Aus dem Zentrum für Innere Medizin
des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg
Klinik für Innere Medizin, Kardiologie
Direktor: Prof. Dr. B. Maisch
Arbeitsgruppe Präventive Kardiologie: Prof. Dr. J. R. Schaefer
In Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH,
Standort Marburg
Funktionelle Charakterisierung neu identifizierter Defekte des
LDL-Rezeptors und von Apolipoprotein B-100
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie
(Dr. rer. physiol.)
dem Fachbereich Humanmedizin
der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt
von
Muhidien Soufi
aus Marburg
Marburg 2008
Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg
am: 09.06.2008
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.
Dekan: Prof. Dr. M. Rothmund
Referent: Prof. Dr. J.R. Schaefer
Korreferent: Prof. Dr. K-H. Grzeschik
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1 Atherosklerose und Koronare Herzkrankheit (KHK)____________________ 1
1.1.1 Die Bedeutung der Atherosklerose___________________________________1
1.1.2 Risikofaktoren für die Entstehung von KHK ___________________________2
1.1.3 Die Hyperlipidämie als bedeutender KHK- Risikofaktor _________________2
1.1.4 Die Pathogenese und Manifestation der Atherosklerose __________________3
1.2 Stoffwechsel der Apolipoproteine _____________________________________4
1.2.1 Aufbau und physikochemische Eigenschaften von Lipoproteinen __________4
1.2.2 Klassifikation und Funktionen der Apolipoproteine _____________________6
1.2.3 Enzyme und zelluläre Transporterproteine im Lipoproteinstoffwechsel ______8
1.3 Zentrale Rezeptoren des Lipoproteinstoffwechsels ______________________10
1.3.1 Die LDL- Rezeptor- Superfamilie __________________________________10
1.3.2 Der HDL- Scavenger Rezeptor B- I (SCARB1) _______________________14
1.3.3 Die Makrophagen Scavenger Rezeptoren Typ I und II (SR- A I/II) ________15
1.4 Die zelluläre Cholesterinhomöostase __________________________________15
1.4.1 Intrazelluläre Synthese von Cholesterin______________________________16
1.4.2 Die zelluläre Aufnahme von LDL über den LDL- Rezeptorstoffwechselweg_17
1.4.3 Transkriptionelle Kontrolle der intrazellulären Cholesterinbiosynthese _____19
1.5 Stoffwechsel der Lipoproteine _______________________________________23
1.5.1 Der exogene Weg (Chylomikronen- Stoffwechselweg)__________________23
1.5.2 Der endogene Weg (VLDL- LDL- Stoffwechselweg) ____________________ 26
1.5.3 Der reverse Cholesterintransport (HDL- Stoffwechselweg) ______________29
1.6 Störungen des Lipidstoffwechsels ____________________________________32
Inhaltsverzeichnis II
1.6.1 Einteilung der Lipidstoffwechselstörungen ___________________________32
1.6.2 Diagnostik von Lipidstoffwechselstörungen und Risikobeurteilung ________34
1.7 Monogenetische autosomal dominant vererbte Lipidstoffwechselstörungen _36
1.7.1 Die Familiäre Hypercholesterinämie (FH)____________________________36
1.7.2 Der LDL- Rezeptor Pathway und die Pathogenese der FH _______________37
1.7.3 Auswirkungen von LDLR- Mutationen auf den Lipidstoffwechsel bei FH___40
1.7.4 Das Familiär defekte Apolipoprotein B-100 (FDB)_____________________41
1.7.5 Struktur des Apolipoprotein B- Gens und Funktion von ApoB- 100________43
1.7.6 Bisher bekannte ApoB- Defekte und ihre Auswirkung auf
den Lipidstoffwechsel____________________________________________44
1.7.7 Mutationen im Gen der neuronalen Apoptosis regulierten Konvertase
(PCSK 9) _____________________________________________________46
1.8 Monogenetische autosomal rezessiv vererbte Lipidstoffwechselstörungen ___47
1.8.1 Apolipoprotein E und der ApoE- Polymorphismus _____________________47
1.8.2 Die Autosomal Rezessive Hypercholesterinämie (ARH) ________________50
1.8.3 Die autosomal rezessiv vererbte Phytosterolemie (Sitosterolämie) _________51
1.9 Aufgabenstellung und Zielsetzung der Arbeit __________________________53
2. Material und Methoden ___________________________ 55
2.1 Material _________________________________________________________55
2.1.1 Geräte ________________________________________________________55
2.1.2 Chemikalien und Biochemikalien __________________________________56
2.1.3 Enzyme _______________________________________________________59
2.1.4 Kommerzielle Reaktionssysteme ___________________________________59
2.1.5 Oligonukleotide ________________________________________________59
Inhaltsverzeichnis III
2.1.6 Kulturmedien/Seren _____________________________________________59
2.1.7 Verbrauchsmaterialien ___________________________________________60
2.1.8 Antikörper_____________________________________________________61
2.1.9 Standardpuffer und Lösungen _____________________________________62
2.1.10 Verwendete DNA und Proteinstandards _____________________________63
2.2 Molekularbiologische Arbeitsmethoden _______________________________64
2.2.1 Isolierung von DNA aus Vollblut___________________________________64
2.2.2 Isolierung von RNA aus kultivierten adherenten Zellen _________________65
2.2.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA__________66
2.2.4 DNA- Hydrolyse mit Restriktionsendonukleasen ______________________66
2.2.5 Agarose- Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA/RNA- Molekülen __67
2.2.6 Polyacrylamid- Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA- Fragmenten _67
2.2.7 Isolierung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen ___________________69
2.2.8 Amplifikation von DNA mit der Polymerase Kettenreaktion (PCR)________69
2.2.9 Quantitative Untersuchung der Genexpression mittels Real- Time RT/PCR _71
2.2.10 Denaturierende Gradientengel Elektrophorese (DGGE)_________________72
2.2.11 Sequenzierung von PCR- amplifizierter DNA ________________________74
2.3 Proteinbiochemische Methoden ______________________________________75
2.3.1 In vivo- Kinetikuntersuchungen von Kontroll- und Patientenproben _______75
2.3.2 Auswahl der Isotope für in vivo- Kinetikuntersuchungen ________________75
2.3.3 Studienprotokoll und Durchführung der in vivo- Kinetikuntersuchungen____77
2.3.4 Gewinnung des Plasmas für die nachfolgenden Experimente _____________78
2.3.5 Isolierung der freien Plasmaaminosäuren_____________________________78
Inhaltsverzeichnis IV
2.3.5 Isolierung der einzelnen Lipoproteinfraktionen mittels sequentieller-
Ultrazentrifugation ______________________________________________79
2.3.7 Dichtelösungen und Zentrifugationsbedingungen zur Isolierung
der Lipoproteine ________________________________________________79
2.3.8 Isolierung der VLDL- Fraktion ____________________________________80
2.3.9 Isolierung der IDL- Fraktion ______________________________________81
2.3.10 Isolierung der LDL- Fraktion _____________________________________81
2.3.11 Isolierung der HDL- Fraktion _____________________________________82
2.3.12 Lipidologische Labordiagnostik ___________________________________82
2.3.13 Entsalzung von Proteinproben mittels Dialyse ________________________83
2.3.14 Delipidierung von isolierten Lipoproteinfraktionen ____________________84
2.3.15 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford __________________86
2.3.16 SDS- Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS- PAGE)_________________87
2.3.17 Coomassie- Blau- Färbung von Proteingelen _________________________90
2.3.18 Immunblot von Proteinen ________________________________________90
2.3.19 Isolierung von Proteinbanden aus SDS- Gelen und Protein- Hydrolyse_____92
2.3.20 Isolierung der Aminosäuren über Ionenaustauscherchromatografie________93
2.3.21 Derivatisierung der Aminosäuren für die GC/MS______________________94
2.3.22 Gaschromatografie/Massenspektrometrie (GC/MS)____________________95
2.3.23 Datenauswertung ______________________________________________100
2.4. Zellbiologische Methoden _________________________________________102
2.4.1 Verwendete Zellen und Kulturbedingungen _________________________102
2.4.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen________________________________102
2.4.3 Fluoreszenzmarkierung von Lipoproteinpartikeln mit DiI_______________103
Inhaltsverzeichnis V
2.4.4 Herstellen von Lipoprotein defizientem Serum (LPDS) für die Zellkultur __104
2.4.5 Bindungs- und Aufnahmestudien mit DiI- markierten Lipoproteinen
in Zellkultur __________________________________________________104
2.4.6 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (LSM) ______________________107
2.4.7 Konfokale Mikroskopie der zellulären Aufnahme von DiI- LDL _________107
2.4.8 Immunfluoreszenz- Mikroskopie zur zellulären Lokalisation von Proteinen 108
2.4.9 Subzelluläre Fraktionierung von Zellen für Immunblot- Experimente _____109
3. Ergebnisse _____________________________________ 110
3.1 Mutationsanalyse mittels denaturierender Gradientengel- Elektrophorese
(DGGE)_________________________________________________________110
3.1.1 Prinzip und Theorie der DGGE ___________________________________110
3.1.2 Konstruktion eines Elektrophorese- Systems für das Screening
mit der denaturierenden Gradientengel Elektrophorese (DGGE) _________113
3.1.3 Schmelzkurven für die Untersuchungen des ApoB- 100 und
LDL- Rezeptorgens ____________________________________________114
3.1.4 Auswahl und Sequenzen der Oligonukleotide für die
DGGE- Untersuchungen ________________________________________116
3.3 Detektion von ApoB- Mutationen bei Patienten aus dem Kollektiv
der Marburger Präventions- Allianz durch DGGE- Screening __________119
3.3.1 Identifizierung einer neuen ApoB- Mutation: ApoB- H3543YMarburg ______119
3.3.2 Untersuchungen des LDL- Rezeptorgens und ApoE- Genotypisierung
bei den Trägern von ApoB- H3543YMarburg _____________________________________ 120
3.3.3 Haplotypanalyse der ApoB- H3543YMarburg- Träger ___________________122
3.3.4 Lipidparameter, Klinik und Prävalenz von ApoB- H3543YMarburg ________125
Inhaltsverzeichnis VI
3.4 Untersuchungen des LDL- Rezeptorgens bei Patienten mit
Familiärer Hypercholesterinämie (FH)_______________________________127
3.4.1 Erstmalige Beschreibung von homozygoter Familiärer-
Hypercholesterinämie (FH) bei eineiigen Zwillingen __________________127
3.4.2 Nachweis einer neuen LDL- Rezeptor Mutation: FH- W556RMarburg ______129
3.4.3 FH- W556RMarburg verändert die Struktur eines hochkonservierten
YWVD- Repeats im ß- Propeller- Motif des LDL- Rezeptors____________131
3.4.4 Unterschiedliche LDL- Cholesterinspiegel bei identischer LDLR- Mutation,
aber unterschiedlichem Geschlecht („Gender Specific Cholesterol“) _____132
3.4.5 Die DGGE und LDLR- Haplotypanalysen zeigen, dass beide FH- Familien
nicht direkt miteinander verwandt sind _____________________________135
3.4.6 ApoE- Genotypisierungen der beiden FH- W556RMarburg- Familien _______139
3.5 Funktionelle Charakterisierung von ApoB- H3543YMarburg
und FH- W556RMarburg in vitro mit Zellkultur- Experimenten ___________140
3.5.1 Aufnahme und Bindung von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg
und ApoB- R3500Q- DiI- LDL in kultivierten HeLa- Zellen ____________141
3.5.2 Die Aufnahme und Bindung von ApoB- H3543YMarburg DiI- LDL
in kultivierten HeLa- Zellen ist deutlich reduziert ____________________145
3.6 DiI- LDL- Aufnahme- Kinetiken mit FH- W556RMarburg- Fibroblasten ____145
3.6.1 Fibroblasten der homozygot betroffenen FH- W556RMarburg- Zwillinge
nehmen praktisch kein DiI- LDL mehr auf __________________________148
Inhaltsverzeichnis I
3.7 Untersuchungen der zellulären DiI- LDL- Aufnahme von
ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg mit konfokaler Mikroskopie _150
3.7.1 Konfokale Mikroskopie der Aufnahme von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg
und ApoB- R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen ______________________150
3.7.2 In der konfokalen Mikroskopie zeigte sich keine DiI- LDL- Aufnahme
in Fibroblasten der homozygot betroffenen FH- W556RMarburg- Zwillinge__152
3.7.3 Immunfluoreszensanalysen von Wildtyp und FH- W556RMarburg-
Fibroblasten mit konfokaler Mikroskopie ___________________________154
3.7.4 Auf der Zelloberfläche von Fibroblasten der FH- W556RMarburg- Zwillinge
lässt sich kein LDL- Rezeptor mehr nachweisen______________________155
3.8 Untersuchung der Expression von Genen des Cholesterinstoffwechsels in
FH- W556RMarburg - Fibroblasten mit Real- Time- RT/PCR _____________157
3.8.1 Die relative Expression zentraler Gene der Cholesterinbiosynthese
in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten ist deutlich erhöht ______159
3.8.2 Die Expression von SCARB1, aber nicht ABCA1, ist in homozygoten
FH- W556RMarburg- Fibroblasten deutlich erhöht ______________________162
3.9 In vivo Turnover- Untersuchung von ApoB- H3543YMarburg
und FH- W556RMarburg mittels stabiler Isotopentechnik ________________164
3.9.1 Isolierung und Aufreinigung der Lipoproteinfraktionen von Kontroll-,
ApoB- H3543YMarburg- und FH- W556RMarburg- Patienten für die
GC/MS- Messungen ____________________________________________165
3.9.2 Ergebnisse der in vivo Kinetikuntersuchung von Kontroll-,
ApoB- H3543YMarburg- und FH- W556RMarburg- Patienten_______________167
3.9.3 Tracer/Tracee- Ratios der freien Plasmaaminosäuren __________________167
Inhaltsverzeichnis II
3.9.4 In vivo Turnover von VLDL ApoB- 100 ___________________________168
3.9.5 In vivo Turnover von LDL ApoB- 100 ____________________________169
3.10 Varia: Ergebnisse weiterer genetischer Studien mit dem Kollektiv
der Marburger Präventions- Allianz _______________________________171
3.10.1 Identifikation der ApoA5 S19W- Mutation als Kofaktor für die Ausbildung
von Hyperlipidämie bei Patienten mit dem Phänotyp ApoE 2/2 _________171
3.10.2 Einfluss von Osteoprotegerin (OPG)- Polymorphismen auf die
koronare Herzkrankheit (KHK) __________________________________171
3.10.3 Promotor- Mutationen der Cytochrome P- 450 Epoxygenase (CYP2J2)
bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit (KHK) ___________________171
3.10.4 Untersuchungen des Gens der endothelialen NO- Synthase (eNOS)
bei Patienten mit KHK _________________________________________172
3.10.5 Untersuchungen von Apolipoprotein E (ApoE) bei Patienten
mit Hypertriglyzeridämie _______________________________________173
4. Diskussion ____________________________________________175
4.1 ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg- zwei neue, häufig
vorkommende Defekte in zentralen Proteinen des Lipidstoffwechsels ____175
4.1.1 ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg- funktionell relevante Defekte,
die über unterschiedliche Mechanismen wirken ______________________181
4.1.2 Die relative Expression zentraler Gene der Cholesterinbiosynthese
in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten ist deutlich erhöht______187
Inhaltsverzeichnis I
4.1.3 Die mRNA- und Proteinspiegel von SCARB1 in homozygoten und
Heterozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten sind erhöht, aber die
Expression von ABCA1 unterscheidet sich deutlich___________________189
4.1.4 In vivo Kinetik- Untersuchungen mit ApoB- H3543YMarburg- und
FH W556RMarburg- Patienten zeigen einen verzögerten
LDL ApoB- 100 Turnover ______________________________________194
4.1.5 Therapie von Patienten mit ApoB- H3543YMarburg- und FH- W556RMarburg _ 195
5. Zusammenfassung _____________________________________198
6. Literaturverzeichnis____________________________________200
7. Anhang ______________________________________________233
7.1 Abkürzungsverzeichnis ________________________________________233
7.2 Lebenslauf __________________________________________________235
7.3 Verzeichnis der akademischen Lehrer_____________________________236
7.4 Danksagung ________________________________________________237
7.5 Publikationen________________________________________________238
7.6 Ehrenwörtliche Erklärung ______________________________________242
1. Einleitung 1
1. Einleitung
1.1 Atherosklerose und Koronare Herzkrankheit (KHK)
1.1.1 Die Bedeutung der Atherosklerose
Die Atherosklerose und ihre Folgen sind heute für nahezu 50% der Todesfälle in den
westlichen Industrienationen verantwortlich (Schaefer 1998). Die Atherosklerose ist
nicht nur eine eigenständige Krankheit der Arterien, sondern manifestiert sich auch in
unterschiedlichen Formen. Am bedeutendsten sind die zerebrovaskuläre Manifestation
(Schlaganfall), sowie die kardiale Manifestation der Atherosklerose in Form der
koronaren Herzerkrankung (KHK). In Deutschland beruhen ca. 30% aller Todesfälle auf
einer KHK, wobei fast die Hälfte der Betroffenen durch einen akuten Myokardinfarkt
zu Tode kommt, während die andere Hälfte durch die chronischen Folgen der KHK
verstirbt (Niederstadt und Stierle 1999).
1.1.2 Risikofaktoren für die Entstehung von KHK
Das heute gültige Risikofaktorenkonzept der koronaren Herzerkrankung basiert auf den
Daten großangelegter epidemiologischer Studien (Castelli et al. 1987; Assmann und
Schulte 1988; Assmann et al. 2002). Besonders hervorzuheben sind hierbei zwei große
Studien, die über Jahrzehnte hinweg prospektiv begünstigende Faktoren für die
Entstehung von Herz- Kreislauf- Erkrankungen untersucht haben. Die in den USA in
einer amerikanischen Kleinstadt seit 1948 laufende Framingham-Studie (Castelli 1982)
beobachtete über Jahrzehnte hinweg mehr als 5200 Männer und Frauen im Alter von 30
bis 62 Jahren und identifizierte folgende kardiovaskuläre Risikofaktoren: männliches
Geschlecht, hohes Lebensalter, familiäre Belastung für das Auftreten von KHK,
Hypercholesterinämie, erniedrigte HDL- Cholesterinwerte, Nikotinabusus, arterielle
Hypertonie, Diabetes mellitus, körperliche Inaktivität, sowie Adipositas (Castelli 1982;
Castelli 1984; Castelli et al. 1987). In der unter der Leitung von Prof. Assmann am
Atheroskleroseforschungs- Institut in Münster seit 1979 laufenden „Prospective
Cardiovaskuläre Münster- Studie“ (PROCAM) (Assmann und Schulte 1986) mit über
18000 eingeschlossenen Personen konnte der potenzierende Effekt von
Einzelrisikofaktoren aufgezeigt werden (Assmann und Schulte 1988). Im Rahmen von
PROCAM wurde unter anderem die Inzidenz der koronaren Herzkrankheit in einer
Gruppe von 2815 Männern im Alter zwischen 40 und 65 Jahren ohne kardiale
Vorgeschichte untersucht. In einer Beobachtungsperiode von 4 Jahren wurden 73
1. Einleitung 2
koronare Ereignisse festgestellt, von denen 21 tödlich verliefen. In der Gruppe ohne
Risikofaktoren war die Infarktinzidenz mit 6/1000 relativ niedrig. Bei Vorhandensein
eines Risikofaktors wie z.B. Bluthochdruck oder Diabetes lag das Risiko für ein
koronares Ereignis bei 14/1000. Die Infarktrate bei der Kombination
Diabetes/Bluthochdruck lag bei 48/1000. Das alleinige Vorhandensein des
Risikofaktors Hyperlipidämie resultierte in einer Inzidenz von 96/1000, kamen
zusätzlich eine Hypertonie und/oder ein Diabetes mellitus hinzu, so erhöhte sich die
Infarkt- Inzidenz auf 114/1000 Personen. Die Daten von PROCAM wurden mittels
eines neuronalen Netzwerks generiert (Assmann et al. 2002) und ermöglichen heute
eine individuelle Risikostratifizierung durch den PROCAM- SCORE (abrufbar unter:
www.chd-taskforce.de).
1.1.3 Die Hyperlipidämie als bedeutender KHK- Risikofaktor
Die Bedeutung von Fettstoffwechselstörungen als kardiovaskuärer Risikofaktor
konnte- wie bereits oben kurz erwähnt- in großen epidemiologischen Studien wie der
Framingham Study (Kannel et al. 1971), der PROCAM- Studie, dem Multiple Risk
Factor Intervention Trial (Stamler et al. 1986) und der Withehall Study (Davey Smith et
al. 1998) aufgezeigt werden. All diese Studien fanden eine positive Korrelation
zwischen der Höhe des Serumcholesterins und dem Auftreten einer koronaren
Herzerkrankung. Besonders die Daten von PROCAM über einen Beobachtungszeitraum
von 4 Jahren zeigten, dass bei alleinigem Vorliegen einer Hyperlipidämie die Inzidenz,
ein kardiovaskuläres Ereignis zu erleiden, etwa 6-7 mal höher liegt (Castelli et al. 1987;
Assmann und Schulte 1988; Assmann et al. 2002) als bei alleinigem Vorliegen der
Risikofaktoren Bluthochdruck bzw. Diabetes mellitus, was eindrucksvoll den
Stellenwert der Hyperlipidämie als herausragendsten kardiovaskulären Risikofaktor
verdeutlicht. Diese Beobachtungen bestätigten sich nicht nur aus den primär erhobenen
Daten über die Ätiologie der Atherosklerose und damit verbunden der KHK, sondern
stützen sich auch auf die gesicherten Daten großangelegter Interventionsstudien mit
lipidsenkenden Medikamenten (insbesondere HMG- CoA- Reduktase- Inhibitoren) und
den Verlauf einer bereits manifesten Lipidstoffwechselstörung. Solche Studien wie z.B.
die „Scandinavian Simvastatin Survival Study (4 S- Studie) (Kjekshus und Pedersen
1995; Pedersen et al. 1998), die „Cholesterol and Recurrent Event Study“ (CARE-
Studie) (Sacks et al. 1996), sowie die „West of Scotland Coronary Prevention Study“
1. Einleitung 3
(WOS- Studie) (Shepherd et al. 1995) konnten zeigen, dass eine medikamentöse
Senkung z.B. des atherogenen LDL- Cholesterins die Gesamtmortalität und die KHK-
Mortalität sowohl bei gesunden, als auch bei erkrankten Personen im Vergleich zur
Placebogruppe signifikant senkt. Mehr noch, die PROVE-IT&TNT (Pravastatin or
Atorvastatin Evaluation and Infection Therapy und Treatment to new Targets) Studien
legen nahe, dass je niedriger das LDL (< 70mg/dl), desto geringer ist das Infarktrisiko
(Salam 2004; Fitchett et al. 2006; Deedwania et al. 2006).
1.1.4 Die Pathogenese und Manifestation der Atherosklerose
Die Enstehung der Atherosklerose ist ein komplexer Vorgang, der durch eine vielseitige
Wechselwirkung zwischen modifizierten Lipoproteinen, Endothelzellen, glatten
Muskelzellen der Intima der Arterien, Blutplättchen, Monozyten/Makrophagen sowie
Wachstumsfaktoren und Zytokinen charakterisiert ist (Libby 2000). Der initiale Prozess
beeinhaltet die Formation von atherosklerotischen Läsionen, welche zu einer Verengung
der großen und mittelgroßen Arterien, des systemischen Kreislaufs, insbesondere der
Aorta und ihren Ästen, der Koronararterien und Karotiden führt. Das von den beiden
amerikanischen Biochemikern Michael S. Brown und Joseph L. Goldstein konzipierte
Modell der Lipidhypothese als Ursache für die Entstehung von atherosklerotischen
Plaques (Goldstein und Brown 1977; Mahley et al. 1979) postuliert, dass modifizierte
Lipoproteine intermediärer und geringer Dichte (IDL und LDL) abhängig von ihrer
Plasmakonzentration in den subendothelialen Raum eindringen können und dort
oxidativ modifiziert werden (Steinberg 1981; Steinberg 1987). Diese modifizierten
oxidierten LDL- Partikel werden nun nicht mehr über den eigentlichen Abbauweg der
IDL und LDL, den sog. LDL- Rezeptorstoffwechselweg (siehe Punkt 1.7.2 dieser
Arbeit) abgebaut, sondern unreguliert von Monozyten/Makrophagen über die
Scavenger- Rezeptoren Typ- A-I und II aufgenommen (Krieger und Herz 1994; Stary
1995). Als Folge dieser unkontrollierten LDL- Aufnahme transformieren die
Makrophagen zu sog. isolierten Schaumzellen, welche Wachstumsfaktoren sezernieren,
die zu einer Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen führen. Im weiteren
Verlauf bilden sich “fatty streaks”(Akkumulationen von Makrophagen und Schichten
von Schaumzellen mit lipidbeladenen glatten Muskelzellen) aus. Mit dem Fortschreiten
der Entwicklung dieser Läsionen bilden sich schließlich Präatherome, die dann zur
Ausbildung von komplizierten Plaques und Atheromen führen (Stary 1995).
1. Einleitung 4
Letztendlich bewirkt die Ruptur eines solchen Plaques dann eine Aktivierung der
Gerinnungskaskade über die es zum thrombotischen Verschluss des Gefäßes mit einer
abrupten Reduktion des koronaren Blutflusses kommt. In Abbildung 1 ist die
Entstehung eines atherosklerotischen Plaques nach dem Modell der Lipidhypothese
dargestellt. Die von uns vorgestellte Marburger Hypothese der Atherogenese sieht des
weiteren die Abhängigkeit des Energiestoffwechsels des Herzens von Fettsäuren als
einen wesentlichen Faktor dafür, dass gerade das Herz Opfer der Atherosklerose wird.
(Schaefer et al. 2005).
Abbildung 1: Entstehung eines atherosklerotischen Plaques nach dem Modell der
Lipidhypothese von Brown und Goldstein (Brown und Goldstein 1983).
1.2 Stoffwechsel der Apolipoproteine
1.2.1 Aufbau und physikochemische Eigenschaften von Lipoproteinen
Lipide zirkulieren wegen ihrer Wasserunlöslichkeit im Plasma nicht in freiem Zustand,
wodurch der Transport von exogenen und endogenen Lipiden im menschlichen
Organismus in Form von großmolekularen Komplexen aus Lipiden und Proteinen
(Lipoproteinen) erfolgen muss. Lipoproteine besitzen einen charakteristischen Aufbau
mit einem Kern, der aus unpolaren Lipiden besteht (Cholesterinestern und
Triglyzeriden), während man an der Oberfläche Phospholipide, freies unverestertes
Cholesterin und die Apoproteine findet. Strukturell findet man in den Apoproteinen sich
Media mit glatten Muskelzellen
LDLMakrophage
Wachstumsfaktoren
Proliferation von glatten Muskelzellen
Ox.LDL
Atherosklerotischer Plaque
Endothelzellen
Angelockte MonozytenÜberangebot an LDL Gefäßlumen
Schaumzellen
Subendothelialer Raum
1. Einleitung 5
wiederholende Repeats aus sog. amphipathischen -helices, die eine Interaktion sowohl
mit den hydrophoben Core- Lipiden und der wässrigen Umgebung des Plasmas
ermöglichen, wodurch ein Transport der Lipide erst möglich wird. Neben der
Stabilisierung der Lipidkomplexe besitzen die Apoproteine weitere spezifische
Funktionen im Lipidstoffwechsel, wie z.B. die Aktivierung und Inhibierung von
Schlüsselenzymen des Lipidstoffwechsels, die Bindung an spezifische
Lipoproteinrezeptoren und Interaktion mit anderen Lipoproteinen. Aufgrund ihrer
unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften (Dichte, Ladung und chemische
Zusammensetzung) lassen sich die Lipoproteine in verschiedene Klassen einteilen und
auftrennen. Zu den wichtigsten Auftrennungsverfahren zählen die präparative
Ultrazentrifugation (Gofman et al. 1949; Gofman et al. 1954) Immunoaffinitätssäulen
und die Lipoprotein-Gelelektrophorese (Seidel et al. 1973; Neubeck et al. 1977). In den
Tabellen 1 und 2 sind die Kompositionen der einzelnen Lipoproteinfraktionen
dargestellt.
Tabelle 1: Eigenschaften der Plasmalipoproteine.
Lipoprotein Dichte (g/ml) Elektrophorese
(Mobilität)
Größe (nm) Apoproteine
Chylomikronen < 0,95 Keine 75 - 1200 A-I, A-IV, B-48
VLDL 0,95 - 1,006 prä- ß 30 - 80B-100, C-I, C-II, C-III,
E, A-V
IDL 1,006 - 1,019 slow prä- ß 25 - 35 B-100, C-III, E
LDL 1,019 - 1,063 beta 18 - 25 B-100
HDL2 1,063 - 1,125 alpha 9 - 12
HDL3 1,125 - 1,210 alpha 5 - 9
A-I, A-II, A-IV,A-V,
C-I,C-II, Apo M, C-III,E
Lp(a) 1,040 - 1,090 slow prä- ß 25 - 30 B-100, (a)
1. Einleitung 6
Tabelle 2: Lipidkomposition der Plasmalipoproteine.
Lipoprotein Cholesterin PhospholipideApolipo-proteine
TriglyzerideCholesterin-
Ester
Chylomikronen 2 % 7 % 2 % 86 % 3 %
VLDL 7 % 18 % 8 % 55 % 12 %
IDL 9 % 19 % 19 % 23 % 29 %
LDL 8 % 22 % 22 % 6 % 42 %
HDL2 5 % 33 % 40 % 5 % 17 %
HDL3 4 % 35 % 55 % 3 % 13 %
1.2.2 Klassifikation und Funktionen der Apolipoproteine
Wie bereits unter Punkt 1.2.1 erwähnt, sind die Apolipoproteine der funktionell
wichtigste Bestandteil aller Lipoproteinpartikel, die neben der Stabilisierung der
Lipidkomplexe weitere wichtige Funktionen im Lipidstoffwechsel übernehmen: 1.
Strukturfunktionen (z.B. ApoB). 2. Rezeptorbindung (z.B. ApoB- 100 und ApoE). 3.
Kofaktorfunktion zur Aktivierung/Inhibierung von Schlüsselenzymen des
Lipidstoffwechsels (z.B. Apo C-II und ApoC-III). Die Nomenklatur der
Apolipoproteine erfolgt alphabetisch nach Alaupovic in apo A, B, C etc. (Alaupovic et
al. 1972), der die Lipoproteinfamilien nach der Hauptkomponente ihres Proteinanteils
einteilte. In den meisten Lipoproteinen finden sich jedoch mehrere
Apolipoproteinklassen oder Kombinationen aus zwei oder mehr Apolipoprotein-
Klassen. Damit existiert eine große Anzahl an Lipoproteinen, die sich hinsichtlich ihrer
Lipid- und Proteinkomposition unterscheiden. Da es sich beim Lipidtransportsystem um
ein sehr dynamisches System handelt, bei dem die Apoproteinzusammensetzung durch
den Transfer von Lipiden und Apoproteinen ständig moduliert wird, stellt diese
Definition der Lipoprotein- Familien nur einen vorübergehenden Zustand dar. Die
wichtigsten Apolipoproteine und ihre speziellen Funktionen im Lipidstoffwechsel sowie
ihr Vorkommen sind in Tabelle 3 dargestellt.
1. Einleitung 7
Tabelle 3: Charakteristika humaner Apolipoproteine (Schneider et al. 1996).
Apolipo-
proteinChromosom
Mw.
(KDa)
Plasma-
Menge
(mg/dl)
VorkommenOrt der
SynthheseFunktion
A-I 11 28, 5 120- 140 HDL, CMLeber,
Darm
Aktivierung der LCAT. Bindung an SCARB1 und den HDL-Rezeptor.
A-II 1 17 35 - 50 HDL Leber Aktivierung der Hepat. Triglyzeridlipase.
A-IV 11 46 < 5 HDL, CM DarmAktivierung der LCAT. Bindung an den HDL-Rezeptor ?
A-V 11 38 < 2 VLDL, HDL Leber Aktivierung der Hepat.Triglyzeridlipase.
B-100 2 550 70 - 90 CM,VLDL, IDL, LDL
Leber Hauptligand des LDL-Rezeptors.
B-48 2 265 < 5 CM, VLDL Darm Strukturprotein der CM. Bindung an LRP.
C-I 19 6,5 5 - 8 HDL,CM, VLDL
Leber Aktivierung der LCAT.
C-II 19 8,8 3 - 7 HDL,CM, VLDL
Leber Aktivierung der LPL.
C-III 11 8,9 10 - 12 HDL,CM, VLDL
Leber Inhibitor der LPL
D 3 29 8 - 10 HDL LeberAktivierung und Stabilisierung der LCAT.
E 19 34 3 - 5 HDL,IDL CM,VLDL
Leber Ligand des LDL/VLDL-Rezeptors und LRP.
(a) 6 350-900 variabel HDL,LDL Lp(a)
Leber Funktion noch unklar.
M6 13 < 2 HDL, VLDL
Leber,
NiereBildung von pre-ß-HDL,Cholesterinefflux.
J 8 70 7-10 HDL, VLDLGehirn,
Leber,
Funktion nicht genau bekannt. Mitwirkung bei zellulärer Apoptose.
1. Einleitung 8
1.2.3 Enzyme und zelluläre Transporterproteine im Lipoproteinstoffwechsel
Bei der Verstoffwechselung der Lipoproteine spielen neben den Apolipoproteinen, die
als Kofaktoren und Rezeptorliganden fungieren, noch verschiedene plasmatische und
intrazelluläre Enzyme sowie spezifische zelluläre Lipidtransporter eine bedeutende
Rolle. In den Tabellen 4 und 5 sind die wichtigsten Vertreter dieser Proteine sowie
Krankheitsbilder, die durch Defekte in diesen Proteinen entstehen, kurz aufgelistet. Eine
detaillierte Beschreibung ihrer spezifischen Funktionen im Lipidstoffwechsel erfolgt in
den nachfolgenden Abschnitten dieser Arbeit.
Tabelle 4: Plasmatische und zellassoziierte Enzyme des Lipoproteinstoffwechsels und
deren Funktionen (Schaefer 1998).
Enzym Funktion im Lipidstoffwechsel Defekt (Krankheitsbild)
Lipoproteinlipase
(endothelassoziierte LPL)
Hydrolyse von Triglyzeriden aus
VLDL und Chylomikronen.
Hyperlipoproteinämie Typ I.
(Bürger- Grütz Syndrom).
Hyperlipoproteinämie Typ V
(Bassen- Kornzweig Syndrom).
HepatischeTriglyzeridlipase
(leberassoziierte HTGL)
Hydrolyse von Triglyzeriden und
Phospholipiden aus IDL und
HDL.
Familiäre HTGL- Defizienz.
Gemischte Hyperlipidämie wie bei
Typ- III Hyperlipoproteinämie nach
Fredrickson.
Endotheliale Lipase (EL)
Hydrolyse von Phospholipiden
und Triglyzeriden aus HDL.
Wichtige Funktion im HDL-
Katabolismus.
Bisher kein eigenständiges
Krankheitsbild bekannt. Seltene
SNPs zeigten Einfluss auf HDL-
Spiegel.
1. Einleitung 9
Tabelle 4: Plasmatische und zellassoziierte Enzyme des Lipoproteinstoffwechsels und
deren Funktionen (Fortsetzung).
Enzym Funktion im Lipidstoffwechsel Defekt (Krankheitsbild)
Lezithin- Cholesterin- Acyl-
Transferase (LCAT)
Veresterung von Cholesterin
(Bereitstellung von >80% der
Cholesterinester).
Fish eyes disease: Korneatrübung,
sehr niedrigte HDL- Plasmapiegel
(<10%), ApoA-I (<15%).
Cholesterinestertransfer-
Protein (CETP)
Cholesterinestertransfer von HDL
zu VLDL und LDL im Austausch
gegen Triglyzeride aus VLDL,
IDL.
Hyperalphalipoproteinämie mit
stark erhöhten HDL Plasmawerten.
Phospholipidtransfer- Protein
(PLTP)
Transfer von Phospholipiden aus
HDL zu VLDL/IDL und
umgekehrt.
Kein eigenständiges Krankheitsbild
bekannt Erniedrigte HDLSpiegel in
PLTP knockout Mäusen.
Tabelle 5: Intrazelluläre Enzyme und Transporterproteine des Lipoproteinstoffwechsels
und deren Funktionen.
Protein Funktion im Lipidstoffwechsel Defekt (Krankheitsbild)
Acyl- CoA- Cholesterin-
Acyltransferase (ACAT)
Intrazelluläre Veresterung von
Cholesterin aus freiem Cholesterin
und Oleat (Cholesterinoleat).
Kein eigenständiges Krankheitsbild
bekannt. Assoziation mit Athero-
sklerose und Alzheimer Krankheit in
knock out Mäusen gezeigt.
HMG- CoA- Reduktase
(HMGCR)
Schlüsselenzym der intrazellulären
de- novo- Synthese von Cholesterin
(Umwandlung von HMG- CoA zu
Mevalonat).
Kein eigenständiges Krankheitsbild
bekannt Zwei seltene nicht-
codierende SNPs zeigten Einfluss auf
Therapie mit Pravastatin.
1. Einleitung 10
Tabelle 5: Intrazelluläre Enzyme und Transporterproteine des Lipoproteinstoffwechsels
und deren Funktionen (Fortsetzung).
Protein Funktion im Lipidstoffwechsel Defekt (Krankheitsbild)
ATP- bindender
Kassettentransporter 1
(ABCA1)
Ausschleusung von überschüssigem
unveresterten Cholesterin aus Zellen
zur Übertragung auf Pre ß- HDL.
Tangier Disease mit extrem ernied-
rigten ApoA-I (< 3%) und HDL-
Plasmaspiegeln (0-5%).
Nieman Pick disease
like- protein 1
(NPC1L1)
Aktiver Transport von über die
Nahrung aufgenommenen Cholesterin
in die Enterozyten des Darms.
Kein eigenständiges Krankheitsbild
bekannt Seltene Mutationen führen
zu Therapieresistenz gegen
Ezetemibe.
ATP- bindender
Kassettentransporter 5
bzw. 8 (ABCA5/8)
Ausschleusung von überschüssigem
Cholesterin und pflanzlichen
Sterolkörpern aus den Enterozyten des
Darms zur Ausscheidung.
Defekte führen zu Phytosterolämie
und Sitosterolämie (Akkumulation
von pflanzlischen Sterolen).
1.3 Zentrale Rezeptoren des Lipoproteinstoffwechsels
1.3.1 Die LDL- Rezeptor- Superfamilie
Struktur und Funktion der Mitglieder der LDL- Rezeptorfamilie
Der LDL- Rezeptor ist ein 839 Aminosäuren großes Protein und Mitglied einer Familie
mit sechs weiteren integralen Membranproteinen aus der sog. LDL- Rezeptor-
Genfamilie (Brown et al. 1997; Sappington und Raikhel 1998). Das Gen des LDL-
Rezeptors umfasst 45 Kb, liegt auf Chromosom 19p13.1-13.3 und besteht aus 18
Exonen (Sudhof et al. 1985). Der LDL- Rezeptor kommt in unterschiedlicher Anzahl
auf nahezu allen Zelltypen vor. Alle Mitglieder der LDL- Rezeptorfamilie besitzen
einen charakteristischen modularen Aufbau aus vier bis fünf unterschiedlichen
Domänen, die ihrerseits wiederum eine große Homologie zu Proteinen anderer
Genfamilien aufweisen, was auf eine Evolution der LDL- Rezeptor- Genfamilie durch
sog. Exon- shuffling hindeutet (Sudhof et al. 1985; Russell et al. 1986; Wessel 1995).
Im Nachfolgenden sollen der modulare Aufbau des LDL- Rezeptors und die
1. Einleitung 11
Charakteristika der einzelnen Domänen sowie ihre Rolle bei der Rezeptoraktivität kurz
dargestellt werden:
Modul 1: Die ligandenbindende- Domäne
Die Ligandenbindungsdomäne des LDL- Rezeptors wird von den Exonen 2-6 codiert
und setzt sich aus 292 Aminosäuren zusammen, die in sieben sich wiederholenden
Schleifen (repeats) mit ca. 40 Aminosäuren zusammengefasst sind. Innerhalb jedes
Repeats findet man sechs Cystein- Moleküle, welche über Ausbildung von drei
Disulfidbindungen für den Aufbau der Tertiärstruktur der Bindungsdomäne
verantwortlich sind. Ursprünglich wurde vermutet, dass hierdurch negativ geladene
Aminosäurereste an der Oberfläche der Repeats exponiert werden und diese mit positiv
geladenen oberflächenexponierten Aminosäureresten der Liganden Apolipoprotein B-
100 und Apolipoprotein E interagieren, wodurch die Bindung der Liganden an den
Rezeptor ermöglicht wird (Schneider et al. 1982; Schneider et al. 1985). Erst die
kristallografische Untersuchung des Repeats 5 konnte zeigen, dass die negativ
geladenen Aminosäurereste durch ein zentrales Ca2+ Ion im Inneren des Repeats
komplexiert sind und nicht für die Ligandenbindung bereit stehen (Brown et al. 1997;
Fass et al. 1997). Das heute gültige Konzept der Bindung von Apolipoprotein B-100
und Apolipoprotein E an den Rezeptor postuliert, dass die Repeats 4 und 5 eine
hydrophobe Tasche ausbilden und mit positiv geladenen amphiphatischen Helices in
Apolipoprotein B-100 (site B) (Boren et al. 1998; Boren et al. 2001), Apolipoprotein E
(ApoE binding domain) (Innerarity et al. 1987; Wilson et al. 1991) in Wechselwirkung
treten und so die Bindung ermöglichen.
Modul 2: Die YWTD- Domäne und EGF- Precursor- Repeats
Die zweite extrazelluläre Domäne des LDL- Rezeptors umfasst 411 Aminosäuren und
wird von den Exonen 7-14 codiert. Diese Region ist zu 35% identisch mit der des
Vorläufermoleküls des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) (Russell et al. 1986).
Strukturell besteht sie aus zwei EGF- Repeats (Repeat A und B), gefolgt von einer
YWTD- Domäne und einem weiteren EGF- Repeat (repeat C) (Stenflo et al. 1988).
Diese Domäne vermittelt die pH- abhängige Dissoziation des Rezeptor- Liganden-
Komplexes im sauren Milieu des Endosoms (Davis et al. 1987; Innerarity 2002). Die
zentrale Rolle spielt hierbei die YWTD- Domäne, die durch kristallografische
Untersuchungen entdeckt wurde. Sie setzt sich aus sechs YWTD- Repeats zusammen,
1. Einleitung 12
die eine ß- Propeller Struktur (six bladed propeller structure) (Springer 1998; Jeon et al.
2001) ausbilden. Dieser ß- Propeller interagiert im Endosom bei einem pH von 6 durch
Ausbildung von Histidin- Salzbrücken und hydrophoben Wechselwirkungen spezifisch
mit den Ligandenbindungsrepeats 4 und 5 und führt so zur Freisetzung des via
Apolipoprotein B-100 und Apolipoprotein E an den Rezeptor gebundenen LDL-
Komplexes (Innerarity 2002).
Modul 3: Die O- glykosidische- Domäne
Die dritte Domäne des LDL- Rezeptors wird von Exon 15 codiert und ist ebenfalls
extrazellulär lokalisiert. Sie besteht aus 58 Aminosäuren und ist reich an Serin und
Threoninresten, von denen ein Großteil glykosiliert ist (Cummings et al. 1983).
Während man dieser Domäne früher für die Rezeptoraktivität keine notwendige
Funktion zusprach (Schneider 1989), geht man heute davon aus, dass diese Domäne
eine hydrophile Pufferzone ausbildet, welche den gebundenen LDL- Komplex von der
Lipiddoppelschicht der Plasmamembran fernhält.
Modul 4: Die Transmembrane- Domäne
Das Exon 16 und ein Teil von Exon 17 codieren für die transmembrane- Domäne des
LDL- Rezeptors. Diese besteht aus einer Sequenz von 22 hydrophoben Aminosäuren,
die den LDL- Rezeptor in der Lipiddoppelschicht der Plasmamembran verankern
(Russell et al. 1984).
Modul 5: Die cytoplasmatische- Domäne
Die cytoplasmatische- Domäne des Rezeptors wird von Exon 17 und 18 codiert und
besteht aus 50 Aminosäuren, die als Konsensus- Aminosäuresequenz ein sog. NPxY-
Motif (Asp.-Pro.-x-Tyr. wobei x = jede beliebige Aminosäure) enthält. Dieses Motif
interagiert spezifisch mit dem ARH1- Protein (He et al. 2002; Cohen et al. 2003) (siehe
Punkt 1.8.3 dieser Arbeit) und ermöglicht hierdurch die Verankerung und
Internalisierung des Rezeptor- Liganden- Komplexes in den coated pits. Wie bereits
oben erwähnt, beträgt die Gesamtlänge des LDL- Rezeptormoleküls 839 Aminosäuren
(Yamamoto et al. 1984). Das Molekulargewicht des reifen vollständig prozessierten
humanen LDL- Rezeptors liegt bei ca. 160 KDa bzw. bei 120 KDa für das nicht
prozessierte Präkursormolekül (Beisiegel et al. 1982; Schneider et al. 1982; Daniel et al.
1983; Hui et al. 1986). In Abbildung 2 ist die Struktur der Mitglieder der LDL-
Rezeptorfamilie sowie der Aufbau des LDL- Rezeptorgens dargestellt.
1. Einleitung 13
Abbildung 2: Darstellung der modularen Struktur der Mitglieder der LDL- Rezeptorfamilie und
Aufbau des LDL- Rezeptorgens mit seinen 18 Exonen, die für die individuellen Module
codieren.
= LDLR repeats mit Ca2+ Ion (Bindung)
= EGF repeats
= ß-Propeller (6xYWTD repeats )
= O-gebundene Zucker
= Transmembrane Domäne
= NpxY-Motif
COOH COOH COOH COOH COOH
LDL-Rezeptor
VLDL-Rezeptor
Neuro/ApoE/LR8B
LRP MegalinGP 330
NH2 NH2 NH2
NH2NH2
SRE
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
5´ 3´
Promotor
Modul 1:
Modul 2:
Modul 3:
Modul 4:
Modul 5:
Modul 6:
1. Einleitung 14
1.3.2 Der HDL- Scavenger Rezeptor Typ B- I (SCARB1)
Struktur und Funktion von SCARB1
Der Scavenger Rezeptor B- I (SCARB1) ist ein Membranprotein mit einem
Molekulargewicht von 80 KDa, welches die selektive Cholesterinaufnahme in Zellen
katalysiert. Das Gen von SCARB1 umfasst 75 Kb, ist auf Chromosom 12q 24.31
lokalisiert und setzt sich aus 13 Exonen zusammen (Cao et al. 1997). SCARB1 weist
eine sehr große Aminosäure und cDNA- Homologie zur CD36- Rezeptorfamilie auf
(Acton et al. 1996). Strukturell besteht SCARB1 aus zwei kurzen N- und C- terminalen
intrazellulär lokalisierten Domänen, zwei transmembranen Regionen und einer großen
extrazellulär lokalisierten Schleife, über welche die Lipoproteinbindung und
Cholesterinaufnahme erfolgt (Cao et al. 1997; Rigotti et al. 2003). SCARB1 ist der erste
identifizierte HDL- Rezeptor überhaupt (Acton et al. 1996) und wird hauptsächlich in
der Leber und in Zellen exprimiert, die eine hohe Steoidbiosynthese aufweisen
(Nebennierenrinde, Ovarien, Testes und Makrophagen) (Landschulz et al. 1996; von
Eckardstein et al. 2001). Neben HDL als Hauptliganden bindet SCARB1 auch
modifiziertes und natives LDL und vermittelt auch hier die Cholesterinaufnahme in die
Zelle (Krieger 1999; Rigotti et al. 2003). Die zentrale Rolle von SCARB1 als HDL-
Rezeptor beim reversen Cholesterintransport (siehe Punkt 1.5.3 dieser Arbeit) besteht in
der selektiven Aufnahme von Cholesterinestern aus HDL in die Leber. Anders als beim
LDL- Rezeptorstoffwechselweg erfolgt hierbei jedoch keine Internalisierung und
endosomale Degradation des HDL- Partikels, sondern ein direkter Influx von
Cholesterinestern in die Zelle. Es konnte gezeigt werden, dass SCARB1 in der
Zellmembran in Caveolae lokalisiert ist und man vermutet, dass SCARB1 gemeinsam
mit weiteren Komponenten der Caveolae (z.B. Caveolin- 1) einen hydrophoben Tunnel
ausbildet, über den der Influx von Lipiden in die Zelle stattfindet (Williams et al. 1999;
Graf et al. 1999). Neben der selektiven Aufnahme von Cholesterinestern aus HDL in die
Zellen vermittelt SCARB1 auch den Efflux von Cholesterin aus Zellen. Generell lässt
sich sagen, dass der von SCARB1 vermittelte zelluläre Netto- Influx/Efflux von
Cholesterin über die Aktivität der extrazellulären Lipidtransfer- Enzyme (LCAT, CETP,
PLTP) und die intrazellulären Enzyme der Cholesterinhomöostase reguliert wird
(Czarnecka und Yokoyama 1995; Ji et al. 1997). Die Expression von SCARB1 in der
Leber und peripheren Zellen wird durch den Transkriptionsfaktor SREBP-2 reguliert
1. Einleitung 15
(Treguier et al. 2004). Cholesterin und Östrogene erniedrigen die Expression von
SCARB1, während mehrfach ungesättigte Fettsäuren diese erhöhen (Krieger 1999;
Trigatti et al. 2000). Die zentrale Bedeutung von SCARB1 für den HDL- Stoffwechsel
und in der Pathogenese der Atherosklerose konnte auch in Experimenten mit SCARB1-
knockout und transgenen Mäusen gezeigt werden. Hier zeigte sich, dass SCARB1-
knockout- Tiere trotz hoher HDL- Plasmaspiegel eine massive Atherosklerose
entwickelten. Bei transgenen Tieren, die SCARB1 überexpremieren kommt es trotz
niedriger HDL- Plasmaspiegel nicht zur Ausbildung von atherosklerotischen Läsionen
(Rigotti et al. 1997; Trigatti et al. 1999).
1.3.3 Die Makrophagen Scavenger Rezeptoren Typ I und II (SR- A I/II)
Struktur und Funktion von SR- A I /II
Erste wichtige Erkenntnisse über die Bedeutung der Makrophagen Scavenger
Rezeptoren im Lipidstoffwechsel und ihrer Mitwirkung bei der Entstehung von
atherosklerotischen Plaques, wurden im Labor von Goldstein und Brown an der
Southwestern University in Dallas/Texas gewonnen (Goldstein et al. 1979). Sie konnten
zeigen, dass nicht der LDL- Rezeptorstoffwechselweg (siehe Punkte 1.1.4 und 1.7.3) für
die massive Akkumulation von Cholesterin in die subendothelialen Makrophagen
verantwortlich ist, sondern eine weitere Klasse von Multiliganden- Rezeptoren, die über
Endozytose LDL- Cholesterin aufnehmen können, die sog. Makrophagen- Scavenger-
Rezeptoren- Typ I und II (SR- A I/II) (Brown et al. 1979; Brown und Goldstein 1983).
Die beiden Rezeptor- Isoformen SR- A I/II werden von einem einzelnen Gen, das 85 Kb
umfasst und auf Chromosom 8p22 liegt, codiert und durch alternatives Spleißen der SR-
A- mRNA generiert (Freeman 1994). Strukturell handelt es sich um homotrimerische
integrale Membranproteine mit einem Molekulargewicht von 222-260 KDa, die sich aus
sechs Domänen zusammensetzen (N- terminale zytoplasmatische Domäne,
transmembranöse- Domäne, spacer- Domäne, - helicale coiled coil- Domäne,
Kollagen- homologe Domäne, cysteinreiche C- terminale Domäne) (Kodama et al.
1990; Krieger und Herz 1994; Krieger 1998). Ein wesentlicher Unterschied zum LDL-
Rezeptor besteht in der Ligandenspezifität der Makrophagen Scavenger Rezeptoren Typ
I und II. Während der LDL- Rezeptor native LDL- Partikel selektiv über Apolipoprotein
B und E bindet, binden SR- A I/II- Rezeptoren eine Vielzahl von polyanionischen
1. Einleitung 16
Liganden über die extrazellulären Kollagen und cysteinreichen Domänen, aber kein
natives LDL. Erst chemisch modifizierte LDL- Partikel (z.B. oxidiertes/acetyliertes
LDL) werden über den “Scavenger pathway” via SR- A I/II- Rezeptoren massiv in die
Zellen aufgenommen. Ein weiterer wichtiger Unterschied zum LDL- Rezeptorweg
besteht darin, dass die Expression der Makrophagen Scavenger Rezeptoren Typ I/II
nicht der Feedback Regulation durch den zellulären Cholesteringehalt unterliegt und
dieser LDL- Aufnahmeweg daher nicht saturierbar ist, was die zentrale Bedeutung des
„Scavenger pathways” in pathologischer Stoffwechselsituation mit erhöhten LDL-
Cholesterinspiegeln und seine Rolle bei der Transformation von Makrophagen zu
Schaumzellen als eines der initialen Ereignisse bei der Formation von
atherosklerotischen Läsionen verdeutlicht (Linton und Fazio 2001).
1.4 Die zelluläre Cholesterinhomöostase
1.4.1 Intrazelluläre Synthese von Cholesterin
Cholesterin ist ein wichtiges Molekül, das der Körper zum Aufbau von Zellmembranen
und zur Synthese von Steroidhormonen und Gallensäuren benötigt. Die de novo
Biosynthese von Cholesterin findet praktisch in allen Körperzellen (v.a. Leber und
Darm) statt und ist ein komplexer Prozess, der mit der Kondensation von drei
Molekülen Acetyl- CoA zu Mevalonat (C6) beginnt. Dieser Schritt der
Cholesterinbiosynthese ist der geschwindigkeitsregulierende und wird durch das Enzym
HMG- 3- Hydroxy- 3- methyl- glutaryl- CoA- Reduktase katalysiert. An diesem Schritt
der Cholesterinbiosynthese wirken cholesterinsenkende Medikamente (Statine) über
eine reversible Inhibition der HMG- CoA- Reduktase. Aus dem Zwischenprodukt
Mevalonat entsteht nach Phosphorilierung und Abspaltung von CO2 und H20
Isopentenyldiphosphat (C5). Im weiteren Verlauf der Synthese kondensieren 6 Moleküle
Isopentenyldiphosphat (Isopren) zu Squalen (C30), welches nach Oxidation zu
Lanosterin zyklisiert wird. Durch oxidative Entfernung dreier Methylgruppen und
Umlagerung der Doppelbindungen entsteht aus Squalen das Endprodukt Cholesterin
(C27), das intrazellulär in Form von Cholesterinestern gespeichert wird. In Abbildung 3
ist der Ablauf der intrazellulären Cholesterinbiosynthese mit den einzelnen
Reaktionsschritten dargestellt.
1. Einleitung 17
Abbildung 3: Ablauf der intrazellulären Cholesterinbiosynthese. Eine detaillierte Erklärung
findet sich im Text.
1.4.2 Die zelluläre Aufnahme von LDL- Cholesterin über den LDL-
Rezeptorstoffwechselweg
Unsere heutigen Kenntnisse über die genauen Mechanismen der zellulären
Cholesterinhomöostase stammen im wesentlichen aus den von Brown und Goldstein in
den 70er Jahren durchgeführten Experimenten an Fibroblasten in Zellkultur. Sie
konnten- wie oben bereits erwähnt- zeigen, dass prinzipiell jede Zelle zur de novo-
Synthese von Cholesterin in der Lage ist und dass diese de novo- Synthese durch eine
externe Zufuhr und Aufnahme von Plasma- LDL- Cholesterin gehemmt wird (Brown et
al. 1973; Brown und Goldstein 1974). Auf der Basis ihrer Beobachtungen postulierten
sie damals einen rezeptorvermittelten Aufnahmeweg von LDL- Cholesterin und
entdeckten 1974 auf Fibroblasten den LDL- Rezeptor (ApoB/E- Rezeptor) (Goldstein
und Brown 1974; Brown und Goldstein 1986). Neben Apolipoprotein B-100 als
Hauptligand der LDL bindet der LDL- Rezeptor auch Apo E- haltige Lipoproteine
(VLDL und IDL), wodurch VLDL und IDL mit LDL um die Rezeptorbindung
konkurrieren und so ebenfalls aus der Zirkulation entfernt werden können. Der Prozess
der rezeptorvermittelten Endocytose von LDL- Partikeln beginnt mit der Synthese der
LDL- Rezeptoren im Endoplasmatischen Retikulum (ER). Nach erfolgter korrekter
Faltung der 120 KDa LDL- Rezeptor- Präkursormoleküle, welche durch molekulare
3,3-Dimetyl PP
Geranyl PP
Acetyl CoA HMG CoA
Mevalonat 5-PP Mevalonat Isopentyl PP
Farnesyl PPSqualenLanosterin
Cholesterin
HMG CoA ReduktaseStatine
1. Einleitung 18
Chaperone (Bu et al. 1995; Jorgensen et al. 2003) kontrolliert wird, gelangen diese in
den Golgi- Apparat, wo durch postranslationale Modifikationen (N und G-
Glykosylierungen) die reifen 160 KDa Formen der LDL- Rezeptoren entstehen
(Tolleshaug et al. 1982). Diese LDLR sammeln sich danach in hoher Dichte über ein
Clathrin- assoziiertes Protein in mit Clathrin ausgekleideten coated pits
(Stachelsaumgrübchen) an der Zelloberfläche an. Nach Bindung der LDL- Partikel über
die Rezeptorbindungstelle site B in ApoB- 100 (Boren et al. 1998), werden die coated
pits internalisiert (Anderson et al. 1977). Für die Internalisierung wird in Leberzellen
das ARH1- Protein benötigt, das über eine sogenannte PDZ- Domäne spezifisch an die
NPxY- Domäne des LDL- Rezeptors bindet und erst dadurch die Internalisierung des
Komplexes ermöglicht (He et al. 2002; Michaely et al. 2004). Aus den coated pits
entstehen anschließend coated vesicles, diese wiederum verschmelzen nach Degradation
der Clathrinhülle zu Endosomen, in denen es durch einen Einstrom von Protonen (H+)
zum Absinken des pH- Wertes auf ca. 6 kommt, was zur Dissoziation von Rezeptor-
und LDL- Partikeln führt (Davis et al. 1987; Brown et al. 1997; Innerarity 2002).
Während der Rezeptor in Vesikeln verpackt wieder an die Zelloberfläche gelangt und
erneut in den coated pits gebunden wird (Rezeptor- Recycling), fusionieren die im
Kompartiment verbleibenden LDL- Partikel mit primären Lysosomen zum sekundären
Lysosom, in dem der Proteinanteil der LDL, das ApoB- 100, proteolytisch gespalten
wird. Die dabei frei werdenden Cholesterinester werden zu Cholesterin hydrolisiert und
stehen der Zelle zur Synthese von Membranbausteinen, Steroidhormonen und in der
Leber zur Produktion von Gallensäuren zur Verfügung. Neben dieser Verwendung
greift das frei gesetzte Cholesterin regulatorisch in den Zellmetabolismus ein und
reguliert über mehrere Stellglieder die intrazelluläre Cholesterinhomöostase (Brown et
al. 1973; Brown und Goldstein 1986). Zum einen werden die Transkriptionsraten der 3-
Hydroxy- 3- Methylglutaryl- CoA- Reduktase (HMGCR) (Brown und Goldstein 1999;
Horton et al. 2002) und des LDL- Rezeptors gesenkt, und zum anderen die Acyl-CoA-
Cholesterin- Acyltransferase (ACAT) aktiviert und das freie Cholesterin zu
Cholesterinestern metabolisiert und intrazellulär gespeichert. Über diese Regulation
wird gewährleistet, dass bei hohen intrazellulären Cholesterinkonzentrationen die
zelluläre de novo- Cholesterinbiosynthese inhibiert wird. In Abbildung 4 sind die
1. Einleitung 19
zellulären Vorgänge bei der Aufnahme von LDL über den LDL-
Rezeptorstoffwechselweg („LDL- receptor pathway”) grafisch dargestellt.
Abbildung 4: Ablauf der rezeptorvermittelten Endozytose von LDL über den „LDL- receptor-
pathway” adaptiert nach Brown und Goldstein (Goldstein und Brown 1989). Eine detaillierte
Erklärung findet sich im Text.
1.4.3 Transkriptionelle Kontrolle der intrazellulären Cholesterinbiosynthese
Wie bereits oben erwähnt, greift das über den LDL- Rezeptorstoffwechselweg
extrazellulär aufgenommene und freigesetzte Cholesterin regulatorisch in den
Zellmetabolismus ein und reguliert über mehrere Stellglieder die intrazelluläre
Cholesterinhämoästase. Die transkriptionelle Kontrolle der Gene, die in der
Cholesterinbiosynthese ein zentrale Rolle spielen, erfolgt über spezifische DNA-
Sequenzen im Promotor dieser Gene durch sog. „sterol- regulatory elements“ (SRE´s).
Diese SRE´s finden sich in den Promotoren des LDL- Rezeptors, der HMG- CoA-
Synthase und HMG- CoA- Reduktase, der ACAT sowie in den Genen weiterer
Rezeptoren und Transporter des Lipidstoffwechsels wie z. B. SCARB1, ABCA1 und
PCSK9 (Brown und Goldstein 1997; Amemiya-Kudo et al. 2002; Wong et al. 2006).
Cholesterin-ester
ApoB-100
H + ARH
Coatedvesicle
EndosomLysosom
Cholesterinester
EndoplasmatischesRetikulum
Golgi- Komplex
LDLR (120KDa)
LDLR (160KDa)
ACAT
Cholesterin
Vesikel
LDL-Rezeptor HMG-CoA- Reduktase
ARH
Proteolyse
LDL
site B
Coated pit
1. Einleitung 20
Der Promotor des LDL- Rezeptorgens beinhaltet in der Region -200 Bp stromaufwärts
vom ATG Startcodon neben zwei AT- reichen Sequenzen (TATA-Boxen) drei
homologe GC- reiche Wiederholungen aus 16 Basenpaaren ( GC- rich „Repeats 1-3“).
Während die Repeats 1 und 3 Bindungstellen für den ubiquitären Transkriptionsfaktor
Sp1 aufweisen, beinhaltet das Repeat 2 als spezifische Bindungstelle ein „sterol
regulatory element“ (SRE) aus 10 Bp, welches die Konsensus- Sequenz 5´
TCACCCCACT 3´ beinhaltet. An dieses SRE binden als Transkriptionsfaktoren
spezifisch zwei „sterol- regulatory element binding proteins“ (SREBP1 und 2) (Mehta
et al. 1991; Hua et al. 1993; Brown und Goldstein 1999). Die Vorläufer der SREBP-
Proteine bestehen aus einer C- terminalen regulatorischen Domäne (Reg) und einer N-
terminalen Transkriptionsfaktor Domäne (bHLH-zip) und sind in der Membran des
Endoplasmatischen Retikulums in einem Komplex mit einem weiteren Protein, dem
„SREBP cleavage- activating protein“ (SCAP) eingebettet (Brown et al. 2002; Adams
et al. 2003). Die Interaktion zwischen beiden Proteinen erfolgt über die regulatorische
Domäne (Reg) in SREBP und eine WD- Domäne (Tryptophan- Asparaginsäure- Motif)
in SCAP (Nohturfft et al. 1998; Horton et al. 2002). Das SCAP- Protein besitzt als
zusätzliche regulatorische Proteinbindungstelle eine sterol sensing Domäne (SSD), an
die bei hohen intrazellulären Cholesterinkonzentrationen zwei regulatorische Proteine
INSIG 1 und 2 (INSIG = Insulin induced genes 1 bzw. 2 Proteine) (Yabe et al. 2002;
Yang et al. 2002) binden und über diese Interaktion eine Prozessierung der SREBP-
Vorläufer-Proteine im Golgi- Apparat verhindern (Loewen und Levine 2002; Rawson
2003). Sterol sensing Domänen finden sich in einer Vielzahl von Proteinen, die eine
Rolle beim Cholesterinstoffwechsel spielen (z. B. HMG- CoA- Reduktase, NPC1,
NPC1L1). Die genauen Funktionen der sterol sensing Domänen im
Cholesterinmetabolismus und die regulatorischen Mechanismen sind bisher nicht
vollständig aufgeklärt. Kommt es zu einem intrazellulären Cholesterinmangel, so
dissoziieren die INSIG- Proteine von der SSD von SCAP ab und der SREBP/SCAP-
Komplex wandert zum Golgi- Apparat. Dort werden die SREBP- Vorläufer in einem
bisher nicht genau bekannten sterolsensitiven Schritt proteolytisch an einer spezifischen
Stelle (site-1) durch eine spezifische site- 1 Protease (Nohturfft et al. 1998; Rawson
2003) geschnitten, wodurch die C- terminale regulatorische Domäne (Reg) abgespalten
wird. In einem nachfolgenden zweitem proteolytischen Schritt spaltet dann die site- 2-
1. Einleitung 21
Protease (S2P) spezifisch an site- 2 die N- terminale Transkriptionsfaktor- Domäne
(bHLH-zip) ab und generiert so die reifen SREBP- Proteine. Diese wandern
anschließend in den Zellkern und aktivieren dort über Bindung an die SRE´s in den
Promotoren der Gene für den LDL- Rezeptor und weiterer Enzyme der
Cholesterinbiosynthese die Transkription dieser Gene (Sakai und Rawson 2001;
Rawson 2003). Als Folge kommt es zu einer Steigerung der extrazellulären
Cholesterinaufnahme über den LDL- Rezeptor und zu einer vermehrten intrazellulären
Cholesterinbiosynthese. Über diesen dualen Mechanismus wird eine Zunahme der
intrazellulären Cholesterinkonzentration gewährleistet. Erreicht die intrazelluläre
Cholesterinkonzentration einen bestimmten Schwellenwert, so wird durch die erneute
Bindung von INSIG 1 und 2 an SCAP eine weitere Prozessierung der SREBP-
Vorläufer- Proteine blockiert und dadurch die LDL- Rezeptor- und Cholesterinsynthese
gedrosselt. Parallel dazu inhibieren die SREBP- Proteine über einen Feedback-
Mechanismus eine weitere Synthese von SREBP- Vorläufer- Proteinen (Brown und
Goldstein 1997; Goldstein et al. 2002). Das so gewonnene Cholesterin wird durch die
Aktivität der ACAT zu Cholesterinestern umgewandelt und intrazellulär gespeichert.
Überschüssiges nicht verestertes Cholesterin wird anschließend in einem aktiven
Prozess via ABCA1- Transporter aus der Zelle hinaus transportiert und auf HDL
übertragen. Neben der vorrangig durch INSIG 1 induzierten, cholesterinabhängigen
konvergenten Feedback- Inhibition der SREBP- Prozessierung am Endoplasmatischen
Retikulum (ER), wird die transkriptionelle Aktivität und Stabilität der SREBP-
Transkriptionsfaktoren durch eine Kaskade von Phosphorilierungs und
Ubiquitinierungsprozessen gesteuert (Sundqvist und Ericsson 2003; Gong et al. 2006).
Durch das komplexe Zusammenwirken dieser Regulationsmechanismen wird
sichergestellt, dass es nicht zu einer zellulären Überladung mit Cholesterin kommt.
Abbildung 5 zeigt einen Überblick über den Mechanismus der Prozessierung der
SREBP- Vorläufer- Proteine zu aktiven Transkriptionsfaktoren und ihre Funktion bei
der Regulation der intrazellulären Cholesterinbiosynthese.
1. Einleitung 22
Abbildung 5: Mechanismus der INSIG 1 gesteuerten Prozessierung des am Endoplasmatischen
Retikulum lokalisierten SREBP/SCAP- Komplexes zu aktiven SREBP- Transkriptionsfaktoren
und deren Funktion bei der Transaktivierung/Reprimierung zentraler Gene der intrazellulären
Cholesterinbiosynthese unter verschiedenen physiologischen Bedingungen. Neben der
cholesterinabhängigen konvergenten Feedback- Inhibition durch INSIG 1 am ER, wird die
transkriptionelle Aktivität und Stabilität der SREBP- Transkriptionsfaktoren durch
Phosphorilierungs- und Ubiquitinierungsprozesse gesteuert (Eine genaue Erklärung findet sich
im Text unter Punkt 1.4.3).
S1P
S2P
LDL-Rezeptor +HMG-CoA-Reduktase +HMG-CoA-Synthase +SCARB1 +ABCA1+/-PCSK9 +SREBP-1/2
bHLH
Nukleus
ER
Golgi
WDReg SSDbHLHWDReg SSD
SREBP SCAP
bHLH
WDReg SSDbHLH
SRE
bHLH
Regulierte Gene:
INSIG1 1
Hohes intrazelluläres CholesterinNiedriges intrazelluläres Cholesterin
SREBP SCAP
SREBP SCAP
1. Einleitung 23
1.5 Stoffwechsel der Lipoproteine
Grundsätzlich lässt sich der Stoffwechsel der Plasmalipoproteine in drei verschiedene
Systeme unterteilen (Schneider et al. 1996; Schaefer 1998). Man unterscheidet ein
exogenes System, über das der Transport von mit der Nahrung aufgenommenen Lipiden
bewerkstelligt wird (Chylomikronen- Stoffwechselweg) sowie ein zweites, endogenes
System, das der Verstoffwechselung von Lipoproteinen hepatischen Ursprungs dient
(VLDL- LDL- Stoffwechselweg). Das dritte System schließlich umfasst den reversen
Cholesterintransport (HDL- Stoffwechselweg) und dient dem Rücktransport von
Cholesterin aus den peripheren Zellen zurück zur Leber. Über die Leber kann dieses
Cholesterin dann endgültig über Gallensäuren und hepatisches Cholesterin
ausgeschieden werden. Nachfolgend sollen diese drei Systeme im Detail beschrieben
werden.
1.5.1 Der exogene Lipidstoffwechselweg (Chylomikronen- Stoffwechselweg)
Die mit der Nahrung aufgenommenen Triglyceride werden zunächst durch die
Pankreaslipasen in Fettsäuren und Mono- bzw. Diglyceride aufgespalten. Die
Resorption dieser Lipide in Form gemischter Mizellen (bestehend aus: Gallensäuren,
Phospholipiden, Cholesterin, Diglyceriden und Fettsäuren) erfolgt durch die
Enterozyten des Dünndarms über einen passiven Transportmechanismus. Die
Resorption des mit der Nahrung aufgenommenen Cholesterins (Chol) in die
Enterozyten erfolgt ebenfalls in Form von Mizellen. Hierbei wird das mizelläre
Cholesterin jedoch durch einen aktiven Transport über das NPC1L1- Protein in die
Zellen aufgenommen. Dieser Aufnahmeweg von Cholesterin in die Darmzellen wurde
erst kürzlich entdeckt (Altmann et al. 2004; Davis, Jr. et al. 2004). Interessanterweise
besitzt das NPC1L1- Protein wie die HMG- CoA- Reduktase und das SCAP- Protein
eine Sterol Sensing Domäne (SSD), was auf eine Regulation der Aktivität von NPC1L1
durch Sterole schließen lässt (Loewen und Levine 2002). Nach Aufnahme der Lipide in
die Darmzellen erfolgt eine intrazelluläre Resynthese der Triglyzeride und eine
Veresterung des Cholesterins durch die ACAT. Überschüssiges Cholesterin und über
die Nahrung aufgenommene und resorbierte pflanzliche Sterole in den Enterozyten
werden über die ATP- bindenden Kassettentransporter ABCA5 und ABCA8 wieder
zurück in das Darmlumen befördert und dann endgültig ausgeschieden (Lee et al. 2001;
Graf et al. 2003). Das Assembling der Chylomikronen aus: Triglyzeriden (TG),
1. Einleitung 24
Cholesterinstern (CE), Phospholipiden (PL) sowie den Proteinkomponenten ApoA-I,
ApoB- 48 und ApoA-IV erfolgt anschließend unter Mitwirkung von Mikrosomalem
Transferprotein (MTP) in den Enterozyten des Darms. Die reifen Chylomikronen
werden daraufhin an die Lymphe abgegeben und gelangen über den Ductus thoracicus
in den Blutkreislauf. Nach ihrer Sekretion nehmen die Chylomikronen zusätzlich die
Apolipoproteine C II und E aus HDL- Partikeln auf und binden anschließend an die
über Proteoglykane an Endothelzellen gebundene Lipoproteinlipase (LPL), in deren
unmittelbarer Nachbarschaft sich der VLDL- Rezeptor (VLDLR) befindet (Oka et al.
1994). Die Hydrolyse der Triglyzeride aus den Chylomikronen in freie Fettsäuren und
MAG erfolgt nach Bindung an den extrazellulären Komplex aus Lipoproteinlipase und
VLDL- Rezeptor (Beisiegel und Heeren 1997; Tacken et al. 2001). Hierbei interagiert
Apo C II als Kofaktor mit der LPL, während ApoE die spezifische Bindung an den
VLDL- Rezeptor vermittelt. Obwohl der VLDLR als Mitglied der LDL-
Rezeptorfamilie ein NPxY-Motif aufweist und somit ein internalisierender Rezeptor ist,
nimmt man heute an, dass bei der Triglyzeridhydrolyse aus den Chylomikronen keine
Internalisierung stattfindet, sondern vielmehr ein zellulärer Flux von freien Fettsäuren
und MAG´s stattfindet, über den diese dann an das Fettgewebe und die Muskulatur,
wegen der Acidität der Fettsäuren durch membrangebundene Fatty Acid Binding
Proteins (FABP 1+2), translokalisiert werden (Glatz und Storch 2001; Tacken et al.
2001; Goudriaan et al. 2004). Im Verlauf des lipolytischen Prozesses verlieren die
Chylomikronen ca. 80-90 % ihres Triglyzeridanteils und nehmen vermehrt ApoE aus
HDL- Partikeln auf, während die Phospholipide und die Apolipoproteine ApoA-I und
A-IV in den HDL- Pool gelangen. Als Endprodukt dieses Stoffwechselweges finden
sich Chylomikronen- Remnants, die letztendlich über rezeptorvermittelte Endozytose
via ApoE- Bindung an den LDLR und das LDL- related Protein (LRP) in die Leber
aufgenommen werden. Die Abbildung 6 gibt einen Überblick über den Chylomikronen-
Stoffwechselweg.
1. Einleitung 25
Abbildung 6: Grafische Darstellung des exogenen Lipidtransportsystems (Stoffwechselweg der
Chylomikronen). Abkürzungen: CE = Cholesterinester, TG = Triglyzeride, PL = Phospholipide,
FABP = Fatty Acid Binding Protein FS = Freie Fettsäuren, LPL = Lipoproteinlipase, ACAT =
Acyl- Coa- Cholesterin- Acyltransferase, VLDLR= Very Low Density Lipoprotein Rezeptor,
MTP = Mikrosomales Transfer Protein, LRP = LDL Related Protein, NPC1L1 = Nieman Pick
disease like protein 1, ABCA= ATP- bindender Kassettentransporter 5 bzw. 8, Apo =
Apolipoprotein.
NPC1L1Chol
Chol ACAT
TG
PL
PL ApoB-48
Apo-A IV
Apo-C IIApoE
TG
FS FSFS Endothelzelle
Energiestoffw./MuskelzellenFettspeicherung/Fettzellen
FS
PL
ApoB-48
ApoE
LeberLDL-Rezeptor +LRP
Chylomikron
Chylomikron
Chylomikron-Remnant
TGPL
Chol
Chol
Ausscheidung
Gallensäuren (GS)
TG
PLCE
ABCA5ABCA 8
GS
GS
MTP
Lipide aus NahrungEnterozyt
DarmChylomikron
FABP
ApoB-48
Apo-A IV
Apo-C II
TG PLCE
ApoB-48
Apo-A IV
Apo-C II
TG PLCE
CE
CE VLDLR LPL
Gallensäuren+Pankreaslipase
1. Einleitung 26
1.5.2 Der endogene Lipidstoffwechselweg (VLDL- LDL- Stoffwechselweg)
Der endogene Stoffwechselweg dient der Versorgung der peripheren Gewebe mit
Triglyzeriden und Cholesterin und beginnt mit dem Zusammenbau (Assembling)
triglyzeridreicher VLDL in der Leber. Hierbei wird ApoB, welches mit der Membran
des ER assoziert ist, in einem schrittweisen Prozess mit Lipiden (vornehmlich
Triglyzeriden) komplexiert. Dieser Triglyzeridtransfer wird unter Mitwirkung von
Mikrosomalem Transferprotein (MTP) (Davis et al. 1989; Davis und Hui 2001) und
wahrscheinlich auch Apo A5 katalysiert (Pennacchio et al. 2001; van der Vliet et al.
2001; Pennacchio und Rubin 2003). Die so entstandenen VLDL- Präkursormoleküle
werden daraufhin durch Glykosylierung und Einlagerung von Phospholipiden am
Golgi- Apparat in ihre reife Form umgewandelt und als sekretorische Vesikeln
abgegeben (Millar und Packard 1998). Zusätzlich zu je einem Molekül ApoB- 100
enthalten die reifen VLDL auch einen geringen Anteil der Apoliproteine E, C und Apo -
A5. Im weiteren Verlauf nehmen die VLDL zusätzlich die Apolipoproteine C-I, C-II, C-
III sowie ApoE aus dem HDL-Pool auf. Während die Apolipoproteine Apo C-II und
ApoE als Kofaktoren bei der LPL vermittelten Hydrolyse der Triglyzeride aus den
VLDL fungieren (siehe Punkt 1.8.1 dieser Arbeit), verhindern Apo C-I und Apo C-III
eine vorzeitige Entfernung der VLDL aus der Zirkulation. Durch die weitere
schrittweise Triglyzerid- Hydrolyse in den VLDL dissoziieren die Apo C- haltigen
Apoproteine von den VLDL ab und gelangen wieder in den HDL- Pool. Es entstehen
ApoB- 100 und ApoE enthaltende VLDL- Remnants, die reich an Cholesterinestern
sind. Diese VLDL- Remnants können daraufhin über zwei Stoffwechselwege
katabolisiert werden. Zum einen können sie direkt über eine ApoE- Bindung an den
LDLR und das LRP über den LDL- Rezeptorstoffwechselweg in die Leber
aufgenommen werden (Kowal et al. 1989; Willnow et al. 1992) oder zum anderen über
die Zwischenstufe IDL (auch ß- VLDL genannt) in LDL umgewandelt werden
(Schneider et al. 1996; Schaefer 1998). Bei dieser Konversion verlieren die VLDL-
Remnants ihren ApoE- Anteil und nehmen unter Mitwirkung von CETP und PLTP
Cholesterinester aus den HDL auf. Im Gegenzug werden noch in den Partikeln
vorhandene Triglyzeride unter Mitwirkung der hepatischen Triglyzeridlipase (HTGL)
hydrolisiert. Neuerdings gibt es Hinweise darauf, dass Apo A5 bei diesem Vorgang eine
Rolle spielt (Schaap et al. 2004). In der aus diesem Lipidtransfer resultierenden LDL-
1. Einleitung 27
Fraktion ist ApoB- 100 die alleinige Proteinkomponente und fungiert als Ligand des
LDL- Rezeptors. Etwa zwei Drittel der entstandenen LDL werden LDL-
rezeptorvermittelt in die Leber sowie in periphere Gewebe aufgenommen, der Rest wird
unspezifisch über Scavenger- Rezeptoren aufgenommen bzw. via CETP- vermitteltem
Transfer von HDL- Cholesterin auf LDL über den LDLR- Pathway aus der Zirkulation
entfernt. In den Zellen kann das Cholesterin dann als Membranbaustein und zur
Synthese von Steroidhormonen verwendet oder in Form von Cholesterinestern
gespeichert werden (siehe auch Punkte 1.2.6.2 und 1.2.6.3 dieser Arbeit). Innerhalb der
LDL existieren verschiedene Subklassen (LDL 1-6) , die sich hinsichtlich Größe, Dichte
und ihrer Bindungsaffinität an den LDL- Rezeptor unterscheiden. Die kleinen und
dichten LDL- Moleküle, die sog. small dense LDL, haben eine geringere Affinität zum
LDL- Rezeptor und werden schlechter aus der Zirkulation entfernt (Marz et al. 1993;
Superko 2000). Als Folge ihrer verlängerten Plasmaverweildauer können sie leichter
oxidiert werden und vermehrt über die Makrophagen- Scavenger Rezeptoren
aufgenommen werden, was ihnen ein sehr hohes atherogenes Potenzial verleiht (siehe
auch Abschnitt 1.1.4. Die Pathogenese und Manifestation der Atherosklerose) (Linton
und Fazio 2001). Die Abbildung 7 zeigt einen Überblick des endogenen
Stoffwechselweges (VLDL- LDL- Stoffwechselweg).
1. Einleitung 28
Abbildung 7: Grafische Darstellung des endogenen Lipidstoffwechselsystems (VLDL- LDL-
Stoffwechselweg) zur Versorgung der peripheren Zellen mit Cholesterin. Abkürzungen: CE =
Cholesterinester, TG = Triglyzeride, PL = Phospholipide, FS = Freie Fettsäuren, FABP = Fatty
Acid Binding Protein, VLDL = Very Low Density Lipoprotein, IDL = Intermediate Density
Lipoprotein, LDL = Low Density Lipoprotein, LPL = Lipoproteinlipase, VLDLR = Very Low
Density Lipoprotein Rezeptor, LRP = LDL Related Protein, MTP = Mikrosomales Transfer
Protein, Apo = Apolipoprotein.
Leber
LDL-Rezeptor +LRP
PL
ApoB-100
ApoE
MTPApoB-100ApoA5
ApoE
TGCE
PL
VLDL-Assembling
PLApo-C II
ApoB-100
ApoE
TG TGCEPL
VLDL
TG
Sekretion
TG PL
CE
ApoB-100
Apo-C II
LPLVLDLRApoE
FS FSFS Endothelzelle
EnergiestoffwechselFettspeicherung
MuskelzellenFettzellen
FS
VLDL
CECE
TG
PLApo-C II
ApoB-100
ApoE
TGCEPL
CE
IDL
PLApoB-100TG
PLCE
CE
CE
Zellversorgung
ApoB-100
TG PLCECE
CE
LDL-Clearance
LDL
IDL-Clearance
LDL-Rezeptor
ApoA5
ApoA5
FABP
CECECE
CE
LDL-Rezeptor
ApoB-100
PLTG
Periphere Zelle
PLCE
CECE
TG
PLCE
CECE
TG
TG
1. Einleitung 29
1.5.3 Der reverse Cholesterintransport (HDL- Stoffwechselweg)
Der Rücktransport von überschüssigem Cholesterin aus den peripheren Geweben
zurück zur Leber, wo der weitere Abbau entweder direkt oder nach Umwandlung zu
Gallensäuren erfolgt, wird als „reverse cholesterol transport“ bezeichnet und durch die
Lipoproteine hoher Dichte (HDL) bewerkstelligt (von Eckardstein et al. 2001; Rigotti et
al. 2003; Fredenrich und Bayer 2003). Bei den HDL handelt es sich um eine heterogene
Klasse von Lipoproteinen im Dichtebereich von 1,063-1,21 g/ml, von denen die meisten
als Hauptproteinkomponente das Apolipoprotein A-I besitzen. Die einzelnen HDL-
Subfraktionen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Komposition an Lipiden,
Apolipoproteinen, Enzymen und Lipidtransferproteinen voneinander und können
generell in zwei Klassen unterteilt werden. Man unterscheidet zwischen lipidarmen
naszenten ApoAI- haltigen HDL (ß- - HDL), die aus den
ß- HDL entstehen. Bei den ß- HDL handelt es sich um diskoidale Partikel, die über drei
unterschiedliche Wege gebildet werden können. Zum einen können sie als Vorläufer der
HDL im Darm und in der Leber gebildet werden und zum anderen beim Prozess der
Lipolyse triglyzeridreicher Lipoproteine (Chylomikronen und VLDL) entstehen (siehe
auch Punkte 1.3.1 und 1.3.2). Ein dritter Weg schließlich besteht in der Interkonversion
von HDL2 zu HDL3 - HDL unter Mitwirkung von PLTP und
CETP. Der Efflux von unverestertem Cholesterin aus der Zellmembran peripherer
Zellen kann über passive Diffusionsmechanismen wie z.B. durch Bindung an Albumin,
Phospholipid- Vesikeln oder Cyclodextrine erfolgen (von Eckardstein et al. 2001),
jedoch ist diese Abgabe ein sehr langsamer ineffizienter Prozess und umfasst nicht das
veresterte Cholesterin im Zytosol der Zellen. Erst über die Bindung lipidarmer ß- HDL-
Partikel wird ein effektiver Efflux von zytosolischem Cholesterin und auch
Phospholipiden aus den Zellen vermittelt. Die treibende Kraft in diesem Prozess ist der
in der Zellmembran lokalisierte ATP- bindende Kassettentransporter 1 (ABCA1) (Rust
et al. 1999; Schmitz et al. 2001). Mittels dieses Transporters können die im Zytosol
lokalisierten Cholesterinester freigesetzt werden und auf ß- HDL- Partikel übertragen
werden (von Eckardstein et al. 2001). ABCA1 wird in vielen Zellen (z.B. Hepatozyten
und Enterozyten) expremiert und spielt wahrscheinlich eine entscheidende Rolle in der
hepatischen und intestinalen Entstehung von HDL. Die Expression von ABCA1 wird
durch die Transkriptionsfaktoren Leber- X- Rezeptor und Retionoid- X- Rezeptor
1. Einleitung 30
(LXR/RXR) reguliert, deren Liganden Oxysteroide bzw. Retinoide sind. Neben
LXR/RXR kontrolliert auch SREBP-2 sowohl positv als auch negativ die Expression
von ABCA1 in einem ligandenabhängigen Prozess. Bei niedrigen intrazellulären
Spiegeln an LXR/RXR- Liganden reprimiert SREBP-2 durch Bindung an das E-Box-
Element im ABCA- Promotor die Transkription von ABCA1. Sind die intrazellulären
Spiegel an LXR/RXR-Liganden hoch, so wird durch Dissoziation/Degradation von
SREBP-2 vom E-Box- Element die reprimierende Wirkung aufgehoben und die
Expression von ABCA1 aktiviert (Zeng et al. 2004; Wong et al. 2006). Die genauen
zellulären Mechanismen der SREBP-2- vermittelten Regulation von ABCA1 sind bisher
noch nicht vollständig aufgeklärt. Bei der Tangier- Krankheit kommt es durch Defekte
von ABCA1 zu einem verminderten Lipidefflux auf ApoA-I, was zur Abwesenheit
lipidreicher HDL im Plasma führt (Rust et al. 1999; Schmitz et al. 2001). Neben
ABCA1 und SCARB1 (siehe Punkt 1.3.2) als zentrale Modulatoren des reversen
Cholesterin Transports, wird vermutet, dass es einen weiteren bisher nicht
identifizierten zellulären Rezeptor für die Bindung von Apo AI gibt, der bei der
Freisetzung von Cholesterinestern aus den zellulären Kompartimenten und beim
Cholesterinefflux mitwirkt. Nach dem ABCA1- vermittelten Transfer von freiem
Cholesterin auf die ß- HDL wird dieses durch das Enzym LCAT verestert und in den
hydrophoben Kern der HDL- Partikel eingebaut, woraus aus diesem - HDL
in Form von HDL2- Partikeln entstehen. Der weitere Transport der HDL2-
Cholesterinester kann anschließend über zwei Wege erfolgen. Zum einen können die
HDL2- Partikel unter Mitwirkung von Cholesterinester- Transferprotein (CETP) und
Phospholipid- Transferprotein (PLTP) die Cholesterinester im Austausch gegen
Triglyzeride an ApoB- haltige Lipoproteine abgeben (VLDL, IDL), diese werden dann
entweder über den LDL- Rezeptor aus der Zirkulation entfernt oder zu LDL konvertiert,
über das die Zellen dann wiederum Cholesterin aufnehmen können. Die Triglyzeride
der HDL2- Partikel werden anschließend durch die HTGL hydrolisiert, während die
Phospholipide der HDL mit großer Wahrscheinlichkeit durch eine weitere Lipase, der
endothelialen Lipase (EL) hydrolisiert werden. Aus diesem Prozess entstehen dann
wieder kleine, dichte HDL3- Partikel (Interkonversion von HDL2 in HDL3), die dann für
eine erneute Cholesterinaufnahme aus peripheren Zellen zur Verfügung stehen. Der
zweite Weg, den die HDL2- Partikel gehen können, besteht in der direkten Aufnahme
1. Einleitung 31
über den Scavenger Rezeptor B- I (SCARB1) in die Leber, wo letztlich dann die
Ausscheidung des Cholesterins über die Galle erfolgt. In der nachfolgenden Abbildung
8 ist der HDL- vermittelte reverse Cholesterintransport schematisch dargestellt.
Abbildung 8: Reverser Cholesterintransport und Stoffwechselweg der HDL. Eine detaillierte
Beschreibung des Stoffwechsels der HDL findet sich im Text (siehe Punkt 1.3.3). Abkürzungen:
CE = Cholesterinester, TG = Triglyzeride, PL = Phospholipide, LPL = Lipoproteinlipase,
HTGL = Hepatische Triglyzerid Lipase, CETP = Cholesterinestertransferprotein, PLTP =
Phospholipid Transfer Protein, LCAT = Lezithin- Cholesterin- Acetyltransferase, SCARB1 =
Scavenger Rezeptor B- I, ABCA 1 = ATP- bindender Kassettentransporter 1, Apo =
Apolipoprotein.
ApoE
ApoC
ApoB100LPL
ApoE
ApoC
ApoB100
IDL LDL
LeberSCARB1
CECECE
CE
Periphere Zelle
HDL-Rezeptor
ABCA1
Preß-HDL
A-I
CE
CE
CETPPLTP
ApoC+ECETGPL
LCATT
A-I
A-ICE
CE
ApoE
VLDL
LDL-Rezeptor
LDL-Rezeptor
HDL 3
HDL 2
CE
ApoB100CE
CE 1.1.1.1.1.1.1.1.1 CE
CE
TG
TG
TG
HTGL
1. Einleitung 32
1.6 Störungen des Lipidstoffwechsels
1.6.1 Einteilung der Lipidstoffwechselstörungen
Wie bereits in Abschnitt 1.1 dieser Arbeit erwähnt, sind Fettstoffwechselstörungen eine
wesentliche Ursache für die Entstehung von atherosklerotischen kardiovaskulären
Erkrankungen und ihrer Komplikationen. Es handelt sich um eine sehr heterogene
Gruppe von Stoffwechselstörungen, die sich generell in primäre und sekundäre
Hyperlipidämien einteilen lassen. Bei sekündären Hyperlipidämien sind
Grunderkrankungen des endokrinologischen, nephrologischen oder hepatischen
Systems wie z.B. Hypothyreose, Niereninsuffiziens und Hepatitis die Ursache für
Dyslipidämien. In den häufigsten Fällen findet man bei Patienten mit
Fettstoffwechselstörungen jedoch eine primäre Hyperlipidämie, welche nach der
klassischen Einteilung nach Fredrickson in fünf phänotypische Formen unterteilt wird.
Die von Fredrickson vorgeschlagene Einteilung basiert auf der Erhöhung von
Chylomikronen, VLDL und LDL oder der Kombinationen dieser Laborparameter und
beschreibt die verschiedenen Formen der Hyperlipoproteinämie. Sie berücksichtigt aber
nicht die heutigen molekulargenetischen Erkenntnisse und deren Einfluss auf die
metabolischen Vorgänge, weswegen man die primären Hyperlipidämien heutzutage
eher genetisch/metabolisch klassifiziert. Dabei werden die Hyperlipidämien nach ihrer
Prävalenz und hinsichtlich ihres Risikopotenzials für koronare Ereignisse eingeteilt. In
den Tabellen 6-8 sind die Klassifizierung der primären Hyperlipidämien nach
Fredrickson (Fredrickson 1993) sowie die genetisch/metabolische Einteilung der
primären Hyperlipidämien und deren Ursachen aufgelistet.
1. Einleitung 33
Tabelle 6: Klassifizierung der primären Hyperlipidämien nach Fredrickson
(Fredrickson 1993).
Phänotyp Chylom. VLDL IDL LDL Chol TG Plasma
I ++ ↓ ↑ ↑↑ Aufrahmend;
Unterstand klar
IIa normal ↑↑ ↑↑ normal Klar
IIb ↑↑ normal
oder ↑
↑↑ ↑↑ ↑↑ Trüb
III + ↑ ↑↑ ↓ ↑↑ ↑↑ trüb
IV ↑↑ normal
oder ↓
↑ ↑↑ trüb
V ++ ↑↑ ↓ ↑(↑) ↑↑ Aufrahmend;
Unterstand trüb
Tabelle 7: Genetisch/metabolische Einteilung der primären Hyperlipidämien.
Primäre Hyperlipidämie Phänotyp Koronares Risiko Pankreatitis Risiko
Gewöhnliche
Hypercholesterinämie
IIa ++++ - -
Familiäre kombinierte
Hyperlipidämie
IIa, IIb, IV ++ -
Familiäre Hypercholesterinämie IIa, IIb ++++ --
Remnant Hyperlipidämie III +++ ?
Familiäre Hypertriglyzeridämie IV, V ? ++
Chylomikronämie I, V - +++
1. Einleitung 34
Tabelle 8: Genetische und metabolische Ursachen der primären Hyperlipidämien.
Primäre Hyperlipidämie Ursache Metabolische Erscheinungsform
Gewöhnliche
Hypercholesterinämie
multiple genetische und
Umwelteinflüsse.
LDL-Überproduktion und
verminderter LDL- Katabolismus.
Familiäre kombinierte
Hypercholesterinämie
unbekannt Überproduktion von ApoB- 100,
VLDL und/oder LDL.
Familiäre
Hypercholesterinämie
Mutationen, die zu einer
beeinträchtigten Rezeptor-
Funktion führen.
Gestörter LDL- Abbau und LDL-
Überproduktion.
Remnant Hyperlipidämie Nicht funktionelle Apo E- und
ApoA-V Isoformen
(E2/S19W). Genetische
erworbene Störung des
VLDL/LDL Metabolismus.
Gestörte Konversion von VLDL zu
LDL, Überproduktion von IDL.
Familiäre
Hypertriglyzeridämie
unbekannt VLDL- Überproduktion und/oder
verminderter VLDL-Katabolismus.
Chylomikronämie- Syndrom Lipoprotein Lipase- oder Apo
C-II-Deffizienz.
Beeinträchtigter Chylomikronen-
Abbau.
1.6.2 Diagnostik von Lipidstoffwechselstörungen und Risikobeurteilung
Die laborchemische Diagnostik von Lipidstoffwechselstörungen wird normalerweise in
drei Stufen durchgeführt (Schaefer et al. 2000). Als Basisuntersuchung werden hierbei
das Gesamtcholesterin, das HDL- Cholesterin und die Triglyzeride bestimmt. Des
weiteren sollte das Lipoprotein(a) (Lp(a)) bestimmt werden, welches sich aus LDL mit
einem apo(a) Anteil zusammensetzt. Apo(a) besitzt eine große strukturelle Homologie
zu Plasminogen. Lp(a) lässt sich zwar therapeutisch kaum beeinflussen, ist aber für die
Risikobeurteilung und die Notwendigkeit einer medikamentösen Lipidtherapie von
Bedeutung. Durch die Friedewald- Formel lässt sich dann das LDL- Cholesterin
berechnen (wenn die Triglyzeride einen Wert von 350 mg/dl nicht überschreiten): LDL-
Cholesterin = Gesamt- Chol. – HDL- Chol. – Triglyzeride / 5 (Friedewald et al. 1972).
Finden sich bei diesen Untersuchungen Auffälligkeiten, so erfolgt bei Bedarf in einem
zweiten Schritt dann die erweiterte Speziallipid- Diagnostik, welche die Bestimmungen
der Apolipoproteine, Enzyme und Rezeptoren des Lipidstoffwechsels umfasst
(Schneider et al. 1996; Schaefer 1998; Soufi et al. 1999). Bei schweren
1. Einleitung 35
Lipidstoffwechselstörungen wird als dritte Stufe der Untersuchungen dann eine
ausführliche Familienuntersuchung durchgeführt, um gefährdete Personen frühzeitig zu
identifizieren und optimal therapieren zu können. Ein eindeutiger Risikoschwellenwert
für Cholesterin (Chol.) oder für Triglyzeride lässt sich aufgrund der großen Streubreite
der Normalwerte in der Normalpopulation nicht eindeutig festlegen, so dass die
alleinige Betrachtung des Gesamtcholesterinwertes für die Risikoeinschätzung nicht
ausreichend ist. Vielmehr müssen wegen der unterschiedlichen Atherogenität der
einzelnen Lipoproteinklassen diese alle mit in die Beurteilung des kardiovaskulären
Risikos mit einbezogen werden. Hypercholesterinämien, die aus erhöhten HDL-
Cholesterinspiegeln resultieren (Hyperalphalipoproteinämien), stellen z.B. kein
erhöhtes Risiko für koronare Herzkrankheit dar, da HDL als Schutzfaktor vasoprotektiv
wirkt. Generell sollte das LDL- Cholesterin nach NCETP- Empfehlungen (National
Cholesterol Education Program“ der USA, „Adult Treatment Panel III“ (ATP III)) bei
Personen ohne weitere zusätzliche Riskofaktoren einen Wert von 160 mg/dl und
150mg/dl für Triglyzeride nicht überschreiten (Brewer, Jr. 2002). Bei Patienten mit
einem zusätzlichen Risikofaktor wie: z.B. hohes Lp(a), Rauchen, Hypertonus, HDL-
Cholesterinwerte < 40 mg/dl, Diabetes oder familiäre Prädisposition für KHK sollten
die LDL- Cholesterinwerte bei < 130 mg/dl liegen. Bei Personen, die bereits ein
kardiovaskuläres Ereignis hatten und auch schon bei Diabetikern ohne KHK, liegt der
Zielwert für das LDL- Cholesterin neuerdings bei 100 mg/dl. Bei Patienten mit KHK
und Diabetes Mellitus gilt der Zielwert LDL- Cholesterin < 70 mg/dl. Diese Werte
entstammen internationalen Empfehlungen aus dem „National Cholesterol Education
Program“ der USA, „Adult Treatment Panel III“ (ATP III) (Brewer, Jr. 2002) und der
International Task Force For Prevention Of Coronary Heart Disease (Grundy et al.
1997). Hier konnte durch langjährige Beobachtungen gezeigt werden, dass das 10-
Jahres Risiko für eine nochmalige oder erste Manifestation der KHK in der höchsten
Risikogruppe bei > 20% lag. Für die mittlere Risikogruppe (ein zusätzlicher
Risikofaktor) betrug das Risiko 10-20% und für die untere Gruppe (kein Risikofaktor)
lag das 10- Jahres- Risiko bei < 10%.
1. Einleitung 36
1.7 Monogenetische autosomal dominant vererbte Lipidstoffwechselstörungen
1.7.1 Die Familiäre Hypercholesterinämie (FH)
Bei der familiären Hypercholesterinämie (FH) ist das LDL- Cholesterin um das 2-
6fache des Normalwertes erhöht. Als Folge dieser Erhöhung kommt es zur Ablagerung
dieses Cholesterins in Sehnen, Haut und um die Augen (Sehnenxanthome, Xanthome,
Arcus lipoides und Xanthelasmen). Neben diesen eher ästhetischen Störungen, kommt
es aber auch zu Lipidablagerungen in den Arterien, insbesondere in den
Koronararterien, was zur Ausbildung einer frühzeitigen Atherosklerose führt. FH wird
autosomal dominant vererbt und ist mit einer Heterozygotenfrequenz von ca. 1:250-
1:500 und einer Homozygotenfrequenz von ca. 1:1000000 eine der häufigsten
monogenetisch vererbten Stoffwechselerkrankungen (Goldstein und Brown 1989;
Austin et al. 2004). Bei heterozygot betroffenen Patienten findet man im 3.-4.
Lebensjahrzehnt Xanthelasmen und Sehnenxanthome u. U. eines Arcus lipoides cornea
(Einlagerung von Cholesterin in die Hornhaut des Auges), sowie eine koronare
Herzkrankheit. Frauen sind durch den protektiven Effekt des Östrogens später betroffen.
Bei heterozygoter FH liegen die Cholesterinwerte zwischen 300-600 mg/dl. Das HDL-
Cholesterin ist häufig erniedrigt und die Triglyzeride normal. Bei homozygoten
Patienten manifestieren sich schwere Xanthome, Aortenklappenstenosen und eine rasch
voranschreitende Atherosklerose aller Gefäße, insbesondere der Koronarien und
Caratoiden aufgrund des „gene dosage effect“ schon vor dem 10. Lebensjahr. Die
Cholesterinspiegel von Betroffenen liegen bei 600 bis maximal 1200 mg/dl. Die
Lebenserwartung unbehandelter homozygoter Patienten liegt unter 20 Jahren, wobei
Todesfälle bereits im 7. Lebensjahr beschrieben wurden. Die Abbildung 9 zeigt die
charakteristischen phänotypischen Merkmale der FH bei Patienten mit homozygoter
familiärer Hypercholesterinämie (FH).
1. Einleitung 37
Abbildung 9: Phänotypische Merkmale der homozygoten Familiären Hypercholesterinämie
(FH). Die Bilder zeigen Sehnenxanthome an den Strecksehnen von Ellenbogen/Knien, einen
Arcus lipoides cornea (Einlagerung von Cholesterin in die Hornhaut des Auges), sowie
Xanthelasmen mit gelblich tuberösen und eruptiven Ablagerungen von Cholesterin in der Haut.
1.7.2 Der LDL- Rezeptor Pathway und die Pathogenese der FH
Unsere heutigen Erkenntnisse über die biochemischen und molekulargenetischen
Ursachen von FH entstammen der detaillierten Erforschung des LDLR- pathways durch
die beiden amerikanischen Biochemiker Michael S. Brown und Joseph L. Goldstein, sie
entdeckten 1974 den LDL- Rezeptor auf der Zelloberfläche von humanen Fibroblasten
und konnten nachweisen, dass Defekte dieses Rezeptors die Ursache für FH darstellen.
(Brown und Goldstein 1974; Brown und Goldstein 1986). Für ihre herausragenden
Arbeiten erhielten sie 1985 den Nobelpreis für Medizin (Brown und Goldstein 1985;
Brown und Goldstein 1996). Wie bereits unter Punkt 1.2.5.3 dieser Arbeit erwähnt, wird
die Transkription des LDLR- Gens durch einen Feedback- Mechanismus gesteuert, der
den Cholesteringehalt der Zelle konstant hält. Ist in der Umgebung LDL verfügbar, so
nehmen Zellen Cholesterin über den LDLR auf und unterdrücken die endogene
zelluläre Cholesterinbiosynthese. Das über den LDLR aufgenommene Cholesterin
1. Einleitung 38
hemmt dann die Transkription des LDLR und der HMG- CoA- Reduktase, wodurch die
Zelle vor einer Überladung mit Cholesterin geschützt wird. Goldstein und Brown
konnten zeigen, dass es bei FH durch Defekte im LDL- Rezeptor zu einer
Unterbrechung oder Behinderung des „LDL receptor pathways“ an verschiedenen
Stellen kommt (Goldstein und Brown 1979; Hobbs et al. 1990; Hobbs et al. 1992).
Aufgrund der abnormen Eigenschaften der mutierten Rezeptoren unterteilten sie die
Defekte in fünf Klassen:
Klasse 1 Mutationen (Null Allele): In den Zellen lässt sich kein LDLR- Protein
nachweisen. Diese Mutationen umfassen größere Gendeletionen und Punktmutationen
des LDLR- Promotors, so dass keine Transkription mehr stattfinden kann (Hobbs et al.
1988). In anderen Fällen entstehen mRNA´s mit abnormer Länge, welche entweder
selbst rapide abgebaut werden, oder deren Genprodukte aufgrund vorzeitiger Stopp-
Codons sofort intrazellulär degradiert werden.
Klasse 2 Mutationen (Transportdefekte Allele): Bei diesen Mutationen ist die LDL-
Rezeptor- Synthese normal, aber die Rezeptoren erreichen die Zellmembran nicht, da
ihr Transport vom Endoplasmatischen Retikulum zum Golgi- Apparat komplett
blockiert oder verlangsamt ist. Man unterscheidet Klasse 2A und 2B Transportdefekte.
Klasse 2A Allele produzieren Rezeptoren, die das ER aufgrund inkorrekter Faltung der
120 KDa LDL- Rezeptor- Präkursormoleküle nicht verlassen können, sodass keine
reifen 160 KDa Formen der Rezeptoren entstehen (Tolleshaug et al. 1982; Goldstein
und Brown 1985). Diese LDL- Rezeptoren werden rapide im ER abgebaut. Bei Klasse
2B Defekten gelangt ein Teil der Rezeptoren aus dem ER (sog. „leaky receptors“), der
Transport zum Golgi- Apparat ist jedoch verzögert, was zu einer Rezeptordefizienz an
der Zelloberfläche führt.
Klasse 3 Mutationen (Bindungsdefekte Allele): Die LDL- Rezeptoren erreichen zwar
die Zellmembran, sind aber nicht in der Lage, LDL zu binden. Viele dieser Mutationen
umfassen die Repeats 4 und 5 des LDL- Rezeptors, die eine zentrale Rolle bei der
Bindung der Liganden ApoB- 100 und Apo E spielen (Hobbs et al. 1986).
Klasse 4 Mutationen (Internalisierungsdefekte Allele): Die LDL- Rezeptoren
erreichen die Zelloberfläche, binden LDL, aber können sich nicht in clathrin coated pits
anreichern, sodass keine Endozytose stattfinden kann. Diese Mutationen betreffen die
cytoplasmatische und transmembrane Domäne des LDL- Rezeptors (Goldstein und
1. Einleitung 39
Brown 1989). In einigen seltenen Fällen ist die Konsensus- Aminosäuresequenz des
NPxY- Motif (wobei x = jede beliebige Aminosäure) betroffen (Davis et al. 1986).
Dieses Motif interagiert spezifisch mit dem ARH1- Protein und ermöglicht hierdurch
die Verankerung und Internalisierung des Rezeptor- Liganden- Komplexes in den
coated pits (Soutar et al. 2003) (siehe auch Punkt 1.8.2 dieser Arbeit).
Klasse 5 Mutationen (Recyclingdefekte Allele): Die Rezeptoren binden die LDL und
internalisieren diese auch. Es findet jedoch keine Dissoziation des Rezeptor- Liganden-
Komplexes im sauren Milieu des Endosoms statt, was zur intrazelullären Degradation
der Rezeptoren führt, sodass diese nicht mehr an die Zelloberfläche zurück gelangen
können, um erneut LDL zu binden (Miyake et al. 1989). In Abbildung 10 sind die
unterschiedlichen LDLR- Defekte nach der Klassifikation von Brown, Goldstein und
Hobbs in Form einer Übersichtsgrafik dargestellt.
Abbildung 10: Klassifikation der unterschiedlichen LDL- Rezeptordefekte, die zur familiären
Hypercholesterinämie (FH) führen (Hobbs et al. 1990).
Eine eindeutige Zuordnung der FH zu einer bestimmten Klasse von LDL- Rezeptor-
Defekten ist in den meisten Fällen nicht möglich, da viele Mutationen des LDL-
Rezeptor- Genlokus Rezeptoren produzieren, die mehrere funktionelle Defekte
aufweisen. Ein Beispiel hierfür sind z.B. Klasse 2B Defekte, bei denen der Rezeptor
zwar die Zelloberfläche erreicht, aber trotzdem den Liganden nicht mehr binden kann
Class INo Synthesis
ER GolgiKlasse II-Defekt:Kein Transport
Klasse III-Defekt:Keine Bindung
Coated Pit
Klasse IV-Defekt:Keine Internalisierung
Klasse V-Defekt:Kein Recycling
Klasse I-Defekt:Keine Synthese
mRNA
LDL
LDL
LDL
LDL
LDL
LDL
LDL
LDL
1. Einleitung 40
(Goldstein und Brown 1989; Hobbs et al. 1990). Bisher sind weltweit über 700
Mutationen des LDL- Rezeptorgens bekannt, die FH verursachen. Die meisten FH
Allele tragen Punktmutationen, kleine Insertionen oder Deletionen, während große
Rearrangements im LDL- Rezeptorgen eher seltener sind. Der Nachweis von LDLR-
Mutationen und Polymorphismen auf DNA- Ebene erfolgt mit molekularbiologischen
Verfahren wie „single strand conformational polymorphismus“ (SSCP) und
denaturierender Gradientengel Elektrophorese (DGGE) (Leren et al. 1993; Nissen et al.
1996; Soufi et al. 2002), durch die Mutationen schnell und effizient nachgewiesen
werden können. Eine exzellente Übersicht über die meisten FH- Allele findet sich in
zwei LDL- Rezeptor- Mutationsdatenbanken, die unter http://www.ucl.ac.uk/fh/, und
http://www.umd.necker.fr abrufbar sind und ständig aktualisiert werden. Neben einer
detaillierten Beschreibung der FH- verursachenden Mutationen und ihrer funktionellen
Relevanz, sind dort auch Ergebnisse aus populationsgenetischen Studien aufgeführt.
1.7.3 Auswirkungen von LDLR- Mutationen auf den Lipidstoffwechsel bei FH
Die Zellen von FH- Heterozygoten exprimieren bei gleicher extrazellulärer LDL-
Cholesterin- Konzentration nur halb soviel funktionelle LDL- Rezeptoren wie normale
Zellen. Das normale LDLR- Allel wird bei FH nicht dazu stimuliert, den Defekt des
mutierten Allels durch eine vermehrte Bildung von noch intaktem LDL- Rezeptor zu
kompensieren. Statt dessen wird das intrazelluläre Cholesterin- Defizit durch eine
gesteigerte Synthese von Cholesterin ausgeglichen. Die Folge für den Organismus ist
eine erhöhte Plasma LDL- Konzentration, die bereits dann auftritt, wenn nur ein
mutiertes Allel vorliegt (dominanter Phänotyp) (Goldstein und Brown 1989). Im
normalen Zustand sezerniert die Leber über den endogenen Kreislauf VLDL, welche
Triglyzeride zu Fettgewebe und Muskulatur transportieren. Durch Hydrolyse der
Triglyzeride entstehen aus den VLDL intermediate- density Lipoproteine (IDL), von
denen ein Teil ApoE- vermittelt über LDL- Rezeptoren abgebaut wird. Aus den
verbleibenden IDL entstehen die LDL, von denen etwa 60-80% über LDL- Rezeptoren
in der Leber aus der Zirkulation entfernt werden (Verweildauer ca. 2,5 Tage). Bei
heterozygoter FH akkumulieren LDL einerseits durch verminderte LDL-Endozytose,
und zusätzlich entsteht mehr LDL aus der Vorstufe IDL, da die IDL selbst nur verzögert
abgebaut werden, wodurch es zu einem massiven LDL- Cholesterinanstieg kommt. Die
Ausprägung von FH- Mutationen kann in Bezug auf Klinik, Laborwerte und
1. Einleitung 41
Ansprechen auf eine lipidsenkende Therapie stark variieren (Genotyp/Phänotyp-
Korrelation) (Soutar 1992; Soutar 1998; Austin et al. 2004). Ein Grund für diese
Varianz liegt in der Restaktivität der mutierten LDL- Rezeptoren. Ein Beispiel hierfür
sind spezielle Klasse 3 Bindungsdefekte, bei denen die ApoE- vermittelte clearance von
IDL stark eingeschränkt sein kann, was zu einer vermehrten LDL- Produktion aus den
nicht aufgenommenen IDL führt und zu einem massiverem LDL- Anstieg führt als z.B.
bei einem Klasse 3 Defekt, bei dem noch eine Restbindung von ApoE/B möglich ist.
Homozygote FH- Patienten sind aufgrund des „gene dosage effect“ wesentlich schwerer
betroffen, jedoch korreliert auch hier die Schwere der Hyperlipoproteinämie mit der
Restaktivität des LDL- Rezeptors. In den meisten Fällen tragen Homozygote FH-
Patienten meist zwei verschiedene FH Allele und sind somit „compound Heterozygote“
(Häufigkeit ca. 1:1000000), wohingegen eine Homozygotie für dasselbe FH- Allel
(„true homozygous“) extrem selten ist (etwa 1: 100000000). In homozygoten FH-
Patienten ohne Restaktivität der mutierten LDL-Rezeptoren steigt die
Plasmaverweildauer der LDL, verglichen mit der Norm, von 2,5 auf 6 Tage (Shepherd
und Packard 1989). Bei diesen Patienten wird praktisch das gesamte LDL über den
LDL- Rezeptor unabhängigen Weg durch die Makrophagen Scavenger Rezeptoren (SR-
AI/II) aufgenommen, was zur frühzeitigen Manifestation einer schwersten
Atherosklerose führt, die unbehandelt vor dem 20. Lebensjahr letal verläuft.
1.7.4 Das Familiär defekte Apolipoprotein B- 100 (FDB)
Eine weitere monogenetisch vererbte Lipidstoffwechselstörung, die einem autosomal
dominanten Vererbungsmodus folgt, ist das „Familiär defekte ApoB“ (FDB). Anders
als bei FH ist hier jedoch nicht der Rezeptor betroffen, sondern der Ligand, das Apo B-
100 defekt (Vrablik et al. 2001; Whitfield et al. 2004). Als Folge dieses Defektes
kommt es zu einer reduzierten Bindung von ApoB- 100 an den LDL- Rezeptor und zu
einem Anstieg der Plasma LDL- Konzentration bei FDB- Patienten, der jedoch
moderater ist als FH- Patienten. Die Erstbeschreibung des „Familiär defekten
Apolipoprotein B-100“ (FDB) erfolgte 1986 durch Vega et al. Er fand in einer Gruppe
von hypercholesterinämischen Patienten mit Ausschluss- FH 5 Patienten, bei welchen
die fraktionelle Katabolismusrate (FCR) von körpereigenem LDL im Vergleich zu
injiziertem LDL gesunder Patienten signifikant erniedrigt war (Vega und Grundy 1986).
Innerarity et al. konnten 1987 durch Bindungsstudien an kultivierten Fibroblasten
1. Einleitung 42
zeigen, dass die Bindung von LDL eines dieser Patienten um ca 70% reduziert war und
propagierten den Namen „Familiär defektes ApoB- 100“ für dieses Krankheitsbild
(Innerarity et al. 1987). Die Aufklärung des Defektes auf Genebene erfolgte 1989 durch
Soria et al. (Soria et al. 1989). Sie identifizierten eine G-A Punktmutation in Position
10708 in Exon 26 des Apo B- Gens. Als Folge dieser Mutation kommt es zu einem
CGG nach CAG Basenaustausch in Codon 3500 der ApoB mRNA, der zu einer
Substitution von Glutamin nach Arginin führt, wodurch die Bindungsseite des Apo B-
100 indirekt verändert wird. Genetische Studien zur Prävalenz von FDB in
verschiedenen kaukasischen Populationen ermittelten eine Heterozygotenfrequenz von
1:200-1:250, wobei die höchsten Frequenzen für die Schweiz und Polen sowie für das
Rhein/Main Gebiet in Deutschland beschrieben wurden (1:200-1:250) (Fisher et al.
2000; Horvath und Ganev 2001). Das Auftreten von FDB in homozygoter Form liegt
ähnlich wie bei FH bei ca. 1:1000000 (Goldstein und Brown 2001; Vrablik et al. 2001;
Austin et al. 2004). Da nahezu alle bisher beschriebenen FDB- Mutationsträger
europäischen Ursprungs sind, nimmt man an, dass die meisten R3500Q-
Mutationsträger von einem gemeinsamen Vorfahren abstammen, der vor ca. 7000
Jahren in Europa lebte.
Klinisch findet man bei FDB- Patienten eine moderate bis stark ausgeprägte
Hypercholesterinämie, Xanthome der Haut, einen Arcus corneae und das Auftreten von
frühzeitiger Atherosklerose. Verglichen mit FH sind die Werte für Gesamt- und LDL-
Cholesterin heterozygoter FDB- Patienten geringer und die Streubreite der Messwerte
ist wesentlich größer (Miserez und Keller 1995). Bisher sind vier homozygote FDB-
Patienten beschrieben worden. Bei diesen Patienten waren die Gesamt- und LDL-
Cholesterinwerte verglichen mit der 6- bis 10- fachen Erhöhung bei FH- Homozygoten
nur geringfügig erhöht und lagen im Bereich von heterozygoten FH- Patienten
(Gallagher und Myant 1995). Eine Erklärung hierfür liegt in der noch völlig intakten
LDLR-Aktivität und in der verbliebenen restlichen Bindungsaffinität des mutierten
LDL von 13,4-14,7% der normalen LDL- Affinität, was auch den milderen Phänotyp
gegenüber FH erklärt. Schaefer et al. konnten in einer in vivo Kinetik Studie bei einem
homozygoten FDB- Patienten zeigen, dass die Funktion des defekten ApoB durch Apo
E nahezu vollkommen kompensiert werden kann und die atherogenen
Lipoproteinpartikel durch diesen „rescue mechanism“ über den LDL- Rezeptor aus der
1. Einleitung 43
Zirkulation entfernt werden können (Schaefer et al. 1997). Es konnte des weiteren
gezeigt werden, dass die Produktion und der Katabolismus der vasoprotektiven HDL
bei diesem Patienten gesteigert waren (Schaefer et al. 1999). Diese Befunde wurden in
der Folge von Pietzsch et al. bestätigt (Pietzsch et al. 2000). Differentialdiagnostisch
sind die gleichen Überlegungen wie bei der FH wichtig. Der direkte Nachweis der
FDB- Mutationen erfolgt durch spezifische PCR- Amplifikation der Codon Region
3456-3553 des ApoB- 100- Gens und anschließende DGGE oder RFLP-Analyse. Bisher
wurden weltweit vier FDB verursachende ApoB- 100 Mutationen beschrieben
(R3500Q, R3500W, R3531C und R3480W). Alle verändern die Proteinstruktur von
ApoB in einem Bereich von nur 51 Aminosäuren in der carboxyterminalen modulator
site von ApoB-100. Diese Befunde lassen vermuten, dass es noch weitere bisher
unentdeckte Mutationen in dieser Region von ApoB- 100 gibt die zu FDB führen
können. Ein Teil dieser Arbeit beschäftigt sich daher mit einem großangelegten
genetischen Screening dieser Region von ApoB- 100 in Patienten mit und ohne KHK.
1.7.5 Struktur des Apolipoprotein B- Gens und Funktion von ApoB- 100
Das Gen für ApoB liegt auf Chromosom 2p23 - p24 (Knott et al. 1985). Es ist 45 kb
lang und besteht aus 28 Introns und 29 Exons, wobei das Exon 26 mit 7572 Bp am
größten ist und das bisher größte im menschlichen Genom identifizierte Exon ist. Apo-
B- 100 kommt als Strukturprotein neben anderen Apoproteinen noch in VLDL, IDL und
Lp(a) vor. In der LDL ist ApoB- 100 das einzige Apoprotein und dient als Ligand für
den LDLR. Es setzt sich aus 4536 Aminosäuren zusammen und ist mit 550 KDa eines
der größten Proteine im menschlichen Plasma. Durch elektronenmikroskopische
Untersuchungen und Bindungsstudien mit trunkierten ApoB- Molekülen in Mäusen
identifizierten Boren et al. die Bindungsdomäne für den LDL- Rezeptor (Boren et al.
1998). Diese Bindungsstelle („B- site“) ist in der Umgebung der Aminosäuren 3359 -
3369 lokalisiert und nahezu identisch mit der ApoE- Bindungsstelle zum LDLR. In
ihren Experimenten fanden sie heraus, dass ApoB- 100 eine ringförmige Struktur
aufweist (Chatterton et al. 1995), und dass die ersten 89% des Moleküls den LDL-
Partikel gürtelförmig umrunden, während die 11% am carboxylterminalen Ende
bogenförmig den Gürtel überqueren (Boren et al. 1998). Sie postulierten darauf ein
Modell, bei dem das carboxyterminale Ende des ApoB- 100 als negativer Modulator der
LDL- Rezeptorbindung fungiert und die Bindung der VLDL an den LDL- Rezeptor
1. Einleitung 44
verhindert. Erst durch die Lipolyse der VLDL und Umwandlung zu kleineren LDL-
Partikeln ändert das ApoB- 100 Molekül seine Konformation und erlaubt so eine
Bindung über die „B- site“ an den LDL- Rezeptor. In Aminosäureaustausch-
Experimenten konnten sie des Weiteren zeigen, dass die Überquerung des
carboxyterminalen Gürtels an Position 3500 des ApoB- 100 durch die spezifische
Interaktion von Arginin 3500 mit Tryptophan 4369 hervorgerufen wird und essentiell
für die Bindung an den LDLR ist. Beim Krankheitsbild des FDB ist diese Interaktion
gestört, sodass die „B- site“ partiell vom carboxyterminalen Gürtel überlagert wird, was
zu einer reduzierten Rezeptorbindung und zu einer Akkumulation von LDL im Plasma
führt (Boren et al. 2001).
1.7.6 Bisher bekannte Apo B- Defekte und ihre Auswirkung auf den
Lipidstoffwechsel
Weltweit wurden bisher vier FDB verursachende Mutationen im Exon 26 des ApoB-
100- Gen beschrieben. Alle führen zum Verlust von positiv geladenen Aminosäuren
(Arginin) in der carboxyterminalen modulator site von ApoB- 100, die durch
ungeladene substitutiert werden (Glutamin, Cystein, Tryptophan). Im Folgenden sollen
diese Mutationen bezüglich ihrer Häufigkeit in der Bevölkerung und funktionellen
Konsequenzen näher beschrieben werden.
Die Arginin 3500 Glutamin- Mutation (R3500Q): Die R3500Q ist die erste und
bestbeschriebene FDB- Mutation (Soria et al. 1989). Sie resultiert aus einer Guanin
Adenin Basensubstitution im Nukleotid 10708 im Codon 3500 des ApoB- Gens, der
einen Aminosäurenaustausch Arginin (CGG)
kann Glutamin 3500 nicht mehr mit Tryptophan 4369 interagieren, und es kommt zu
einer Maskierung der für die LDL- Rezeptorbindung wesentlichen „B- site“ des Apo B-
100 (Boren et al. 2001). Das Verhältnis von defekten zu normalen LDL- Partikeln im
Plasma heterozygoter Patienten beträgt 70/30, wodurch es zu einer stark reduzierten (-
40-80%) LDL- Bindung an den LDLR kommt .
Große genetische Untersuchungen ermittelten eine Prävalenz von 0,08% für die
R3500Q- Mutation in der Normalpopulation. Bei Trägern der Mutation lagen die
Gesamt- und LDL- Cholesterinwerte im Vergleich zur Normalbevölkerung
durchschnittlich um 100 bzw. 82 mg/dl höher. Das Risiko an einer KHK zu erkranken
war sieben mal größer als in der Normalbevölkerung, auch das Risiko an pAVK und
1. Einleitung 45
Hypertonie zu erkranken, war erhöht (Tybjaerg-Hansen et al. 1998). Eine mögliche
Erklärung für das im Verhältnis zur moderaten Cholesterinerhöhung deutlich gesteigerte
KHK- Risiko ist die vermehrte Anzahl modifizierter LDL- Partikel und die verlängerte
„residence time“ (RT= Plasmaverweildauer) dieser Partikel bei FDB (Schaefer et al.
1997; Pietzsch et al. 2000). Pietzsch et al. konnten in einer weiteren in vivo-
Turnoverstudie mit 5 heterozygoten FDB- Patienten zeigen, dass der im Vergleich zu
heterozygoten FH- Patienten moderate Anstieg der LDL- Plasmawerte durch einen
Anstieg der fraktionellen Katabolismusrate (FCR) der LDL- Vorstufen und eine
verminderte Konversion von IDL zu LDL bedingt war (Pietzsch et al. 1996). Die
Plasmaverweildauer von mutiertem IDL- ApoB- 100 war signifikant verkürzt, die von
LDL- ApoB- 100 verlängert. Die FCR für LDL- ApoB- 100 betrug 32 % der normalen
Kontrollen, die FCR für VLDL unterschied sich dagegen nicht.
Die Arginin 3500 Tryptophan- Mutation (R3500W): Gaffney et al. fanden in einer
Untersuchung mit 907 hyperlipämischen Patienten bei zwei Patienten eine unabhängige
Mutation im Codon 3500 des ApoB- Gens, bei der Arginin 3500 durch Tryptophan
ausgetauscht ist (Gaffney et al. 1995). Auch hier fand sich eine verminderte
Rezeptoraffinität, die jedoch nicht so stark war wie bei der R3500Q Mutation,
wahrscheinlich weil Tryptophan 3500 besser mit Tryptophan 4369 interagieren kann als
Glutamin 3500 (Boren et al. 2001). Die R3500W Mutation hat in der asiatischen
Population eine ähnlich hohe Frequenz wie R3500Q in Europa (Choong et al. 1997).
Eine sehr hohe Prävalenz wurde bei Patienten mit Hypercholesterinämie in China
beschrieben (2,7%) (Choong et al. 1997; Tai et al. 1998). In Europa scheint die
R3500W Mutation eher selten vorzukommen. In einer dänischen Studie mit 9255
Probanden konnte kein Träger der R3500W Mutation identifiziert werden. (Tybjaerg-
Hansen et al. 1998).
Die Arginin 3531 Cystein- Mutation (R3531C): In einer Studie mit 1560 Probanden
identifizierten Pullinger et al. 1995 durch SSCP- Screening von DNA- Proben eine
dritte ApoB- Mutation (R3531C). Sie resultiert aus einer Cytosin
Basensubstitution im Nukleotid 10800 im Codon 3531 des ApoB- Gens, die zu einem
Aminosäurenaustausch Arginin (CGC)
mutierten LDL mit Fibroblasten zeigten eine um 40% reduzierte Bindung von R3531C-
LDL verglichen mit normalen LDL. Die Gesamt- und LDL- Cholesterinwerte lagen um
1. Einleitung 46
51 und 36 mg/dl höher als bei Kontrollen (Pullinger et al. 1999). In einer zweiten Studie
mit 4130 vorselektierten Patienten mit Fettstoffwechselstörungen fanden Pullinger et al.
11 R3531C- Mutationsträger, was einer Prävalenz von 1 in 375 entspricht. Tybjaerg-
Hansen et al. fanden in einer Studie mit 9255 dänischen Patienten die R3531C-
Mutation in einer Häufigkeit von 0,08%. Sie konnten keine signifikante Erhöhung von
Gesamt- und LDL- Cholesterin feststellen (Tybjaerg-Hansen et al. 1998). Die Mutation
war nicht mit einem erhöhten KHK- Risiko assoziiert. Rabes et al. fanden in einer
Untersuchung einer französischen Familie 10 heterozygote R3531C- Mutanten. Nur 4
von 10 hatten erhöhte Gesamt- und LDL- Cholesterinwerte, bei diesen vier Probanden
konnte gleichzeitig eine Mutation im LDL- Rezeptorgen (LDLR P644L) festgestellt
werden (Rabes et al. 2000). Die unterschiedlichen Ergebnisse sprechen für eine variable
Expression des Phänotyps dieser Mutation, die durch andere genetische Faktoren wie
den ApoE- Phänotyp und anderen Stoffwechselstörungen moduliert wird.
Die Arginin 3480 Tryptophan- Mutation R3480W: Die ApoB- R3480W- Mutation
wurde von Boren in einer Untersuchung von 2500 hypercholesterinämischen Patienten
in den USA bei einem Patienten identifiziert. Klinisch zeigte sich eine milde Form der
Hypercholesterinämie und eine reduzierte Bindung an den LDL- Rezeptor. Daten für
die Prävalenz dieser Mutation in Europa liegen bisher noch nicht vor (Boren et al.
2001). ApoB- H3543RMarburg wird im Rahmen dieser Arbeit erstmals entdeckt und in
Kapitel 3.3 dieser Arbeit ausführlich beschrieben.
1.7.7 Mutationen im Gen der neuronalen Apoptosis regulierten Konvertase
(PCSK 9)
Vor kurzem konnte der molekulare Defekt für eine weitere Form von autosomal
dominant vererbter Hypercholesterinämie entdeckt werden. Die Patienten unterscheiden
sich klinisch nicht von heterozygoten FH- oder FDB- Trägern, jedoch seggregiert die
Krankheit nicht mit dem LDLR und dem ApoB- Gen (Damgaard et al. 2004). Das
krankheitsauslösende Gen PCSK9 codiert die neurale apoptosis regulierte Konvertase
(NARC-1) und ist Mitglied der Proteinase K- Familie von Subtilasen (Abifadel et al.
2003). Das PCSK9 Gen befindet sich auf Chromosom 12, umfasst 34 Kb und setzt sich
aus 12 Exonen zusammen, die für ein 60 KDa Protein codieren. PCSK9 ist wie das
LDLR- Gen ein SREBP-2 reguliertes Gen, das cholesterinabhängig induziert wird, im
Gegensatz zu anderen SREBP-2 regulierten Genen resultiert eine Überexpression von
1. Einleitung 47
PCSK9 jedoch nicht in einer gesteigerten zellulären Cholesterinbiosynthese/LDL-
Aufnahme, sondern führt paradoxerweise zu einer Degradation des zellulären LDLR-
Proteins, was zu einen Anstieg der Plasma LDL- Konzentration und damit verbunden zu
einem erhöhten Atheroskleroserisiko führt. Eine direkte Interaktion zwischen LDLR
und PCSK9 konnte bisher noch nicht nachgewiesen werden, was auf ein bisher nicht
identifiziertes zelluläres Modulator/Adapterprotein hindeuted. Im Rahmen von
genetischen Screeningstudien in unterschiedlichen Populationen konnten schon einige
PCSK9 Mutationen, die zu einer Hyper- bzw. Hypocholesterinämie führen, identifiziert
werden. (Timms et al. 2004; Leren 2004). Je nach Aminosäureaustausch im PCSK9-
Protein wurden sog. „loss of function“ (Hypocholesterinämie) oder „gain of function“
Mutationen, die zu einer Hypercholesterinämie führen, identifiziert.
1.8 Monogenetische autosomal rezessiv vererbte Lipidstoffwechselstörungen
1.8.1 Apolipoprotein E und der ApoE- Polymorphismus
ApoE ist ein 299 Aminosäuren großes Glykoprotein, das reich an Argininresten ist.
Hauptsyntheseorte von ApoE sind die Leber, Niere und Milz. Das Gen von ApoE- Gen
umfasst 3,7 kb, besteht aus 4 Exonen und ist cytogenetisch auf Chromosom 19
lokalisiert. Röntgenstrukturdaten von ApoE ergaben, dass die aminoterminale Region
von ApoE aus vier -Helices besteht und Helix 4 die Bindungsstelle für den LDL-
Rezeptor beinhaltet (Aminosäuren 136- 150), die eine große Homologie zur Apo B-
Bindungstelle (B- site) aufweist (Wilson et al. 1991; Boren et al. 1998). Wie bereits in
den vorherigen Kapiteln dieser Arbeit erwähnt, kommt ApoE in Chylomikronen VLDL,
IDL und HDL vor (Schneider et al. 1996; Schaefer 1998). Es vermittelt die
Lipoproteinaufnahme in die Leber, stimuliert die VLDL- Produktion, moduliert die
Hydrolyse der VLDL- und Chylomikronen- Triglyzeride und reguliert durch Bindung
an das LRP und den LDL- Rezeptor den Katabolismus der VLDL und Chylomikronen
Remnants. Zudem wirkt ApoE bei der Regeneration des peripheren Nervengewebes und
bei der Immunregulation mit (Mahley und Rall, Jr. 2000). In der Bevölkerung existiert
ein Polymorphismus des ApoE, der durch drei unterschiedliche ApoE-
Jr. 2000). Diese codieren für sechs unterschiedliche ApoE- Phänotypen, drei
homozygote (E 2/2, E 3/3, E 4/4) und drei heterozygote (E 2/3, E 2/4, E 3/4). Die
1. Einleitung 48
- Allel codiert und kommt mit 77,3% am häufigsten
in der Bevölkerung vor. Die Allele om
- Allel durch den Austausch von Aminosäuren an 2 unterschiedlichen
Positionen, die aus Punktmutationen im ApoE- Gen resultieren (Utermann et al. 1982;
Rall und Mahley 1992). Bei ApoE 4 findet sich in Position 112 Arginin anstelle von
Cystein und bei ApoE 2 in Position 158 Cystein statt Arginin. Der Apo E-
Polymorphismus beeinflusst sowohl den endogenen, als auch den exogenen
-,
LDL-Cholesterin-, Apo B- und höheren Triglyzerid-Werten assoziiert. ApoE 2 zeigt
praktisch keine Bindung an den LDL- Rezeptor und das LRP (Bindungsaffinität etwa 1
% verglichen mit ApoE 3 und 4). Die bei ApoE 2- Trägern niedrigen Gesamt- und
LDL- Cholesterinspiegel lassen sich zum einen durch eine verringerte Konversion
VLDL- IDL in LDL und zum anderen durch eine gesteigerte LDL-Rezeptorsynthese in
der Leber erklären. Da die Leber die ApoE 2- Chylomikronen nicht aufnehmen kann,
erfolgt kompensatorisch eine Aktivierung der LDLR- Synthese in der Leber, über diese
LDL- Rezeptoren können dann vermehrt LDL- Partikel via ApoB-100 aufgenommen
werden und der Plasma LDL- Spiegel sinkt. Eine besonders schwere Form der
Hyperlipoproteinämie, bei der Homozygotie für ApoE 2 eine Rolle spielt, ist der Typ III
Hyperlipoproteinämie nach Fredrickson. Bei Patienten mit Typ III
Hyperlipoproteinämie sind Cholesterin und Triglyzeride gleichermaßen erhöht,
wodurch diese Patienten ein sehr hohes Risiko haben, frühzeitig eine Atherosklerose zu
entwickeln (Utermann 1985; Utermann 1986; Mahley et al. 1999). Für die Ausbildung
einer Typ III Hyperlipoproteinämie sind noch weitere zusätzliche Faktoren notwendig
(Diabetis, Insulinresistenz, Hypothyreose), da die meisten ApoE 2/2 Träger (ca. 90%)
normolipämisch sind, sodass der ApoE 2/2 Genotyp für sich alleine nicht zwingend die
Ursache für eine Hypertriglyzeridämie zu sein scheint, sondern vielmehr weitere
Kofaktoren involviert sind, die in Kombination mit dem ApoE 2- Allel erst zur
Ausprägung einer Hypertriglyzeridämie führen (Mahley et al. 1999; Mahley und Rall,
Jr. 2000). Ein solcher relevanter Faktor scheint Apolipoprotein A5 zu sein, welches
kürzlich entdeckt wurde und ausschließlich in der Leber expremiert wird (van der Vliet
et al. 2001). In Studien mit transgenen und knockout- Mäusen konnte gezeigt werden,
dass ApoA5 die Plasma- Triglyzeridkonzentrationen moduliert (Pennacchio et al. 2001;
1. Einleitung 49
Talmud et al. 2002; Pennacchio und Rubin 2003). Der exakte Mechanismus der ApoA5
vermittelten TG- Senkung und die möglichen Interaktionen mit Apo E und
Lipoproteinlipase (LPL) bei der Hydrolyse triglyzeridreicher Lipoproteine sind bisher
nicht genau aufgeklärt. Aktuelle Daten postulieren jedoch, dass Apolipoprotein A5
einerseits die Produktion triglyzeridreicher Lipoproteine (VLDL) reduziert und
andererseits die Lipoproteinlipaseaktivität stimuliert (Schaap et al. 2004). In einer
Studie mit hypertriglyzeridämischen Patienten aus dem Kollektiv der Marburger
Präventions-Allianz konnten wir zeigen, dass ApoA5 einen wesentlichen Kofaktor für
die Hyperlipoproteinämie bei ApoE 2/2 darstellt. Bei 7 hypertriglyzeridämischen ApoE-
2/2-Trägern zeigten immerhin 6 dieser Patienten zusätzlich ein heterozygote ApoA5
S19W-Mutation (Schaefer et al. 2004). Dieser Befund ist insofern von Bedeutung, da
ApoE 2/2 in der Normalbevölkerung mit einer Häufigkeit von 0,6% vorkommt und nur
10% dieser Apo E 2/2 Träger eine Hypertriglyzeridämie entwickeln. Intersessanterweise
liegt die Frequenz von ApoA5 S19W in der Normalbevölkerung bei 10,9% (Talmud et
al. 2002), was der Häufigkeit der durch ApoE 2/2 induzierten Hypertriglyzeridämie
entspricht. Wir folgern aus diesen Daten, dass ApoA5 ein wichtiger Kofaktor (wenn
nicht gar der wichtigste Faktor) für die Ausprägung einer Hypertriglyzeridämie bei Apo
E2/2 Trägern ist. Im Gegensatz zu ApoE 2 -Allel häufiger in
hypercholesterinämischen Patienten gefunden (Mahley und Rall, Jr. 2000). ApoE 4
führt zu einem beschleunigten Umbau der VLDL in LDL und einer schnelleren
Chylomikronenelimination aus dem Plasma. Die Anzahl der LDL- Rezeptoren auf den
Hepatozyten sinkt kompensatorisch ab, wodurch das Plasma- LDL ansteigt. Personen
mit ApoE4- Phänotyp haben ein erhöhtes Risiko für Atherosklerose und early onset
Alzheimer- Krankheit. In einer Studie mit FH- Patienten konnte gezeigt werden, dass
das E 4- Allel in FH- Patienten nahezu doppelt so häufig vorkommt als in der
Normalpopulation (Duly et al. 1997). Andere Untersuchungen haben gezeigt (Davignon
et al. 1988), dass der ApoE- Polymorphismus bei ca. 10% der interindividuellen
Unterschiede der Serumcholesterinspiegel in verschiedenen Populationen
verantwortlich ist. Unabhängig vom Apo E- Polymorphismus können Veränderungen in
der Plasmamenge von ApoE 20-40% der Variationen der Plasmakonzentrationen von
Triglyzeriden und VLDL- Cholesterin bedingen (Mahley et al. 1999). Studien mit
Trägern der R3500Q- Mutation (FDB) haben gezeigt, dass bei FDB- Patienten eine Apo
1. Einleitung 50
E- bedingte Variabilität der Lipidwerte zu finden ist (Manke et al. 1993). Bei FDB
Patienten spielt ApoE eine zentrale Rolle, da es als hochaffiner Ligand des LDLR hier
einen „rescue shuttle“ generiert, der die defekte Bindung des ApoB durch eine
vermehrte Aufnahme der LDL- Vorstufen via ApoE in die Zelle kompensiert (Schaefer
et al. 1997). Dieser Mechanismus erklärt auch die moderateren LDL-
Plasmacholesterinspiegel bei FDB im Vergleich zu FH.
1.8.2 Die Autosomal Rezessive Hypercholesterinämie (ARH)
Die autosomale rezessiv vererbte Hypercholesterinämie wurde erstmals bei einer
Familie libanesischen Ursprungs beschrieben, bei der vier betroffene Nachkommen die
klassischen Zeichen einer homozygoten Familiären Hypercholesterinämie (FH)
aufwiesen (Garcia et al. 2001). Neben ausgeprägten Xanthomen an den Strecksehnen
fanden sich LDL- Plasmacholesterinwerte, die zwischen denen von heterozygoten und
homozygoten FH- Patienten lagen. Eine Untersuchung der Aufnahme und Bindung von
LDL in kultivierten Fibroblasten dieser Patienten zeigte keine Auffälligkeiten, und es
fand sich keine Segregation mit dem LDLR und dem ApoB- Gen. Weitere
Familienuntersuchungen im Mittelmeerraum (Türkei, Sardinien, Syrien) identifizierten
zusätzliche Fälle dieses Krankheitsbildes, bei denen Aufnahme und Bindung von LDL
in den Fibroblasten der Betroffenen ebenfalls völlig normal waren (Arca et al. 2002; Al
Kateb et al. 2003; Soutar et al. 2003). Die Plasma LDL- clearance- Rate war jedoch
genau so niedrig wie bei homozygoter FH, und es fand sich auch bei diesen Fällen keine
Segregation mit dem LDLR und dem ApoB- Gen, sodass man diese Form der
Hypercholesterinämie als Autosomal Rezessive Hypercholesterinämie (ARH)
klassifizierte. Der zugrundeliegende molekulare Defekt der Krankheit konnte 2001
aufgeklärt werden und wird durch Mutationen im Gen des ARH1- Proteins
hervorgerufen, welches sich auf Chromosom 1 befindet. Das Gen von ARH1 umfasst
45 Kb und besteht aus 16 Exonen, die für ein 20 KDa Protein codieren (Soutar et al.
2003). Durch Untersuchungen mit Lymphozyten von ARH- Patienten konnte
nachgewiesen werden, dass ARH1 ein Adapterprotein ist, welches der LDLR für die
Internalisierung des LDLR/LDL- Komplexes benötigt (Garcia et al. 2001; He et al.
2002; Soutar et al. 2003). In diesem Prozess interagiert ARH1 spezifisch über eine
Phosphotyrosin- Bindungsdomäne (PTBD) mit dem NPxY- Motif des LDLR und
ermöglicht hierdurch die Verankerung und Internalisierung des Rezeptor- Liganden-
1. Einleitung 51
Komplexes in den coated pits (Mishra et al. 2002). Interssanterweise benötigen nur die
Lymphozyten und Hepatozyten das ARH1- Protein für die Internalisierung des
Rezeptor- Liganden- Komplexes, nicht aber- wie bereits oben erwähnt- die
Fibroblasten. Man nimmt an, dass in Fibroblasten die Funktion des ARH1- Proteins
durch ein anderes Mitglied aus der Familie der Adapterproteine kompensatorisch
übernommen wird, und dass dieser kompensatorische Weg in Hepatozyten und
Lymphozyten nicht funktioniert. Da ca. 75% der Plasma- LDL über den LDLR pathway
in der Leber katabolisiert werden, erklärt dies auch, warum die in ARH beobachteten
LDL- Plasmacholesterinwerte zwischen denen von heterozygoten und homozygoten
FH- Patienten liegen. Anders als bei FH, wo der LDLR in allen Zellen defekt ist, ist bei
ARH also noch eine partielle LDL- clearance über einen funktionierenden LDLR in den
Fibroblasten möglich. Phänotypisch weisen Patienten mit ARH Xanthome auf und
besitzen ein sehr hohes Risiko, frühzeitig an Atherosklerose zu erkranken. Bisher
konnte die ARH erst in zehn Fällen ausschließlich im Mittelmeerraum (mediterrane
Hypercholesterinämie) nachgewiesen werden (Arca et al. 2002; Al Kateb et al. 2003;
Barbagallo et al. 2003), sodass diese Form der Hypercholesterinämie mit einer
Prävalenz 1-5 : 106 eher selten zu sein scheint.
1.8.3 Die autosomal rezessiv vererbte Phytosterolemie (Sitosterolämie)
Eine weitere monogenetisch vererbte Lipidstoffwechselstörung, die einem autosomal
rezessiven Vererbungsmodus folgt und sehr selten auftritt (Prävalenz 1-5:106), ist die
Sitosterolämie. Das Krankheitsbild wurde erstmals 1974 von Bhattacharyya und Connor
beschrieben (Bhattacharyya und Connor 1974). Die betroffenen Patienten wiesen stark
ausgeprägte Xanthome auf und hatten 50- fach erhöhte Plasmawerte für das
hauptsächlich im Plasma vorkommende pflanzliche Sterol Sitosterol. Der Gesamtanteil
der über die Nahrung eines Nicht- Vegetariers aufgenommenen Sterole besteht zu 60%
aus Sterolen, die dem tierischen Cholesterin entstammen und zu 40% aus pflanzlichen
Sterolen (Sitosterol, Campesterol etc.). Beide werden über das im Darm lokalisierte
NPC1L1- Transporterprotein in die Enterozyten des Dünndarms aufgenommen
(Altmann et al. 2004; Davis, Jr. et al. 2004). Beim gesunden Menschen werden
normalerweise etwa 50-60% des über die Enterozyten resorbierten Cholesterins
modifiziert und intrazellulär behalten, wohingegen nur 1% der aufgenommenen
pflanzlichen Sterole intrazellulär gespeichert werden und der Rest wieder aktiv aus den
1. Einleitung 52
Enterozyten in das Darmlumen heraus transportiert wird und über Faecas ausgeschieden
wird. Der Rücktransport von überschüssigem Cholesterin und pflanzlichen Sterolen aus
den Enterozyten heraus wird durch die Transporterproteine ABCA5 und ABCA8
bewerkstelligt. Die Gene beider Proteine liegen auf Chromosom 2p21, umfassen jeweils
56 Kb und bestehen aus 35 Exonen, die für zwei Transmembranproteine von 160 KDa
codieren (Lu et al. 2001). Beim Krankheitsbild der Sitosterolämie ist der
Rücktransportmechanismus von überschüssigem Cholesterin und pflanzlichen Sterolen
aus den Enterozyten heraus durch Mutationen in ABCA5/ABCA8 gestört, und es
kommt primär zu einer intrazellulären Akkumulation von Cholesterin, was sekundär
dann über eine verringerte LDLR- Aktivität in einem Anstieg der Plasma- LDL
resultiert (Hubacek et al. 2001; Heimer et al. 2002). Phänotypisch kann eine
Sitosterolämie einer homozygoten FH sehr ähnlich sein. Neben ausgeprägten
Xanthomen findet man bei den Patienten LDL- Plasmaspiegel > 500 mg/dl sowie ein
frühzeitiges Risiko für die Ausbildung von atherosklerotischen Läsionen.
1. Einleitung 53
1.9 Aufgabenstellung und Zielsetzung der Arbeit
Die Atherosklerose und ihre Folgen sind heute für nahezu 50% der Todesfälle in den
westlichen Industrienationen verantwortlich. In großen epidemiologischen Studien
konnte die Bedeutung von Fettstoffwechselstörungen, insbesondere die Rolle der
Hypercholesterinämie, als zentraler kardiovaskulärer Risikofaktor in der Pathogenese
der Atherosklerose aufgezeigt werden. Die von Prof. Dr. J. R. Schaefer und Prof. B.
Maisch 1998 in der Klinik für Kardiologie in Marburg gegründete Marburger
Präventions- Allianz versteht sich als ein multimodales Konzept zur Prävention der
KHK. Im Rahmen dieses mittlerweile in Deutschland größten koronarangiografierten
und risikostratifizierten Kollektivs werden seit 1998 von jedem Patienten, der sich in
der Klinik für Kardiologie in Marburg einer Herzkatheteruntersuchung unterzieht und
sich dazu bereit erklärt hat, Blut zur allgemeinen und speziellen Aufarbeitung
abgenommen. Neben den Standardparametern des lipidologischen Risikoprofils
(LDL/HDL- Cholesterin, Triglyzeride etc.), wird zusammen mit den weiteren klinischen
Daten so ein umfassendes kardiovaskuläres Risikoprofil des Patienten erstellt und
computergestützt mit dem Koronarbefund abgeglichen. In der ausführlichen klinischen
Datenbank liegen mittlerweile die Daten von mehr als 5000 Patienten in anonymisierter
Form vor. Ein Votum zur Durchführung von Studien mit diesem Kollektiv, welches auf
der Basis der Helsinki- Deklaration von 1975 in der revidierten Form von 1996 beruht,
wurde durch die Ethikkomission der Philipps-Universität-Marburg (Aktenzeichen
Studie: 10/03) erteilt.
Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, in einem ersten Schritt ein
molekulargenetisches Nachweissystem zu entwickeln, welches ein sicheres Screening
von Mutationen und Polymorphismen in relevanten Kandidatengenen, die bei der
Pathogenese der Atherosklerose eine Rolle spielen, aufzubauen. Hierzu sollte eine
Apparatur konzeptioniert werden, die einen Nachweis von Mutationen mit der Technik
der Denaturierenden Gradientengel Elektrophorese (DGGE) ermöglicht. In einem
zweiten Schritt sollte danach die Hypercholesterinämie als ein zentraler Faktor für die
Pathogenese der Atherosklerose untersucht werden. In einer DGGE- basierten
Screening- Studie sollten erstmals bei 1000 konsekutiv gesammelten Patienten der
Marburger Präventions- Allianz der Einfluss und die Prävalenz von Mutationen in
einem bestimmten Bereich des ApoB- 100- Gens, der für die Bindung von ApoB- 100
1. Einleitung 54
an den LDL- Rezeptor relevant ist, untersucht werden. Zusätzlich sollten im Rahmen
dieses Screenings extrem seltene und schon in frühester Kindheit schwerstmanifestierte
Formen der Familiären Hypercholesterinämie (FH), die durch Defekte im LDL-
Rezeptor entstehen, aufgeklärt werden. Im dritten Teil dieser Arbeit schließlich sollte
die funktionelle Relevanz von identifizierten Mutationen auf den Lipidstoffwechsel in
vitro als auch in vivo mittels stabiler Isotopentechnik genauer untersucht werden.
2. Material und Methoden 55
2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Geräte
Agarosegeldokumentations- System, Intas (Göttingen)
Agarosegelkammern, BioRad (München)
Aquariumpumpe, Roth (Karlsruhe)
Autoklaven, MMM (München)
Bunsenbrenner, Roth (Karlsruhe)
DNA- Sequencer ABI- Prism 310, Applied Biosystems (Werrington, UK)
Drehschieber Vakuumpumpe vaccubrand Typ RD 4, Brand (Reutlingen)
Gaschromatograf/Tandem- Massenspektrometer MAT TSQ 700, Finnigan (USA)
Gradientenmischer, BioRad (München)
Heizblöcke Thermomixer 5436, Eppendorf (Hamburg)
Heizrührgerät Ikamag RCT, Bachhofer (Reutlingen)
Inkubatoren, Heraeus (Osterode)
Konfokales Lasermikroskop LSM 510, Zeiss (Jena)
Kühlfalle „Refridgerated Condensation Trap RT 100, Savant (Frankreich)
Lichtmikroskop Typ IM35, Zeiss (Jena)
Magnetrührer Ikamag Reo, Bachhofer (Reutlingen)
Nephelometer Modell- 100, Behring (Marburg)
PCR- Heizblock MJ Research, Corbett Research, Sidney (USA)
Peristaltische Pumpe, Amersham (Freiburg)
pH- Meter Modell 761, Knick (Berlin)
Photometer Spektrophotometer DU 640, Beckmann (München)
Pipetten P2, P20, P200, P1000, Gilson (Middleton, USA)
Pipetten P10, P20, P250, P1000, Eppendorf (Hamburg)
Protein- Minigel- Apparaturen- Mini- Protean II, BioRad (München)
Protein- Gel- Apparaturen Protean II, BioRad (München)
Quickseal- Tube- Sealer, Beckmann (München)
Quickseal- Tube- Spacers, Beckmann (München)
Quickseal- Tube- Slicer, Beckmann (München)
Real Time PCR- Heizblock (I- Cycler), BioRad (München)
2. Material und Methoden 56
Reinstwasseranlage MilliRo 30plus, Millipore (Eschborn)
Schüttelgeräte Reax 2000, Heidolph (Kelheim).
Spannungsgeräte:
- Modell Power Pac 300, BioRad (München)
- Modell Power Pac 3000, BioRad (München)
Speed-Vac Konzentrator SVC 100, Savant (Frankreich)
Spektralfluorometer (Model LS- 5 Fa. Perkin-Elmer, Langen)
Sterilbank, BDK (Sonnenbühl)
Stickstofftank XLC-2 30, MVE (New Prague, USA)
Tischschüttler 3020, GFL (Burgwedel)
Thermoelement 2219 Multitemp, LKB (Schweden)
UV- Illuminatoren (254 nm und 365 nm), Bachhofer (Reutlingen)
Waagen:
-AE163, Mettler- Toledo (Gießen);
-Typ 1412, Sartorius (Göttingen)
Wasserbäder 1086, GFL (Burgwedel)
Zentrifugen:
-Sorvall RC- 5C plus, DuPont (Bad Homburg);
-J6- MC und L8- 80M, Beckmann (München);
-5417 und 5417R, Eppendorf (Hamburg)
-Ultrazentrifuge Modell L8-55M Beckmann, (München)
Zentrifugenrotoren:
-Rotor RH 24-18, Savant (Frankreich)
-50.3 Ti.- Rotor, Beckmann (München)
-50.4 Ti.- Rotor, Beckmann (München)
2.1.2 Chemikalien und Biochemikalien
Acrylamid, Serva (Heidelberg)
30% Acrylamid:Bisacrylamid (37,5:1), Roth (Karlsruhe)
30% Acrylamid:Bisacrylamid (29:1), BioRad (München)
Agarose GTG, Biozym (Hess- Oldendorf)
Ammoniumacetat, Merck (Darmstadt)
Ammoniumhydrogencarbonat, Merck (Darmstadt)
2. Material und Methoden 57
Ammoniumperoxodisulfat (APS), Merck (Darmstadt)
Ammoniumsulfat, Merck (Darmstadt)
Aprotinin, Sigma (Taufkirchen)
Borsäure, Merck (Darmstadt)
Bradford- Reagenzlösung, BioRad (München)
Bromphenolblau, Merck (Darmstadt)
Calciumchlorid, Merck (Darmstadt)
Coomassie- Blau R- 250, Sigma (Taufkirchen)
Deuterium markiertes Leuzin (3D- Leuzin), MSD (USA)
DiI (1,1´-dioctadecyl-3,3,3´,3´-tetramethylindocarbocyaninperchlorate),
Sigma (Taufkirchen)
Dimethylsulfoxid (DMSO), Merck (Darmstadt)
Di- Natriumhydrogenphosphat, Merck (Darmstadt)
Dithiothreitol (DTT), Sigma (Taufkirchen)
dNTP`s (desoxyribonukleotidtriphosphate: dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
Roth (Karlsruhe)
Essigsäure, Roth (Karlsruhe)
Ethanol (EtOH), Riedel- de- Haen (Seelze)
Ethidiumbromid (EtBr), Sigma (Taufkirchen)
Ethylacetat, Merck (Darmstadt)
Ethylendiamintetraacetat (EDTA), Merck (Darmstadt)
Fiquoll-Paque, Amersham (Freiburg)
Formaldehyd, Sigma (Taufkirchen)
Formamid (deionisiert), Roth (Karlsruhe)
Gentamycinsulfat, Gibco (Eggenstein)
Glukose, Gibco (Eggenstein)
Glycerin, Merck (Darmstadt)
Glycin, Roth (Karlsruhe)
Hepes, Sigma (Taufkirchen)
Isopropanol, Riedel- de- Haen (Seelze)
Kaliumacetat, Merck (Darmstadt)
Kaliumbromid, Merck (Darmstadt)
2. Material und Methoden 58
Kaliumchlorid, Merck (Darmstadt)
Kaliumdihydrogenphosphat, Merck (Darmstadt)
Kaliumphosphat, Merck (Darmstadt)
Lithiumchlorid, Sigma (Taufkirchen)
Leupeptin, Roth (Karlsruhe)
Magnesiumchlorid, Merck (Darmstadt)
Magnesiumsulfat, Merck (Darmstadt)
Methanol (MeOH), Riedel- de- Haen (Seelze)
2-Mercaptoethanol, Merck (Darmstadt)
Natriumacetat, Merck (Darmstadt)
Natriumchlorid, Merck (Darmstadt)
Natriumdodecylsulfat, (SDS) Roth (Karlsruhe)
Natriumhydroxid, Merck (Darmstadt)
Mounting- Medium, Vector Shield (USA)
Oligonukleotid dT- Primer, Gibco (Eggenstein)
Phenol (in TE äquilibriert), Roth (Karlsruhe)
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Serva (Heidelberg)
Phosphate buffered saline (PBS),Gibco (Eggenstein)
Polyvinylpyrolidon (PVP), Sigma (Taufkirchen)
Rinderserumalbumin (BSA), Sigma (Taufkirchen)
Saccharose, Merck (Darmstadt)
Salzsäure (37%), Riedel- de- Haen (Seelze)
Streptomycin, Sigma (Taufkirchen)
SYBR- green- Fluoreszenz- Farbstoff, BioRad (München)
TEMED (N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin), BioRad (München)
Tris, Roth (Karlsruhe)
Trizol- Reagent, Gibco (Eggenstein)
Triton-X- 100, Sigma (Taufkirchen)
Trypsin/EDTA- Lösung, Gibco (Eggenstein)
Xylencyanol, Sigma (Taufkirchen)
2. Material und Methoden 59
2.1.3 Enzyme
Platinium Taq DNA- Polymerase, Gibco (Eggenstein)
Restriktionsendonukleasen (Bezugsquellen):
-NEB (Schwalbach)
-Roche (Mannheim)
-Sigma (Taufkirchen)
-Stratagene (Heidelberg)
Rnase Inhibitor, Promega (Mannheim)
2.1.4 Kommerzielle Reaktionssysteme
Aminosäuren- Derivatisierungs- Kit (HFBA- IBA amino acid derivatization kit),
bestehend aus: Heptafluorobuttersäureanhydrid (HFBA), Isobutanol, Acetyl- Chlorid,
Alltech, (USA)
Enzymatischer Assay- Kit zur Quantifizierung von: Gesamtcholesterin,
HDL- Cholesterin und Triglyzeriden, Roche (Mannheim)
Nephelometrie Standard- Kit zur Quantifizierung der Apolipoproteine:
A-I, ApoB, ApoE, und Lipoprotein(a), Behring (Marburg)
Quiaex II Gel extraction Kit, Quiagen (Hilden)
Qiagen RNeasy Purification Kit, (Qiagen, Hilden)
Quiagen One step RT/PCR Kit, Quiagen (Hilden)
Big dye terminator ® Sequencing Kit, Applied Biosystems (Werrington, UK)
2.1.5 Oligonukleotide
Alle in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide wurden über die Firmen Roth
(Karlsruhe) und Invitrogen (Karlsruhe) bezogen. Eine detaillierte Sequenzangabe
erfolgt im Ergebnisteil.
2.1.6 Kulturmedien/Seren
DMEM- Medium, Biochrom (Berlin)
Fötales Kälberserum (FCS), Biochrom (Berlin)
Lipoprotein defizientes Serum (LPDS), (Eigene Präparation)
2. Material und Methoden 60
2.1.7 Verbrauchsmaterialien
Deckgläser (Poly- L- Lysin beschichtet), Sigma (Taufkirchen)
Dialyseschläuche (Spectra/Por, molecular weight cut off 6000 -8000),
Serva (Heidelberg)
Dialyseschlauch- Klemmen (Spectra/Por Closures), Spectrum medical industries (USA)
Einweg Plastik- Pasteur- Pipetten, Sarstedt (Nümbrecht)
Einweg- Skalpelle, Finnigan (USA)
Eppendorf- Reaktionsgefäße (2,0/1,5 ml), Eppendorf (Hamburg)
Einweg- Sterilfilter (0,45 µm), Schleicher&Schuell (Dassel)
Filterpapier (Whatman 3MM), Schleicher&Schuell (Dassel)
Glasröhrchen mit Schraubverschluss und Teflondichtung
(Vials Typ I, temperaturbeständig bis 1500C), NeoLab (Heidelberg)
Ionenaustauschersäulen (Prefilled Poly- Prep Columns AG- 50W- X8),
BioRad (München)
Kanülen, Microlance 2,19 G 1,5 (USA)
Nitrozellulosemembran (0,45 µm), Schleicher&Schuell (Dassel)
Objektträger, Sigma (Taufkirchen)
PCR- Reaktionsgefäße (0,2/0,5ml),Biozym (Hess.- Oldendorf)
PCR- Platten (48- Well), Biozym (Hess.- Oldendorf)
Probengefäße für GC/MS (Combo- Pack), Ass- Chemicals (USA)
Röhrchen- Polypropylen mit Schraubverschluss (15 ml), Sarstedt (Nümbrecht)
Röhrchen mit Stopfverschluss- Polypropylen (5 ml), Sarstedt (Nümbrecht)
Ultrazentrifugationsröhrchen, Beckmann (München)
Zellkultur- Einweg- Plastikmaterialien (Bezugsquellen):
-Nunc (Dänemark)
-Falcon (Heidelberg)
-Greiner (Bad Homburg)
2. Material und Methoden 61
2.1.8 Antikörper
Nachfolgend eine Auflistung der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Antikörper.
Primärantikörper:
Anti-human LDL-Rezeptor (IgG- C-7):
Monoklonaler Antikörper aus Maus gerichtet gegen ein Epitop der ligandenbindenden-
Domäne des humanen LDL- Rezeptors (Fa. Acris, Hiddenhausen).
Anti-human LDLR (polyclonal antibody)
Polyklonaler Antikörper aus Kaninchen gerichtet gegen ein Epitop der EGF- Domäne
des humanen LDL- Rezeptors (Fa. Acris, Hidenhausen).
Anti-human SCARB1( polyclonal antibody)
Polyklonaler Antikörper aus Ziege gerichtet gegen ein Epitop im N- Terminus des
humanen scavenger receptors type B I (Fa. Santa Cruz, Heidelberg).
Anti-human Na+/K+- ATPase (polyclonal antibody)
Polyklonaler Antikörper aus Ziege gerichtet gegen die 35 KDa Unterheit der humanen
Natrium/Kalium ATPase (Fa. Santa Cruz, Heidelberg).
Sekundärantikörper:
Anti- Maus IgG (H+L) FITC:
Affinitätsgereinigter, polyklonaler Antikörper aus Kaninchen gegen Maus- IgG,
gekoppelt an Fluoreszeinisothiozyanatisomer I (Fa. DAKO, Hamburg).
Anti- Maus IgG (H+L)TRITC:
Affinitätsgereinigter, polyklonaler Antikörper aus Kaninchen gegen Maus- IgG,
gekoppelt an Tetramethylrhodaminisozyanat (Fa. DAKO, Hamburg).
Anti- Kaninchen IgG (H+L) Peroxidase :
Affinitätsgereinigter, polyklonaler Antikörper aus Ziege gegen Kaninchen- IgG,
gekoppelt an Peroxidase (Fa. Santa Cruz, Heidelberg).
Anti- Ziege IgG (H+L) Peroxidase :
Affinitätsgereinigter, polyklonaler Antikörper aus Kaninchen gegen Ziege- IgG,
gekoppelt an Peroxidase (Fa. Santa Cruz, Heidelberg).
2. Material und Methoden 62
2.1.9 Standardpuffer und Lösungen
Nachfolgend eine Auflistung der im Rahmen dieser Arbeit häufig verwendeten
Lösungen und Puffer.
50 x TAE- Puffer :
Tris: 242,0 g
Eisessig: 57,1 ml
EDTA(0,5 M; pH 8): 100,0 ml
H2O (bidest.): auf 1000 ml
10 x PBS- Puffer (pH 7,3):
NaCl: 80,0 g
KCl: 2,0 g
KH2PO4: 2,0 g
Na2HPO4: 11,5 g
H2O (bidest.): auf 1000 ml
1x TE- Puffer (pH 7,5) :
Tris: 121,1 g
EDTA: 0,09 g
H2O (bidest.): auf 100 ml
6x DNA/RNA- Auftragspuffer:
Bromphenolblau: 0,25 g
Xylencyanol: 0,25 g
EDTA: 1,21 g
Glycerin: 30,0 ml
H2O (bidest.): auf 100 ml
10% Ammoniumperoxodisulfat (APS) :
10 g APS mit H2O (bidest.) auf 100 ml.
70% Ethanol:
700 ml Ethanol p.A mit H2O (bidest.) auf 1000 ml.
2. Material und Methoden 63
2.1.10 Verwendete DNA und Proteinstandards
DNA- Längenstandards:
Proteinstandards:
SDS- PAGE
Broad Range Standards
(Fa.BioRad,München)
Apolipoprotein A-I
Purified (HDL)
(Fa.Calbiochem,Darmstadt)
Aprotinin
34,3 KDaApo E
28,3 KDaApo A-I
6,5KDa
14,4 KDa
45,0 KDa
66,2 KDa
116,2 KDa KDAa
200,0 KDa KKdaKDAa
97,4 KDa
31,0 KDa
21,5 KDa
Myosin
ß-Galactosidase
Phosporylase B
Serum Albumin
Ovalbumin
Trypsin Inhibitor
Lysozym
Carbon Anhydrase Inhibitor
Protein:
Apolipoprotein E
Purified (VLDL)
(Fa.Calbiochem,Darmstadt)
-DNA-Hind III-Marker
(Fa.Roche,Mannheim)
pUC 18 Msp I- Marker
(Fa.Sigma,Taufkirchen)
PCR- Markers
(Fa.Promega,Mannheim)
23130 Bp
9460 Bp
6557 Bp
2027 Bp2322 Bp
564 Bp
125 Bp
242 Bp
147 Bp
1000 Bp
750 Bp
500 Bp
300 Bp
150 Bp
50 Bp
110 Bp
502 Bp489 Bp
190 Bp
89 Bp67 Bp
404 Bp353 Bp
4361 Bp
2. Material und Methoden 64
2.2 Molekularbiologische Arbeitsmethoden
2.2.1 Isolierung von DNA aus Vollblut
Für die Isolierung von DNA aus Vollblut wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neues
Verfahren entwickelt, welches die schnelle Isolierung von DNA aus einer großen
Anzahl von klinischen Proben ermöglicht. Die Zusammensetzungen der Lösungen für
dieses Verfahren waren wie folgt:
Äquilibriertes mit TE- Puffer (pH 8,0) überschichtetes Phenol:
Isopropanol (2-Propanol) p. A :
70% Ethanol:
DNA- Isolations- Stammlösung:
3M Guanidiniumisothyoycyanat : 70,80 g
2M Lithium Chlorid: 4,20 g
3M Harnstoff: 9,00 g
30mM Tris- HCl (pH 7,0): 0,20 g
15mM EDTA: 0,28 g
0.5% SDS: 0,25 g
Triton X- 100 (w/v): 0,10 g
ß- Mercaptoethanol (w/v): 0,25 g
H2O (bidest.): auf 200ml
Diese Lösung wurde über Nacht auf einem Magnetrührer gemischt und anschließend
durch Papierfilter (Schleicher&Schüll) filtriert und bis zur weiteren Verwendung als
Stammlösung bei RT (250C) aufbewahrt.
DNA- Isolations- Lösung (Arbeitslösung):
3 Volumen DNA- Isolations- Stammlösung: 300ml
1 Volumen äquilibriertes Phenol: 100ml
Isolierung der DNA
Jeweils 200µl Vollblut wurden mit 600µl DNA- Isolations- Lösung versetzt und für 10
Sek auf einem Vortexgerät geschüttelt. Anschließend wurde für 30 Sek. bei 13000 rpm
2. Material und Methoden 65
9460 23130
M 1 2 3 4 5Bp
6557
2027 2322
4361
in einer Eppendorf- Zentrifuge abzentrifugiert und der wässrige Überstand mit der DNA
in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Nach Zugabe von 1ml Isopropanol wurde
vorsichtig gemischt und abermals für 1 Min. bei 13000 rpm abzentrifugiert. Der
Überstand wurde vorsichtig mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt und das Pellet mit
800µl einer 70% Ethanol- Lösung gewaschen. Nach einer weiteren kurzen
Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und die isolierte DNA für 3 Min. an der
Luft getrocknet, anschließend in 500µl sterilem H2O (bidest.) aufgenommen und zur
weiteren Verwendung bei- 200C aufbewahrt. Die Integrität der mit diesem Verfahren
gewonnenen DNA wurde durch Auftrennung in einem analytischen 1% Agarosegel
überprüft (Abbildung 11).
Abbildung 11: Auftrennung von aus Vollblut isolierter DNA des im Rahmen dieser Arbeit neu
entwickelten Verfahrens in - DNA- Hind III- Marker ).
2.2.2 Isolierung von RNA aus kultivierten adherenten Zellen
Qualitativ hochwertige RNA aus kultivierten adherenten Zellen konnte mit Hilfe des
,,Qiagen RNeasy Purification Kit‘‘ (Qiagen, Hilden) präpariert werden. Für eine
Standard- RNA- Präparation wurden ca.1.5 - 2 x 106 Zellen verwendet. Nach
Trypsinisierung wurden die Zellen bei 1000 x g und RT abzentrifugiert und der
Überstand an Medium abgesaugt. Die pelletierten Zellen wurden anschließend jeweils 2
mal mit 2ml sterilem 1x PBS- Puffer gewaschen und das Zellpellet sofort in Lysis-
Puffer lysiert. Die Aufreinigung der RNA über Qiagen- Säulen erfolgte nach den
Angaben des Herstellers. Abschließend wurde die RNA in 50µl sterilem DEPC- H2O
von den Quiagen- Säulen eluiert und für weitere Anwendungen entweder sofort
2. Material und Methoden 66
eingesetzt oder bei -800C aufbewahrt. Die Integrität der gewonnenen RNA wurde durch
Auftrennung in einem analytischen Agarosegel überprüft.
2.2.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA
Zur Konzentrationsmessung von DNA und RNA wurden die DNA/RNA-Lösungen 1:50
in 200µl H2O verdünnt und die Konzentration bei einer Wellenlänge von 260nm
(OD260) spektralphotometrisch bestimmt. DNA und RNA weisen bei einer Wellenlänge
von 260nm ein Absorptionsmaximum auf. Bei doppelsträngiger DNA wird bei einer
OD260 = 1,0 eine DNA- Konzentration von 50µg/ml zugrunde gelegt, für
einzelsträngige RNA ergibt sich eine Konzentration von 33 µg/ml.
Formel: C =
C= Konzentration in mM/l
k= Verdünnungsfaktor
ε= Extinktionskoeffizient in mM-1 cm-1
d= Küvettenschichtdicke in cm
Wurde bei einer Wellenlänge von 280nm ein weiteres Absorptionsmaximum gemessen,
deutete dies auf die Anwesenheit von Proteinen in der Lösung hin. Der Quotient aus den
Absorptionskoeffizienten, bei 260nm und 280nm, gab Aufschluss über die Reinheit
einer DNA/RNA- Präparation. Bei reinen DNA/RNA- Lösungen liegt der Quotient bei
ungefähr 2. Niedrigere Werte sind ein Hinweis auf Verunreinigungen durch Proteine.
2.2.4 DNA- Hydrolyse mit Restriktionsendonukleasen
Restriktionsenzyme spalten DNA durch Hydrolyse des Desoxyribose- Phosphat-
Rückgrats an spezifischen Erkennungssequenzen. Endonukleasen vom Typ II erkennen
spezifische, pallindromische DNA- Sequenzen aus 4-8 Nukleotiden und schneiden diese
in Anwesenheit von MgCl2. Für die Restriktion wurden für analytische Zwecke 0,2–1
ätzen) bzw. 2µg (bei präparativen Ansätzen) der DNA
eingesetzt und mit der jeweils benötigten Restriktionsendonuklease unter den vom
Hersteller empfohlenen Bedingungen gespalten. Waren Restriktionen mit zwei
Enzymen gleichzeitig nötig, so wurde ebenfalls nach Angaben des Herstellers verfahren
und der jeweils für beide Restriktionsendonukleasen günstigste Reaktionspuffer
OD260 x k
ε x d
2. Material und Methoden 67
gewählt. Das Reaktionsvolumen für die Restriktion betrug 30- -1U Enzym
ändige Spaltung der DNA wurde in der Regel nach
12 Stunden Inkubationszeit (Restriktion von PCR- Produkten) erreicht.
2.2.5 Agarose- Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA/RNA- Molekülen
Die Auftrennung von DNA/RNA- Molekülen zu analytischen und präparativen
Zwecken wurde in horizontalen Agarosegelen in Flachgelapparaturen durchgeführt.
Dabei erlaubt die negative Ladung der DNA/RNA- Moleküle deren Wanderung im
elektrischen Feld. Die Konzentration an Agarose im Gel richtete sich nach der Größe
der aufzutrennenden DNA- und RNA- Moleküle und lag zwischen 1% und 3% (w/v).
Vor dem Auftragen wurden die Proben mit 1/6 Vol. 6x DNA- Auftragspuffer (Loading
buffer) versetzt. Zusätzlich wurde auf dem Gel eine bekannte Referenz (DNA-
Längenstandard) aufgetragen, um das Molekulargewicht der aufgetrennten Fragmente
zu bestimmen. Die Elektrophorese erfolgte in 1x TAE- Puffer bei einer Spannung von 5
V/cm. Das in die DNA- und RNA- Moleküle interkalierte EtBr wurde anschließend zur
Visualisierung der Fragmente unter UV- Licht zur Fluoreszenz gebracht. Zur Agarose-
Gelelektrophorese wurden folgende Puffer und Lösungen verwendet:
Agarosegel:
Agarose: x mg
50xTAE- Puffer: 600µl
EtBr (10mg/ml) 2µl
H2O (bidest.): auf 30ml
1 x TAE- Laufpuffer: 10ml 50xTAE- Puffer mit H2O auf 500ml
6x DNA- Auftragspuffer: 0,25% (w/v) Bromphenolblau
0,25% (w/v) Xylencyanol
30% (v/v) Glycerin
50mM EDTA
2.2.6 Polyacrylamid- Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA- Fragmenten
Die Auftrennung von DNA- Fragmenten aus Restriktionsanalysen im Größenbereich
20-200 Bp erfolgte in vertikalen Minigel- Apparaturen in 1mm dicken 5 x 10cm großen
2. Material und Methoden 68
Gelen (BioRad, München). Die Konzentration an Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) im
Gel richtete sich nach der Größe der aufzutrennenden DNA- Fragmente und lag
zwischen 10% und 15%. Nach Zugabe von 1/100 Volumen TEMED und 1/10 Volumen
10%iger Ammoniumpersulfatlösung und Polymerisation der Gele wurden die
Fragmente elektrophoretisch aufgetrennt.Vor der Auftragung wurden die Proben mit 1/6
Vol. 6x DNA- Auftragspuffer versetzt. Zusätzlich wurde auf dem Gel eine bekannte
Referenz (DNA- Längenstandard) aufgetragen, um das Molekulargewicht der
aufgetrennten Fragmente zu bestimmen. Die Elektrophorese erfolgte in 1x TAE- Puffer
bei einer Spannung von 100 Volt über einen Zeitraum von 2-3 Stunden. Nach
Beendigung der Elektrophorese wurden die Gele für 10 Min. in 1x TAE/EtBr- Puffer
(0,5µg EtBr/ml) gefärbt und anschließend für 5 min in H20 entfärbt. Das in die DNA-
Fragmente interkalierte EtBr wurde anschließend- zur Visualisierung der Fragmente -
unter UV- Licht zur Fluoreszenz gebracht. Zur Auftrennung von DNA- Fragmenten
mittels Polyacrylamid- Gelelektrophorese wurden folgende Puffer und Lösungen
verwendet:
Polyacrylamidgel:
40% Acryrylamid/Bisacrylamid (29:1): x ml
50xTAE- Puffer: 200 µl
H2O (bidest.): auf 10 ml
TEMED (N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin)
10%Ammoniumperoxodisulfat (APS)
1 x TAE- Laufpuffer: 10 ml 50xTAE- Puffer mit H2O auf 500 ml.
6x DNA- Auftragspuffer: 0,25% (w/v) Bromphenolblau
0,25% (w/v) Xylencyanol
30% (v/v) Glycerin
50 mM EDTA
2. Material und Methoden 69
2.2.7 Isolierung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen
Zur Aufreinigung von DNA- Fragmenten wurden 1/5 eines Restriktionsansatzes, je
nach Fragmentgröße, auf ein Agarosegel mit einer Konzentration von 1-2% aufgetragen
und elektrophoretisch aufgetrennt. Unter UV- Licht der Wellenlänge
(langwelliges UV- Licht) wurden die entsprechenden DNA- Fragmente mit Hilfe eines
Skalpells aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem Qiaex II Gel extraction kit (Qiagen,
Hilden) nach den Angaben des Herstellers aufgereinigt.
2.2.8 Amplifikation von DNA- Fragmenten mit der Polymerase- Kettenreaktion
(PCR)
Die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) führt zu exponentieller Vermehrung eines DNA-
Abschnittes zwischen zwei an den komplementären Strängen anhybridisierten Oligo-
desoxyribonukleotiden (Saiki et al. 1985; Mullis und Faloona 1987; Saiki et al. 1988).
Im Rahmen dieser Arbeit wurden PCR- Reaktionen für Restriktions-, Mutations- und
Sequenzierungs- Experimente verwendet. Bei allen Amplifikationen wurde dabei die
Platinium Taq DNA- Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe) benutzt, da sie wegen ihrer
„Hot Start- Aktivierung“ ein Vorpipettieren einer großen Anzahl an PCR- Reaktions-
Ansätzen ermöglicht. Die typische Zusammensetzung eines PCR- Ansatzes war wie
folgt:
PCR- Mix (1fach): 100 ng Template- DNA (genomische)
10 pmol Vorwärts- Oligodesoxyribonukleotid
10 pmol Rückwärts- Oligodesoxyribonukleotid
5 µl 10x Taq- Polymerase- Puffer mit 1,5 mM MgCl2
0,4 µl 25 mM dNTP- Mix
0,2 µl Taq-P olymerase (5 U/µl)
H2O (bidest.) auf 50 µl
25 mM dNTP- Mix: 25 mM dGTP
25 mM dATP
25 mM dTTP
25 mM dCTP
2. Material und Methoden 70
Die PCR- Reaktion wurde in einem MJ-Research PTC- 200 PCR- Thermocycler
(Biozym, Hess. Oldendorf) entsprechend der programmierten Temperaturen für
Strangtrennung (Denaturierung), Oligonukleotid- Hybridisierung und
Strangverlängerung (Elongation) durchgeführt. In der Regel wurden hierzu folgende
Bedingungen gewählt:
Denaturierung: 940C 30 Sek.
Hybridisierung: 600C 60 Sek.
Elongation: 720C 60 Sek.
(25-35 Zyklen)
Abschließend erfolgte ein einzelner Zyklus zur Vervollständigung aller Stränge unter
folgenden Bedingungen :
Denaturierung: 940C 30 Sek.
Hybridisierung: 600C 60 Sek.
Elongation: 720C 5 Min.
Für spezielle Experimente wie Denaturierende Gradientengel Elektrophorese (DGGE)
wurde ein Denaturierungs/Renaturierungs- Programm unter folgenden Bedingungen
durchgeführt:
Denaturierung: 940C 5 Min.
Inkubation: 650C 30 Min.
Inkubation: 370C 60 Min.
Inkubation: 40C hold
Nach Beendigung der Reaktion wurde ein 5µl- Aliquot des Produktes zur Kontrolle
auf einem Agarosegel analysiert.
2. Material und Methoden 71
2.2.9 Quantitative Untersuchung der Genexpression mittels Real- Time RT/PCR
Die Technik der Real- Time RT/PCR (Higuchi et al. 1993; Pfaffl 2001) ermöglicht es,
in einem Reaktionsansatz die tatsächliche und relative Expression von Genen unter
unterschiedlichen Bedingungen zu bestimmen. Hierbei wird über den signifikanten
Einbau eines Fluoreszenz- Farbstoffes (z.B. SYBR- green) die Menge aus cDNA
generiertem PCR- Produkt in Echtzeit bestimmt. Durch den Vergleich mit einem
konstant expremierten „house keeping gene“ (zB. ß- Aktin, Na+K+- ATPase oder
GAPDH), dessen Expression unter verschiedenen Stimuli immer konstant bleibt, lässt
sich dann ermitteln, ob die Transkription des untersuchten Gens ansteigt oder abfällt.
Die Präparation der RNA für die Untersuchungen mit der Real- Time RT/PCR erfolgte
wie unter Punkt 2.2.2 beschrieben aus kultivierten Zellen mit Hilfe des ,,Qiagen RNeasy
Purification Kit‘‘(Fa.Qiagen,Hilden) nach den Anweisungen des Herstellers. Als
Referenz „house keeping gene“ für alle Untersuchungen und Berechnungen der
Induktion/Repression der Transkription der untersuchten Gene diente das GAPDH-Gen.
Ein einzelner Ansatz für ein Real- Time RT/PCR- Experiment setzte sich wie folgt
zusammen:
RT/PCR-Mix (1fach): 500 ng RNA (DNAse- verdaut)
2,5 pmol Vorwärts- Oligodesoxyribonukleotid
2,5 pmol Rückwärts- Oligodesoxyribonukleotid
2,5 µl SYBR -green ( Fa Biorad,München
5,0 µl Q- Solution (Fa. Quiagen,Hilden)
5,0 µl RT/PCR Puffer (Fa. Quiagen,Hilden)
1,0 µl 10 mM dNTP- Mischung
1,0 µl One step RT/PCR Enzymmix ,
(Fa. Quiagen,Hilden)
H2O (bidest.) auf 25 µl
Die Real- Time RT/PCR-Reaktionen wurden in einem Real- Time PCR- Thermocycler
(I- Cycler, Fa. Biorad, München) durchgeführt. In der Regel wurden hierzu die
nachfolgenden Bedingungen gewählt:
2. Material und Methoden 72
cDNA- Synthese-Reaktion:
Inkubation: 500C 30 Min.
Denaturierung: 950C 15 Min.
(1 Zyklus)
Im Anschluss erfolgte aus der so synthetisierten cDNA direkt die PCR- Amplifikation
der zu untersuchenden Gene. Hierzu wurde das folgende Programm verwendet:
Denaturierung: 950C 45 Sek.
Hybridisierung: 590C 45 Sek.
Elongation: 720C 60 Sek.
(47 Zyklen)
Nach Beendigung der PCR- Reaktionen wurde ein 2,5 µl- Aliquot des Produktes auf
einem Agarosegel zur Kontrolle analysiert und anschließend die RT/PCR- Daten
Computer gestützt ausgewertet (siehe auch Punkt 3.8 Ergebnisteil dieser Arbeit).
2.2.10 Denaturierende Gradientengel Elektrophorese (DGGE)
Zum Nachweis von neuen Mutationen in bestimmten Genbereichen gibt es eine
Vielzahl von Verfahren, z.B. Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP),
Heteroduplex- Analyse oder Chemical Mismatch Cleavage (CMC), welche sich
hinsichtlich Sensitivität und Praktikabilität unterscheiden. Im Rahmen dieser Arbeit
wurde die Technik der Denaturierenden Gradientengel Elektrophorese (DGGE)
verwendet, da sie die höchst- mögliche Sensitivität aller Mutations-Nachweis-
Verfahren besitzt (Myers et al. 1985; Nollau und Wagener 1997). Diese Technik basiert
auf dem Prinzip, dass DNA- Fragmente, die sich in ihrer Nukleotid- Zusammensetzung
unterscheiden, unterschiedlich weit in Polyacrylamidgelen mit einem linearen
Denaturans- Gradienten aus Harnstoff/Formamid wandern (Myers et al. 1985; Sheffield
et al. 1989). Zum Nachweis von Mutationen in DNA- Fragmenten mit Denaturierender
Gradientengel Elektrophorese (DGGE) wurden folgende Puffer und Lösungen
verwendet:
2. Material und Methoden 73
Denaturans- Stammlösung 0% :
40% Acryrylamid/Bisacrylamid (37,5:1): 22,5 ml
50xTAE- Puffer: 2,0 ml
H2O (bidest.): auf 100 ml
Denaturans- Stammlösung 100% :
40% Acryrylamid/Bisacrylamid (37,5:1): 22,5 ml
50xTAE- Puffer: 2,0 ml
Formamid p.A(deionisiert): 40,0 ml
Harnstoff (Ultra Qualität): 42,0 g
H2O (bidest.): auf 100 ml
N,N,N`,N`- Tetramethylethylendiamin (TEMED)
10%Ammoniumperoxodisulfat (APS)
1 x TAE- Laufpuffer: 120 ml 50xTAE- Puffer mit H2O auf 6000 ml.
Diese Lösungen wurden durch 0,45µl Filter (Schleicher&Schüll,Dassel) filtriert und
anschließend für 10 Min. in einer Vakuumflasche entgast. Bis zur weiteren Verwendung
erfolgte die Lagerung der Stammlösungen dann bei 40C in einer braunen Flasche über
einen Zeitraum von maximal 1 Monat.
6x DNA- Auftragspuffer: 0,25% (w/v) Bromphenolblau
0,25% (w/v) Xylencyanol
30% (v/v) Glycerin
50 µM EDTA
Herstellen von DGGE- Gelen und Gelelektrophorese von PCR- amplifizierter
DNA
Zum Herstellen von linearen denaturierenden Gradientengelen wurden jeweils 15 ml
100% und 0% Denaturans- Stammlösung mit 1/100 Volumen TEMED und 1/10
Volumen 10%iger Ammoniumpersulfatlösung versetzt. Die rechnerisch auf das
Gelvolumen genau aufeinander abgestimmten Lösungen wurden in einen
2. Material und Methoden 74
Gradientenmischer gegeben und von dort über eine peristaltische Pumpe mit einer
Pumpgeschwindigkeit von 5ml/Min. in die Gelkammer geleitet. Dabei wurde der
hochkonzentrierten Gel- Lösung im vorderen Gefäß des Gradientenmischers
kontinuierlich niederkonzentrierte Lösung zugemischt, sodass die Konzentration an
Denaturans in der Gelkammer linear von unten nach oben abnahm. Für die
Elektrophorese wurden jeweils 5µl PCR- Produkt mit 1/6 Vol. 6x DNA- Auftragspuffer
versetzt und auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte in einer eigens für die
DGGE speziell umgebauten Elektrophorese- Einheit (siehe Punkt 3.1 Ergebnisse dieser
Arbeit), bei einer konstanten Temperatur von 600C in 1x TAE- Puffer über einen
Zeitraum von 5 Stunden und einer Spannung von 120 Volt. Nach Beendigung der
Elektrophorese wurden die Gele für 10 Min. in 1x TAE/EtBr- Puffer (0,5µg EtBr/ml)
gefärbt und anschließend für 5 Min. in H20 entfärbt. Das in die DNA- Fragmente
interkalierte EtBr wurde anschließend zur Visualisierung der Fragmente unter UV-
Licht zur Fluoreszenz gebracht.
2.2.11 Sequenzierung von PCR- amplifizierter DNA
Zur Sequenzierung von aufgereinigten PCR- Produkten wurden diese zuerst mittels
PCR amplifiziert. Der Reaktionsansatz enthielt neben der DNA- Polymerase und den
Sequenzier- Primern (Vorwärts- Oligodesoxyribonukleotid bzw. Rückwärts-
Oligodesoxyribonukleotid) zusätzlich mit Fluoreszenz- Farbstoff- markierte
Didesoxynukleotide (Big Dye Terminator ddntp´s), die eine vorzeitige Termination
der DNA- Synthese bewirken, wenn sie durch die Polymerase in den wachsenden DNA-
Strang eingebaut werden. Alle bei der Big Dye Terminator- Sequenzierung
verwendeten Chemikalien und Reaktionsgefäße waren frei von Fluoreszenz und
entsprachen den höchstmöglichen Reinheitsgraden. Zur Sequenzierung von PCR-
Produkten wurden folgende Puffer und Lösungen verwendet:
3M Natriumacetat pH 4,6 in H20 (reinst):
96% Ethanol p.A (Ultra- Qualität):
70%Ethanol: 70 ml 96% Ethanol p.A mit H2O (reinst) auf 100 ml
2. Material und Methoden 75
Reaktionsansatz:
Premix (ABI- Big Dye Terminator): 2µl
Aufgereinigtes PCR- Produkt: 50ng
Sequenzier- Primer (10pmol): 2µl
H2O (reinst): auf 10µl
Nach der PCR wurden zu 2
Natriumacetat hinzugegeben und gemischt. Nach Überführung in ein 0,5ml Eppendorf-
Reaktionsgefäß erfolgte die Zugabe von 55 ür 15 Min.
bei 13000 rpm und RT in einer Eppendorf- Zentrifuge abzentrifugiert. Der Überstand
anschließend erneut zentrifugiert und der Überstand wiederum abgenommen. Das Pellet
Template Supression
Reagent, ABI) resuspendiert. Nach einer zweiminütigen Inkubation bei 900C wurde der
Reaktionsansatz sofort auf Eis gestellt und für 10 Min. abgekühlt. Abschließend wurde
der Ansatz in Sequencer- Reaktionsgefäße überführt und der eigentliche
Sequenzierungslauf in einem ABI Prism 310- DNA-Sequencer (Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA) durchgeführt.
2.3 Proteinbiochemische Methoden
2.3.1 In vivo- Kinetikuntersuchungen von Kontroll- und Patientenproben
Der Einfluss von neu identifizierten Defekten des LDL- Rezeptors und des Haupt-
Liganden dieses Rezeptors (Apolipoprotein B-100) auf die in vivo- Situation des
Lipoproteinstoffwechsels wurde im Rahmen einer in vivo- Kinetikuntersuchung im
Vergleich mit Normalprobanden untersucht. Das Studienprotokoll für diese
Untersuchungen wurde von der Ethikkomission der Philipps- Universität Marburg
genehmigt, und jeder Teilnehmer wurde im „informed consent“ genau über die
Untersuchungen aufgeklärt. Eine detaillierte Beschreibung von Normalkollektiv und
Patientenproben erfolgt im Ergebnisteil.
2.3.2 Auswahl der Isotope für in vivo- Kinetikuntersuchungen
Zur Untersuchung der Verstoffwechselung eines menschlichen Proteins können für
Isotopenuntersuchungen grundsätzlich alle in Proteinen vorkommenden Isotope
2. Material und Methoden 76
eingesetzt werden. Isotope eines Elements unterscheiden sich gegenüber den natürlich
vorkommenden Elementen lediglich in der Anzahl der Neutronen im Atomkern und
besitzen dadurch veränderte physikalische Eigenschaften, ansonsten sind sie jedoch
vollkommen chemisch inert. Die Auswahlkriterien für den Einsatz eines bestimmten
Isotops umfassen im Wesentlichen Faktoren wie: 1) Verfügbarkeit des entsprechenden
Tracers. 2) Die Stabilität der Interaktion zwischen Isotop und dem zu detektierenden
Molekül. 3) Applikationsweise und Anreicherung des Tracermaterials im zu
untersuchenden Molekül. 4) Das verwendete Detektionsverfahren zum Nachweis des
Isotops.
Bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurde als
Traceraminosäure 3fach markiertes Deuterium L- Leucin (5,5,5,-2 H3- L- Leucin)
verwendet. Aufgrund der vergleichsweise hohen Anreicherung in Apolipoproteinen
(11,6 % im ApoB- 100, 37 Mol pro Mol Apo A-I) besitzt diese Traceraminosäure auch
bei geringer Gesamtproteinmenge eine hohe Sensitivität im Tracernachweis. Weitere
Kriterien für die Auswahl von (5,5,5,- 2H3- L- Leucin) waren zum Einen, dass L- Leuzin
eine der 10 essentiellen Aminosäuren ist und somit die Plasmakonzentration dieser
Aminosäure unabhängig von endogenen Synthesewegen ist und ihre Zufuhr über die
Nahrungsaufnahme kontrolliert werden kann; zum Zweiten, dass L- Leuzin als
essentielle Aminosäure in relativ niedrigem Plasmaspiegel vorliegt, was aufgrund der
geringen Poolgröße eine niedrigere Tracergabe im Vergleich zur Verwendung von
endogen synthetisierten, nicht-essentiellen Aminosäuren ermöglicht. Des Weiteren ist
die 3fach- Markierung der Aminosäure L- Leuzin mit Deuterium chemisch stabil und
hat sich bereits in anderen Arbeiten bewährt (Colby und McCaman 1979; Schaefer et al.
1997). Nach Qualitätskontrolle (Reinheit > 99,9%) wurden die markierten Aminosäuren
durch die Klinikumsapotheke der Philipps-Universität Marburg in physiologischer
Kochsalz- Lösung aufgenommen, steril filtriert und autoklaviert. Nach abschließender
Testung auf Sterilität und Pyrogenfreiheit wurden sie zur Injektion für in vivo-
Kinetikuntersuchungen verwendet. In Abbildung 12 ist die Strukturformel von (5,5,5,-2H3- L- Leuzin) dargestellt.
2. Material und Methoden 77
Abbildung 12: Strukturformel der Traceraminosäure von [5,5,5-2H3]-L- Leuzin. Die
Sterne markieren die Positionen, an denen die Wasserstoffatome des Leuzins gegen
Deuterium ausgetauscht sind.
2.3.3 Studienprotokoll und Durchführung der in vivo- Kinetikuntersuchungen
Etwa 6 Wochen vor Studienbeginn wurden bei den Patienten, die unter Lipidsenker-
Therapie standen, alle lipidsenkenden Medikamente abgesetzt („wash out Phase“). Des
Weiteren wurden die Patienten angewiesen, 3 Tage vor dem Studientag eine Diät in
Form einer isokalorischen Standardkost einzuhalten. Diese Standardkost enthielt 30
kcal pro kg und setzte sich zusammen aus 20% Eiweiß, 30% Fett, 50% Kohlenhydraten
und max. 300 mg Cholesterin pro Tag. Am Studientag erschienen die Patienten
nüchtern (nach 10- stündiger Nahrungskarenz). Der Studientag selbst verlief unter
Fastenbedingungen, wobei es jedoch erlaubt war, Trinkwasser in beliebiger Menge zu
konsumieren. Die Probanden erhielten in jede Ellenbeuge eine Venenverweilkanüle.
Über den ersten Zugang erfolgte die Tracerapplikation, über den zweiten die
zahlreichen Blutentnahmen. Zu Studienbeginn gegen 8:00 Uhr erhielten die Probanden
eine Bolus- Injektion von 10µmol (5,5,5- D3)- L- Leucin/kg Körpergewicht (KG),
gefolgt von einer konstanten Infusion mittels Infusomat von 10 µmol/kg KG des
Tracers (Cohn et al. 1990; Schaefer et al. 1990). Während der gesamten Studiendauer
von 12 Std. erfolgten nach einem festen Zeitschema insgesamt 18 Blutentnahmen von
jeweils 20 ml EDTA- Blut/Zeitpunkt. Die erste Blutentnahme erfolgte zum Zeitpunk t=
C
C
CH 2
CHH 3C
C
O O
D *
D *D *
-
HH 3N +
2. Material und Methoden 78
0 (vor Bolusgabe), anschließend erfolgten nach Bolus-Gabe und konstanter
Tracerapplikation weitere Blutentnahmen zu den Zeitpunkten: t= 10, 20, 30, 40, 60, 90
Min., und ab Zeitpunkt t=120 Min. beginnend, wurde jeweils stündlich Blut
entnommen.
2.3.4 Gewinnung des Plasmas für die nachfolgenden Experimente
Es wurden pro Zeitpunkt jeweils zwei 10 ml EDTA- Monovetten (mit Kalium EDTA
zur Gerinnungshemmung, Fa. Sarstedt, Nümbrecht) entnommen und diese für 20 Min.
bei 40C und 4000 rpm in einem Laborfuge- Modell GL (Fa. Heraeus, Hanau)
abzentrifugiert. Der Plasmaüberstand wurde vorsichtig mit einer Pasteur- Pipette
abgenommen und in 15 ml Plastikröhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) überführt. Um
eine vorzeitige Degradation der Apolipoproteine zu vermeiden, wurde dem Plasma der
folgende Konservator nach Alaupovic (1µl/ml Plasma) zugesetzt (Alaupovic et al.
1972) :
Alaupovic- Konservator:
Gluthation (reduziert): 5,0 g
EDTA: 2,5 g
- Aminocapronsäure (13,0 g in 90 ml H20 bidest.): 90 ml
Chloramphenicol: (0,2 g in 10 ml Ethanol p.A) 10 ml
Vgesamt: 100 ml
Für die weiterführenden Experimente wurden von jeder Plasma-Probe 1ml zur
Bestimmung der Konzentrationen von Cholesterin, Triglyzeriden, ApoA-I und ApoB-
100 entnommen und in 1ml Eppendorfgefäße überführt. Weitere 750µl- Probe wurde
zur Isolierung der freien Plasmaaminosäuren entnommen. Zur Aufarbeitung der
Lipoproteinfraktionen mittels Ultrazentrifugation wurden 6 ml jeder Probe benötigt, das
restliche Plasma wurde bei -200C eingefroren und der Zellunterstand (buffy coat) für die
molekularbiologischen Untersuchungen verwendet.
2.3.5 Isolierung der freien Plasmaaminosäuren
Für die Berechnung der Kinetik ist wesentlich, dass auf Aminosäure-Ebene ein Steady
State besteht. Hierzu müssen die freien Aminosäuren aus dem Plasma isoliert werden,
um sie anschließend einer Bestimmung mittels Gaschromatografie und
2. Material und Methoden 79
Massenspektrometrie (siehe Punkt 3.8 Ergebnisse dieser Arbeit) zuzuführen. Zu diesem
Zweck wurden jeweils 750µl des Probenplasmas mit 1,5 ml 50%iger Essigsäure
gründlich gemischt und anschließend über Kationenaustauschersäulen (siehe Punkt
2.3.21) gegeben. Die so gewonnenen Proben wurden dann- wie unter Punkt 2.3.22
näher beschrieben- derivatisiert. Die quantitative Bestimmung der Isotopenanreicherung
erfolgte schließlich mit Hilfe der Gaschromatographie und Massenspektrometrie (siehe
Punkt 2.3.23).
2.3.6 Isolierung der einzelnen Lipoproteinfraktionen mittels sequentieller
Ultrazentrifugation
Die sequentielle präparative Ultrazentrifugation ermöglicht die Auftrennung der
einzelnen Lipoproteinfraktionen in mehreren aufeinander folgenden
Zentrifugationsschritten (Gofman et al. 1949; Havel et al. 1955). Das Prinzip basiert auf
den unterschiedlichen Fluktuations- und Sedimentationseigenschaften der
verschiedenen Plasmabestandteile im Schwerefeld der Zentrifuge. Die Plasmaproteine
mit der geringsten Dichte flottieren nach oben und können so nach jedem
Zentrifugationsschritt aus dem Überstand entnommen werden. Der Unterstand wird im
darauf folgenden Schritt mit einer vorgeschriebenen Menge Dichtelösung auf den
Dichtebereich der nächstfolgenden Lipoproteinfraktion gebracht, und es wird erneut
zentrifugiert, sodass schrittweise die verschiedenen Lipoproteinklassen nacheinander
isoliert werden können. In Tabelle 9 sind die verschiedenen Dichtefraktionen der
Lipoproteine aufgeführt:
Tabelle 9: Dichtefraktionen der Lipoproteine.
Lipoproteinfraktionen Dichtebereich in g/ml
Chylomikronen ,VLDL < 1,006
IDL 1,006-1,019
LDL 1,019-1,063
HDL 1,063-1,210
2.3.7 Dichtelösungen und Zentrifugationsbedingungen zur Isolierung der
Lipoproteine
2. Material und Methoden 80
Alle Zentrifugationen wurden in einer Ultrazentrifuge Modell L8- 55M mit einem 50.4
Ti.- Rotor (Fa. Beckmann, USA) unter Hochvakuum durchgeführt. Als
Zentrifugationsgefäße dienten Quickseal- Röhrchen (Beckmann Quickseal System),
welche in Kombination mit der entsprechenden Schneidevorrichtung („Tube Slicer“)
benutzt wurden. Die Zentrifugationsbedingungen zur Isolierung der einzelnen
Lipoproteinfraktionen sind in Tabelle 10 dargestellt. Es wurden folgende
Dichtelösungen verwendet:
KBr- Stammlösung: (d=1,350 g/ml)
0,9% NaCl- Lösung: (d=1,006 g/ml)
KBr- Dichtelösung I: (d=1,019 g/ml)
KBr- Dichtelösung II: (d=1,063 g/ml)
KBr- Dichtelösung III: (d=1,210 g/ml)
Tabelle 10: Zentrifugationsbedingungen zur Isolierung der Lipoproteinfraktionen.
Lipoproteinfraktion Laufzeit/h Umdrehungszahl/min Temp/OC
VLDL 18 49000 4
IDL 18 49000 4
LDL 24 49000 4
HDL 48 49000 4
2.3.8 Isolierung der VLDL- Fraktion
Die Quickseal Zentrifugenröhrchen wurden mit einer Spritzennadel (Microlance 2,19 G
1,5, USA) mit exakt 6 ml Plasma befüllt und mit Hilfe von Metallkappen mit dem
Quickseal Tube Sealer (Fa.Beckmann,USA) zugeschweißt. Die Röhrchen wurden
anschließend in den auf 40C vorgekühlten Festwinkelrotor 50.3 Ti. (Fa.Beckmann,USA)
symetrisch eingesetzt und mittels Quickseal tube spacers (Fa.Beckmann,USA)
stabilisiert. Der Rotor wurde fest verschlossen und die Proben nach den in Tabelle 10
angegebenen Bedingungen zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Röhrchen
vorsichtig (ohne Erschütterung) mit einer Pinzette aus dem Rotor entnommen und der
Überstand mittels einer Schneidevorrichtung vom farblich klar unterscheidbaren
Unterstand getrennt. Das Volumen des gewonnenen VLDL- Überstandes wurde in 15
ml Röhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) überführt und mit Dichtelösung d=1,006 g/ml
2. Material und Methoden 81
wieder auf ein Volumen von 6 ml gebracht. Von diesem Ansatz wurden 500µl
entnommen und zur Bestimmung von Apolipoproteinen, Cholesterin und Triglyzeriden
verwendet. Das übrige Material wurde bis zur weiteren Bearbeitung bei 4 °C
aufbewahrt. Der gewonnene Unterstand wurde zur IDL- Isolierung eingesetzt.
2.3.9 Isolierung der IDL- Fraktion
Der VLDL- Unterstand wurde mit einer Spritzennadel aus der unteren Hälfte des
Röhrchens entnommen und das Röhrchen mit Kaliumbromid- Dichtelösung d=1,006
g/ml gespült. Sowohl Spüllösung als auch Unterstand wurden in neue
Zentrifugenröhrchen überführt, und das Volumen wurde durch Zugabe von
Dichtelösung d=1,006 g/ml auf 5 ml gebracht. Zum Dichtewechsel VLDL nach IDL
(d=1,019 g/ml) wurde zu den Proben 188,6µl Kaliumbromid- Stammlösung (d=1,35)
zugegeben. Die Proben wurden gemischt mit Dichtelösung d=1,019 g/ml, wiederum auf
ein Volumen von 6 ml aufgefüllt, anschließend verschweißt, in den Rotor gestellt und
unter den in Tabelle 10. angegebenen Bedingungen zentrifugiert. Nach Zentrifugation
wurde der visuell unterscheidbare Überstand wiederum geschnitten, mit Spritze und
Kanüle sorgfältig nach Nachspülen mit Dichtelösung d=1,019 g/ml in ein 15 ml
Röhrchen überführt und auf ein Volumen von 6 ml aufgefüllt. Von diesem Ansatz
wurden wie bei der VLDL- Fraktion 500µl entnommen und zur Bestimmung von
Apolipoproteinen, Cholesterin und Triglyzeriden verwendet, der Rest wurde bis zur
weiteren Bearbeitung bei 40C aufbewahrt. Aus dem Unterstand erfolgte die Gewinnung
der LDL- Fraktion.
2.3.10 Isolierung der LDL- Fraktion
Der IDL- Unterstand wurde wie bei der VLDL- Fraktion durch Spülen mit
Kaliumbromid- Dichtelösung d=1,019 g/ml gewonnen und auf ein Volumen von 5 ml
aufgefüllt. Nach Überführung in ein neues Zentrifugenröhrchen wurde die Dichte durch
Zugabe von 740,8µl KBr- Stammlösung (d=1,35 g/ml) auf die Dichte der LDL von
d=1,063 g/ml eingestellt und mit Dichtelösung d=1,063 g/ml auf 6 ml aufgefüllt.
Anschließend erfolgte die Zentrifugation zur Gewinnung der LDL- Fraktion. Nach
Zentrifugation wurden Über- und Unterstand mittels Schneidevorrichtung voneinander
getrennt, der Überstand nach Entnahme von 500µl Probe zur Cholesterin-, Triglyzerid-
und Apolipoproteinbestimmung bei 40C gelagert und der Unterstand zur HDL-
Isolierung weiter verwendet.
2. Material und Methoden 82
2.3.11 Isolierung der HDL- Fraktion
Im letzten Zentrifugationsschritt erfolgte die Isolierung der HDL- Fraktion. Hierbei
wurde der LDL- Unterstand in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt, und es wurde
mit Kaliumbromid- Dichtelösung d=1,063 g/ml auf ein Volumen von 5 ml aufgefüllt.
Nach Zugabe von 1,18 g Kaliumbromid wurden die Röhrchen verschlossen, das
Kaliumbromid durch Schütteln in Lösung und die Probendichte hierdurch auf d=1,21
g/ml gebracht. Anschließend wurden die Proben mit Dichtelösung d=1,21 g/ml auf ein
Volumen von 6 ml gebracht, in Quickseal- Röhrchen überführt, und es erfolgte die
Zentrifugation zur Gewinnung der HDL- Fraktion. Nach Zentrifugation wurden Über-
und Unterstand durch Schneiden von einander getrennt und mit Dichtelösung d=1,21
g/ml auf ein Volumen von jeweils 5 ml gebracht. Aus dem HDL- Überstand wurden
500µl zur Bestimmung von Apo A-I und HDL- Cholesterin entnommen und der Rest
der Probe bis zur weiteren Aufarbeitung bei 40C gelagert. Der Unterstand wurde bei -
200C tief gefroren.
2.3.12 Lipidologische Labordiagnostik
Bestimmung von Gesamtcholesterin, HDL- Cholesterin und Triglyzeriden
Die Quantifizierung der Plasmakonzentrationen von Gesamtcholesterin, HDL-
Cholesterin und Triglyzeriden erfolgte durch kommerziell erhältliche enzymatische
Assays (Fa. Roche, Mannheim). Es wurde die CHO- PAD- Methode (Aufenanger et al.
1988) zur Cholesterin- Messung und die GPO- PAP- Methode für die
Triglyzeridbestimmungen verwendet (Zoppi 1985). Zur Ermittlung der Plasma-
Cholesterinkonzentration wurden jeweils 10µl Probandenserum eingesetzt. Die
Cholesterinbestimmung aus den UZ- isolierten Lipoproteinfraktionen erfolgte aus
jeweils 100µl der VLDL und IDL- Fraktionen und je 20µl der LDL und HDL-
Fraktionen. Zur Triglyzeridbestimmung betrug das eingesetzte Probenvolumen 10µl für
das Serum, 50µl für die VLDL- Fraktionen und jeweils 100µl für die IDL-, LDL- und
HDL- Fraktionen.
Messung der Apolipoproteine Apo A-I, Apo B, Apo E und Lp(a) durch
Nephelometrie
Die Nephelometrie ist ein immunologisches Verfahren zur Protein- Quantifizierung.
Hierbei bilden sich spezifische, gegen das zu quantifizierende Protein gerichtete,
Antisera, Antigen- Antikörper- Komplexe in der Probe aus, durch die anschließend ein
2. Material und Methoden 83
geschickter Lichtstrahl gestreut wird. Die Intensität des Streulichts wird von einem
Photodetektor erfasst und gegen einen Referenz-Standard quantifiziert. Die
quantitativen Bestimmungen von Apolipoprotein A-I und Apolipoprotein B-100 wurden
mit einem Behring Nephelometer Modell- 100 (Fa.Behring, Marburg) bestimmt.
Hierfür wurden die entsprechenden Testschemata (Siedel et al. 1988) sowie die
entsprechenden kommerziell erhältlichen Antisera, Standards, Kontrollen und Puffer der
Fa. Behring eingesetzt. Es wurde 200µl Probenvolumen eingesetzt. Gegen eine mit
bekanntem Proteingehalt generierte Eichgerade ermittelte das Gerät vollautomatisch den
Apo A-I- Gehalt der Serum- und HDL- Proben sowie den ApoB- 100- Gehalt der
Serum-, VLDL-, IDL- und LDL- Proben. Die Bestimmung der Lipoprotein (a)-
Konzentration erfolgte analog. Hierfür wurden die entsprechenden Testschemata sowie
kommerziell erhältliche Antisera, Standards, Kontrollen und Puffer der Fa. Behring
eingesetzt (N- Latex Lp(a) Reagenz, N Lp(a) Kontrolle SY, N Lp(a) Standard SY, Fa.
Behring, Marburg). Mit dem Test können Lp(a)- Konzentrationen zwischen 10 bis etwa
160 mg/dl gemessen werden.
2.3.13 Entsalzung von Proteinproben mittels Dialyse
Durch die verwendeten KBr- Dichtelösungen bei den Ultrazentrifugationsschritten
steigt der Salzgehalt in den Proben so hoch an, dass eine saubere Proteinauftrennung in
der Gelelektrophorese nicht mehr gewährleistet ist. Daher wurden die Proben vor der
weiteren Aufarbeitung gegen eine Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung dialysiert. Das
Prinzip der Dialyse besteht in einem Konzentrationsgefälle zwischen zwei durch eine
semipermeable Membran getrennte Räume. Abhängig von der Porengröße der
Membran (cut off) können kleinere Teile einer Lösung durch die Membran hindurch
diffundieren, während größere Moleküle (Proteine, DNA) in den Dialyseschläuchen
zurück gehalten werden. Zur Entsalzung wurden die isolierten Lipoproteinfraktionen in
Dialyseschläuche (Spectra/Por, molecular weight cut off 6000-8000, Durchmesser 14,6
mm, Fa. Serva, Heidelberg) eingefüllt und mit Klemmen (Spectra/Por Closures, Fa.
Spectrum medical industries,USA) verschlossen. Jeweils zehn dieser Schläuche wurden
in ein Plastik- Bechergefäß gehängt, das mit 5 l einer 10 mM
Ammoniumhydrogencarbonat- Lösung gefüllt war. Die Dialyse erfolgte über einen
Zeitraum von 24 Std. unter ständiger Durchmischung mittels eines Magnetrührers bei
einer Temperatur von 40C in einem Kühlraum. Insgesamt wurde die
2. Material und Methoden 84
Ammoniumhydrogencarbonat- Lösung während dieser Zeit dreimal gewechselt, um ein
ständiges Konzentrationsgefälle zu gewährleisten. Nach der Dialyse wurden die Proben
mit Einweg- Plastik- Pasteur- Pipetten in 15 ml Röhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht)
überführt und zur weiteren Bearbeitung bei 40C gelagert oder für eine spätere
Aufarbeitung bei -200C eingefroren.
Dialyse- Stammlösung:
1M Ammoniumhydrogencarbonat: 79,06 g
H2O (bidest.): auf 1000 ml
Dialyse- Lösung:
Dialyse-Stammlösung: 50 ml
H2O (bidest.): 4950 ml
Vgesamt: 5000 ml
2.3.14 Delipidierung von isolierten Lipoproteinfraktionen
Durch den extrem hohen Lipidanteil in den isolierten Proben wird die
Proteinauftrennung mittels Gelelektrophorese empfindlich gestört. Es kommt durch die
Lipide zur Ausbildung eines Lipidfilms im Gel („lipid smearing“) und damit verbunden
zu einer veränderten Mobilität der Proteine in der SDS- Gelelektrophorese. Um dieses
zu verhindern, muss das Delipidierungsverfahren eine vollständige Elimination der
Lipide bei maximaler Schonung der Apolipoproteine gegen die verwendeten
denaturierenden Substanzen gewährleisten. Nach der Delipidierung werden die Proben
in SDS- Probenpuffer aufgenommen. Hier ist darauf zu achten, dass sich die Proben
vollständig im Probenpuffer auflösen, da vor allem bei den extrem großen ApoB-
Molekülen eine starke Tendenz zur Konglomeratbildung besteht. Zur Delipidierung
wurden folgende Lösungen verwendet:
Ethanol/Ether- Gemisch (3:1):
Ethanol p.A: 300 ml
Diethylether p.A 100 ml
V gesamt: 400 ml
2. Material und Methoden 85
Delipidierung von VLDL
Aufgrund des relativ geringen Proteingehalts der VLDL- Fraktion mussten im
Vergleich zu den anderen Fraktionen größere Volumina verwendet werden. Hierzu
wurden jeweils 3,5 ml der dialysierten VLDL- Proben in 4,5 ml Polypropylen-
Spitzröhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) gefüllt und für 12 Stunden unter schonenden
Bedingungen (Programm „drying rate low“) in einer Speed- Vac ankonzentriert. Die
Speed- Vac ist eine Tischzentrifuge mit integriertem Heizblock, an die eine
Vakuumpumpe angeschlossen ist (Speed Vac, bestehend aus: Konzentrator Speed- Vac
SVC 100, Rotor RH 24-18, Kühlfalle „Refridgerated Condensation Trap“ RT 100,
Drehschieber Vakuumpumpe vaccubrand Typ RD 4, Fa. Brand, Reutlingen). Das
VLDL- Probenvolumen wurde auf ca. 1 ml eingeengt und anschließend mit 3 ml eines
Ethanol/Ether- Gemischs (Volumenverhältnis Ethanol/Diethylether 3:1) gemischt und
bei -200C für 18 Stunden inkubiert. Danach wurden die Proben bei 40C und 4000 rpm
für 20 Min. abzentrifugiert (Laborfuge GL, Fa. Heraeus Christ) und der Überstand
vorsichtig mit einer Wasserstrahlpumpe auf ein Restvolumen von ca. 0,5 ml abgesaugt.
Das VLDL- Pellet im Probenröhrchen wurde daraufhin in einem Kältebad aus Methanol
und Trockeneis mit einem Homogenisatorstempel zerkleinert. Anschließend erfolgte ein
weiterer Delipidierungsschritt, bei dem das zerkleinerte Pellet mit 3,5 ml Ethanol/Ether
gemischt wurde und für 1 Stunde bei -200C inkubiert wurde. Nach erneuter
Zentrifugation und Absaugen des Überstandes wurde das Pellet abermals im Kältebad
zerkleinert. Zur vollständigen Delipidierung wurde das VLDL- Pellet mit 3 ml
Diethylether gemischt und nochmals für eine Stunde bei -200C inkubiert. Danach wurde
erneut zentrifugiert, der Überstand komplett abgesaugt und das Pellet in 170µl SDS-
Probenpuffer gelöst. Um ein Aufsteigen der Proben aus den Geltaschen zu vermeiden,
wurde der noch in der Probe verbliebene Ether durch eine 20- minütige Begasung mit
Stickstoff entfernt. Die Proben wurden im nachfolgenden Schritt in der SDS-
Gelelektrophorese aufgetrennt.
Delipidierung von IDL
Die Delipidierung sowie die weitere Bearbeitung der IDL- Fraktionen entspricht der
Vorgehensweise der unten beschriebenen LDL- Aufarbeitung.
2. Material und Methoden 86
Delipidierung von LDL
Der hohe Gehalt an hochmolekularem Apolipoprotein B-100 gestaltet die LDL-
Delipidierung schwieriger als die der anderen isolierten Lipoprotein- Partikel.
Besonders bei Proben, die über einen längeren Zeitraum bei -200C tiefgefroren waren,
kann es problematisch werden, das hochmolekulare ApoB- 100 durch Delipidierung mit
Ethanol/Ether wieder in Lösung zu bringen. Eine möglichst zeitnahe Delipidierung der
isolierten LDL ist daher von Bedeutung. Da die LDL einen höheren
Apolipoproteingehalt haben als VLDL, wurden für die Delipidierung 0,5 ml der
dialysierten LDL- Proben verwendet. Die Proben wurden in 4,5 ml
Polypropylenröhrchen überführt und 3.5 ml Ethanol/Ether hinzugegeben. Die Proben
wurden analog zur VLDL- Aufarbeitung bei -200C inkubiert, abzentrifugiert, der
Überstand mit der Wasserstrahlpumpe abgesaugt und dann das Pellet mit dem
Homogenisatorstempel zerkleinert. Dieser Delipidierung- Schritt wurde zweimal
wiederholt. Danach wurde das Pellet in 3 ml Diethylether aufgenommen, für eine
Stunde bei -200C inkubiert, abzentrifugiert, der Überstand abgesaugt und das Pellet
zerkleinert. Die Probe wurde daraufhin in 170µl SDS- Probenpuffer aufgenommen und
zur Entfernung des noch verbliebenen Ethers für 20 Min. mit Stickstoff bedampft.
Delipidierung von HDL
Zur Delipidierung der HDL- Proben wurde jeweils 1 ml der dialysierten HDL-
Fraktionen verwendet. Im Vergleich zur LDL- Aufarbeitung ist nur ein Delipidierungs-
Schritt mit einer Inkubation bei -200C über Nacht für eine saubere Proteinauftrennung
in der SDS- Gelelektrophorese erforderlich. Ansonsten war der Ablauf identisch mit
dem Protokoll der LDL- Isolierung .
2.3.15 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford
Die Proteinkonzentration in Lösung wurde durch die Bradford- Methode bestimmt
(Bradford 1976). Die Messung basiert auf der Absorptionsänderung des gebundenen
Farbstoffes Coomassie- Brilliant- Blau bei einer Wellenlänge von = 595nm im
Vergleich zum ungebundenen Farbstoff, in Abhängigkeit zur Proteinkonzentration. Der
Farbstoff bindet dabei an basische (Ausnahme Arginin) und aromatische
Aminosäurereste. Als Referenz der gemessenen Proteinkonzentration der Probe diente
die Eichkurve eines Standardproteins, in aller Regel BSA verschiedener bekannter
Konzentrationen (1, 2, 5, 10, 20 und 30µg). Zur Bestimmung der Proteinkonzentration
2. Material und Methoden 87
wurde eine im Handel erhältliche, konzentrierte Bradford- Reagenzlösung (Fa.BioRad,
München) 1:5 mit 0,9% NaCl- Lösung verdünnt. Jeweils 1 ml dieser verdünnten
Farbstofflösung wurde mit 20µl der Proteinprobe unbekannter Konzentration vermischt
und die optische Dichte bei der Wellenlänge
Messwert wurde anschließend mit den Daten der Eichkurve verglichen und über diese
die Proteinkonzentration ermittelt.
2.3.16 SDS- Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS- PAGE)
Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen erfolgte unter denaturierenden
Bedingungen durch die diskontinuierliche, eindimensionale SDS- Polyacrylamid- Gel-
elektrophorese nach Laemmli (Laemmli 1970). Polyacrylamid als Trägermedium besitzt
den Vorteil, dass es chemisch inert ist und zudem die Porengröße des Gels durch
unterschiedliche Konzentrationen von Acrylamid und Bisacrylamid leicht variiert
werden kann. Durch Zusatz von SDS zum Proteingemisch werden praktisch alle
nichtkovalenten Wechselwirkungen in den nativen Proteinen zerstört. Ferner wird ein
SDS/Protein- Komplex gebildet, dessen stark negative Ladung dem Molekulargewicht
des Proteins ungefähr proportional ist. Die Wanderungsgeschwindigkeit in SDS-
haltigen Gelen ist somit alleine durch das Molekulargewicht eines unmodifizierten
Proteins und durch den Vernetzungsgrad des Gels bestimmt. Zur Aufarbeitung der UZ-
isolierten Lipoproteinfraktionen aus den in vivo- Kinetik-Untersuchungen wurden für
präparative Zwecke spezielle SDS- Gradientengele verwendet, die eine optimale
Auftrennung der Lipoproteine über einen breiten Molekulargewichtsbereich
ermöglichen. Die Elektrophorese für präparative Zwecke erfolgte in einem “Protean II
xi Vertical- Electrophoresis System“ (Fa. BioRad, München) in 20 x 15cm x 1,5mm
Gelen. Für analytische Zwecke wurden die Proteine entsprechend in SDS- Mini-
Gradientengelen in einer Mini- Gelapparatur (Fa. BioRad, München) aufgetrennt.
Herstellung der SDS- Gele und benötigte Gellösungen
Für die Herstellung der SDS- Gele wurden die Polyacrylamid- Gellösungen zwischen
zwei durch Sandwichklammern zusammengehaltene, auf einer Gummidichtung
stehende Glasplatten, eingefüllt. Die Zusammensetzung der verschiedenen Gellösungen
für die SDS- Gradientengelelektrophorese (zur Herstellung von zwei Gradientengelen)
war wie folgt:
2. Material und Methoden 88
3,5% Vorlaufgel:
45% Acrylamid: 1,4 ml
1,6% Bisacrylamid: 1,4 ml
0,5M Tris/HCl (pH 6,8): 5,0 ml
4% SDS- Lösung: 1,0 ml
H2O (bidest.): 10,8 ml
TEMED: 30,0 µl
0,56% APS: 1,4 ml
5% Trenngel I:
45% Acrylamid: 3,5 ml
1,6% Bisacrylamid: 2,1 ml
1,5M Tris/HCl (pH 8,8): 7,0 ml
4% SDS- Lösung: 1,4 ml
H2O (bidest.): 14,0 ml
TEMED: 50,0 µl
0,56% APS: 2,1 ml.
15% Trenngel II:
45% Acrylamid: 20,8 ml
1,6% Bisacrylamid: 3,2 ml
1,5M Tris/HCl (pH 8,8): 15,0 ml
4% SDS- Lösung: 1,6 ml
H2O (bidest.): 16,2 ml
TEMED: 80,0 µl
0,56% APS: 3,2 ml
Zum Herstellen der Gele wurde die 15%ige Gellösung bis zu einer Höhe von 9 cm in
die Kammern gefüllt und anschließend vorsichtig mit 5%iger Gellösung bis zu einer
Höhe von ca. 12,5 cm überschichtet, sodass sich an der Übergangszone ein
Dichtegradient bildete. Die Gellösungen wurden mit H2O (bidest.) überschichtet, um
eine saubere obere Gelabschlussgrenze herzustellen. Nach einer Polymerisationszeit
2. Material und Methoden 89
von 45 Minuten wurde das Wasser vollständig entfernt und das Trenngel mit
Sammelgel (3,5%) überschichtet. In das Sammelgel wurde der Probenkamm
eingebracht und nach Polymerisation wieder entfernt. Die Probentaschen wurden mit
H2O (bidest.) gespült, um noch nicht polymerisierte Lösungsreste zu entfernen.
Gelelektrophorese der aufgearbeiteten Protein- Proben
Die Elektrophoresekammer wurde mit 4 l auf 40C vorgekühlten 1x SDS- Laufpuffer
gefüllt und die Gelkammer eingesetzt. Anschließend wurde das Gel mit jeweils 150µl
Protein- Probe (in SDS- Probenauftrags- Puffer) beladen. Alle Luftblasen, welche den
Gellauf negativ beeinflussen könnten, wurden entfernt. Zur genauen Lokalisation der
Proteinbanden wurde auf jedes Gel ein Protein- Standard (Broad- Range- Standard, Fa
BioRad, München) aufgetragen. Zusätzlich wurden zur Identifizierung der relevanten
Proteine aus den VLDL und HDL- Fraktionen Apolipoprotein- Standards (ApoA-I/
ApoE- Standard, Fa. Calbiochem, Darmstadt) aufgetragen. Anschließend erfolgte die
Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 600V und einer Stromstärke von
60mA über einen Zeitraum von 15 Stunden.
1x SDS- Laufpuffer:
Tris: 30,0 g
Glycin: 144,0 g
SDS: 5,0 g
H2O (bidest.): auf 5000 ml.
1x SDS- Probenauftrags- Puffer:
0,5 M Tris (pH 6.8): 6,0 ml
SDS (4%): 7,0 ml
Glycerin (89%): 8,4 ml
DTT: 0,3 g
Bromphenolblau: 0,03 g
H2O (bidest.): auf 30 ml
2. Material und Methoden 90
2.3.17 Coomassie- Blau- Färbung von Proteingelen
Zur Anfärbung der durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese aufgetrennten Proteine
wurde das Verfahren der Coomassie- Blau- Färbung angewendet. Das Polyacrylamidgel
wurde hierzu etwa 60 Min. bei RT auf einem Tischschüttler bei 60 Upm in Färbelösung
geschwenkt, anschließend die Färbelösung entfernt und das Gel mit mit H2O (bidest.)
gespült. Zur Visualisierung der Proteinbanden wurde das Gel jeweils 3 Mal für 15 Min.
in Entfärbelösung inkubiert.
Färbelösung:
Methanol p.A: 500 ml
Essigsäure (100 %) 50 ml
Coomassie- Blau R- 250: 1,0 g
H2O (bidest.): auf 1000 ml
Entfärbelösung:
Ethanol p.A: 1250 ml
Essigsäure (100%): 500 ml
H2O (bidest.): auf 5000 ml
2.3.18 Immunblot von Proteinen
Zum Nachweis von auf Träger- Membranen immobilisierten Proteinen mit spezifischen
Antikörpern, wurden Immunblot- Experimente durchgeführt. Hierzu wurden die
Proteine zunächst in 8% oder 10%- igen SDS- Polyacrylamidgelen in einer Mini-
Gelapparatur (Fa. BioRad, München) aufgetrennt und anschließend auf eine Membran
übertragen. Als Trägermaterial wurde eine PVDF- Membran (Immobilon P, Fa.
Millipore, Bad Nauheim) verwendet. Zum Transfer der Proteine wurde die elektrische
Ladung der SDS- denaturierten Proteine genutzt (Elektro- Blot). Die Gele wurden
zunächst für 15 Min. in Kathodenpuffer (25mM Tris- HCl; pH 9,4, 40mM Glycin, 20%
(v/v) Methanol) äquilibriert. Anschließend wurden jeweils 2 Blatt Whatman- Papier in
Anodenpuffer 1 (30mM Tris- HCl; pH 10,4, 10% (v/v) Methanol) und Anodenpuffer 2
(25mM Tris- HCl; pH 10,4, 10% (v/v) Methanol) getränkt. Die Membran wurde für 15
Sek. mit Methanol benetzt, danach für 2 Min. mit H2O gewaschen und anschließend für
2. Material und Methoden 91
5 Min. in Anodenpuffer 2 äquilibriert. Nach Äquilibrierung wurde der Blot
folgendermaßen in einer ,,Semidry“- Blot-Apparatur (Fa. Biometra, Bad Nauheim)
geschichtet: Anode: 2 Blatt Whatman getränkt mit Anodenpuffer 1 – 1 Blatt Whatman
getränkt mit Anodenpuffer 2 – Membran – Gel. Kathode: 3 Blatt Whatman getränkt mit
Kathodenpuffer. Innerhalb dieser Anordnung hatten Membran, Filterpapier und Gel
exakt die gleiche Größe, um Seitenströme zu verhindern. Der Transfer erfolgte bei
2,5mA/cm2 für 90 Min. Die Protein- Übertragung wurde durch reversible Färbung der
Membran mit verdünnter Ponceau- Rot- Lösung (Fa. Sigma, Taufkirchen) überprüft.
Alle nachfolgenden Schritte wurden in TBS- Lösungen durchgeführt. Zunächst wurden
freie Bindungskapazitäten mit 5% (w/v) Milchpulver für 60 Min. bei RT abgesättigt.
Die Inkubation mit dem ersten Antikörper erfolgte in TBS- Lösung für 1 Stunde bei RT
bzw. über Nacht bei 40C. Ungebundener Antikörper wurde durch 3- maliges Waschen
der Membran mit 0,5% (w/v) Milchpulver, 0,02% (v/v) Tween bei RT entfernt. Die
Detektion des ersten Antikörpers erfolgte mit einem gegen den ersten Antikörper
gerichteten, HRP- gekoppelten Sekundärantikörper. Nach 1 Stunde Inkubation bei RT
wurde der Blot 3 Mal mit PBS- Lösung gewaschen. Die Identifikation der vom
Antikörper erkannten Proteine erfolgte über die Umsetzung eines Substrates durch das
Enzym HRP (,,Horse Radish Peroxidase‘‘), wobei ein leuchtendes Produkt ,,enhanced
chemiluminescence‘‘(ECL) entsteht, das über Autoradiografie mit der ECL- Technik
der Fa. Millipore, Bad Nauheim, exakt nach den Angaben des Herstellers nachgewiesen
wurde.
Kathodenpuffer (pH 9,4):
Tris: 0,57 g
Glycin : 4,50 g
Methanol p.A: 100 ml
H2O (bidest.): auf 500 ml
Anodenpuffer 1 (pH 10,4):
Tris: 0,57 g
Glycin : 4,50 g
Methanol p.A: 100 ml
H2O (bidest.): auf 500 ml
2. Material und Methoden 92
Anodenpuffer 2 (pH 10,4):
Tris: 0,57 g
Glycin : 4,50 g
Methanol p.A: 100 ml
H2O (bidest.): auf 500 ml
Blockingpuffer (pH 7,4,):
Tris: 0,57 g
NaCl : 4,50 g
Milchpulver: 2,50 g
Tween-20: 100 µl
H2O (bidest.): auf 500 ml
2.3.19 Isolierung von Proteinbanden aus SDS- Gelen und Protein- Hydrolyse
Für die späteren Untersuchungen der Proteine durch Gaschromatografie- Quadrupolen-
Massenspektrometrie (GC/MS) war es erforderlich, die relevanten Proteinbanden aus
den gefärbten SDS- Gradientengelen zu isolieren. Vor dem Ausschneiden der
jeweiligen Banden wurde jedes Gel durch Einscannen mit einem Flachbett-Scanner in
digitaler Form dokumentiert.
Folgende Proteinbanden wurden isoliert:
• VLDL- Gele: ApoB- 100, ApoE
• LDL- Gele: ApoB- 100
• HDL- Gele: Apo A-I, Apo (a)
Die Proteinbanden wurden zu diesem Zweck mit Einmalskalpellen (Disposable Scalpel
sterile, Fa. Finnigan USA) aus den Gelen ausgeschnitten und in Glasröhrchen (Vials
Typ I mit Schraubverschluss und Teflondichtung, temperaturbeständig bis 1500C, Fa.
NeoLab, Heidelberg) überführt. Neben den relevanten Proteinbanden wurde zudem ein
proteinfreies Gelstück, welches als Leerwert (sog. „Blank“) diente, ausgeschnitten, um
mögliche Leucin- Kontaminationen der Gelmatrix in der späteren statistischen
Auswertung zu berücksichtigen. Danach wurden die Gelbanden für 24 Std. bei 600C im
Heizschrank getrocknet und in verschlossenen Glasröhrchen bei RT zwischen gelagert
oder direkt hydrolisiert.
2. Material und Methoden 93
Da die GC/MS- Einheit eine Auswertung hochmolekularer Eiweiße nicht erlaubt,
mussten die getrockneten Protein-Proben durch Hydrolyse in ihre einzelnen
Aminosäurebestandteile aufgespalten werden. Ein wesentlicher Vorteil einer Hydrolyse
des Proteins liegt im Sensitivitätsgewinn für die GC/MS, da die Traceranreicherung
(Ratio: markierte Aminosäure/nicht markierte Aminosäure) hierbei wesentlich höher ist
als in Relation zur Gesamtproteinmasse. Zur Aufspaltung der Peptidbindungen wurden
zu den getrockneten Protein- Banden jeweils 3 ml Hydrolyse- Lösung gegeben und die
Proben kurz mit Stickstoff bedampft, um den Sauerstoff zu entfernen. Die Glasröhrchen
(Vials Typ I mit Schraubverschluss und Teflondichtung, temperaturbeständig bis 1500C,
Fa. Neo Lab, Heidelberg), wurden anschließend sofort verschlossen und für 24 Std. bei
1100C im Heizblock inkubiert. Nach der Hydrolyse wurden die Proben aus dem
Heizblock genommen und bei RT abgekühlt. Danach wurde zum Entfernen der
verbliebenen Gelmatrix kurz abzentrifugiert und der Überstand mittels Einmalpipetten
in 5 ml Polypropylen- Röhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) überführt und danach der
Salzsäureüberstand durch Eintrocknen in der Speed- Vac entfernt.
Hydrolyse- Lösung:
6 N HCl- Lösung: 999,5 ml
ß- Mercaptoethanol: 500,0 µl
V gesamt: 1000 ml.
2.3.20 Isolierung der Aminosäuren über Ionenaustauscherchromatografie
Um das Hydrolysat von noch verbliebenen Gelmatrix-Resten und anderen
Verunreinigungen zu befreien, wurden die hydrolysierten Proben über
Kationenaustauscherchromatografie aufgereinigt. Das Prinzip dieser Methode basiert
darauf, dass die Aminosäuren im sauren Milieu in Kationenform vorliegen und an die
negativ geladenen Sulfonsäuregruppen (R-SO3--) des Säulenmaterials binden können,
während neutrale und negativ geladene Moleküle nicht binden können (Wolfe 1984).
Das Eluieren der gebundenen Aminosäuren erfolgt dann im basischen Milieu durch
Spülung mit Ammoniaklösung. In diesem Milieu besitzen die Aminosäuren eine
negative Nettoladung und werden von den NH4- Ionen aus der Sulfonsäurebindung
verdrängt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden kommerziell erhältliche
2. Material und Methoden 94
Ionenaustauschersäulen (Prefilled Poly- Prep Columns AG- 50W- X8, Fa. BioRad,
München) verwendet, die mit einer Kunstharz- Matrix gefüllt waren, an die
Sulfonsäurereste kovalent gekoppelt waren.
Kationenaustauscherchromatografie der hydrolisierten Proteine
Um eine durch das Säulenmaterial bedingte Kontamination auszuschließen, wurden
diese vor dem Probenauftrag vorbehandelt. Zu diesem Zweck wurden die Ausgänge der
Fertigsäulen geöffnet und die enthaltene Pufferlösung aus den Säulen heraus gelassen.
Anschließend wurden die Säulen mit 4 ml einer 8% Ammoniaklösung voreluiert,
danach mit 10 ml H2O (bidest.) durchgespült und schließlich mit 50% Essigsäure
wieder äquilibriert. Die hydrolysierten Proben wurden mit 3 ml einer 50%
Essigsäurelösung vollständig in Lösung gebracht und auf die Säulen aufgetragen.
Anschließend wurden die Säulen zuerst mit 10 ml H2O (bidest.) nachgespült und
schließlich die Aminosäuren von der Säulenmatrix mit 4 ml 8% Ammoniaklösung
eluiert. Das Eluat wurde in Glasröhrchen aufgefangen und diese bis zur weiteren
Aufarbeitung bei -200C eingefroren.
Kationenaustauscherchromatografie der freien Plasmaaminosäuren
Die Vorbehandlung der Säulen erfolgte wie oben beschrieben. Jeweils 700µl der freien
Plasmaaminosäuren wurden mit 1,4 ml 50% Essigsäure gemischt und über die
äquilibrierten Säulen gegeben. Die Elution von den Säulen erfolgte wie bei den
hydrolysierten Proben. Das Eluat wurde in Glasröhrchen bis zur weiteren Aufarbeitung
bei -20 0C eingefroren.
2.3.21 Derivatisierung der Aminosäuren für die GC/MS
Der Derivatisierungsprozess der Aminosäuren zu Heptafluorobuturylisopropylestern ist
die chemische Umwandlung der Aminosäuren in eine flüchtige und thermisch stabile
Form für die gaschromatografische und massenspektrometrische Detektion. Durch die
Umwandlung sind zudem Rückschlüsse auf funktionelle Gruppen, eine spezifische
Massenverschiebung und eine verbesserte Steuerung der Fragmentierungsrichtung
möglich. Das im Rahmen dieser Arbeit angewandte Derivatisierungsverfahren hat sich
bereits in mehreren Untersuchungen für die Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin
(MacKenzie und Tenaschuk 1974; Ford et al. 1985; Schweer et al. 1996; Schaefer et al.
1997), bewährt. Für die Derivatisierung der Aminosäuren wurde ein kommerziell
erhältlicher „Derivatisierungs- Kit“, bestehend aus: Heptafluoro- buttersäureanhydrid
2. Material und Methoden 95
(HFBA), Isobutanol und Acetyl- Chlorid (HFBA- IBA amino acid derivatization kit, Fa.
Alltech, USA.), verwendt. Zu diesem Zweck wurde unter Kühlung auf Eis durch
schrittweise Zugabe von 2,5 ml Acetyl- Chlorid zu 5 ml Isobutanol eine Isobutanol-
HCl- Lösung hergestellt. Die mit Ammoniaklösung eluierten Proben aus 2.2.19 wurden
in der Speed Vac lyophilisiert und anschließend mit 400µl Isobutanol- HCl- Lösung
versetzt und für 1 Std. bei 1100C im Heizblock inkubiert. Nach Abkühlen auf RT
wurden die Proben in der Speed Vac eingetrocknet und mit je 200µl Ethylacetat (99,8
%, Fa. Merck. Darmstadt) und 150µl HFBA gemischt und für 10 Min. bei 1500C im
Heizblock inkubiert. Nach erneutem Abkühlen wurden die Proben in der Speed Vac
lyophilisiert und daraufhin in definierten Mengen an Ethylacetat gelöst (VLDL 30µl,
IDL-, LDL-, HDL jeweils 50µl, freie Plasmaaminosäuren 100µl), die sich nach der
Konzentration der tracermarkierten Aminosäuren in den einzelnen
Lipoproteinfraktionen richteten. Die gelösten Proben wurden in speziell für die GC/MS-
Analytik vorgesehene Probengefäße (Combo- Pack, Fa. Ass- Chem, USA) überführt,
mit gummierten Metalldeckeln verschlossen und bis zur GC/MS- Analyse bei -200C
aufbewahrt.
2.3.22 Gaschromatografie / Massenspektrometrie (GC/MS)
Die Bestimmung der Isotopenanreicherung in den aufgearbeiteten Studienproben
erfolgte mittels kombinierter, gaschromatografischer/massenspektrometrischer Analyse
(GC/MS- MS) der Heptafluorobuturylisopropylester- Derivate der Aminosäuren
(Schweer et al. 1996). Da komplexe organische Substanzgemische durch ihr
massenspektrometrisches Verhalten nicht immer eindeutig zu unterscheiden sind,
erfolgte im ersten Schritt zuerst eine gaschromatografische (GC) Auftrennung. Im
zweiten Schritt erfolgte dann die Ionisierung der Zielionen in der Ionisationskammer
und deren massenspektrometrische Analyse mittels Triple- Stage- Quadrupole-
Massenspektrometrie (MS). Durch dieses extrem sensitive Verfahren ist es möglich,
selbst kleinste Traceranreicherungen zu bestimmen. Experimente mit
Verdünnungsreihen haben gezeigt, dass sich die markierte Aminosäure bis zu einer
Menge von 5-10pg/20ng unmarkierter Aminosäure nachweisen ließ (Schweer et al.
1996). Besonders Proteine mit einem sehr langsamen Turnover wie z.B. Apolipoprotein
A-I und ApoB- 100 (Fraktionelle Katabolismusrate (FCR) <1%) können mit diesem
Verfahren gut erfasst werden. Die Bezeichnung Tracer/Tracee beschreibt das Verhältnis
2. Material und Methoden 96
(markierte Aminosäure/unmarkierte Aminosäure) und wird vereinfacht auch als
Anreicherung bezeichnet. Die Vermessungen erfolgten mit einem Finnigan MAT TSQ
700 Gaschromatograf/Tandem-Massenspektrometer.
Gaschromatografie (GC)
Das Prinzip der Chromatografie basiert auf der Auftrennung eines Stoffgemisches (sog.
mobile Phase) durch unterschiedliche Absorption an ein Trägermaterial (sog. stationäre
Phase). In der Gaschromatografie liegt das aufzutrennende Stoffgemisch (mobile Phase)
im gasförmigen Zustand vor und wird mit Hilfe eines inerten Trägergases durch die
stationäre Phase geleitet. Diese besteht aus einem mit nicht flüchtiger Flüssigkeit
getränktem porösen Trägerstoff (Gas- Liquid- Chromatografie,GLC). Während des
Säulendurchlaufs verteilen sich die Probenbestandteile in einer für sie charakteristischen
Weise zwischen beiden Phasen, sodass es zu einer unterschiedlich schnellen Elution
kommt. Die Geschwindigkeit des Transports hängt hierbei von der Löslichkeit des
Gases in der Flüssigkeit ab (Adams 1974). Als Chromatografiesäulen dienten
Quarzkapillarsysteme mit einer Länge von bis zu 15 m, diese weisen eine sehr hohe
Sensitivität und Spezifität bei der Probentrennung auf. Als Trägergas wurde Helium
verwendet. Die Temperaturkontrolle der Säulen erfolgte über einen Ofen, welcher über
ein speziell auf die aufzutrennende Probe abgestimmtes Temperaturprotokoll das
Elutionsprofil festlegte. Zur Ermittlung der Anreicherung kamen hochsensitive
Flammenionisationsdetektoren oder Elektronen- Einfang- Detektoren zum Einsatz.
Über dieses Verfahren gelang eine Separation weitgehend reiner Einzelsubstanzen,
welche anschließend in der angeschlossenen Ionisationskammer durch
Elektronenbeschuss geladen und massenspektrometrisch analysiert wurden. Die
eingesetzte Menge an Probe (je nach Protein 0,5-2µl) wurde voll automatisch vom
Gerät mit einer Hamiltonspritze aus den Probengefäßen entnommen.
2. Material und Methoden 97
Tabelle 11: Charakteristika der verwendeten Gaschromatografie.
Merkmale Eigenschaften
Quarzkapillarsäule Länge 15 m,
Innendurchmesser 0,25 mm
Filmdicke 0,25 mm
(J&W- DB %, Fa. Analyt, Mühlheim)
Trägergas Helium
Gasdruck 70 kPa
Injektionstemperatur 2400C
Temperaturprogramm Anfangstemperatur 900C für 1 Min.
Erhöhung um 100C/Min. bis 1800C
Erhöhung um 300C/Min. bis 2800C
nach 2 Min. Abkühlen auf Ausgangstemperatur
Massenspektrometrie (MS)
Für die massenspektrometrische Analyse der gaschromatografisch aufgetrennten Proben
wurden die Proben zunächst ionisiert und anschließend in ein elektrischens Feld
geleitet. Hierbei ist das Verhalten der geladenen Teilchen im elektrischen Feld vom
Verhältnis Masse/Ladung (m/z) abhängig. Bei identischer Ladung der Teilchen erfolgt
eine Auftrennung entsprechend ihrer Masse.
Zur Anwendung kam ein Quadrupol- Tandem-Massenspektrometer, das aus folgenden
Komponenten aufgebaut war:
• Ionisierungskammer
• Trennvorrichtung (Quadrupole)
• Detektor
Ionisierungskammer
Die Applikation der Proben in die Ionisationskammer erfolgte über einen
drucktrennenden Gasseparator.
Die Ionisierung der Probenmoleküle kann entweder durch Elektronenbeschuss
(„Electron Impact“, „EI“) oder chemische Ionisierung („Chemical Ionisation“, „CI“)
erfolgen.
Bei der „EI“ erfolgt die Ionisierung der Moleküle durch einen von einer Glühelektrode
generierten hochenergetischen Elektronenstrahl. Die Elektronen reagieren hierbei unter
2. Material und Methoden 98
Ionenbildung mit den Probenmolekülen. Durch den hochenergetischen
Elektronenbeschuss entstehen Molekülfragmente aus dem Muttermolekül. Über diese
für jedes Molekül charakteristischen Fragmentierungsmuster können auch unbekannte
Moleküle mit Hilfe von Fragmentbibliotheken identifiziert werden. Es ist darüber
hinaus auch möglich, unspezifische Kontaminationen des Probenmaterials zu
identifizieren, indem man den gesamten Massenbereich der kontaminierten Proben
vermisst (sog. Full- Scan) und durch die Fragmentierungsmuster Rückschlüsse auf die
Quelle der Verunreinigung ziehen kann. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass durch
die ausgeprägte Fragmentierung ein Sensitivitätsverlust entstehen kann, da ein
schwaches Signal durch die Fragmentierung zu mehreren noch schwächeren Signalen
wird und letztlich einzelne Signale gar nicht mehr messbar sind.
Die Technik der „CI“ stellt das schonendere Verfahren dar. Hierbei werden ionisierende
Hilfsgase (z.B. Methan, Ammoniak) verwendet, die durch Ladungsaustausch oder
Ionen-Molekül-Reaktionen die zu untersuchenden Probenmoleküle in positiv („Positive
Ion Chemical Ionization, PICI) oder negativ („Negative Ion Chemical Ionization“,
NICI) geladene Ionen überführen. Ein wesentlicher Vorteil dieses Verfahrens im
Vergleich zur „EI“ ist der geringere Einsatz an Energiemengen und damit verbunden
eine minimale Fragmentierung der Probenmoleküle, was in einer Sensitivitätssteigerung
resultiert. Aufgrund dieser Vorteile wurde im Rahmen dieser wissenschaftlichen Arbeit
das „NICI“- Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse verwendet (Garland et al.
1979; Wolfe 1984). Als Hilfsgas wurde Methan eingesetzt.
Trennvorrichtung (Quadrupole)
Als Analysator wurde ein Quadrupole- System benutzt, das aus vier in den Eckpunkten
eines Quadrats parallel zueinander angeordneten 20 cm langen Stabelektroden besteht,
die elektrisch miteinander verbunden sind. An diese Elektroden wird eine konstante
Gleichspannung angelegt, die von einem oszillierenden Wechselstromfeld überlagert
wird, woraus ein Hochfrequenzfeld resultiert, welches die aus der Ionenquelle
kommenden Ionen auf eine oszillierende Flugbahn zwischen den Stabelektronen
zwingt. Die elektromagnetischen Wechselfelder versetzen die Ionen dabei in eine
senkrecht zur Fortbewegungsrichtung stehende Schwingung. Durch diese
Flugbewegung können nur Ionen mit einem bestimmten Masse/Ladungs- Verhältnis
(m/z) die Quadrupole passieren, alle anderen prallen an den Stabelektroden ab und
2. Material und Methoden 99
werden eliminiert. Über eine Variation der Gleich- und Wechselstromfelder lassen sich
gezielt Ionen mit einem bestimmten Masse/Ladungs- Verhältnis (m/z) herausfiltern. Die
entsprechenden Parameter der relevanten Zielmoleküle dieser Arbeit waren für das
Mutterion des D3-markierten L- Leuzin m/z = 366 und für das Mutterion des
unmarkierten L- Leuzin m/z = 363.
Nach Durchlauf der ersten Quadrupole-Einheit wurden Ionen eines bestimmten m/z-
Verhältnisses in einer Argon- Kollisionszelle einer „Collision- Induced- Dissociation“
„CID“) unterzogen. Durch Kollision des Stoßgases Argon mit den beiden Mutterionen
kam es zur gemeinsamen Aufspaltung in Fragmentionen, in dieser Studie in
Fragmentionen mit einem m/z = 280,1.
Die entstandenen Fragmentionen wurden anschließend der zweiten Quadrupole- Einheit
zugeführt und dort über einen Detektor registriert. Die Zuordnung zum jeweiligen
Mutterion erfolgte anhand des Entstehungszeitpunktes der Peaks. Durch diesen zweiten
MS-Schritt wurde die Spezifität des Verfahrens verbessert. Kontaminationen mit
identischen m/z- Verhältnissen wie die der Zielionen, welche in der ersten Messung
noch miterfasst wurden, werden in der zweiten Messung aufgrund des unterschiedlichen
Fragmentierungsmusters eliminiert.
Detektor
Über einen Sekundärionenverfielfacher wurden die Ionenströme registriert und über
eine zusätzliche Verstärkung an einen Oszillographen weitergeleitet. Die Peaks wurden
anschließend mit Hilfe einer speziellen Computer- Software automatisch oder manuell
ausgewertet. In Tabelle 12 und Abbildung 13 sind die technischen Eigenschaften und
der Aufbau des Quadrupol- Tandem- Massenspektrometers aufgezeigt.
Tabelle 12: Charakteristika der Massenspektrometrieeinheit.
Merkmale Eigenschaften
Temperatur der Ionenquelle 1500C
Elektronenenergie 70 eV
Emissionsstromstärke 0,4 mA
Sekundärionenvervielfacher 1400 V
Gasdruck des Methans 50 Pa
Kollisionsgasdruck des Argons 0,2 Pa
Kollisionsenergie 10 eV
2. Material und Methoden 100
Abbildung 13: Aufbau der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Quadrupol- Tandem-
Massenspektrometrieeinheit.
2.3.23 Datenauswertung
Aus den Ergebnissen der GC/MS- Messungen wurden die Anreicherungen der
jeweiligen Proben ermittelt. Diese werden entweder vereinfacht als
Isotopenanreicherung E oder korrekter als Tracer/Tracee- Verhältnis angegeben
(Cobelli et al. 1987; Cobelli et al. 1992). Die Isotopenanreicherung E gibt die relative
Anreicherung des stabilen Isotopes über dem der natürlich vorkommenden
Anreicherung wieder. Die Anreicherung E ist definiert als:
E = q/(Q+q) – qN/(QN+qN)
Q ist definiert als Masse des unmarkierten Hauptisotopes (in diesem Falle 1H) und q als
Masse des Tracerisotopes (hier 3H). qN/(QN+qN) entspricht der natürlich
vorkommenden Isotopenanreicherung vor der Tracergabe (sog. „Natural Abundance“).
Bei der massen-spektrometrischen Bestimmung der Isotopenverhältnisse („Isotope
Ratio“) wird das Verhältnis (R) von Tracer zu Tracee üblicherweise angegeben als:
R = q/Q
So kann die obige Gleichung umgeformt werden in:
E = R/(1+R) – RN/(1+RN)
Cobelli et al. weisen darauf hin, dass bei Studien mit stabiler Isotopentechnik im
Vergleich zu Studien mit radioaktivem Tracermaterial verhältnismäßig viel Material in
das zu untersuchende System eingebracht wird (Cobelli et al. 1992). Mehrere
2. Material und Methoden 101
Arbeitsgruppen schlagen daher vor, die Isotopenanreicherung E durch das tatsächliche
Tracer/Tracee- Verhältnis zu ersetzen (Colby und McCaman 1979; Buckley et al. 1985).
Es gilt:
Tracermasse/Traceemasse = Z(t) = (QI(t)+qI(t))/(QN(t)+qN(t))
Das Verhältnis Z(t) von Tracer/Tracee kann unter Kenntnis der Isotopenanreicherung E
auch bestimmt werden durch:
Z(t) = E(t)/(EI-E(t)
EI entspricht dem infundiertem Tracermaterial über der natürlichen Anreicherung des
Tracers („Natural Abundance“). Für 3D- Leucin liegt diese bei ca. 99,5%. Obige
Gleichung wurde in dieser Studie zur Berechnung der Tracer/Tracee-Werte
(Anreicherung) verwendet.
Die Werte wurden für die in dieser Arbeit relevanten Apolipoproteine errechnet und
gegen die Zeit (t) aufgetragen. Mittels linearer Regression wurde die Steigung der
Kurve berechnet.
Die mittlere Verweildauer („Resident Time“) der Zielproteine entspricht dem Quotient
aus Plateauanreicherung des Präkursors und der Steigung der Tracer/Tracee- Kurve. Die
fraktionelle Katabolismusrate (FCR) errechnet sich aus dem Kehrwert der mittleren
Verweildauer.
Geht man von dem Vorliegen konstanter Plasmaspiegel („Steady State“) der
Zielproteine aus, so wird der pro Zeiteinheit katabolisierte Teil des Plasmapools in
gleicher Zeit durch eine äquivalente Menge neu synthetisierten Materials ersetzt. Im
„Steady State“ ist die fraktionelle Katabolismusrate (FCR) und die fraktionelle
Syntheserate (FSR) gleich groß (FCR=FSR).
Die Produktionsrate (PR) wurde wie folgt berechnet:
PR = (FSR x C x V)/KG
C entspricht dem Plasmavolumen des Zielproteins, KG dem Körpergewicht und V dem
Plasmavolumen (hier als 4% des KG angenommen) (Schaefer et al. 1997).
2. Material und Methoden 102
2.4. Zellbiologische Methoden
2.4.1 Verwendete Zellen und Kulturbedingungen
Folgende Zellen wurden im Rahmen dieser Arbeit eingesetzt:
HeLa: Epithelienartige Adenocarcinoma- Zellen, Mensch, Gebärmutter (ATCC, CCL-
2, Rockville, MD)
Fibroblasten: Primärkulturen aus Haut- Biopsien, Mensch.
Die Kultivierung eukaryontischer Zellen erfolgte in Dulbecco’s Modified Eagle
Medium (DMEM), supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FCS), 2 mM L-
Glutamin, MEM Vitaminen, nichtessentiellen Aminosäuren, 100 U/ml Penicillin und
100µg/ml Streptomycin. Die Zellkulturen wurden in einem Inkubationsschrank in einer
wasserdampfgesättigten Atmosphäre bei 370C und 5% CO2 inkubiert. Alle zwei bis drei
Tage wurden die Zellen passagiert. Als physiologische Lösung wurde in allen
Zellkultur- Experimenten 1x PBS- Puffer eingesetzt
2.4.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Zur dauerhaften Aufbewahrung wurden die Zellen in einem Gemisch aus DMEM-
Medium, 10% FCS und 10% DMSO in flüssigen Stickstoff tiefgefroren. Aus 10
Kulturschalen (Durchmesser 94mm) von 50% konfluenten, adherenten Zellen, wurden
5x2ml Einfrier- Aliquots hergestellt. Dazu wurden die Zellen zuerst trypsinisiert und
anschließend durch resuspendieren in einer 10ml Pipette vereinzelt und in 50ml Falcon
Röhrchen vereinigt. Nach Abzentrifugieren bei 200g und 40C wurden die Zellen mit den
entsprechenden Mengen Medium, DMSO und FCS versetzt. Die Einfrier- Aliquots
wurden zunächst für zwei Stunden bei 4°C inkubiert, bevor sie für 24 h bei -800C
schonend heruntergekühlt wurden, um dann letztendlich in flüssigen Stickstoff
dauergelagert zu werden.
Beim Auftauen wurden die Zellen so kurz wie nur möglich im Einfriermedium
belassen. Die Kryoröhrchen mit den eingefrorenen Zellen wurden dazu im 370C warmen
Wasserbad aufgetaut und anschließend sofort in ein vorbereitetes, mit DMEM-
Komplettmedium gefülltes Falcon Röhrchen, überführt. Nach Abzentrifugieren des
Mediums bei 200 g und 40C für 5 Min. wurden die Zellen in frischem Medium auf die
Zellkulturschalen ausgesät.
2. Material und Methoden 103
2.4.3 Fluoreszenzmarkierung von Lipoproteinpartikeln mit DiI
Zur Fluoreszenzmarkierung von UZ- isolierten Lipoproteinpartikeln (VLDL, LDL,
HDL) für Bindungs und Aufnahmestudien in kultivierten Zellen, wurde der Farbstoff
1,1´- dioctadecyl- 3,3,3´,3´- tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) verwendet.
DiI lagert sich ähnlich wie Phospholipide mit seinen polaren Gruppen in die Oberfläche
der Lipoproteine ein, beeinflusst dabei aber nicht die Bindungseigenschaften der
Lipoproteine (Rezeptor- Liganden). Wesentliche Vorteile gegenüber klassischen,
radioaktiven Markierungsverfahren von Lipoproteinen mit I125 liegen zudem in den
Kosten der Markierung und darüber hinaus darin, dass sich die zelluläre Aufnahme bzw.
Bindung der Lipoproteine in der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie (LSM)
aufgrund der sehr hohen Fluoreszenz des Farbstoffs gut darstellen lässt. Zur Markierung
von Lipoproteinen mit DiI wurden diese wie unter Punkt 2.3.10 beschrieben über
sequentielle Ultrazentrifugation isoliert und anschließend gegen 5 l 1x Markierungs-
Puffer dialysiert, hierbei wurde der Puffer zur vollständigen Entsalzung insgesamt 4x
gewechselt. Danach wurden die Lipoproteine mittels 0,45µM Filter (Fa.
Schleicher&Schüll, Dassel) steril filtriert und die Proteinmenge durch Bradford- Assay
bestimmt. Jeweils 4,5 mg Lipoprotein wurden in ein 15 ml Röhrchen (Fa. Sarstedt,
Nümbrecht) überführt und zur Vermeidung oxidativer Prozesse mit 12µl einer 0.1M
Ascorbinsäure- Lösung versetzt und daraufhin mit 0,9% NaCl- Lösung auf ein
Volumen von insgesamt 12 ml gebracht. Anschließend wurden die Lipoproteine unter
vorsichtigem Schwenken mit jeweils 90µl DiI- Lösung (15 mg DiI gelöst in 1ml
DMSO) vermischt, danach mit Stickstoff bedampft und für 18 Stunden bei 370C unter
Lichtabschluss in einem Wasserbad mit Schüttler inkubiert (Teupser et al. 1996). Nach
der Markierung wurde der nicht eingebaute DiI- Farbstoff entfernt. Zu diesem Zweck
wurden die markierten Lipoproteine mittels Ultrazentrifugation im entsprechenden
Dichtebereich rezentrifugiert, isoliert und unter mehrmaligem Wechseln des Puffers
gegen 0,9% NaCl- Lösung dialysiert. Die markierten Lipoproteine wurden daraufhin
erneut mittels 0,45µM Filter steril filtriert und die Proteinmenge über Bradford- Assay
bestimmt. Bis zur weiteren Verwendung für Bindungs und Aufnahmestudien in
kultivierten Zellen wurden die Lipoproteine bei 40C unter sterilen Bedingungen und
Lichtabschluss aufbewahrt.
2. Material und Methoden 104
1x Markierungs- Puffer (pH 7,4):
Tris: 30,0 g
NaCl: 144,0 g
EDTA: 5,0 g
H2O (bidest.): auf 5000 ml
2.4.4 Herstellen von Lipoprotein defizientem Serum (LPDS) für die Zellkultur
Für die Herstellung von humanem Lipoprotein defizientem Serum (LPDS) für
Zellkultur-Experimente wurde der Unterstand der HDL- Fraktion aus 2.3.11.
(Probendichte d=1,21g/ml) aufgearbeitet. Dieser Unterstand beinhaltet nach der
Isolierung der HDL- Fraktion keine Lipoproteine mehr und kann in Zellbindungs- und
Aufnahmestudien in kultivierten Zellen verwendet werden. Kultiviert man die Zellen
über einen Zeitraum von 48 Stunden in DMEM-Medium welches anstelle von 10%
fötalem Rinderserum (FCS) mit 10% LPDS supplementiert wird, so erfolgt aufgrund
der Lipoproteindefizienz ein Aushungern der Zellen. Dieses führt zu einer
Hochregulation der Genexpression der Rezeptoren für die Aufnahme von Lipoproteinen
(vornehmlich LDL- Rezeptoren) siehe Punkt 1.4.3 dieser Arbeit. Inkubiert man diese
Zellen dann mit Fluoreszenz- markierten Lipoproteinen (z.B. DiI- LDL), so kann
spektrofluorometrisch quantitativ die zelluläre Aufnahme und Bindung dieser
Lipoproteine ermittelt werden. Zur Herstellung von LPDS wurde der Unterstand der
HDL- Fraktion mit 0,9% NaCl- Lösung auf ein Volumen von 5 ml gebracht
(Ausgangsmenge des eingesetzten Plasmas für die sequentielle Ultrazentrifugation), in
Dialyse- Schläuche überführt und anschließend unter mehrmaligem Wechseln des
Puffers gegen 0,9% NaCl- Lösung dialysiert. Das entsalzte LPDS wurde daraufhin
mittels 0,45µM Filter steril filtriert und bis zur weiteren Verwendung bei -200C
aufbewahrt.
2.4.5 Bindungs und Aufnahmestudien mit DiI-markierten Lipoproteinen in
Zellkultur
Zur quantitativen Bestimmung der zellulären Aufnahme und Bindung von DiI-
markierten Lipoproteinen, wurde zuerst die spezifische Fluoreszenz-Intensität in Units
(U) der markierten DiI- Lipoprotein- Präparationen ermittelt. Hierzu wurden
unterschiedliche Mengen des Farbstoffs DiI (0-100ng) in 1ml Zell- Lysis- Reagent
gelöst und anschließend die Fluoreszenz- Intensität FI(U) bei einer Exzitations-
2. Material und Methoden 105
Wellenlänge von 525nm und Emissions-Wellenlänge von 565nm in einem
Spektralfluorometer (Model LS- 5 Fa. Perkin- Elmer, Langen) bestimmt. Aus der
Standardkurve wurde danach die FI(U) pro ng DiI ermittelt. Für die Bestimmung der FI
der DiI- Lipoproteine wurden unterschiedliche Proteinmengen (0, 5, 10, 20, 50, 100,
200, 400, 600 800, 1000, 1200, 1400ng) in 1ml Zell- Lysis- Reagent gelöst und aus der
Standardkurve die FI(U)/ng DiI- Lipoprotein ermittelt. Aus beiden Messungen wurde
anschließend der Einbau (ng DiI/µg Lipoprotein) errechnet, dieser lag in der Regel
zwischen 30-50ng DiI/µg Lipoprotein. Für die Messung der Aufnahme und Bindung
von DiI- LDL in humanen Fibroblasten und HeLa- Zellen wurden Zellen die sich
zwischen Passage 5-10 befanden, in 35- mm Zellkulturschalen ausgesät und für 72
Stunden in DMEM- Medium mit 10% FCS inkubiert. Anschließend wurden die Zellen
3x mit 2 ml PBS gewaschen und für weitere 48 Stunden in DMEM- Medium mit 10 %
LPDS inkubiert. Nach erneutem 3- maligen Waschen mit 2 ml PBS erfolgte zur
Bestimmung der zellulären DiI- LDL- Aufnahme eine 5-stündige Inkubation bei 370C
mit unteschiedlichen Mengen an DiI- LDL (0, 5, 10, 20, 50, 100µg in DMEM mit 10%
LPDS). Die spezifische Aufnahme wurde bei einer Menge von 10µg DiI- LDL mit
einem 50fachen Überschuss an unmarkiertem LDL ermittelt. Zur Messung der DiI-
LDL- Bindung wurden die Zellen für 2 Stunden bei 40C mit 0, 5, 10, 20 und 50µg DiI-
LDL inkubiert, hierbei wurde auschließlich vorgekühltes DMEM- Medium und PBS
verwendet. Die Messung der spezifischen Bindung erfolgte bei einer Menge von 20µg
DiI- LDL unter Kompetition mit einem 50fachen Überschuss an unmarkiertem LDL.
Nach den Inkubationen wurde das Medium abgesaugt und die Zellen insgesamt 4 x mit
2 ml PBS gewaschen, die Lyse der Zellen erfolgte anschließend durch Zugabe von 1 ml
Zell- Lysis- Puffer unter Lichtabschluss durch eine 1- stündige Inkubation bei RT auf
einem Schüttler.
Zell- Lysis- Puffer:
NaOH: 30,0 g
SDS: 144,0 g
H2O (bidest.): auf 5000 ml
2. Material und Methoden 106
Berechnung der zellulär aufgenommenen/gebundenen Menge an DiI- LDL
Nach dem Lysieren der Zellen erfolgte die Bestimmung der
aufgenommenen/gebundenen Menge an DiI- LDL. Hierzu wurden jeweils 200µl Zell-
Lysat aus den jeweiligen Ansätzen in eine speziell für Fluoreszenz- Messungen
geeignete, weiße 96 Well- Platte pipettiert und anschließend die Fluoreszenz- Intensität
FI(U) bei einer Exzitations- Wellenlänge von 525nm und Emissions- Wellenlänge von
565nm in einem Spektralfluorometer (Model LS- 5 Fa. Perkin- Elmer, Langen)
gemessen. Zur Korrektur der „Background“- Fluoreszenz wurde eine Zell- Lysis-
Präparation ohne Inkubation mit DiI- LDL als Leerwert verwendet. Parallel zur
Messung der FI(U) wurde zudem aus allen Ansätzen die Proteinmenge über Bradford-
Assay bestimmt. Die Berechnung der zellulären DiI- LDL- Aufnahme/Bindung (ng
LDL- Protein/mg Zellprotein) setzte sich aus folgenden gemessenen Werten zusammen:
1. DiI- Label: FI(U)/ng DiI- LDL aus Standardkurve.
2. Zellprotein (mg/ml) aus Leerwert.
3. Zellprotein (mg/ml) aus Ansatz.
4. FI(U)/ml gemessen aus Leerwert.
5. FI(U)/ml gemessen aus Ansatz.
Zunächst erfolgt die Korrektur der Background- Fluoreszenz:
FI (U)/ml Ansatz - FI (U)/ml Leerwert = FI (U)/ml korr.
Aus dem gemessenen Zellprotein (mg/ml)Ansatz lässt sich dann die FI/mg Zellprotein
berechnen:
FI (U)/ml korr.: Zellprotein (mg/ml) Ansatz = FI (U)/mg Zellprotein Ansatz
Nach Abzug des analog berechneten Zellprotein- Leerwerts (FI(U)/mg Zellprotein)
erhält man den „Background“- korrigierten Wert des Ansatzes:
FI (U)/ mg Zellprotein korr.
Über die aus der Standardkurve bestimmte Menge des DiI- Labels FI(U)/ng DiI- LDL
lässt sich anschließend die aufgenommene/gebundene Menge an LDL- Protein im
Ansatz berechnen:
DiI- Label FI (U)/ng DiI- LDL : FI(U) /mg Zellprotein korr.= ng DiI- LDL/mg
Zellprotein
2. Material und Methoden 107
Die so ermittelten Daten wurden anschließend mit Scatchard- Plot- Analyse
ausgewertet und über diese die maximale Bindung/Aufnahme (Vmax ) und die Km
ermittelt (Teupser et al. 1996).
2.4.6 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (LSM)
Die konfokale Mikroskopie ermöglicht die Darstellung der Proteinexpression und die
genaue intrazelluläre Lokalisierung von Proteinen in einzelnen, intakten Zellen. Analog
dazu lässt sich auch die Aufnahme und Bindung von Fluoreszenz- markierten Proteinen
z.B. DiI- LDL darstellen. Bei der Immunofluoreszenz- Analyse erfolgt die Detektion
des zu untersuchenden Proteins über Inkubation mit einem spezifischen Primär-
Antikörper, der gegen das nachzuweisende Protein gerichtet ist. Im zweiten Schritt
erfolgt dann eine Inkubation mit einem Fluoreszenzfarbstoff- konjugierten
Sekundärantikörper (FITC bzw. TRITC markiert), welcher dann den an das Protein
gebundenen Primär- Antikörper erkennt. In dieser Arbeit wurde die konfokale
Mikroskopie eingesetzt, um die intrazelluläre Lokalisation des LDL- Rezeptors, sowie
die Aufnahme/Bindung von DiI- markiertem LDL zu analysieren. Die Aufnahmen mit
der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Birgit
Hufnagel (Institut für Pharmazie, Abteilung Prof. Krieglstein, Philipps- Universität
Marburg) mit einem Zeiss 510 Konfokalem Laser Scanning Mikroskop unter
Verwendung eines Argon- Lasers (Zeiss Lasertechnik GmbH, Jena) erstellt. Hierbei
wurden die Bilder elektronisch vergrößert, um eine kleine Gruppe von Zellen darstellen
zu können. Jedes Bild stellte einen optischen Schnitt dar, welcher die Mitte zwischen
Zelloberfläche und Boden des Objektträgers repräsentierte
2.4.7 Konfokale Mikroskopie der zellulären Aufnahme von DiI- LDL
Für die Darstellung der zellulären Aufnahme von DiI- LDL in humanen Fibroblasten
und HeLa- Zellen mittels konfokaler Mikroskopie, wurden Zellen zwischen Passage 5-
10 in 35-mm Zellkulturschalen ausgesät, die mit sterilen Deckgläschen versehen waren.
Die Inkubation der Zellen erfolgte über einen Zeitraum von 72 Stunden in DMEM-
Medium mit 10% FCS, bis eine ausreichende Anzahl von Zellen auf den Deckgläschen
angewachsen war. Anschließend wurden die Zellen jeweils 3x mit 2 ml PBS gewaschen
und danach für weitere 48 Stunden in DMEM- Medium mit 10 % LPDS inkubiert. Die
spezifische Aufnahme an DiI- LDL wurde durch eine 5- stündige Inkubation bei 370C
mit 10µg DiI- LDL (in DMEM- Medium mit 10% LPDS) unter einem 50fachem
2. Material und Methoden 108
Überschuss an unmarkiertem LDL ermittelt. Nach der Inkubation wurde das Medium
abgesaugt und die Zellen jeweils 3 x mit 2 ml PBS gewaschen, um nicht- adhärente
Zellen zu entfernen. Abschließend wurden die Zellen auf den Deckgläschen mit 25µl
„Mounting“- Medium (Vector Laboratories, USA) überschichtet und vorsichtig auf
einen Objekträger aufgelegt. Die Ränder der beiden Glasplatten wurden mit Nagellack
abgedichtet und die Zellen daraufhin wie unter Punkt 2.4.6 beschrieben mit einem
konfokalen Lasermikroskop analysiert.
2.4.8 Immunfluoreszenz- Mikroskopie zur zellulären Lokalisation von Proteinen
Zum Nachweis von intra/extrazellulär- lokalisiertem LDL- Rezeptor- Protein wurde
eine spezielle- Doppel- Immunfluoreszenz- Färbe- Technik verwendet (Jensen et al.
1997). Die Kultivierung von humanen Fibroblasten erfolgte zu diesem Zweck genau
wie unter Punkt 2.4.1 beschrieben auf sterilen Deckgläschen. Nach 3 x Waschen mit
jeweils 1 ml PBS wurden die Zellen mit 5µg/ml des monoklonalen LDLR- Primär-
Antikörpers (Maus Anti- LDL- Rezeptor IgG- C7, Fa.Acris, Bad Nauheim) für 10 Min.
bei 40C inkubiert und danach mit 2 ml PBS (1% BSA) in einem Kühlarbeitzplatz bei
40C gewaschen. Der Nachweis von an der Zelloberfläche lokalisiertem LDL- Rezeptor
erfolgte durch eine 10- minütige Inkubation bei 40C mit 27µg/ml
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugierten Antikörper (gerichtet gegen den
primären Antikörper). Nach Waschen mit jeweils 2 x 1 ml PBS (1% BSA) erfolgte die
Fixation der Zellen durch Inkubation in 1 ml 4% Formaldehyd/PBS- Lösung für 15
Min. bei RT. Die fixierten Zellen wurden daraufhin zur Lokalistion von intrazellulärem
LDL-Rezeptor direkt weiterverwendet. Hierzu wurden die Zellen zunächst durch eine
15- minütige Inkubation in 1 ml 70% Ethanol/PBS- Lösung permeabilisiert und
anschließend erneut mit monoklonalem LDLR- Primär- Antikörper (1,25µg in 1 ml
PBS/BSA) für 30 Min. bei RT inkubiert. Nach Waschen mit 2 ml PBS/BSA erfolgte die
intrazelluläre Lokalisation des LDL- Rezeptors durch eine 30- minütige Inkubation bei
370C mit Tetramethylrhodaminisozyanat (TRITC)- konjugierten Sekundär- Antikörper
(8µg/ml). Zum Abschluss wurden die Zellen auf den Deckgläschen jeweils 3 x mit 1 ml
PBS gewaschen und danach, um ein zu schnelles Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe
zu verhindern, mit 25µl „Mounting“- Medium überschichtet die Ränder der beiden
Glasplatten mit Nagellack abgedichtet und anschließend genau wie unter Punkt 2.3.6.
beschrieben mit der konfokalen Lasermikroskopie untersucht.
2. Material und Methoden 109
2.4.9 Subzelluläre Fraktionierung von Zellen für Immunblot- Experimente
Für die Darstellung von in zellulären Membranen lokalisierten Proteinen (zB. LDL-
Rezeptor, SCARB1, Na+/K+- ATPase) in Imunblot- Experimenten wurden subzelluläre
Fraktionierungen aus kultivierten humanen Fibroblasten mit dem Qproteome Cell
Compartment Kit (Fa. Quiagen, Hilden) durchgeführt. Humane Fibroblasten Zellen die
sich zwischen Passage 5-10 befanden, wurden in 35- mm Zellkulturschalen ausgesät
und für 72 Stunden in DMEM- Medium mit 10 % FCS inkubiert. Nach 2maligem
Waschen der Zellen mit 2 ml eisgekühltem PBS wurden die einzelnen zellulären
Kompartmente mit den jeweiligen Proteinbestandteilen (Zytosolische Proteine, Plasma
und ER-Membranproteine, Nukleare Proteine und Proteine des Zytoskeletts), exakt
nach den vorgegebenen Anweisungen des Herstellers isoliert. Zur Ankonzentrierung
und Entsalzung der isolierten Proteine wurden anschließend jeweils 500µl der Lysate
mit 4 Volumen (V/V) eiskalter Acetonlösung versetzt, für 2 Stunden bei 40C inkubiert
und die Proteine durch eine 20minütige Zentrifugation bei 13000 rpm pelletiert. Nach
Abnahme des Überstandes wurden die Proteinpellets direkt in 100µl SDS- Probenpuffer
aufgenommen und anschließend die Proteinmenge in Lösung mit dem C- BXTM
Protein- assay (Fa. G- Biosciences, St. Louis, USA) bestimmt. Dieser Proteinassay
erlaubt eine genaue Bestimmung der isolierten Proteinmenge in einem linearen Bereich
von 0-50µg in der Gegenwart von interferierenden Detergentien (z.B. Chaps, Harnstoff
und SDS), die mit der Bradford- Methode nicht möglich ist. Zur Quantifizierung der
Proteinmengen aus den isolierten Mebranfraktionen für Immunblot-Experimente
wurden jeweils 10µl gelöstes Protein eingesetzt und die Proteinmenge in den Fraktionen
exakt nach den vorgegebenen Anweisungen des Herstellers nach Messung der optischen
Dichte bei einer Wellenlänge Für die nachfolgenden Immunblot –
Experimente wurden jeweils 8 µg Protein eingesetzt.
3. Ergebnisse 110
3. Ergebnisse
3.1 Mutationsanalyse mittels denaturierender Gradientengel- Elektrophorese
(DGGE)
3.1.1 Prinzip und Theorie der DGGE
Die denaturierende Gradienten- Gelelektrophorese (DGGE) ist eine physiko- chemische
Methode zur Separation von doppelsträngiger DNA, durch die es möglich ist, DNA-
Fragmente aufzutrennen, die sich in ihrer Nukleotidkomposition unterscheiden (Fischer
und Lerman 1980). Die Seperation der DNA- Fragmente wird durch ihr
unterschiedliches Schmelzverhalten in linearen denaturierenden Gradientengelen
bewirkt. Jedes DNA- Fragment besitzt spezifische Bereiche, sogenannte
Schmelzdomänen („melting domains“), in die es aufschmilzt, wenn man die Temperatur
oder die Konzentration an einem chemischen Denaturans erhöht. Die
Schmelztemperatur (Tm) der einzelnen Domänen eines DNA- Fragments ist dabei
abhängig von der Nukleotidkomposition und kann bis zu 0,1-10C zwischen zwei
Fragmenten, die sich in nur einem Nukleotid voneinander unterscheiden, variieren. In
der Praxis werden die DNA- Moleküle in einem Polyacrylamidgel mit einem linear
ansteigenden Gradienten an chemischen Denaturans aufgetrennt und wandern so lange,
bis sie eine Konzentration an Denaturans erreicht haben, an dem ihre niedrigste
Schmelzdomäne aufschmilzt (Seperation des DNA- Doppelstranges). Die nun partiell
geschmolzenen Fragmente ändern ihre Molekülstruktur („branched structure
Formation“), wodurch die Mobilität der Moleküle im Gel abrupt reduziert wird und die
Unterschiede durch einen „mobility shift“ im Gel sichtbar werden. Fragmente mit
unterschiedlichen Mutationen (Substitutionen, Transitionen, Deletionen und
Insertionen) wandern im Vergleich zum Wildtyp- DNA- Fragment unterschiedlich weit
innerhalb des Gradienten bis zu ihrem jeweiligem Schmelzpunkt und können so leicht
identifiziert werden. In der Regel schmelzen die meisten DNA- Fragmente in einem
Temperaturbereich, der zwischen 68-840C liegt. Um diese Temperaturen experimentell
herstellen zu können, wird die Elektrophorese bei einer konstanten Temperatur von
600C durchgeführt. Die noch fehlende und benötigte Temperatur zum Aufschmelzen der
DNA- Moleküle wird durch einen linearen chemischen Denaturierungsgradienten,
bestehend aus Harnstoff und Formamid, geschaffen (100% Denaturans- Lösung = 7 M
3. Ergebnisse 111
Harnstoff; 40%- deionisiertes Formamid). Hierbei entsprechen 3% an Denaturans-
Lösung einer Temperatur von ca. 10C. Ideale DGGE- Bedingungen setzen voraus, dass
sich die DNA- Doppelstränge nicht vollständig voneinander getrennt haben und die zu
untersuchende Region mit Mutationen sich im Bereich der niedrigsten Schmelzdomäne
befindet. Bei Fragmenten, die mehrere Schmelzdomänen aufweisen, kann es passieren,
dass nicht alle Domänen erfasst werden, da ihre höchsten Schmelzdomänen erst dann
erfassbar sind, wenn beide DNA- Stränge schon vollständig voneinander separiert sind,
sodass Mutationen in den höchsten Schmelzdomänen nicht nachgewiesen werden
können. Um dieses Problem zu lösen, fügt man mittels PCR eine sogenannte 30-60
Basenpaare lange GC- Klammer („GC- clamp“) in die zu untersuchenden DNA-
Fragmente ein. (Myers et al. 1985). Hierzu wird einer der verwendeten PCR-Primer mit
dem GC- clamp versehen, sodass dieser anschließend im Verlauf der PCR in das PCR-
Produkt mit eingebaut wird (Sheffield et al. 1989). Hierdurch ist es möglich, auch
Mutationen in den höher schmelzenden Domänen eines DNA- Fragments zu erfassen.
Um die optimalen DGGE- Parameter (Elektrophoresezeit, Gradientenauswahl) für das
jeweilige Fragment zu definieren, muss das Schmelzverhalten des Fragments untersucht
werden. Dies kann über zwei unterschiedliche Methoden ermittelt werden. Mit Hilfe
eines Computerprogramms (WINMeltTM, Fa. BioRad, München) kann man anhand der
Nukleotidsequenz des zu untersuchenden DNA- Fragments die Anzahl der
Schmelzdomänen und deren Schmelzpunkt theoretisch ermitteln. Der Vorteil dieser
Methode liegt daran, dass man den GC- clamp gezielt an ein bestimmtes Ende des
Fragments anhängen kann (5' oder 3' Ende), sodass man im optimalen Fall eine einzelne
Schmelzdomäne generieren kann, die eine Erfassung aller Mutationen gewährleistet
(Lerman und Silverstein 1987). Eine zweite experimentelle Möglichkeit besteht in der
Gelelektrophorese des zu untersuchenden Fragments in einem linearen Gradienten an
Denaturans (0-100%). Hierbei wird das Fragment im Gegensatz zum Parallel- Gel
rechtwinklig (perpendikulär) zu einem Denaturans- Gradienten über einen Zeitraum von
5 Stunden aufgetrennt. Der Probenauftrag erfolgt hierbei über eine einzige das Gel
umfassende Probentasche. Fragmente auf der niedrigen Seite des Gradienten wandern
sehr weit ins Gel hinein, da die geringe Denaturans- Konzentration sie nicht
aufschmelzen lässt, während Fragmente auf der hohen Seite des Gradienten nur eine
kurze Strecke bis zur Aufschmelzung im Gel zurücklegen. Im intermediären
3. Ergebnisse 112
Konzentrationsbereich werden durch ein bedingtes Schmelzen der Fragmente
Übergangszustände sichtbar. Durch Anfärben der Gele mit Ethidiumbromid erhält man
eine Kurve, welche die Anzahl der Schmelzdomänen und deren Schmelzbereich
anzeigt. Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zur theoretischen Ermittlung besteht
darin, dass man das tatsächliche Schmelzverhalten des Fragments erfasst und anhand
dieser Kurve die optimalen Gradienten- Bedingungen für die Auftrennung der
Fragmente im parallelen Gradientengel genau bestimmen kann (Myers et al. 1985). In
der Regel unterscheiden sich die theoretisch und experimentell ermittelten Parameter
jedoch nur geringfügig voneinander, sodass die computergestützte Bestimmung des
Schmelzverhaltens das praktikablere Verfahren darstellt. In der Abbildung 14 ist das
Prinzip der denaturierenden Gradientengel- Elektrophorese (DGGE) zum Nachweis von
DNA- Mutationen grafisch dargestellt.
Abbildung 14: Prinzip der denaturierenden Gradientengel- Elektrophorese (DGGE). In der
perpendikulären DGGE ermittelt man den Schmelzbereich der Fragmente (In diesem Beispiel
z.B. 30-70%). Dieser wird dann zur Auftrennung der DNA- Fragmente in der parallelen DGGE
verwendet. Bei Vorhandensein einer heterozygoten Mutation ergeben sich auf dem Gel vier
Banden (jeweils zwei Heteroduplexe und Homoduplexe).
100%
Elek
troph
orese
0% Denaturans
Schmelzbereich
30%- 70%
WT.-DNA
Mut.-DNA
DNA -Doppelstrang
DNA-Partiell-geschmolzen
30%
70%
Heteroduplex 1
Heteroduplex 2
Mut.-Homoduplex
WT.-Homoduplex
Wt Mut Het.
5´-3´
3´-5´
5´-3´
3´-5´
5´-3´
3´-5´
5´-3´
3´-5´
Den
aturan
s
Perpendikuläre DGGE Parallele DGGE
3. Ergebnisse 113
3.1.2 Konstruktion eines Elektrophorese- Systems für das Screening mit der
DGGE
Da konventionelle Elektrophorese- Systeme für die Untersuchungen mit der
denaturierenden Gradientengel- Elektrophorese relativ teuer in der Anschaffung sind
(Preis ca. 8000-12000 €) und in den meisten Fällen einen großen Probendurchsatz nicht
immer gewährleisten können, wurde im Rahmen dieser Arbeit durch den Umbau einer
Standard- Elektrophoresekammer (Protean II System, Fa. BioRad, München) ein
Elektrophorese- System für die Untersuchungen mit der DGGE konstruiert. Hierbei
wurde die zentrale Kühleinheit mit Löchern versehen und die Zu- und Abläufe der
Kühleinheit mit hitzebeständigem Silikon abgedichtet, um einen Stromfluss innerhalb
des Systems zu gewährleisten. In den Puffertank wurde jeweils ein neuer Zu- und
Ablauf eingebaut. Der Zulauf der Kammer wurde über einen Silikonschlauch mit dem
Einlass einer Pumpe (Pumpvolmen: 30L/Minute) verbunden und der Ablauf der
Kammer über einen zweiten Silikonschlauch mit einer Glasspirale verbunden, die in
einem regulierbaren Thermoelement (Temperaturbereich. 4-950C) untergebracht war.
Von dieser Glasspirale führte ein dritter Schlauch zum Auslass der Pumpe, sodass ein
geschlossener Kreislauf hergestellt wurde, über den das Puffersystem geheizt und
gekühlt werden konnte. Um pH- Unterschiede des Elektrophorese- Puffers in der oberen
und unteren Pufferkammer während der 5- stündigen Elektrophorese bei 600C zu
vermeiden, wurde ein zweites Pumpsystem eingebaut, das eine konstante Zirkulation
von Ober- und Unterpuffer gewährleistete. Abbildung 15 zeigt die umgebaute Protean
II- Elektrophorese- Apparatur, mit der alle DGGE- Untersuchungen in dieser Arbeit
durchgeführt wurden.
3. Ergebnisse 114
Abbildung 15: Aufbau der selbst umgebauten Elektrophorese- Apparatur, mit der alle DGGE-
Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden.
3.1.3 Schmelzkurven für die Untersuchungen des ApoB- 100 und LDL-
Rezeptorgens
Um den Einfluss von neuen Mutationen, die zur Hypercholesterinämie führen und bei
der Pathogenese der Atherosklerose eine mögliche Rolle spielen, aufzuklären, sollte
zunächst ein spezifischer Bereich in Exon 26 des ApoB- 100- Gens mit der DGGE auf
Mutationen untersucht werden. Es handelte sich um die für die Bindung an den LDL-
Rezeptor essentielle Region der carboxyterminalen Modulator site von ApoB- 100
(Aminosäuren 3448-3561) (Boren et al. 1998; Boren et al. 2001). Diese Region wird
von den Nukleotiden 10551-10893 des ApoB- 100- Gens codiert (Genbank Accession
Nr: NM_ 000384). Weltweit existieren bisher erst vier beschriebene Mutationen in
dieser Region, die über eine reduzierte ApoB- 100- Bindung an den LDL- Rezeptor zur
Hypercholesterinämie führen und bei der Pathogenese der Atherosklerose mitwirken.
Ein zweites Gen, das im Cholesterinstoffwechsel eine zentrale Rolle spielt und im
Rahmen des DGGE- Screenings bei extrem seltenen und schwersten Formen der
Familiären Hypercholesterinämie (FH) untersucht wurde, war das LDL- Rezeptorgen
Heizsystem
Pufferpumpe I
Pufferpumpe II
Gelkammer
3. Ergebnisse 115
(Genbank Accession Nr: NM_000527). Hierzu wurden Primer ausgewählt, die das
gesamte LDL- Rezeptorgen inklusive der „splice sites“ (Exon/Intron- Übergänge) und
der in den Introns lokalisierten Bindungsstellen für Proteinkomplexe des Spliceosoms
(U1/U2 und U4/5 SnRNP´s), umfassten. Zusätzlich wurde der LDL- Rezeptor-
Promotor (Region -252 bis +1) mit den für die transkriptionelle Kontrolle der LDL-
Rezeptor- Genexpression relevanten regulatorischen Sequenzen (TATA- Boxen, Sp1-
Bindungstellen, Sterol regulatory elements (SRE´s)) untersucht. Zunächst wurden mit
dem Computerprogramm WINMeltTM Schmelzkurven für die Untersuchungen der
einzelnen Fragmente des ApoB- 100 und des LDL- Rezeptorgens generiert. Abbildung
16 zeigt die Schmelzkurve des hierzu ausgewählten ApoB- 100 DNA- Fragments,
sowie repräsentativ die Schmelzkurve des DNA- Fragments von Exon 12 des LDL-
Rezeptors als eines der verwendeten Fragmente für die DGGE- Untersuchungen.
1 80
159
238
317
396
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
Sequence position (bp)
Mel
ting
tem
pera
ture
(°C
)
GC- clamp(50 bp)
CgcccgccgcgccccgcgcccgTcccgccgcccccgcccgcggcCccccgGGAGCAGTTGACCACAAGCTTAGCTTGGAAAGCCTCACCTCTTACTTTTCCATTGAGTCATCTACCAAAGGAGATGTCAAGGGTTCGGTTCTTTCTCGGGAATATTCAGGAACTATTGCTAGTGAGGCCAACACTTACTTGAATTCCAAGAGCACACGGTCTTCAGTGAAGCTGCAGGGCACTTCCAAAATTGATGATATCTGGAACCTTGAAGTAAAAGAAAATTTTGCTGGAGAAGCCACACTCCAACGCATATATTCCCTCTGGGAGCACAGTACGAAAAACCACTTACAGCTAGAGGGCCTCTTTTTCACCAACGGAGAACATACAAGCAAAGCCACC
ApoB (Exon 26)
3. Ergebnisse 116
Sequence position (bp)
1 70 139 208 277 34620.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
Mel
ting
tem
pera
ture
(°C
)
GC- clamp(50 bp)
Abbildung 16: Mit WINMeltTM ermittelte Schmelzkurven des ausgewählten ApoB- 100-
Fragments, sowie repräsentativ die Schmelzkurve von Exon 12 des LDL- Rezeptorgens. Die
roten Buchstaben markieren den GC- clamp. Fettgedruckte Buchstaben zeigen die codierenden
Bereiche und normal gedruckte die Intron- Sequenzen der Fragmente.
3.1.4 Auswahl und Sequenzen der Oligonukleotide für die DGGE-Untersuchungen.
Die Auswahl der Oligonukleotid- Sequenzen für die PCR- Amplifikationen erfolgte im
Wesentlichen an den von Nissen et al. publizierten Sequenzen zur DGGE-
Untersuchung des ApoB- 100 und LDL- Rezeptorgens (Nissen et al. 1996). Ein
Unterschied bestand in der Länge der verwendeten 5´ terminalen GC- Klammer, die in
unserem Fall 50 Bp betrug und für alle Primer mit GC- clamps verwendet wurde. Aus
den mit WINMeltTM ermittelten Schmelzkurven ergab sich, dass alle Fragmente in
einem Temperaturbereich von 68-750C schmelzen, sodass für die Untersuchungen ein
linearer Denaturans- Gradient von 30-78% zur Auftrennung aller Fragmente verwendet
wurde. In der Tabelle 13 sind die Daten aller verwendeten DGGE- Primer aufgelistet.
ggccctcaggaccctctgggactggcatcagcacgtgacctctccttatccacttgtgtgtctagATCTCCTCAGTGGCCGCCTCTACTGGGTTGACTCCAAACTTCACTCCATCTCAAGCATCGATGTCAACGGGGGCAACCGGAAGACCATCTTGGAGGATGAAAAGAGGCTGGCCCACCCCTTCTCCTTGGCCGTCTTTGAGgtgtggcttacgtacgagatgcaagcacttaggtggcggatagacacagactatagatcactcaagccaagatgaacgcagaaaactcgcccgccgcgccccgcgcccgTcccgccgcccccgcccgcggccccccg
LDLR (Exon 12)
3. Ergebnisse 117
Tabelle 13: Oligonukleotid- Sequenzen für die Amplifikationen des ApoB- 100 und
LDL- Rezeptorgens und die codierenden Regionen der jeweiligen PCR- Produkte.
NameVorwärts-Primer
(5´- 3´)Rückwärts-Primer
(5´-3´)
Fragment ( Bp)
Codierende Region
ApoB- Gen (Exon 26)
aGGAGCAGTTGACCACAAGCTTAGC
GGTGGCTTTGCTTGTATGTTCTCC
382Aminosäure-Region
(3448- 3561)
LDL-Rezeptor (Promotor)
aAGGACTGGAGTGGGAATCAGAGC
TGCTGTGTCCTAGGAAACCC
252Region: -252 bis + 1
LDL-Rezeptor (Exon 1)
aTTGAAATGCGAAATGACGTGGCG
CTGGCGCCTGGAGCAAGC
256Signalpeptid
LDL-Rezeptor (Exon 2)
aCGTGGTCAGTTTCTGATTCTGGCG
ATAAATGCATATCATGCCCAAAGG
253Modul1:(Repeat1)
Ligandenbindung
LDL-Rezeptor (Exon 3)
aTCGGCCTCAGTGGGTCTTTC
ACTCCCCAGGACTCAGATAGGC
268Modul 1: (Repeat 2) Ligandenbindung
LDL-Rezeptor (Exon 4, 3´)
aACTGCGGCAGCGTCCCCGGC
GGCTGCAGGTGGAGCTGTTGC
297 Modul 1: (Repeat 3) Ligandenbindung
LDL-Rezeptor (Exon 4, 5´)
aACCTGTGGTCCCGCCAGC
CCAGGGACAGGTGATAGGACG
345Modul 1: (Repeats- 4 und 5) Ligandenbindung
LDL-Rezeptor (Exon 5)
aGGCCCTGCTTGTTTTCTCTGG
AGCAGCAAGGCACAGAGAATGG
282Modul 1: (Repeat 6) Ligandenbindung
LDL-Rezeptor (Exon 6)
aACGAAACTGAGGCTCAGACACACC
GCTCCCCACAAACTCTGCAAGC
262Modul 1: (Repeat 7) Ligandenbindung
LDL-Rezeptor (Exon 7)
aAGAGTGACCAGTCTGCATCCCTGG
TTGGTTGCCATGTCAGGAAGC
253Modul 2: EGF-Repeat
LDL-Rezeptor (Exon 8)
aTCCCCACCAAGCCTCTTTCTCTC
CCACCCGCCGCCTTCC
222Modul 2: EGF-Repeat
LDL-Rezeptor (Exon 9)
aCTGACCTCGCTCCCCGGACC
GGCTGCAGGCAGGGGCGACG
278Modul 2: EGF-Repeat + (YWTD Repeats 1 und 2)
3. Ergebnisse 118
Tabelle 13 (Fortzetzung): Oligonukleotid- Sequenzen für die Amplifikationen des
ApoB- 100 und LDL- Rezeptorgens und die codierenden Regionen der jeweiligen PCR-
Produkte.
LDL-Rezeptor (Exon 10)
GCAGTGAGATGAGGGCTCCTGG
aCCTGCAGCCCTCAGCGTCG
349Modul 2: EGF-Repeat + (YWTD Repeat 3)
LDL-Rezeptor (Exon 11)
aGGATCCTCCCCCGCCCTC
TGGCTGGGACGGCTGTCC
239Modul 2 EGF-Repeat + (YWTD Repeat 4)
LDL-Rezeptor (Exon 12)
GGCCCTCAGGCCCTCTGG
aCCGAGTTTTCTGCGTTCATCTT
336
Modul 2: EGF-Repeat + (YWTD Repeat 5)
LDL-Rezeptor (Exon 13)
aGTCATCTTCCTTGCTGCCTG
CACAAGGAGGTTTCAAGGTTGG
264 Modul 2: EGF-Repeat + (YWTD repeat 6)
LDL-Rezeptor (Exon 14)
aTCTCGTTCCTGCCCTGACTCC
GACACAGGACGCAGAAACAAGG
274
Modul 2: EGF-Repeat
LDL-Rezeptor (Exon 15)
aGGCACGTGGCACTCAGAAGACG
aGTGTGGTGGCGGGCCCAGTC
288
Modul 3: O-gebundene Zucker
LDL-Rezeptor (Exon 16)
aCTCCATTTCTTGGTGGCCTTCC
CATAGCGGGAGGGCTGTGACCTGG
239
Modul 4: Trans-membrane Domäne
LDL-Rezeptor (Exon 17)
aGGGCAGCTGTGTGACAGAGCG
CATGGCTCTGGCTTTCTAGAGAGG
279
Modul 4 + 5: Trans-membrane + cyto-plasmatische-Domäne
LDL-Rezeptor (Exon 18)
aCCTGAGTGCTGGACTGATAGTTTCC
AAGGCCGGCGAGGTCTCAGG
190
Modul 5: Cyto-plasmatische -Domäne
a 50-Bp GC- clamp: CGCCCGCCGCCGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG.
Zur Validierung des DGGE- Mutationsscreening- Systems wurden durch gezielte PCR-
Mutagenese Mutationen in Kontrollfragmente eingeführt. Diese wurden in
Etablierungsexperimenten als Positivkontrollen zur Überprüfung der Detektionskraft
des Systems verwendet Im weiteren Verlauf der Untersuchungen dienten dann
identifizierte Polymorphismen in den Exonen der LDLR und ApoB- 100- Gene als,
interne Positivkontrollen für die Mutationsanalysen (siehe auch Punkt 3.4.5 dieser
Arbeit).
3. Ergebnisse 119
3.3 Detektion von heterozygoten ApoB- Mutationen bei Patienten aus dem
Kollektiv der Marburger Präventions- Allianz durch DGGE- Screening
Für die DGGE- Untersuchungen von Exon 26 des ApoB- 100- Gens wurde die DNA
von 1000 konsekutiv gesammelten Patientenproben aus dem Kollektiv der Marburger-
Präventions- Allianz, wie unter Material und Methoden beschrieben, isoliert und
anschließend mittels PCR amplifiziert. Das DGGE- Screening erfolgte in 38-75%
linearen denaturierenden Gradientengelen, die mit Hilfe eines Gradientenmischers
hergestellt wurden. Nach einer Elektrophoresezeit von 5 Stunden bei 600C wurden die
Gele mit Ethidiumbromid gefärbt, unter UV- Licht betrachtet und ausgewertet. Von den
1000 initial gescreenten Patienten waren 853 Proben auswertbar. Bei fünf Patienten
konnte ein auffälliges DGGE- Bandenmuster nachgewiesen werden, das auf eine
heterozygote Mutation hinwies. In Abbildung 17 ist das mit Ethidiumbromid gefärbte
DGGE- Gel mit den identifizierten Mutationsträgern dargestellt.
Abbildung 17: Nachweis von auffälligen heterozygoten DGGE- Bandenmustern bei fünf
Patientenproben aus dem Kollektiv der Marburger Präventions- Allianz (Bahnen: 1-5). K =
Kontrolle (Wildtyp- ApoB- 100- DNA).
3.3.1 Identifizierung einer neuen ApoB- Mutation: ApoB- H3543YMarburg (ApoB-
Marburg)
Zum Nachweis des zugrundeliegenden Defekts auf DNA- Ebene bei den mittels DGGE-
Untersuchung identifizierten heterozygoten Mutationsträgern wurden jeweils 30µl PCR-
Produkt der jeweiligen Patienten über ein Agarosegel aufgereinigt, mit dem Big Dye
Terminator- Sequenzierungs- Kit sequenziert und der Sequenzierungslauf in einem
ABI Prism 310 DNA- Sequencer durchgeführt. Die Sequenzierungreaktionen der fünf
Probanden identifizierten bei einer Patientin die bekannte ApoB- R3500Q- Mutation
(R3500Q) und bei den anderen vier Patienten eine noch nicht beschriebene
Basensubstitution von C nach T an Nukleotidposition 10836 in Codon 3543 des ApoB-
Heteroduplex- Banden
Mut. Homoduplex- Bande
WT. Homoduplex- Bande
1 2 3 K 4 5
3. Ergebnisse 120
Gens (Abbildung 18 A). Als Folge dieses Basenaustausches wurde die basische
Aminosäure Histidin (Codon: CAC) durch die ungeladene Aminosäure Tyrosin (Codon:
TAC) substituiert (ApoB- H3543Y). Dadurch kam es bei der neuen ApoB- Marburg-
Mutation genau wie bei allen anderen weltweit bisher identifizierten FDB- ähnlichen
ApoB- Mutationen zum Verlust einer postiven Ladung im carboxyterminalen
Modulatorelement von ApoB- 100, über das die Bindung an den LDL- Rezeptor
ermöglicht wird (Abbildung 18 B) (Boren et al. 1998; Soufi et al. 2004).
A.
B.
Abbildung 18: A. Nachweis einer neuen ApoB- Mutation (ApoB- H3543Y) bei vier Patienten
aus dem Kollektiv der Marburger Präventions- Allianz durch Sequenzierung. B. Die Mutation
bewirkt genau wie bei allen anderen weltweit bisher identifizierten FDB- ähnlichen- ApoB-
Defekten den Verlust einer postiven Ladung im carboxyterminalen Modulatorelement von
ApoB- 100.
3.3.2 Untersuchungen des LDL- Rezeptorgens und ApoE- Genotypisierung bei den
Trägern von ApoB- H3543YMarburg
Um eine Beeinflussung des exogenen und endogenen Cholesterintransportes durch
zusätzliche Defekte im LDL- Rezeptor und dessen Ligand ApoE auszuschließen, wurde
das LDL- Rezeptorgen bei den fünf gefundenen Patienten mit ApoB- Defekt mittels
C10836T
ApoB- H3543YMarburgWildtyp- ApoB- 100
NH2 COOH
R3500W
R3500QR3480W R3531C H3543Y
carboxyterminales Modulatorelement
3. Ergebnisse 121
Std. H3543Y H3543Y R3500Q H3543Y H3543Y
404
501489
353
242
190
147
110 89
67
Bp
72 Bp
56 Bp
91 Bp
48 Bp
ApoE: 3/3 3/3 3/3 3/4 3/4
DGGE untersucht und eine ApoE- Genotypisierung durchgeführt. Die DGGE-
Untersuchungen des LDL- Rezeptorgens erfolgten genau wie unter Punkt 3.3
beschrieben. Für die ApoE- Genotypisierungen wurden jeweils 10ng Patienten- DNA
mit den Primerpaaren: ApoE (Vorwärts) 5´ -ATAAATATAAAATATAAATAACAGA
ATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3´ und ApoE (Rückwärts) 5´-TAAGCTTGGCAC
GGCTGTCCAAGGA-3´ - wie unter Material und Methoden beschrieben- mittels PCR
amplifiziert und anschließend 15µl des Reaktionsansatzes mit 5 Units (U)
Restriktionsendonuklease Cfo I für 12 Stunden bei 370C verdaut. Nach Auftrennung der
Fragmente in einem 14% Polyacrylamidgel und Färbung mit Ethidiumbromid, wurden
die ApoE- Genotypen ermittelt. In den Untersuchungen des LDL-Rezeptorgens fanden
sich bis auf vorbeschriebene frequente Polymorphismen in den Exonen: 2 (SfaN I), 10
(G/A), 12 (Hinc II) und 13 (Ava II) keine weiteren synonymen DNA- Mutationen. Die
ApoE- Genotypisierungen ergaben bei den Trägern von ApoB- H3543Y- Marburg je
zweimal den ApoE- Genotypen 3/3 und 3/4. Bei der Patientin mit der FDB-Mutation
(R3500Q) fand sich der ApoE- Genotyp 3/3. Somit konnte bei allen Patienten eine
Beeinflussung des exogenen/endogenen Cholesterintransportes durch zusätzliche
Mutationen im LDL- Rezeptor und den ApoE- Polymorphismus ausgeschlossen
werden. In Abbildung 19 sind die Ergebnisse der ApoE- Genotypisierungen aufgezeigt.
Abbildung 19: Ermittelte ApoE- Genotypen der Träger von ApoB- H3543YMarburg nach
Auftrennung der Fragmente in einem 14% Polyacrylamidgel. Es wurden je zweimal die ApoE-
Genotypen 3/3 und 3/4 nachgewiesen. Bei der Patientin mit der R3500Q- Mutation fand sich
der ApoE- Genotyp 3/3.
3. Ergebnisse 122
3.3.3 Haplotypanalyse der ApoB- H3543YMarburg - Träger
Die Tatsache, dass ApoB- H3543YMarburg im Kollektiv der Marburger Präventions-
Allianz sehr viel häufiger gefunden wurde als die klassische FDB- Mutation (R3500Q),
welche in den publizierten Daten als die am häufigst vorkommende in kaukasischen
Populationen beschrieben wurde (Fisher et al. 2000; Horvath und Ganev 2001),
veranlasste uns dazu, herauszufinden, ob der neue ApoB- Marburg- Defekt mit einem
individuellen Haplotyp assoziert ist. Eine weitere Frage, die durch die Haplotypanalyse
abgeklärt werden sollte, war, ob zwischen den Mutationsträgern ein mögliches
Verwandtschaftsverhältnis bestand, welches die Häufigkeit von ApoB- H3543Y- Marburg
im untersuchten Kollektiv erklären könnte. Obwohl ein direkter Verwandtschaftsgrad
schon aus den anamnestischen Daten formell nicht ersichtlich war, weil zwei der
Patienten aus anderen Regionen Deutschlands stammten, sollte dieses durch eine
zusätzliche Haplotyp- Untersuchung abgeklärt werden. Hierzu wurden vier polymorphe
Marker in Exon 26 von ApoB, sowie ein 15 Bp TA(n)- polymorphes Nukleotid- Repeat
(3´HVR) in der 3´ Region des ApoB- Gens untersucht (Pullinger et al. 1992; Choong et
al. 1999). Zur detaillierten Untersuchung und Absicherung des Haplotyps wurden des
weiteren die Schwester und der Bruder von einem der ApoB- H3543Y- Träger (Patient
4) untersucht. Diese beiden Geschwister waren ebenso wie der Indexpatient
heterozygote Träger der ApoB- H3543Y- Mutation (Abbildung 20 A). Die ApoB-
Haplotyp- Untersuchung erfolgte anhand der von Pullinger et al. publizierten Methode
(Pullinger et al. 1992). Jeweils 15µl der PCR- Produkte von den ApoB-
Mutationsträgern und einer gesunden Kontrollperson wurden mit 5 U der
Restriktionsendonukleasen: Xba I, Xsp I, Msp I sowie EcoR I für 12 Stunden bei 370C
verdaut und anschließend nach Auftrennung der Spaltprodukte in einem 2% Agarosegel
die individuellen Haplotypen ermittelt (Abbildung 20 B). Die Bestimmung der Anzahl
an 15 Bp TA(n)- Nukleotid- Repeats in der 3´ Region des ApoB- Gens der Patienten
erfolgte durch Sequenzierung und Auftrennung der PCR- Produkte in einem 2%-
Agarosegel (Abbildung 20 C). In Tabelle 14 sind alle Daten der ApoB- Haplotyp-
Untersuchungen der identifizierten Mutationsträger zusammengefasst.
3. Ergebnisse 123
A.
B.Haplotypanalyse der ApoB- H3543YMarburg - Patienten:
Exon 26 (Xba I)
+/- +/- +/- +/+ +/- +/- +/- -/-
ApoB- H3543YMarburg - Familie
Exon 26 (Msp I)
Exon 26 (Xsp I)
Exon 26 (EcoR I)
H3543Y* H3543Y* H3543Y* H3543Y H3543Y H3543Y Kontr. R3500Q
+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
+/- +/- +/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
1 2 3 4
1 2 3 4 5 6 7
I.
II.
#
1
III.
#
#
2
#* * *
Stammbaum der untersuchten ApoB- H3543YMarburg - Familie:
3. Ergebnisse 124
C.
Abbildung 20: Haplotypanalyse der ApoB- H3543YMarburg und R3500Q- Patienten, sowie einer
Kontrollperson (Kontr.). A. Stammbaum der Familie von einem der identifizierten Träger von
ApoB- H3543YMarburg (Patient 4). Zur Untersuchung und Absicherung des Haplotyps wurden
die ebenfalls heterozygot betroffene Schwester und der Bruder des Patienten in die Analyse mit
einbezogen (*). Ein # markiert Mitglieder der Familie, die an KHK litten und an den Folgen
dieser verstorben sind. B. Darstellung der ermittelten ApoB- Haplotypen in einem 2%
Agarosegel nach Verdau mit den Restriktionsendonukleasen: Xba I, Xsp I, Msp I sowie EcoR I.
Ein + symbolisiert das Vorhandensein und ein - die Abwesenheit der entsprechenden
Schnittstellen. C. Untersuchung der polymorphen Nukleotid- Repeats in der 3´ Region des
ApoB- Gens (3´HVR) der Patienten. Die Zahlen geben die Anzahl an 15 Bp TA- Nukleotid-
Repeats an.
Tabelle 14: Zusammenfassung der ApoB- Haplotypanlysen und ermittelter Konsensus-
Haplotyp der ApoB- H3543YMarburg - Mutationsträger.
Patient/Mutation Mutation Xba I Msp I Xsp I EcoR I 3´HVR
1* (H3543Y) +/- +/- +/+ +/+ +/- 37/35
2* (H3543Y) +/- +/- +/+ +/+ +/- 37/35
3* (H3543Y) +/- +/- +/+ +/+ +/- 37/35
4 (H3543Y) +/- +/+ +/+ +/+ +/+ 35/29
5 (H3543Y) +/- +/- +/+ +/+ +/+ 35/29
6 (H3543Y) +/- +/- +/+ +/+ +/+ 35/29
7 (Wildtyp) -/- +/- +/+ +/+ +/+ 37/35
8 (R3500Q) +/- -/- +/+ +/+ +/+ 49/49
Konsensus- Haplotyp (H3543Y) + + + + + 35
ApoB - 3´ HVR-Repeat- Untersuchung: (Anzahl der 15 BpTA(n)- Repeats)
Std. H3543Y* H3543Y* H3543Y* H3543Y H3543Y H3543Y Kontr. R3500Q
1000
750
500
Bp
37/35 37/35 37/35 35/29 35/29 35/29 37/35 49/49
3. Ergebnisse 125
Aus den Daten der Haplotyp- Untersuchungen ging hervor, dass ApoB- H3543YMarburg
einen eigenständigen Konsensus-Haplotyp aufwies: Xba I +, Msp I +, Xsp I +, EcoR I +
und 3´HVR 35, der sich von den bisher beschriebenen Haplotypen der anderen
publizierten ApoB- Mutationen unterschied (Wenham et al. 1997; Fisher et al. 1999).
Ein direktes Verwandschaftsverhälnis der Träger von ApoB- H3543YMarburg war
ebenfalls unwahrscheinlich, da bei einigen der Patienten Unterschiede hinsichtlich des
Vorhandenseins bzw. der Abwesenheit der polymorphen Schnittstellen nachzuweisen
waren (Tabelle 14). Bei der identifizierten Patientin mit der ApoB- R3500Q- Mutation
fand sich der für diese Mutation in kaukasischen Populationen sehr häufig beschriebene
Haplotyp: Xba I -, Msp I +, Xsp I +, EcoR I + und 3´HVR 49 (Ludwig und McCarthy
1990).
3.3.4 Lipidparameter, Klinik und Prävalenz von ApoB- H3543YMarburg
Die Lipidwerte der ApoB- H3543YMarburg- Patienten unterschieden sich von denen des
übrigen Studienkollektivs. Die Werte für Gesamtcholesterin (+ 100 mg/dl), LDL-
Cholesterin (+ 65 mg/dl), Triglyzeride (+ 170 mg/dl) sowie ApoB- 100 (+ 55 mg/dl)
waren, verglichen mit dem übrigen Studienkollektiv, deutlich erhöht. Die Werte für das
HDL- Cholesterin (- 2 mg/dl) und Apo A-I (+ 35 mg/dl) lagen im Normbereich.
Verglichen mit anderen FDB- Kollektiven waren die Werte für Gesamtcholesterin
(GC), LDL- Cholesterin (LDL- C) und ApoB im untersuchten Kollektiv niedriger. Die
Mittelwerte für GC. und LDL- C. der ApoB- H3543YMarburg- Patienten, waren
verglichen mit denen der R3500Q- Mutation, nur moderat erhöht (Miserez und Keller
1995) und lagen im Bereich publizierter Werte für R3500W und R3531C (Gaffney et al.
1995; Gaffney et al. 2002). Wie bei den anderen FDB- Mutationen, fand sich eine große
Variabilität der Klinik- und Lipidparameter der einzelnen Patienten (Gaffney et al.
1995). Durch die ApoE- Genotypisierungen und Untersuchung des LDL- Rezeptorgens
konnte eine Beeinflussung der Lipidwerte und des Lipidstoffwechsels durch zusätzliche
Defekte in diesen Genen ausgeschlossen werden. Klinisch fand sich bei drei der vier
gefundenen ApoB- H3543Y- Mutationsträger eine angiografisch gesicherte koronare
Herzerkrankung, nur bei dem jüngsten Patienten (Alter 42 Jahre) konnte eine KHK
ausgeschlossen werden. Die Anamnese ergab, dass alle vier Patienten eine positive
Familien- Anamnese für Hyperlipidämie und frühzeitige KHK hatten. Bei keinem der
Patienten fanden sich Xanthome der Sehnen, Xanthelasmen oder ein Arcus lipoides. Die
3. Ergebnisse 126
neue ApoB- H3543YMarburg- Mutation wurde bei insgesamt 4 Patienten in einer aus
Deutschland stammenden Population von 853 konsekutiv gesammelten und
koronarangiografierten Patienten der Marburger Präventions- Allianz gefunden,
wohingegen die klassische FDB- Mutation (R3500Q) nur einmal detektiert wurde.
Damit ist ApoB- H3543YMarburg mit einer Häufigkeit von 0,48% eine in Deutschland
sehr häufig vorkommende ApoB- Mutation, wenn nicht sogar die häufigste FDB-
ähnliche Mutation in Deutschland, wenn man sie mit der Häufigkeit für die ApoB-
R3500Q- Mutation (Prävalenz: 0,12%) im untersuchten Kollektiv vergleicht (Soufi et
al. 2004). In der Tabelle 15 sind die ermittelten Lipidparameter und klinischen Daten
aller identifizierten ApoB- Mutationsträger zusammengefasst.
Tabelle 15: Zusammenfassung des ermittelten Lipidpstatus und klinische Daten aller
identifizierten ApoB- Mutationsträger aus dem Kollektiv der Marburger Präventions-
Allianz. Die Patienten waren ohne lipidsenkende Medikation. Patient Nr. 4 ist kurz nach
der Untersuchung an den Folgen seiner KHK verstorben. n.b = nicht bestimmt.
Patient (Mutation) Alter GC
(mg/dl)
Tgl.
(mg/dl)
HDL- C
(mg/dl)
LDL- C
(mg/dl)
ApoB
(mg/dl)
Lp(a)
(mg/dl)
ApoE KHK
1. (H3543Y) 69 270 145 60 181 145 < 10 3/4 1- Gefäß
2. (H3543Y) 49 279 341 36 174 140 < 10 3/4 2- Gefäß
3. (H3543Y) 42 217 166 17 167 n.b. < 10 3/3 keine
4. (H3543Y) 64 220 235 43 130 129 85 3/3 3- Gefäß
5. (R3500Q) 61 300 95 41 240 190 < 10 3/3 1- Gefäß
3. Ergebnisse 127
3.4 Untersuchungen des LDL- Rezeptorgens bei familiärer Hypercholesterinämie
(FH)
Neben den Defekten des ApoB als eine der Ursachen für die Entstehung von
Hypercholesterinämien und Manifestation einer frühzeitigen Atherosklerose bewirken
Defekte im LDL- Rezeptor schwerste Formen der familiären Hypercholesterinämie
(FH). Die Inzidenz für die autosomal dominant vererbte Erkrankung liegt bei 1:250-
1:500 für Heterozygotie und ca. 1:1000000 für Homozygotie. Die Cholesterinspiegel
von betroffenen Patienten liegen bei 300-600 mg/dl (Heterozygote) und 600-1200 mg/dl
(Homozygote). Bei homozygoten Patienten findet man phänotypisch neben der
Ausbildung von schweren tuberösen Sehnenxanthomen und Xanthelasmen der Haut
eine rasch voranschreitende Atherosklerose der Koronarien, die sich bereits vor dem 10.
Lebensjahr manifestiert. Die Lebenserwartung unbehandelter homozygoter FH-
Patienten liegt unter 20 Jahren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die molekularen
Ursachen von extrem seltenen Formen der familiären Hypercholesterinämie, die sich
schon in frühester Kindheit manifestieren, untersucht.
3.4.1 Erstmalige Beschreibung von homozygoter familiärer Hypercholesterinämie
(FH) bei eineiigen Zwillingen
Kasuistik und Lipidparameter der FH- Familie
Im Rahmen einer Untersuchung stellte sich Ende 1999 in der Stoffwechselambulanz der
Universitätskinderklinik der Philipps-Universität Marburg zur Abklärung von
gelblichen tuberösen Ablagerungen in der Haut und an den Strecksehnen von
Ellenbogen und Knien, eine türkische Familie mit einem 3- jährigem eineiigen
männlichen Zwillingspaar vor. Die von Prof. Dr. Juergen Schaefer durchgeführte
Konsilliaruntersuchung diagnostizierte eine homozygote familiäre Hyper-
cholesterinämie (FH) bei den Kindern (Abbildung 21). Die Familienanamnese ergab ein
consanguines Verwandtschaftsverhältnis 1. Grades der beiden 36 und 30 Jahre alten
Eltern der Kinder. Phänotypisch zeigten sich bei den Eltern keine Merkmale einer FH.
Die lipidologische Labordiagnostik der Familie ermittelte bei den Kindern ein
Gesamtcholesterin, das bei 1260/1160 mg/dl lag und ein LDL- Cholesterin von
1192/1093 mg/dl, was dem 12fachen des Normwerts entsprach. Die Triglyzeride waren
mit 275/260 mg/dl ebenfalls erhöht und das HDL- Cholesterin mit 13/15 mg/dl stark
3. Ergebnisse 128
erniedrigt, zusätzlich fand sich bei den Zwillingen ein mit 84/75 mg/dl deutlich erhöhtes
Lp(a). Bei den Eltern waren die Werte für Gesamtcholesterin mit 355 mg/dl (Vater) und
290 mg/dl (Mutter) ebenfalls erhöht. Das LDL- Cholesterin betrug 307/220 mg/dl, und
das HDL- Cholesterin war beim Vater mit 29 mg/dl erniedrigt, während es bei der
Mutter mit 58 mg/dl im Normbereich lag. Beide Eltern hatten zudem ein mit 130 bzw.
46 mg/dl deutlich erhöhtes Lp(a). Tabelle 16 zeigt den kompletten ermittelten
Lipidstatus der türkischen FH- Familie.
Abbildung 21: Phänotypische Merkmale der weltweit erstmals bei einem 3- jährigem
türkischen eineiigen männlichen Zwillingspaar identifizierten homozygoten familiären
Hypercholesterinämie (FH). Die Bilder zeigen gelbliche tuberöse und eruptive Ablagerungen
von Cholesterin in der Haut und an den Strecksehnen von Ellenbogen/Knien bei den Kindern.
3. Ergebnisse 129
Tabelle 16: Zusammenfassung des ermittelten Lipidstatus der türkischen FH- Familie.
Patient Alter GC
(mg/dl)
Tgl.
(mg/dl)
HDL- C
(mg/dl)
LDL- C
(mg/dl)
ApoB
(mg/dl)
Lp(a)
(mg/dl)
Vater 36 355 95 29 307 238 130
Zwilling 1 3 1260 275 13 1192 792 84
Zwilling 2 3 1160 260 15 1093 658 75
Mutter 30 290 60 58 220 179 46
Zur Aufklärung der molekularen Ursache der familiären Hypercholesterinämie (FH) bei
der türkischen Familie wurde ein komplettes Familien- Screening des LDL-
Rezeptorgens mittels DGGE durchgeführt.
3.4.2 Nachweis einer neuen LDL- Rezeptor Mutation: FH- W556RMarburg
Das Familien- Screening des LDL- Rezeptorgens mittels DGGE führte zur Detektion
einer homozygoten Mutation in Exon 12 des LDL- Rezeptorgens bei den Zwillingen.
Beide Eltern waren aufgrund des consanguinen Verwandtschaftsverhältnisses- wie zu
erwarten- heterozygote Träger der Mutation (Abbildung 22 A). Die
Sequenzierungreaktionen identifizierten eine Basensubstitution von T nach C in cDNA-
Position 1729 des LDL- Rezeptors. Als Folge dieses Basenaustausches wurde die
hydrophobe ungeladene Aminosäure Trypthophan 556 im LDL- Rezeptor (Codon:
CCG) durch die positiv geladene hydrophile Aminosäure Arginin (Codon: TCG)
substituiert (FH- W556R). Zusätzlich zur Mutation FH- W556RMarburg konnte durch die
DNA- Sequenzierung bei den Zwillingen der Exon 12 Hinc II- Polymorphismus in
homozygoter Form identifiziert werden, die beiden Eltern waren heterozygote Träger
des Polymorphismus (Abbildung 22 B). Eine Untersuchung der DNA- Sequenz von
Exon 12 der Familie mit dem Computerprogramm BioEdit- Sequence Alignment Editor
(Free Download unter: ftp://iubio.bio.indiana.edu/molbio/seqpup/) ergab, dass durch
die Mutation eine Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease Nci I entstand, über die
FH- W556RMarburg durch PCR- RFLP- Analyse zusätzlich verifiziert wurde (Abbildung
22 C).
3. Ergebnisse 130
A.
B.
C.
Abbildung 22: A. Nachweis einer Mutation in Exon 12 des LDL- Rezeptorgens mittels DGGE.
Die Eltern (V, M) sind heterozygote Träger für dieselbe Mutation und haben den Defekt
homozygot auf beide Kinder vererbt (Z 1, Z 2). Beide Eltern sind zusätzlich heterozygote
Träger des Exon 12- LDLR- Hinc II- Polymorphismus. K1= Wildtyp- LDLR mit Hinc II-
Polymorphismus (heterozygot). K2= Wildtyp- LDLR ohne Hinc II- Polymorphismus. K3=
Wildtyp- LDLR mit Hinc II- Polymorphismus (homozygot). B. Sequenzierungreaktionen von
Exon 12 und Nachweis einer neuen T/C Basensubstitution in cDNA- Position 1729 des LDL-
Rezeptors.C. Verifizierung der Mutation FH- W556R auf DNA- Ebene durch Verdau mit Nci I.
Sequenzierung: FH- Marburg- LDLR (Exon 12)
T1729C (homozygot) W556RT1729C (heterozygot) W556R
V Z 1 Z 2 M K 1 K 2 K 3
Heteroduplex- Banden
Mut. Homoduplex- BandeWT. Homoduplex- Bande
DGGE: FH- Marburg- LDLR (Exon 12)
PCR- RFLP: LDLR (Exon 12) Nci I
1000
Bp
750
500
300
150
5095 Bp
345 Bp
250 Bp
Std. K 1 V Z 1 Z 2 M K 2
3. Ergebnisse 131
3.4.3 FH- W556RMarburg verändert die Struktur eines hochkonservierten YWVD-
Repeats im ß-Propeller- Motif des LDL- Rezeptors
Eine Untersuchung der strukturellen Auswirkung von FH- W556RMarburg ergab, dass die
Mutation das fünfte von sechs hochkonservierten YWTD- Repeats des LDL- Rezeptors
betraf, das Bestandteil der YWTD- Domäne des ß- Propeller- Motifs („six bladed
propeller structure“) ist (Jeon et al. 2001). Wie bereits in Punkt 1.3.1 dieser Arbeit
erwähnt, spielt die YWTD- Domäne eine wichtige Rolle bei der pH- abhängigen
Dissoziation des Rezeptor- Liganden- Komplexes im sauren Milieu des Endosoms
(Innerarity 2002). Alle bisher beschriebenen FH- Mutationen, die
Aminosäuresubstitutionen in den sechs YWTD- Repeats bewirkten, produzierten LDL-
Rezeptoren, bei denen der Transport vom endoplasmatischen Retikulum (ER) zum
Golgi Apparat komplett blockiert ist (Klasse 2A LDLR- Transportdefekte). Aufgrund
inkorrekter Faltung der 120 KDa LDL- Rezeptor- Präkursormoleküle werden diese
Rezeptoren rapide im ER abgebaut, was zu einer Rezeptordefizienz an der
Zelloberfläche führt (Goldstein und Brown 1989; Hobbs et al. 1990) Im fünften
YWVD- Repeat des LDL- Rezeptors wurde bereits eine Mutation in Dänemark
beschrieben, welche die Aminosäure Tryptophan 556 betraf und zu FH führte. Bei
dieser Mutation wurde Tryptophan 556 durch Serin substituiert (W556S), jedoch wurde
diese Mutation bisher nur in heterozygoter Form nachgewiesen (Jensen et al. 1997).
FH- W556RMarburg ist somit weltweit die erste tatsächliche homozygote Mutation („true
homozygous“) im fünften YWVD- Repeat des LDL- Rezeptors, die bei eineiigen
Zwillingen identifiziert werden konnte. In Abbildung 23 ist die Auswirkung von FH-
W556RMarburg auf die Struktur der YWTD- Domäne des LDL- Rezeptors grafisch
dargestellt.
3. Ergebnisse 132
Abbildung 23: Auswirkung von FH- W556RMarburg auf die Struktur des LDL- Rezeptors. Die
Mutation betrifft das fünfte von sechs hochkonservierten YWTD- Repeats der YWTD- Domäne
des ß- Propeller- Motifs. Alle FH- Mutationen, die Aminosäuresubstitutionen in den sechs
YWTD- Repeats bewirken, produzierten Klasse 2A- LDL- Rezeptoren, bei denen der Transport
vom Endoplasmatischen Retikulum (ER) zum Golgi- Apparat komplett blockiert ist.
3.4.4 Unterschiedliche LDL- Cholesterinspiegel bei identischer Mutation, aber
unterschiedlichem Geschlecht ( „Gender Specific Cholesterol“ )
Kasuistik und molekulargenetische Untersuchung einer weiteren FH- Familie
Zur Aufklärung der molekulargenetischen Ursache einer homozygoten familiären
Hypercholesterinämie (FH) übersandte uns die Abteilung Innere Medizin des
Zentralkrankenhauses links der Weser in Bremen (Direktor: Prof. Dr. G. Klose) die
LDL- Rezeptor- YWTD- Domäne (ß- Propeller- Motif)
COOH
LDL- Rezeptor
NH2 Wildtyp- LDLR
YWTD 3(Ex. 10)
YWTD 4(Ex.11 )
YWVD 5(Ex. 12)
FWTD 6(Ex.13)
YWSD 2(Ex. 9)
FFTN 1(Ex. 9)
YWTD 3
YWTD 4
FWTD 6YWSD 2
FFTN 1
FH- W556RMarburg
= LDLR- Repeats mit Ca2+ Ion (Bindung)
= EGF- Repeats
= ß-Propeller- Motif (6xYWTD- Repeats )
= O- gebundene Zucker
= Transmembrane Domäne
= NPxY-Motif
YRVD 5
3. Ergebnisse 133
Blutproben einer libanesischen Familie mit zwei Töchtern. An äußerlichen Merkmalen
fanden sich bei der Indexpatientin, einem 4 jährigen Mädchen, genau wie bei den
Kindern der türkischen FH- Familie, schwere tuberöse Sehnenxanthome und
Xanthelasmen der Haut. Die Familienanamnese ergab, wie bei der türkischen Familie
aus Marburg, ein consanguines Verwandtschaftsverhältnis 1. Grades der beiden 24 und
20 Jahre alten Eltern des Mädchens. Phänotypisch zeigten sich bei den Eltern und einer
weiteren 2- jährigen Tochter keine Merkmale einer FH. Die lipidologische
Labordiagnostik der Familie ermittelte bei der Indexpatientin ein Gesamtcholesterin,
das bei 797 mg/dl lag und ein LDL- Cholesterin von 723 mg/dl. Die Triglyzeride und
das HDL- Cholesterin waren mit 108 bzw. 52 mg/dl normal. Das Lp(a) des Mädchens
war, anders als bei der Marburger Familie, nicht erhöht. Bei den Eltern und der
Schwester des Kindes waren die Werte für Gesamtcholesterin mit: 290 mg/dl (Vater),
234 mg/dl (Mutter) und 344 mg/dl Schwester erhöht. Die Werte für das LDL-
Cholesterin lagen bei 227/190 mg/dl (Vater/Mutter) und 287 mg/dl bei der Schwester.
Das HDL- Cholesterin lag bei Mutter und Vater bei 41/35 mg/dl und bei der jüngeren
Schwester bei 43 mg/dl. Tabelle 17 fasst den ermittelten Lipidstatus der libanesischen
FH- Familie zusammen.
Tabelle 17: Zusammenfassung des ermittelten Lipidstatus der libanesischen FH-
Familie.
Patient Alter GC
mg/dl
Tgl.
mg/dl
HDL- C
mg/dl
LDL- C
mg/dl
ApoB
mg/dl
Lp(a)
mg/dl
Vater 24 290 110 34 227 171 < 10
Tochter 1 4 797 108 52 723 495 < 10
Tochter 2 2 344 70 43 287 246 < 10
Mutter 20 234 48 41 190 156 < 10
Die Untersuchungen des LDL- Rezeptorgens mittels DGGE und die
Sequenzierungreaktionen identifizierten bei der Indexpatientin- genau wie bei der
Marburger FH- Familie- die W556R- Mutation in homozygoter Form als Ursache der
familiären Hypercholesterinämie (FH). Beide Eltern und die Schwester waren
heterozygote Träger der Mutation (Abbildung 24 A). Neben FH- W556RMarburg konnte
wie bei den türkischen Kindern zusätzlich der Exon 12 Hinc II- Polymorphismus in
3. Ergebnisse 134
homozygoter Form nachgewiesen werden. Anders als bei den Eltern der türkischen FH-
Familie aus Marburg, waren die Eltern und die Schwester des Kindes jedoch auch
homozygote Träger dieses Polymorphismus (Abbildung 24 B). Aus den
Untersuchungen und dem Lipidstatus geht hervor, dass trotz identischer LDL-Rezeptor-
Mutation die LDL- Cholesterinwerte bei dem homozygot betroffenen 4- jährigen
Mädchen aus der libanesichen Familie deutlich niedriger lagen, als bei den türkischen
Jungen. Zudem fand sich auch ein deutlich höheres HDL- Cholesterin bei dem
Mädchen. Ein Vergleich der männlichen und weiblichen Familienmitglieder aus beiden
Familien zeigt, dass weibliche Mutationsträger bei Diagnose (unter keiner
medikamentösen Therapie) niedrigere LDL- und höhere HDL- Plasmaspiegel hatten.
Dies lässt auf eine eventuelle geschlechtsspezifische Ausprägung des Phänotyps bei
FH- W556R schließen. In mehreren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass
Östrogene und Androgene die Transkription einer Vielzahl von Genen des
Lipidstoffwechsels (z.B. LDLR, VLDLR, SCARB1, ABCA1 und ApoA-I) beeinflussen
(Wu und von Eckardstein 2003; Schmitz und Langmann 2005). Diese Modulation der
Genexpression erfolgt sowohl über direkte Mechanismen (Bindung von aktivierten
Hormonrezeptoren an Hormone responsive elements (HREs)) in den Promotoren dieser
Gene, als auch über indirekte Mechanismen, durch Interaktion von aktivierten
Hormonrezeptoren mit Transkriptionsfaktoren des Transkriptionskomplexes ohne
vorherige Bindung an HREs (Harnish et al. 1998; Sattler et al. 2005). Als Folge dieser
Prozesse kommt es dann zu einer unterschiedlich starken hormonabhängigen
Transaktivierung dieser Gene bei Männern und Frauen, was zu einer heterogenen
Ausprägung des Phänotyps bei FH, trotz Vorliegen einer identischen LDLR- Mutation,
führen könnte (siehe auch Punkt 4. Diskussion dieser Arbeit).
A. DGGE: FH- Familie- Libanon- LDLR (Exon 12)
V T 1 T 2 M K 1 K 2 K 3
Heteroduplex-Banden
Mut. Homoduplex-BandeWT. Homoduplex-Bande
3. Ergebnisse 135
B.
Abbildung 24: Erneuter Nachweis von FH- W556RMarburg bei einer FH- Familie aus dem
Libanon. A. DGGE von Exon 12 der FH- Familie. Die Eltern (V, M) sind heterozygote Träger
der Mutation und haben den Defekt homozygot bzw. heterozygot auf die Töchter (T1, T2)
vererbt. K1-K3: Wt- LDLR- Kontrollen. B. Erneuter Nachweis von FH- W556RMarburg durch
DNA- Sequenzierung von Exon 12.
3.4.5 Die DGGE und LDLR- Haplotypanalysen zeigen, dass beide FH-Familien
nicht direkt miteinander verwandt sind.
Die Tatsache, dass eine homozygote FH mit einer Inzidenz von 1:1000000 sehr selten
vorkommt und FH- W556RMarburg bei zwei Familien gleichzeitig gefunden wurde, legte
nahe, dass eine direkte Verwandtschaft zwischen beiden FH- Familien bestand. Aus den
Daten der Anamnese beider Familien ging hervor, dass weder die libanesische Familie,
noch die türkische Familie direkte Verwandte in der Türkei bzw. im Libanon hatten.
Um abzuklären, ob doch ein direktes mögliches Verwandtschaftsverhältnis bestand,
wurden die generierten molekulargenetischen Daten der DGGE- Untersuchungen
(Abbildung 25), sowie der DNA- Sequenzierungen beider Familien und der
untersuchten Kontrollpersonen direkt miteinander verglichen (Abbildung 26).
Zusätzlich wurde durch die Untersuchung fünf polymorpher Marker des LDL-
Rezeptorgens (SfaN I: Exon 2, Stu I: Exon 8, Hinc II: Exon 12, Ava II: Exon 13 und
FH- W556RMarburg/Libanon (hom.)
FH- W556RMarburg/Libanon (het.) Hinc II T/C-Polymorphismus
T1729C C/C
C/CT1729C
3. Ergebnisse 136
Pvu I: Exon 18) ermittelt, mit welchem LDLR- Haplotyp FH- W556RMarburg
coseggregiert (Abbildung 27). In der Tabelle 18 sind alle Daten der LDLR-
Haplotypanalysen der identifizierten FH- W556RMarburg- Familien zusammengefasst.
Abbildung 25: Vergleich der DGGE- Analysen von Exon 12 des LDL- Rezeptorgens der
identifizierten FH- W556RMarburg- Familien. Die Bandenmuster der heterozygot betroffenen
Eltern in beiden Familien unterscheiden sich deutlich voneinander. Während die Eltern der
türkischen Kinder heterozygote Träger des Hinc II- Polymorphismus sind (siehe Vergleich der
Bandenmuster von V, M mit den Kontrollen K1, K2), sind die Eltern der libanesischen Familie
homozygote Träger des Polymorphismus (siehe Vergleich der Bandenmuster von V, M, T2 mit
den Kontrollen K1, K3). Im Gegensatz dazu ist die Migration der DNA- Bande mit der
Mutation bei allen betroffenen Familienmitgliedern gleich. Abkürzungen: V= Vater, M=
Mutter, Z1/Z2= Zwilling 1 bzw. 2, T1/T2= Tochter 1 bzw. 2, K1= Wildtyp- LDLR mit Hinc II-
Polymorphismus (heterozygot). K2= Wildtyp- LDLR ohne Hinc II- Polymorphismus. K3=
Wildtyp- LDLR mit Hinc II- Polymorphismus (homozygot).
V Z 1 Z 2 M K 1 K 2 K 3 V T 1 T 2 M K 1 K 3 K 2
FH- W556RMarburg/Türkei FH- W556RMarburg/Libanon
3. Ergebnisse 137
Vergleich der DNA- Sequenzierungen beider FH- Familien und der Kontrollen
Abbildung 26: Vergleich der DNA- Sequenzierungen von Exon 12 des LDL- Rezeptorgens der
identifizierten FH- W556RMarburg- Familien und der Kontrollen. Die heterozygot betroffenen
Patienten in beiden Familien unterscheiden sich hinsichtlich des Hinc II- Polymorphismus
voneinander. Die Eltern der türkischen Kinder sind heterozygote Träger des Polymorphismus
(T/C), wohingegen alle Mitglieder der libanesischen Familie homozygote C/C- Träger dieses
Polymorphismus sind (V, M, T1). Die homozygote LDLR- Mutation T1729C (FH-
W556RMarburg) der Kinder aus beiden Familien (Z1/2 und T1) wird gekoppelt mit dem Hinc II-
C- Allel vererbt. Abkürzungen: V= Vater, M= Mutter, Z1/Z2= Zwilling 1 bzw. 2, T1/T2=
Tochter 1 bzw. 2, K1-3= Wildtyp- LDLR- Kontrollen.
Hinc II T/C- Polymorphismus
LDLRYWVD-Repeat 5
T/TWT:T/T
WT:T/T
WT:T/T T/C
C/C
FH-W556RMarburg/Türkei
(Het.)Mut:T/C
FH-W556RMarburg/Libanon
(Het.)
FH-W556RMarburg/Türkei/Libanon
(Hom.)
T/C
C/CMut: T/C
C/CMut: C/C
Wildtyp- LDLRExon 12 (Kontrollen 1- 3)
Z1/2 und T1:
V, M, T2:
V, M:
K1:
K2:
K3:
3. Ergebnisse 138
LDLR- Haplotypen der identifizierten FH- W556RMarburg- Familien
Abbildung 27: LDLR- Haplotypanalyse der beiden FH- W556RMarburg- Familien. Zur
Bestimmung der Haplotypen wurden jeweils 15µl der für die DGGE- Untersuchungen
verwendeten PCR- Produkte von allen FH- W556RMarburg- Mutationsträgern und den
Kontrollpersonen (K1-3) mit 5 U der Restriktionsendonukleasen: SfaN I, Stu I, Ava II und Nco
I für 12 Stunden bei 370C verdaut und anschließend nach Auftrennung der Spaltprodukte in
einem 2% Agarosegel die individuellen Haplotypen ermittelt. Ein + symbolisiert das
Vorhandensein und ein - die Abwesenheit der entsprechenden Schnittstellen.
Tabelle 18: Zusammenfassung der LDLR- Haplotypanalysen der beiden FH-
W556RMarburg- Familien.
LDLR- Polymorphismus V Z1 Z2 M V T1 T2 M K1 K2 K3
SfaN I (Exon 2) +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Stu I (Exon 8) +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+
Hinc II (Exon 12) +/- +/+ +/+ +/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/- -/- +/+
Ava II (Exon 13) +/- -/- -/- +/- -/- -/- -/- -/- +/- -/- +/+
Nco I (Exon18) -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
LDLR (W556R) Konsensus +/- +/+ +/+ +/- +/- +/+ +/- +/- -/- -/- -/-
Exon 2 (SfaN I)
+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+
+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
+/- -/- -/- +/- -/- -/- -/- -/- +/- -/- +/+
Std. V Z 1 Z 2 M V T 1 T 2 M K 1 K 2 K 3
FH-W556RMarburg/Türkei FH-W556RMarburg/Libanon
Exon 8 (Stu I)
Exon 13 (Ava II)
Exon 18 (Nco I)
3. Ergebnisse 139
Aus den Daten der Haplotyp- Untersuchungen geht hervor, dass FH- W556RMarburg den
Konsensus- Haplotypen: SfaN I +, Stu I +, Hinc II + Ava II - und Nco I - aufweist. Ein
direktes Verwandschaftsverhältnis 1. Grades zwischen beiden FH- Familien kann
formell ausgeschlossen werden, da die heterozygot betroffenen Familienmitglieder aus
beiden Familien sich hinsichtlich des Vorhandenseins bzw. der Abwesenheit der
polymorphen Schnittstellen in den LDLR- Exonen 12 und 13 voneinander
unterscheiden und somit das Wildtyp- LDLR- Allel in beiden Familien mit einem
unterschiedlichen Haplotyp seggregiert.
3.4.6 ApoE- Genotypisierungen der beiden FH- W556RMarburg- Familien
Um eine Beeinflussung des exogenen und endogenen Cholesterintransportes durch
einen zusätzlichen Defekt im Liganden ApoE des LDL- Rezeptors auszuschließen,
wurde bei den identifizierten FH- W556RMarburg- Familien eine Genotypisierung des
ApoE durchgeführt. Die ApoE- Genotypisierungen wurden genau wie unter Punkt 3.3.2
beschrieben durchgeführt. Nach Verdau der PCR- Produkte mit 5 U
Restriktionsendonuklease Cfo I für 12 Stunden bei 370C, wurden die Fragmente in
einem 14% Polyacrylamidgel aufgetrennt und nach anschließender Färbung mit
Ethidiumbromid die ApoE- Genotypen ermittelt. Die Untersuchungen ermittelten bei
allen Familienmitgliedern der türkischen FH- Familie den ApoE- Genotypen 3/3. Bei
der libanesischen Familie waren der Vater und die homozygot betroffene Tochter
Träger des ApoE- Genotyps 3/4. Die Mutter und die zweite Tochter wiesen den
Genotyp ApoE 3/3 auf. Aus den Daten geht hervor, dass die Mutation FH-
W556RMarburg gemeinsam mit dem ApoE 3- Allel vererbt wird. Somit kann bei allen
betroffenen FH- Patienten eine Beeinflussung des exogenen/endogenen
Cholesterintransportes durch zusätzliche bindungsrelevante Mutationen an den
Positionen 142 und 158 von ApoE ausgeschlossen werden. In Abbildung 28 sind die
Ergebnisse der ApoE- Genotypisierungen dargestellt.
3. Ergebnisse 140
Abbildung 28: Ermittelte ApoE- Genotypen der beiden FH- W556RMarburg- Familien. In der
türkischen Familie sind alle Familienmitglieder Träger des ApoE 3/3- Genotyps. In der
libanesischen Familie sind der Vater (V) und die homozygot betroffene Tochter (T1) Träger von
ApoE 3/4, die Mutter (M) und zweite Tochter (T2) besitzen den ApoE- Genotyp 3/3.
3.5 Funktionelle Charakterisierung von ApoB- H3543YMarburg und FH-
W556RMarburg in vitro mit Zellkultur- Experimenten
Die molekulargenetischen Untersuchungen haben ergeben, dass die
Aminosäuresubstitutionen in ApoB- H3543YMarburg, und FH- W556RMarburg funktionell
wichtige Regionen in beiden Proteinen betreffen. Bei ApoB- H3543YMarburg kam es
genau wie bei allen anderen weltweit bisher identifizierten ApoB- Mutationen zum
Verlust einer positiven Ladung im carboxyterminalen Modulatorelement von ApoB-
100, über das die Bindung an den LDL- Rezeptor ermöglicht wird (Boren et al. 2001;
Soufi et al. 2004). Die Mutation bei FH- W556RMarburg betraf das fünfte
hochkonservierte YWVD- Repeat im LDL- Rezeptor, das Bestandteil der YWTD-
Domäne des ß- Propeller- Motifs („six bladed propeller structure“) ist und eine wichtige
Rolle bei der pH- abhängigen Dissoziation des Rezeptor- Liganden- Komplexes spielt
(Innereraty 2002; Jeon et al. 2001; Springer et al. 1998). Um die funktionellen
Auswirkungen der beiden neu identifizierten Defekte zu untersuchen, wurden zunächst
Bindungs und Aufnahmestudien mit fluoreszenzmarkierten DiI (1,1´-dioctadecyl-
3,3,3´,3´- tetramethylindocarbocyanine- perchlorate)- LDL- Partikeln in kultivierten
HeLa- Zellen und Fibroblasten durchgeführt.
Std. V Z 1 Z 2 M
FH-W556RMarburg/Türkei FH-W556RMarburg/Libanon
Std. V T 1 T 2 M
ApoE: 3/3 3/3 3/3 3/3 3/4 3/3 3/4 3/3
501489
353
242
190
147
110 89
67
Bp
404
72 Bp56 Bp
91 Bp
48 Bp
3. Ergebnisse 141
3.5.1 Aufnahme und Bindung von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg- und ApoB-
R3500Q- DiI- LDL in kultivierten HeLa- Zellen
Die Untersuchungen der Aufnahme- und Bindungs- Kinetiken von ApoB-
H3543YMarburg- LDL erfolgten im direkten Vergleich mit ApoB- R3500Q- und
Wildtyp- LDL in kultivierten HeLa- Zellen. Hierzu wurden die LDL- Fraktionen der
entsprechenden Probanden- wie unter „Material und Methoden“ beschrieben- in parallel
durchgeführten Experimenten über sequentielle Ultrazentrifugation isoliert und
anschließend mit dem Fluoreszenz- Farbstoff DiI markiert. Zur quantitativen
Bestimmung der zellulären DiI- LDL- Aufnahme wurden Zellen, die sich zwischen
Passage 5-10 befanden, in 35- mm Zellkulturschalen ausgesät und für 72 Stunden in
DMEM- Medium mit 10% FCS inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS
gewaschen und für weitere 48 Stunden in DMEM- Medium mit 10% LPDS
(Lipoprotein Defizientem Serum) inkubiert, um eine maximale Hochregulation der
LDL- Rezeptor- Genexpression zu erreichen. Nach erneutem Waschen mit PBS erfolgte
die Bestimmung der zellulären DiI- LDL- Aufnahme durch eine 5- stündige Inkubation
bei 370C mit unterschiedlichen Mengen an DiI- LDL (0, 5, 10, 20, 50, 100µg in
DMEM- Medium mit 10% LPDS). Die spezifische Aufnahme wurde bei einer Menge
von 10µg DiI- LDL mit einem 50fachen Überschuss an unmarkiertem LDL und nach
Subtraktion der Background- Fluoreszenz ermittelt. Für die Messungen der zellulären
DiI- LDL- Bindung wurde analog verfahren. Hierzu wurden die Zellen für 2 Stunden
bei 40C mit: 0, 5, 10, 20 und 50µg DiI- LDL inkubiert, wobei ausschließlich
vorgekühltes DMEM- Medium und PBS verwendet wurde. Die Messung der
spezifischen Bindung erfolgte bei einer Menge von 20µg DiI- LDL unter Kompetition
mit einem 50fachen Überschuss an unmarkiertem LDL. Nach den Inkubationen wurden
die Zellen durch eine 1- stündige Inkubation bei RT auf einem Schüttler in 1 ml Zell-
Lysis- Puffer und unter Lichtabschluss lysiert. Die Bestimmung der
aufgenommenen/gebundenen Menge an DiI- LDL erfolgte mit 200µl Zell- Lysat aus
den jeweiligen Ansätzen nach Messung der Fluoreszenz- Intensität (FI) bei
Exzitations/Emissions-Wellenlängen von 525/565nm in einem Spektralfluorometer
(Model LS- 5 Fa. Perkin- Elmer, Langen). Parallel zur Messung der FI (U) wurde
zudem aus allen Ansätzen die Proteinmenge über Bradford- Assay bestimmt. Die
Berechnung der zellulären DiI- LDL- Aufnahme/Bindung (ng LDL- Protein/mg
3. Ergebnisse 142
Zellprotein) erfolgte nach der unter Material und Methoden angegebenen Formel (siehe
Punkt 2.4.5 dieser Arbeit). In den Abbildungen 29 und 30 sind die Kurven der
Aufnahme- und Bindungs- Kinetiken von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg, und ApoB-
R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen mit den Standardabweichungen (+/-SD) vom
Mittelwert der in Doppelbestimmungen durchgeführten Experimente aufgezeigt (A).
Die Bestimmung der halbmaximalen Aufnahme-/Bindungsgeschwindigkeit (Km) und
der maximalen zellulären Aufnahme-/Bindungskapazitäten (Vmax) der einzelnen DiI-
LDL- Präparationen erfolgte durch Scatchard- Plot- Analyse der ermittelten Daten (B).
Die ermittelten Km- und Vmax- Werte aller Aufnahme- und Bindungsexperimente sind in
den Tabellen 19 und 20 zusammengefasst.
A. B.
0
2000
4000
6000
8000
10000
0 20 40 60 80 100 120
DiI-LDL (µg)
DiI
-LD
L (
ng/
mg
Zel
lpro
tein
)
R2 = 0,994
0
200
400
600
800
1000
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
DiI-LDL (Gebunden)
DiI
-LD
L (
Geb
un
den
/Fre
i)
Wildtyp-DiI- LDL (5h, 370C)
Zelluläre Aufnahme von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg und ApoB- R3500Q- DiI- LDL
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100 120
DiI-LDL (µg)
DiI
-LD
L (
ng/
mg
Zel
lpro
tein
)
R2 = 0,9949
0
200
400
600
800
1000
0 2000 4000 6000 8000
DiI-LDL (Gebunden)
DiI
-LD
L (
Geb
un
den
/Fre
i)
ApoB- H3543YMarburg DiI- LDL (5h, 370C)
3. Ergebnisse 143
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100 120
DiI-LDL (µg)
DiI
-LD
L (
ng/
mg
Zel
lpro
tein
)
R2 = 0,9976
0
200
400
600
800
1000
0 2000 4000 6000
DiI-LDL (Gebunden)
DiI
-LD
L (
Geb
un
den
/Fre
i)
ApoB- R3500Q DiI- LDL (5h, 370C)
A. B.
Abbildung 29: Aufnahme- Kinetiken von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg, und ApoB- R3500Q-
DiI- LDL in HeLa- Zellen (Inkubation für 5h bei 370C). A. Aufgetragen sind die Daten der
Mittelwerte aus jeweils 2 Experimenten (+/- SD). B. Scatchard- Plot- Analyse zur Bestimmung
der halbmaximalen Aufnahme-/Bindungsgeschwindigkeit (Km) und der maximalen zellulären
Aufnahme (Vmax) der einzelnen DiI- LDL- Präparationen.
A. B.
A. B.
Zelluläre Bindung von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg und ApoB- R3500Q- DiI- LDL
0
250
500
750
1000
1250
1500
0 10 20 30 40 50 60
DiI-LDL (µg)
DiI
-LD
L (
ng/
mg
Zel
lpro
tein
)
R2 = 0,998
0
200
400
600
800
0 250 500 750 1000 1250 1500
DiI-LDL (Gebunden)
DiI
-LD
L (
Geb
un
den
/Fre
i)
Wildtyp- DiI- LDL (2h, 40C)
0
250
500
750
1000
0 10 20 30 40 50 60
DiI-LDL (µg)
DiI
-LD
L (
ng/
mg
Zel
lpro
tein
)
R2 = 0,9993
0
100
200
300
400
500
0 250 500 750 1000
DiI-LDL (Gebunden)
DiI
-LD
L (
Geb
un
den
/Fre
i)
ApoB- H3543YMarburg DiI- LDL (2h, 370C)
3. Ergebnisse 144
A. B.
Abbildung 30: Darstellung der Bindungs- Kinetiken und Scatchard- Plot- Analyse von:
Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg, und ApoB- R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen (Inkubation für
2h bei 40C).
Tabelle 19: Zusammenfassung der errechneten Daten (Vmax, Km , Aufnahme- Verlust)
der Experimente zur Aufnahme von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg, und ApoB-
R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen.
Patient/ApoB- Mutation
Aufnahme
Vmax (370C)
( ng DiI-LDL/mg Zellprotein/5h )
Aufnahme
KM (370C)
(µg DiI-LDL/ml)
Verlust Aufnahme
vs.
Kontrolle (%)
Kontrolle (WT.- ApoB) 9915 11,2 100%
Patient 1 (H3543Y het.) 6866 8,7 -31%
Patient 2 (R3500Q het.) 5427 6,6 -45%
Tabelle 20: Zusammenfassung der ermittelten Daten (Bmax, Km , Bindungs- Verlust) der
Experimente zur Bindung von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg, und ApoB- R3500Q-
DiI- LDL in HeLa- Zellen.
Patient/ApoB- Mutation
Bindung
Bmax (40C)
( ng DiI-LDL/mg Zellprotein/2h )
Bindung
KM (40C)
(µg DiI-LDL/ml)
Verlust Bindung
vs.
Kontrolle (%)
Kontrolle (WT.- ApoB) 1381 2,3 100%
Patient 1 (H3543Y het.) 889 2,0 -35%
Patient 2 (R3500Q het.) 825 2,3 -40%
0
250
500
750
1000
0 10 20 30 40 50 60
DiI-LDL (µg)
DiI
-LD
L (
ng/
mg
Zel
lpro
tein
)
R2 = 0,9944
0
100
200
300
400
0 250 500 750 1000
DiI-LDL (Gebunden)
DiI
-LD
L (
Geb
un
den
/Fre
i)
ApoB- R3500Q DiI- LDL (2h, 370C)
3. Ergebnisse 145
3.5.2 Die Aufnahme und Bindung von ApoB- H3543YMarburg DiI- LDL in
kultivierten HeLa- Zellen ist deutlich reduziert.
Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Aufnahme und Bindung von ApoB-
H3543YMarburg DiI- LDL in HeLa- Zellen im direkten Vergleich mit Wildtyp und
ApoB- R3500Q- LDL haben gezeigt, dass das LDL von ApoB- H3543YMarburg-
Patienten deutlich schlechter über den LDL- Rezeptor internalisiert wird und auch
schlechter an diesen bindet. Aus den Aufnahme- Studien ergab sich eine maximale
Aufnahme (Vmax) von 6,8µg DiI- LDL/mg Zellprotein für das LDL von heterozygoten
Trägern der ApoB- H3543YMarburg- Mutation. Verglichen mit der Aufnahme des
Wildtyp- LDL (9,9µg/mg Zellprotein) resultiert dieses in einer um 31% reduzierten
zellulären LDL- Aufnahme. Gleiches findet sich auch in den Untersuchungen der
Bindung. Hier betrugen die ermittelten Werte an zellulär gebundenem DiI- LDL 0,88µg
mg/Zellprotein, was gegenüber dem Wildtyp (1,38µg/mg Zellprotein) eine um 35%
verringerte Bindung bedeutet (Tabellen 19 und 20). Der Vergleich mit den parallel
ermittelten Daten für das LDL der ApoB- R3500Q- Mutationsträgerin zeigt, dass
ApoB- H3543YMarburg LDL eine höhere zelluläre Aufnahme-/Bindungskapazität
aufweist. Ein Abgleich mit den in der Literatur beschriebenen Aufnahme- und
Bindungskapazitäten für ApoB- R3500Q- LDL (-40-70% Verlust für Aufnahme und
Bindung) (Innerarity et al. 1987; Fisher et al. 1999) deckt sich mit den von uns
ermittelten Daten für die ApoB- R3500Q- Mutation (in unserem Fall: 40-45%).
Gleiches gilt auch für die publizierten Vmax- und Km- Werte von Wildtyp- Dil- LDL
(Teupser et al. 1996), sodass die ermittelten Daten der Kinetiken verlässlich erscheinen.
3.6 DiI- LDL- Aufnahme- Kinetiken mit FH- W556RMarburg - Fibroblasten
Für die Untersuchungen der funktionellen Auswirkung der LDL- Rezeptor Mutation
FH-W556RMarburg auf die DiI- LDL Aufnahme und Bindung in vitro wurde genau wie
bei den Aufnahme- und Bindungsstudien zur Charakterisierung von ApoB-
H3543YMarburg verfahren. Anders als bei diesen Experimenten wurden jedoch nicht
HeLa- Zellen, sondern Fibroblasten der Patienten verwendet, da hier nicht der Ligand
(ApoB), sondern der Rezeptor defekt ist. Hierzu wurden zunächst Primärkulturen aus
Haut- Biopsien der betroffenenen FH- W556RMarburg- Patienten zur Etablierung einer
stabilen Fibroblasten- Kultur angelegt und- wie unter „Material und Methoden“
3. Ergebnisse 146
beschrieben- kultiviert. Zur quantitativen Bestimmung der zellulären DiI- LDL-
Aufnahme wurden Fibroblasten zwischen Passage 5-10 in 35- mm Zellkulturschalen
ausgesät und für 72 Stunden in DMEM- Medium mit 10% FCS inkubiert. Danach
wurden die Zellen zur maximalen Stimulation der LDL- Rezeptor- Genexpression für
weitere 48 Stunden in DMEM- Medium mit 10 % LPDS inkubiert. Nach Waschen der
Zellen mit PBS erfolgte die Bestimmung der zellulären DiI- LDL- Aufnahme genau wie
bei den Untersuchungen der ApoB- H3543YMarburg- Mutation. In Abbildung 31 sind die
Daten der DiI- LDL- Aufnahme- Kinetik von FH- W556RMarburg- Fibroblasten
dargestellt. Tabelle 21 fasst die ermittelten Km- und Vmax- Werte der Aufnahme- Experi-
mente zusammen.
A. B.
A. B.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 20 40 60 80 100 120
DiI-LDL (µg)
DiI
-LD
L (
ng/
mg
Zel
lpro
tein
)
R2 = 0,9521
0
200
400
600
800
1000
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
DiI-LDL (Gebunden)
DiI
-LD
L (
Geb
un
den
/Fre
i)
Wildtyp- Fibroblasten (5h, 370C)
Zelluläre DiI- LDL- Aufnahme von Wildtyp und FH- W556RMarburg - Fibroblasten
R2 = 0,9851
0
200
400
600
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
DiI-LDL (Gebunden)
DiI
-LD
L (
Geb
un
den
/Fre
i)
0
2000
4000
6000
8000
0 20 40 60 80 100 120
DiI-LDL (µg)
DiI
-LD
L (
ng/
mg
Zel
lpro
tein
)
FH- W556RMarburg - Vater (het.)
3. Ergebnisse 147
A. B.
A. B.
A. B.
Abbildung 31: DiI- LDL- Aufnahme- Kinetiken mit: Wildtyp, heterozygoten FH- W556RMarburg
(Vater/Mutter) und Fibroblasten der homozygot betroffenen Zwillinge (Inkubation für 5h bei
370C). A. Aufgetragen sind die Daten der Mittelwerte aus jeweils 2 Experimenten (+/- SD). B.
Scatchard- Plot- Analyse zur Bestimmung der halbmaximalen Aufnahmegeschwindigkeit (Km)
und maximalen zellulären DiI- LDL- Aufnahme (Vmax) von Fibroblasten.
0
200
400
600
800
0 20 40 60 80 100 120
DiI-LDL (µg)
DiI
-LD
L (
ng/
mg
Zel
lpro
tein
)
R2 = 0,9802
0
20
40
60
0 200 400 600 800
DiI-LDL (Gebunden)
DiI
-LD
L (
Geb
un
den
/Fre
i)
FH- W556RMarburg - Zwilling 1 (hom.)
FH- W556RMarburg - Mutter (het.)
0
2000
4000
6000
0 20 40 60 80 100 120
DiI-LDL (µg)
DiI
-LD
L (
ng/
mg
Zel
lpro
tein
)
R2 = 0,9505
0
200
400
600
800
0 1000 2000 3000 4000 5000
DiI-LDL (Gebunden)
DiI
-LD
L (
Geb
un
den
/Fre
i)
FH- W556RMarburg - Zwilling 2 (hom.)
0
200
400
600
0 20 40 60 80 100 120
DiI-LDL (µg)
DiI
-LD
L (
ng/
mg
Zel
lpro
tein
)
R2 = 0,9558
0
10
20
30
0 100 200 300 400 500 600
DiI-LDL (Gebunden)
DiI
-LD
L (
Geb
un
den
/Fre
i)
3. Ergebnisse 148
Tabelle 21: Zusammenfassung der errechneten Daten (Vmax, Km , Aufnahme- Verlust)
der Experimente zur Aufnahme von DiI- LDL in Wildtyp und FH- W556RMarburg–
Fibroblasten.
Patient/LDLR-Mutation
Aufnahme
Vmax(370C)
(ng DiI-LDL/mg Zellprotein/5h )
Aufnahme
KM(370C)
(µg DiI-LDL/ml)
Verlust Aufnahme
vs.
Kontrolle (%)
Vater (W556R het.) 6238 11,8 -42%
Zwilling 1 (W556R hom.) 533 20,4 -95%
Zwilling 2 (W556R hom.) 729 14,6 -93%
Mutter (W556R het.) 4293 8,8 -60%
Kontrolle (Wt.- LDLR) 10840 12,2 100%
3.6.1 Fibroblasten der homozygot betroffenen FH- W556RMarburg- Zwillinge
nehmen praktisch kein DiI- LDL mehr auf
Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Aufnahme von Wildtyp- DiI- LDL mit FH-
W556RMarburg- Fibroblasten haben gezeigt, dass bei den homozygot betroffenen
Zwillingen praktisch kein LDL mehr aufgenommen wird. Die maximale DiI- Aufnahme
(Vmax) lag bei 0,53 bzw. 0,72 DiI- LDL/mg Zellprotein. Verglichen mit der Aufnahme
von Wildtyp- Fibroblasten (10,8µg DiI- LDL/mg Zellprotein) bedeutete dies eine um
95-93% reduzierte zelluläre LDL- Aufnahme. Die beiden heterozygot betroffenen
Eltern wiesen maximale Aufnahmen von 6,2 (Vater) bzw. 4,2µg (Mutter) DiI- LDL/mg
Zellprotein auf, was einen Aufnahme- Verlust von 42 bzw. 60% bedeutete. Da die
Daten gezeigt haben, dass die noch verbliebene LDL- Restaufnahme bei den Kindern
durch unspezifische Mechanismen erfolgte, wurde auf eine zusätzliche komplette
Untersuchung der Bindungs- Kinetik verzichtet. Statt dessen wurde die maximale
Bindung für 2 Stunden bei 40C unter Inkubation mit 20µg DiI- LDL bei 50facher
Kompetition mit unmarkiertem LDL bestimmt. Die ermittelten Daten dieser Messungen
sind in Abbildung 32 dargestellt. In der Tabelle 22 sind die Ergebnisse der
Untersuchungen und die Bindungskapazitäten von Wildtyp und FH- W556RMarburg -
Fibroblasten zusammengefasst.
3. Ergebnisse 149
Abbildung 32: Bindung von DiI- LDL an Wildtyp und FH- W556RMarburg- Fibroblasten.
Gezeigt sind die ermittelten Daten der maximalen Bindung (2 Stunden bei 40C) mit 20µg DiI-
LDL unter 50facher Kompetition mit unmarkiertem LDL aus Doppelbestimmungen (+/- SD).
Tabelle 22: Zusammenfassung der Daten zur zellulären DiI- LDL- Bindung von
Wildtyp und FH- W556RMarburg- Fibroblasten.
Patient/LDLR-Mutation
Bindung (40C)
20µg DiI-LDL/ml
(Kompetition 50fach)
( ng DiI-LDL/mg Zellprotein/5h )
Verlust Bindung
vs.
Kontrolle (%)
Vater (W556R het.) 113 -54%
Zwilling 1 (W556R hom.) 23 -90%
Zwilling 2 (W556R hom.) 36 -85%
Mutter (W556R het.) 148 -40%
Kontrolle (Wildtyp- LDLR) 249 100%
Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Bindung von DiI- LDL an FH- W556RMarburg –
Fibroblasten haben gezeigt, dass auch die Bindung bei den homozygot betroffenen
Zwillingen mit -90% bzw. -85% extrem stark reduziert war. Die Bindungen der
heterozygot betroffenen Eltern waren um 54% bzw. 40% reduziert. Bei der noch
verbliebenen Restbindung der Kinder handelt es sich um unspezifische Bindung von
DiI- LDL an die Fibroblasten- Zellmembran, die durch die Waschschritte nicht entfernt
werden konnte.
0
50
100
150
200
250
300
Vater Zwilling 1 Zwilling 2 Mutter Kontrolle
DiI
-LD
L (
ng/
mg
Zel
lpro
tein
)
Bindung von Wildtyp und FH- W556RMarburg- Fibroblasten
3. Ergebnisse 150
3.7 Untersuchungen der zellulären DiI- LDL- Aufnahme von ApoB- H3543YMarburg
und FH- W556RMarburg mit konfokaler Mikroskopie
Um die Daten der DiI- LDL Aufnahmekinetiken von ApoB- H3543YMarburg und FH-
W556RMarburg zusätzlich zu verifizieren, wurden Experimente zur Darstellung der
zellulären Aufnahme von DiI- LDL mittels konfokaler Mikroskopie durchgeführt.
Hierzu wurden HeLa-Zellen und humane Fibroblasten, die sich zwischen Passage 5-10
befanden, in 35- mm Zellkulturschalen ausgesät, die mit sterilen Deckgläschen versehen
waren. Die Inkubation der Zellen erfolgte zunächst über einen Zeitraum von 72 Stunden
in DMEM- Medium mit 10% FCS bis eine ausreichende Anzahl von Zellen auf den
Deckgläschen angewachsen war. Anschließend wurden die Zellen, wie unter „Material
und Methoden“ beschrieben, mit PBS gewaschen und danach für weitere 48 Stunden
zur maximalen Hochregulierung der LDL- Rezeptor- Genexpression in DMEM-
Medium mit 10% LPDS inkubiert. Die spezifische DiI- LDL- Aufnahme wurde durch
eine 5-stündige Inkubation bei 370C mit 10µg- DiI- LDL unter Kompetition mit einem
50fachem Überschuss an unmarkiertem LDL ermittelt. Nach der Inkubation wurde das
Medium abgesaugt und die Zellen jeweils 3 x mit 2 ml PBS gewaschen, um nicht-
adhärente Zellen zu entfernen. Abschließend wurden die Zellen auf den Deckgläschen
mit 25µl „Mounting“- Medium (Vector Laboratories, USA) überschichtet, auf einen
Objekträger aufgelegt und die Ränder der beiden Glasplatten mit Nagellack versiegelt.
Die Darstellung der Zellen erfolgte daraufhin, wie unter „Material und Methoden“
beschrieben, mit einem Zeiss 510 Konfokalem Laser Scanning Mikroskop unter
Verwendung eines Argon-Lasers (Zeiss Lasertechnik GmbH, Jena) bei Exzitations- und
Emissions- Wellenlängen von 525 bzw. 565nm. Hierbei wurden die Bilder elektronisch
vergrößert, um eine kleine Gruppe von Zellen darstellen zu können.
3.7.1 Konfokale Mikroskopie der Aufnahme von: Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg
und ApoB- R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen
Die Untersuchung der Aufnahme von ApoB- H3543YMarburg DiI -LDL in kultivierten
HeLa- Zellen mit konfokaler Mikroskopie erfolgte im direktem Vergleich mit ApoB-
R3500Q- und Wildtyp- DiI- LDL. Hierzu wurden jeweils 10µg der unter Punkt 3.5
verwendeten DiI- LDL Präparationen verwendet und die spezifische DiI- LDL-
Aufnahme nach einer 5- stündigen Inkubation bei 370C unter Kompetition mit einem
3. Ergebnisse 151
50fachen Überschuss an unmarkiertem LDL mit konfokaler Mikroskopie dargestellt.
Abbildung 33 zeigt die Bilder der konfokalen Mikroskopie.
Abbildung 33: Konfokale Mikroskopie der Aufnahme von Wildtyp, ApoB- H3543YMarburg und
ApoB- R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen. Die Bilder zeigen die Aufnahme von
fluoreszenzmarkiertem DiI- LDL- bei Exzitations- und Emissions- Wellenlängen von 525 bzw.
565nm, sowie zur Darstellung der Zellen ohne Fluoreszenz die Durchlicht- Aufnahme.
Aus den Untersuchungen der konfokalen Mikroskopie ging hervor, dass die Aufnahme
von ApoB- H3543YMarburg und ApoB- R3500Q- DiI- LDL in HeLa- Zellen im
Vergleich zu Wildtyp- DiI- LDL deutlich reduziert war. Diese Ergebnisse bestätigten
die unter Punkt 3.5.1 in den Aufnahme- Kinetik- Experimenten gefundenen Daten der
Em. 525/Ex. 565
Konfokale Mikroskopie der Aufnahme von DiI- LDL in HeLa- Zellen
ApoB- WT.- LDL:
ApoB-H3543Y- LDL :
Durchlicht
ApoB-R3500Q- LDL :
3. Ergebnisse 152
reduzierten zellulären Aufnahmekapazitäten für ApoB- H3543YMarburg und ApoB-
R3500Q- LDL. Unter Kompetition mit einem 50fachem Überschuss an unmarkiertem
Wildtyp- LDL zeigte sich, dass ApoB- H3543YMarburg genau wie ApoB- R3500Q ein
funktionell relevanter Defekt war, der zu einer reduzierten spezifischen zellulären LDL-
Aufnahme in vitro führte.
3.7.2 In der konfokalen Mikroskopie zeigte sich keine DiI- LDL- Aufnahme in
Fibroblasten der homozygot betroffenen FH- W556RMarburg - Zwillinge
Die Untersuchungen der Aufnahme- Kinetik von Wildtyp- DiI- LDL mit FH-
W556RMarburg- Fibroblasten, haben gezeigt, dass bei den homozygot betroffenen
Zwillingen praktisch keine LDL- Aufnahme mehr erfolgte. Um diese Daten zusätzlich
zu bestätigen, wurden Experimente mit konfokaler Mikroskopie durchgeführt. Hierzu
erfolgten die Inkubationen von Wildtyp, heterozygoten, sowie homozygoten FH-
W556RMarburg- Fibroblasten, genau wie bei den Untersuchungen von ApoB-
H3543YMarburg beschrieben. Die Darstellung der spezifischen LDL- Aufnahme erfolgte
nach 5 stündiger Inkubation bei 370C mit 10µg- Wildtyp- DiI- LDL unter Kompetition
mit einem 50fachem Überschuss an unmarkiertem LDL. Aus den ermittelten Daten ging
klar hervor, dass FH- W556RMarburg- Fibroblasten der homozygot betroffenen Kinder
kein DiI- LDL mehr aufnahmen. In den Bildern der konfokalen Mikroskopie zeigte sich
lediglich eine ganz schwach nachweisbare Fluoreszenz, die auf eine LDL- Aufnahme
durch unspezifische Mechanismen oder alternative, jedoch nicht effiziente zelluläre
LDL- Transportwege zurückzuführen war. Bei den Fibroblasten des Vaters zeigte sich
eine relativ starke zelluläre DiI- LDL- Aufnahme, die durch den noch intakten Wildtyp-
LDL- Rezeptor hervorgerufen wurde, dessen Expression zusätzlich durch die
Inkubation der Fibroblasten in LPDS- Medium noch verstärkt wurde. Die stärkste DiI-
LDL- Aufnahme erfolgte- wie zu erwarten- bei den Wildtyp- Fibroblasten, hier zeigte
sich eine sehr deutlich nachweisbare Fluoreszenzfärbung im Zytoplasma der Zellen. Die
Untersuchungen mit der konfokalen Mikroskopie legten nahe, dass bei den Fibroblasten
der homozygoten FH- W556RMarburg- Kinder praktisch kein funktioneller LDL-
Rezeptor mehr an der Zelloberfläche vorhanden war, was in Kombination mit den
gefundenen Daten der molekulargenetischen Untersuchungen einen Defekt vom Typ:
Klasse 2 implizierte. In der Abbildung 34 sind die Bilder der konfokalen Mikroskopie
zur zellulären Aufnahme von DiI- LDL aufgezeigt.
3. Ergebnisse 153
Abbildung 34: Konfokale Mikroskopie zur Darstellung der zellulären Aufnahme von Wildtyp-
DiI- LDL in Wildtyp, heterzygoten und homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten. Die
Bilder zeigen die Aufnahme von fluoreszenzmarkiertem DiI- LDL- bei verwendeten
Exzitations- und Emissions- Wellenlängen von 525 bzw. 565nm, sowie zur Darstellung der
Zellen ohne Fluoreszenz die Durchlicht- Aufnahme.
Wildtyp- Zellen:
FH- W556R (het):
Em. 525/Ex. 565 Durchlicht
FH- W556R (hom):
Konfokale Mikroskopie der Aufnahme von DiI- LDL in Fibroblasten
3. Ergebnisse 154
3.7.3 Immunfluoreszenzanalysen von Wildtyp und FH- W556RMarburg-
Fibroblasten mit konfokaler Mikroskopie
Die Ergebnisse der unter Punkt. 3.7.2 durchgeführten Untersuchungen mit konfokaler
Mikroskopie ließen vermuten, dass die Fibroblasten der homozygoten FH-
W556RMarburg- Kinder keine funktionellen LDL- Rezeptoren mehr auf der
Zelloberfläche aufwiesen, was auf einen Klasse- 2 A LDLR- Defekt hindeutete. Um die
intra- bzw. extrazelluläre Lokalisation des LDL- Rezeptorproteins in FH- W556RMarburg-
Fibroblasten zu untersuchen, wurden Immunfluoreszenzanalysen mit konfokaler
Mikroskopie durchgeführt. Hierbei wurde eine Doppel- Immunfluoreszenz- Färbe-
technik verwendet (Jensen et al. 1997). Die Kultivierung der Fibroblasten erfolgte zu
diesem Zweck genau wie unter Punkt 3.7 beschrieben auf sterilen Deckgläschen in
DMEM- Medium mit 10% LPDS, um eine maximale Anzahl von zellulären LDL-
Rezeptoren zu erhalten. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen mit 5µg/ml
monoklonalem LDLR- Primär- Antikörper (Maus Anti- humaner- LDL- Rezeptor IgG-
C7, Fa. Acris, Bad Nauheim) für 10 Min. bei 40C inkubiert und danach in einem
Kühlarbeitsplatz bei 40C mit PBS gewaschen. Der Nachweis von an der Zelloberfläche
lokalisiertem LDL- Rezeptorprotein erfolgte durch eine 10- minütige Inkubation bei
40C mit 27µg/ml Rabbit- Anti- Maus- Fluoresceinisothiocyanat (FITC)- konjugiertem
Sekundär- Antikörper. Nach erneutem Waschen mit PBS wurden die Zellen durch
Inkubation in 1 ml 4% Formaldehyd/PBS- Lösung bei RT fixiert. Zur Lokalisation von
intrazellulärem LDL- Rezeptorprotein erfolgte eine 15- minütige Permeabilisierung der
Zellen in 70% Ethanol/PBS- Lösung und anschließende erneute Inkubation mit
monoklonalem LDLR- Primär- Antikörper (1,25µg) für 30 Min. bei RT. Nach Waschen
mit PBS/BSA erfolgte die intrazelluläre Lokalisation des LDL- Rezeptors durch eine
30-minütige Inkubation bei 370C mit Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC)-
konjugiertem Sekundär- Antikörper (8µg/ml). Abschließend wurden die Zellen auf den
Deckgläschen mit 25µl „Mounting“- Medium (Vector Laboratories, USA)
überschichtet, auf einen Objekträger aufgelegt und die Ränder der beiden Glasplatten
mit Nagellack versiegelt. Der Nachweis von intra-/extrazellulär lokalisiertem LDL-
Rezeptorprotein erfolgte daraufhin wie unter Punkt 3.7 beschrieben mit einem Zeiss
510 Konfokalem Laser Scanning Mikroskop unter Verwendung eines Argon-Lasers
3. Ergebnisse 155
(Zeiss Lasertechnik GmbH, Jena), bei Exzitations und Emissions- Wellenlängen von
488/530nm (FITC) bzw. 540/570nm (TRITC).
3.7.4 Auf der Zelloberfläche von Fibroblasten der FH- W556RMarburg- Zwillinge
lässt sich kein LDL- Rezeptor mehr nachweisen
Die Untersuchungen zur intra- bzw. extrazellulären Lokalisation des LDL-
Rezeptorproteins in FH- W556RMarburg- Fibroblasten mit Doppel-
Immunfluoreszenzanalyse ergaben, dass die Fibroblasten der Kinder keine LDL-
Rezeptoren an der Zelloberfläche aufwiesen. In der FITC- Färbung zur Lokalisation des
membrangebundenen LDL- Rezeptors zeigte sich lediglich eine minimale grüne
Hintergrund- Färbung, die auf unspezifische Antikörperbindung zurückzuführen war.
Im Gegensatz dazu war in der TRITC- Färbung zum intrazellulären Nachweis des LDL-
Rezeptors in den Zellen eine sehr starke Anfärbung sichtbar. Bei den Wildtyp-
Fibroblasten ließen sich- wie zu erwarten- LDL- Rezeptoren sowohl extrazellulär als
auch intrazellulär nachweisen. Gleiches fand sich auch in der konfokalen Mikroskopie
der Fibroblasten des heterozygot betroffenen Vaters. Die Immunfluoreszenz-
Untersuchungen mit konfokaler Mikroskopie bestätigten somit die Vermutung, dass es
sich bei FH- W556RMarburg um einen LDL- Rezeptor- Defekt vom Typ: Klasse 2 A
handelte, der zu einem kompletten Verlust des Transports von intaktem Rezeptor zur
Zelloberfläche führte. Zur weiteren Verifizierung dieses Befundes wurde eine
Westernblot- Analyse mit Membranproteinextrakten aus FH- W556RMarburg-
Fibroblasten durchgeführt. Bei Wildtyp und heterozygoten FH- W556RMarburg-
Fibroblasten ließ sich die 160 KDa Bande des vollständig prozessierten LDL- Rezeptors
nachweisen. In homozygoten Zellen hingegen zeigte sich nur die 120 KDa Proteinbande
des unprozessierten LDL- Rezeptors, was einen Defekt vom Typ: Klasse 2 A bestätigte,
der zu einem kompletten Verlust des LDLR- Transports vom Endoplasmatischen
Retikulum zum Golgi- Apparat führt. Ein weiterer Befund der Westernblot-Experimente
war, dass der defekte W556R in heterozygoten FH- Fibroblasten einem schnellen
turnover unterliegt (schneller Abbau durch molekulare Chaperone des ER), da sich trotz
48 stündiger Inkubation unter Steroldepletion keine 120 KDa- LDL- Rezeptoren in
diesen Zellen nachweisen ließen. In den Abbildungen 35 und 36 sind die Ergebnisse der
Immunfluoreszenz und Westernblot- Untersuchungen mit FH- W556RMarburg-
Fibroblasten dargestellt.
3. Ergebnisse 156
Abbildung 35: Konfokale Mikroskopie zum Nachweis des LDL- Rezeptors in Wildtyp und
FH- W556RMarburg- Fibroblasten mittels Immunfluoreszenzanalyse. Die Bilder zeigen
extrazellulär (FITC- markierter- Sekundärantikörper) und intrazellulär lokalisierten (TRITC-
markierter- Sekundärantikörper) LDL- Rezeptor und die Überlagerung (FITC/TRITC) aus
beiden Aufnahmen.
Immunfluoreszenzanalyse des LDL- Rezeptors mit konfokaler Mikroskopie
FITC Em. 488/Ex. 530
Wildtyp-Zellen:
FH- W556R (Het):
FH- W556R (Hom):
LDL- Rezeptor(Zelloberfläche)
LDL- Rezeptor(Intrazellulär)
Überlagerung(Extra/intrazellulär)
FITC/TRITCTRITC Em. 540/Ex. 570
3. Ergebnisse 157
Abbildung 36: Nachweis des LDL- Rezeptors aus Wildtyp und FH- W556RMarburg- Fibroblasten
durch Westernblot-Analyse. In Membranextrakten von Wildtyp und heterozygoten FH-
W556RMarburg- Fibroblasten lässt sich die 160 KDa Bande des vollständig prozessierten LDL-
Rezeptors nachweisen. In homozygoten Zellen hingegen ist nur die 120 KDa Proteinbande des
unprozessierten LDL- Rezeptors nachweisbar, was einen Defekt vom Typ: Klasse 2 A eindeutig
bestätigt. M=Marker (Biotinilierter Protein Standard, Fa Santa Cruz, Heidelberg).
3.8 Untersuchung der Expression von Genen des Cholesterinstoffwechsels in FH-
W556RMarburg- Fibroblasten mit Real- Time- RT/PCR
Zur Untersuchung der Expression von Genen, die bei der Aufnahme, Transport und
Regulation der intrazellulären Cholesterinbiosynthese ein zentrale Rolle spielen (siehe
Punkt 1.4.3 dieser Arbeit: Transkriptionelle Kontrolle der intrazellulären
Cholesterinbiosynthese) und zur Erfassung der unterschiedlichen Aktivierung dieser
Gene in heterozygoten und homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten, wurden
Untersuchungen mit quantitativer Real- Time RT/PCR durchgeführt. Insgesamt wurden
die Expressionen von 8 Genen untersucht, diese umfassten: 1. LDLR (LDL- Rezeptor);
Westernblot (LDL- Rezeptor)
M WT. Hom. Het.
160 KDa
120 KDa
KDa
200
140
100
60
80
50
3. Ergebnisse 158
2. SCARB1 (scavenger receptor class B type I); 3. ABCA1, (ATP- binding cassette
transporter 1); 4. HMGCR, (HMG- CoA- Reduktase); 5. SREBP-1a (Sterol regulatory
element- binding protein 1a); 6. SREBP-2 (Sterol regulatory element- binding protein
2); 7. INSIG-1 (Insulin induced gene 1); 8. SCAP (SREBP cleavage- activating
protein), sowie dem konstitutiv expremierten housekeeping gene GAPDH,
(Glyceraldehyde- 3- Phosphat- Dehydrogenase). In der Tabelle 23 sind die
Oligonukleotid- Sequenzen für die Amplifikationen der untersuchten Gene
zusammengefasst.
Tabelle 23: Oligonukleotid- Sequenzen (Alle Primerpaare Exon- übergreifend) für die
Amplifikationen der mittels Real- Time- RT/PCR untersuchten Gene.
Gen/Genbank Acc.Nr. Vorwärts- Primer 5´-3´ Rückwärts- Primer 5´ 3´ Fragment (Bp)
LDLR(NM_000527)
TGGAGTGAAGTTTGGAGTCAAC
GACTCTGTCCTGGGCACTGTCT
280
SCARB1(NM_005505)
GGCGGCCACATTTGCCCAG
CCCTGAAGCTCATCATGACCTT
330
ABCA1NM_005502)
AACAGTTTGTGGCCCTTTTG
AGTTCCAGGCTGGGGTACTT
156
HMGCR(NM_000859)
ACAAGAATTTAGTGGGCTCTG C
CTTGAACACCTAGCATCTGCA
273
SREBP-1a (NM_004176)
TGCATTGAGAGTGAAGACCAGT
TCTAAGAGATGTTCCCGGAAT
267
SREBP-2 (NM_004599)
AAGGTCAAAGATGAGCCAGACT
CATAAGAGAAGAGTAGGCATC
242
INSIG 1 (NM_005542)
TAACCACGCCAGTGCTAAATTG
GCTAACTGTCGTCCTATGTT
279
SCAP(NM_012235)
CCATGGGCTCCTCTGTGCTCC
AGCACCAACACATTCTCTAAC
256
GAPDH (NM_002046)
TCATTGACCTCAACTACATGG
AAATGAGCCCCAGCCTTCTCC
226
Die Untersuchungen mit der Real- Time RT/PCR erfolgten, wie unter „Material und
Methoden“ beschrieben mit isolierter Gesamt- RNA aus Wildtyp, heterozygoten und
homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten, die unter Standard- Kulturbedingungen
(DMEM- Medium mit 10% FCS) gehalten wurden. Als Referenz- „house keeping
gene“ für die in dreifachen Ansätzen durchgeführten Real- Time RT/PCR - Reaktionen
und Berechnungen des Abfalls/Anstiegs der Expressionen der untersuchten Gene (+/-
SD) diente das GAPDH- Gen. Zur Berechnung der Expressionen der untersuchten Gene
3. Ergebnisse 159
wurde zunächst die gemessene Fluoreszenz (Exzitations/Emissionswellenlängen
490/530nm von SYBR- green) im entstandenen GAPDH- PCR- Produkt (Ct- GAP) von
der Fluoreszenz des PCR- Produktes des untersuchten Gens (CtUnt.Gen) subtrahiert: Ct
Unt.Gen -Ct GAP Unt.Gen -
Wert des untersuchten Gens bei der Kontrolle Unt.Gen/Kontrolle), dessen Expression
gleich 1 gesetzt wurde, subtrahiert Unt.Gen - Unt.Gen/Kontrolle Unt.Gen). Der
berechnete Wert für den spezifischen Anstieg/Abfall der Expression des untersuchten
Gens Unt.Gen) wurde anschließend in die von Pfaffl et al. beschriebene Formel:
Ratio= 2- (Pfaffl 2001) eingesetzt und hierüber die Ratio (Relativer
Expressionsanstieg/Abfall vs. Kontrolle) des untersuchten Gens ermittelt.
3.8.1 Die relative Expression zentraler Gene der Cholesterinbiosynthese in FH-
W556RMarburg – Fibroblasten ist deutlich erhöht
Aus den Experimenten der Real- Time RT/PCR mit isolierter Gesamt- RNA aus
Wildtyp, heterozygoten und homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten ging hervor,
dass die relativen Expressionen von sechs der acht untersuchten zentralen Gene der
Cholesterinbiosynthese in homozygoten und heterozygoten FH- W556RMarburg-
Fibroblasten signifikant erhöht bzw. erniedrigt waren. Es ergaben sich folgende relative
Expressionsanstiege in homozygoten Zellen: LDL- Rezeptor (4,17fach ), SREBP-2
(6,3fach), SREBP-1a (1,85 fach) INSIG 1 (2,55fach), sowie HMG- CoA- Reduktase
(1,73fach). Die Genexpression von SCAP war im Vergleich zur Kontrolle nicht
signifikant erhöht. In heterozygoten Fibroblasten zeigten sich ebenfalls
Expressionsanstiege in diesen Genen. Diese waren z.T. für einige Gene deutlich
geringer, was darauf hinwies, dass in diesen Zellen der Cholesterinbedarf über die noch
vorhandene intakte Kopie des LDL- Rezeptors zusätzlich gedeckt wurde. In
homozygoten Fibroblasten war dies trotz erhöhter LDLR- Genexpression wegen des
Fehlens funktioneller LDL- Rezeptoren nicht mehr möglich. Hier zeigte sich eine starke
Aktivierung/Inhibierung der Expression von Genen, deren Genprodukte die
intrazelluläre de novo Synthese von Cholesterin, die Aufnahme von Cholesterin über
kollaterale Pathways, sowie die Abgabe von überschüssigen zellulären Cholesterin,
steuern. Diese Aktivierung/Inhibierung erfolgte im Wesentlichen durch den SREBP-2-
Transkriptionsfaktor als zentralen Schlüsselregulator dieser Gene (siehe auch Punkt 4.
Diskussion dieser Arbeit). In Abbildung 37 sind exemplarisch die Kurven eines der
3. Ergebnisse 160
Real- Time RT/PCR- Experimente zur Bestimmung der relativen Genexpression in
Fibroblasten am Beispiel des LDL- Rezeptors aufgezeigt. Die Abbildung 38 zeigt die
Diagramme mit den ermittelten Ratios der untersuchten Gene in Wildtyp, heterozygoten
und homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten. In Tabelle 24 sind die Daten aller
Experimente zusammengefasst.
Real Time RT/PCR von GAPDH und LDL- Rezeptor aus Fibroblasten
Schmelzkurven der Real Time RT/PCR- Produkte von GAPDH und LDL- Rezeptor
Abbildung 37: Ergebnisse der Real-Time- PCR- Experimente von GAPDH und LDL- Rezeptor
aus Wildtyp und FH- W556RMarburg- Fibroblasten. Die Kurven zeigen den zeitlichen Verlauf
des SYBR- green- Einbaus in die PCR- Produkte. Vordere Kurven: GAPDH (Zyklen 17-19).
Hintere Kurven: LDL- Rezeptor (Zyklen 31-33). Schmelzkurven der entstandenen spezifischen
GAPDH (vorderer Peak) und LDL- Rezeptor (hinterer Peak)- PCR- Produkte. Es sind keine
zusätzlichen unspezifischen Amplifikate vorhanden.
3. Ergebnisse 161
Ratios der Real-Time- RT/PCR- Experimente in Wildtyp und FH- W556RMarburg –
Fibroblasten
Abbildung 38: Grafische Darstellungen der normalisierten mRNA- Expressionen von acht
zentralen Genen der Cholesterinbiosynthese die mit Real- Time RT/PCR untersucht wurden.
Signifikante Unterschiede (p < 0.001 bzw. p < 0.05) der Genexpressionen von FH-
W556RMarburg- Fibroblasten gegenüber Wildtyp, sowie von homozygoten gegenüber
heterozygoten FH W556RMarburg- Fibroblasten sind mit *, ** und # gekennzeichnet.
0
2
4
6
8
LDLR HMGCR SREBP-1a SREBP-2 INSIG1 SCAP
Nor
mal
isie
rte
mR
NA
Exp
ress
ion
Wildtyp
FH-W556R het.
FH-W556R hom.
∗
∗ p < 0.05 vs. WT
** p < 0.001 vs. WT
# p <0.05 Hom. vs. Het.
** #
* #
**
∗
**
** #
** #
0
1
2
3
4
5
SCARB1 ABCA1
Nor
mal
isie
rte
mR
NA
Exp
ress
ion
Wildtyp
FH-W556R het.
FH-W556R hom. * #
** #
*
*
∗ p < 0.05 vs. WT
** p < 0.001 vs. WT
# p < 0.05 Hom. vs. Het.
3. Ergebnisse 162
Tabelle 24: Zusammenfassung der ermittelten normalisierten mRNA- Expresssionen
der untersuchten Gene aus den Real- Time RT/PCR Experimenten mit Fibroblasten.
Relative Zunahme der mRNA-Expression
vs. Kontrolle (Ratio)
Untersuchtes Gen der Cholesterinbiosynthese Fibroblasten
(W556R het.)
Fibroblasten
(W556R hom.)
LDL- Rezeptor (LDLR) +2,28 fach +4,17 fach
Scavenger receptor class B type I (SCARB1) +2,15 fach +3,93 fach
ATP-binding cassette transporter 1 (ABCA1) +1,42 fach -4,34 fach
HMG- CoA- Reduktase (HMGCR) +2,42 fach +1,73 fach
Sterol regulatory element-binding protein (SREBP-2) +3,76 fach +6,29 fach
Sterol regulatory element-binding protein 1a (SREBP-1a) +2,08 fach +1,85 fach
Insulin induced gene 1 (INSIG 1) +3,76 fach +2,55 fach
SREBP cleavage activating protein (SCAP) +0,88 fach +0,79 fach
3.8.2 Die Expression von SCARB1 aber nicht ABCA1 ist in homozygoten FH-
W556RMarburg - Fibroblasten deutlich erhöht
Neben dem gemessenen Anstieg der Expressionen von LDL- Rezeptor, SREBP-2
INSIG 1, HMG- CoA- Reduktase und SREBP-1a war interessanterweise auch eine
deutlich erhöhte Expression und Translation von SCARB1, sowohl in heterozygoten als
auch in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten zu beobachten (+ 2,19 bzw.
3,93fach). Dieses deutet stark darauf hin, dass SCARB1 einen kollateralen Bypass-
Pathway darstellt, über den FH- W556RMarburg- Fibroblasten Cholesterinester
unabhängig vom LDLR- Pathway aufnehmen können. Dieses nicht- lysosomale
Cholesterin wird über die Bindung von HDL und LDL an SCARB1 in die Zelle
eingeschleust und steht den metabolischen Pools der Zelle dann direkt zur Verfügung
(Xie et al. 2006). Im Gegensatz zu SCARB1 war die Genexpression des
Cholesterintransporters ABCA1 in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten
dramatisch erniedrigt (- 4,34fach), was darauf hinweist, dass die intrazellulären
Cholesterinspiegel, trotz der Aktivierung des SCARB1- Pathways und der HMGCR
induzierten intrazellulären de novo Synthese von Cholesterin, nicht ausreichen, um
genügend LXR- Liganden für eine Aktivierung der ABCA1 Gen- Transkription zu
generieren. In heterozygoten Fibroblasten hingegen kann Cholesterin sowohl über de
3. Ergebnisse 163
novo Synthese, die Aufnahme über die noch vorhandenen Kopie des intakten LDL-
Rezeptors, als auch via SCARB1 aufgenommen werden. In diesen Zellen sind die
intrazellulären Cholesterinspiegel hoch genug, um genügend LXR- Liganden für eine
Aktivierung der ABCA1 Gen- Transkription zu generieren, was dazu führt, dass
überschüssiges unverestertes Cholesterin via ABCA1 aus der Zelle augeschleust wird.
(siehe auch Punkt 4. Diskussion dieser Arbeit). Abbildung 39 zeigt die gesteigerte
SCARB1- Proteinsynthese in FH- W556RMarburg- Fibroblasten in einer Westernblot-
Analyse.
Abbildung 39: Westernblot- Analyse von SCARB1 aus isolierten Membranproteinextrakten
von Wildtyp und FH- W556RMarburg- Fibroblasten. Es zeigt sich eine deutlich gesteigerte
Proteinsynthese von SCARB1 in heterozygoten und homozygoten FH- W556RMarburg-
Fibroblasten (Na+/K+ - ATPase = housekeeping Membranprotein; Natrium Kalium ATPase).
Westernblot (SCARB1)
WT. Het. Hom. KDa
84
47
SCARB1
Na+/K+ - ATPase
3. Ergebnisse 164
3.9 In vivo Turnover- Untersuchung von ApoB- H3543YMarburg und FH-
W556RMarburg mittels stabiler Isotopentechnik
Zur detaillierten Erfassung der metabolischen und klinischen Auswirkungen der neu
identifizierten Mutationen ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg auf den
Lipidstoffwechsel in vivo wurden mit je einem Träger der ApoB- H3543YMarburg -
Mutation (Patient, dessen ApoB- H3543YMarburg LDL in den Zellkulturexperimenten
verwendet wurde), sowie dem heterozygot betroffenen Vater der FH- W556RMarburg –
Zwillinge und 6 gesunden Normalprobanden, eine in vivo Turnover- Untersuchung zur
Verstoffwechselung des VLDL und LDL- ApoB- 100 mittels stabiler Isotopentechnik
durchgeführt. Als Tracer- Aminosäure für den Einbau in neu synthetisierte Proteine
wurde die dreifach mit Deuterium (3- D) markierte essentielle Aminosäure L- Leucin
verwendet (Fa. MSD, USA). Da es sich um eine am Menschen durchgeführte Studie
handelte, wurde ein detailliertes Studienprotokoll erstellt, das von der lokalen
Ethikkommission auf der Basis der Helsinki- Deklaration von 1975 in der revidierten
Form von 1996 genehmigt wurde (Ethikkomission der Philipps-Universität-Marburg,
Aktenzeichen Studie: 10/03). Zusätzlich wurde jeder Studien-Teilnehmer im „informed
conset“ ausführlich über die Untersuchung aufgeklärt. Nach einer Medikamenten-wash-
out-Phase von 6 Wochen erhielten die Probanden drei Tage vor Studienbeginn eine
isokalorische Standardkost mit einem Energiegehalt von 30 kcal pro kg Körpergewicht
(20% Eiweiß, 30% Fett, 50% Kohlenhydrate und maximal 300 mg Cholesterin pro
Tag). Die Studie selbst wurde unter „Nüchtern-Bedingungen“ durchgeführt. Während
der Studie durften die Probanden lediglich Trinkwasser zu sich nehmen. Sie erhielten in
jede Ellenbeuge eine Venenverweilkanüle. Über den ersten Zugang erfolgte die
Tracerapplikation, über den zweiten die Blutentnahmen. Zu Studienbeginn erfolgte eine
Bolus- Injektion von 10 mmol (5,5,5- D3)- L- Leucin/kg Körpergewicht (KG), gefolgt
von einer konstanten Infusion über einen Infusomat von 10 µmol/kg (KG) des Tracers
(Cohn et al. 1990). Während der gesamten Studiendauer von 12 Stunden. erfolgten nach
festem Zeitschema insgesamt 18 Blutentnahmen von jeweils 20 ml EDTA-Blut pro
Zeitpunkt: 1. Blutentnahme zum Zeitpunkt 0, vor Bolusgabe: in den ersten 40 Min. alle
10 Min.; nach 60 Min. und 90 Min., beginnend mit der 2. Stunde, jeweils stündlich. In
der Tabelle 25 sind die Lipoproteinprofile der untersuchten Probanden nach
Durchführung der Studie dargestellt.
3. Ergebnisse 165
Tabelle 25: Lipoproteinprofile der 6 untersuchten männlichen Kontrollpersonen, sowie
der heterozygoten ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg- Mutationsträger. Die
Tabelle zeigt die ermittelten Mittelwerte der 18 Blutentnahmen nach durchgeführter
Studie.
Patient AlterGC
mg/dl
Tgl.
mg/dl
HDL-C
mg/dl
LDL-C
mg/dl
ApoA-I
mg/dl
ApoB
mg/dl
Kontrolle 1 36 138 97 34 85 108 74
Kontrolle 2 30 190 45 35 147 142 111
Kontrolle 3 28 140 53 37 92 137 85
Kontrolle 4 26 161 39 44 109 143 90
Kontrolle 5 26 136 36 47 82 142 80
Kontrolle 6 26 127 26 50 72 157 66
MW ± SD 29 ± 3,6 149 ± 21,1 49 ± 22,3 41 ± 6,1 98 ± 24,7 138 ± 14,8 84 ± 14,1
ApoB H3543YMarburg
49 192 94 44 129 143 105
FH- W556RMarburg 36 279 341 36 174 129 140
3.9.1 Isolierung und Aufreinigung der Lipoproteinfraktionen von Kontroll-, ApoB-
H3543YMarburg - und FH- W556RMarburg - Patienten für die GC/MS- Messungen
Für die in vivo- Kinetikuntersuchungen wurden direkt nach Abschluss der Studie die
einzelnen Lipoproteinfraktionen (VLDL, IDL, LDL und HDL) aus den 18 gewonnenen
Plasmaproben der Probanden- wie unter Material und Methoden beschrieben- über
sequentielle Ultrazentrifugation isoliert. Nach Dialyse und Delipidierung der einzelnen
Fraktionen wurden diese in SDS- Probenpuffer aufgenommen und die Lipoproteine in
5-15 % präparativen SDS- Gradientengelen aufgetrennt, in Commassie- Lösung gefärbt,
anschließend entfärbt und folgende Proteinbanden der einzelnen Fraktionen
ausgeschnitten. VLDL: ApoB- 100 und ApoE, LDL: ApoB- 100, HDL: Apo A-I.
Zusätzlich wurde ein Gelstück ohne Protein als Negativ- Kontrolle (Blank) mit
ausgeschnitten. Nach Hydrolyse der entsprechenden Proteinbanden und Isolierung der
Aminosäuren über Kationenaustauschersäulen wurden die Proben derivatisiert, in
Etylacetat gelöst und die Isotopenanreicherung- wie unter „Material und Methoden“
3. Ergebnisse 166
beschrieben- mittels GC/MS- Messung bestimmt. Zur Berechnung der Kinetiken der
Apolipoproteine wurde in parallelen Ansätzen die Menge an freien Plasmaaminosäuren
von jedem Messzeitpunkt bestimmt. Hierzu wurden die freien Aminosäuren mittels
Kationenaustauschersäulen aus dem Plasma isoliert, derivatisiert und durch GC/MS
quantifiziert. Abbildung 40 zeigt ein SDS- Polyacrylamidgel der aufgetrennten
Lipoproteine.
SDS- Polyacrylamidgel zur Auftrennung der Lipoproteine
Abbildung 40: SDS- Gradientengel (5-15%) zur Auftrennung der mittels sequentieller
Ultrazentrifugation isolierten Apoproteine (ApoB- 100, ApoE und Apo A-I) aus VLDL, IDL,
LDL und HDL. Zur besseren Identifikation wurde aufgereinigtes (Fa. Calbiochem, Darmstadt)
ApoE und Apo A-I mit aufgetragen. Std= Broad Range Proteinstandard (Fa. BioRad,
München).
VLDL IDL LDL HDL ApoE Apo A-I Std.
ApoB- 100
ApoE
Apo A-I
Albumin
200
116
97
66
45
31
21
KDa
3. Ergebnisse 167
3.9.2 Ergebnisse der in vivo- Kinetikuntersuchung von Kontroll-, ApoB-
H3543YMarburg - und FH- W556RMarburg - Patienten
3.9.3 Tracer/Tracee- Ratios der freien Plasmaaminosäuren
Der Plateauwert der freien Plasmaaminosäuren wurde bei allen Probanden nach circa 30
Minuten erreicht und war während der gesamten Infusionszeit nahezu konstant. Bei den
Kontrollen lag er im Mittel bei 7,0% ± 0,9, für den ApoB- H3543YMarburg- Patient bei
8,5% ± 0,85 und für den Träger von FH- W556RMarburg bei 6,5% ± 0,68. Diese Werte
sind vergleichbar mit den bisher in der Literatur beschriebenen FAA- Anreicherungen
(Cohn et al. 1990; Schaefer et al. 1992; Fisher et al. 1997; Venkatakrishnan et al. 1997).
Die Abbildung 41 zeigt das Tracer/Tracee- Verhältnis wahrend der Infusionsdauer.
Abbildung 41: Grafische Darstellung des Tracer/Tracee- Verhältnis (%) der freien
Plasmaaminosäuren während der Infusionszeit von 12 Stunden. Kontrollen (rote Kurve +/-SD),
ApoB- H3543YMarburg- Patient (blaue Kurve) sowie FH- W556RMarburg- Patient (grüne Kurve).
Freie Plasmaaminosäuren
0,01
0,10
1,00
10,00
100,00
0 2 4 6 8 10 12 14
Zeit/h
Tra
cer/
Tra
cee
%
3. Ergebnisse 168
3.9.4 In vivo Turnover von VLDL ApoB- 100
Da VLDL ApoB- 100 vergleichsweise schnell verstoffwechselt wird, erreichten alle
Normalprobanden einen stabilen VLDL ApoB- 100- Plateauwert der Tracer/Tracee-
Anreicherung nach ca. 6 bis 7 Stunden. Ebenso zeigte sich eine hohe Korrelation
zwischen Traceranreicherung der freien Plasmaaminosäuren und dem Plateauwert der
VLDL ApoB- 100- Fraktion bei den Kontrollen (MW: FAA 7,8% ± SD 0,9; MW:
VLDL ApoB- 100 7,0%, ± SD 1,0) (Cummings et al. 1995). Abbildung 42 zeigt die
Darstellung des Tracer/Tracee- Verhältnis von VLDL ApoB-100 (%) während der
Infusionszeit von 12 Stunden bei den heterozygot betroffenen ApoB- H3543YMarburg
(blaue Kurve) und FH- W556RMarburg- Patienten (grüne Kurve), sowie dem
Kontrollkollektiv (rote Kurve ± SD).
Abbildung 42: Grafische Darstellung des Tracer/Tracee- Verhältnis von VLDL ApoB- 100 (%)
während der Infusionszeit von 12 Stunden. Kontrollen (rote Kurve +/-SD), ApoB-
H3543YMarburg -Patient (blaue Kurve) und FH- W556RMarburg (grüne Kurve).
VLDL ApoB-100
0
1
2
3
4
5
6
7
0 2 4 6 8 10 12 14
Zeit/h
Tra
cer/
Tra
cee
%
3. Ergebnisse 169
LDL ApoB-100
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 2 4 6 8 10 12 14
Zeit/h
Tra
cer/
Tra
cee
%3.9.5 In vivo Turnover von LDL ApoB- 100
Wie zu erwarten erreichte keiner der Normalprobanden, als auch der ApoB-
H3543YMarburg FH- W556RMarburg- Patienten einen Plateauwert für das nur langsam
verstoffwechselte LDL ApoB- 100. Zur Berechnung der Kinetikwerte wurden daher die
Plateaus des VLDL ApoB- 100 verwendet. In der Abbildung 43 sind die in vivo-
Kinetikdaten des LDL ApoB- 100 von allen Probanden aufgezeigt. In der Tabelle 26
sind die ermittelten Kinetikdaten für: Fraktionelle Katabolismusrate (FCR),
Plasmaverweildauer (RT), Poolgröße, sowie Produktionsrate (PR) von LDL ApoB- 100
zusammengefasst.
Abbildung 43: Grafische Darstellung des Tracer/Tracee- Verhältnis von LDL ApoB- 100 (%)
während der Infusionszeit von 12 Stunden. ApoB- H3543YMarburg- Patient (blaue kurve) FH-
W556RMarburg - Patient (grüne Kurve) und Kontrollkollektiv ± SD (rote Kurve).
3. Ergebnisse 170
Tabelle 26: Kinetik- Daten des LDL ApoB- 100 von ApoB- H3543YMarburg, FH-
W556RMarburg und der Kontrollen. FCR ist die fraktionelle Katabolismusrate in Tagen,
RT ist die Verweildauer im Plasma (Residence Time), Pool das gesamte Apo B- 100 im
Plasma in mg/L. PR die ApoB- 100- Produktionsrate in mg pro kg proTag. MW=
Mittelwerte der 6 Normalprobanden ± SD.
LDL- ApoB-100
Proband FCR RT Pool PR
Kontrolle 1 0,39 2,53 68 10,7
Kontrolle 2 0,40 2,50 107 17,1
Kontrolle 3 0,25 4,00 82 8,2
Kontrolle 4 0,25 4,00 88 8,8
Kontrolle 5 0,36 2,80 78 11,2
Kontrolle 6 0,50 2,00 64 12,8
MW ± SD 0,36 ± 0,1 2,97 ± 0,8 81,2 ± 15,5 11,5 ± 3,2
ApoB- H3543YMarburg 0,10 10 140 5,6
FH- W556RMarburg 0,19 5,3 169,0 13,0
Die FCR und die PR der Normalprobanden lagen im Bereich publizierter Werte
vergleichbarer Normalkollektive anderer Arbeitsgruppen (Cohn et al. 1990; Pietzsch et
al. 1996; Schaefer 1997). Beim ApoB- H3543YMarburg- Träger war die FCR von LDL-
ApoB- 100 mit 0,1 Pools/Tag versus 0,36 bei den Kontrollen deutlich verzögert, dies
entsprach einer Reduktion von -28%. Die RT war mit 10 Tagen vs. 2,97 bei den
Kontrollen um das dreifache verlängert. Für die Produktionsrate ergab sich eine
Reduktion von 5,6 mg/kg x d vs. 11,5 mg/kg x d, was einer Senkung der PR auf 49%
des Normalen entsprach. Bei FH- W556RMarburg ergab sich für LDL ApoB- 100 eine
FCR von 0,19, was einer Reduktion auf 47% des Normwertes entsprach. Die
„Residence Time“ war mit 5,3 auf das 1,8fache verlängert. Die Produktionsrate (PR)
war beim FH- W556RMarburg- Träger um 13% erhöht und betrug 13 mg/kg x d
gegenüber einem Mittelwert von 11,5 in der Kontrollgruppe.
3. Ergebnisse 171
3.9.10 Varia: Ergebnisse weiterer genetischer Studien mit dem Kollektiv der
Marburger Präventions- Allianz
Neben den detaillierten funktionellen Charakterisierungen von ApoB- H3543YMarburg
und FH- W556RMarburg, die im Rahmen dieser Arbeit erfolgten, wurden eine Reihe
weiterer Studien zur Identifizierung von Mutationen/Polymorphismen in
Kandidatengenen, die bei Lipidstoffwechselstörungen und koronarer Herzkrankheit eine
Rolle spielen, durchgeführt. Hierzu wurden Patienten der Marburger- Präventions-
Allianz je nach Fragestellung entweder konsekutiv oder auf der Basis vorhandener
kardiovaskulärer Risikofaktoren ausgewählt. In den folgenden Abschnitten sind die
Ergebnisse dieser Untersuchungen kurz zusammengefasst.
3.9.10.1 Identifikation der ApoA5 S19W- Mutation als Kofaktor für die
Ausbildung von Hyperlipidämie bei Patienten mit dem Phänotyp ApoE 2/2
In einer DGGE- Mutationsscreening-Studie des kompletten ApoA5- Gens mit 170
hypertriglyzeridämischen Patienten aus dem Kollektiv der Marburger Präventions-
Allianz konnten wir zeigen, dass ApoA5 einen wesentlichen Kofaktor für die
Hyperlipoproteinämie bei ApoE 2/2 darstellt. Apolipoprotein A5 wird in der Leber
expremiert und senkt die Plasma- Triglyzeridspiegel, indem es die Produktion
triglyzeridreicher Lipoproteine (VLDL) in der Leber reduziert und die Aktivität der
Lipoproteinlipase stimuliert. Wir konnten zeigen, dass bei 7 identifizierten
hypertriglyzeridämischen ApoE 2/2- Trägern zusätzlich die heterozygote ApoA5
S19W- Mutation vorlag. Dieser Befund ist insofern von Bedeutung, da ApoE 2/2 in der
Normalbevölkerung mit einer Häufigkeit von 0,6% vorkommt und nur 10% dieser Apo-
E 2/2- Träger eine Hypertriglyzeridämie entwickeln. Intersessanterweise liegt die
Frequenz von ApoA5 S19W in der Normalbevölkerung bei 10,9%, was der Häufigkeit
der durch ApoE 2/2 induzierten Hypertriglyzeridämie entspricht (Schaefer et al. 2004).
3.9.10.2 Einfluss von Osteoprotegerin (OPG) Polymorphismen auf die koronare
Herzkrankheit (KHK)
In dieser Studie wurde das komplette Osteoprotegerin- Gen bei 468 konsekutiv
gesammelten Patienten der Marburger Präventions- Allianz mit und ohne koronararer
Herzkrankheit, mittels DGGE- Mutationsscreening untersucht. Osteoprotegerin (OPG)
antagonisiert den Nuclear Faktor- Kappa B- Liganden (RANKL), der ein zentraler
3. Ergebnisse 172
Regulator des Osteoklastenstoffwechsels ist. Studien mit OPG- defizienten Tieren
zeigten eine starke Osteoporose und arterielle Kalzifizierung in diesen Tieren. Im
DGGE- Screening wurden 5 Basensubstitutionen im Promotor (-149 T-->C, -163 A--
>G, -209 G-->A, -245 T-->G, -950 T-->C), eine in Exon 1 (1181 G-->C), sowie eine in
Intron 4 (6890 A-->C) identifiziert. Träger der Genotypen -950 TC/ 1181 GC und -950
CC/1181 CC hatten ein signifikant höheres KHK- Risiko. Außerdem zeigte sich eine
signifikante Korrelation des C- Allels mit den Serum- OPG- Spiegeln. Unsere Studie
zeigte, dass genetische Variationen an den Positionen -950 und 1181 zu einem erhöhten
Risiko für KHK führen (Soufi et al. 2004).
3.9.10.3 Promotor-Mutationen der Cytochrome P 450- epoxygenase (CYP2J2) bei
Patienten mit koronare Herzkrankheit (KHK)
In einer case- control- Studie mit 534 Patienten aus den Kollektiven der Marburger
Präventions- Allianz und dem Universitätsklinikum der Ruhr- Universität Bochum,
wurde der Einfluss von Mutationen im Cytochrom P450- Gen (CYP2J) auf die koronare
Herzkrankheit untersucht. CYP2J2 wird in Endothelzellen expremiert und metabolisiert
Arachidonsäure zu Epoxyeicanoidsäuren (EETs). EETs sind potente Vasodilatatoren
und inhibieren die vaskuläre Inflammation. Es konnte eine funktionell relevante
Mutation (-50 G/T) im Promotor von CYP2J identifiziert werden. Träger der Mutation
hatten signifikant erniedrigte EET- Spiegel und ein erhöhtes Risiko für KHK (Spiecker
et al. 2004).
3.9.10.4 Untersuchungen des Gens der endothelialen NO- Synthase (eNOS) bei
Patienten mit KHK
Im Rahmen einer DGGE- Mutationsscreening- Studie wurden konsekutiv jeweils 795
Patienten aus dem Kollektiv der Marburger Präventions- Allianz auf Mutationen in 8
unterschiedlichen Regionen des Gens der endothelialen NO- Synthase (eNOS), die für
konservierte Regionen der eNOS codieren, untersucht. Die endotheliale
Stickstoffmonoxid- Synthase (eNOS) ist in den Zellen der Gefäßwand lokalisiert und
katalysiert die Bildung von NO aus dem Substrat L- Arginin, was zu einer Aktivierung
der Guanylatzyklase und Bildung von zyklischem Guanosin- monophosphat (cGMP)
führt, über das der Tonus der glatten Muskelzellen reguliert wird. Es konnte eine bisher
unbeschriebene heterozygote Mutation C1463T im eNOS- Gen, die zu einer
3. Ergebnisse 173
Substitution der Aminosäure Thr488Ilein der Calmodulin- bindenden Domäne von
eNOS führt identifiziert werden. Thr 488 ist einer von drei konservierten
Threoninresten, die reziprok phosphoriliert/dephosphoriliert werden und die Aktivität
der eNOS unter verschiedenen physiologischen Gegebenheiten modulieren. Beim
Mutationsträger handelte es sich um einen 49- jährigen Patienten mit einer 2- Gefäß-
KHK, der neben einer positiven Familienanamnese eine Neigung zu Vasospasmen
aufwies, was auf eine funktionelle Relevanz der Mutation schließen lässt. Zusätzlich
zum Screening auf neue eNOS- Mutationen wurde der vorbeschriebenen eNOS-
Polymorphismus Glu298Asp untersucht, dessen Assoziation hinsichtlich KHK
kontrovers diskutiert wird. Unsere Untersuchungen ergaben, dass dieser
Polymorphismus in Deutschland keine Assoziation mit KHK zeigte, was im Einklang
mit den Ergebnissen einer weiteren Studie aus Deutschland steht, in der bei 3250
untersuchten koronarangiographierten Patienten ebenfalls kein Zusammenhang von
eNOS Glu298Asp mit KHK gefunden wurde (Gardemann et al. 2002). Unsere
Mutationsanalyse der eNOS konnte zeigen, dass funktionelle Domänen der eNOS einen
hohen Konservierungsgrad aufweisen, was die enorme Bedeutung der eNOS für den
Nitric Oxide Pathway aufzeigt (Soufi M, Imhof M, Sattler AM, Rafat M, Maisch B, und
Schaefer JR. Mutationsscreening der endothelialen NO- Synthase (eNOS). (2002). 108.
Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Innere Medizin (DGIM) in Wiesbaden 1.
Posterpreis in der Sektion Angiologie).
3.9.10.5 Untersuchungen von Apolipoprotein E (ApoE) bei Patienten mit
Hypertriglyzeridämie
In dieser Studie wurde Apolipoprotein E (ApoE), bei 130 Patienten mit
Hypertriglyzeridämie sowohl molekulargenetisch mittels direkter Sequenzierung des
ApoE- Gens, als auch auf Proteinebene durch isoelektrische Fokussierung (IEF)
untersucht. ApoE erfüllt wesentliche Aufgaben bei der Verstoffwechselung der
Chylomikronen und VLDL und ist Ligand von LDL- Rezeptor, VLDL- Rezeptor und
LRP (LDL- Rezeptor- related Protein). Die Studie identifizierte bei einem Patienten mit
ausgeprägter Hypertriglyzeridämie (Tgl. 510 mg/dl) gleichzeitig zwei heterozygote
Basensubstitutionen in Exon 1 (T3100C) und Exon 4 (C3371T), welche zu zwei
Aminosäuresubstitutionen Leu28Pro und Leu141Met in ApoE führen. Neben der bereits
vorbeschriebenen Mutation Leu28Pro (Orth et al. 1999), liegt die neue zusätzlich
3. Ergebnisse 174
identifizierte Mutation Leu141Met innerhalb der LDL- Rezeptor- Bindungsregion von
Apo E (AS 136-150). Mutationen in diesem Bereich bewirken eine verminderte
Bindung von ApoE an den LDL- Rezeptor und führen über diesen Mechanismus zu
Hyperlipidämien. Am häufigsten betroffen sind positiv geladene Aminosäuren in dieser
Region (Arg; His; Lys 136-150). Neben den positiv geladenen Aminosäuren spielen
auch Leuzine für die Stabilisierung der Bindungsregion eine wichtige Rolle. Aufgrund
des deutlich ausgeprägten Phänotyps ist es naheliegend, dass es durch den zusätzlichen
Aminosäureaustausch zu einer gestörten Bindung von ApoE an den LDL- Rezeptor und
somit zu einem verzögerten Abbau triglyzeridhaltiger Partikel kommt. (Soufi M,
Hackler R, Sattler AM, Maisch B, und Schaefer JR. Nachweis einer neuen Variante des
Apolipoprotein E (Leu141Met) bei einem Patienten mit therapierefraktärer
Hyperlipidämie. (2001). 107. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Innere
Medizin (DGIM) in Wiesbaden 1. Posterpreis in der Sektion Endokrinologie).
4. Diskussion 175
4. Diskussion
4.1 ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg zwei neue, häufig vorkommende
Defekte in zentralen Proteinen des Lipidstoffwechsels
ApoB- 100 ist die alleinige Proteinkomponente der atherogenen LDL und spielt als
Ligand des LDL- Rezeptors eine zentrale Rolle bei der rezeptorvermittelten „clearance“
dieser Lipoproteinpartikel aus der Zirkulation. Etwa zwei Drittel der entstandenen LDL
werden in die Leber sowie in periphere Gewebe aufgenommen, der Rest wird
unspezifisch über Scavanger- Rezeptoren aufgenommen. In den Zellen wird das LDL-
Cholesterin dann als wichtiger Membranbaustein und zur Synthese von
Steroidhormonen verwendet oder in Form von Cholesterinestern gespeichert. Störungen
in der Verstoffwechselung und Akkumulation von LDL sind nach heutigen
Erkenntnissen einer der Haupt- Pathomechanismen für die Ausbildung von kardialer
und zerebrovaskulärer Atherosklerose; Krankheiten, die heute für nahezu 50% der
Todesfälle in den westlichen Industrienationen verantwortlich sind (Schaefer 1998), was
durch große prospektive epidemiologische (Framingham- Study und PROCAM- Studie)
(Castelli 1982; Assmann et al. 2002) sowie einer Vielzahl von geographischen
Assoziations- Studien belegt werden konnte. Eine der genetischen Ursachen für einen
verzögerten LDL- Katabolismus und ein erhöhtes Atheroskleroserisiko sind Mutationen
des ApoB- 100 (Vrablik et al. 2001; Whitfield et al. 2004), die autosomal dominant
vererbt werden. Als Folge dieser Defekte kommt es zu einer reduzierten Bindung von
Apo B- 100 an den LDL- Rezeptor und zu einem Anstieg der Plasma- LDL-
Konzentration bei den betroffenen Patienten. Weltweit wurden bisher vier Apo B- 100 -
Defekte (ApoB- R3500Q, ApoB- R3500W, ApoB- R3531C und ApoB- R3480W)
beschrieben, die zu einem veränderten LDL- Katabolismus führen (Soria et al. 1989;
Pullinger et al. 1995; Gaffney et al. 1995). Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten
genetischen DGGE- Screening- Studien mit 853 konsekutiv gesammelten Proben aus
dem koronarangiografierten Patienten- Kollektiv der Marburger Präventions- Allianz
(Schaefer et al. 2000) führten zur Detektion eines weiteren bisher unbekannten ApoB-
100- Defektes (ApoB- H3543YMarburg) in einer aus Deutschland stammenden Population
(Soufi et al. 2004). Im untersuchten Kollektiv konnte diese Mutation bei insgesamt vier
Patienten nachgewiesen werden. Bisherige Untersuchungen über die Häufigkeiten der
4. Diskussion 176
bisher identifizierten vier ApoB- 100 Defekte in unterschiedlichen kaukasischen
Populationen, ergaben für die R3500Q- Mutation Prävalenzen, die bei 1:500 bis 1:1000
in der Normalpopulation lagen (Tybjaerg-Hansen et al. 1990; Innerarity et al. 1990;
Tybjaerg-Hansen et al. 1998). Vereinzelt fanden sich in einigen vorselektionierten
Populationen (Patienten mit Typ II a Hypercholestrinämie) jedoch auch höhere
Prävalenzen, die bei 1:250 (Schweiz) (Miserez und Keller 1995; Miserez und Muller
2000), sowie 1:114 im Rhein- Main- Gebiet (Fisher et al. 2000) lagen, was
wahrscheinlich auf ein sampling Bias in diesen Kollektiven zurückzuführen ist.
Ähnliche Häufigkeiten fanden sich auch für die ApoB- R3531- Mutation in
vorselektionierten Populationen aus Kliniken mit Lipidstoffwechselambulanzen. Hier
wurden die höchsten Prävalenzen mit 1: 206-1:1000 in Großbritannien und Frankreich
ermittelt (Rabes et al. 1997; Pullinger et al. 1999). Die dritte bisher beschriebene
Mutante R3500W scheint in Europa weniger häufig zu sein (Tybjaerg-Hansen et al.
1998), stattdessen besitzt die Mutation in asiatischen Populationen eine annähernd hohe
Prävalenz wie R3500Q in Europa (Choong et al. 1997; Tai et al. 1998). Die ApoB-
R3480W- Mutation wurde von Boren bisher lediglich bei einem Patienten in einer
Untersuchung von 2500 hypercholesterinämischen Patienten in den USA identifiziert.
Daten bezüglich der Prävalenz in Europa liegen bisher noch nicht vor (Boren et al.
2001). Ein Vergleich der bisher gefundenen Prävalenzen der ApoB- Mutationen mit den
in dieser Arbeit gefundenen Daten für (ApoB- H3543YMarburg) zeigt, dass die neue
identifizierte Mutation mit einer Prävalenz von 1: 213 eine sehr häufige Mutation in
Deutschland ist, wenn man sie mit den Daten für R3500Q im untersuchten Kollektiv
vergleicht (1 heterozygote Patientin unter 853 Probanden). Dies bestätigte sich auch in
einem zweiten unabhängigen aus, Südwest- Deutschland stammenden
koronarangiografierten Kollektiv der Ludwighafen Risk and Cardiovascular Health-
Study (LURIC-Studie) (Winkelmann et al. 2001), das ebenfalls mit DGEE- Screening
auf ApoB- Genmutationen untersucht wurde. Es fand sich eine annähernd gleiche
Häufigkeit der ApoB- H3543YMarburg- Mutation (12 heterozygote Patienten unter 3300
untersuchten Probanden, unpublizierte Daten aus der Abteilung von Prof. W. März,
Institut für Klinische Chemie der Universität Graz) wie im Marburger Kollektiv. Die
durchgeführte ApoB- Haplotypanalyse zur Seggregation von ApoB- H3543Y ermittelte
einen eigenständigen Konsensus- Haplotyp: Xba I +, Msp I +, Xsp I +, EcoR I + , 3´HVR
4. Diskussion 177
35, der sich von den bisher beschriebenen Haplotypen der anderen publizierten ApoB-
Mutationen unterschied (Wenham et al. 1997; Fisher et al. 1999). Bei der identifizierten
Patientin mit der ApoB- R3500Q- Mutation fand sich der für diese Mutation in
kaukasischen Populationen am häufigsten gefundene Konsensus- Haplotyp 194: Xba I -,
Msp I +, Xsp I +, EcoR I + und 3´HVR 49 (Ludwig und McCarthy 1990; Castillo et al.
2002). Da nahezu alle bisherigen ApoB- Mutationsträger europäischen Ursprungs sind,
wird vermutet, dass die meisten R3500Q- Mutationsträger von einem gemeinsamen
Vorfahren keltischen Ursprungs abstammen, der vor ca. 6750 Jahren in Europa lebte
(Miserez und Muller 2000), was auch den häufig gefundenen Konsensus- Haplotyp 194
erklärt. Wir konnten ApoB- H3543YMarburg bisher nur in heterozygoter Form bei
Personen mit deutsch- ethnischem Hintergrund identifizieren. Es könnte sein, dass
ApoB- H3543YMarburg populationsgenetisch ein „founder effect“ ist, der einer anderen
Volksgruppe entstammt. Interessanterweise besaßen alle bisher gefundenen
Mutationsträger Vorfahren im Osten Europas (Schlesien, Ostpreußen, Pommern). Die
hohe Prävalenz der Mutation in den von uns untersuchten Kollektiven könnte somit
durch Migration (Völkerwanderung) von Osten nach Westen nach Marburg gekommen
sein. Um diese Hypothese zu bestätigen, sind weitere populationsgenetische Studien in
unterschiedlichen Regionen Deutschlands und Osteuropas zur Inzidenz von ApoB-
H3543YMarburg notwendig. Die Frage, warum ApoB- H3543YMarburg in Deutschland
nicht schon früher identifiziert wurde, lässt sich durch die unterschiedlichen
molekularbiologischen Nachweisverfahren zur Detektion der Mutationen in
Lipidkliniken/Ambulanzen erklären. In den meisten Fällen erfolgt bei Verdacht auf
Dyslipidämien ein spezifischer PCR- RFLP- Nachweis der Mutationen R3500Q und
R3531C auf DNA- Ebene (Hansen et al. 1991; Rust et al. 1993). Ein hochsensitives
DGGE- basiertes Screening, welches den Nachweis bekannter und neuer ApoB-
Genmutationen ermöglicht, wird in Deutschland nur von wenigen Arbeitsgruppen
durchgeführt (Fisher et al. 1999; Nauck et al. 2001).
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden extrem seltene und schon in frühester Kindheit
schwerstmanifestierte Formen der familiären Hypercholesterinämie (FH), die durch
Defekte im LDL- Rezeptor entstehen, untersucht. Bei der familiären
Hypercholesterinämie (FH) findet man klinisch eine massive Erhöhung der
Plasmakonzentration an LDL- Cholesterin- um das 2-6fache des Normalwertes. Die
4. Diskussion 178
Erkrankung wird autosomal dominant vererbt und ist mit einer Heterozygotenfrequenz
von ca. 1:250 (in Populationen mit founder effect) -1:500 (bei einer
Homozygotenfrequenz von ca. 1:1000000) eine der häufigsten monogenetisch vererbten
Stoffwechselerkrankungen (Goldstein und Brown 1989; Austin et al. 2004). Als Folge
der massiven LDL- Akkumulation kommt es zur chemischen Modifikation der LDL
(Acetylierung und Oxidation) und Einwanderung in den subendothelialen Raum, wo
weitere oxidative Prozesse zu einer unregulierten Aufnahme dieser LDL durch
Monozyten/Makrophagen über die Scavenger- Rezeptoren Typ- A-I/II (Krieger und
Herz 1994; Stary 1995) führen, was letztendlich dann zur Ausbildung von
komplizierten Plaques in den Arterien des systemischen Kreislaufs insbesondere der
Aorta und ihren Ästen, sowie der Koronararterien, Karotiden und Aortenklappen führt.
Die Lebenserwartung unbehandelter homozygoter Patienten (compound heterozygot)
liegt unter 20 Jahren. Für „true homozygous“- FH liegt die Lebenserwartung je nach
Defekt, unter 10 Jahren. In der hier vorliegenden Arbeit konnte erstmals eine neue
homozygote FH- Mutation (FH- W556RMarburg) bei einem eineiigen männlichen
türkischen Zwillingspaar identifiziert werden, das einer consanguinen Ehe beider Eltern
entstammte. Betrachtet man die Häufigkeit einer Geburt von eineiigen Zwillingen, die
bei ca. 1:300 liegt und die Inzidenz für eine homozygote FH, welche 1:1000000 beträgt,
so dürften rechnerisch etwa 20 homozygote eineiige FH- Zwillingspaare auf der Erde
leben, von denen wahrscheinlich viele schon wegen mangelnder ärztlicher Versorgung
und frühzeitiger medizinischer Intervention an den Folgen kardiovaskulärer oder
zerbrovaskulärer Ereignisse verstorben sind. In der Literatur fand sich bis heute keine
beschriebene homozygote familiäre Hypercholesterinämie bei eineigen Zwillingen,
sodass davon ausgegangen werden kann, dass FH- W556RMarburg zur Zeit weltweit der
einzige Fall dieser Art ist. Die Untersuchung einer zweiten FH- Familie (ebenfalls ein
consanguines Eheverhältnis der Eltern) aus dem Libanon führte zum erneuten Nachweis
von FH- W556RMarburg in homozygoter Form bei einem 4- jährigen Mädchen.
Interssanterweise zeigten sich bei diesem Mädchen, verglichen mit den Jungen aus der
türkischen Familie, deutlich niedrigere initiale Werte (ohne therapeutische Intervention)
für das atherogene LDL- Cholesterin (- 30%) und höhere Werte für das vasoprotektive
HDL- Cholesterin (+ 75%). Diese Tendenz zeigte sich auch bei den heterozygoten
Müttern aus beiden Familien. Die Tatsache, dass trotz Vorliegen einer identischen
4. Diskussion 179
LDLR- Mutation bei Frauen ein moderateres Lipidprofil vorliegt als bei Männern, lässt
auf zusätzliche Mechanismen schließen, die bei Frauen zur Ausprägung eines weniger
atherogenen Lipidphänotyps führen (z.B. durch eine effizientere Aktivierung von LDLR
und Scavanger- Rezeptor- Pathways, und/oder einen aktiveren zellulären
Cholesterintransport durch Mitglieder der ATP- bindenden Cholesterintransporter
ABCA und ABCG). Ein möglicher Grund für diese Unterschiede könnte in einer
zusätzlichen Aktivierung der Genexpression über hormonelle Stimuli bei Frauen liegen.
Seit längerer Zeit ist bekannt, dass Sexualhormone einen Einfluss auf die
kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität bei Frauen und Männern haben (Mendelsohn
und Karas 2005). Während Androgene (männliche Geschlechtshormone) einen
Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen darstellen, wird den Östrogenen
(weibliche Geschlechtshormone) eine KHK- Schutzfunktion zugesprochen. Der durch
Östrogene hervorgerufene vasoprotektive Schutzeffekt wird bei Frauen durch höhere
HDL- und niedrigere LDL- Spiegel hervorgerufen, geht jedoch postmenopausal
verloren und führt danach sogar zu einer höheren kardiovaskulären Morbidität und
Mortalität bei Frauen. Bisher sind die genauen Mechanismen über die Östrogene ihre
Schutzfunktion ausüben, nicht exakt aufgeklärt. Eine zentrale Rolle in diesem Prozess
scheint jedoch der Östrogenrezeptor (ER-
Zellkulturmodellen konnte eine Mitwirkung von ER- -
regulierten Genen des Lipidstoffwechsels aufgezeigt werden (Lopez et al. 2002). Diese
Studien ermittelten, dass ER- Transkription von LDLR, SCARB1 und ABCA1
zellspezifisch regulieren kann, sowohl über direkte Mechanismen (Bindung an HREs
und cis- acting SP1 repeats in den Promotoren dieser Gene), als auch indirekt durch
Interaktion mit an den Promotor gebundenen Transkriptionsfaktoren der basalen
Transkriptionsmaschinerie, jedoch ist bisher nicht genau bekannt, welche Faktoren die
ER- - vermittelte Aktivierung des SREBP/SCAP/INSIG- Pathways steuern. Die ER- -
vermittelte geschlechtspezifische Schutzfunktion vor Atherosklerose konnte auch in
tierexperimentellen Studien nachgewiesen werden. So konnte z.B. in LDLR- -- Mäusen
ein Schutz vor der Ausbildung von atherosklerotischen Läsionen und der CD36-
Rezeptor- vermittelten Akkummulation von Cholesterinestern in Makrophagen von
weiblichen Tieren gegenüber männlichen Tieren nachgewiesen werden, der dann
verloren ging, wenn es zu einer Inaktivierung von ER- - -- Tieren
4. Diskussion 180
kam (Allred et al. 2006). Diese Daten konnten somit zeigen, dass es
geschlechtspezifische hormonell induzierte regulatorische Mechanismen für die
Aktivierung des SREBP/SCAP/INSIG- Pathways gibt, die zu einer unterschiedlichen
Cholesterinverstoffwechselung in beiden Geschlechtern führen und damit verbunden
das Atheroskleroserisiko nachhaltig beeinflussen. Eine weitere Erklärung für die
unterschiedlichen HDL- und LDL- Spiegel bei Männern und Frauen mit der LDLR
W556R-Mutation, könnten zusätzliche SNPs und Haplotypen (Single Nucleotide
Polymorphisms) in Genen oder genregulatorischen Elementen (Enhancern/Silencern)
des Lipidstoffwechsels liefern, welche regulatorische, postranskriptionelle und
postranslationelle Mechanismen beeinflussen, die dann zu einem besseren/schlechteren
HDL- und LDL- Katabolismus führen (Betard et al. 1996). Prinzipiell liegt in der
Erforschung von geschlechtsspezifischen Mechanismen auf den Lipidstoffwechsel bei
Patienten mit identischer FH- Mutation ein hohes Potenzial für zukünftige
Therapieansätze. Hierzu sind jedoch weiterführende Experimente mit SNP- und
Genexpressionsarrays notwendig, um die zugrunde liegenden Faktoren/Mechanismen
zu identifizieren, damit diese Erkenntnisse dann für eine optimale Therapie von FH-
Patienten und auch anderen Patienten mit Lipidstoffwechselstörungen verwendet
werden können.
Die LDLR- Haplotypanalyse beider Familien konnte ein direktes Verwandschafts-
verhältnis aufgrund unterschiedlicher Haplotypen des LDLR- Wildtyp- Allels klar
ausschließen und zeigen, dass die Mutation FH- W556RMarburg in beiden Familien mit
dem Konsensus- Haplotyp: SfaN I +, Stu I +, Hinc II +, Ava II - und Nco I- vererbt wird,
was darauf hindeutet, dass es sich bei der neu identifizierten FH- W556R- Marburg -
Mutation wahrscheinlich um einen, im Mittleren Osten häufig vorkommenden „founder
effect“ handelt, der in den bisher durchgeführten populationsgenetischen Studien zu FH
in dieser Region, unentdeckt blieb. Aus den Daten der Dallas FH- Kollektion von
Goldstein und Brown an der Southwestern- University/Texas geht hervor, dass es im
Libanon bisher 4 homozygote FH- Mutationen gibt, die einem „founder effect“
enstammen (Lehrman et al. 1987). Diese konnten bei libanesischen Christen und
Angehörigen der Drusen, einer islamischen Sekte, die seit mehr als 1000 Jahren isoliert
im Libanon lebt, identifiziert werden (Landsberger et al. 1992). Bisher gibt es nur
geschätzte Daten zur Prävalenz von FH- Mutationen im gesamten Libanon, es wird
4. Diskussion 181
jedoch von einer Häufigkeit von 1:100000 für homozygote und 1:171 für heterozygote
FH ausgegangen (Goldstein und Brown 1989). Eine Studie von Sözen et al., die
während der Verfassung dieser Dissertation publiziert wurde, beschäftigte sich mit der
Prävalenz von FH und möglichen founder- Effekten in der Türkei (Sozen et al. 2005).
Diese Studie konnte zeigen, dass die W556R- Mutation mit einer Häufigkeit von 21,4%
die häufigste homozygote FH- Mutation in der Türkei ist. Diese Daten bestätigen unsere
erhobenen Befunde, die nahe legen, dass FH- W556RMarburg eine „founder mutation“ im
Mittleren Osten ist. In einer von Jensen et al. durchgeführten Studie zur Prävalenz von
FH in der dänischen Population (Jensen et al. 1997) wurde mittels SSCP- Analyse, bei
einer Untersuchung von 65 nicht miteinander verwandten dänischen FH- Familien, ein
neues FH- Allel identifiziert, welches die gleiche Aminosäure (Tryptophan 556) im
LDLR betraf, wie bei FH- W556RMarburg. Hierbei wurde Tryptophan 556 jedoch nicht
durch Arginin, sondern Serin substituiert (FH- W556S). Dieses neue FH- Allel wurde
bei 12% der dänischen FH- Familien (alle heterozygote Träger) identifiziert. Eine
LDLR- Haplotypanalyse ermittelte einen Konsensus-Haplotyp der auf einen „founder
effect“ der Mutation schließen ließ. Ein Abgleich mit dem für FH- W556RMarburg
ermittelten LDLR- Haplotyp zeigte einen anderen Haplotyp bei den dänischen FH-
Patienten, was darauf schließen lässt, dass es sich um zwei unabhängig voneinander
entstandene founder- Mutationen (unter der Annahme, dass keine
Rekombinationsereignisse am LDLR- Lokus stattgefunden haben) handelt.
4.1.1 ApoB- H3543YMarburg- und FH- W556RMarburg - funktionell relevante Defekte,
die über unterschiedlichen Mechanismen wirken
Die Untersuchungen zur funktionellen Relevanz der bisher identifizierten ApoB-
Defekte (R3500Q, R3500W R3531C und R3480W) durch Bindungs- und
Aufnahmexperimente in Zellkultur mit markierten LDL- Partikeln von heterozygoten
Mutationsträgern- ermittelten Bindungs- und Aufnahmekapazitäten, die bei ca. 30-70%
der Norm (Wildtyp- LDL) lagen (Gallagher und Myant 1995; Gaffney et al. 1995;
Pullinger et al. 1999), was zeigte, dass alle Aminosäuresubstitutionen in diesem Bereich
von nur 51 Aminosäuren, die zelluläre LDL- Bindung/Aufnahme deutlich reduzierten.
Erste Experimente zur funktionellen Relevanz dieser Region bei der Bindung von
ApoB- 100 an den LDLR wurden durch Untersuchungen und Bindungsstudien mit in
transgenen Mäusen generierten, trunkierten ApoB- Molekülen von Boren et al. am
4. Diskussion 182
Gladstone Institute of Cardiovascular Disease in San Francisco/USA gewonnen. In
ihren Experimenten identifizierten Boren et al. die Bindungsdomäne („B- site“) von
ApoB- 100 an den LDL- Rezeptor. Diese ist im Bereich der Aminosäuren 3359-3369
lokalisiert und nahezu identisch mit der ApoE- Bindungsstelle zum LDLR, was in
Domänen- Austausch und Bindungsexperimenten mit trunkierten ApoB- Molekülen
gezeigt werden konnte. In weiteren Experimenten fanden sie heraus, dass die ersten
89% des ApoB- 100 Moleküls den LDL- Partikel gürtelförmig umrunden, während die
verbliebenen 11% am carboxylterminalen Ende bogenförmig den Gürtel überqueren
(Boren et al. 1998), siehe Abbildung 44. Sie postulierten darauf ein Modell, bei dem das
carboxyterminale Ende des ApoB- 100 als negativer Modulator der LDL-
Rezeptorbindung fungiert und die Bindung der größeren VLDL- Partikel an den LDL-
Rezeptor verhindert. Erst durch die Lipolyse der VLDL und Umwandlung zu kleineren
IDL und LDL- Partikeln ändert das ApoB- 100- Molekül seine Konformation (Wang et
al. 2000) und erlaubt so eine Bindung über die „B- site“ an den LDL- Rezeptor. In
Aminosäureaustausch- Experimenten mit „site directed mutagenesis“ konnte in
weiterführenden Experimenten gezeigt werden, dass die Überquerung des
carboxyterminalen Gürtels an Position 3500 des ApoB- 100 durch die spezifische
Interaktion von Arginin 3500 (R3500) mit Tryptophan 4369 (W4369) hervorgerufen
wird und essentiell für die Bindung an den LDLR ist. Beim Krankheitsbild des FDB
(R3500Q- Mutation) ist diese Interaktion gestört, sodass die eigentliche
Rezeptorbindungsstelle „B- site“ partiell vom carboxyterminalen Gürtel maskiert wird,
was zu einer reduzierten LDL- Rezeptorbindung führt (Boren et al. 2001). ApoB-
H3543YMarburg ist nun eine weitere, neu identifizierte Mutation, die im Bereich des
carboxyterminalen Modulatorelements liegt. Vergleicht man alle ApoB- Defekte in
dieser Region miteinander, so zeigt sich, dass alle mit dem Verlust der positiv
geladenen Aminosäure Arginin (R) einhergehen, die bei allen Defekten durch eine
ungeladene Aminosäure substitutiert wird (Glutaminin, Cystein, Tryptophan). Auch bei
ApoB- H3543YMarburg kommt es durch die Substitution von Histidin (H) durch das
ungeladene Tyrosin (Y) zum Verlust einer positiven Ladung. Dieser Ladungsverlust ist
jedoch geringer, da Histidin schwächer basisch ist als Arginin. Die in dieser Arbeit
durchgeführten Experimente zur Aufnahme und Bindung von ApoB- H3543YMarburg
DiI- LDL (Teupser et al. 1996) in HeLa- Zellen im direkten Vergleich mit ApoB-
4. Diskussion 183
R3500Q- LDL haben gezeigt, dass ApoB- H3543YMarburg - LDL genau wie die anderen
LDL- Partikel mit defekten ApoB- 100 deutlich schlechter über den LDL- Rezeptor
internalisiert und gebunden wurden (-31 bzw. 35% der Norm), was sich auch in den
Untersuchungen mit der konfokalen Mikroskopie zeigte. Der Vergleich mit den parallel
ermittelten Daten für ApoB- R3500Q- LDL zeigte jedoch, dass die in den Experimenten
ermittelten zellulären Aufnahme- und Bindungskapazitäten von ApoB- H3543YMarburg -
LDL höher waren als die von R3500Q- LDL und den in der Literatur publizierten Daten
für die ApoB- Mutationen R3531C und R3500W (Innerarity et al. 1987; Fisher et al.
1999; Pullinger et al. 1999). In der 2001 erschienenen Arbeit zum molekularen
Mechanismus der reduzierten LDL- Bindung beim Krankheitsbild des FDB (R3500Q-
Mutation) postulierte Boren, dass Tryptophan 4369 nicht nur spezifisch mit Arginin
3500, sondern auch mit den Argininresten 3531 und 3480 interagiert und, dass die
Substitution dieser basischen Aminosäuren die Bindung an den LDLR ebenfalls
reduziert (Boren et al. 2001). Es wäre denkbar, dass alle basischen Aminosäurereste
(Arginin, Lysin, Histidin) in dieser Region die spezifische Interaktion zwischen
Tryptophan 4369 und Arginin 3500 des carboxyterminalen Modulatorelements
stabilisieren und Substitutionen dieser Aminosäuren die Bindung an den LDLR
reduzieren. Die funktionellen Daten mit der neu identifizierten ApoB- H3543YMarburg -
Mutation in dieser Arbeit weisen sehr stark auf einen solchen Mechanismus hin. Zur
detaillierten Abklärung dieser Hypothese sind jedoch „site directed mutagenesis“-
Experimente zur Substitution der Aminosäurereste R3531, R3480, H3543 notwendig. In
der Abbildung 44 ist das von Boren entwickelte Modell der Bindung von ApoB- 100 an
den LDLR dargestellt.
4. Diskussion 184
Abbildung 44: Mechanismus der gestörten Bindung von ApoB- H3543YMarburg und der
anderen bisher identifizierten ApoB- Defekte an den LDL- Rezeptor, nach dem von Boren et al.
postulierten Modell der ApoB- 100- Bindung an den LDL- Rezeptor. Das Bild zeigt, wie der
carboxyterminale Bereich von ApoB- 100 durch spezifische Interaktion der Aminosäuren
Tryptophan 4369 und Arginin 3500 sowie weiterer Reste in unmittelbarer Nähe von Arginin
3500 (R3531 und H3543), die Bindung über die Rezeptorbindungseite („B-site“) an den LDLR
ermöglicht. Bei den ApoB- Defekten R3500Q (FDB), R3531C und der neuen ApoB- H3543Y-
Mutante ist diese Interaktion gestört und es kommt zu einer reduzierten LDLR- Bindung.
Während es sich bei ApoB- H3543YMarburg um einen Liganden- Defekt handelte, der zu
einer reduzierten zellulären Aufnahme und Bindung von LDL führte, betraf die FH-
W556RMarburg- Mutation das zweite zentrale Protein des Cholesterinstoffwechsels, den
LDL- Rezeptor. Die Experimente zur Charakterisierung der funktionellen Auswirkung
von FH- W556RMarburg mit Fibroblasten- Kulturen von einer der betroffenen FH-
Familien ergaben, dass die Mutation in Position 556 des LDLR im fünften von sechs
hochkonservierten YWTD- Repeats des ß- Propeller- Motifs („six bladed propeller
structure“) (Jeon et al. 2001) zu einem kompletten Verlust von funktionellen zellulären
LDL- Rezeptoren führten. Bei FH- W556RMarburg handelte es sich um eine von weltweit
bisher 4 beschriebenen FH- Mutationen im fünften YWVD- Repeat des LDLR (siehe
auch: http://www.ucl.ac.uk/fh/). Zwei dieser Mutationen- FH- Moskau und FH- Odense
bewirken Stopp- Codons, die Rezeptoren der Klasse 1 (siehe Punkt 1.2.5 dieser Arbeit)
B-site(AS 3359 -3369)
His3543
Arg3500
Trp4369
COOH
NH2
ApoB-100
R3500
W4369
ApoB- 100
H3543
COOH
NH2
R3531H3543Y
R3500Q
W4369
COOH
NH2
ApoB- 100
B-site(AS 3359-3369)
R3500W
R3531C B-site
(AS 3359-3369)
LDL- Partikel mit normalem ApoB- 100 LDL- Partikel mit mutiertem ApoB- 100
4. Diskussion 185
produzieren (Goldstein und Brown 1989; Hobbs et al. 1990). Wie bereits erwähnt,
identifizierten Jensen et al. in einer dänischen FH- Studie eine Mutation im fünften
YWVD- Repeat des LDL- Rezeptors, die ebenfalls die Aminosäure Tryptophan 556
betraf. Bei diesem FH- Allel wurde Tryptophan 556 durch Serin substituiert (W556S),
jedoch konnte diese Mutation wie alle bisher weltweit beschriebenen Mutationen in
diesem Repeat, nur in heterozygoter Form nachgewiesen werden (Jensen et al. 1997),
sodass FH- W556RMarburg die erste tatsächliche homozygote Mutation („true
homozygous“) im fünften YWVD- Repeat des LDL- Rezeptors ist, die bei eineiigen
Zwillingen identifiziert wurde. Die dänische Gruppe charakterisierte die W556S-
Mutante hinsichtlich ihrer funktionellen Auswirkungen. In transient transfizierten COS-
7- Zellen überexpremierten sie unter Kontrolle des CMV- Promotors die LDLR-
W556S- Mutante und konnten in „pulse chase“ Experimenten zeigen, dass die Zellen
nur noch die 120 KDa LDL- Rezeptor- Präkursormoleküle produzierten und keine
funktionellen 160 KDa LDL- Rezeptoren an der Zelloberfläche mehr nachweisbar
waren, was auf einen kompletten Transportdefekt vom Endoplasmatischen Retikulum
(ER) zum Golgi Apparat (Klasse 2A LDLR- Transportdefekt) zurückzuführen war. Im
Rahmen dieser Arbeit konnten wir diese Daten in Zellen, die tatsächlich nur defekte
W556R- LDL-Rezeptoren aufweisen, bestätigen. Die mit DiI- LDL durchgeführten
Bindungs- und Aufnahmestudien in Fibroblasten der homozygot betroffenen Kinder,
zeigten keinerlei nennenswerte Aufnahmen. Es fand sich lediglich eine unspezifische
Aufnahme, die bei ca. 5% der Kontrollen lag. In der konfokalen Mikroskopie mit
homozygoten LDLR-W556R- Fibroblasten, bei denen die LDLR- Produktion durch
Kultivierung in LPDS- Medium maximal stimuliert wurde, konnte mittels
Immunofluoreszenz- Analyse kein LDLR an der Zelloberfläche mehr nachgewiesen
werden, was einen Klasse 2A LDLR- Transportdefekt implizierte und durch eine
Westernblotanalyse endgültig bestätigt wurde. Die zeigte, dass in homozygoten
Fibroblasten nur die 120 KDa LDL- Rezeptor- Präkursorform nachweisbar war. Etwa
50% der FH- verursachenden LDLR- Mutationen produzieren Rezeptoren, die das
Endoplasmatische Retikulum (ER) nur partiell oder überhaupt nicht verlassen können
(„retained LDL receptors“). Die genauen Mechanismen, die dazu führen, dass Klasse
2A LDLR im ER zurückgehalten werden, sind bisher nicht genau geklärt. Zwei
Proteine, für die eine Rolle bei Klasse 2 LDLR- Defekten aufgezeigt werden konnte,
4. Diskussion 186
sind die molekularen Chaperone GRP 78 (Jorgensen et al. 2000) und RAP (receptor
associated protein). Diese beiden Proteine kontrollieren im ER, ob die LDL- Rezeptoren
korrekt gefaltet sind (quality control) (Jorgensen et al. 2003) und verhindern im Falle
von RAP auch eine frühzeitige Komplexierung des LDLR mit den Liganden ApoE und
B im ER (Li et al. 2002). Sind die LDL- Rezeptoren nicht korrekt gefaltet, so werden
sie wahrscheinlich chaperon- vermittelt über Proteasomen abgebaut. Ein sehr gut
charakterisiertes Beispiel hierfür ist die -Mutante bei cystischer Fibrose (Jensen
et al. 1995), bei der gezeigt werden konnte, dass aufgrund inkorrekter Faltung des
Proteins (Bross et al. 1999) eine Retention im ER mit rapidem proteasomalem Abbau
stattfindet (Ward et al. 1995). In einer Arbeit mit stabil transfizierten Zellen, in denen
Klasse 2- LDL- Rezeptoren überexpremiert wurden, konnten Li et al. zeigen, dass eine
Inhibition des proteasomalen Degradationssystems zu einem verzögerten Abbau von
Klasse 2A LDL- Rezeptoren im ER führte und parallel dazu die Anzahl von mutierten
LDL- Rezeptoren an der Zelloberfläche anstieg, während die Degradation von Wildtyp-
LDL- Rezeptoren nicht beeinflusst wurde. Eine direkte Ubiquitinierung der mutierten
LDL- Rezeptoren, die Voraussetzung für eine Aktivierung des zellulären proteasomalen
Abbauweges ist (Nobelpreis für Chemie 2004 an die Mediziner: Aaron Ciechanover,
Avram Hershko (Israel) und Irvin Rose (USA)), konnte die Gruppe aber nicht
nachweisen (Li et al. 2004). Stattdessen postulierten sie, dass nicht die mutierten LDL-
Rezeptoren selbst, sondern ein mit den Rezeptoren assoziertes, bisher nicht genau
bekanntes, molekulares Chaperon ubiquitiniert wird und anschließend der
LDLR/Chaperon- Komplex proteasomal abgebaut wird. Wir vermuten, dass bei FH-
W556RMarburg, dieselben Prozesse ablaufen. In unseren Westernblot- Untersuchungen
mit heterozygoten W556R- Fibroblasten, konnten wir trotz maximaler Aktivierung der
LDLR- Expression keine 120 KDa Rezeptoren nachweisen, was auf einen rapiden
proteasomalen Abbau inkorrekt gefalteter Rezeptoren hinweist. Zur Aufklärung der
genauen intrazellulären Mechanismen sind jedoch weiterführende zellbiologische
Experimente erforderlich. Für diese Zwecke sind FH- W556RMarburg- Fibroblasten ein
ideales Tool, da es sich um ein nicht transfiziertes Zellsystem handelt, in dem die
zellulären Wirkungsmechanismen unter verschiedenen Bedingungen (z.B. Kultivierung
+/- LPDS, Cholesterin, Statinen etc.) real studiert werden können. Die Abbildung 45
4. Diskussion 187
zeigt die möglichen zellulären Mechanismen, die zur Retention von FH- W556R- LDL-
Rezeptoren im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und zu deren Degradation führen.
Abbildung 45: Möglicher Mechanismus, der dazu führt, dass mutierte Klasse 2A LDL-
Rezeptoren wie LDLR- W556RMarburg- im ER zurückgehalten und intrazellulär abgebaut werden.
Nach erfolgter Qualitätskontrolle im ER durch molekulare Chaperone (wie z.B. GRP 78 und
RAP) gelangen, korrekt gefaltete LDLR über Vesikel zum Golgi- Apparat, wo durch weitere
Prozessierung die reifen 160 KDa LDL- Rezeptoren entstehen („on pathway“). Sind die LDLR
nicht korrekt gefaltet wie bei FH- W556RMarburg, so kommt es wahrscheinlich zunächst zur
Retention der LDLR im ER („off patway) und späteren Ausschleusung der Rezeptoren in das
Cytoplasma, wo durch Ubiquitinierung eine Degradation der Rezeptoren über Proteasomen
erfolgt. Ob dabei die Rezeptoren selbst oder mit den Rezeptoren assoziierte molekulare
Chaperone ubiquitiniert werden, ist bisher nicht genau geklärt.
4.1.2 Die relative Expression zentraler Gene der Cholesterinbiosynthese in
homozygoten FH- W556RMarburg - Fibroblasten ist deutlich erhöht
Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Real- Time RT/PCR- Untersuchungen
mit FH- W556RMarburg- Fibroblasten zeigten, dass die relativen Expressionen von fünf
der acht untersuchten zentralen Gene der Cholesterinbiosynthese in homozygoten FH-
Korrekte Faltung(LDLR- W556)
Endoplasmatisches Retikulum
Golgi- Apparat
Molekulare Chaperone(z.B. GRP 78, RAP)
Inkorrekte Faltung(LDLR- W556R)
Retention/Cytopl. Abbau
„off pathway“
Prozessierung(reife LDL- Rezeptoren 160 KDa)
„on pathway“
(LDL- Rezeptoren 120 KDa)
LDLR (120KDa)
Proteasom
UbiquitinierungDegradation
Cytoplasma
4. Diskussion 188
W556RMarburg- Fibroblasten deutlich erhöht waren. Bei einem verwendeten cut- off-
Wert von +/- 1,5fach, zeigten sich in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten
signifikant erhöhte Expressionsanstiege für LDL- Rezeptor, SREBP-2, SREBP-1a,
INSIG 1, sowie HMG- CoA- Reduktase, was aufgrund des intrazellulären
Cholesterindefizits wegen fehlender funktioneller LDL- Rezeptoren auch zu erwarten
ist, sodass der zelluläre Cholesterinbedarf durch eine gesteigerte zelluläre Synthese und
kolaterale Aufnahmewege für Cholesterin erfolgen muss. Wie bereits in der Einleitung
dieser Arbeit genauer erläutert, greift das intrazellulär synthetisierte Cholesterin in den
Zellmetabolismus ein (Anderson 2003) und reguliert über mehrere Stellglieder die
transkriptionelle Kontrolle der Gene, die in der Cholesterinbiosynthese eine zentrale
Rolle spielen (Brown und Goldstein 1997; Goldstein et al. 2002). Ist eine ausreichende
Menge an Cholesterin vorhanden, so wird über die Bindung des regulatorischen
Proteins INSIG 1 (Yabe et al. 2002; Yang et al. 2002) an SCAP eine weitere
Prozessierung der SREBP- Vorläufer- Proteine in aktive Transkriptionsfaktoren
blockiert (Brown et al. 2002; Adams et al. 2003) und dadurch die LDL- Rezeptor und
intrazelluläre Cholesterinsynthese gedrosselt (Loewen und Levine 2002; Rawson 2003).
Aus den durchgeführten Studien zur Expression von SCAP, SREBP-1a/2 und INSIG 1
in FH- Fibroblasten ging hervor, dass SREBP-2 die zentrale Rolle bei der Regulation
von Genen der Cholesterinbiosynthese spielt. Für SCAP sahen wir keine Unterschiede
in der Expression dieses Gens in FH- Fibroblasten, sodass es scheint, dass die
Transkription des SCAP- Gens konstitutiv ist und die Aktivität von SCAP
posttranskriptionell oder postranslationell reguliert wird. Dieses muss jedoch noch in
weiter führenden Experimenten mit FH- Fibroblasten anderer Patienten überprüft
werden, da diesbezüglich keine Hinweise in der Literatur gefunden wurden. Ein
interessanter Aspekt war die erhöhte Expression von INSIG 1 in FH- Fibroblasten, die
wahrscheinlich als Gegenregulation für eine Überladung der Zellen mit Cholesterin
erfolgte. Sever et al. konnten zeigen, dass INSIG 1 nicht nur spezifisch mit SCAP,
sondern auch mit der HMG- CoA- Reduktase interagiert und diese Interaktion zu einer
Ubiquitinin- abhängigen proteasomalen Degradation dieses geschwindigkeits-
bestimmenden Enzyms der Cholesterinbiosynthese führt (Sever et al. 2003; Song et al.
2005). Als Folge kommt es zu einer gedrosselten intrazellulären de novo Synthese von
Cholesterin. Die Daten dieser Arbeit deuten darauf hin, dass dieser
4. Diskussion 189
Regulationsmechanismus bei FH- W556RMarburg- Fibroblasten zum Tragen kommt, um
eine überschießende durch SREBP-2 induzierte Überladung mit Cholesterin zu
verhindern. Eine neuere Arbeit von Gong et al. hat gezeigt, dass SREBP-2 in einem
konvergenten Feedback- Mechanismus auch die Expression von INSIG 1 positiv
reguliert und dafür sorgt, dass die intrazellulären Level an INSIG 1 nach ausreichender
zellulärer Versorgung mit Cholesterin wieder hergestellt werden, um eine weitere
Prozessierung der SREBP- Vorläufer- Proteine durch INSIG 1- Bindung an den
SCAP/SREBP- Komplex am ER zu verhindern (Gong et al. 2006).
Generell muss gesagt werden, dass es sich bei den in dieser Arbeit durchgeführten
Experimenten mit der Real- Time RT/PCR in FH- Fibroblasten lediglich um eine
Erfassung der relativen Expressionen dieser Gene in untransfizierten Primärzellen
handelte. Um die detaillierten Mechanismen der Regulation, Aufnahme, und Synthese
von Cholesterin aufzuklären, sind weitere proteinbiochemische und zellbiologische
Untersuchungen (zur Aufklärung von Interaktionen/Degradationen der einzelnen
Proteine) erforderlich.
4.1.3 Die mRNA- und Proteinspiegel von SCARB1 in homozygoten und
heterozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten sind erhöht, aber die Expression
von ABCA1 unterscheidet sich deutlich
Ein weiterer interessanter Befund der Real- Time RT/PCR- Experimente in dieser
Arbeit war die ermittelte, deutlich erhöhte Expression und Translation von SCARB1,
sowohl in heterozygoten, als auch in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten.
Dieses deutet stark darauf hin, dass SCARB1 einen kollateralen Bypass- Pathway
darstellt, über den FH- W556R- Fibroblasten Cholesterinester unabhängig vom LDLR-
Pathway aufnehmen können. In einer Studie zur Regulation der SCARB1- Expression
in der humanen Nierenkarzinom- Zellinie 293, konnten Treguier et al. eine individuelle
SREBP- Bindungsstelle im Promotor von SCARB1 identifizieren. Sie konnten zeigen,
dass eine Überexpression von SREBP-2 in stabil transfizierten Zellen mit einem
proportionalen Anstieg der Expression und Translation von SCARB1 einherging
(Treguier et al. 2004). Aus ihren Beobachtungen folgerten sie, dass SREBP-2 der
zentrale transkriptionelle Regulator zur Aktivierung des LDLR- Pathways für die
Cholesterinaufnahme ist. Zusätzlich zum LDLR- Pathway reguliert auch SCARB1 die
intrazelluären Cholesterinspiegel in diesen Zellen durch einen nicht- endozytotischen
4. Diskussion 190
Pathway. In diesem Prozess ist SREBP-2 ein stärkerer Aktivator als SREBP-1a. Ein
Befund, der sich mit den Daten dieser Arbeit deckt, auch hier zeigte sich, dass die
Expression von SREBP-2 in FH- W556R- Fibroblasten 4 mal höher war als die von
SREBP-1a. Ein weiterer Hinweis, der darauf hindeutet, dass SCARB1 einen Bypass-
Pathway zur Aufnahme von Cholesterin darstellt, kommt aus Experimenten mit NPC1
(Niemann Pick C1 protein) knock out- Mäusen. Xie et al. konnten zeigen, dass eine
Blockade des NPC1- abhängigen Clathrin- Coated- Pit- Pathways durch knock out von
NPC1 (wie bei der Cholesterinesterspeicherkrankheit Woolmann- Disease), zu einer
gesteigerten intrazellulären Cholesterinsynthese und Aufnahme von nicht lysosomalen
Cholesterin via SCARB1 in diesen Tieren führte (Xie et al. 2006). Diese Situation ist
vergleichbar mit der bei homozygoter familiärer Hypercholesterinämie, bei der es durch
den kompletten Verlust des LDLR- Pathways zu einer kompletten Blockade der
rezeptorvermittelten Aufnahme von Cholesterinestern aus LDL kommt. In FH- Zellen
stellt die Aufnahme von nicht- lysosomalen Cholesterinestern aus HDL und LDL über
SCARB1 einen kollateralen Weg dar, der es ermöglicht, Cholesterinester unabhängig
vom NPC1- abhängigen Clathrin- Coated- Pit- Patway direkt in die metabolisch aktiven
Pools der Zelle einzuschleusen. In unseren Untersuchungen fanden wir erhöhte
SCARB1 mRNA und Proteinspiegel in heterozygoten und homozygoten FH W556R-
Fibroblasten. Im Gegensatz zu SCARB1 war die Genexpression des
Cholesterintransporters ABCA1 in homozygoten FH- W556RMarburg- Fibroblasten
signifikant erniedrigt (- 4,34fach), wohingegen sie in heterozygoten Zellen erhöht war
(+1,4fach). Eine mögliche Erklärung hierfür liegt in den unterschiedlichen
intrazellulären Cholesterinspiegeln, welche in homozygoten Zellen trotz der SREBP-2-
induzierten Aktivierung von SCARB1 und HMGCR nicht hoch genug sind, um
genügend LXR- Liganden für eine Aktivierung der ABCA1- Transkription zu
generieren (Schmitz et al. 2001). In heterozygoten Fibroblasten hingegen kann
Cholesterin sowohl durch de novo Synthese, die Aufnahme über die noch vorhandenen
Kopie des intakten LDL- Rezeptors und via SCARB1 bereitgestellt werden, wodurch
die intrazellulären Cholesterinspiegel in diesen Zellen hoch genug sind, um genügend
LXR- Liganden für eine Aktivierung der ABCA1 Gen- Transkription zu generieren. In
der Vergangenheit haben sich zwei Studien mit kontroversen Ergebnissen mit der
SREBP-2- vermittelten transkriptionellen Kontrolle von ABCA1 befasst. Zeng et al.
4. Diskussion 191
konnten zeigen, dass eine Cholesterin- Depletion in SREBP-2 überexpremierenden,
transfizierten humanen Endothelzellen zu einer Aktivierung der LDLR und
Reprimierung der ABCA1- Expression führte. Nach ihren Befunden wird die
erniedrigte ABCA1- Expression durch die Bindung von SREBP-2 an das E-Box-
Element im ABCA1- Promotor herbeigeführt (Zeng et al. 2004). Im Gegensatz dazu
fanden Wong et al. in transfizierten Chinese Hamster Ovarien- Zellen (CHO- Zellen)
eine SREBP-2- abhängige erhöhte Transkription von ABCA1. Wong et al. postulieren,
dass SREBP-2 ein indirekter Modulator der ABCA1- Transkription ist, der über die
Aktivierung des Mevalonat- Pathways LXR- Liganden generiert, welche die Expression
von ABCA1 positiv regulieren (Wong et al. 2006). Die Daten unserer Experimente mit
untransfizierten Primärzellen stehen im Einklang mit beiden Hypothesen und
postulieren, dass eine Aktivierung der ABCA1- Transkription abhängig vom
intrazellulären Level an unverestertem Cholesterin bzw. LXR- Liganden ist und
SREBP-2 möglicherweise der Schlüsselregulator in diesem Prozess ist. In
heterozygoten FH- W556R- Zellen werden durch die SREBP-2- induzierte Aktivierung,
der LDLR, SCARB1 und HMGCR- Pathways genügend LXR- Liganden gebildet, und
die Expression von ABCA1 wird durch Dissoziation/Degradation von SREBP-2 am E-
Box- Element im ABCA1- Promotor aktiviert (Abbildung 46). In homozygoten FH-
W556R- Zellen sind durch den kompletten Ausfall des LDLR- Pathways die
intrazelluläre de novo Synthese von Cholesterin und die Aufnahme von nicht
lysosomalen Cholesterin via SCARB1 die Hauptwege der Cholesterinzufuhr. Hier
reichen die intrazellulären Spiegel an unverestertem Cholesterin jedoch nicht aus, um
genügend LXR- Liganden für eine Aktivierung der ABCA1- Expression zu generieren,
wodurch es durch Bindung von SREBP-2 an das E-Box- Element im ABCA1-
Promotor zu einer Inhibition der ABCA1- Transkription kommt (Abbildung 47). In den
Abbildungen 46 und 47 ist ein Modellsystem für die unterschiedliche SREBP-2-
vermittelte Transaktivierung des ABCA1- Promotors in heterozygoten und
homozygoten FH- W556R- Zellen dargestellt.
4. Diskussion 192
Abbildung 46: Möglicher Mechanismus der Aktivierung von ABCA1 in heterzygoten FH-
W556R- Fibroblasten. Durch Aktivierung der LDLR, SCARB1- und HMGCR- Pathways wird
eine ausreichende Menge von LXR- Liganden generiert und der ABCA1 Promotor aktiviert.
ABCA1- Promotor
LXR- Liganden (hohe Spiegel)
SREBP-2
E-Box
RXRLXR
GC-Box GC-Box
SP-1
DR-4 TATA
RNA-Pol. II
Dissoziation/Degradation
SP-1
++
FH- W556R- Fibroblasten (heterozygot)
LDLR
CC,CE
SaureCEase
CC
CC
Endosom/Lysosom
SCARB1NPC1
NeutraleCEase
C,CE C
ACAT
CNeutraleCEase
C
Acetyl- CoASynthese
C
LXR- Liganden
++
++
++
++
++
++
LDL- C
LXR- Liganden
LXR- Liganden
ABCA1 ++
LDL- C
HDL- C
4. Diskussion 193
Abbildung 47: Möglicher Mechanismus der Reprimierung von ABCA1 in homozygoten FH-
W556R- Fibroblasten. Trotz einer Aktivierung der SCARB1- und HMGCR- Pathways, stehen
wegen des kompletten Ausfalls des LDLR- Pathways nicht genügend LXR- Liganden zur
Verfügung, um den ABCA1- Promotor zu aktivieren.
ABCA1- Promotor
LXR- Liganden (niedrige Spiegel)
SREBP-2
E-Box
RXRLXR
GC-Box GC-Box
SP-1
DR-4 TATA
RNA-Pol. II
Bindung/Inhibition
SP-1
--
FH- W556R- Fibroblasten (homozygot)
LDL- C
LDLR
CC,CE
SaureCEase
CC
CC
Endosom/Lysosom
SCARB1NPC1
NeutraleCEase
C,CE C
ACAT
CNeutraleCEase
C
Acetyl- CoASynthese
C
LXR- Liganden
++
++
++
--
+
--
LDL- C
LXR- Liganden
LXR- Liganden
ABCA1 --
HDL- C
4. Diskussion 194
4.1.4 In vivo Kinetik- Untersuchungen mit ApoB- H3543YMarburg- und FH- W556R
Marburg- Patienten zeigen einen verzögerten LDL ApoB- 100 Turnover
Um die Auswirkungen von ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg auf den
Lipidstoffwechsel in vivo zu erfassen, wurden mit jeweils einem heterozygoten
Mutationsträger Turnover- Untersuchungen zur Verstoffwechselung des VLDL- und
LDL ApoB- 100 durchgeführt. Es fand sich, wie erwartet und in Übereinstimmung mit
den in der Literatur publizierten Daten von in vivo- Kinetikuntersuchungen der ApoB-
Mutationen R3500Q und R3500W, eine deutliche Reduktion der ApoB- 100 LDL FCR
beim ApoB- H3543YMarburg - Patienten um -28%, was zu einem dreifachen Anstieg der
Verweilzeit im Plasma (RT) führte. Die PR war, wie in anderen FDB- Studien (Gaffney
et al. 2002), reduziert, der Pool im Vergleich zu diesen Studien aber nur mäßig erhöht
(Pietzsch et al. 1996). Genau wie in der von Schaefer et al. publizierten in vivo
Turnover- Studie (Schaefer et al. 1997) mit einem homozygoten R3500Q- Patienten
fand sich eine Reduktion der FCR bei gesteigertem VLDL- Pool um das fünf- bzw.
zweifache, was die defekte ApoB- Bindung an den LDL- Rezeptor verdeutlichte und in
einer verlängerten Plasmaverweildauer des VLDL ApoB- 100 resultierte, da das VLDL
ApoB- 100 im Vergleich zu den Kontrollen nicht adäquat über den LDL- Rezeptor aus
der Zirkulation entfernt werden konnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurden keine
Untersuchungen zum IDL ApoB- 100- Stoffwechsel durchgeführt. In einer anderen
Studie konnte jedoch eine signifikante Reduktion der VLDL- IDL- zu LDL -
Konversion in FDB nachgewiesen werden (Pietzsch et al. 1996). Bei der neuen ApoB-
H3543Y- Mutante scheint es ebenfalls zu einer reduzierten verminderten
Nettokonversion von IDL zu LDL zu kommen, sodass wie bei FDB, aufgrund des
defekten Liganden ApoB die zelluläre Cholesterinaufnahme sinkt. Als Folge kommt es
zu einer gesteigerten zellulären LDL- Rezeptor- und Cholesterinbiosynthese. Durch die
größere Anzahl intakter LDL- Rezeptoren können nun vermehrt die LDL- Vorstufen
(insbesondere IDL- Partikel) über den Liganden ApoE in die Zelle aufgenommen
werden, was eine Erklärung für den reduzierten Nettotransfer von IDL nach LDL bei
FDB und ApoB- H3543Y ist (Gaffney et al. 2002). Aufgrund der noch vollkommen
intakten ApoE- Bindung kommt es zu einer relativen Kompensation des defekten
ApoB- 100 durch ApoE über einen sogenannten „ApoE rescue shuttle“. Dieser
Mechanismus würde auch die bei FDB beobachtete moderatere Erhöhung des
4. Diskussion 195
Cholesterinspiegels im Vergleich zu FH erklären. Da aus den IDL jedoch auch immer
LDL- Partikel entstehen, haben die ApoB- H3543Y- LDL wegen ihrer reduzierten
Bindung an den LDLR eine verlängerte Plasmaverweildauer, was ihnen auf Dauer ein
hohes atherogenes Potential verleiht. In den Bindungs- und Aufnahmeexperimenten
zeigte sich eine um -31 bzw. 34% reduzierte zelluläre Bindung/Aufnahme von ApoB-
H3543Y- LDL, was mit den ermittelten in vivo Kinetikdaten für die FCR (-28%) bzw.
RT (etwa dreifach velängert) des LDL- ApoB- 100 von ApoB- H3543YMarburg-
Patienten korreliert. Die in vivo turnover Daten des heterozygoten FH- W556RMarburg -
Patienten zeigten ein umgekehrtes Bild. Anders als bei ApoB- H3543Y ist hier die
Konversion von IDL zu LDL erhöht, was zu einer erhöhten Produktionsrate (PR) und
verzögerten FCR von LDL- ApoB- 100 bei FH- W556RMarburg führt. Hier kommt es
wegen des defekten LDL- Rezeptors nicht zu einer relativen Kompensation durch Apo
E, da sowohl ApoB- 100 und ApoE als Liganden nicht mehr an den defekten LDL-
Rezeptor binden können. In Studien mit FH- Patienten konnte eine Reduktion der
VLDL- ApoB- 100 und ApoE- FCR´s bereits aufgezeigt werden. Bei FH- W556RMarburg
werden die zirkulierenden LDL- Partikel als Folge des fehlenden „ApoE rescue
shuttles“ daher vermehrt über Scavangerrezeptoren (z.B. Makrophagen Scavenger
Rezeptoren Typ I und II) in die Zelle aufgenommen, was das höhere
Atheroskleroserisiko von FH- Patienten gegenüber Patienten mit ApoB- Defekten
erklärt.
4.1.5 Therapie von Patienten mit ApoB- H3543YMarburg und FH- W556RMarburg
Die klinische Relevanz der neu entdeckten Defekte ApoB- H3543YMarburg und FH-
W556RMarburg zeigt sich auch in einer noch nicht publizierten Studie unserer
Arbeitsgruppe zum in vivo Stoffwechsel der Mutationsträger unter Therapie mit den
beiden HMG- CoA- Reduktasehemmern Pravastatin (Pravasin) und Atorvastatin
(Sortis). Es kam unter beiden Medikamenten zu einer signifikanten Reduktion der
Werte für Gesamtcholesterin (GC), LDL- Cholesterin (LDL- C) und ApoB bei den
Patienten. Für den in dieser Arbeit untersuchten ApoB- H3543YMarburg- Patient ergaben
sich unter Pravasin Reduktionen von: GC -43%, LDL- C -65%, ApoB -43%. Für FH-
W556RMarburg ergaben sich unter Pravasin Werte von: GC -16%, LDL- C -20%, ApoB -
14%. Unter der Therapie mit Atorvastatin ergaben sich für ApoB- H3543YMarburg die
folgenden Senkungen: GC -50%, LDL- C -70 %, ApoB -54%, sowie HDL- C +33%.
4. Diskussion 196
Bei FH- W556RMarburg waren die Werte wie folgt: GC -40%, LDL- C -46 %, ApoB -
42%, sowie HDL- C +13%. Unter Therapie mit Atorvastatin kam es auch zu einer
leichten Erhöhung des vasoprotektiven HDL- Cholesterins, die sich unter Therapie mit
Pravastatin nicht zeigte. Die beobachteten Veränderungen der Lipidwerte stimmen mit
denen anderer Arbeitsgruppen überein (Hansen et al. 1994) und zeigen, dass die
Therapie von ApoB- H3543YMarburg- Patienten effizienter ist als die von FH-
W556RMarburg- Patienten. Die Reduktion von GC, LDL- C und Apo B- 100 durch die
HMG- CoA- Reduktasehemmer ist durch eine gedrosselte endogene
Cholesterinproduktion und eine Hochregulation des LDL- Rezeptors bedingt, wodurch
das zelluläre „steady state“ in Richtung einer vermehrten Aufnahme über den LDLR-
Pathway verschoben wird (Goldstein und Brown 1989). Bei ApoB- H3543YMarburg und
FDB (R3500Q) kommt es durch eine vermehrte Expression funktionstüchtiger LDL-
Rezeptoren zur vermehrten Aufnahme von Cholesterin über ApoE- tragende LDL-
Vorstufen (VLDL und IDL) und somit zu einer deutlicheren Senkung der
Cholesterinwerte im Plasma als bei FH- W556RMarburg. Die Cholesterinsenkung bei FH-
W556RMarburg kommt vornehmlich durch die erhöhte LDL- clearance über die
hochregulierten intakten LDL- Rezeptoren zustande. Da es sich bei FH- W556RMarburg
um einen Klasse 2 A Transportdefekt handelt, sind nur intakte LDL- Rezeptoren an der
Zelloberfläche vorhanden, die anders als bei heterozygoten FH mit bindungsdefekten
LDL- Rezeptoren nicht mit der Funktion des intakten Rezeptors interferieren
(transdominant negative Effekte). Dieses könnte auch eine Erklärung für die oft
beobachtete Genotyp/Phänotyp- Variabilität bei FH sein (Soutar 1998; Austin et al.
2004). Wir sahen in den Kinetikstudien mit Pravasin und Atorvastatin, wie erwartet,
eine deutliche Steigerung der LDL ApoB- 100- FCR und eine Reduktion des LDL
ApoB- 100- Pools bei den Patienten. Zu gleichen Ergebnissen in
Turnoveruntersuchungen bei Patienten mit moderater (Vega et al. 1990) und gemischter
Hyperlipoproteinämie (Parhofer et al. 1993) unter Pravastatintherapie kamen auch
andere Arbeitsgruppen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Therapie mit
HMG- CoA- Reduktasehemmern sowohl bei ApoB- H3543YMarburg, als auch bei
heterozygoten FH- W556RMarburg- Patienten sehr gut funktioniert und zur Zeit die
einzige Intervention zur effizienten Senkung des Atheroskleroserisikos bei den
betroffenen Patienten darstellt. Anders sieht die Situation bei den homozygot
4. Diskussion 197
betroffenen Kindern von FH- W556RMarburg aus. Hier gibt es zur Zeit keine suffiziente
medikamentöse Therapie, die eine relevante LDL- Senkung herbeiführen könnte.
Atorvastatin zeigte initial keine relevante Senkung und wurde wegen einer möglichen
Hemmung der intrazellulären Cholesterinbiosynthese abgesetzt. Unter Therapie mit
Ezetemibe konnte das LDL- Cholesterin um 15% gesenkt werden. Ezetemibe hemmt
die intestinale Cholesterinresorption durch eine reversible Inhibition des in den
Dünndarmzellen lokalisierten Cholesterintransporters NPC1L1 (Nieman Pick C 1 like
protein). Der einzige Weg für eine klinisch relevante, adequate Cholesterinsenkung bei
den Kindern ist die extrakorporale Plasmaapherese (LDL- Apherese), über die das LDL
aus der Zirkulation entfernt wird. Diese Therapie wurde von Prof. Dr. J.R. Schaefer
gemeinsam mit Prof. Dr. G. Klaus (Klinik für Kinder- und Jugendmedizin, Direktor
Prof. Dr. R. F. Maier) am Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH, erstmals
bei Kindern dieses Alters durch den Umbau eines Apheresesystems, welches
normalerweise nur für Erwachsene verwendbar ist, im September 2000 (im Alter von 4
Jahren) bei den Marburger FH- Zwillingen gestartet und läuft seitdem 1 x wöchentlich.
Unter dieser Therapie konnte das LDL- Cholesterin der Kinder von anfänglich >1100
mg/dl, nach der ersten durchgeführten LDL- Apherese stabil auf ca. 600 mg/dl (- 46%
vor LDL- Apherese) gesenkt werden. Im Verlauf der Therapie wurde dieser Wert dann
nochmals um 60% gesenkt und liegt zur Zeit im Mittel bei ca. 240 mg/dl (nach LDL-
Apherese), sodass im Verlauf der letzten Jahre durch dieses Interventionsverfahren eine
LDL- Senkung von 78% des ursprünglichen Wertes erreicht wurde. Aus ärztlicher Sicht
ist dieser Wert natürlich immer noch zu hoch, doch die Marburger Erfahrungen haben
gezeigt, dass dieses Therapieverfahren auch bei FH- Kindern dieses Alters ohne
Komplikationen durchgeführt werden kann, und einen KHK- Progress, der unbehandelt
zu einem frühzeitigen Tod führt, aufhält. Die über dieses Therapieverfahren gewonnene
Zeit lässt darauf hoffen, dass in der medizinischen Forschung neue therapeutische
Ansätze zur Behandlung von homozygoter FH entwickelt werden, die speziell bei
betroffenen Kindern dann zur Anwendung kommen können.
5. Zusammenfassung 198
5. Zusammenfassung
Die Atherosklerose und ihre Folgeerkrankungen, insbesondere die koronare
Herzkrankung (KHK) ist in den westlichen Industrienationen für die Mehrheit der
Todesfälle verantwortlich. In großen epidemiologischen Studien konnte die Bedeutung
von Fettstoffwechselstörungen, insbesondere die der Hypercholesterinämie als
kardiovaskulärer Risikofaktor aufgezeigt werden. Die familiäre Hypercholesterinämie
(FH) ist eine monogenetisch autosomal dominant vererbte Lipidstoffwechselstörung,
die in homozygoter Ausprägung zu schwerstmanifesten Formen einer Atherosklerose
führt. Bei betroffenen Patienten kommt es ohne medizinische Intervention bereits in der
ersten Lebensdekade zu einem frühzeitigen Tod durch Myokardinfarkt oder
Schlaganfall. Die Ursachen von FH sind Mutationen in den Genen des LDL-Rezeptors
und dessen Ligand ApoB-100, die zu einem Plasmaanstieg von atherogenen LDL-
Partikeln führen. In der vorliegenden Arbeit wurden in einer DGGE- basierten
Mutationsstudie mit Patienten aus dem Kollektiv der Marburger Präventions-Allianz
zwei neue Defekte des LDL-Rezeptors (W556R) und von ApoB-100 (H3543Y)
identifiziert und detailliert funktionell charakterisiert. Diese Untersuchungen konnten
zeigen, dass ApoB-H3543YMarburg mit 1: 223 eine sehr hohe Prävalenz in der deutschen
Population aufweist und häufiger vorkommt als alle bisher publizierten ApoB-
Mutationen. Strukturell kommt es bei ApoB-H3543YMarburg genau wie bei den anderen
ApoB-Defekten mit reduzierter LDL-Rezeptorbindung zur Substitution einer positiv
geladenen Aminosäure (H) durch eine neutrale Aminosäure (Y) im carboxyterminalen
Modulatorelement der LDLR-Bindungsstelle von ApoB-100. Bindungs- und
Aufnahmekinetikstudien mit fluoreszenzmarkiertem DiI- ApoB-H3543YMarburg- LDL in
HeLa-Zellen zeigten eine reduzierte Bindung an und Aufnahme über den LDLR (-31%
bzw. 35% der Norm). In vivo Kinetikuntersuchungen zum Turnover von ApoB-
H3543YMarburg- LDL ermittelten wir, wie für die FDB-R3500Q-Mutation bereits
vorbeschrieben, einen verlangsamten ApoB-H3543YMarburg- LDL Katabolismus. Diese
Daten konnten klar zeigen, dass es sich bei ApoB-H3543YMarburg um einen neuen
Defekt mit funktioneller Relevanz handelt. Neben ApoB-H3543YMarburg konnte im
Rahmen dieser Arbeit weltweit erstmals die LDL-Rezeptor-Mutation (W556R) in
homozygoter Form bei einer Familie mit 3-jährigen eineiigen männlichen Zwillingen
identifiziert werden. Diese Mutation konnte dann ein zweites Mal in homozygoter Form
5. Zusammenfassung 199
bei einem 4-jährigen Mädchen aus einer nicht verwandten FH-Familie aus dem Libanon
nachgewiesen werden. Phänotypisch zeigte sich eine geschlechtsspezifische heterogene
Ausprägung der W556R-Mutation (weibliche Mutationsträger hatten deutlich niedrigere
LDL- und höhere HDL-Spiegel). Die LDLR-W556R-Mutation betrifft das fünfte
hochkonservierte YWVD- Repeat des six bladed ß-Propeller- Motif im LDLR und führt
zu einer kompletten zellulären LDLR-Defizienz. Aufnahme und Bindungsstudien mit
DiI-LDL in Fibroblasten von homozygoten Patienten zeigten keine nachweisbare DiI-
LDL- Bindung/Aufnahme mehr (< 5%). Bei heterozygoten Patienten lagen LDL-
Bindung und Aufnahme bei 45% bzw. 49% der Norm. Experimente mit konfokaler
Mikroskopie und Western- Blotting identifizierten einen Transportdefekt Klasse 2a mit
kompletter LDLR-Retention im Endoplasmatischen Retikulum als molekulare Ursache
der W556R-Mutation. Real-Time PCR-Untersuchungen zur Auswirkung von W556R
auf die Regulation der intrazellulären Cholesterinbiosynthese ermittelten eine stark
erhöhte Expression zentraler Gene des Cholesterinstoffwechsels, die hauptsächlich über
den SREBP-2 (Sterol regulatory element-binding protein 2) Transkriptionsfaktor
vermittelt wurde. Zusätzlich fanden sich erhöhte mRNA-und Proteinspiegel von
SCARB1 (Scavenger-receptor-type- B-I) in Fibroblasten von homozygoten und
heterozygoten W556R- Patienten, was auf einen nicht endozytotischen kollateralen
Pathway zur direkten Aufnahme von Cholesterin aus HDL und nativen LDL bei FH-
W556R via SCARB1 hinweist. Im Gegensatz dazu zeigte sich eine stark reduzierte
Genexpression des zellulären Cholesterintransporters ABCA1 in homozygoten, aber
nicht in heterozygoten Fibroblasten, die abhängig von der Menge an intrazellulären
ABCA1-LXR-Liganden zu sein scheint. Wie bei ApoB-H3543YMarburg fand sich in der
in vivo Kinetik-Untersuchung eines FH-W556R-Patienten eine deutlich erhöhte LDL-
Plasmaverweildauer.Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass ApoB-H3543YMarburg-
und LDLR-W556R häufig vorkommende, funktionell relevante Mutationen sind und es
geschlechtsspezifische Faktoren gibt, die trotz des Vorliegens einer identischen LDLR-
Mutation zu einer unterschiedlich starken Expression des Phänotyps führen. Die
Erforschung der zugrundeliegenden Mechanismen bietet ein hohes Potenzial für
zukünftige Therapieansätze der homozygoten familiären Hypercholesterinämie, für die
es bis zum heutigen Zeitpunkt trotz der enormen Fortschritte in der molekularen
Medizin leider immer noch keine adäquate medikamentöse Therapie gibt.
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7. Anhang 232
7. Anhang
7.1 Abkürzungsverzeichnis
ABCA ATP- bindender Kassettentransporter
ACVB Aorto-koronarer Venenbypass
Apo Apolipoprotein
APS Ammoniumpersulfat
ARH Autosomal Rezessive Hypercholesterinämie
ATP Adenosintriphosphat
cDNA copy DNA
CETP Cholesterylester- Transferprotein
CI Chemische Ionisierung
CR Katabolismusrate
D Deuterium
DGGE Denaturierende Gradientengel Elektrophorese
E Anreicherung
EI Elektron Impakt
EtBr Ethidiumbromid
FCR Fraktionelle Katabolismusrate
FDB Familiär defektes Apolipoprotein B
FH Familiäre Hypercholesterinämie
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FSR Fraktionelle Syntheserate
GC Gaschromatograph
H Histidin
HDL High Density Lipoprotein
HFBA Heptafluorobutyricacid
HLP Hyperlipoproteinämie
HMGC R 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoenzymA-Reduktase
HMGCS 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoenzymA- Synthase
HTGL Hepatische Triglyzeridlipase
IDL Intermediate Density Lipoprotein
7. Anhang 233
IE Isotopen Anreicherung
IEF Isoelektrische Fokusierung
INSIG Insulin induced gene
IR Isotopen Verhältnis (Isotope Ratio)
KHK koronare Herzkrankheit
Kontr. Kontrolle
LCAT Lecithin Cholesterin Acyltransferase
LDLR Low density lipoprotein receptor
Lp Lipoprotein
LPL Lipoproteinlipase
LSM Laser Scanning Mikroskopie
LXR Liver-X-receptor
MS Massenspektrometer
MTP Mikrosomales- Transferprotein
Mut. Mutante
MW Mittelwert
NPC1L1 Nieman Pick disease like- protein 1
NPxY Asparagin-Prolin-x-Tyrosin
PAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese
pAVK Periphere arterielle Verschlusskrankheit
PLTP Phospholipid- Transferprotein
PR Produktionsrate
Q Tracee Pool
q Tracer Pool
R Arginin
RFLP Restriktions- Fragment- Längen- Polymorphismus
RT Residenzzeit
RT/PCR Reverse transcription/Polymerase chain reaction
RXR Retionoid-X-Rezeptor
SAAM Simulation, Analysis And Modelling
SCAP SREBP cleavage activating protein
SCARB1 Scavenger-receptor-type B 1
7. Anhang 234
SD Standard Deviation (Standardabweichung)
SDS Sodium dodecyl sulfat
SNP Single nucleotide polymorphism
SR Scavenger receptor
SRE Sterol regulatory element
SREBP Sterol regulatory element binding protein
SSCP Single strand conformation polymorphism
Std. Standard
t Zeit
TEMED N,N,N,N – Tetramethylethylenediamine
Tm Melting temperature (Schmelztemperatur)
TRITC Tetramethylrhodaminisothiocyanat
UZ Ultrazentrifuge
VLDL Very Low Density Lipoprotein
VLDLR Very low density lipoprotein receptor
W Tryptophan
Wt Wildtyp
YWTD Tyrosin-Tryptophan-Threonin-Asparaginsäure
7. Anhang 235
7. 2 Lebenslauf
Personalien
Name: Muhidien Soufi
Geburtsdatum: 19.08.1964
Geburtsort: Marburg
Familienstand: Verheiratet mit Rosemarie Bode
Kinder: Marlon-Muhidien Bode
Schulausbildung
1971-75: Astrid Lindgren Grundschule Marburg
1975-81: Gesamtschule Richtsberg Marburg
1981-1984: Gymnasium Philippinum Marburg
Abschluß: Allgemeine Hochschulreife
Hochschulstudium
1985-1991: Studium der Humanbiologie an der Philipps-Universität Marburg
1987: Diplom-Vorprüfung
1991: Diplom-Hauptprüfung
Berufliche Tätigkeit
1992-1994: Wiss. Hilfskraft am Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung in
Marburg.
1996-1998: Anstellung als wissenschaftlicher Mitarbeiter im Labor von Prof. Dr. A.
Steinmetz und Prof. Dr. J. R. Schaefer im Rahmen einer ABM- Maßnahme des
Arbeitsamts Marburg.
1999: Übernahme als wiss. Mitarbeiter durch Prof. Dr. J. R. Schaefer in die
Arbeitsgruppe Präventive Kardiologie, Klinik für Innere Medizin, Universitätsklinikum
Gießen und Marburg, GmbH. Tätigkeit: Aufbau des molekularbiologischen Labors.
Seitdem Laborleiter der Arbeitsgruppe Präventive Kardiologie (Dr. Pohl
Stiftungsprofessur „Präventive Kardiologie“ an Prof. Dr. J.R. Schaefer)
7. Anhang 236
7.3 Verzeichnis der akademischen Lehrer
Meine akademischen Lehrer in Marburg waren die Damen und Herren Professoren:
Amon, Aumüller, Aziz, Basler, Beato, Braasch, Braun, Drenckhahn, Engel,
Eschenbach, Fruhstorfer, Fuhrmann, Ganz, Geus, Golenhofen, Gotzen, Gressner, Griss,
Grzeschik, Habermehl, Happle, Havemann, Huffmann, Joseph, Jentzsch, Kaffarnik,
Kern, Kirchner, Kleinsasser, Klenk, Klose, Koecke, Koolmann, Kretschmer, Krieg,
Kroll, Lange, Lennartz, Lührman, Maisch, Mannherz, Müller, Mennel, Moosdorf,
Netter, Pfab, Pohlen, Priebe, Prinz, Remschmidt, Riedmiller, Rogausch, Röhm,
Rothmund, Schachtschabel, Schäfer, Schmitz-Moormann, Schneider, Schüffel, Seitz,
Schulz, Siegrist, Slenczka, Thomas, Uniscker, Vogt, von Wichert, Westphal, Zelder,
Zimmermann,.
7. Anhang 237
7. 4 Danksagung
An dieser Stelle gilt mein besonderer Dank…
…Herrn Prof. Dr. Juergen R. Schaefer für die Bereitstellung des Themas, die stetige
Motivation, sowie hervorragende wissenschaftliche Betreuung und fortwährende
Förderung meiner Arbeit und wissenschaftlichen Laufbahn.
… allen Ärzten und lieben Freunden aus dem Labor für Präventive Kardiologie: Alex,
Bilgen und Mostafa, für die entgegengebrachte Freundschaft und Mitwirkung bei allen
Studien, ohne euch wäre vieles nicht realisierbar gewesen.
… den guten Seelen des Labors: Sabine und Ulrike, für eure fortwährende
Unterstützung und die schöne Zeit die ich mit euch verbringen durfte.
…Prof. Dr. Armin Steinmetz der gemeinsam mit Prof. Dr. Juergen R. Schaefer mein
Interesse am Gebiet der Fettstoffwechsel- und Arterioskleroseforschung geweckt und
aufrechterhalten hat.
… Prof. Dr. Hans Kaffarnik und Prof. Dr. Kurt Oette, die Pioniere der
Lipidstoffwechselforschung, für all die fachlichen Diskussionen und wunderbaren
geselligen Abende bei allen nationalen und internationalen Meetings.
… allen Studienteilnehmern für ihre Mitwirkung, ohne Sie wäre diese Arbeit nicht
möglich gewesen.
… meiner Familie. Ihr habt mir diesen Weg ermöglicht und mich immer unterstützt.
Mein unermesslicher Dank gilt Rosemarie und Marlon. Ihr habt mir die Kraft und die
Zuversicht gegeben, die ich in dieser Zeit benötigt habe und mir in allen
Lebenssituationen den Rücken gestärkt. Eure Liebe ist mein Antrieb für alles bisherige
und zukünftige.
7. Anhang 238
7.5 Publikationen
Soufi M, Sattler AM, Maerz W, Starke A, Herzum M, Maisch B, Schaefer JR. A new
but frequent mutation of apoB-100-apoB His3543Tyr. Atherosclerosis. 2004;174:11-16.
Soufi M, Schoppet M, Sattler AM, Herzum M, Maisch B, Hofbauer LC, Schaefer JR.
Osteoprotegerin gene polymorphisms in men with coronary artery disease. J Clin
Endocrinol Metab. 2004;89:3764-68.
Soufi M, Schoppet M, Sattler AM, Herzum M, Maisch B, Hofbauer LC, Schaefer JR.
Osteoprotegerin gene polymorphisms in men with coronary artery disease. J Clin
Endocrinol Metab. 2004;89:3764-68.
Spiecker M, Darius H, Hankeln T, Soufi M, Sattler AM, Schaefer JR, Node K, Borgel J,
Mugge A, Lindpaintner K, Huesing A, Maisch B, Zeldin DC, Liao JK. Risk of coronary
artery disease associated with polymorphism of the cytochrome P450 epoxygenase
CYP2J2. Circulation. 2004;110:2132-36.
Schaefer JR, Sattler AM, Hackler B, Kurt B, Hackler R, Maisch B, Soufi M.
Hyperlipidemia in patients with apolipoprotein E 2/2 phenotype: apolipoprotein A5
S19W mutation as a cofactor. Clin Chem. 2004;50:2214.
Hufnagel B, Dworak M, Soufi M, Mester Z, Zhu Y, Schaefer JR, Klumpp S, Krieglstein
J. Unsaturated fatty acids isolated from human lipoproteins activate protein phosphatase
type 2Cbeta and induce apoptosis in endothelial cells. Atherosclerosis. 2005;180:245-54.
Sattler AM, Soufi M, Maisch B, Schaefer JR. Lipids and lipoproteins in women. Herz.
2005;30:368-74.
Soufi M, Sattler AM, Herzum M, Maisch B, Schaefer JR. Molecular basis of Obesity
and the risk for Cardiovascular Disease. Herz. 2006;3:200-206.
7. Anhang 239
Bronner G, Sattler AM, Hinney A, Soufi M, Geller F, Schafer H, Maisch B, Hebebrand
J, Schaefer JR. The 103I variant of the melanocortin 4 receptor is associated with low
serum triglyceride levels. J Clin Endocrinol Metab. 2006;91:535-8.
Soufi M, Sattler AM, Maisch B, Schaefer JR. Molecular mechanisms involved in
atherosclerosis. Herz. 2002;27:637-48.
Freie Vorträge und Postervorträge mit publiziertem Abstract
Soufi M, Ruppert V, Sattler AM, Klaus G, Teupser D, Thiery J, Maisch B, und
Schaefer JR. Untersuchungen zur Expression von Genen der Cholesterinbiosynthese bei
Trägern der LDL-Rezeptormutation (W556R). Perfusion. 20; (2). 21. Jahrestagung der
Deutschen Gesellschaft für Arterioskleroseforschung, Blaubeuren, 2007.
Soufi M, Sattler AM, Kurt B, Maisch B, Schaefer JR. VLDLR mutations in subjects
from the “Marburger Präventions-Allianz“ CAD database and thei association with
Obesity. LaboratoriumsMedizin. 30; (5). 2. Deutscher Atherosklerosekongress,
Münster, 2006.
Soufi M, Sattler AM, Broenner G, Hinney A, Kurt B, Maisch B, Hebebrand J, Schaefer
JR. Genetische Faktoren der Adipositas und koronaren Herzerkrankung (KHK). Akt
Ernähr Med. 31; (5). 22. Jahrestagung der Deutschen Adipositas-Gesellschaft, Köln,
2006.
Soufi M, Sattler AM, Kurt B, Ruppert V, Maisch B, Schaefer JR. Der VLDL-Rezeptor:
Bindeglied zwischen Energiestoffwechsel des Herzens und Adipositas (NGFN-2
Obesity and Related Disorders). Medizinische Klinik. 101; (4).112. Jahrestagung der
DGIM, Wiesbaden, 2006.
Soufi M, Ruppert V, Sattler AM, Starke A, Maisch B, und Schaefer JR.
Characterization of a novel and frequent apo B-100 mutation in Germany (apoB-100
H3543Y). Perfusion. 17; (9). 1. Deutscher Atherosklerosekongress, Leipzig, 2004.
7. Anhang 240
Soufi M, Sattler AM, Rafat M, Maisch B, Dugi K, Biedenkopf A und Schaefer JR.
Detektion eines frequenten Polymorphismus (S19W) im Apolipoprotein A-V bei
Patienten mit Hypertriglyzeridämie. Medizinische Klinik. 98; (Abstract-Band I). 109.
Jahrestagung der DGIM, Wiesbaden, 2003.
Soufi M, Imhof M, Sattler AM, Rafat M, Maisch B, und Schaefer JR.
Mutationsscreening der endothelialen NO-Synthase (eNOS). Medizinische Klinik. 97;
(Abstract- Band II). 108. Jahrestagung der DGIM, Wiesbaden, 2002.
Soufi M, Sattler AM, Maisch B, und Schaefer JR. Neuartiger LDL-Rezeptordefekt bei
einem Kind mit familiärer Hypercholesterinämie (FH), Carotis-interna-Stenose und
Apoplex. Perfusion. 14; (2). 15. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für
Arterioskleroseforschung, Blaubeuren, 2001.
Soufi M, Hackler R, Sattler AM, Maisch B, und Schaefer JR. Nachweis einer neuen
Variante des Apolipoprotein E (Leu141Met) bei einem Patienten mit therapierefraktärer
Hyperlipidämie. Medizinische Klinik. 96; (Abstract- Band II). 107. Jahrestagung der
DGIM, Wiesbaden, 2001.
Soufi M, Zschoke J, Quak E, Hofmann G, Maisch B, und Schaefer JR. First description
of homozygous familial hypercholesterolemia (FH) in twins. Atherosclerosis. 147;
(Suppl. 2). 10th International Dresden Symposium on Lipoproteins and Atherosclerosis
Dresden, 1999.
7. Anhang 241
Buchbeiträge
Heinle H, Schulte H, Hahmann H, von Eckardstein: Arteriosklerose: Neue Konzepte,
Risikofaktoren und Targets: Köhler-Verlag-Tübingen (2006). M. Soufi: Hyperlipidämie
bei Patienten mit ApoE 2/2 und ApoA5 S19W
Heinle H, Schulte H, Hahmann H: Besondere Aspekte der cerebrovaskulären und
peripheren Arteriosklerose: Köhler-Verlag-Tübingen (2004). M. Soufi: Untersuchungen
des ApoA5-Gens bei Patienten mit Hypertriglyzeridämie.
Richter V, Reuter W, Rassoul F, Thiery J: Lipoproteinmetabolismus und
Atherosklerose-Prävention. Verlag wissenschaftliche Scripten-Zwickau; (2002).
M. Soufi: Screening auf Mutationen des LDL-Rezeptorgens bei Kindern mit familiärer
Hypercholesterinämie (FH).
Richter V, Reuter W, Rassoul F: Aktuelle Aspekte der Lipoprotein und
Atheroskleroseforschung: Verlag wissenschaftliche Scripten-Zwickau; (2000).
M. Soufi: Vereinfachtes DGGE-Screeningverfahren zur Detektion von neuen und
bekannten Mutationen des LDL-Rezeptors bei familiärer Hypercholesterinämie.
Vortragspreise
Soufi M, Hackler R, Sattler AM, Maisch B, und Schaefer JR. Nachweis einer neuen
Variante des Apolipoprotein E (Leu141Met) bei einem Patienten mit therapierefraktärer
Hyperlipidämie. (2001). 107. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Innere
Medizin (DGIM) in Wiesbaden, 1. Posterpreis in der Sektion Endokrinologie.
Soufi M, Imhof M, Sattler AM, Rafat M, Maisch B, und Schaefer JR.
Mutationsscreening der endothelialen NO-Synthase (eNOS). (2002) 108. Jahrestagung
der Deutschen Gesellschaft für Innere Medizin (DGIM) in Wiesbaden, 1. Posterpreis in
der Sektion Angiologie.
7. Anhang 242
7.6 Ehrenwörtliche Erklärung
Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die dem Fachbereich Medizin Marburg zur
Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel „ Funktionelle Charakterisierung
neu identifizierter Defekte des LDL-Rezeptors und von Apolipoprotein B-100“ in der
Klinik für Kardiologie (Direktor: Prof. Dr. B. Maisch) in der Arbeitsgruppe Präventive
Kardiologie unter Leitung von Prof. Dr. J. R. Schaefer ohne sonstige Hilfe selbst
durchgeführt und bei der Abfassung der Arbeit keine anderen als die in der Dissertation
aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe. Ich habe bisher an keinem in- oder ausländischen
Medizinischen Fachbereich ein Gesuch um Zulassung zur Promotion eingereicht, noch
die vorliegende oder eine andere Arbeit als Dissertation vorgelegt.
Marburg, Januar 2008