Gliederung
1) Wie funktioniert der Mechanismus der Transkriptionsaktivierung bei GAL4?
2) Welche Regionen des Transkriptionsfaktors sind essentiell für dessen Funktion?
3) Inwiefern finden die Ergebnisse in der Bioanalytik ihre Anwendung?
GAL4• Transkriptionsfaktor der Hefe• Aktiviert Gene des
Galactosemetabolismus in Abhängigkeit von Glucose und Galactose
• Bindestelle UASG (upstream activation sites)
Wie funktioniert der Mechanismus der
Transkriptionsaktivierung bei GAL4?
Mögliche Mechanismen: 1) Bindung des Transkriptionsfaktors
führt zur DNA-Konformationsänderung
2) Aktivierung durch Protein-Protein-Wechselwirkungen
Neues Konstrukt: LexA-GAL4
- Potentielle
Aktivierungsdomäne von GAL4
- DNA-Bindungsdomäne von prokaryotischen Repressor LexA
Zusammenfassung• LexA-GAL4 erkennt LexA-Operator in
E.coli• Transkription in der Hefe wird nur
aktiviert, falls LexA-Operator vorhanden • LexA-GAL4 aktiviert Transkription auch,
wenn lexA-Operator downstream gelegen• Mögliche Wechselwirkungen von LexA-
GAL4 mit GAL80
Welche Regionen des Transkriptionsfaktors sind
essentiell für dessen Funktion?
Struktur von GAL4 bis dahin noch ungeklärt
Erzeugung von GAL4–Deletionsmutanten zur Bestimmung der relevanten Proteinregionen!
Zusammenfassung
• Zwei entscheidende Regionen für die Proteinaktivität identifiziert
N-Terminus: 1-147 bzw. 1-74 C-Terminus: 851-881 • Bis zu 80% des Proteins können
fehlen, ohne gravierenden Funktionsverlust
Ergebnisse:• Spezifität der Aktivierung der
Transkription wird durch die DNA-Bindung reguliert
• Kopplung der DNA-Bindungsdomäne und Aktivator-Domäne über zusätzliche Proteinanteile Analyse von Protein-Protein-Interaktionen
Kriterien des Köderproteins
•„Volle Länge“-Expression des LexA-Fusionsproteins:Western Blotting
•Transport des Fusionsproteins in den Zellkern des Akzeptorstamms und Bindung an die LexA-bindenden DNA –Elemente in der
Promotorregion der Reportergene;
•Das Fusionsprotein selbst darf die Transkription des Reportergens nicht auslösen.
Fazit
Die gewonnenen Erkenntnisse der Struktur und Funktion des GAL4-
Systems sind von grundlegender Bedeutung für die Proteomik!