UNIVERSIDAD DE TALCA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
MAGISTER EN HORTICULTURA
OBTENCIÓN DE UN CONCENTRADO DE ANTIOXIDANTES PROVENIENTE DE MANZANA
DE PIEL Y FRUTOS PEQUEÑOS DE RALEO DE MANZANA SOBRE SÍNDROME
METABÓLICO EN UN MODELO ANIMAL MURINO
TESIS DE GRADO
MAURICIO ANDRÉS POBLETE BUSTAMANTE
TALCA, CHILE
2012
UNIVERSIDAD DE TALCA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
OBTENCIÓN DE UN CONCENTRADO DE ANTIOXIDANTES PROVENIENTE DE MANZANA
DE PIEL Y FRUTOS PEQUEÑOS DE RALEO DE MANZANA SOBRE SÍNDROME
METABÓLICO EN UN MODELO ANIMAL MURINO
POR
MAURICIO ANDRÉS POBLETE BUSTAMANTE
Presentada a la Universidad de Talca
Como parte de los requisitos para optar
Al grado académico de
MAGISTER EN HORTICULTURA
TALCA, CHILE
2012
COMISIÓN EVALUADORA
Iván Palomo Gonzalez
Tecnólogo Médico, Dr.
Facultad de Ciencias de Salud
Universidad de Chile
Iván Razmilic Bonilla
Químico, Dr.
Instituto de Química de los Recursos Naturales
Universidad de Talca
PROFESOR TUTOR
José Antonio Yuri Salomón
Ingeniero Agrónomo, Dr.
Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad de Talca
Agradecimientos
La idea de ingresar al programa era aprender algo nuevo, en lo que estaba trabajando pero sinconocimientos en “el como” funcionaban los organismos vegetales…. Creo que fue unaexperiencia enriquecedora que ayudo a aumentar mis conocimientos en temas en los que no eraespecialista, no fue para nada fácil, pero creo que con esto estoy terminando un largo viaje deaprendizaje.
Es difícil comenzar a pensar y escribir las personas que de alguna u otra manera me ayudaron aterminar este largo proceso que comenzó hace aproximadamente 3 años.
Y para no dejar a nadie fuera, creo que una manera bastante lógica es ordenarlo y dividirlos endos grupos: Uno profesional/educacional y otro personal.
Profesional:
Al primero que debiera agradecer es al profesor José Antonio Yuri por abrirme las puertas de unode los Centro Tecnológicos con más prestigio que cuenta la Universidad de Talca, el Centro dePomáceas. Digo esto porque es un referente nacional en tema de fruticultura y que tuve laoportunidad de trabajar ahí. Al conocer la dinámica interna de este centro me llevo a conocercómo se pueden realizar investigaciones y que tengan un impacto concreto en la industria.
A la Sra. Amalia Neira, me gustaría agradecer su paciencia y ayuda, que durante lasconversaciones que tuvimos, me sirvió en todas las dificultades metodológicas que nos fuepresentando mientras avanzábamos en el desarrollo de la tesis. Y por intermedio de ella a IvettePeña que me fue una tremenda ayuda en las mediciones de fenoles y capacidad antioxidante, ypor intermedio de ella al Centro de Pomaceas que me ayudaron de alguna u otra manera.
A los profesores guías, Dr. Iván Palomo y Dr. Iván Razmilic, por auxiliarme en ámbitos delconocimiento que yo no manejaba.
Al Sr. Reyes que me ayudo en toda la parte de HPLC y química próximal.
A Lisbet, que en el último tiempo me tubo una paciencia extraordinaria.
Al Programa de Capital Humano Avanzado de CONICYT y el Gobierno Regional del Maule,que me apoyaron en los dos primeros años y que sin su ayuda no hubiera podido entrar alPrograma de Magíster en Horticultura.
Personal:
Una de las personas que más me ayudo fue Luis, gracias por facilitarme todas las instalaciones einsumos que podía, no tan solo con la tesis…. Y por la amistad en los años en que estuve en laUniversidad…. Que no fueron pocos….
A Rodrigo por compartir su conocimiento en cómo trabajar con ratones en cautiverio, terminar yprocesar los datos obtenidos… Además que fuiste un gran apoyo cuando la paciencia seagotaba….
A mis padres, que me forjaron como persona y en gran parte a ellos estoy ahora aca terminandomi segundo programa de Magíster….
Según creo, a la persona que más debiera agradecer es a mi Natalia, que durante estos tres años latuve que dejar de lado para dedicarme a estudiar, siendo una gran apoyo en aquellos momentosen los que las fuerzas me abandonaban. Además, de acompañarme a revisar el ensayo con losanimales o cuando me explicaba las formulas inentendibles de cierto ramo…. Gracias por lapaciencia……..
A mi gran compañera Natalia
que sin su ayuda y apoyo
no hubiera sido capaz de terminar
1
I. RESUMEN
Chile, desde finales de 1980, está pasando por un extraordinario momento económico que lo ha
llevado a situarse como líder en Latinoamérica según una gran cantidad de indicadores
(Desarrollo Humano, nivel de pobreza, Producto Interno Bruto, etc.). Es así que nuestro país fue
invitado a formar parte de la Organization Economic Cooperation Development (OECD), grupo
de países con un fuerte desarrollo socio-económico, como Estados Unidos, Japón, Noruega,
Alemania, Corea del Sur entre otros. En temas de fruticultura, el nivel de liderazgo que ha
alcanzado está industria en nuestro país lo sitúa en un nivel de categoría mundial, logrando ser
lideres exportadores del hemisferio sur de fruta fresca en diversas especies como manzana, uva
de mesa, kiwi, cerezas por citar algunos. Y actualmente también tiene una posición de líder de
exportación en fruta procesada con frambuesas y arándanos. Aprovechando las fortalezas de ser
un proveedor confiable de alimentos, entre otras cualidades de nuestro país.
Este periodo de gran brillantez trae consigo nuevos desafíos, los cuales se debe hacer cargo la
sociedad en su conjunto y no tan solo el Estado. Debido a que la globalización y la rapidez de las
investigaciones han transformado al mundo en el que Chile se encuentra inserto y que en la
muchas ocasiones debe competir con países con mayores recursos. Una de las alternativas, que se
han barajado para hacer frente a este nuevo escenario es la utilización de las ventajas
competitivas que presenta nuestro país para el desarrollo de la fruticultura, como es el clima y la
disposición de agua (aunque cada vez sea más escaso este vital elemento). Por otra parte, es
necesario aumentar la competitividad de la industria fruticultura en general, para evitar la entrada
de nuevos competidores que pueden dejar a nuestro país fuera del mercado de exportación de
fruta. Esto se deberá conjugar con las exigencias de los mercados, que cada vez están poniendo
mayores exigencias, pero que puede ser una gran oportunidad de negocios para los productores
nacionales. Una de las demandas crecientes son los alimentos con propiedades biológicas para
evitar enfermedades o suplementos alimenticios de origen natural que signifiquen beneficios para
la salud de las personas, especialmente en la última etapa de la vida.
2
La producción de manzana fresca es uno de los puntales en la fruticultura nacional, siendo
solamente superada en cantidad de producción por la uva de mesa. Para la Región del Maule es la
segunda fuente de ingresos económicos, según la Agencia Regional de Desarrollo Productivo
Maule (Agencia Regional de Desarrollo Productivo Maule, 2010). Con el fin de aumentar la
competitividad de este sector es que el trabajo realizado toma una gran importancia, porque se
está buscando utilizar diversos componentes que no están siendo comercializables en la
producción de manzana, ni tampoco se les ha asignado valor. Lo que traería consigo aumentar la
competitividad de un sector económico que ha sido fuertemente golpeado por la valorización del
peso en desmedro del dólar. Se desea desarrollar un nuevo producto en base de los desechos y/o
subproductos de la industria de la manzana, por lo que se orientaron los esfuerzos en dos puntos
claves:
Agregación de valor en el fruto pequeño (raleo), el cual es descartado en alrededor de un
70%, con el fin de alcanzar mayores calibres y por consiguiente mayores precios de venta
en la fruta fresca.
Por otra parte, utilizar los desechos industriales (piel) que son eliminados en el proceso de
producción industrial de chip de manzana.
Se tomaron en consideración para la extracción de antioxidantes desde estos residuos diferentes
factores que facilitaran el escalamiento desde el laboratorio hacia la industria. El primero fue
descartar distintas metodologías que no son utilizadas por la agroindustria en sus procesos. El
segundo paso fue estudiar si existían diferencias entre los cultivos orgánicos y tradicionales,
especialmente en la extracción desde el fruto pequeño para estudiar la existencia de agroquímicos
utilizados en sus procesos y que podrían estar presentes debido a que no han cumplido el tiempo
de carencia, ya que su presencia sería perjudicial para la salud. Y por último, utilizar los extractos
en un modelo animal para confirmar los posibles efectos benéficos que podrían resultar en su
administración en organismos complejos y descartar efectos nocivos agudos para la salud.
Los resultados del laboratorio demostraron que en el grupo control con dieta grasa se logro
inducir el aumento considerable de peso y valores elevados en los indicadores relacionados al
metabolismo lipídico, debido a la dieta alta en grasa o hipercalórica a la que fueron sometidos.
En cambio en los grupos en estudio que fueron sometidos a los tratamientos con los extractos
3
altos en antioxidantes, proveniente desde el desecho agroindustrial, disminuyeron los valores
hasta niveles del control normal. Concluyendo que el extracto alto en antioxidantes provenientes
de la manzana se encuentra relacionado con la disminución de colesterol total y colesterol LDL y
a su vez un aumento de colesterol HDL.
4
II. CONTENIDO
I. RESUMEN ...............................................................................................................................1
II. CONTENIDO ...........................................................................................................................4
III. INDICE DE FIGURAS.............................................................................................................5
IV. INDICE DE TABLAS ..............................................................................................................9
V. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................11
VI. HIPOTESIS.............................................................................................................................12
6.1 Objetivo General..............................................................................................................12
6.2 Objetivo Específico .........................................................................................................12
VII. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ..............................................................................................13
VIII. METODOLOGÍA............................................................................................................21
8.1 Recolección Y Extracción ...............................................................................................21
8.2 Preparación De Los Extractos .........................................................................................22
8.3 Caracterización Química .................................................................................................24
8.4 Análisis Estadístico..........................................................................................................25
8.5 Preparación De Las Dietas. .............................................................................................26
8.6 Ensayos Biológicos..........................................................................................................26
8.7 Análisis Bioquímicos.......................................................................................................28
8.8 Análisis De La Dieta........................................................................................................28
IX. RESULTADOS.......................................................................................................................30
9.1 Búsqueda De La Metodología Óptima De Extracción De Compuestos Fenólicos Y
Actividad Antioxidante...............................................................................................................30
5
9.1.1 Evaluación De Concentración De La Mezcla Etanol/H2O.......................................30
9.2 Cuantificación De Los Extractos .....................................................................................38
9.3 Composición De Las Dietas Y Los Extractos .................................................................41
9.4 Ensayos Biológicos..........................................................................................................42
9.4.1 Ensayo De 10 Ml De Extracto / 250 Ml De Volumen Final ....................................42
9.4.2 Ensayo Concentración Constante De 400 Mg / Kg Peso De Raton.........................50
X. CONCLUSIONES ..................................................................................................................57
XI. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................59
III. INDICE DE FIGURAS
FIGURA 1. COMPOSICIÓN DE DIFERENTES ANTIOXIDANTES PROVENIENTES DE MANZANA.
OBTENIDO DESDE MANACH, ET AL 2004. 14
FIGURA 2. PERFILES DE LIPOPROTEÍNAS EN DIFERENTE MODELOS. LAS LIPOPROTEÍNAS FUERON
SEPARADAS A PARTIR DEL PLASMA Y FUERON PUESTAS A CORRER 100 UL EN UNA COLUMNA
SUPEROSA 6 EN UN FLUJO DE 0,5 ML/MIN EN UN BUFFER QUE CONTENÍA 0,15 M NACL, 0,01 M
NA2HPO4 Y 1 MM DE EDTA. CUARENTE FRACCIONES DE 0,5 ML FUERON RECOLECTADAS Y LA
CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL FUE CUANTIFICADA ENTRE LAS FRACCIONES 10 – 40.
TIPICAMENTE, VLDL ELUYE ENTRE LA FRACCIÓN 15 – 20, LDL EN FRACCIÓN 21 -27 Y HDL EN
FRACCIÓN 28 – 34. (A) PERFIL DE LIPOPROTEÍNAS COMPARANDO EL PERFIL “NORMAL” DE LA
PERSONA CON UN MODELO C57BL/6J. (B) C57BL/6J Y RATÓN LEP R DB/DB. EL PEAK LDL/HDL1
ELUYE EN LA FRACCIÓN 23 – 27. (C) PERFIL DE LIPOPROTEÍNA DE RATAS DELGADAS LDLR -/-
Y RATAS APOE –/-. (D) PERFIL DE LIPOPROTEÍNA DE OBESAS LDLR -/- Y RATAS APOE –/-.
(KENNEDY ET AL., 2010) 20
FIGURA 3. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC EN LAS DIFERENTES
CONDICIONES DE 40% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN) 34
6
FIGURA 4. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC PARA DIFERENTES QERCITINAS
EN DISTINTAS CONDICIONES DE 40% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN)
35
FIGURA 5. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC EN LAS DIFERENTES
CONDICIONES DE 80% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN) 35
FIGURA 6. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC PARA DIFERENTES QERCITINAS
EN DISTINTAS CONDICIONES DE 80% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE
EXTRACCIÓN) 36
FIGURA 7. CONCENTRACIÓN DE QUERCETINAS POR GRAMOS DE TEJIDO EXTRAÍDO EN 80%
ETANOL EN DIVERSAS CONDICIONES DE TEMPERATURA Y TIEMPO. 37
FIGURA 8. CONCENTRACIÓN DE QUERCETINAS POR GRAMOS DE TEJIDO EXTRAÍDO EN 40%
ETANOL EN DIVERSAS CONDICIONES DE TEMPERATURA Y TIEMPO. 37
FIGURA 9. CONSUMO DIARIO DE ALIMENTACIÓN TOTAL DIARIA GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL
ENSAYO 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI
TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y
GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL
DIETA GRASA (DG). 42
FIGURA 10. EVOLUCIÓN DEL PESO PROMEDIO POR GRUPO EN ESTUDIO EN EL ENSAYO DE 10 ML
DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT),
GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH
PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). 43
FIGURA 11. GANANCIA DE PESO DE TODOS LOS GRUPOS EN ESTUDIO FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI
TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y
GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL
DIETA GRASA (DG). 44
FIGURA 12. CONSUMO DE MG DE FENOLES DIARIOS EN CADA UNA DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO
EN EL ENSAYO DE 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL 45
FIGURA 13. INGESTA DE FENOLES PROMEDIO DURANTE EL ENSAYO EN LOS DIFERENTES GRUPOS
EN ESTUDIO.FUJII ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO
(GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) YGRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP). 45
7
FIGURA 14. CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL EN CADA UNOS DE LOS GRUPOS EN
ESTUDIO Y LOS GRUPOS CONTROL. FUJII ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY
SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP)
Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). A, B, C, D, E,
F, G VALOR P<0,001. 47
FIGURA 15. PORCENTAJE PROMEDIO DE GANANCIA DE TEJIDO ADIPOSO EN COMPARACIÓN CON
EL PESO INICIAL FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO
(GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP),
CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). * VALOR P < 0,05 Y ** VALOR
P < 0,05 48
FIGURA 16. RESULTADOS DE ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES DE COLESTEROL TOTAL
(COL T), COLESTEROL LDL (COL LDL), COLESTEROL HDL (COL HDL), TRIGLICERIDOS (TRIG),
TEJIDO ADIPOSO BLANCO (T ADIPOSO). PARA ENSAYO 10 ML DE EXTRACTO EN 250 ML DE
SOLUCIÓN FINAL 49
FIGURA 17. CONSUMO DIARIO DE ALIMENTACIÓN POR GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL ENSAYO
400 MG / KG PESO DE RATON. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH
ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI
PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG) 50
FIGURA 18. EVOLUCIÓN DEL PESO PROMEDIO POR CADA GRUPO EN ESTUDIO EN EL ENSAYO DE
400 MG / KG PESO DE RATON 51
FIGURA 19. GANANCIA DE PESO DE TODOS LOS GRUPOS EN ESTUDIO PARA EL ENSAYO 400
MG/KG PESO DE RATON. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH
ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI
PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (CN) Y CONTROL DIETA GRASA (CG). * VALOR P < 0,05
Y ** VALOR P < 0,05 52
FIGURA 20. CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL EN CADA UNOS DE LOS GRUPOS EN
ESTUDIO PARA EL ENSAYO DE 400 MG/ KG DE PESO Y LOS GRUPOS CONTROL. FUJI ORGÁNICO
(FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH
TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA
NORMAL (CN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).A VALOR P<0,05 . 54
FIGURA 21. PORCENTAJE PROMEDIO DE GANANCIA DE TEJIDO ADIPOSO EN ENSAYO DE 400
MG/KG DE PESOEN COMPARACIÓN CON EL PESO INICIAL FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI
8
TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y
GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (CN) Y CONTROL
DIETA GRASA (DG). A VALOR P < 0,001 Y B VALOR P< 0,05 55
FIGURA 22. RESULTADOS DE ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES DE COLESTEROL TOTAL
(COL T), COLESTEROL LDL (COL LDL), COLESTEROL HDL (COL HDL), TRIGLICERIDOS (TRIG),
TEJIDO ADIPOSO BLANCO (T ADIPOSO) E HIGADO (HIGADO) EN ENSAYO DE 400 MG / KG PESO
DE RATON 56
9
IV. INDICE DE TABLAS
TABLA 1. ANALISIS ANOVA DE LA CANTIDAD DE FENOLES EN LOS EXTRACTOS................................ 31
TABLA 2. RESULTADOS CON LAS CONCENTRACIONES SIGNIFICATIVAMENTE MAYORES DE
FENOLES EN LOS EXTRACTOS .................................................................................................................... 31
TABLA 3. ANALISIS ANOVA DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN LOS EXTRACTOS ....................... 32
TABLA 4. RESULTADOS CON LAS SIGNIFICATIVAMENTE MAYOR ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN
LOS EXTRACTOS............................................................................................................................................. 33
TABLA 5. RESULTADOS PRIMERA ETAPA DE EXTRACCIÓN. *LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE SON
LOS MG DE ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO-1 MATERIAL VEGETAL .... 39
TABLA 6. RESULTADOS SEGUNDA ETAPA DE EXTRACCIÓN *LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE SON
LOS MG DE ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO-1 DE MATERIAL VEGETAL
............................................................................................................................................................................. 40
TABLA 7. RESULTADOS DE LOS EXTRACTOS DEFINITIVOS. (*) LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE ES
EL MG DE ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO-1 DE MATERIAL VEGETAL 40
TABLA 8. COMPOSICIÓN DE LAS DIETAS, DE ACUERDO A LA QUÍMICA PROXIMAL. (*) ELN
ELEMENTO LIBRE DE CARBONO ................................................................................................................ 41
TABLA 9. RESULTADOS DE QUÍMICA PROXIMAL Y CONTENIDO DE FENOLES PARA LOS
DIFERENTES EXTRACTOS ............................................................................................................................ 41
TABLA 10. INGESTAL TOTAL POR CADA GRUPO EN ESTUDIO DE ALIMENTACIÓN DURANTE EL
ENSAYO 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL ............................................................ 43
TABLA 11. RESUMEN DE LOS RESULTADOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL HDL
(COL HDL), GLICEMIA (GLI). PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT),
GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL
(GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). LOS
RESULTADOS SE ENCUENTRAN CON EL ERROR DE LA MEDIA (E.M)............................................... 46
10
TABLA 12. RESUMEN DE LOS PESOS DE DIFERENTES ORGANOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT),
COLESTEROL HDL (COL HDL), COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL
LDL (COL LDL). PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY
SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y
FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).......................... 47
TABLA 13. INGESTAL TOTAL DE ALIMENTACIÓN POR CADA GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL
ENSAYO 400 MG / KG PESO DE RATON FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY
SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP)
Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG) ...................... 51
TABLA 14. RESUMEN DE LA CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL HDL
(COL HDL), COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL LDL (COL LDL).
PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO
(GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP),
CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). LOS RESULTADOS SE
ENCUENTRAN CON EL ERROR DE LA MEDIA (E.M) ............................................................................... 53
TABLA 15. RESUMEN DE LOS PESOS DE DIFERENTES ÓRGANOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT),
COLESTEROL HDL (COL HDL), COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL
LDL (COL LDL). PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY
SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y
FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). CON EL
RESPECTIVO ERROR DE LA MEDIA (E.M) ................................................................................................. 54
11
V. INTRODUCCIÓN
La pérdida de competitividad del sector frutícola nacional le ha llevado a disminuir los márgenes
de ganancia que tuvieron en el pasado reciente. Una de las razones, es la falta de inversión en la
búsqueda de nuevas formas de “agregar valor” a los productos y solamente han aprovechado las
ventajas competitivas que presenta nuestro país, como son las condiciones edafoclimáticas
idóneas para la producción frutícola, acceso relativamente a fácil a agua para riego, baja
presencia de plagas y enfermedades, entre otros factores. Por otra parte, la adopción de
tecnologías traídas desde el extranjero ha sido un factor común en la agricultura nacional, lo que
crea una alta dependencia a otros países que muchas veces son competidores. Esto ha motivado al
Centro de Pomáceas (CP) a realizar investigaciones que puedan revertir esta situación, buscando
nuevas fuentes de valor en productos no utilizados por la industria frutícola nacional, como son la
fruta de raleo y los desechos de los procesos industriales en los que la materia prima es la
manzana. Una de las características que presenta este fruto es la alta cantidad de antioxidantes de
tipo fenoles presentes en la piel, lo que lo hace atractivo para realizar I + D en la obtención de un
nuevo producto. Además, por investigaciones llevadas a cabo por el CP se conoce que los niveles
de fenoles encontrados entre los 35 y 45 días después de plena flor son altos en comparación con
otros estadios de desarrollo del fruto de la manzana. Lo que sumado, a que es la fecha en la que
se realiza el proceso de raleo, ofrece una gran cantidad de material vegetal disponible y no
aprovechado que puede ser de gran valor para combatir enfermedades crónicas como el cáncer, la
diabetes y problemas cardiovasculares, que han aumentado su prevalencia, principalmente por el
empeoramiento de los estilos de vida de las personas, en países como Chile.
El objetivo de la tesis fue encontrar una metodología de extracción eficiente e inocua de
antioxidantes, para el desarrollo de un extracto que pudiera ser administrado en el modelo animal
de síndrome metabólico like. Con el fin de estudiar su comportamiento y con especial énfasis en
los posibles resultados que se pudieran obtener beneficiosos que se pudieran extrapolar a
personas, como por ejemplo revertir las diferentes manifestaciones de este síndrome, como son
hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, diabetes, obesidad e hipertensión.
12
VI. HIPOTESIS
La cantidad de fenoles y actividad de los antioxidantes proveniente de la piel de manzana y frutos
pequeños de raleo es capaz de producir mejoras en la condición patológica que presenta un
Modelo Murino de Síndrome Metabólico – like.
6.1 OBJETIVO GENERAL
Estudiar diversas variables agronómicas en fruto pequeño y subproductos de manzana que
intervienen en la concentración de antioxidantes y su efecto en un Modelo Murino de Síndrome
Metabólico-like.
6.2 OBJETIVO ESPECÍFICO
Determinar un protocolo eficiente y saludable de extracción de antioxidantes fenólico con énfasis
en quercetinas, sin la utilización de nitrógeno líquido y ultrasonido.
Caracterizar los extractos mediante su capacidad antioxidantes y contenido de fenoles.
Determinar si existe acción benéfica del extracto sobre el modelo animal y si esta es dependiente
de la concentración de los antioxidantes.
13
VII. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Chile ha privilegiado la exportación de recursos naturales como la minería (principalmente
cobre), salmón, productos forestales y la agricultura. A principios de los años noventa este fue
una inyección importante a la economía nacional alcanzando registros de crecimiento nunca antes
visto en la historia nacional, lo que fue ayudado de gran manera por el esfuerzo de los
productores nacionales, el alto valor del dólar y la apertura de Chile hacia el mundo
(Globalización). En los últimos años las diversas circunstancias financieras y económicas del
mundo han incidido en la apreciación del peso local y la disminución del precio del dólar, lo que
se ha traducido en una pérdida en la competitividad de los productos horto – frutícolas
nacionales. Uno de los factores que explican la disminución en la curva de crecimiento del país es
que se está alcanzando el límite de los Factores Productivos, lo que se ha visto reflejado en el
estancamiento en el crecimiento nacional, por lo que es necesario comenzar a buscar nuevas
fuentes de creación de valor aprovechando las bases productivas ya instaladas, es por esto que si
se desea seguir creciendo y mantener el nivel de liderazgo a nivel internacional que se ha
alcanzado hasta el momento, es importante innovar para proporcionar “valor agregado” a sus
productos.
En el contexto de aumentar la cartera de los productos ofrecidos por Chile en el mercado mundial
es necesario innovar para incrementar los retornos de los fruticultores en general, la comunidad
científica nacional ha comenzado a estudiar los atributos que pueden tener diversos alimentos,
por el envejecimiento de la población y los problemas que esto puede causar, principalmente por
el aumento de enfermedades crónicas no transmisibles que esto acarrea y su correspondiente
aumento en los costos de salud que se han experimentado en los últimos años, lo que se ha
traducido en un cambio de enfoque de los consumidores de frutas y hortalizas en países
desarrollados (principales mercado de destino de estos productos) y en nuestro país.
Desde el punto de vista nacional, es prioritario realizar estudios que comprueben características
que demandan los exigentes mercados internacionales en donde se exportan nuestros productos,
por lo que se podrían obtener mejores precios de venta, y por otra parte se pueden identificar y
aislar estos componente a partir de material de desecho (fruta de raleo, fruta con daño o
14
subproductos) para ser comercializado en forma independiente como un nuevo producto. Es por
esto que la tendencia mundial se ha centrado en identificar los componentes biológicamente
activos de los alimentos que puedan disminuir el riesgo de enfermedades (Diplock et al., 2007).
Debido a lo anterior es que el interés de los productores nacionales se conjuga (aumento de
ganancias) con las demandas de los mercados (mejorar calidad de vida en la vejez).
Lo anterior, ha llevado al mercado de preocuparse de ciertas propiedades de los alimentos, es por
esto que la manzana adquiere un importante rol, debido a que es uno de las principales frutos
consumidos a nivel mundial y uno de los más importante frutales cultivados en el país, el cual
representa una significativa fuente laboral y de ingresos, en especial en la región del Maule
llegando a un 5% del PIB Regional, superado exclusivamente por la producción de celulosa(Agencia Regional de Desarrollo Productivo Maule, 2010). Por otra parte, la confirmación por
medio de diferentes reportes encontrados en la literatura demuestran que la manzana posee una
gran cantidad de antioxidantes, en especial fenoles (Huber & Rupasinghe, 2009; Lee, 2003; J.A. Yuri, et al. 2009). Lo anterior, se suma a que es una de las frutas que aporta una cantidad
importante de antioxidantes fenólicos consumidos en la dieta de las personas, según estudios
previos representa el 22% de los fenoles consumidos (Vinson, et al. 2001). Los compuestos
fenólicos no son exclusivos de las manzanas, también existen en una gran cantidad de frutas y
hortalizas (manzanas, arándanos, frutillas, frambuesas, cebollas, ajos, etc.).
Con la finalidad de entender de mejor manera su formación en los organismos vegetales, se
puede realizar una separación de acuerdo a sus características químicas, por lo que se pueden
encontrar tanto como compuestos simples o complejos. Por lo que en organismos vegetales se
pueden encontrar compuestos simples y complejos, como ejemplo de los compuestos simples se
encuentran el ácido cafeico y el ácido clorogénico (Awad & de Jager, 2002). Ver FIGURA 1.
FIGURA 1. COMPOSICIÓN DE DIFERENTES ANTIOXIDANTES PROVENIENTES DE MANZANA. OBTENIDO DESDE
MANACH, ET AL. 2004.
15
El principal fenol complejo que se pueden hallar son los flavonoides, que presentan como
característica común 15 moléculas de carbono en su estructura (Ver FIGURA 1). A partir de los
flavonoides se pueden obtener diversas moléculas derivadas como flavononas, flavonones,
leucoantocianidinas, flavones y antocianidinas. Otras moléculas complejas son los biflavonilos
que tienen un esqueleto de C30, Benzofenonas, betacianinas y los taninos (Vermerris &Nicholson, 2007).
Los principales compuestos fenólicos que se encuentran en las manzanas son Acido clorogénico,
quercitina glucósido, quercetina xilosa, floricidina, procianidina B2, entre otras (Holderbaum, etal. 2010; Huber & Rupasinghe, 2009). La forma en que los organismos vegetales, incluidos las
manzanas, sintetizan estos compuestos es mediante la conversión de fenilalanina, el cual es
convertido a ácido shikimico por la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL), que produce la
deaminación de la fenilalanina resultando en ácido cinámico y posteriormente a ácido p-
cumarico, el que sirve como precursor de las vías metabólicas relacionadas a la formación de los
principales compuestos fenólicos en las manzanas.
La composición fenólica se encuentra determinada por diversos factores, tanto dependiente de la
planta como externos a ella. Dentro de los factores propios la ontogenia de la fruta uno de los
indicadores más importantes que se ha podido corroborar son los niveles de ciertos compuestos
fenólicos, como el ácido clorogénico, que aumentan en etapas tempranas. Algunos factores
fisiológicos involucrados en estos procesos, que podrían explicar este comportamiento y que
además se encuentran relacionados con el proceso de desarrollo de color, queda demostrada en el
experimento desarrollado por Ju en 1995. En donde frutos pequeños al interior de bolsas con
restricción de luz hasta cosecha, resultó en la inhibición de la síntesis de diversos compuestos de
tipo flavonoides. Posteriormente, unas semanas antes de cosecha, se retiró la restricción de luz a
los frutos, consiguiendo aumentar la concentración de la enzima chalcon sintasa (cataliza la
reacción desde ácido cumárico y malonyl-CoA a narigenin chalcona) lo que se tradujo en un
aumento en la síntesis de flavonoides, llegando a niveles normales previo a la restricción de luz
de los frutos.
Otro dato importante es que 40 días después de plena flor se encuentran niveles elevados de
compuestos fenólicos. Esta alza disminuye hasta encontrar los niveles más bajos 120 días
16
después de plena flor, lo que es explicado por un aumento de la actividades biosintética durante la
fase de división celular y una alta actividad enzimática (Treutter, 2001; Mayr, et al. 1995).Otros factores que han sido estudiados y que determinan las cantidades de compuesto fenólicos
en las manzanas, además del cultivar, son una serie de condiciones ambientales, nutricionales,
etc. En condiciones naturales existe mayor presencia de antioxidantes fenólicos en la piel del
fruto en comparación con otros tejidos (Drogoudi 2008). En relación a los cultivares, se ha
determinado que entre ellas muestran distintas cantidades de estos compuestos, como fue
demostrado por J. A. Yuri et al., (2009). Este trabajo muestra que existen diferencias
considerables entre cultivares y regiones agroclimáticas, encontrando mayor diferencia en el
cultivar Baeburn y mayor cantidad de antioxidantes en las regiones más frías. Otro factor que ha
sido estudiado son las condiciones de almacenamiento, Napolitano demostró que existe un
marcado aumento de antioxidantes principalmente catequinas y floricidina, cuando manzanas
sanas son almacenadas en condiciones de frío, los cuales son atribuidos principalmente al
aumento en la actividad de enzima fenilalanina amonio liasa, que es activada en condiciones de
almacenamiento por la hormona etileno, con lo que se acumulan compuestos fenólicos
principalmente en la piel. (Napolitano et al., 2004). Aunque estudios realizado por el Centro de
Pomáceas indica que la ganancia de antioxidantes es solo marginal (Resultados no publicados),
descartando la posibilidad de aumentar de manera controlada la cantidad de antioxidantes
presentes en las manzanas posterior a largos periodos de almacenamiento.
Por otra parte, en forma teórica se ha propuesto que el manejo agronómico también determina
diferencias en la presencia y cantidad de antioxidantes fenólicos, como es el cultivo orgánico y
tradicional (Brandt & Mølgaard, 2001). Esto debido a que los huertos orgánicos se encuentran
expuesto a enfermedades, resultando en que los cultivos deben desarrollar sistemas de defensa y
por consiguiente un aumento en los niveles de compuestos fenólicos. La bibliografía demuestra
que no existen diferencias entre el manejo orgánico y tradicional de diversos huertos con la
concentración de antioxidantes fenólicos en diversos cultivares (Red Delicious-Starking, Golden
Delicious, Granny Smith, Jona Gold and Royal Gala) (Valavanidis, et al, 2009; J. Yuri et al.,2012). Otros manejos agronómicos que han sido estudiados y relacionados con la concentración
de compuestos fenólicos, han determinado que consta una relación entre los niveles de
fertilizantes utilizados y los niveles de antioxidantes, en donde se encuentra una mayor
17
concentración de nitrógeno en los frutos (producto de una alta cantidad de fertilización de
nitrógeno) y una disminución de los compuestos fenólicos en los frutos.(Awad et al, 2002; Wang& Lin, 2003). Esto no ocurre en todas las especies, el efecto negativo de la alta fertilización con
nitrógeno en manzano, por ejemplo en frambuesa se ha demostrado que al aumentar la
fertilización aumentan los niveles de acido elágico, kaempferol glicosidos, cianidina glicosido(Wang & Lin, 2003). Otro factor que altera la producción de compuestos fenólicos es el riego, se
han visto diversas variaciones relacionadas en las concentraciones de antioxidantes presentes en
los frutos (Cohen et al. 1994).La importancia de los antioxidantes y los compuestos fenólicos que se generan en la manzana, es
su efecto en prevenir enfermedades crónicas que afectan a los seres humanos (Palomo et al.2010). El número de publicaciones relacionada a estas investigación se ha incrementado en
forma exponencial en la última década. Las razones son diversas pero se encuentran enfocadas a
afrontar de mejor manera la última etapa de vida, en donde enfermedades crónicas como la
diabetes miellitus, cáncer, patologías coronarias y cerebrovasculares, por citar algunas, están
altamente relacionadas con el estrés oxidativo a los que se encuentran expuestos estos tejidos(Diplock et al., 2007). La literatura muestra que la alimentación y en especial algunos
componentes de las frutas y v nberduras son capaces de disminuir la incidencia de enfermedades
cardiovasculares. (Palomo G et al., 2011)Otra corriente de investigación es el efecto de los polifenoles en enfermedades cardiovasculares.
Este tipo de patologías es una de las principales causas de muerte en las sociedades desarrolladas
y en Chile, son causadas por aumento del consumo de dieta altas en colesterol, vida sedentaria, y
por otro lado una disminución en el consumo de fruta y verduras.
El consumo de polifenoles naturales proveniente de frutas y verduras ha demostrado tener un
efecto benéfico en el sistema cardiovascular, principalmente en diversos tejidos o células como
es el endotelio, el musculo liso vascular y las plaquetas (Perez-Vizcaino & Duarte, 2010). Lo
que se traduce en una disminución de enfermedades relacionadas como son la hipertensión,
ateroesclerosis, isquemia del miocardio y accidentes cerebrovasculares. Las acciones concretas
son (Perez-Vizcaino et al 2006):
18
1) efectos vasodilatadores independientes de endotelio; 2) efecto de protección sobre el NO
(oxido nítrico) y de la función endotelial bajo condiciones de estrés oxidativo; 3) efecto de
antiagregante plaquetario;4) inhibición de la oxidación de LDL; 5) reducción de las moléculas de
adhesión y otros marcadores inflamatorios; 6) prevención de oxidación neuronal y daño
inflamatorio en el sistema nervioso central
Un efecto que no ha sido estudiado en profundidad es la acción de los antioxidantes fenólicos
provenientes de la manzana para contrarrestar el síndrome metabólico, y que ha sido asociado a
un aumento en el riesgo cardiovascular (Eckel et al. 2005). Pero existe evidencia científica
suficiente y en aumento, ha sugerido que los polifenoles provenientes de diversos organismos
vegetales llevan a disminuir los riesgos de desarrollar el Síndrome Metabólico (Cherniack, 2011;Xia & Weng, 2010).
Se denomina Síndrome Metabólico al conjunto de alteraciones metabólicas constituidas por:
obesidad central, disminución de la concentración de lipoproteína HDL, elevación de las
concentraciones de triglicéridos, aumento de la presión arterial e hiperglicemia (Eckel et al.,2005).
La importancia de este síndrome es debido a que es la antesala a diversas patologías más
complejas como son diabetes, accidentes cerebrovasculares e infartos agudos al miocardio,
siendo una de las principales causas de muerte a nivel nacional y mundial. El exceso de ingesta
de energía es en gran parte responsable por este síndrome, llevando a un inadecuado
procesamiento de dos componentes claves en el metabolismo energético del hombre, como son
los lípidos y la glucosa. Esta sobreabundancia de energía se almacena en los adipocitos, los que
en aumentar en número comienzan con la liberación de adipoquinas y citoquinas que afectan al
sistema vascular (Galic, et al. 2010; Kershaw & Flier, 2004). La gran mayoría de estas
moléculas liberan compuestos pro-inflamatorios como son factor de necrosis tumoral α (TNF –
α), interleuquina (IL) 6, 12, proteína C reactiva, proteína quimioatractante de macrófago 1, los
que se traducen en un aumento del stress oxidativo en los tejidos y células relacionados al sistema
vascular, esto sumado al exceso de lípidos que se encuentran en circulación aumentan los factores
para la generación de placas ateroescleróticas. Con todo lo anterior se logra un desbalance
19
energético e inflamatorio que termina en diversas enfermedades crónicas como diabetes y
enfermedades cerebrovasculares (Grundy, 2012).La prevalencia de este síndrome varía, pero según la literatura se encuentra entre 15% y un 40%.
Según la Fundación Internacional de Diabetes cerca de un cuarto de la población de países
desarrollados presenta este síndrome (Cherniack, 2011). En Chile, la Encuesta Nacional de
Salud realizada durante año 2003 por el Ministerio de Salud, en una población de 3.619
individuos mayores de 17 años mostró que la prevalencia de SM fue de 22,6%, para hombres
22,6% y mujeres (23%,), pero siendo dependiente de la edad: 25-44 años (17,9%), 45-64 años
(36,5%) y sobre 65 años (48%) (Ministerio de Salud, 2003).
Los modelos experimentales en animales han sido ampliamente validados en la comunidad
científica por entregar resultados en organismo complejos que pueden ser asimilables a la
realidad que ocurre en humanos. En relación al Síndrome Metabólico, la especie animal más
utilizado son los roedores. Éstos permiten un estudio fácil independiente del tiempo de duración
y de los aspectos a investigar. Lo que sí, aunque permite realizar estudios en cortos periodos de
tiempo y en ambientes controlados, existen diferencias entre el Síndrome Metabólico en ratones
que en humanos, como por ejemplo los perfiles de HDL y LDL siendo diferente en ambos
organismos (Kennedy, et al. 2010).
En general, obesidad e insulina - resistencia coincide en los modelos en ratas. Un estudio
realizado por Moore, se llevó a cabo para probar el efecto de una dieta alta en grasas y una dieta
normal (25% y 4,4% de grasa, respectivamente), durante un período de 40 días, en ratones CF-1,
en dos experimentos separados, para inducir la manifestación del SM, lo cual corresponde al
denominado modelo murino de SM-like. Los parámetros medidos para estos efectos fueron el
peso de los alimentos y agua ingeridos, el peso de los ratones y de sus órganos seleccionados
(tejido adiposo, gastrocnemio, hígado y corazón), a su perfil bioquímico (glicemia, ácido úrico,
nitrógeno ureico, triglicéridos, colesterol, proteínas y albúmina) y el porcentaje de grasa en el
hígado (Moore-Carrasco et al., 2008). En los ratones CF-1 alimentados con una dieta alta en
grasas, pero equilibrado en proteínas (16,9%), se evidenció niveles altos, estadísticamente
significativos, de glicemia, colesterol, triglicéridos y en el peso del tejido adiposo. Estos
20
resultados llevan a la conclusión de que los ratones CF-1 alimentados con una dieta alta en grasas
desarrollan alteraciones metabólicas que corresponden equivalentemente al SM.
FIGURA 2. PERFILES DE LIPOPROTEÍNAS EN DIFERENTE MODELOS. LAS LIPOPROTEÍNAS FUERON SEPARADAS
A PARTIR DEL PLASMA Y FUERON PUESTAS A CORRER 100 UL EN UNA COLUMNA SUPEROSA 6 EN UN FLUJO DE
0,5 ML/MIN EN UN BUFFER QUE CONTENÍA 0,15 M NACL, 0,01 M NA2HPO4 Y 1 MM DE EDTA. CUARENTE
FRACCIONES DE 0,5 ML FUERON RECOLECTADAS Y LA CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL FUE
CUANTIFICADA ENTRE LAS FRACCIONES 10 – 40. TIPICAMENTE, VLDL ELUYE ENTRE LA FRACCIÓN 15 – 20,
LDL EN FRACCIÓN 21 -27 Y HDL EN FRACCIÓN 28 – 34. (A) PERFIL DE LIPOPROTEÍNAS COMPARANDO EL PERFIL
“NORMAL” DE LA PERSONA CON UN MODELO C57BL/6J. (B) C57BL/6J Y RATÓN LEP R DB/DB. EL PEAK LDL/HDL1
ELUYE EN LA FRACCIÓN 23 – 27. (C) PERFIL DE LIPOPROTEÍNA DE RATAS DELGADAS LDLR - / - Y RATAS APOE – / -.
(D) PERFIL DE LIPOPROTEÍNA DE OBESAS LDLR - / - Y RATAS APOE – / -. (KENNEDY ET AL., 2010)
21
VIII. METODOLOGÍA
8.1 RECOLECCIÓN Y EXTRACCIÓN
La recolección del material vegetal se realizó en dos huertos ubicados en la comuna de
Chimbarongo, Provincia de Colchagua, Región de O’Higgins el 11 de noviembre de 2011. Para
la obtención de la fruta con manejo tradicional se realizó en el Huerto propiedad de Orlando
Barra en la localidad de Tingüirica (34º 44’ L.S., 70º 57’ L.O) y para el caso de manejo orgánico
el huerto de propiedad de la empresa Viconto ubicado en la localidad de Codegua (34º 40’ L.S.,
70º 55’ L.O.). En ambos huertos se recolectaron frutos de los cultivares Fuji y Granny Smith
con una madurez de 40 días después de plena flor. Para el caso del huerto orgánico las
características de plantación son un cuartel de de 7 hectáreas: 50% cv Fuji y 50% cv Granny
Smith, con hileras orientadas en sentido oriente – poniente, con un marco de plantación de 4,5 x
2,75 mts (808 plantas/ hectáreas). Para el caso del huerto tradicional, las condiciones de
plantación son similares para la plantación orgánica. Para ambos huertos el sistema de
recolección fue el mismo, de cada árbol se seleccionaron dos frutos, del cuadrante suroeste, se
recolectaron un total de 2 Kg de material vegetal de cada cultivar/manejo.
La piel de manzana fue obtenida a partir de los desechos obtenidos de la empresa SURFRUT,
para los cultivares Granny Smith y Fuji.
Las muestras fueron puestas en cámaras de frío a 1°C hasta el proceso de extracción de los
antioxidantes.
El protocolo de extracción fue definido, de acuerdo a los objetivos propuestos. Para este fin, se
buscaran las diferentes condiciones para extraer la mayor cantidad de compuestos fenólicos a
partir del material vegetal, en especial con un alto contenido de quercetinas. Las condiciones a
modificar son: concentración de etanol, temperatura y tiempo de extracción.
El protocolo inicial para la extracción fue el siguiente:
a) Lavar las manzanas con agua destilada.
b) Se pesarán alrededor de 10 gr de fruta completa (pulpa y piel).
c) Posteriormente se les realizará un corte transversal por el centro de la fruta.
22
d) El material vegetal se colocarán en vaso precipitado a baja temperatura, para ser molida
con máquina trituradora. Luego se determinará la mezcla etanol/agua que permita una
mejor extracción de los compuestos fenólicos desde 0% etanol (100% agua) hasta 80%
etanol (20% agua)
e) Se seleccionará la temperatura óptima de extracción.. desde 0°C hasta 80°C, por un
tiempo que se desea analizar desde las 2 horas, hasta las 24 horas, en agitación constante.
f) Posteriormente, se separará la fase líquida mediante filtración al vacío, para cuantificar en
ella la actividad antioxidante, contenido fenólico total y fenoles específicos por HPLC Se
tomarán dos alícuotas de 2 ml para ser analizadas posteriormente por HPLC y cuantificar
la cantidad de fenoles y actividad antioxidante (DPPDH).
g) A continuación la fase líquida será concentrada mediante evaporador rotario a 55 °C y
150 rpm. El concentrado obtenido será cuantificado, de la forma antes mencionada, y
almacenado a -20°C.
h) Por último, los extractos obtenidos del evaporador rotatorio serán liofizados, para
posteriormente ser cuantificado, al igual que los productos de las etapas anteriores.
i) Para el caso de la piel obtenida de SURFRUT, se aplicara la metodología establecida
utilizando también 50 gramos.
El protocolo descrito anteriormente es la base para la extracción, para determinar el protocolo
definitivo se realizaron modificaciones de acuerdo a la concentración de extracción de
etanol/agua, temperatura y tiempo de extracción. El protocolo definitivo será expuesto en el
capítulo de Resultados.
8.2 PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS
Se prepararon 6 extractos: Orgánico Fuji (FO), Orgánico Granny Smith (GSO), Tradicional Fuji
(FT), Tradicional Granny Smith(GST), Piel Granny Smtih (GSP) y Piel Fuji (FP) (ver capítulo
metodología). En los primeros grupos se realizó el proceso de extracción en el mes de enero del
2011. En los otros dos, el proceso se realizó en el mes de junio. Ambos extractos fueron
almacenados a -80°C, hasta realizar en ensayo en el modelo de Síndrome Metabólico like.
23
El proceso de extracción fue realizado de acuerdo a las condiciones preliminares establecidas. Se
dividió en 3 etapas: extracción, concentración en evaporador rotatorio y liofilización. La
primera, a partir de la fruta se realizó en 3 rondas de aproximadamente 400 gr de material
vegetal, a excepción de la piel de manzana que se realizo en dos etapas
Los volúmenes obtenidos en el proceso de extracción y posterior filtración al vacío fueron
llevados a evaporador rotatorio, con dos objetivos:
a) Recuperación del etanol ocupado en el proceso de extracción
b) Disminuir el volumen de la muestra antes de pasar al proceso de liofilización.
Las condiciones en el evaporador rotatorio fueron las siguientes: 150 rpm. a 50 °C, el tiempo fue
variable para cada extracto, se definió el punto de termino cuando el matraz dedicado a la
acumulación de etanol se mantuvo constante debido a que en el extracto no existen residuos
extraíbles por esta técnica.
A continuación se prosiguió con el proceso de liofilización, siendo ostensiblemente más largo:
Se tuvieron las muestras en ciclos de 10 horas diarias, en promedio 3 semanas. Los extractos
preparados al ser liofilizados disminuyeron su volumen. Teniendo en cuenta que la
administración de los antioxidantes a los animales de experimentación fue por el agua del
bebedero, se decidió disolver las muestras liofilizadas en agua (la disolución en diferentes
soluciones de etanol no fueron un éxito), en un proceso que se detalla a continuación:
a) Los frascos en donde se liofilizaron las muestras fueron pesados previos a realizar el
proceso de liofilización.
b) Cuando las muestras finalizaron el proceso de liofilización, se procedió nuevamente que
ser pesadas y se conoció la cantidad de extracto presente en cada una de las muestras por
diferencia de peso.
c) Posteriormente se agregaron 20 mL de agua en cada una de las muestras para poder
disolver el liofilizado, esta solución fue puesta en agitación constante en agitador orbital
por 3 horas a una velocidad de 50 rpm.
24
d) Por último, fue cuantificado el volumen de cada muestra resuspendida y se obtuvo una
alícuota para la medición de fenoles y capacidad antioxidante para ser finalmente
almacenada a -80°C.
8.3 CARACTERIZACIÓN QUÍMICA
Para determinar el protocolo definitivo de extracción, se apoyara en técnicas colorimétricas de
determinación de antioxidantes y HPLC. Se buscó tener un extracto con alto contenido de
quercetinas glicosiladas o libres:
a) Caracterización y cuantificación de los diferentes extractos mediante el ensayo de Folin –
Ciocalteu. Y por último, capacidad antioxidante mediante técnica basada en la estabilidad
del radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil)
b) Caracterización y cuantificación de los extractos para observar los diferentes metabólitos
que se persigue obtener mediante HPCL con detector arreglo de diodo.
Los protocolos son los siguientes:
Fenoles: Mediante la técnica de Folin – Ciocalteau, según lo descrito por Coseteng y Lee en.
1987 (Coseteng & Lee, 1987). Se midió absorbancia a 640 nm, el resultado de compuestos
coloreados obtenidos a partir de la reacción entre el reactivo Folin – Ciocalteau en presencia de
Na2CO3, la cual es directamente proporcional a la cantidad de fenoles presente en el medio de
reacción. El protocolo es el siguiente: 100 µL de muestra del extracto, se agrego 2,5 mL de agua
destilada y 0,5 mL de reactivo Folin – Ciocalteau, se agita en vortex y se deja incubar por 5
minutos. Por último, se agrego 0,5 ml de Na2CO3, nuevamente se repitió la agitación y se incubo
por 15 minutos. Finalmente se leyó absorbancia de las muestras a 640 nm. Las muestras se
analizaron por duplicado. Se desarrollo una curva estándar de calibración en base a ácido
clorogénico con concentraciones conocidas entre 0 y 0,125 mg, por lo que se obtendrá una
ecuación de la recta de donde se interpolara las concentraciones de las muestras analizadas.
Determinación de Actividad Antioxidante: La actividad antioxidante será determinada por el
método del DPPH (radical 1,1-difenil-2-picril-hidraxilo), según lo descrito por Von Gadow,
25
Joubert y Hansmann, (von Gadow, et al. 1997). Para todas las muestras se fijara en 8 min el
tiempo de reacción. Se colocaran en el medio de reacción 10 µL de extracto con 2 mL de DPPH 8
x 10-5. Se utilizaron diferentes concentraciones de ácido clorogénico como estándar para la curva
de calibración (entre 2 y 25 µg/ tubo) y la captura del radical libre DPPH fue expresado de
acuerdo a los mg de ácido clorogénico equivalentes a peso fresco-1 (PF) de manzana (fruto de
raleo o piel). Etanol fue utilizado como blanco y todas las muestras se trabajaron en tubos con
duplicado.
Perfil HPLC de las muestras: Se inyectarán 20 µL de cada una de las muestras en instrumento
Merck – Hitachi, compuesto por una bomba LaCrhom -7100, un detector de arreglo de diodos
modelo L – 7455 LaCrhom, y una columna Kromasil 100 – 5C18 de 250 x 4,9 mm con
precolumna de iguales características, termotizadas a 20 °C. Para la identificación de los
compuestos se usaron estándares de distintos antioxidantes (fenoles, quercetinas, etc.) y los
espectros UV – Vis de la biblioteca del equipo. El cromatograma será monitoreado a 4 diferente
longitudes de onda (. Los solvente de la fase móvil serán: a) ácido fòrmico al 1% en agua calidad
HPLC; b) acetonitrilo/H2O (40%) y c) acetonitrilo. La elución se efectúo mediante el siguiente
programa: tiempo 0 – 10 minutos: a (70), b (30), c (0) flujo de 1 mL minuto-1; tiempo 45
minutos: a (25), b (75), c (0) flujo 0,5 mL minuto -1; tiempo 52 minutos: a (0), b (0) y c (100)
flujo de 1 mL minuto-1
8.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para la determinación de la metodología de extracción, se utilizó ANOVA con un post – test de
Tukey en el programa SPSS versión 15. Para el análisis de los resultados obtenido en el modelo
animal se utilizó el programa GraphPad 5.0, con un test estadístico de ANOVA y un post-test de
Newman-Keuls y Bonferroni. P<0.05 fue considerado estadísticamente significativo. Además se
utilizará un análisis multivariable (Colesterol Total, Colesterol LDL, Colesterol HDL,
Trigliceridos, evolución del peso para tejido adiposo blanco), con esto podremos agrupar y
realizar conclusiones para definir si los extractos son capaces de influir en el metabolismo
lipídico de los animales disminuyendo o no los valores de colesterol (total, LDLy HDL), este fue
realizado por el programa estadístico Statgraphics Centurion XV.
26
8.5 PREPARACIÓN DE LAS DIETAS.
Las dietas fueron preparadas una vez por semana. Se utilizó como base el alimento Champion®
para roedores., que es el mismo que fue suministrado al grupo normal. Para conseguir aumentar
las calorías de las dietas estas fueron suplementadas con vitaminas, proteínas (en forma de
peptona), aceite vegetal y grasa animal en la siguiente relación:
Para 630 gramos de alimento normal se utilizo 0,7 gramos de multivitamínico, 3,8 gramos de
peptona, 158 ml de aceite vegetal y 35 gr. de grasa disuelta en horno microondas.
Para ambos ensayos se prepararon 10 kg de esta mezcla.
8.6 ENSAYOS BIOLÓGICOS
Los experimentos se realizaron con ratones CF-1 machos adquiridos en el Instituto de Salud
Pública (ISP) de Chile. Los animales se mantuvieron estabulados por una semana de
ambientación, separados en 4 grupos de 24 ratones cada uno bajo condiciones ambientales
estándar (22±2 °C y ciclo de iluminación de 12 horas de luz diarias) con libre acceso al alimento
para ratas de laboratorio (Champion®) y agua. Los ratones en esta etapa y en la fase experimental
se mantendrán en el Bioterio de la Universidad de Talca.
Los 6 extractos obtenidos Fuji Orgánico (FO), Granny Smith Orgánico (GSO), Fuji Tradicional
(FT), Granny Smith Tradicional (GST), Granny Smtih Piel (GSP) y Fuji Piel (FP), fueron
incorporados en el agua para beber de los animales según He (He et al., 2011). Los animales
fueron randomizados y divididos en 6 por cada grupo experimental, más los controles Normal
(que tendrá acceso a agua y alimento normal) y el control graso que tendrá alimentación con alto
contenido graso y agua normal.
Los grupos de ratones de laboratorio fueron divididos de acuerdo a la dieta que ellos tendrán:
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GRUPO DIETA
Grupo normal (control) Normal
Grupo con dieta grasa Peptona, grasa animal, aceite vegetal y vitaminas.
Grupo con dieta grasa más GSO Peptona, grasa animal, aceite vegeta, vitaminas y
extracto de manzana OGS
Grupo con dieta grasa más FO Peptona, grasa animal, aceite vegeta, vitaminas y
extracto de manzana OJ
Grupo con dieta grasa más FT Peptona, grasa animal, aceite vegeta, vitaminas y
extracto de manzana TJ
Grupo con dieta grasa más GST Peptona, grasa animal, aceite vegeta, vitaminas y
extracto de manzana TGS
Grupo con dieta grasa más FP Peptona, grasa animal, aceite vegeta, vitaminas y
extracto de manzana FGS
Grupo con dieta grasa más GSP Peptona, grasa animal, aceite vegeta, vitaminas y
extracto de manzana FGS
Se practicaron dos ensayos:
a) Volumen constante de los extractos 10 mL de extracto final / 250 mL de volumen final o
4 % v/v.
b) Concentración constante de antioxidantes 400 mg/Kg peso animal, de acuerdo a Hogan(Hogan et al., 2010) con sus ensayos realizados en ratones.
La finalidad de realizar ambos ensayos fue comprobar si existe una relación entre la cantidad de
antioxidantes ingeridos por cada grupo experimental (animales en el estudio) y la posible mejoría
en los parámetros bioquímicos. Además, estudiar si la concentración fija de antioxidante (mg de
antioxidante / Kg. de ratón) se podrían obtenían resultados similares (Objetivo específico).
En cada uno de los ensayos (volumen y concentración constante) se repitió el mismo modelo de
alimentación y administración de los extractos. Diariamente el alimento ingerido por los grupos
muestrales fue pesado, al igual que cuantificado el volumen a beber de los animales.
Semanalmente fueron pesados los individuos, con el fin de observar su evolución y descartar la
presencia de cualquier anormalidad. La duración del estudio fue de 40 días, al finalizar este
28
periodo los animales fueron anestesiados con una inyección i.p. en una mezcla de Ketamina 100
al 10% (Richmond, Argentina), acetopromacina (Centrovet, Chile) y xylazina 2%(Centrovet,
Chile) (Moore-Carrasco et al., 2008). La sangre obtenida desde la aorta descendente fue
utilizada para determinar parámetros bioquímicos (Glicemina, Triglicéridos, Colesterol Total,
HDL y LDL). Los ratones anestesiados fueron sacrificados por exanguinación.
8.7 ANÁLISIS BIOQUÍMICOS
Todos los reactivos de colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicéridos y glicemia
fueron obtenidos desde Roche S.A. (Santiago, Chile), los análisis fueron medidos por un equipo
automatizado Hitachi 717 (Japón).
8.8 ANÁLISIS DE LA DIETA
Una vez finalizados los ensayos biológicos, las dietas y los extractos fueron llevadas al
Laboratorio de Plantas Aromáticas, perteneciente al Instituto de Química de Recursos Naturales
de la Universidad de Talca, donde fueron sometidas al análisis e informe nutricional
correspondiente. Éste será realizado mediante métodos estandarizados por la Official Methods of
Analysis of the Association of Official Analitical Chemist (AOAC). Las determinaciones que se
realizaron corresponden a porcentajes de humedad, cenizas, lípidos o grasas, proteínas, fibra e
hidratos de carbono.
Determinación del porcentaje de agua (humedad):
El método se basa en el secado de una muestra en un horno y su determinación por diferencia de
peso entre el material seco y húmedo.
29
Determinación de lípidos o grasas por el método de soxhlet
En este método, las grasas de la muestra son extraídas con n-hexano y evaluadas como porcentaje
del peso después de evaporar el solvente
Determinación del porcentaje de fibra cruda
Este método permite determinar el contenido de fibra en la muestra, después de ser digerida con
soluciones de ácido sulfúrico e hidróxido de sodio y calcinado el residuo. La diferencia de pesos
después de la calcinación nos indica la cantidad de fibra presente.
Determinación de proteína cruda por el método Kjeldahl
La determinación del contenido de proteínas se efectúa mediante el método de Kjeldahl, mismo
que evalúa el contenido de nitrógeno total en la muestra, después de ser digerida con ácido
sulfúrico en presencia de un catalizador de mercurio o selenio.
Determinación de cenizas
Este método permite determinar el contenido de ceniza en los alimentos o sus ingredientes
mediante la calcinación. Se considera como el contenido de minerales totales o material
inorgánico en la muestra.
Determinación del contenido de elementos libre de Nitrógeno
La determinación del porcentaje de hidratos de carbono es realizado mediante la diferencia entre
todas las mediciones anteriores, la expresión matemática es 100 – Σ de las determinaciones antes
realizadas.
30
IX. RESULTADOS
9.1 BÚSQUEDA DE LA METODOLOGÍA ÓPTIMA DE EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS
Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE.
Para lograr el objetivo propuesto se ensayó, primero distintas concentraciones de la mezcla
etanol/H2O y a continuación diferentes temperaturas y tiempos de extracción. Para evaluar cada
uno de los ensayos se cuantificó contenido fenólico total (Coseteng & Lee, 1987) actividad
antioxidantes (von Gadow et al., 1997) y perfil de polifenoles por HPLC (J. Yuri et al., 2012).9.1.1 EVALUACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE LA MEZCLA ETANOL/H2O
Para definir las condiciones eficientes de extracción de antioxidantes desde los tejidos vegetales,
se realizó pruebas con mezclas etanol / agua a diferentes concentraciones 0, 40 y 80 % de etanol,
utilizando el procedimiento base la extracción descrito por Cosetang y Lee (Coseteng y Lee
1987) con modificaciones, lo que implica una molienda en frío (recipiente en donde se encuentra
la muestra a 0°C), extracción alcohólica, sonicación, homogenización y una doble extracción a
100ºC por 10 minutos y 5 minutos.
Uno de los objetivos fue sacar del proceso dos componentes como son el nitrógeno líquido y el
sonicador, debido a que encarecen los procesos industriales, no siendo utilizados. Para esto se
busco probar diferentes temperaturas y tiempos, con el fin de aumentar las probabilidades de
extraer la mayor cantidad de antioxidantes en los tejidos vegetales. Las pruebas realizadas fueron
desde 2, 4, 6, 12 y 24 horas; la temperatura 4°C, 50°C y 80°C; con las concentraciones de etanol
anteriormente descritas. Para tener un control de extracción se realizó el proceso descrito por
Cosetang y Lee con modificaciones en paralelo a los ensayos para la determinación de las
condiciones ideales de extracción de antioxidantes. Las características de este ensayo fueron
similares a las descritas en metodologías (Recolección y extracción), con las siguientes
diferencias:
a) En el proceso de molienda se utilizó nitrógeno líquido
b) Posteriormente las muestras fueron colocadas en un baño de ultrasonido por 30 minutos
31
c) El tiempo de extracción fue de 4 horas a una temperatura de 60 °C y en una solución de
40% de etanol
Los resultados del análisis estadístico ANOVA con test de Tukey con un nivel de confianza de
95%, (realizados en el programa SPSS versión 15), se visualizan en TABLA 1.
TABLA 1. ANALISIS ANOVA DE LA CANTIDAD DE FENOLES EN LOS EXTRACTOS
Según estos resultados, las condiciones óptimas de extracción de fenoles se presentan en la
TABLA 2:
Muestra % Etanol Tiempo de Extracción Temperatura deExtracción
111 40% ETANOL 6 H 50°C
112 80% ETANOL 6H 50°C
12 80% ETANOL 24 H 80°C
115 80% ETANOL 24 H 50° C
CONTROL 1 40 % ETANOL 6 H 50°C
CONTROL 2 80% ETANOL 6 H 50°C
TABLA 2. RESULTADOS CON LAS CONCENTRACIONES SIGNIFICATIVAMENTE MAYORES DE FENOLES EN LOS
EXTRACTOS
32
Según la Tabla 2, los controles de extracción son similares a las otras cuatro condiciones
indicadas, alcanzando valores análogos utilizables sin la utilización de nitrógeno líquido y
ultrasónido.
Si bien la cantidad de los fenoles es importante para determinar el protocolo de extracción
definitivo, es necesario determinar la capacidad antioxidante resultante de la solución obtenida.
Para definir cuál es la condición idónea, se realizo la medición del radical libre DPPH. Los
resultados del análisis ANOVA con test estadístico de Tukey con el nivel de confianza de 95%,
realizados en el programa SPSS versión 15, los resultados aparecen en la TABLA 3..
TABLA 3. ANALISIS ANOVA DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN LOS EXTRACTOS
Según los resultados de este análisis, las condiciones en donde se obtuvo mayor capacidad
antioxidante aparecen en la Tabla N°4.
33
Muestra % Etanol Tiempo de extracción T° de extracción
24 80% ETANOL 6 H 50°C25 40% ETANOL 6 H 80°C
26 80% ETANOL 6H 80°C
27 40% ETANOL 24 H 50° C
28 80% ETANOL 24 H 50° C
29 40% ETANOL 24 H 80° C
30 80% ETANOL 24 H 80°C
Control 1 40 % ETANOL 6 H 50°C
Control 2 80% ETANOL 6 H 50°CTABLA 4. RESULTADOS CON PARA LAS CONDICIONES SIGNIFICATIVAMENTE MAYOR A LA ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE EN LOS EXTRACTOS
En definitiva se obtienen 7 condiciones similares para la extracción de una alta capacidad
antioxidante en esta etapa, las cuales no son las mismas condiciones que definió el análisis
obtenidas en la etapa de concentración de fenoles (ver Tabla 2). Por esta razón y con la finalidad
de tener certeza en las condiciones de extracción se definió utilizar HPLC (High-performance
liquid chromatography) y de acuerdo a Huber y Rupansinghe en 2009), los principales
compuestos fenólicos que se encuentran en las manzanas son ácido clorogénico, quercetina-
glucósido, quercetina-xilosa, floricidina, procianidina B2. Por lo anterior, es que los compuestos
fenólicos a buscar son ácido clorogénico, catequina, procianidina B2, epicatequina, floridicina y
diversas quercetinas glicosildas. Las condiciones de temperatura y tiempo de extracción de
acuerdo a 40% etanol en diversas condiciones de extracción se muestran en la FIGURA 3.
Los resultados que se exhiben en la FIGURA 3 son los elevados valores de ácido clorogénico en
las tres de las cuatro condiciones probadas, la única que disminuyó la cantidad esta molécula fue
en 24 H/ 80°C. El otro compuesto que presenta altas concentraciones fue la Procianidina B2,
siendo más bajas que ácido clorogénico y en las mismas condiciones de extracción. Tanto
catequina, epicatequina y floridicina no superan los 400 µg de compuestos / gr de tejido vegetal
procesado.
Otros metabolitos importantes que se desean extraer en altas cantidades de los frutos pequeños y
piel de desecho son las quercetinas, ya sean libres o glicosiladas. El interés corresponde a que
tienen diversas propiedades benéficas para las personas, incluyendo mayor sobrevida en modelos
34
murino de influenza de H1N1 (He et al., 2011), disfunción endotelial (Gendron et al., 2012) y
cáncer (D’Archivio et al., 2008).
FIGURA 3. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC EN LAS DIFERENTES CONDICIONES DE 40%
DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN)
Debido a lo anterior se cuantificaron las siguientes quercetinas: quercetina rutinosido, quercetina
galactósido, quercetina glúcosido, quercetina xilósido, quercetina arabinósido, quercetina
ramnosido. El resultado se encuentra en la FIGURA 4.
La FIGURA 4 muestra condiciones similares para la extracción en 50 °C para ambos tiempo y
similar para 80° en 6 Hrs. En cambio, la condición de 80°C en 24 horas no presenta una cantidad
significativa de antioxidantes.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
6H 24H 6H 24H
50ºC 80ºC
ug /
g d
e te
jido
AcClorogénico
Catequina
ProcianidinaB2
Epicatequina
Floridicina
35
FIGURA 4. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC PARA DIFERENTES QERCITINAS EN
DISTINTAS CONDICIONES DE 40% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN)
Para las condiciones de extracción de 80% de etanol, los resultados para ácido clorogénico,
catequina, procianidina B2, epicatequina y floridicina en la FIGURA 5.
FIGURA 5. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC EN LAS DIFERENTES CONDICIONES DE 80%
DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN)
Nuevamente aparecen elevados niveles de ácido clorógenico y procianidina B2, lo que indicaría
que la extracción de estos compuestos es independiente de la concentración de etanol. Siguiendo
la comparación con la FIGURA 3, llama la atención que en la condición de 80°C en 24 hrs.
05
101520253035404550
6H 24H 6H 24H
50ºC 80ºC
ug /
g d
e te
jido
Q. RutinósidoQ. GalactósidoQ. GlucósidoQ. XilósidoQ. ArabinósidoQ. Ramnósido
0200400600800
10001200140016001800
6H 24H 6H 24H
50ºC 80ºC
80% Etanol
ug /
g d
e te
jido Ac Clorogénico
Catequina
Procianidina B2
Epicatequina
Floridicina
36
existe una diferencia significativa entre los metabolitos presentes en la extracción con 40%
etanol, siendo inferior a la encontrada a 80% de etanol, indicando que en esta última condición se
puede obtener mayor presencia de antioxidantes, reflejando mayor eficiencia con este método de
extracción.
También se pueden apreciar concentraciones significativas de epicatequina y floridicina, por
sobre los 600 µg / g de tejido vegetal (manzana), en cambio catequina sigue en bajas
concentraciones. Para la extracción realizada a 80% etanol, los resultados obtenidos para
quercetina rutinosido, quercetina galactósido, quercetina glúcosido, quercetina xilósido,
quercetina arabinósido, quercetina ramnosido, se observan en la FIGURA 6
FIGURA 6. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC PARA DIFERENTES QERCITINAS EN
DISTINTAS CONDICIONES DE 80% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN)
En la FIGURA 6 aparecen concentraciones mayores de las distintas quercetinas analizadas,
siendo sumamente menor la Q. rutinosido. Se observa un leve aumento, aunque no significativo
en la condición de 80°C para los dos tiempos de extracción, siendo sumamente mayores a los
niveles detectados con la solución a 40% de etanol (ver FIGURA 4). Con el análisis de los
resultados que se observan en las figuras 5 y 6, se muestra una leve diferencia entre los métodos
de extracción, presentando mayores concentraciones de quercetina cuando el proceso de
0
50
100
150
200
250
6H 24H 6H 24H
50ºC 80ºC
80% Etanol
ug /
g d
e te
jido
Q. Rutinósido
Q. Galactósido
Q. Glucósido
Q. Xilósido
Q. Arabinósido
Q. Ramnósido
37
extracción se realiza con 80% de etanol. Debido a los resultados y la imposibilidad de definir
un protocolo de acuerdo a las mediciones realizadas previas (Cantidad de fenoles, capacidad
antioxidantes, concentración de antioxidantes mediante HPLC) se acordó definir el proceso de
extracción en función de los valores totales de quercetinas glicosiladas. Los resultados de este
análisis se muestran en las FIGURA 7 y FIGURA 8.
FIGURA 7. CONCENTRACIÓN DE QUERCETINAS POR GRAMOS DE TEJIDO EXTRAÍDO EN 80% ETANOL EN
DIVERSAS CONDICIONES DE TEMPERATURA Y TIEMPO.
FIGURA 8. CONCENTRACIÓN DE QUERCETINAS POR GRAMOS DE TEJIDO EXTRAÍDO EN 40% ETANOL EN
DIVERSAS CONDICIONES DE TEMPERATURA Y TIEMPO.
0100200300400500600700800
6H 24H 6H 24H
50ºC 80ºC
ug d
e qu
erci
tinas
/ g
r de
tejid
o
0100200300400500600700800
6 H 24H 6 H 24H
50 º C 80ª C
ug d
e qu
erce
tinas
/ g
rde
tejid
o
38
De acuerdo a la concentración de quercetinas que se obtienen en la FIGURA 7 y descartando la
utilización de 24 horas de extracción por el excesivo gasto energético que representa, las
condiciones de extracción que será utilizado es: 80% de etanol, 6 horas y 80°C. Debido a ello el
protocolo de extracción quedó definido de la siguiente forma:
a) Lavar manzanas con agua destilada.
b) Corte transversal a cada fruto por su centro.
c) El material vegetal se coloca en vaso precipitado a baja temperatura (en hielo), para ser
molida con máquina trituradora. Luego se procede a colocar la solución de extracción.
d) Está solución más el material vegetal de manzano es puesta en matraz erlenmeyer en una
relación de 50 g de material vegetal y 500 mL de solución de extracción por un tiempo de
6 horas en agitación constante a 80ºC.
e) A continuación, se procede a filtrar al vacio para realizar la separación entre la fase sólida
y líquida. Se recolecta y cuantifico la fase líquida. Se toma una alicuota de 2 ml para
estudiar la concentración fenoles y capacidad antioxidante.
f) Por último, la fase líquida se concentra por evaporador rotatorio a 55 °C - 150 rpm. El
concentrado obtenido es cuantificado volumétricamente y almacenado a -20°C.
g) Los extractos obtenidos del evaporador rotatorio son liofizados. En esta etapa se tomaron
dos alícuotas de 2 mL para cuantificar la cantidad de fenoles totales y actividad
antioxidante.
h) Posteriormente estos fueron resuspendidos antes de comenzar con la administración al
modelo animal, de acuerdo a lo mencionado en el capítulo de METODOLOGIA.
9.2 CUANTIFICACIÓN DE LOS EXTRACTOS
El proceso de extracción fue realizado de acuerdo a las condiciones establecidas en forma
experimental. Se dividió en 3 etapas: extracción, evaporador rotatorio y liofilización. La primera,
a partir de la fruta se realizó en 3 rondas de aproximadamente 400 gr de material vegetal, a
excepción de la piel de manzana que se realizo en dos etapas. El resumen de las extracciones se
exhibe en la TABLA 5.
39
Los resultados nos muestran una baja concentración tanto de fenoles totales como de actividad
antioxidante en los extractos obtenidos de los desechos provenientes de SURFRUT. Los mayores
valores se obtuvieron en el extracto proveniente de Fuji Orgánico. Las columnas de mg. de
fenol/mg de manzana y actividad antioxidante / g. de manzana fueron colocadas para asegurar
que el peso inicial del material vegetal no fuese una variable que distorsionara el análisis de los
datos.
TABLA 5. RESULTADOS PRIMERA ETAPA DE EXTRACCIÓN. *LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE SON LOS MG DE
ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO-1 MATERIAL VEGETAL
En la segunda etapa de extracción, posterior a procesar las muestras por el evaporador rotatorio,
el resumen de los resultados obtenidos se muestra en la TABLA 6. Las muestras al ser
concentradas perdieron actividad antioxidante y fenoles, lo que era predecible de acuerdo a la
extracción de etanol realizada por el evaporador rotatorio. Aquellas muestras que no
disminuyeron sus niveles de capacidad antioxidante y cantidad de fenoles fueron las que
previnieron desde SURFRUT; probablemente ello ocurrió debido a que estos desechos provienen
de fruto maduro lo cual aumenta la cantidad de lípidos que existen en la extracción, lo que de
cierta manera le otorga estabilidad a los antioxidantes e impide la perdida de estos por el proceso
MuestraFecha de
extracciónPeso
manzana (gr)Volumen totalextracción (ml)
Cantidad deFenoles totales
(mg totales)
ActividadAntioxidante
totales*
mg de fenol/gr de
manzana
ActividadAntioxidante/
gr demanzana
GS tradicional 17-01-2011 312,2 2550 3.613,0 3.198 11,573 10,244GS tradicional 18-01-2011 433,7 3370 4.168,1 4.785 9,610 11,033GS tradicional 19-01-2011 436,2 3340 3.865,6 4.376 9,153 10,436TOTAL 1.182,1 9.260,0 11.646,6 30,3Fuji orgánico 20-01-2011 411,4 3350 4.225,5 5.453 11,100 13,254Fuji orgánico 21-01-2011 419,7 3290 5.003,3 5.173 11,921 12,325Fuji orgánico 24-01-2011 414,9 3350 4.609,1 5.025 11,109 12,564TOTAL 1.246,0 9.990,0 13.837,9 34,1GS orgánico 25-01-2011 416,7 3320 5.268,1 3.988 12,642 9,571GS orgánico 26-01-2011 419,9 3300 4.328,3 3.527 11,338 9,213GS orgánico 27-01-2011 422,0 3340 4.669,5 4.479 11,065 9,666TOTAL 1.258,6 9.960,0 14.265,8 35,0Fuji tradicional 28-01-2011 418,7 3280 4.733,2 5.210 11,304 12,442Fuji tradicional 31-01-2011 421,0 3220 4.682,3 4.888 11,122 12,193Fuji tradicional 01-02-2011 416,0 3600 4.314,3 4.450 10,932 12,526TOTAL 1.255,7 10.100,0 13.729,8 33,4Granny piel 02-06-2011 427,2 3220 2.407,9 2.719 5,64 6,365Granny piel 03-06-2011 425,4 3470 2.829,4 3.101 6,65 7,288TOTAL 852,6 6690 5.237,3 12,29Fuji piel 22-08-2011 427,3 3510 1.810,7 2.004 4,24 4,691Fuji piel 23-08-2011 425,5 3400 1.966,6 2.743 4,62 6,447TOTAL 852,8 6910 3.777,3 8,86
40
de extracción. El aumento de los lípidos fue detectado según los resultados de la química
proximal (Tabla 9).
TABLA 6. RESULTADOS SEGUNDA ETAPA DE EXTRACCIÓN *LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE SON LOS MG DE
ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO-1 DE MATERIAL VEGETAL
La última etapa de la preparación de los extractos consistió en la liofilización de acuerdo a la
metodología propuesta y posterior resuspensión de las muestras en agua destilada, los resultados
se encuentran en la TABLA 7.
Extracto
mg TotalFenoles
presenteen el
Extracto
Masa Total DeExtracto (mgr)
% FenolesDel Total
Peso Inicial dematerial
vegetal en Gr
MgFenol/grMaterialVegetal
ActividadAntioxidantes
Totales (*)
ActividadAntioxidante/
Gr DeManzana
VolumenFinal
FT 7.522,5 23.620 32 1.255 5,99 8.637 7,31 116
FO 6.705,2 22.122 30 1.246 5,38 12.557 10,08 115
GSO 7.433,6 19.400 38 1.258 5,91 10.976 8,72 113
GST 7.375,3 42.080 18 1.182 6,24 10.872 8,66 120
GSP 5.870,3 28.070 21 852 6,89 4.945 5,8 160
FP 4.345,0 104.670 5 852 5,09 5.117 6 195
TABLA 7. RESULTADOS DE LOS EXTRACTOS DEFINITIVOS. (*) LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE ES EL MG DE
ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO-1 DE MATERIAL VEGETAL
MuestraVolumenrotavapor
CantidadFenoles totales
(mg totales)
ActividadAntioxidante
totales*
mg deFenol/Gr demanzana
Actividadantioxidante/gr de manzana
% Disminuciónde fenoles
% Disminuciónactividad
antioxidante
GS tradicional 235 2.492 2.823 8,0 9,0 31,0 11,7GS tradicional 245 3.437 2.879 8,8 7,5 17,5 39,8GS tradicional 250 2.615 2.935 8,1 7,7 32,3 32,9TOTAL 730 8.544,4 24,8 26,6Fuji orgánico 245 3.953 4.142 9,6 10,1 6,4 24,0Fuji orgánico 210 4.348 4.053 10,4 10,1 13,1 21,6Fuji orgánico 260 3.878 4.362 9,8 10,5 15,9 13,2TOTAL 715 12.179,5 29,7 12,0GS orgánico 240 3.901 3.436 9,4 8,2 26,0 13,8GS orgánico 240 3.918 3.340 9,5 8,7 9,5 5,3GS orgánico 245 4.137 4.200 9,8 10,0 11,4 6,2TOTAL 725 11.955,0 28,7 16,2Fuji tradicional 210 3.698 4.211 10,5 9,8 21,9 19,2Fuji tradicional 220 3.091 4.439 12,1 10,5 34,0 9,2Fuji tradicional 250 4.068 4.222 10,5 10,1 5,7 5,1TOTAL 680 10.857,1 33,1 20,9Granny piel 235 2.796 2.357 6,54 5,52 16,1- 13,3Granny piel 245 2.773 3.017 6,52 7,09 2,0 2,7TOTAL 480 5.569 13,06 6,3-Fuji piel 310 1.873 2.205 4,38 5,16 3,4- 10,0-Fuji piel 340 2.113 2.752 4,97 6,47 7,4- 0,3-TOTAL 650 3.986 9,35 5,5-
41
Los anteriores son los extractos que serán utilizados en el ensayo con el modelo murino de
Síndrome Metabólico like., los cuales tienen una alta cantidad de capacidad antioxidante y
cantidad de fenoles.
9.3 COMPOSICIÓN DE LAS DIETAS Y LOS EXTRACTOS
Las dietas a las que fueron sometidos los animales estuvieron compuestas por una dieta alta en
calorías, esto se muestra en la TABLA 8. Esta composición es igual para ambos ensayos
realizadas (10 ml de extracto / 250 ml de volumen final y 400 mg /kg de peso de ratón)
%
Agua
%
Proteínas
%
Lípidos
%
Cenizas
%
Fibra
%
ELN (*)
Dieta Normal 10,3 19,8 3 3 1,3 62,6
Dieta Grasa 6,8 16,8 28 5,5 1,9 41
TABLA 8. COMPOSICIÓN DE LAS DIETAS, DE ACUERDO A LA QUÍMICA PROXIMAL. (*) ELN: ELEMENTO LIBRE
DE NITROGENO
En la Tabla 8 se puede comprobar el aumento de lípidos presente tanto en la dieta normal como
en la dieta grasa que fue suministrada a los animales. Las diferencias radican en el contenido de
lípidos que en la dieta normal alcanza el 3% en comparación con el 28% de la dieta grasa.
Los resultados de los extractos por química proximal y medición de fenoles es el siguiente:
TABLA 9. RESULTADOS DE QUÍMICA PROXIMAL Y CONTENIDO DE FENOLES PARA LOS DIFERENTES
EXTRACTOS. ELN: ELEMENTOS LIBRES DE NITROGENO
FT 2,5 1,2 2,5 3,7 0,3 89,8 23.620 7.523 32FO 1,8 0,6 3,8 4,6 0,54 88,66 22.122 6.705 30GSO 1,9 0,4 1,2 1,8 0,2 94,5 19.400 7.434 38GST 2,3 0,8 2,9 5,7 1,3 87 42.080 7.375 18GSP 2,07 1,1 2,45 6,7 1,32 86,36 28.070 5.870 21FP 1,8 2,6 12,3 11,4 1,1 70,8 104.670 4.345 5
% Proteínasmg Total Fenoles
presente en elExtracto
% Fenoles Total% Agua % Lípidos % Cenizas % Fibra % ELN Masa TotalExtracto (mgr)
42
Cabe hacer notar la baja cantidad de fenoles que se obtuvo desde el extracto proveniente de la
piel de Fuji, en comparación con el resto de los extractos. Además del alto porcentaje de lípidos
que fue encontrado en el mismo extracto, la explicación más fundamentada para esta alza es la
adición de cera por parte de los empresarios frutícolas a los frutos de exportación, para resaltar el
brillo de las manzanas, lo cual es una hipótesis que no pudo ser demostrada por los ensayos
realizados durante el transcurso de la tesis.
9.4 ENSAYOS BIOLÓGICOS
Los resultados obtenidos después de los ensayos con el modelo murino de Síndrome Metabólico-
like se dividirán de acuerdo al ensayo al que correspondan, en primera instancia se mostraran los
resultados correspondiente a ensayo de 10 ml de extracto final / 250 ml de volumen final.
9.4.1 ENSAYO DE 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL
El ensayo comenzó el 12 de octubre de 2011 y fue dado a término el día 19 de noviembre con el
sacrificio de los animales de acuerdo a las normas de bioéticas que se encuentran vigentes en la
Universidad de Talca.
Ingesta de alimento y evolución del peso
La ingesta diaria de alimentación fue seguida rigurosamente, como lo demuestra la FIGURA 9
FIGURA 9. CONSUMO DIARIO DE ALIMENTACIÓN TOTAL DIARIA GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL ENSAYO 10
ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY
0
20
40
60
80
100
120
gram
os d
iario
s
dia
FP
DG
FO
FT
GSP
GST
GSO
43
SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP),
CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).
La ingesta total de alimentos durante el ensayo se muestra en la TABLA 10
GRUPO ESTUDIO INGESTA TOTAL (GRS)DIETA GRASA 1.174FO 1.361FT 1.403GSP 1.298GST 1.069GSO 1.093FP 1.090TABLA 10. INGESTAL TOTAL POR CADA GRUPO EN ESTUDIO DE ALIMENTACIÓN DURANTE EL ENSAYO 10 ML
DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL
Los pesos de los animales fueron tomados cada 7 días, los resultados son mostrados en la
FIGURA 10. Se observa que en todos los grupos en estudios fueron subiendo de peso de acuerdo
a la ingesta diaria de alimentación, llegando a una estabilización de los pesos al llegar al final del
estudio.
FIGURA 10. EVOLUCIÓN DEL PESO PROMEDIO POR GRUPO EN ESTUDIO EN EL ENSAYO DE 10 ML DE EXTRACTO
/ 250 ML DE VOLUMEN FINAL. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO
(GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA
NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).
31
33
35
37
39
41
43
45
12-o
ct13
-oct
14-o
ct15
-oct
16-o
ct17
-oct
18-o
ct19
-oct
20-o
ct21
-oct
22-o
ct23
-oct
24-o
ct25
-oct
26-o
ct27
-oct
28-o
ct29
-oct
30-o
ct31
-oct
01-n
ov02
-nov
03-n
ov04
-nov
05-n
ov06
-nov
07-n
ov08
-nov
09-n
ov10
-nov
Peso
de
rato
n en
gr.
Días de ensayo
Normal
ControlGrasoFO
FT
GSP
GST
GSO
FP
44
La FIGURA 11, muestra la ganancia de peso que se obtuvieron en cada uno de los grupos
experimentales, observando que la mayor ganancia de peso fue en los grupos de dieta grasa (DG)
y dieta normal (DN). Aunque en los grupos experimentales, el aumento de peso no existió una
ganancia de peso estadísticamente significativa, los resultados sugieren una tendencia en la
disminución en el peso de los grupos que fueron sometidos a los tratamientos con los diferentes
extractos de manzana.
FIGURA 11. GANANCIA DE PESO DE TODOS LOS GRUPOS EN ESTUDIO FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL
(FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y
FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).
Consumo de antioxidantes
En este ensayo las cantidades de antioxidantes fueron evolucionando de distinta forma de acuerdo
a la ingesta diaria de los animales, como se observa en la FIGURA 12. Esto se debió porque se
dejó la libre demanda de la que bebían los animales (en donde estaban incluidos los distintos
extractos). Esto se fue normalizando en el transcurso del ensayo hasta alcanzar rangos bajos de
variabilidad en el consumo de agua y extractos. Para determinar el consumo de antioxidantes, fue
necesario cuantificar diariamente la cantidad de extractos que fueron bebiendo los animales
durante el transcurso del ensayo.
45
FIGURA 12. CONSUMO DE MG DE FENOLES DIARIOS EN CADA UNA DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO EN EL
ENSAYO DE 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL
Según lo que se aprecia en la figura anterior, la cantidad de antioxidantes consumidas durante
todo el ensayo fue variable y va desde los 200 mg de fenoles, para FP, hasta los 600 mg de
fenoles diarios en FO y FT. También permite observar la irregularidad de la administración del
extracto durante la primera semana, esto se debe a que los animales debieron adecuarse a las
nuevas condiciones de alimentación y líquido para beber. El promedio de ingesta de fenoles
diario por Kg de peso de ratón es mostrado en la FIGURA 13
FIGURA 13. INGESTA DE FENOLES PROMEDIO DURANTE EL ENSAYO EN LOS DIFERENTES GRUPOS EN
ESTUDIO.FUJII ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH
TRADICIONAL (GST) YGRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP).
0
50
100
150
200
250m
g fen
oles
tot
ales
Dia de ensayo
FP
FT
FO
GSP
GST
GSO
46
Bioquímica del plasma
Los análisis realizados fueron Colesterol total (COL T), colesterol HDL (COL HDL),
triglicéridos (TRIG) y glicemia (GLI). Los resultados se muestran en la siguiente TABLA 11.
COL T COL HDL TRIG COL LDL GLI
FO 117 ± 4,4 78 ± 1,2 112 ± 1,3 61 ± 1,1 310 ± 1,2
FT 113 ± 9,8 71 ± 7,2 85 ± 11,1 59 ± 5,5 261 ± 15,8
GSO 130 ± 9,4 81 ± 6 91 ± 15,4 67 ± 5,8 337 ± 14,5
GST 120 ± 7,5 74 ± 5,3 114 ± 17,2 69 ± 4,1 250 ± 17,2
GSP 155 ± 9,1 88 ± 7,6 124 ± 17 92 ± 3,3 317 ± 20,6
FP 144 ± 13,3 91 ± 6,7 105± 5,6 74 ± 8,2 230 ± 21,3
DN 119 ± 10,3 80 ± 8,8 121 ± 8,8 64 ± 3,1 254 ± 19,5
DG 252 ± 16,6 13 ± 2,8 104 ± 12,7 190 ± 14,9 159 ± 8,3TABLA 11. RESUMEN DE LOS RESULTADOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL HDL (COL HDL),
GLICEMIA (GLI). PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO
(GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA
NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). LOS RESULTADOS SE ENCUENTRAN CON EL ERROR DE LA
MEDIA (E.M)
En la tabla 11 muestra el resumen de los resultados de parámetros bioquímicos sobre los
diferentes grupos en estudios, los que fueron sometidos a la misma dieta grasa más el aporte de
los diferentes extractos de manzana. El análisis estadístico muestra que el parámetro en donde
muestran diferencia significativa entre la dieta grasa (DG) y los grupos en estudio fue en el
colesterol total (COL T), los resultados se muestran en la FIGURA 14. Los resultados muestran
que los niveles de colesterol de todos los grupos en el estudio disminuyeron a niveles similares al
control con dieta normal (DN) en comparación con el control de dieta grasa (DG).
47
FIGURA 14. CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL EN CADA UNOS DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO Y LOS
GRUPOS CONTROL. FUJII ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO),
GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL
(DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). A, B, C, D, E, F, G VALOR P<0,001.
Peso de órganos
El resumen del peso de algunos órganos obtenidos después del sacrificio de los animales se
muestra en la TABLA 12
Corazón Hígado Tejido adiposo blanco Riñón Gastrocnemio
FO 0,55 ± 0,03 5,17 ± 0,21 0,90 ± 0,18 1,71 ± 0,07 0,65 ± 0,03
FT 0,20 ± 0,01 4,81 ± 0,09 0,68 ± 0,03 1,65 ± 0,02 0,66 ± 0,01
GSO 0,59 ± 0,05 6,12 ± 0,57 0,57 ± 0,15 2,03 ± 0,17 0,72 ± 0,07
GST 0,62 ± 0,03 5,02 ± 0,2 0,71 ± 0,11 1,74 ± 0,03 0,63 ± 0,02
GSP 0,53 ± 0,06 5,57 ± 0,41 0,96±0,15 1,80 ±0,23 0,70 ± 0,08
FP 0,21 ± 0,01 6,02 ± 0,14 0,66 ±0,03 1,67 ± 0,02 0,6 ± 0,01
DN 0,65 ± 0,05 5,80 ± 0,33 0,53 ± 0,13 1,97 ± 0,08 0,67 ± 0,06
DG 0,67 ± 0,04 5,79 ± 0,26 1,05 ± 0,13 1,81 ± 0,06 0,64 ± 0,03TABLA 12. RESUMEN DE LOS PESOS DE DIFERENTES ORGANOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL
HDL (COL HDL), COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL LDL (COL LDL). PARA LOS
GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH
TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL
DIETA GRASA (DG)
48
La Tabla 12, indica los promedios de los pesos de corazón, hígado, tejido adiposo blanco, riñón y
gastrocnemio. El único tejido que muestra una diferencia estadísticamente significativa es el %
de tejido adiposo blanco (ver resultados en FIGURA 15) en comparación con el peso inicial del
individuo en estudio. Existe diferencia entre el grupo con dieta grasa (DG) y dieta normal (DN).
Además, entre el grupo con dieta grasa (DG) y el tratamiento con Granny Smith orgánica (GSO).
Entre el resto de los tratamientos no existe diferencia significativa, aunque si hay una tendencia a
la disminución del tejido adiposo blanco y el % del peso inicial.
FIGURA 15. PORCENTAJE PROMEDIO DE GANANCIA DE TEJIDO ADIPOSO EN COMPARACIÓN CON EL PESO
INICIAL FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH
TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y
CONTROL DIETA GRASA (DG). * VALOR P < 0,05 Y ** VALOR P < 0,05
Para realizar la asociación entre el peso del tejido adiposo blanco y los resultados de los
parámetros bioquímicos fue necesario realizar un análisis de componentes principales, el cual fue
hecho por el Programa Statgraphics Centurion, versión 10. Los resultados se muestran en la
FIGURA 16.
49
FIGURA 16. RESULTADOS DE ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES DE COLESTEROL TOTAL (COL T),
COLESTEROL LDL (COL LDL), COLESTEROL HDL (COL HDL), TRIGLICERIDOS (TRIG), TEJIDO ADIPOSO BLANCO
(T ADIPOSO). PARA ENSAYO 10 ML DE EXTRACTO EN 250 ML DE SOLUCIÓN FINAL
La interpretación de esta figura muestra dos grupos de datos, los puntos ubicados en el cuadrante
izquierdo de la figura corresponden al grupo de Dieta grasa y que están relacionados con las
variables (vectores) Colesterol Total , Colesterol LDL y % Tejido adiposo blanco acumulado
durante el ensayo. El resto de los puntos se ubican en el cuadrante central de la FIGURA 16, con
una leve tendencia hacia la derecha, encontrándose relacionado con el la variable Colesterol
HDL. El aumento de tamaño del T. adiposo se encuentra altamente relacionado con el aumento
del COL LDL y COL HDL. En este sentido no se ha encontrado bibliografía en la cual explique
los resultados obtenidos en el que extractos provenientes de manzana puedan mejorar los
indicadores de hipercolesterolemia, pero se puede inferir que en tejido adiposo blanco
(metabólicamente activo) están relacionados con el metabolismo del colesterol y en la
disminución de los niveles de colesterol en el plasma.
50
9.4.2 ENSAYO CONCENTRACIÓN CONSTANTE DE 400 MG / KG PESO DE RATON
El ensayo comenzó el 25 de octubre de 2011 y fue terminado el día 02 de diciembre de 2011 con
el sacrificio de los animales, de acuerdo a las normas de bioéticas que se encuentran vigentes en
la Universidad de Talca.
Hay que considerar en este ensayo que al ser constante la cantidad de fenoles ingeridos por los
animales no fue necesario cuantificar la cantidad de estos fenoles ingeridos por jaula. El cálculo
fue obtenido a partir de los datos recolectados en el ensayo de 10 ml de extracto / 250 ml de
volumen final, en donde los promedios de ingesta de los extractos ricos en fenoles en las
primeras semanas del ensayo anterior se utilizo para ajustar las concentraciones 400 mg de
fenoles / kg de ratón.
Ingesta de alimento y evolución del peso
La ingesta diaria de alimentación fue seguida rigurosamente, como lo demuestra la FIGURA 17
FIGURA 17. CONSUMO DIARIO DE ALIMENTACIÓN POR GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL ENSAYO 400 MG / KG
PESO DE RATON. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY
SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y
CONTROL DIETA GRASA (DG)
Se observa una etapa de adaptación por parte de los individuos en cada una de las jaulas al inicio
del ensayo por alrededor de una semana, posterior a eso la ingesta de alimentos se mantuvo
constante, disminuyendo la variabilidad observada en un comienzo.
La ingesta total de alimentos durante el ensayo se muestra en la TABLA 13
0
20
40
60
80
100
120
FO
FT
GSP
GST
GSO
FP
51
GRUPO ESTUDIO INGESTA TOTAL (GRS)DIETA GRASA 1.174FO 1.451FT 1.432GSP 1.311GST 1.428GSO 1.393FP 1.311TABLA 13. INGESTAL TOTAL DE ALIMENTACIÓN POR CADA GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL ENSAYO 400 MG
/ KG PESO DE RATON FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO),
GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL
(DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG)
LOS PESOS DE LOS ANIMALES FUERON TOMADOS CADA 7 DÍAS, LOS RESULTADOS SON MOSTRADOS EN LA
FIGURA 18. Se observa que en todos los grupos en estudios aumentaron de peso de acuerdo a la
ingesta diaria de alimentación, llegando a una estabilización de los pesos en la etapa final del
ensayo.
FIGURA 18. EVOLUCIÓN DEL PESO PROMEDIO POR CADA GRUPO EN ESTUDIO EN EL ENSAYO DE 400 MG / KG
PESO DE RATON
23
28
33
38
43
48
25-o
ct
27-o
ct
29-o
ct
31-o
ct
02-n
ov
04-n
ov
06-n
ov
08-n
ov
10-n
ov
12-n
ov
14-n
ov
16-n
ov
18-n
ov
20-n
ov
22-n
ov
24-n
ov
26-n
ov
28-n
ov
30-n
ov
Peso
rato
n en
gr
Dias de ensayo
Normal
ControlGrasoFO
FT
GSO
GST
52
FIGURA 19. GANANCIA DE PESO DE TODOS LOS GRUPOS EN ESTUDIO PARA EL ENSAYO 400 MG/KG PESO DE
RATON. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH
TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (CN) Y
CONTROL DIETA GRASA (CG). * VALOR P < 0,05 Y ** VALOR P < 0,05
FIGURA 19La FIGURA 19, muestra la ganancia de peso que se obtuvieron en cada uno de los
grupos experimentales para el ensayo de 400 mg de fenoles/ Kg de ratón. Se observa que existe
diferencia significativa entre el grupo control Dieta normal (DN) y el grupo Dieta grasa (DG).
Además, existe diferencia entre la dieta grasa y el resto de los grupos estudio.
53
Bioquímica del plasma
Los análisis realizados fueron Colesterol total (COL T), colesterol HDL (COL HDL), colesterol
LDL (COL LDL), triglicéridos (TRIG) y glicemia (GLI), los resultados se muestran en la
TABLA 14, en la cual se muestra el resumen de los resultados de parámetros bioquímicos sobre
los diferentes grupos en estudios, los que fueron sometidos a la misma dieta grasa más el aporte
de los diferentes extractos de manzana. Al observar y analizar los resultados se vuelven a repetir
los resultados en el ensayo de 10 ml de extracto en 250 ml de volumen final. Teniendo una
disminución en todos los grupos de COL T llegando a niveles similares a los observados en el
control normal. El análisis estadístico muestra que el parámetro en donde muestran diferencia
significativa entre la dieta grasa (DG) y los grupos en estudio fue en el colesterol total (COL T),
los resultados se muestran en la FIGURA 20. Esta figura muestra que los niveles de colesterol de
todos los grupos en el estudio disminuyeron a niveles similares al control con dieta normal (DN)
en comparación con el control de dieta grasa (DG).
COL T (mg/dl) COL HDL (mg/dl) TRIG (mg/dl) GLI (mg/dl) COL LDL (mg/dl)
FO 152,33 ±3,84 92 ± 8,4 176 ±9,02 233,5 ± 19,36 95 ± 12,7
FT 115,5 ± 10,6 90,3 ± 10,1 135 ± 6,84 167 ± 313,81 62 ± 19,9
GSO 161 ± 8,09 96,4 ± 9,4 166 ± 8,09 340 ± 7,92 53 ± 5,6
GST 149,2± 36,5 86,4 ±7,5 152 ± 23,16 363,2 ± 22,07 77 ± 15
GSP 179,4± 33,2 97,4 ±5,6 156 ± 13,42 304 ±10,83 53 ± 18,4
FP 164,5 ± 32,7 98,5 ± 5 154 ± 17,57 352,3 ± 14,64 40 ± 11,4
DN 119 ± 23,1 80 ± 19,7 121 ± 19, 6 254 ± 43,6 15 ± 7
DG 252 ± 37,18 13 ± 6,2 104 ± 28,4 159 ± 18,6 178 ± 33TABLA 14. RESUMEN DE LA CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL HDL (COL HDL),
COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL LDL (COL LDL). PARA LOS GRUPOS FUJI
ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL
(GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA
(DG). LOS RESULTADOS SE ENCUENTRAN CON EL ERROR DE LA MEDIA (E.M)
54
FO FTGSO
GSTGSP FP DN DG
0
100
200
300a
Col
este
rol t
otal
(mg/
dl)
FIGURA 20. CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL EN CADA UNOS DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO PARA EL
ENSAYO DE 400 MG/ KG DE PESO Y LOS GRUPOS CONTROL. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT),
GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI
PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (CN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).A VALOR P<0,05 .
Peso de los órganos
El resumen del peso de algunos órganos obtenidos después del sacrificio de los animales se
muestra en la TABLA 15
Corazón Hígado Tejido adiposo blanco
o
blanco
Riñón Gastrocnemio
FO 0,17 ± 0,02 5,25 ± 0,04 0,58 ± 0,01 1,83 ± 0,02 0,57 ± 0,03
FT 0,22 ± 0,01 5,22 ± 0,05 0,59 ± 0,01 1,86 ± 0,01 0,63 0,01
GSO 0,22 ± 0,01 5,29 ± 0,07 0,58 ± 0,03 1,95 ± 0,01 0,67± 0,01
GST 0,22 ± 0,01 6,33 ± 0,07 0,56 ± 0,05 1,66 ± 0,01 0,64 ± 0,05
GSP 0,19 ± 0,02 5,52 ± 0,04 0,63 ± 0,03 1,90 ± 0,01 0,72 ± 0,03
FP 0,22 ± 0,02 5,81 ± 0,09 0,57 0,03 1,78 ± 0,01 0,64 ± 0,07
DN 0,65 ± 0,05 5,80 ± 0,33 0,53 ± 0,13 1,97± 0,08 0,67 ± 0,06
DG 0,67 ± 0,04 5,79 ± 0,13 1,05 ± 0,06 1,81 ± 0,03 0,64 ± 0,03TABLA 15. RESUMEN DE LOS PESOS DE DIFERENTES ÓRGANOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL
HDL (COL HDL), COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL LDL (COL LDL). PARA LOS
GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH
TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL
DIETA GRASA (DG). CON EL RESPECTIVO ERROR DE LA MEDIA (E.M)
55
FIGURA 21. PORCENTAJE PROMEDIO DE GANANCIA DE TEJIDO ADIPOSO EN ENSAYO DE 400 MG/KG DE PESOEN
COMPARACIÓN CON EL PESO INICIAL FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH
ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP),
CONTROL DIETA NORMAL (CN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). A VALOR P < 0,001 Y B VALOR P< 0,05
La Tabla 15, indica los promedios de los pesos de corazón, hígado, tejido adiposo blanco, riñón y
gastrocnemio. El único tejido que muestra una diferencia estadísticamente significativa es el %
de tejido adiposo blanco en comparación con el peso inicial del individuo en estudio (Ver
resultados en FIGURA 21). Existe diferencia entre el grupo con Dieta grasa (DG) y el resto de
los grupos en estudio. Además, de una marcada diferencia entre el grupo dieta normal y todos los
grupos en estudio experimentales. Entre los grupos experimentales no existe diferencia
significativa.
Nuevamente se debe realizar un análisis de los componentes principales para analizar la
asociación entre el peso del tejido adiposo blanco y los resultados de los parámetros bioquímicos
es necesario realizar un análisis de componentes principales, los resultados son mostrados en la
FIGURA 22.
56
FIGURA 22. RESULTADOS DE ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES DE COLESTEROL TOTAL (COL T),
COLESTEROL LDL (COL LDL), COLESTEROL HDL (COL HDL), TRIGLICERIDOS (TRIG), TEJIDO ADIPOSO BLANCO
(TAD). EN ENSAYO DE 400 MG / KG PESO DE RATON
El análisis estadístico valida los resultados obtenidos en el ensayo de 10 mL de extracto en 250
ml de volumen final, con una clara diferencia entre el grupo de control graso, los que se ubican en
el cuadrante derecho de la figura, y el resto de los datos se ubicaron en el cuadrante central de la
figura. La única diferencia que existe en este resultado es la relación que encontró la prueba
entre los resultados de COL T – COL LDL y % TAD, lo cual se relaciona con los fundamentos
bioquímicos y metabólicos conocidos hasta el momento. Lo único que presenta distorsión entre
lo que supone la teoría con la práctica, son los resultados en cuanto a los triglicéridos, los cuales
encuentra una relación con el COL –HDL, los que se pueden deber a la diferencia que existe en el
metabolismo de colesterol en las personas que en ratones (Kennedy et al., 2010).
57
X. CONCLUSIONES
Para el objetivo específico “Determinar un protocolo eficiente y saludable de extracción de
Antioxidantes fenólico con énfasis en quercetinas, sin la utilización de nitrógeno líquido y
ultrasonido”, se definió un protocolo de extracción, siguiendo los objetivos propuestos de
eliminar de este proceso la utilización de nitrógeno líquido y ultrasonido, con similares niveles de
antioxidantes a los controles utilizados (Tabla 2 y 4). Siendo sumamente importante para el
escalamiento que se podría realizar en etapas futuras si se continuara con el desarrollo de algún
producto rico en antioxidantes.
Por otra parte, la extracción de antioxidantes fenólicos, en especial de quercetinas totales desde el
material vegetal, es dependiente del tiempo, de la temperatura y la concentración de etanol
(FIGURA 3,FIGURA 4,FIGURA 5,FIGURA 6,FIGURA 7,FIGURA 8). Puesto, que al variar
estos parámetros, la cuantificación de los metabolitos presente fueron cambiando, es por esto que
las condiciones de extracciones que fueron las utilizadas son: una concentración de etanol al
80%, temperatura de extracción 80°C y 6 horas el tiempo del proceso de extracción.
Para el objetivo específico “Caracterizar los extractos mediante su capacidad antioxidantes y
contenido de fenoles”, las extracciones realizadas a partir de los desechos obtenidos de la
empresa Surfrut no perdieron una actividad antioxidante significativa, ni tampoco se redujeron en
la cantidad de fenoles que fueron cuantificados, desde el paso inicial de extracción hacia la
concentración en el evaporador rotatorio. La única diferencia que existe en el análisis de química
proximal realizados es el alto valor de lípidos presente en la muestra FP (Tabla 9), la cual está
compuesta en su gran mayoría por lípidos del tipo alcanos que podría otorgar estabilidad a la
solución con antioxidantes sin perder su actividad biológica (Tabla 5, 6, 7) y tampoco afectar la
salud de los animales en el estudio debido a que son inocuos. Se logro aumentar el contenido
tanto de fenoles y antioxidantes desde un 38% para GSO a un 5% para FP (Tabla 9),
disminuyendo desde 1.200 Gr de manzana a un extracto que varío en entre 19 y 100 gr. de
extracto (más de 100 veces).
Para el objetivo específico “Determinar si existe acción benéfica del extracto sobre el modelo
animal y si esta es dependiente de la concentración de los antioxidantes”, se logro especificar que
la acción de los extractos, disminuyo el colesterol total en el modelo animal. Con ambos ensayos
58
realizados se pudo determinar que los efectos son independientes de la concentración de
antioxidantes presente en los extractos (Tabla 11 y 14).
Además, en la administración de los diferentes extractos al modelo animal exhiben un marcado
descenso de su colesterol total, por consiguiente de un aumento del colesterol HDL y un aumento
del colesterol LDL. La comparación entre los grupos con dieta grasa (28 % de lípidos, ver tabla
8), el control normal (alimentación normal y agua para beber) y los diferentes grupos en estudio
muestran una disminución del colesterol total a niveles similares del control normal. Este
resultado parece ser independiente de la cantidad de antioxidante (constante o variable en el
transcurso del ensayo), de la variedad en estudio (Fuji o Granny Smith), del manejo agronómico
o si proviene de piel o fruto pequeño de raleo de manzana (Tabla 11 y 14). Según algunos
artículos esto podría deberse a la inhibición de la absorción de lípidos por parte de algunos
antioxidantes. (Koo & Noh, 2007), para llegar a esa conclusión en ensayos futuros se podría
cuantificar las concentraciones de lípidos en las deposiciones de los animales durante el
experimento. Según el análisis de los componentes principales, se observa que la disminución
del colesterol total se encuentra relacionada a la disminución de la cantidad de tejido adiposo
blanco.
La hipótesis que da origen a esta tesis es aceptada, ya que los extractos proveniente de la piel y
fruto pequeño de raleo de manzana es capaz de presentar mejoras en el modelo animal. La
contradicción que se puede generar, es que no puede ser definido si la disminución de los niveles
de colesterol es debido a los antioxidantes presente en el extracto.
Las aplicaciones de los resultados podrían ser varias, desde suplementos alimenticios hasta la
utilización como conservante de alimentos naturales. Efectos similares no han sido detallados en
la literatura, solamente se describen las acciones biológicas y los efectos beneficiosos que
presentan los polifenoles de uva en prevenir patologías mediadas por inflamaciones incluidas las
enfermedades cardiovasculares (Leifert & Abeywardena, 2008; Perez-Vizcaino & Duarte,2010).
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