cultivo, se sembró una alícuota de lOOµL por dispersión con varilla acodada y
se incubo a 30 ºC por 48-72 h.
Cuadro 11. Cajas petri con diluciones de jugo de agave con a ua fisioló ica.
\1edio Cloranfenicol Dilución
YPD ,; 1/50
YPD si lf\00
J.A. .si \!50 J.:\. si 1/100
WL 00 l/50
APD ,; 1150
.l.t\. 00 1/100
En cada medio de cultivo se hizo el conteo de las unidades formadoras de
colonias (ufc/mL). así como la descripción morfológica de las colonias.
De cada tipo de levaduras aisladas en los medios de cultivo se tomó una 1nuestra
por picadura para inocular en tubos de ensayo con YPD y cloranfenicol al O.O 1 % en
agitador orbital a 30ºC y 125 rpm por 48 á 72 h.
Después de obtener crecimiento de los microorganismos se sembró en cajas Petri
por duplicado con medio YPD y WL con cloranfenicol a! 0.0lo/o, para la obtención de
cultivos puros.
En un criovial se depositaron 500µL de glicerol y 500µL de la levadura diluida
en agua estéril, y se conservaron a -70ºC, estas muestras se utilizaron como reserva de
cultivos puros para el cepario de CIATEJ.
35
7.4 Identificación bioquímica
La galería API 20 C AUX (bioMérieux) se compone de 20 cúpulas con sustratos
deshidratados que permiten realizar 19 pruebas de asimilación (Figura 13). Las cúpulas
se inoculan con un medio mínimo semisólido y las levaduras sólo se reproducen si son
capaces de utilizar el sustrato correspondiente. Lo que permite identificar un total de 34
especies diferentes.
La lectura de estas reacciones se hace por comparación con un control de
crecimiento, la identificación se obtiene a partir de un código numérico, mediante un
catálogo analítico o un programa informático.
·-----~----· ----· ----~----_..:........:--·-. :. ~ :
Figura 13. Galería API 20 C AUX (bioMérieux) con 20 cúpulas con sustratos deshidratados: O-glucosa. glicerol. 2-ceto-gluconato cálcio. L·arabinosa. D-Xylosa. AdonitoL X;litoL O-galactosa. lnositoL D·sorbitoL Metil-aD-Glucopiranosida. N Acetil-Glucosamida. D-celobiosa. D-lactosa. O-maltosa. D·sacarosa D·trehalosa. D· melezitosa y 0-rafinosa.
Cada una de las colonias aisladas se inoculó en una galería API 20 C
(bioMérieux), el procedimiento es indicado en el cuadro 12. Se incubó posteriormente a
29ºC y se observó a las 48 y 72 h. La presencia de cualquier grado de turbidez con
respecto a la cavidad de control. se consideró como un resultado positivo.
Cuadro 12. Procedimiento para inocular galería API 20 C.
:;.. Concentración de células en tubos de 1 mL c/u
;¡;. Preparación del medio de suspensión hasta Me Farland
:;.. Transferir IOOµL al medio API C
:;.. Llenar los alveolos con aproximadamente 5 ml de agua estéril
} Colocar la galería API en caja del kit
> Llenar cada pozo de la galería con e! medio API C inoculado aproximadamente 180 µL
36
7.5 Identificación molecular
7.5.1 Extracción de ADN genómico
La extracción de ADN se realizó de acuerdo al protocolo de Tapia-Tussell y col.
(2006), con el equipo y los reactivos mencionados en el cuadro 13.
Cuadro 13. Equipo y reactivos para la extracción de ADN.
Equipo
> Centrifuga
>- Baño María
> Agitador Vortex
';- Congelador
Reactivos
>- Cloroformo
;... Etanol 70°/o
;... lsopropanol frio
;... Buffer TE:
!OmM Tris-1-!Cl (pH8)
lm.\1 EIJTA (pH8)
1 Om1\.1 NaCI
Procedimiento:
> Buffer de lisis:
50mM Tris-base
250mM NaCI
50mM EDTA
(pH 8)
O.Jo/~ SDS (w/v)
50µ.L RNAsa: Se agrega por cada 10mL de buffer
antes de aplicar
Se tomaron colonias de levaduras de! medio de cultivo que fue aislado en YPD
sólido y/o medio WL, bajo las medidas asépticas en campana de flujo laminar, y se
utilizó guantes de látex y mechero. Se agregó agua destilada estéril a la caja petri y se
traspasó 1 mL del cultivo en tubos eppendorf por triplicado cada uno, después se
centrifugó y se resuspendió a 13,000 rpm por 5 min. Se adicionó 2 unidades ó 0.l5g de
perlas de vidrio estériles (Q. Biogene), se agitó en vortex a alta velocidad por un lapso de
3-5 min, y posteriormente congeló a -70ºC en un tiempo de 10 min. Se descongelaron las
muestras en baño María por 3 min, se agitó en vortex 3 min. Se transfirió 300 µL de la
suspensión celular a un tubo nuevo eppendorf de 2 mL, se adicionó 800 µL de buffer de
lisis con (50 µL RNAsa R4642) e incubó a 65ºC por 30 ruin, con inversión ocasional. Se
enfrió la mezcla a temperatura ambiente; se añadió 500 µL de cloroformo y centrifugó
por l O min a 13,000 rpm., se recuperó la capa superior acuosa en microtubo nuevo y se
37
añadieron 700 µL de Isopropanol frío. Se mezcló cuidadosamente por inversión y
posteriormente se incubó a -70ºC por de 1 O min. Después se llevó a centrifugar por 5 min
a 13,000 rpm a temperatura ambiente. Se decantó el sobrenadante, se lavó el botón con
500 µL de etanol al 70%, se centrifugó y se decantó el etanol dejando secar por una 1 h.
Se resuspendió el botón en 50 µL de buffer TE 0.1 K pH7. Se tomaron tres muestras de
cada cultivo y se visualizó por electroforesis en gel de agarosa al 1 %. (análisis
cualitativo).
7.5.2 Electroforesis en gel de agarosa
Se preparó solución con 0.5 g de agarosa y 50mL de buffer TAE 1 x. Se añadió
l.5µL de bromuro de etidio. La solución fue vaciada en un molde para su solidificación,
colocando previamente peinecillos. Se vertió el buffer TAE a la cámara de electroforesis
1 x y posteriormente se colocó en los pozos del gel 1 O µL de la extracción de ADN
mezclado con 2 µL de colorante de carga, y se corrió a 80v-l OOv aproximadamente
durante 1 h.
Procedimiento:
r Colocar 50 1nL de Buffer T AE IX en un matraz
r Agregar 0.5 g de agarosa
),.- Disolver la agarosa en el microondas (2 min)
J;. Agregar 1.5 µL de bromuro de etidio ( 1 O mg/ml)
? Vaciar en cámara de electroforesis
r Correr el gel a 80-l Oüv 1 h
7.5.3 Espectrofotometría a A= 260nm
La concentración y la pureza de ADN se detenninaron por espectrofotometría.
Ya que los ácidos nucleicos (ADN y ARN) absorben fuertemente en el intervalo de la luz
ultravioleta (UV) con un máximo de absorbancia a 260 nm (promedio de la longitud
máxima de absorción de las bases nitrogenadas), Jo cual permite su cuantificación en el
UV.
38
Procedimiento:
> Se hace una dilución 1: 100 con agua HPLC de las muestras a analizar
> Se determina la absorbancia del ADN
260 nm y 280 nm usando como blanco
agua HPLC
Se tomó de la extracción 35 µL ADN con micropipeta calculando 50:50 de ADN
con agua estéril. Se homogeneiza por pipeteo y se introduce la mezcla a la celda del
cuarzo del espectrofotómetro que anteriormente fue calibrado. El resultado de la
concentración de! ADN µL/mL y el grado de pureza de los ácidos nucleicos usando la
relación A260/A280, la otorgó directamente el equipo de espectrofotometría. Una buena
pureza de los ácidos nucleicos es de J .8 a 2.
7 .5.4 Amplificación de la región S.8S ribosomal con iniciadores ITS
Este método ha sido propuesto por Esteve-Zarzoso y col. (2001 ). La
amplificación de fragmentos de ADN se llevó a cabo por medio de reacción en cadena
de la polimerasa (PCR). El kit que se utilizó: illustra puReTaq Ready-To-Go PCR
Beads (GE Healthcare™) (BSA, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 2.5 unidades Taq
polimerasa para un volumen de 25 µl con una concentración de dNTP a 200µM en
IOmM Tris-HCI, pH 9.0, 50mM KCI y 1.5 mM MgCI). Se amplificó la región ITS 5.8s
rRNA ribosomal empleando los cebadores ITSI (5TCC GTA GGT GAA CCT GCG
G3') e ITS4 (5' TCC TCC GCT TATTGA TAT GC 3').
Reactivos:
> 2µL de ADN de cada muestra {aproximadamente 50 ng)
l> 1.25µL de ITSI (IOµM)
l> !.25µL de ITS4 (!OµM)
> 20.5µL de agua purificada
39
~ Tubo eppendorf del kit
Procedimiento:
Una vez añadidas las muestras por duplicado en tubos eppendorf con perla de
reactivos, se añadieron los iniciadores y posteriormente se colocaron en termociclador
programado con protocolo para incubar. bajo las siguientes condiciones de reacción:
>- Desnaturalización inicial a 95 ºC por l O min
> Desnaturalización a 94 ºC por 1 min
> Alineamiento a 55.5 ºC por 2 min
> Extensión a 72 ºC por l min
~ Repetir 35 ciclos
).... Extensión final a 72 ºC por 1 O m in
r Si es necesario, incubar a 4 ºC
'r Electroforesis en gel de agarosa al l .3o/o en TAE lx.
Se realizó una electroforesis en gel de agarosa al l .3o/o. Se tiñó con solución
acuosa de bromuro de etidio y se visualizó con luz UV para comprobar la amplificación.
Procedimiento:
Y Colocar 50 mL de Buffer T AE l x
>- Agregar 0.65 g de agarosa
>- Disolver la agarosa en el microondas (2 min)
>- Agregar 1.5 µL de bromuro de etidio (1 Omg/ml)
>- Vaciar en cámara de electroforesis
>- Correr el gel a 80-1 OOv l h
40
7.5.5 Digestión enzimática
Una vez comprobada la amplificación del fragmento de ADN deseado, se realizó
una digestión enzimática con tres enzimas de restricción diferentes Hha I, Hae III, Hin/
Procedimiento:
> En tres tubos estériles para PCR, colocar:
> 7µL del AON amplificado
> 1 µL de cada una de las enzimas en cada tubo (Hae III, Hha I Hinfl)
r 17 µL de amortiguador de cada enzima
Dependiendo de la concentración del ADN se tomó un volumen detenninado ya
sea ( 1 µL ó 2 µL) por duplicado. Fueron añadidas las enzimas a un tubo eppendorf con
todos los reactivos. La digestión enzimática se realizó por 2 ha 37 ° C en termociclador.
r Electroforesis en gel de agarosa a! 3o/t1 en TAE 1 x.
Visualizar !as bandas de los fragmentos de restricción con luz UY en un gel de
agarosa al 3º/o :' comparar !os tamaños con un 1narcador de PM de 1 00 pb (Tracklt™ ! 00
bp DNA Ladder, Invitrogcn).
Procedimiento:
'.r Colocar 120 mL de Buffer TAE 1 x
,_ Agregar 3.6 g de agarosa
;... Disolver la agarosa en el microondas (3 min)
> Agregar 1.5 µL debromurodeetidio(IOmg/mL)
> Vaciar en cámara de electroforesis
? Correr el gel a 120v 1 h
> Comparar los patrones de bandas encontrados con los patrones de cepas identificadas de estudios anteriores.
41
8. RESULTADOS
8.1 Descripción morfológica de las cepas de levaduras en cultivo en placa
De acuerdo a la morfología de las colonias observadas en las cajas de cultivo se
hicieron cinco grupos. A cada levadura diferente se le asignó una clave utilizando el
abecedario junto con la fecha del día del muestreo y las iniciales del estado de San Luis
Potosí. Además, se incluyeron cinco cepas {A040907, 81040907, Cl040907, 01040907
Y El 040907) que previamente habían sido recolectadas de esta misma mezcalera. La
figura 14 muestra las diferencias por morfología de las levaduras. El cuadro 14 muestra
cómo se agruparon las levaduras para su posterior identificación.
Figura 14. Aspecto de las colonias de levaduras cultivadas en medio WL. 1: levaduras del grupo I; 2: levaduras del grupo 11; 3: levaduras del grupo lll; 4: levaduras del grupo IV; 5: levaduras del grupo V; 6 levaduras antes de aislar por grupos.
42
Cuadro 14. Descripción morfológica de los grupos de las levaduras de SLP en medio WL.
Grupo
Grupo 1
Grupo 11
Grup-0 1!1
Grupo l\i
Grupo V
Descripción morfológica para
WL
Color verde con el centro más obscuro, 3-5mm, cremosa, forma circular, aplanada
Color blanco, 2-3mm. forma circular con superficie y bordes rugosos, irregular
Color rosa. 1-3mm. color cremoso brillante
Color verde obscuro, 1-2mm. cóncava. bordes regulares y lisos
Color verde pálido casi color blanco. 2mm. supcrticie lisa. bordes regulares
Cepas
E091007 SLP F091007 SLP K09!007 SLP L091007 SLP R091007 SLP
A 1040907 SLP 5091007 SLP G091007 SLP H091007 SLP 0091007 SLP A040907SLP V091007 SLP Z091007 SLP
CI040907 SLP D 1040907 SLP E1040907 SLP
1091007 SLP J091007 SLP M091007 SLP N091007 SLP P091007 SLP U091007 SLP X091007 SLP Y091007 SLP
B1040910SLP T091007 SLP 1N091007 SLP
43
8.2 Caracterización bioquímica
De los grupos fonnados, se seleccionaron cepas representativas de cada uno,
incluyendo algunas de la colección de Italia como control positivo para realizar la
prueba bioquímica API 20 C (bioMérieux). Los resultados obtenidos de las reacciones
de fermentación de los sustratos se presentan en el cuadro 15, en el que se observan los
distintos perfiles respecto a la asimilación de los sustratos probados.
Cuadro 15. Perfiles bioquímicos de las colonias por galerías API 20 C (bioMérieux).
G G 2 A X A X G 1 s M N e L M s T M L L K R y o L A N o o A E A A A R L u y G A L o T L o R G G L e L e E z
GRUPO E + + + + + + + + + + + + + +
B + + + + + + + + + + + + + + +
A + GRUPO
Cl + + + + + + + + 11
34 + + + + + + +
e + + + + + + + + +
GRUPO + + +
IV + +
9 + + +
D
GRUPO p + +
V 18 + + + + + + + + + + + +
19 + +
Se observó el crecimiento de las levaduras. Las cúpulas más turbias que el
testigo indican una reacción positiva, el resultado se anotó en una hoja que proporciona
el kit de la galería API 20 C. En esta hoja, los diferentes nutrientes están separados en
grupos de tres y se adjudica a cada uno, en caso de ser positivo, un valor diferente: una
para el primero, dos para el segundo y cuatro para el que ocupa el tercer lugar. Sumando
cada triplete se obtiene un número de siete cifras que constituye el perfil numérico. La
44
R A F
+
+
+
+
identificación se realizó mediante el Catálogo Analítico o el Programa Infonnático de
identificación suministrado por el fabricante de la galería API 20 C.
Los resultados obtenidos de las galerías API 20 C (Cuadro 15) se ingresaron a la
base de datos de identificación apiweb™, de la cual se obtuvieron los siguientes perfiles
de posibles especies de levaduras (Cuadro 16).
Cuadro 16. Levaduras identificadas por prueba bioquímica (galerías API 20 C).
GRUPO 1
GRUPO 11
GRUPO IV
GRUPO V
Taxón significativo
E Candidafamata 82.3o/o
B Cryptococcus !aurenrii 98%
A C'andida glabra/a 47%
CI Pichiafermentans (no
proporcionó la base de
datos ningún porcentaje
para esta identificaciúni
34 C'andida gui!lermondii (no
proporcionó la base de
datos ningún porcentaje
para esta identificación)
e Candidafamata 53%
Saccharomyces cerevisiae
77%
Kloeckera spp (no
proporcionó la base de
datos ningún porcentaje
para esta identificación)
9 Rhodotoru!a glutinis 57%
D Candida glabrata 47%
Nota
Posibilidad de Candida tropica/is
Posibilidad de Candida !ambica ó Candida.
lipo!yrica
Para el caso de esta levadura la base de datos no
man,;:ió alguna otra posibilidad de especie
Posibilidad: Candida lropicalis
Posibilidad: Candida tropica!is
Posibilidad: Rhodotoru!a glutinis
Para el caso de esta levadura la base de datos no
manejó alguna otra posibilidad de especie
Posibilidad: Candida Collicu!osa
Posibilidad: Candida !ambica o Candida. lipolytic11
45
p Candida magno/iae 62o/o Posibilidad: Geotrichum candidum
18 Cryprococcus laurentii 8lo/o Para el caso de esta levadura la base de datos no
manejo alguna otra posibilidad de especie
19 Kloeckera spp (no Para el caso de esta levadura la base de datos no
proporcionó la base de manejo alguna otra posibilidad de especie
datos ningún porcentaje
para esta identificación)
46
8.3 Análisis molecular
8.3.1 Extracción de ADN
Todas las colonias identificadas (Cuadro 9) fueron aisladas y de cada una se extrajo
ADN. Posteriormente se hizo una electroforesis del ADN extraído para evaluar la
presencia y la calidad. En los resultados de electroforesis como se puede apreciar en las
figuras 15, 16 y 17 el ADN de las cepas fue integro. Sólo en tres muestras se el ADN un
poco degradado, lo cual nos indica que el protocolo que se utilizó fue apropiado para la
obtención de ADN de levaduras. Además, al observar la calidad del ADN obtenido nos
permitió manejar volúmenes que se deberían utilizar en la PCR, ya que dependiendo la
intensidad de la banda se determinó la cantidad de ADN que se colocó en la mezcla de
reacción la cual fue de 1 µL ó 2 µL.
·' ¡•
e.u =-. = - . . . - ---- -Figura 15. Gel de electroforesis con el perfil de migración de la extracción de ADN de cepas aisladas d..:l proceso fr:rmentativo de mezcal de San Luis Potosí. Carrile;; 1-20:(A. B. C. D. E F. G. H. L J. K. M. l\'. O. P. R. S. T y U).
.:51 _, =- =-·a - --~·- - - -~
Figura 16. Gel de electroforesis con e! perfil de migración de la extracción de ADN de las cepas aislaJas del proceso termentativo de mezcal de San Luis Potosí y colección de Italia. Carriles l-20:(V. W. X, Y. Z.Al.Bl.CJ,Dl,El. l.2.3,4,6,9, 10, 12y 13).
47
líl 11
.; . Q , ·- - . ;t. . -. ' . . .,__ .
(
Figura 17. Gel de electroforesis con el perfil de migración de la extracción de los ADN de cepas de colección de Italia. Carriles 1-11:(15, 17J8, 19, 20, 21. 25, 26, 28, 29 y 33).
8.3.2 Concentración y pureza de ADN
Para determinar la concentración del ADN así como su pureza, se realizó una
lectura espectrofotométrica del ADN de las levaduras de la colección de Italia y de las
aisladas de San Luis Potosí. Una relación ópti1na de absorbancia 260/280 nm de la
muestra de ADN es de 1.8 a 2.0. números más altos indican contaminación con ARN.
núineros más bajos. indican contaminación con proteínas.
Cuadro 17. Espectrofotometria de levaduras de la colección de Italia y San Luis Potosí. los números
indican las muestras de la colección de Italia y las letras indican las cepas de San Luis Potosí.
Muestra Concentración Relación Relación
Cepa (ng/µL) 260/280 260/230
l 149.2 1.75 0.66
2 35.0 l.42 2.46
3 25.9 1.81 0.29
4 144.0 l.82 0.71
6 6.6 I.80 0.07
9 24.8 1.57 o.so 10 35.3 1.95 0.25
12 84.1 1.81 0.46
13 102.6 ]. 77 0.47
15 31.7 1.85 0.18
17 123.8 1.76 0.83
18 71.2 2.01 J.59
19 42.8 1.58 1.08
20 20.8 1.56 0.16
21 72.9 I.63 0.93
48
25 31.3 1.51 0.80
26 68.9 1.54 0.94
28 58.4 1.81 0.21
29 53.5 1.72 0.71
30 28 1.60 0.26
32 164.7 1.56 0.91
33 13.9 1.82 0.20
34 64.6 1.72 1.12
Continuación del cuadro 17
Muestra Concentración Relación Relación
Cepa (ng/µL) 260/280 2601230
A 45.9 1.48 0.33
B 19.5 I.83 0.26
1 e 28.9 1.26 0.19
o 13.3 1.24 0.19
E 203.7 l.48 0.73
1 F 43.4 1.61 o.so 1
' e 141.9 1.62 0.73 '
H 419.0 l.74 1.18
1 27.3 1.56 0.30
J 290.3 1.52 O.SI
K 324.7 1. 70 1.07
L 1968.7 l.39 0.70
" 595.1 2.05 1.11
N 79.2 1.61 0.70
o 128.4 1.74 0.96
p 178.2 1.64 0.91
R 34.0 1.64 0.34
s 937.5 1.69 1.29
T 30.4 1.75 0.36
u 796.4 2.05 1.79
V 106.l 1.51 0.69
w 1017.6 1.61 1.18
X 840.0 1.58 1.56
y 160.6 1.55 0.67
z 435.I 1.86 J.46
Al 12.0 J.67 0.35
BI 390.4 1.67 0.35
BIBLIOTECA CUCBA 49
Ct 285.3 1.72 0.92
DI 172.8 1.48 0.59
El 1274.1 1.58 1.10
De la medición de espectrofotométrica realizada al ADN extraído de las cepas de
San Luis Potosí e italianas. Se obtuvo el 64. I 5%, con una concentración mayor a 50
ng/µ1. De la relación 260/280 se obtuvieron valores menores a 1.8 en el 75.47o/o de las
muestras lo cual indica una contaminación de proteínas. El 18.86% entre 1.8 y 2.0
siendo estas las que se encuentran en el rango óptimo y sólo el 5.6% fue mayor a 2.0
mostrando una contaminación con ARN.
so
8.3.3 Amplificación de la región ITS1-5.8S-ITS2
8.3.3.1 Amplificación de ADN
Una vez obtenido el ADN de las levaduras, se amplificó !a región ITSI-5.8S-ITS2
con el método propuesto por Esteve-Zarzoso y col. (2001 ), mediante la técnica de PCR
con el kit (i!lustra™ puReTaq Ready-To-Go). Los tamaños de los fragmentos fueron
arrojados de! programa Quantity one. En la figura 18 se muestran los resultados
obtenidos de !a amplificación de las cepas: las muestras A 1-S presentan un tamaño
uniforme de fragmento amplificado de 740-760 pares de bases (pb), de las cepas Cl-Z
el tamaño que se observa es de 420-450pb, la cepa Dl se muestra con un peso de 642pb,
de las cepas 1, N y E 1, el tamaño es de 848, 814 y 8 I 8pb respectivamente; las cepas de
la P-T presentan un peso molecular de 710-760pb, la cepa W su peso es de 566pb, la
cepa A es de 350pb y la cepa B 1 es de 664pb.
Figura 18. Gel de electroforesis para visualizar la amplificación de la región !TSI-5.8S-JTS2 de la~ C<..'r•i~ de San Luis Potosí. Carriles 2-19:(A 1, E. F. K. L. R. S. CL G, H, O, V, Z DI, EL 1, J y M). Carriks i\1 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases.
51
l 2 > ~ 5 ·=· , .. ·; r. 1
· ··::
P· P R
!.;, ' I' ( '~ •' •'
Figura 19. Gel de electroforesis para visualizar la amplificación de la región 1TS 1-5.8S-ITS2 de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 1-9: (N, P, U, X, Y. T, W, A y B 1 ). Carril M indica: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).
8.3.3.2 Amplificación directa de las colonias
Con la finalidad de acortar el tiempo y los costos que requieren una extracción
de ADN. se procedió a la estandarización de un protocolo que permitiera la
amplificación directa de las colonias. Tomando como referencia a Esteve-Zarzoso y col.
( 1999).
Por lo que se probó la amplificación directa de las colonias aisladas de San Luis
Potosí. Se seleccionó una cepa representativa de cada grupo (cepa E, cepa C 1, cepa 1,
cepa W y cepa U) para realizar la amplificación sin haberles real izado extracción de
ADN previamente (Figura 20).
Figura 20. Gel de electroforesis para visualizar amplificación a partir de colonias de cepas representativas de cada grupo de San Luis Potosí. Carriles 2-6: (E, Cl, 1, W y U). Carriles 1 y 7 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).
52
8.4 Digestión
Una vez realizada la amplificación del fragmento del gen ITS 1-5.8S-ITS2, se
realizó la digestión enzimática con las enzimas de restricción Hha I, Hae III y Hinf I a
los productos de PCR de todas las cepas de San Luis Potosí citadas en el cuadro 9. Se
obtuvieron los siguientes perfiles que se muestran en las figuras 21 , 22, 23, 24, 25 y 26
y para su posterior identificación en los cuadros 18, 19, 20, 21 , 22 y 23.
4 ~ <• I X <t 1 O 1111 B "J.t 1 \ 1 b 1 / 1:.; 19 70
Figura 21. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha l. Hae 11 1 y Hinfl de las cepas de San Luis Potosí. Carriles l-1 9:(Al. E. F. K. L y B). Carriles 4 y 20 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).
4 ~ h / X •t 10 1 1 111 1 141\ "lb 1/ 1X1't / O
Figura 22. Gel de electroforesis de digestión con enzima Hha 1, Hae lll y Hinfi de las cepas de San Luis Potosí. Carriles l -19:(R, S, SLP2, SLP5, SLP8 y SLP1 5). Carriles 4 y 20 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).
53
Cuadro 18. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestión de las cepas del Grupo 1: A 1, E, F, K, L. B, R, S, SLP2, SLP5, SLP8 ~ SLP15. Cepa Amplicón Hhal Hae 111 Hinfl
Al 742 286-180-175-77 661-79 245-191-120-80
E 747 287-184-180-88 669-81 246- 188- 11 7-80
F 774 276-180-173-88 611 -59 241-181-1 18-80
K 757 284-1 84- 180-89 646-89 243-182-118-80
L 762 275-181-175-86 641 -80 239-182- 11 4-80
B 750 295-193-171-90 635-76 252-188-120-80
R 723 274-180-171-80 639-67 228-17 1-106-80
s 728 281-182-180-8 1 636-72 243-177- 112-80
SLP2 738 281-178-85-178 632-76 241,183, 113,63
SLP5 740 296-188-85- 180 659-76 249-1 84-1 15-62
SLP8 745 289-181-85-181 648-58 247-1 83- 113-62
SLP15 740 296-189-87-180 675-60 255- 191-1 17-62
Figuro 23. Gel de electroforesis de digestión con enzima Hha l. Hae lll y Hin/ l de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-l 3:(C l, G, H y Z). Carril l indica: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM). El recuadro marcado con rojo señala la banda que diferencia las cepas de una especies posible de Pichia membranaefanciens y las cepas de Pichiafermentas.
C uadro 19. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestión de las cepas del Grupo 11 a: C l. G. H z.
Cepa Amplicón Hita! Hae 111 Hinfl
Cl 455.27 150-98-80 286-157-86 243-201
G 438.65 160- 102-84 311-160-80 250-211
H 441.32 164-1 05-86 312-165-95 260-2 15
z 414.78 150- 107-80 282-170-70 231 - 186
54
~ 10 U 1l H 14 1} 1ó 17 1S n ! O Z1 ll 13 !4 .!!> !o ! 1
Figura 24. Gel de electroforesis de d igestión con enzimas Hha 1, Hae 111 y Hinf 1 de las cepas de San Luis Potosi. Carriles 1-6 y 9-26: A, DI , V, O, SLPI. SLP4, SLPI 1 y SLP l 2. Carriles 7, 8 y 27 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).
Cuadro 20. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de d igestión de las cepas del Grupo 11 b: cepas A. DI. V, 0. SLPI , SLP4, SLPI! y SLPl2.
Cepa Amplicón Hiia! Hne 111 Hin[ ! A 360 155-1 05-90 309-81 254-201
DI 395 150-106-80 290-75 242-197
V 400 155-1 00-80 318-80 249-201
o 447 160- 101-84 320-93 256-211
SLP l 400 160-101-84 315-90 250-2 10
SLP4 410 165-100-80 315-78 245-200
SLPl 1 390 160-90-80 300-80 249-197
SLP12 390 151-90-75 303-80 248-200
Figura 25. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha 1, Hae 111 y Hin/ 1 de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2- 10: E l , SLPl 4 y W. Carril l indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).
55
Cuadro 21. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestión de las cepas del Grupo 111: El, W y 14.
Cepa Amplicón Hltal Hae 111 Hin/!
El 642 293-225-97 405-220 342-216
w 566 293-224-11 o 406-200 342-211
SLP l4 630 299-222-99 496-209 330-205
.J 6 I :; •t 1 1) 1'1l l1?. H nl61/ 1!:!19 20
Figura 26. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hho l. Hoe 111 y Hif 1 de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2-19: N. J. C. Y. T y SLP6. Carriles 1 y 20 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).
X <t 10 11 'l/ '('. H 1\ lb 1 / l:l 1'1
Figura 27. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hho 1, Hoe lll y Hinf 1 de las cepas de San Luis Potosí. Carriles 2, 3, 4, 5, 6 y 7: SLP9 y SLP13 y carriles 13,14,15, 16, 17 y 18: 1 y M. Carriles 1, 9 y 19 indican: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).
56
Cuadro 22. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestión de las cepas del Grupo IV: N, J, C, Y, T. l, M, 6, 9 13.
Cepa Amplicóo Hita ! Hae 111 Hin/!
N 814 380-365-1 40 32 1-243-183-136 380- 125
J 848 387-367-147 324-247-188-140 375-132
c 850 368-359-129 299-224- 167-1 03 357-117
y 786 380-369-143 320-239-183-136 392-130
T 760 382-360-141 322-24 1-1 84-141 392-123
813 381-360-140 311-236-175-131 371-131
M 782 380-362-1 42 340-250- 190-145 381- 127
SLP6 800 356-321-129 309-228-168-125 377-126
SLP9 810 363-338-133 315-236-175-125 368-120
SLPJ3 800 360-330-1 25 300-230-175-125 368- 120
Figura 28. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hha l, Hae lll y Hin/ 1 de las cepas de San Luis Potosi. Carriles 2-19:P. U, X, D. SLP7 y BI. Carril 1 indica: marcador de peso molecular de 100 pares de bases (MPM).
C uadro 23. Tamaño del amplicón y de los fragmentos de digestión de las cepas del Grupo V: P, U, X, D, SLP7 BI.
Cepa Amplicóo Hlta l Hae 111 Hinfl
p 735 320-236-95 735 345-228-158
u 735 319-289-95 735 354-234-164
X 710 314-290-98 710 353-234- 165
D 700 299-280-90 700 350-230-165
B l 700 291- 189-98 700 255-199-120
57
Figura 29. Gel de electroforesis de digestión con enzimas Hhaf, Hae!!! y Hú?fl con la cepa de San Luis Potosi. Carriles 1-3: SLP3.
8.4.1 Resultados de cepas SLP091007 aisladas de inóculo de San Luis Potosí.
Cuadro 24. Tamaño del amplicón y Gru o VI: cepas SLP3.
Cepa Amplicón
SLP3 400
de los fragmentos de digestión de las cepas del Grupo
Hhal Hae 111 Hinfl
160-103-79 303-89 258-210
58
En el cuadro 7 se presentan levaduras que han sido analizadas por RFLP. Este cuadro se
utilizó como referencia para comparar Jos patrones de bandas que se obtuvieron de las
levaduras de San Luis Potosí y así, poder identificar las especies encontradas.
Posteriormente se realizo el cuadro 25. En donde se presenta específicamente los
patrones de bandas para comparar los resultados de los análisis de RFLP de las cepas
de San Luis Potosí y las referencias que se tomaron.
Cuadro 25. Referencia de los articulos publicados con los que se compararon !as cepas para Ja identificación de levaduras.
Especie Amplicón Hlwl Hae 111 Hin/ 1 Autor
K!u.weromyces 740 285- ¡ 90-165-90 655-80 290-180- 120-80-65 Esteve-Zarzoso y
/acus col. ( 1999)
P1chia 460 l 60- l 00-90-75 315-90-55 270-195 Coton y col. (2006)
membranaefaciens
P1chw fermentans 450 170-110-80 340-85 260-210 Guillamón y col
( 1998)
Rhodozorula 640 320-240-80 415-215 340-225-75 Guillamón y col.
muci/a;;;mosa ( ! 998). Estcv.:-
ZarLOSO y col
( 1999). Carvalho:
col. (2005)
S(lc/111ro111v¡;·¿s 880 380-366-160 290-220-165-130 395-145 Coton y nil (20061
cereviswe
Hunse111aspor11 750 320-310-105 750 350-200-180 Estcvc-Zarloso:
g11illiermo11di1 col.(1999)
/s.w1chenkii1 460 160-100-90-75 315-90-55 270-195 Hierro y col. (2006)
lw11oiens10
59
De los cinco grupos que se formaron inicialmente de acuerdo a la morfología de
las levaduras de San Luis Potosí, una vez que fue realizado el análisis molecular, se
identificaron por especie cada uno_ de Jos cuales se obtuvieron dos grupos más. Para el
caso del grupo 11 se dividió en dos grupos: grupo II a y grupo ll b, el segundo grupo que
se agregó fue el VI que se muestran en e[ cuadro 26.
Cuadro 26. Tamaño en pares de bases (pb) de los productos de PCR y fragmentos de restricción
obtenidos de las levaduras de San Luis Potosí.
Grupo Especie Producto
DePCR Fragmentos de restricción
(pb) Hhal Haelll Hinfl
Grupo !\lun·i:rom; ·ces 742 286- 180-175-77 661-79 245-191-120-80
luc1is
Cirupo fJichiu 455 150-98-80 286-157-86 243-201
¡¡ b
(irurn !'1dri11 m 160- lDl-8-I 320-93 256-21 1
11 ~l /er111,,n1u11.1
(irn¡x1 R!111l/1,1or11/u 6-12 29.l-225-97 -105-220 3-12-21 (¡
111 m11cilo{'Íl10S(/
(lrupo Suc,·haron1yces 8'8 387-367-147 324-24 7-1 88-14() 375-132
1 \' Cl!/"1!1"i5ÍUI!
Grupo Ha11se11iuspora 735 319-289-95 735 354-234-164
\' guilliermondii
Grupo lssatchenkia 455 150-98-80 286- !57-86 243-201
VI
60
9. DISCUSIÓN
Para llevar a cabo este método mo!ecu!ar, primero se aislaron en placa las
colonias (Figura 13). De los medios de cultivos utilizados, el WL resultó e! más
apropiado para diferenciar mejor las cepas., debido a que entre sus componentes se
encuentra el verde de bromocresol y éste le confiere una tonalidad a cada colonia, lo
cual facilitó la identificación morfológica (ya que otorga más características con
respecto a !os otros medios). Este medio fue utilizado también por Pallmann y col.
(2001) para la identificación de flora nativa en fermentaciones logrando una
diferenciación morfológica eficiente.
En cuanto a la identificación de las levaduras aisladas por galerías APL los
resu!tados obtenidos de la base de datos apiweh™, inuestran notas como: perfil
inaceptable. dudoso o de baja discriminación. por lo que se observa que el 1nétodo. No
parece ser el adecuado para la identificación de levaduras aisladas del proceso de
elaboración del mczcal hasta nivel especie. ya que los resultados son confusos para una
identificación nccrtada. Algunos autores corno Guillan1ón) col. { 1998). Esteve-Zarzoso
)' col. ( 1999). Orberá-Ratón (2004 ), mencionan que estos métodos en general_ producen
arnbigüedades e incorrecciones en !os resultados. debido a que las características
111orfo!ógicas ) fisiológicas están fuerternente influenciadas por las condiciones de
cultivo. Nuestros resultados arrojan estas 1nismas a1nbigüedades. ya que dentro de los
1nisrnos grupos estamos obteniendo perfiles bioquímicos n1u) distintos entre sí. Las
técnicas basadas en la asimilación de nutrientes son 1nuy cuestionadas por los
investigadores que trabajan con identificación 1nolecular debido a la baja
reproducibilidad. co1no lo menciona Guillamón y col. ( 1998) y Esteve-Zarzoso y col.
(1999).
Para realizar la extracción de ADN se probó e! protocolo de Tapia-Tussel! y col.
(2006) que propone un método rápido y simple para extracción de ADN para levaduras
y hongos aislados del Agave. Este método implica dos pasos importantes: en primer
lugar, la ruptura de las paredes de las células por inedias mecánicos y la congelación, y
en segundo lugar. extracción. aislamiento. y precipitación del ADN genómico. Este
61
método pennite obtener un ADN de buena calidad, útil para llevar a cabo reacciones de
PCR.
En relación a la concentración y pureza del ADN, el 64.15% de las muestras
analizadas presentaron una concentración mayor a 50 ng/µL. Aunque en el cuadro 17 se
puede apreciar que no se obtuvo una concentración homogénea por lo que el método de
extracción es muy variable. Con relación a la pureza en la relación 260/280 tenemos que
el 75.4 7% es menor a 1.8, el I 8.86o/o es entre 1.8 y 2.0 y sólo el 5.66% fue mayor a 2.0.
Lo cual nos indica una contaminación con proteínas en la mayoría de las muestras, la
concentración de ADN obtenida está en el rango de 6.6-1968.7ng/µL y la pureza, de
1.24-2.05 (260/280). En contraste con los resultados de Tapia-Tussel! y col. (2006) ellos
obtienen una concentración entre 230-2620ng/µL y una pureza de 1.6-2.0 (260/280).
Sin embargo la calidad del ADN obtenido es suficiente para realizar la amplificación
para la técnica de RFLP. Estas muestras amplificaron en PCR. gracias a que la
concentración de ADN fue mayor a 50 ng/µL en la inayoría de los casos. Cuando se
obtuvieron concentraciones menores se colocó mayor volumen de muestra en las
reacciones de PCR.
En la figura 15 se puede observar un gel de electroforesis de la amplificación
realizada a partir de 1nuestras a las que se les realizó extracción de ADN y en la figura
16 se muestra un gel de electroforesis de la amplificación directa de cepas
representativas de cada grupo. Como se puede apreciar con las dos metodologías de
amplificación se obtuvieron los mismos resultados, ya que si hacemos primero
extracción de ADN o si ponemos directamente la colonia en la mezcla de reacción de
PCR, obtenemos e! mismo fragmento amplificado. Con la metodología donde ponemos
la colonia directa para amplificar tenemos la ventaja de que al no hacer la extracción de
ADN, reducimos tiempo y costos en el análisis. Esteve-Zarzoso y col. (1999) utilizaron
esta técnica de amplificación directa, obteniendo resultados similares.
De los resultados que se obtuvieron con la tecnica de RFLP mediante la
amplificacion directa de ADN de las colonias, se observó que los patrones resultantes de
la digestion en ambos casos son iguales. De las cuales el 95.455% de las cepas aisladas
se identificaron a nivel de especie por Ja técnica de RFLP, sólo el 4.545% de la
muestras se logró identificar a nivel género.
62
En el estudio que realizaron en la destiladora de tequila Herradura (Amatitan,
Jalisco) (Lachance, 1995) encontraron las siguientes especies: Clavispora lusitaniae,
Metschnikowia agaveae, Hanseniaspora spp., Pichia kluyverz~ Candida krusei,
Schizosaccharomyces spp., Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii,
Kluyveromyces marxianus, Hanseniaspora spp., Zygosaccharomyces bailii, Candida
milleri. Brettanomyces spp. y. Pichia membranaefaciens. Comparado con el trabajo que
aquí se presenta, se encontraron más especies de levaduras, lo que podría ser debido a
que en éste trabajo se hizo un muestreo de inócu!o y en el trabajo de Lachance se realizó
un muestreo más extenso en agave fresco y cocido, Drosóphila spp .. jugo de agave y en
el equipo que se utilizó para el proceso de la elaboración del tequila, dando como
resultado una gama más amplia de especies de levaduras. Además de que la especie de
agave que se utiliza para la producción de tequila es diferente a !a que se maneja en la
elaboración de mezcal en San Luis Potosí.
En otro trabajo realizado en la fermentación de mezcal de San Luis Potosí por
Escalante-\1inakata y col. (2008) sólo se encontraron C/avispora lusitaniae. Pichia
fi?rmentans y Kfuyveron1yces n1arxianus. El mayor número de levaduras encontradas en
este trabajo. podría ser debido a que e! muestreo se hizo en inóculo y el trabajo de
Escalante-Minakata (2008) se realizó durante la fermentación y algunas de las levaduras
presentes en e! inóculo no logran sobrevivir a la fermentación. También podría ser
debido a los medios de cultivos que utilizaron Escalante-Minakata y col. (2008).
quienes no utilizaron el medio WL (sólo APD. YPD y JA); que nos ayudó a
identificar más variedad en las cepas, ya que, confiere tonalidades a las diferentes
levaduras y facilita la diferenciación de las cepas para posteriormente poderles realizar
e! análisis molecular para su identificación.
63
10. CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos permiten concluir que:
l. El método de RFLP permitió identificar levaduras hasta nivel de especie con un
95.455% y con un 4.455% a nivel de género con los patrones de polimorfismo
reportados hasta el momento.
2.- El presente trabajo permitió establecer y estandarizar un protocolo corto para la
identificación de levaduras presentes en el inóculo muestreado.
3.-El inócu[o utilizado para la producción de mezcal en la mezca!era ''La Perla,. está
constituido por una población heterogénea debido a que se encontraron siete grupos de
levaduras diferentes. de las cuales cinco se identificaron a nivel especies y dos a nivel
género.
64
11. LITERATURA CITADA
Aguirre-Rivera, J. R., Charcas Salazar, H. y Flores Flores, J. L. (2001). El maguey mezcalero potosino. Universidad Autonóma San Luis Potosí.
Antunovics, Z., lrinyi, L. y Sipiczki, M. (2005). ''Combined application of methods to taxonomic identification of Saccharomyces strains in fennenting botrytized grape must." Joumal of Applied Microbiology 98, 971-979.
Arias., C. R., Burns., J. K., Friedrich, L. M., Goodrich, R. M. y Parish, M. E. (2002). "Yeast Species Associated with Orange Juice; Evaluation of Different Identification Methods." Applied and Environmenta/ 11.1icrobiology 68, 1995-1961.
Blomberg, L. (2000). ''Tequila Mezcal y Pulque lo Auténtico Mexicano. ·· Editorial Diana. México.
Cadez, N., Raspor. P .. de Cock, A. W. A. M., Boekhout, T. y Smith, M. T. (2002). "Molecular identification and genetic diversity within species of the genera Hanseniaspora and Klockera." FElvfS Yeast Res 1, 279-289.
Cappello. M. S., Bleve. G., Grleco. F., Dellaglio, F. y Zacheo, G. (2004). "Characterization of Saccharomyces cerevisiae strains isolated from must of grape grown in experimental vineyard." Journal of Applied Microbiology 97, 1274-1280.
Carvalho, C. M., Rocha, A .. Estevinho. M. L. F. y Choupina, A. (2005). "ldentification of honey yeast species based on RFLP analysis of the ITS region." Ciencia y Tecnología Alirnentaria 5, 11-17.
Cavazzan. "\l. (1995). ··Fabricación de vinos espuinosos."Editorial Acribia. S. A. Zaragoza España.
Clcmente-Jimenez, J. M., Mingorance-Cazorla, L., Martínez-Rodríguez, S., Las HerasYázquez. F. J. y Rodríguez-Vico. F. (2004). "Molecular characterization and oenological properties of v.·ine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must." Food Microbiology 21, 149-155.
Coco!in, L. y Milis, D. A. (2003). "Wine Yeast Inhibition by Sulfur Dioxide: A Comparison of Cu!ture-Dependent and Independent Methods." American Journal of Enology· and Viticulture 54, 125-130.
Conabio (2005). ··Magueyes y Mezcales·» http://realminero.com.mxlrea!minero/images/pdf/magueyes.pdf
Cotan, E., Cotan, M., Levert D., Casaregola, S. y Sohier, D. (2006). "Yeast ecology in French cider and b!ack olive natural fermentations." lnternational Joumal of Food Microbiology 108, 130-135.
Diario Oficial de la Federación (DOF). 1997. Norma Oficia! Mexicana-NOM-070-SCFI-1994. Bebidas Alcohólicas-Mezcal-Especificaciones., México, D. F.
Divo!, B., Miot-Sertier, C. y Lonvaud Fune!, A. (2006). "Genetic characterization of strains of Saccharomyces cerevisiae responsible for "refermentation" in Botrytisafected wines "Joumal of Applied Microbiology 100, 516-526.
Escalante-Minakata, P., Biaschek, H. P., Barba de la Rosa, A. P., Santos, L. y De LeonRodriguez, A. (2008). "Identification of yeast and bacteria involved in the rnezcal fermentation of Agave salmiana." Letters in Applied Microbiology 46, 626-630.
Esteve-Zarzoso, B., Belloch, C., Uruburu, F. y Querol, A. (1999). "Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal interna!
65
transcribed spacers." International .lournal of Systematic Bacteriology 49, 329-337.
Esteve-Zarzoso. B., Peris-Torán, M. J .. Rafl!ón, D. y Quero\, A. (2001). "Molecular characterisation of Hanseniaspora species." Antonie Van Leeuwenhoek 80, 85-92.
Fernandez-Espinar, M. T., Martorell, P., De Llanos, R. y Querol, A. (2006). ··Molecular Methods to Identify and Characterize Yeasts in Foods and Beverages. ·· en Amparo Quera!, G. H. F. (Ed). Yeasts in Food and Beverages.
Fleet. G. H. (2006). The Commercial and C'ommunity Significance of Yeasts in Food and Beverage Production. En: Springer, V. B. H. (Ed). Yeasts in Food and Beverages.
Frazier, W.C. y Westhoff, D. C. (1993). ·'Microbiología de los Alimentos''. 4a ed. Acribia. Zaragoza.
Gallardo Valadez, J., Gschaedler Mathis. A. C .. Cházaro Basáñes, M. J., Rodríguez Domínguez, J. M., Tapia Campos, E., Villanueva Rodríguez, S .. Salado Ponce, J. H .. Villegas García. E .. Medina Niño. R .. Aguirre Ochoa, M. y Vallejo Pedraza. M. (2008) ... La Producción de Mezcal en el Estado de lv!ichoacán:· Gobierno del Estado de Michoacán. Morelia. Michoacán. Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco.
García-Mendoza. A. y Galván R. 1995. Riqueza de las familias Agavaceae y No!inaceae en :viéxico. Bol. Soc. Bot. México 56: 7-24.
García-Mendoza. A. (1998). "Con Sabor a Maguey Guia de la coh!cción nacional de agavacea.~· y nolináceas del jardin botánico del ins1i1u10 de biología. - f_/1\/AA4 en México. Universidad Nacional Autónoma de México. México D.F.
Gentry. H. S. (1982) ... Agave.1· (~l Continental l'v'orth An1erico."The University of Arizona Press, Tucson. Arizona, USA.
Guilla1nón, J. M .. Sabaté, J .. Barrio, E .. Cano. J. y Querol, A. (1998). "Rapid identification of wine yeast spccies based on RFLP analysis of the ribosom~J interna! transcribed spacer (ITS) region." Arch l"1icrobiol 169, 387-392.
Hierro. N .. González. A .. Mas. A. y Gui!lamón. J. M. (2006). "Diversity and evo!ution of non-Saccharomyces yeast populations duringwinefennentation:efectogrape rípenessand cold maceration." FEM.S Yeasl R.es 6, 102- 1 1 1.
Kurtzman. C. P. y Robnett, C. J. ( 1998). "!dentification and phylogeny oj·a\·con1ycetous yeas'fs .from analysi.1· of nuclear large subunit (26SJ ribosoma/ Dlv'A portia/ sequences." Antonie Van Leeuwenhoek 73, 331-371.
Lachance, M. A. (1995). "Yeast communities in a natural tequila fermentation." Antonie VanLeeu>1:enhoek68, 151-160.
Lachenmeier, D. W., Sohnius, E.-M., Attig, R. y Lopez. M. G. (2006). "Quantlfication ofSe!ected Vo[atile Constituents and Anions in Mexican Agave Spirits (Tequib, Mezcal, Soto[, Bacanora)." Journal of Agricultura! and Food Chemistry 54, 3911-3915.
Lappe-Oliveras, P., Moreno-Terrazas, R., Arrizón-Gavino, J., Herrera-Suárez, T., García-Mendoza, A. y Gschaedler-Mathis, A. (2008). "Yeasts associated with the production of Mexicanalcoholic nondistilledand distilled Agave beverages." FEMS Yeast Res 8, 1037-1052.
Las Heras Vázquez, F. J., Mingorance Cazor!a, L .. Clemente Jimenez, J. M. y Rodriguez-Vico, F. (2003). "Identification ofyeast species from orange fruit and juice by RFLP and sequence analysis of the 5.8S rRNA gene and the two interna! transcribed spacers." FEMS Yeast research 3, 3~9.
66
Martínez, C., Gac, S., Lavín. A. y Ganga, M. (2004). "Genomic characterization of Saccharomyces cerevisiae strains isolated from wine-producing areas in South America." Journal of Applied Microbiology 96, 1161-1168.
Naumova, E. S., Korshunova, l. V., Jespersen, L. y Naumov, G. I. (2003). "Molecular genetic identification of Saccharomyces sensu stricto strains from African sorghum beer." FEA1S Yeast Res 3, 177-184.
Nisiotou, A. A. y Nychas, G.-J. E. (2007). "Yeast Populatíons Residing on Healthy or Botrytis-Infected Grapes from a Vineyard in Attica, Greece." Applied and Environmenta/ Microbiology 73, 2765-2768.
Orberá-Ratón, T. (2004). "Métodos moleculares de identificación de levaduras de interés biotecnológico." Revista Jberoamercana de Mico logia 21, 15-19.
Pa!lmann, C. L., Brown, J. A., Olineka, T. L., Coco!in, L .. Milis, D. A. y Bisson, L. F. (2001). "Use of WL medium to profile native flora fermentations." American Journa! o/Enoiogy and Viticufture 52, 198-203.
Pretorius, l. S. (2000). "Tailoring wine yeast far the new millennium: novel approaches to the ancient art of winemarking." reas! 16, 675-729.
Pulvirenti, A .. Caggia, C., Restuccia, C .. Gu!lo, M. y Giudici, P. (2001). "DNA fingerprinting methods used for identification of yeasts isolated from Sici!ian sourdoughs." Annais oflvficrohiology 5 ! , 107-J 20.
Renouf. V., Falcou, M._ Miot-Sertier. C .. Perello. M.C .. De Revel, G. y Lonvaud Funel, A. (2006). "[nteractions bet\veen Brettanomyces hruxel!ensi1· and other yeast species during the initial stages of winemaking." Journaf (~l Applied !v!icrobioloy;y 100, 1208-1219.
Roinano. P .. Capece. A. y Jespersen. L. (2006). Taxononlic and Ecologica/ Diversity o/" Food onJ Ben:ragl:' Yeasf.\· en Amparo QueroL G. H. F. (Ed). Yeasls in Food und Beverages.
Tapia-Tussell. R .. Lappe. ? .. U!loa. M .. Quijano-Ramayo. A., Cáceres-Farfán. M .. Larqué-Saavedra, A. y Perez-Brito, D. (2006). "A Rapid and Simple Method for DNA Extraction Froin Yeasts and Fungi lsolated From Agave .fourcro.vdes." /\!folecu!ar Biolechno!ogy 33, 67-70.
Trost. A .. Graf. B .. Eucker. J.. Sezer. O .. Possinger. K .. GObel. U. B. y Ada1n. T. (2004). "[dentification of clinically re!evant yeast by PCR/RFLP." Journa! í~f
/vlicrohio!ogical Mezhod.\' 56, 201.2 I 1.
BIBLIOTECA CUCBA 67