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Correspondencia: Dr. Jaime GosálvezDepartamento de Biología. Unidad de Genética.Universidad Autónoma de Madrid (UAM).20849 Madrid. España. Email: [email protected]

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Fragmentación del ADN esperm á t i c o - 1 9 5

Fragmentación del ADN espermático ¿un concepto dinámico o estático?

S p e rm DNA frag m e n t ation a dynamic or static concep t ?

G o s á l vez J1, Núñez-R2, Cab a l l e ro P2, Fe rnández JL3, Cort é s - G u t i é rrez E4, López-Fe rnández C1

1D ep a rtamento de Biología. Unidad de Genética. Unive rsidad Autónoma de Madri d( UAM). 20849-Madri d. España. 2Clínica Ta m b re. C/ Ta m b re 8. 28002. Madri d, España.3INIBIC-Genética, Complejo Hospitalario Unive rs i t a rio Juan Canalejo, As Xubias, AC o ruña, España.4D ep a rtamento de Genética. Centro de Inve s t i gación Biomédica del Nore s t e, InstitutoM exicano del Seg u ro Social. 64720-Monterrey. México.

R e s u m e n

O b j e t ivo : El propósito de este estudio es demostrar que la cro m atina del esperm at o zo i d e, tanto en hu-manos como en otros mamífe ros, cuando se manipula para ser utilizado en técnicas de rep ro d u c c i ó nasistida, se ve sometido a una situación de estrés que se traduce en un incremento progre s ivo en losn iveles de fragmentación de la molécula de ADN.

M at e rial y métodos: Se utilizaron 10 donantes humanos con fe rtilidad probada tras haber obtenido 6e m b a ra zos y 10 sementales de morueco, 10 de caballo y 10 de toro. Todas las mu e s t ras se conge l a ro ny desconge l a ron en condiciones óptimas. El estudio de la dinámica de la fragmentación se re a l i z ót ras incubar los esperm at o zoides a 37ºC durante un período máximo de 48h. La fragmentación delADN se analizó utilizando la metodología SCD (Halosperm® para el caso de humanos y Halomax®p a ra el caso de otros mamífe ro s ) .

R e s u l t a d o s : El proceso de la fragmentación del ADN en el esperma es un proceso dinámico y ex i s t e nd i fe rencias signifi c at ivas en la velocidad de fragmentación de las distintas especies de mamífe ros quese han analizado, siendo muy elevada en el caso del morueco, media para el caso del humano y el ca-ballo y baja en el caso del toro. Adicionalmente, también se pueden detectar dife rencias entre los in-d ividuos de cada especie. Los resultados obtenidos indican que la fragmentación del ADN puede serun efector importante de la disminución rápida en la calidad seminal a medida que tra s c u rre el tiem-po, dado que la molécula de ADN tiende a degra d a rse de fo rma rápida tras la desconge l a c i ó n .

C o n cl u s i o n e s : 1) La fragmentación del ADN en mu e s t ras de esperma congelado es un proceso diná-mico característico de cada especie. 2) Las mu e s t ras de semen congelado deben de utilizarse sin nin-guna dilación tras ser descongeladas. 3) El estudio de la va riación intra i n d ividual en la dinámica de

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I N T RO D U C C I Ó N

La eficacia biológica se relaciona de forma directa,además de con otros factores, con la presencia de célu-las ge rminales de una alta calidad. En el caso del serhumano y muy pro b ablemente asociado al modelo dehábitos sociales generados tras la revolución industrial,la calidad de las células ge rminales se ha resentido enc i e rta medida. De hecho, en el mundo desarrollado yano podemos asumir con tanta facilidad que cualquierp a reja puede concebir sin re c u rrir a tecnologías de re-p roducción asistida, bien sean de alta o baja intensi-dad. De esta forma, en el caso de los humanos, surge lapercepción de esterilidad como un concepto que afectano sólo a la descendencia y por tanto a un modelo so-

cial estru c t u rado y sostenibl e, sino también al equili-b rio psicológico de los individuos que se ven afe c t a-dos. La esterilidad se entiende como la incap a c i d a dque presenta una pareja para conceb i r, tras intentarl ode fo rma regular durante un periodo de 12 meses, sinpor ello obtener los resultados esperados. Un estudios o b re la pro b abilidad que tendría una pareja fértil dec o n c eb i r, asumiendo una vida sexual activa y en edadcomprendida entre los 20 y los 30 años, daría como re-sultado que ap roximadamente un 10% de las pare j a stendrá dificultades para procrear. Lo fatídico de esta si-tuación es que esta tendencia va en aumento. Desde es-te punto de vista, habría que asumir que la eficacia bio-l ó gica del ser humano, como especie, puede ve rs ealterada.

la fragmentación se podría utilizar como método de discriminación entre mu e s t ras de semen que tie-nen una alta o una baja velocidad de fragmentación. 4) Los resultados obtenidos sobre los niveles def ragmentación que se regi s t ran entre distintos lab o rat o rios e incluso dentro del mismo lab o rat o ri o ,pueden no ser comparables si no se hace re fe rencia explícita al tiempo de recolección de la mu e s t ra ,condiciones de mantenimiento de esa mu e s t ra y el momento del análisis.

Pa l ab ras cl ave : Fragmentación del ADN. Esperm at o zoides. Andro l ogía. Fe rt i l i d a d.Calidad seminal.

S u m m a ry

O b j e c t ive s : The aim of this study was to demonstrate that the sperm DNA in humans and other mam-mals, when manipulated for assisted rep roduction techniques, is stressed and causes a progre s s ive in-c rease in the basal level of DNA frag m e n t at i o n .

M at e rials and methods: 10 human donors with proven fe rtility and 10 stallions, 10 rams, and 10 bu l l swe re also included in the analysis. All samples we re fro zen and thawed under optimum conditions.The dynamic assessment of sperm DNA frag m e n t ation took place after incubation of the sperm sam-ples at 37ºC for a maximum period of 48 hours. Sperm DNA frag m e n t ation was analy zed using theS p e rm Chro m atin Dispersion (SCD) test methodology (Halosperm® for the case of human andHalomax® for the case of other mammals).

Results: Sperm DNA frag m e n t ation is a dynamic process and there are significant diffe rences in thevelocity of DNA frag m e n t ation when diffe rent mammalian species are compare d. According to the re-sults here fo u n d, this velocity could be considered as ve ry high in the case of ram, medium in the caseof human and the horse and low in the case of bull. Add i t i o n a l ly, diffe rences can also be detectedamong individuals within the same species.

C o n clusions: 1) The frag m e n t ation of DNA in fro zen semen samples is a dynamic process ch a ra c t e ri s-tic for each species 2) The immediate use of fro zen semen samples, without any delay after thaw i n g, ish i g h ly recommended 3) The study of the intra - i n d ividual va ri ation in the dynamics of sperm DNAf rag m e n t ation could be used as a method of discri m i n ation among semen samples that present a highor a low velocity of DNA frag m e n t ation 4) Within this scenario, the results of sperm DNA frag m e n t a-tion as rep o rted between diffe rent lab o rat o ries and even within the same lab o rat o ry, may not be com-p a rable without explicit re fe rence to the time of sample collection, conditions for maintenance andthe time when the analysis was perfo rmed considering time of collection.

Key wo rd s : D NA frag m e n t ation. Sperm at o zoa. Andro l ogy. Fe rt i l i t y. Semen quality.

D ebido a que la rep roducción es un proceso bioló-gico ex t remadamente complejo, no existe ningunap ru eba defi n i t iva que ofrezca un pronóstico exacto dela fe rtilidad de una pareja (1). Las alteraciones en elvarón pueden suponer el 50% de los casos de infe rt i-lidad y en mu chos casos se asocian con una baja cali-dad del semen. En la mayoría de las situaciones, lacausa posible de infe rtilidad masculina puede deter-m i n a rse mediante estudios andro l ó gicos, ya que lasc a racterísticas que debe cumplir una mu e s t ra de es-p e rma para conseguir una fecundación normal, estánbien establecidas (1). De todas fo rmas, aún re a l i z a n-do este tipo de análisis, se ha determinado que alre d e-dor de un 15% de los va rones estériles presentan une s p e rm i ograma normal (2), e individuos con paráme-t ros seminales considerados anormales pueden serf é rtiles. Por lo tanto, parece ser que, incluso la bu e n ad e t e rminación de estos parámetros, no es ab s o l u t a-mente info rm at iva sobre la calidad de los esperm at o-zoides presentes en una mu e s t ra seminal. La concl u-sión final es que ningún parámetro considerado dem a n e ra aislada se puede considerar de valor diag n ó s-tico absoluto de la infe rtilidad masculina (3). En con-secuencia, un estudio seminal en el que se integre nd i fe rentes parámetros parece ser la mejor de las op-ciones para entender la infe rt i l i d a d.

E n t re todos los parámetros que se estudian parad e t e rminar la calidad seminal existe uno que ha des-p e rtado un gran interés en los últimos años: la frag-mentación de la molécula de ADN (4, 5). Este pará-m e t ro t iene un interés evidente dado que lat ra n s fe rencia de la molécula de ADN íntegra e intactadesde el esperm at o zoide al óvulo, es esencial parac o n s eguir la gestación de un individuo normal. ElADN nu clear presenta una serie de discontinu i d a d e se n t re los cromosomas que serían equivalentes a lasro t u ras de la doble cadena del ADN, pero que, encondiciones normales, quedan selladas por los teló-m e ros. Estos ex t remos cromosómicos en realidad ge-n e ran un número de cromosomas estables para cadae s p e c i e, y corresponderían a “ro t u ras biológi c a m e n t ec o rrectas”. Es decir, un núcleo diploide, en el que suADN se haya replicado para posteri o rmente ge n e ra rdos nu evas células, por ejemplo cualquier célula enp ro fase de meiosis, deberá presentar 8 x n “ro t u ra sb i o l ó gicamente correctas”, siendo n = número de cro-mosomas haploide de la especie en cuestión, esto es,el número de cromosomas que tra n s p o rta un esperm a-t o zo i d e. Tan sólo una ro t u ra ex t ra de la doble cadenade ADN en cualquier lugar de la molécula y que nof u e ra adecuadamente rep a rada por los mecanismos derep a ración, puede entrañar pro blemas a la célula quela posea y a su descendencia. En otras palab ras, las

ro t u ras de doble cadena que se producen y pers i s t e nen el ADN son fuertes condicionantes de la estab i l i-dad de los cromosomas en las siguientes div i s i o n e sc e l u l a res y si estas se presentan en los esperm at o zo i-des, pueden ser trasmitidas en el momento de la fe-c u n d a c i ó n .

Sin embargo, en el análisis de cualquier mu e s t raseminal se encontrará, con mayor o menor fre c u e n c i a ,e s p e rm at o zoides que presentan su ADN frag m e n t a d oy quizás deb i é ramos estudiar este fenómeno en mayo rp rofundidad para entender hasta que punto esta ano-malía puede llegar a influir en los resultados tantocualitativos como cuantitativos de la descendencia. So-b re la nat u raleza del daño en el ADN regi s t rado en ele s p e rm at o zo i d e, nos enfrentamos con toda seg u ri d a da un efecto de nat u raleza mu l t i fa c t o rial y no del tododelimitada y/o escl a recida. Se sabe que la ge n e ra c i ó nde radicales libres asociados a procesos REDOX (6,7), erro res en la sustitución correcta de la fracción dehistonas en la cro m atina por las protaminas, o defi-ciencias en la recombinación pueden producir dañoi rreve rs i ble en el gameto (8). En relación directa coneste tipo de acontecimientos, la presencia de ap o p t o-sis, como un suceso de mu e rte celular progra m a d a ,tiene lugar durante el proceso de fo rmación de las es-p e rmátidas en las paredes de los túbulos seminífe ro sdel testículo (9, 10). En este caso, las células de Sert o-li, presentes también en las paredes de dichos túbu l o s ,fagocitan y limpian los residuos cel u l a res. No obstante,es interesante destacar que si la incidencia del fe n ó-meno apoptótico tiene lugar tras la salida del esper-m at o zoide a la luz de los túbulos seminífe ros, podríange n e ra rse una serie de metabolitos presentes en el lí-quido seminal, que no serán re t i rados una vez que seha producido la eyaculación y que podrían contri bu i ra acelerar el proceso de degradación del ADN deo t ros esperm at o zoides. Esta situación podría ser espe-cialmente crítica cuando se maneja semen de eyacula-do para una posterior inseminación o cuando lasmu e s t ras se congelan. En estas circunstancias se ge-n e raría un acopio no deseable de metabolitos alta-mente re a c t ivos, tales como enzimas celulares, enzi-mas procedentes del acrosoma, nu cleasas y enzimasde remodelación de la cro m atina, como la topoisome-rasa, que pueden ser activas sobre núcleos esperm á t i-cos normales. En este escenario de daño directo o in-directo sobre la molécula de ADN del espermat o zo i d e,se ha suge rido que la salud del embrión, la del feto, ei n cluso la de la descendencia, pueden ve rse afe c t a d a(11, 12). Además, se ha propuesto que el efecto deeste daño puede asociarse a enfe rmedades que ap a re-cen en la descendencia, tales como la propia infe rt i l i-dad (13, 14), la presencia de cáncer en la niñez (15),

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o bien puede re l a c i o n a rse con ciertas enfe rm e d a d e sde impronta genómica anormal (16). En resumen, pa-rece elemental que la va l o ración de los niveles def ragmentación en el ADN en el esperm at o zoide decualquier especie tiene un interés obvio. Sin embargo ,en este momento hay que asumir que determ i n a d o saspectos del daño que sufre la molécula de ADN enel esperm at o zoide re q u i e ren de un estudio porm e n o ri-zado, ya que son todavía mu chos los puntos obscuro sque tendremos que despejar para poder obtener todala info rmación potencial que nos ayude a canalizar yentender mejor los pro blemas de infe rt i l i d a d.

C u ri o s a m e n t e, las estimas de la fracción de esper-m at o zoides con ADN fragmentado siempre tienen uncarácter estático. Independientemente de la metodolo-gía que se utilice, los va l o res que se le at ri bu yen, tansólo hacen re fe rencia al valor en sí mismo. En mu ycontadas ocasiones se explicita si esos va l o res corre s-ponden al momento después de la eyaculación, o des-pués de ser tra n s p o rtados y manejados en el lab o rat o-rio. Habitualmente no se hace re fe rencia a circ u n s tanciasrelacionada con el tiempo y las condiciones de manejodel esperm at o zo i d e. En este caso, si ex i s t i e ra una ten-dencia hacia el aumento a lo largo del tiempo de los ni-veles de fragmentación, los resultados obtenidos entremu e s t ras distintas no serían comparables. La hipótesisde trabajo que se plantea en este experimento estableceque la fragmentación del ADN en el esperm at o zo i d ehumano una vez eyaculado, al igual que debe sucederen otras especies, tendería a aumentar con el tiempo.Sin embargo, esa tendencia hacia un aumento progresi-vo no afectaría de igual forma a todos los individuos oespecies por dos razones esenciales 1) el nivel de dañobasal entre distintos individuos no es idéntico y 2) elfondo genético de cada individuo/especie es propio deese indiv i d u o / e s p e c i e. Es decir, la fragmentación delADN en el esperm at o zoide humano, al igual que deb eocurrir en otras especies, es un proceso dinámico y porlo tanto variable en el tiempo, con una tendencia haciael aumento una vez que este se maneja de forma extra-c o rp o ral. El objetivo de esta inve s t i gación es analizarcuales son los pat rones temporales de degradación delADN del humano frente al que presentan otras espe-cies, en un intento de entender algo más acerca de lae s t e rilidad que se puede llegar a producir cuando ma-nejamos muestras de semen en los procesos ordinariosde reproducción asistida.

M ATERIAL Y MÉTO D O S

El estudio piloto se plantó utilizando mu e s t ras con-geladas de esperm at o zoides humanos procedentes de

10 donantes con fe rtilidad probada, al haber conceb i-do 6 hijos por varón, de acuerdo con la legislación es-pañola vige n t e. Tras analizar la dinámica de frag m e n-tación del ADN en estas mu e s t ras, se amplió elanálisis a otras especies de mamífe ros con objeto dec o m p robar si la tendencia observada en humanos eracomún y ex t rap o l able a otras especies. De esta fo rm ase incl u ye ron en el estudio mu e s t ras, también conge-ladas, de semen de morueco, caballo y toro. En todoslos casos el número de mu e s t ras procesadas por espe-cie también fueron 10.

Todas las mu e s t ras de semen se almacenaron enn i t r ó geno líquido y se conge l a ron de acuerdo con lose s t á n d a res de dilución y productos de pre s e rva c i ó ne s p e rmática re q u e ridos para mantenerlas en las mejo-res condiciones durante y tras su descongelación. Lasmu e s t ras de semen humano proceden del banco desemen de la Clínica Ta m b re, mientras que las corre s-pondientes al resto de mamífe ros son mu e s t ras co-m e rciales adquiridas en distintos centros de ge n é t i c ay pertenecientes a sementales de altor valor ge n é t i c oy rep ro d u c t ivo contrastado. Las mu e s t ras de moru e c ose obtuvieron en Ovigen (Centro de Selección yM e j o ra Genética de Ovino y Cap rino, Zamora) y co-rrespondían a la raza Assaf, las de caballo se obtuvie-ron del FRCCDD en Ávila y correspondían con la ra-za de caballo español y las de toro procedían deA b e rekin S.A. (Centro de Inseminación, Derio, Biz-kaia) y correspondían con la raza Hosltein. En todoslos casos, para la congelación de las mu e s t ras, se uti-l i z a ron los diluyentes y las rampas de enfri a m i e n t oe s p e c í ficas para cada especie, según cert i ficación delos distintos centro s .

Pa ra el estudio de la dinámica de la frag m e n t a c i ó np o s t - c o n gelación, cada mu e s t ra de semen se descon-geló por inmersión rápida en agua a 37ºC durante unp e riodo de 30 segundos. El contenido se tra n s fi rió aun tubo eppendorf esterilizado que se incubó dura n t eun periodo va ri able de tiempo en una estufa a 37ºC ycon una tensión de CO2 de un 5%. Los tiempos máxi-mos de incubación de las mu e s t ras va ri a ron entre lasdistintas especies y oscilaron entre las 48 horas utili-zadas para humano, oveja y caballo y los 10 días uti-lizados en el caso del toro. Se tomaron mu e s t ras parael análisis de la fragmentación a tiempos va ri abl e s .T0 fue considerado como el nivel basal de frag m e n t a-ción de la mu e s t ra regi s t rado tras la desconge l a c i ó n .

Po s t e ri o rmente se obtuvieron alícuotas a 1,5h,(T1,5), 4h (T4), 8h (T8), 24h (T24) y 48h (T48). Laidea básica del ex p e rimento era emular lo que podríasuceder con la fragmentación del ADN una vez que ele s p e rm at o zoide descongelado se enfrenta a un oocito,bien por inseminación asistida, bien por FIV.


La fragmentación del ADN se analizó de fo rm ai n m e d i ata a la obtención de la mu e s t ra en el tiempoc o rre s p o n d i e n t e. En todos los casos se utilizó la me-t o d o l ogía Sperm Chro m atin Dispersion - SCD- (17)en sus va riantes comerciales (Halosperm(r) para elcaso de humanos o bien Halomax(r), para el caso deanimales; Halotech - D NA S.L., Madri d, España). Losdetalles técnicos del proceso se han descrito en dife-rentes publicaciones, tanto para el caso de humanoscomo para el de animales (18, 19, 20, 21, 22).

Las mu e s t ras procesadas una vez deshidratadas set i ñ e ron con dife rentes fl u o ro c romos tales comoE va G reen (Biotum, Hay wa rd, CA, USA), ioduro dep ropidio o 2,4-diamidinofenilindol -DAPI- (Sigma-A l d ri ch, Barcelona, España) o bien en campo cl a routil izando una solución de colorante de Wri g h t( M e rck, Darmstadt, Germ a ny) 5% en un tampón fo s-fato libre de Ca y Mg. Las prep a raciones para su uti-lización en fl u o rescencia se analizaron con el moduloS p e rm Class Analy zer (Modulo ADN; Micro p t i c,B a rcelona , España) montado sobre un micro s c o p i oN i kon Elipse 600 equipado con una platina motori z a-da (Prior Houston, Tex a s ) .

El sDFI (sperm DNA Frag m e n t ation Index) se de-finió como el porcentaje de esperm at o zoides conADN fragmentado, obtenidos tras estudiar 500 esper-m at o zoides en cada mu e s t ra .

R E S U LTA D O S

Visualización de la fragmentación de ADN esperm á t i c ocon el método SCD

La idea base del test SCD reside en producir unadescondensación dife rencial de la cro m atina entreaquellos esperm at o zoides que presentan su ADNf ragmentado con respecto a aquellos que lo mantie-nen intacto. Pa ra ello se utiliza un tratamiento de des-p roteinización controlada que facilita la relajación delos bu cles de cro m atina en el esperm at o zo i d e. En elcaso de las mu e s t ras de esperm at o zoides humanos, lava riante metodología del SCD utiliza un trat a m i e n t od o ble que incl u ye una desnat u ralización seguido deuna desproteinización. En el primer caso se pre t e n d ep roducir una desnat u ralización del ADN, utilizandocomo punto de partida aquellas ro t u ras de cadena do-ble o de cadena sencilla presentes en la molécula deA D N, y en segundo, eliminar las proteínas para re l a-jar la cro m atina. Tras tinciones convencionales, biensea para microscopía de campo cl a ro o utilizandofl u o ro c romos normales, los esperm at o zoides que pre-sentan el ADN fragmentado no presentan un halo vi-

s i ble de dispersión de la cro m atina o si lo hacen estees de muy pequeño tamaño (Fi g u ra 1a). Por el contra-rio, los esperm at o zoides sin fragmentación en suADN ge n e ran halos compactos de relajación de losbu cles de cro m atina (Fi g u ra 1c, d).

A dife rencia de lo que ocurre con el esperm at o zo i d ehumano, tras aplicar la técnica SCD en el caso de los ani-males, cuyo proceso se ciñe a la utilización de una despro-teinización controlada, los esperm at o zoides que contienenADN fragmentado presentan un gran halo de difusión delos fragmentos de cro m atina (Fi g u ra 1 f), mientras queaquellos que no están afectados por ro t u ras en su ADN,bien no presentan halo de bu cles de cro m atina o este es detamaño muy reducido y compacto (Fi g u ra 1e).


Fi g u ra 1Visualización de la fragmentación del ADN tras la utiliza-ción de Halosperm(r) (a-d) en humanos y Halomax(r) (e-g)en animales. a) Tinción con ioduro de propidio b) Ti n c i ó ncon Eva - G reen. Nótese el halo de dispersión en los núcl e o scon ADN fragmentado fo rmado por fragmentos mínimosde ADN. Las fl e chas en a y b corresponden con núcleo quecontienen ADN fragmentado. c-f ) Núcleos seleccionadosp a ra una comparación de la visualización del ADN nof ragmentado (c) y fragmentado (d) en humanos y frag m e n-tado (e) y no fragmentado (f) en toro. g) va rios núcl e o sconteniendo ADN fragmentado mu e s t ran un halo de dis-p e rsión grande en el caso del moru e c o .

En realidad esta dife rencia entre “no halo” en elcaso de humanos para ser asociada con presencia deADN fragmentado y “halo” en el caso de otros mamí-fe ros para identificar esperm at o zoides con ADN frag-mentado, se debe a la habilidad de los colorantes utili-zados y al método de tratamiento en cada especie parage n e rar los halos. La realidad es que en el caso de loshumanos, los esperm at o zoides en los que no se identi-fican halos de expansión, no quiere decir que estos noexistan. Existen, pero debido al tratamiento utilizado,la dispersión de la cro m atina es muy grande y losf ragmentos de ADN muy pequeños, con lo cual sólopueden ser visualizados tras utilizar fl u o ro c romos demuy alta sensibilidad como los pertenecientes a la fa-milia de los Synergy Bra n d, Eva Green o equiva l e n t e s .En la fi g u ra 1 se mu e s t ran dos núcleos equivalentes enn ivel de fragmentación tras tinción con un fl u o ro c ro-mo estándar como el ioduro de propidio (Fi g u ra 1a) ycon Eva G reen (Fi g u ra 1b). En el segundo caso se ob-s e rva un extenso halo de dispersión de la cro m at i n aque no es visible con otros fl u o ro c romos o con tinciónp a ra campo cl a ro. Por lo tanto, en re a l i d a d, el métodoSCD está produciendo halos en aquellos esperm at o-zoides que contienen ADN fragmentado tanto en elcaso de humanos como en el caso de otros mamífe ro s ,p e ro en el pri m e ro no es fácil de visualizar.

Si en el caso de los humanos se utiliza la técnicade desproteinización directa sin desnat u ra l i z a c i ó np revia, el tamaño de los halos que se produce es mu yva ri able y es re l at ivamente frecuente la dificultad pa-ra dife renciar los esperm at o zoides que tienen el ADNa fectado y los intactos.

Más aún, la desproteinización controlada que seconsigue tras la aplicación del método SCD en todaslas especies, genera unos halos de relajación de la cro-m atina en esperm at o zoides que se consideran que nop resentan ADN fragmentado que no son homog é n e o spara todos los espermatozoides. Este efecto es particu-l a rmente obvio en el caso de los esperm at o zoides hu-manos y se traduce, tanto en variaciones en el área delhalo de difusión de fragmentos que se genera, como enla distri bución de la densidad de los bu cles de re l a j a-ción de la cromatina. Este efecto es claramente visiblet ras la aplicación directa de fi l t ros electrónicos a lasi m á genes digitales obtenidas en fl u o rescencia (Fi g u ra2). Las imágenes de fluorescencia directamente digita-lizadas son susceptibles de ser filtradas y con ello real-zar o eclipsar bandas de información que ayuden a dis-c riminar de fo rma evidente posibles dife rencias en ladensidad de la cro m atina que se desorganiza y en laexpansión de los halos. En la figura 2a se muestra unai m agen directamente obtenida del microscopio, mien-tras que la figura 2b corresponde al resultado obtenido

tras la aplicación del filtro que se diseño para este caso( Fi g u ra 2c). El fi l t ro es sencillo y puede ser autodise-ñado en cualquier procesador de imáge n e s .B á s i c a m e n t e, consiste en la supresión suavizada de labanda de info rmación correspondiente a los va l o re smedios comprendidos entre 55 y 65, en una escala degrises correspondiente a la acumulación de la informa-ción en los tres canales genéricos (RGB), y generar uni n c remento hasta los niveles 200 de la info rm a c i ó ncomprendida entre los valores ≤ 55 y ≥ 65. Si este fil-t ro se aplica de fo rma homogénea a imágenes que secapturan con los mismos tiempos de exposición, gene-ra una redistribución de la información en la que es re-saltan dife rencias existentes entre los halos corre s p o n-dientes a los esperm at o zoides que contienen ADN nofragmentado (Figura 2d) y ADN fragmentado con dife-rente intensidad (Figura 2e y 2f).

Dinámica de la fragmentación del ADN esperm á t i c oen humanos

En las mu e s t ras de esperma humano sometidas a es-tudio, la distri bución de los va l o res para la frag m e n t a-


Fi g u ra 2P roceso de fi l t rado en esperm at o zoides humanos para re l at a rlas dife rencias entre las densidades de distri bución de la cro m a-tina tras el proceso SCD. Ver texto para detalles. a-d)E s p e rm at o zoides con ADN sin frag m e n t a r. e-f) Esperm a-t o zoides con ADN fragmentado. c) Densitometría del núcl e om o s t rado en fi g u ra (a) y detalle del fi l t ro aplicado para pro d u c i rla imagen (b). Ver portada de la revista para un campo ge n e ra l .

ción del ADN en su nivel basal, osciló entre un 8 y un23% (Fi g u ra 3a). Sin embargo, en todos los casos, es-tos va l o res se incre m e n t a ron después de que lasmu e s t ras se incubasen a 37ºC (Fi g u ra 3a). El aumentoen los niveles medios de sDF es perc ep t i ble tra n s c u-rridos 90 minu t o s .

Con objeto de obtener una primera visión integradade la posible correlación entre el incremento observadoen el sDFI y el tiempo transcurrido, se realizó un análi-sis de regresión de las distintas tendencias presentadaspor cada individuo. Dado que el valor de p obtenido esi n fe rior a 0,01 (Tabla 1), hay una relación estadística-mente significativa entre las variables al 99%. Es decir,se está produciendo un incremento efectivo de la frag-mentación del ADN en el tiempo. Lo interesante delanálisis es que la pendiente en la recta de regresión quese obtiene para cada individuo es distinta, lo que gene-ra una serie de cruces entre las distintas tendencias co-mo un reflejo de la distinta velocidad de fragmentaciónque se está produciendo en cada individuo (Figura 4a).En términos medios, se estima que la velocidad de de-gradación transcurridas 4 horas de la incubación supo-ne un incremento de la fragmentación del ADN esper-mático del orden de un 7,4% por hora sobre los nivelesde fragmentación basal.

Por otra parte el análisis de regresión mu e s t ra otroaspecto interesante tanto al estudiar tanto el valor deR2 como en el error medio absoluto de los re s i d u o s

(EAR). Un valor alto de R2 y un valor bajo para elEAR indican un mejor ajuste de las distintas regre s i o-nes (Tabla 1).

Dinámica de la fragmentación del ADN esperm á t i c oen otros mamíferos

En el caso de los otros mamífe ros incluidos en el es-tudio, los niveles basales de sDFI fueron re l at iva m e n t ebajos en el caso del toro y del morueco, que no ex c e-d i e ron el 10% y el 15% re s p e c t ivamente para los va-l o res mayo res de sDF observados (Fi g u ra 3b, c). Sine m b a rgo, en el caso del caballo, el ra n go de va ri a c i ó nde los sDFI fue más amplio y se detectaron indiv i-duos con sDFI basal cercano a un 30%.

En todos los casos existe una relación directa en-t re la va ri able tiempo de incubación y el incre m e n t ode los niveles de fragmentación observados. Sin em-b a rgo, tanto las pendientes que se obtuvieron para lasdistintas especies como los va l o res de R2 y EAR fue-ron distintos (Tabla 1). Las especies que ofre c i e ro nc o m p o rtamientos similares para la dinámica de laf ragmentación fueron el humano y el caballo, siendoel ajuste mayor en el caso del caballo (Tabla 1). En loque se re fi e re a la velocidad de la fragmentación esti-mada para cada especie a las 4 horas de incubación,se observa que la menor longevidad -mayor ve l o c i d a dde fragmentación- del ADN espermático corre s p o n d e


Fi g u ra 3D i s t ri bución de los va l o res de fragmentación del ADN a lo largo del periodo de incubación en humanos

(a), morueco (b), caballo (c) y toro (d).

al morueco (Tabla 1), mientras que en el caso del to-ro, el disparo real de la fragmentación ocurre de ma-n e ra efe c t iva, por lo menos tra n s c u rridas 48 hora spost descongelación-incubación. Al igual que en elcaso de los humanos, se encontra ron dife rentes pen-dientes para cada individuo, lo que demostraba que ladinámica de la fragmentación era distinta para cadai n d ividuo dentro de la misma especie.

El análisis de regresión mostraba unos ajustesa c ep t ables en las distintas especies. Al igual que ocu-rre en el caso de los humanos, el incremento de los ni-veles de fragmentación se correlaciona con el tiempo.

Sin embargo, el error para los residuos era en algunoscasos, muy elevado como por ejemplo en el caso delm o rueco (Tabla 1). Esto podría ser indicat ivo de quelas tendencias hacia el incremento de la frag m e n t a c i ó npodría ser distinta entre especies. Pa ra comprobar esteaspecto part i c u l a r, se realizó un ajuste de la tendenciahacia el incremento de los niveles de frag m e n t a c i ó nde cada especie utilizando los va l o res medios obteni-dos para los 10 individuos en cada punto de análisis.En la Fi g u ra 5 se mu e s t ran el ajuste de la curva y losva l o res de R2 obtenidos. En el caso de humanos, losva l o res de R2 m ayo res se obtuvieron utilizando unajuste a una curva de tendencia exponencial (Fi g u ra5a), mientras que en el caso del morueco la tendenciae ra de tipo logarítmico. En el caso del caballo y delt o ro, si bien con dife rentes pendientes como vimos enel análisis posteri o r, se obtuvieron unos va l o res altosde R2 p a ra una un ajuste de tendencia lineal (Fi g u ra 5b, d). Si bien esta es la tendencia ge n e ral de ajuste pa-ra cada una de las especies, si analizáramos cada indi-viduo por sep a rado encontraríamos que los va l o res deR2 son va ri ables para cada individuo, lo que está enconsonancia con los cruces de las pendientes observa-das para cada individuo tras el análisis de regre s i ó n .

D I S C U S I Ó N

Los resultados obtenidos en el presente ex p e ri-mento indican que la fragmentación del ADN puede


R 2 p E A R V 4

H u m a n o 8 3 , 1 % 0 , 0 1 9 , 0 8 7 , 4

M o ru e c o 7 0 , 4 % 0 , 0 1 2 0 , 3 1 1 5 , 7

C ab a l l o 8 7 , 2 % 0 , 0 1 8 , 7 0 5 , 7

To ro 9 8 , 8 % 0 , 0 1 0 , 1 5 � 0

Tabla 1Va l o res de R2 para las correlaciones entre los niveles def ragmentación y el tiempo (T0 y T48) en las dife re n t e s

especies estudiadas. EAR: Error absoluto de losresiduos. En la última columna (V4) se re c ogen los

d atos de velocidad media de fragmentación del ADNe s p e rmático por unidad de tiempo, estimada para cadaespecie durante las pri m e ras 4 horas de incubación de

las mu e s t ras de esperm at o zoides a 37ºC

Fi g u ra 4Análisis de regresión de los va l o res mostrados en la fi g u ra 3. Humano (a) morueco (b), caballo (c) y toro (d). Ve r

t abla 1 y texto para info rmación de re s i d u o s

ser un efecto importante de la rápida disminución enla calidad seminal, dado que la molécula de ADNtiende a degra d a rse de fo rma rápida tras la desconge-lación. Sin embargo, la velocidad de degradación dela molécula de ADN varía entre las especies, siendomuy elevada para el caso de oveja, media para el casodel humano y el caballo y baja en el caso del toro .

En la práctica, las condiciones ex p e rimentales uti-lizadas en este ex p e rimento, sobre todo en el caso delos esperm at o zoides humanos, son idénticas a las quese utilizan para FIV. Dado que se trata de donantescon una calidad seminal seleccionada, es evidente quei n cluso en estos casos parece aconsejable una utiliza-ción rápida de las mu e s t ras una vez descongeladas da-do que la degradación del ADN parece que se iniciarápidamente tras la incubación a 37ºC, con lo cualcualquier lige ro re t raso podría ejercer una infl u e n c i an egat iva sobre la fe rtilidad de ese donante. En el casode los humanos, debido a la velocidad de degra d a c i ó no b s e rvada durante las pri m e ras 4 horas de incubación,p a rece muy pro b able que cualquier mu e s t ra pueda lle-gar a presentar casi un 50% de las células esperm á t i-cas con su ADN dañado tra n s c u rridas las pri m e ras ho-ras de incubación. Si relacionamos estos niveles def ragmentación con las ventanas definidas como asu-m i bles para los niveles de fragmentación en el caso de

humanos, donde se considera que individuos que pre-s e n t a ran niveles mayo res de 30% de frag m e n t a c i ó npodrían tener mayo res dificultades para conseguir em-b a ra zo (23), o bien aquellos que superan un 20% po-drían estar fuera de la norma (24), es evidente que lamu e s t ras de semen que se utilizan para inseminacióna rt i ficial, tra s c u rridos una serie de minutos, puedenh aber superado con creces estos va l o re s .

La pérdida de la calidad del esperma cuando lasmu e s t ra se exponen a un aumento de la temperat u raque se considera biológicamente correcta, se ha des-c rito en la mayoría de los animales analizados. Po rejemplo, la fe rtilidad del esperma de toro se conservacon unas tasas acep t ables durante los 3-5 días, si elsemen se almacena a temperat u ra ambiente. Despuésde este tiempo, la fe rtilidad disminu ye a una tasa del3%-6% por día y esto ocurre incluso cuando el esper-ma se almacena a 5ºC. Sin embargo, este efecto esm ayor cuando la temperat u ra de incubación es de15ºC (25). En el caso del toro, este resultado concuer-da perfectamente con la baja velocidad de frag m e n t a-ción del ADN que presenta esta especie, demostra d aen nu e s t ro estudio. De igual fo rma, en el caso de laoveja, es bien conocido que la inseminación utilizan-do mu e s t ras de semen congelado ofrece malos re s u l-tados (26, 27), lo también estaría de acuerdo con la


Fi g u ra 5Mejor ajuste conseguido en las distintas especies analizadas. Humano (a), morueco (b), caballo (c) y toro (d). Mientra s

que la tendencia hacia el incremento en los niveles de fragmentación es de tipo exponencial en el caso de loshumanos, esta es de tipo logarítmico en el caso del moru e c o

p resencia de un aumento rápido en los niveles def ragmentación y de un ajuste muy alto a un modelode incremento de tipo logarítmico. En el caso de lasovejas, el resultado de una buena fe rtilidad tras inse-minación art i ficial se complica por la estru c t u ra com-pleja del cuello uteri n o .

En humanos, los estudios de dinámica de frag m e n-tación del ADN son prácticamente inexistentes, perose ha demostrado que la re c ogida de semen eya c u l a d oen áreas ge ogr á ficas distantes y fuera de los lab o rat o-rios donde se realiza la inseminación art i ficial, podríadar lugar a un incremento en los esperm at o zoides condaño en el ADN (28). Las consecuencias de la cort al o n gevidad de la calidad del esperma detectada en de-t e rminadas situaciones clínicas podrían también estarrelacionadas con el efecto descrito en el presente estu-dio. Es posible que en situaciones clínicas de ri e s gop a ra la calidad seminal, estos efectos puedan estar am-p l i ficados, por un proceso de degradación en cadena.De hecho, se ha demostrado que la fragmentación delADN en individuos con azo o s p e rmia obstru c t iva sei n c rementa cuat ro veces tra n s c u rridas 24 horas desdela eyaculación (29). Así, en estas circunstancias, eluso inmediato de esperm at o zoides testiculares en lai nyección intracitoplasmática de esperm at o zoides (IC-SI) es altamente re c o m e n d able (29).

N u e s t ros resultados sugi e ren que se debe pre s t a respecial atención al factor temporal en el análisis se-minal. Es posible que ciertas características conside-radas como suficientes para la fe rtilización en el ini-cio de la evaluación de la calidad del esperm at o zo i d epuedan cambiar rápidamente entre la inseminación yla fe rtilización. Además, nu e s t ros estudios han de-m o s t rado una va ri abilidad interi n d ividual en la diná-mica de la fragmentación del ADN del esperm at o zo i-d e. Es decir, no todos los individuos presentan lamisma tasa de incremento de la fragmentación en suA D N, hecho que se había encontrado en otras espe-cies (30, 31). Este comportamiento sugi e re una hipó-tesis interesante para ve ri fi c a r, esto es, las pers o n a sc u yas mu e s t ras seminales presentan un aumento ex-ponencial (velocidad lenta inicial) de la pro p o rc i ó nde esperm at o zoides con ADN fragmentado tendríanm ayor aptitud rep ro d u c t iva que las que mu e s t ran uni n c remento logarítmico (velocidad rápida inicial). Siesto es cierto, el diseño ex p e rimental aquí ex p u e s t ose podría utilizar para seleccionar las mu e s t ras semi-nales de aquellos donantes con mayor estabilidad delADN a largo plazo, para ser empleadas en la insemi-nación art i ficial. En cualquier caso, parece evidente ei m p re s c i n d i ble para cualquier clínica, que las mu e s-t ras seminales se utilicen lo más rápidamente posibl euna vez que hayan sido desconge l a d a s .

Por último, el momento temporal de determinaciónde sDF debe especifi c a rse en cada determinación, yaque esto podría ser una limitación para establecer com-p a raciones fi ables entre las técnicas para evaluar lasDF y entre los resultados obtenidos en distintos labo-rat o rios. Sin ninguna re fe rencia explícita a la hora dere c ogida del semen y de descongelación de la pajuela,así como las condiciones de almacenamiento y mani-pulación, las comparaciones de resultados de sDF en-t re dife rentes lab o rat o rios, o correlaciones del sDFIcon la fe rtilización, calidad embri o n a ria y embara zo ,podría carecer de sentido o por lo menos siempre po-drían ser discutibles. Quizás para un futuro, que no de-b i e ra ser muy lejano, sí que se deberían pro t o c o l i z a rtanto las normas para las tomas de muestras, como lostiempos trascurridos entre las tomas de esas muestras yla realización de los análisis. Esto ayudaría de fo rm amuy notoria a entender mu chas de las discrep a n c i a sque ahora encontramos entre los resultados que presen-tan distintos grupos sobre algunos de los aspectos quehemos tratado en este trabajo. En nu e s t ro caso, tantoen humanos como en otros mamífe ros, en el caso demu e s t ras seminales frescas realizamos los análisis tra sdilución de la mu e s t ra. Esta dilución siempre se re a l i-za, si ello es posible, inmediatamente tras la obtenciónde la muestra. De no ser posible por aspectos de logís-tica, siempre se hace referencia a los tiempos y condi-ciones de almacenamiento de la muestra hasta su análi-sis. Esto nos permite que en situaciones en las quedetectamos una baja calidad seminal y estas se asociena no haber seguido el protocolo pre e s t ablecido, se po-dría rediseñar la toma de mu e s t ra y adap t a rla a pro t o-colo para descartar o aceptar que el manejo de lamuestra tiene una baja influencia en el resultado final.

En conclusión, los resultados obtenidos en la pre-sente inve s t i gación demu e s t ran de fo rma evidente quela determinación de la frecuencia de esperm at o zo i d e scon ADN fragmentado deb i e ra ser considerada y eva-luada como parte de un proceso dinámico y no estáti-co. Esto no sólo es así en el caso de humanos, sinoque también compete, como era lógico de espera r, ao t ras especies de mamífe ros. Por lo tanto, los va l o re sque podamos at ri bu i rle a los niveles de frag m e n t a c i ó ndel ADN en un individuo, tienen un sentido re l at ivo yno comparable con los de otro individuo si no se ex-plicitan en que condiciones y cuando se ha re a l i z a d oel estudio de esa mu e s t ra .

AG R A D E C I M I E N TO S

Los autores quieren agradecer a los técnicos FA rroyo y A Gosálbez su activa colab o ración en la ob-


tención de mu chos de los datos presentados en esteestudio y a Halotech DNA por su ayuda técnica.Estudio realizado con fondos de inve s t i gación públ i-cos BFU 2007-66340/BFI, CCG06-UA M / AG R - 0 3 0 7 ,C o o rdinación de Inve s t i gación en Salud del IMSS,México y Xunta de Galicia INCITE07PXI916201ES.

B I B L I O G R A F Í A

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