Arş.Gör.Göktan KUŞPINAR

(Yüksek Lisans Öğrencisi)

ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ

HİSTOLOJİ – EMBRİYOLOJİ AbD.

Neurokinin B (NKB)/NK3

Neurokinin B reseptör (NK3R)

Kisspeptin/KISS1

Kisspeptin reseptör (KISS1R)

Ovaryum, tuba uterina ve uterusda,messenger RNA (mRNA) düzeylerinin ve peptit lokalizasyonlarınıngösterilmesi ,olası birlikte ekspresyonların tespitedilmesi

Neurokinin B (NKB)Tachykinin neuropeptit ailesi :

Substance P (SP) Neurokinin A (NKA) Neurokinin B (NKB)

Endokinins Hemokinins

Page NM. Ve ark. - 2005

10-11 aminoasit

Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2

Pennefather JN ve ark. - 2004

TAC3 geni NKB ( Almeida TA. ve ark. – 2004 )

Neurokinin B Reseptör ( NK3R )

SP

NKA

NKB

NK1R

NK2R

NK3R

Tacr1 geni

Tacr2 geni

Tacr3 geni

Mussap CJ ve ark. .- 1993

Seabrook GR. ve ark. - 1995

Kisspeptin

Kiss 1 geni( 1q32 )

KP-145145 Aminoasitlik öncül protein

Kisspetin – 54, 14, 13, 10

Kisspeptin Reseptör/ KISS1R (GPR54)

KISS1R geni KISS1R

G- Proteini bağımlı reseptörler

Galanin reseptörleri ile %45’lik benzerlik gösterir.

(Lee DK. Ve ark. 1999 )

( Kispeptin 54 - Lee DK. ve ark. 1999)( Gottsch ML. ve ark. 2004 - 2009 )

de Roux N ve ark. (2003 ) Seminara SB ve ark. (2003)Navarro VM ve ark. ( 2004 )

KISS1 ve KISS1R üreme fonksiyonlarının düzenlenmesinde rol üstlenmesi

KISS1R (GPR54 ) reseptörunün fonksiyon kaybına yol açan mutasyonların,

Pubertal gelişme eksikliği Üreme aktivitelerinde kayıp Hipogonadotropik hipogonadizm

NKB ve NK3R proteinlerini kodlayan TAC3 ve TACR3 genlerinde görülen mutasyon;

Normosmic hypogonadotropic hypogonadism( Seksuel gelişim bozukluğu,hatalı gametogenez,infertilite )

NKB ve NK3R ligand reseptör ilişkisinin üremefonksiyonlarının düzenlenmesinde anahtar rol üstlenmesi

Topaloglu AK, Semple RK ve ark. ( 2009 , 2010 )

Young J ve ark. (2010)Gianetti E ve ark. (2010)

NKB’ nin , hipotalamus da bulunan GnRH salınımının duzenlendiği ayrı norönalpopulasyonlardan sentezlendiği gösterilmiştir. (Goodman RL ve ark. 2007 ), (Rance NE. ve ark. 2009 )

NKB eksprese eden bu nöronlarda; postmenapozal dönemde ve ovariektomisonrası NKB ekpsresyon artışı, östrojenin down-regule edici etkisisaptanmıştır.(Rance N ve ark. 1991 ve 2009 )

NKB / kisspeptin / dynorphin birlikte eksprese edildiği,hipotalamusta arcuateçekirdeklerin içerisinde yer alan, KNDy adı verilen nöronlar tespitedilmiş,(Lehman MN ve ark. 2010 ) ve bu 3 peptitlerin birlikte GnRH salgılanmasıve gonadotropin salınımında anahtar modülator oldukları sunulmuştur. (Navarro VM ve ark. 2011)

Merkezi düzeyde NKB ve NK3R işlevlerinini yanı sıra, üreme organlarındafonskiyonlarında önemli rolleri hakkında bir çok bilgi araştırmacılar tarafındansunulmuştur.

NKB ve NK3R çeşitli memeli türlerinde plesanta , ovaryum, testis ve prostat da saptanmıştır. (Page NM ve ark. 2000 ) Diğer bir çeşit üreme hücreleri olan oosit veolgun spermatozoa da da eksprese edildiği gösterlimiştir.(Cintado CG ve ark. 2007)

Tüm bu verilere rağmen NKB, NK3R, kisspeptin ve KISS1R ekspresyonu yapan üremeorganlarında yer alan hücre tipleri hakkında bilinenler azdır.

• RT-PCR

Ovaryum

5 - Postmenapoz dönemi hasta *( non-ovarian olgusu ile ooferektomi )Tuba Uterina

Uterus 6 - Orta üreme dönemi hasta*5 - Postmenapoz dönemi hasta*( benign uterus olgusu ile histerektomi )

* Yaş aralığı 36 – 77 arasında olan gebe olmayan hastalar

30 mg doku örneklerinden - Total RNA izolasyonu TriReagent ( Sigma )

cDNA sentezi – Quantitect Revers Trasncription Kit ( Qiagen )

• RT-PCR

PCR hedef geni Primerler

TAC3 – 266 bp. F 5’-CCAGTGTGTGAGGGGAGCA-3’

R 5’-TCCAGAGATGAGTGGCTTTTGA-3’

TAC3R – 178 bp. F 5’-TTGCGGTGGACAGGTATATGG-3’

R 5’-GGCCATTGCACAAAGCAGAG-3’

KISS1 – 295 bp. F 5’-CCACTTTGGGGAGCCATTAG-3’

R 5’-CCAGTTGTAGTTCGGCAGGTC-3’

KİSS1R – 166 bp. F 5’-GGACGTGACCTTCCTCCTGT-3’

R 5’-GTACCAGCGGTCCACACTCA-3’

b-actin – 362 bp. F 5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3’

R 5’-ATCTGCTGGAAGGTGGACAG-3’

*** Pozitif kontrol amaçlı 20 farklı doku örneği içeren “cDNA havuzu” kullanılmıştır.

• İmmunohistokimya

Myometrium 6 - Üreme Dönemi Hasta( 3 sekretuar faz- 2 proliferatif faz- 1 menstruel faz ) 1 - Postmenapoz Dönemi Hasta( uterin leiomyoma olgusu ile histerektomi )

Ovaryum 3- Üreme Dönemi Hasta ( farklı mensturel dönemlerde ) 4 - Postmenapoz Dönemi Hasta( non- ovarian olgusu ile ooferektomi )

% 10 tamponlanmış Formaldehit – Fiksasyon

Parafin bloklama

3 mM kesitlerin alınması

Deparafinizasyon - TBS tamponu ile ve rehidratasyon

• İmmünohistokimya

Primer poliklonal antikorlar ile oda sıcaklığında gece boyu inkübasyon

NKB (sc-14109 ; Santa Cruz Biotechnology - Keçi anti insan )NK3R ( Sigma )KISS (sc-15400 ; Santa Cruz Biotechnology – Tavşan anti insan )KISS1R (sc-48220 ; Santa Cruz Biotechnology – Keçi anti insan )

1:30 dilusyon% 0,2 Tritron X-100 içeren TBS tamponunda

Biotin isaretli sekonder antikor ile 1:1000 dilusyonda 60 dakika inkübasyon

Streptavidin – peroxsidase ile 1:1000 dilusyonda 60 dakika inkübasyon

Peroxsidase aktivitesinin tespiti için 4-chloro-1-napthol ( Sigma ) ve %0,01 hidrojen peroksit

*** Mast hücrelerinin tayini amaçlı Toluidine Blue boyaması yapılmıştır.

• İmmünohistokimya

Endometriyum 6 – Hasta *( bening uterus olgusu ile histerektomi )

Tuba Uterina 6 – Hasta *( malign uterus olgusu )

* Hasta yaş aralığı : 36-77

Kesitler primer antikorla ile 30 dakika oda sıcaklığında 1:100 diluyonda inkübasyon

Ultra View Universal DAB detection kit ( Ventana medical Systems ) - BenchMark XT

*** Negatif kontrol örnekleri primer antikor ile inkübasyon edilmemiştir.

Gen Ekspresyon analizleri – Tac3, Tacr3, Kiss1 ve Kiss1r

İmmünohistokimya

Myometrium NK3B

Myometrium NKB

İmmünohistokimya

Myometrium da NK3R ekspresyonu, özellikledüz kas hücrelerinde, hormanal düzeye bağımlıolarak belirgin değişiklikler göstermiştir.

Bu gözlemlerde araştırmacıların daha öncekiçalışmalarında insan,fare,sıçan uteruslarındagözlemledikleri östrojen baskısının olduğukoşullarda TACR3 gen ekspresyonunun yüksekoranda duştuğu verisini doğrulamıştır.

NBK/NK3R ekspresyonunun vasküler ve epitelhücreler de görulduğu gibi mast hücrelerindegörülmesi, bu sistemin uterus ile immün sistemarasında haberleşmede rol aldığı idda edilebilir.

Proliferatif Faz NK3B Sekretuar Faz NK3B

Proliferatif Faz NKB Sekretuar Faz NKB

İmmünohistokimya

Endometrium lümen epitel hücreleri ve bez epitel hücreleri - NBK/NK3R veKisspeptin / KISS1R

İmmünohistokimya

İlk defa Kisspeptin / KISS1R ekspreyonlarıinsan endometrium vetuba uterina da gösterilmiştir.

Kisspeptin / KISS1R ligand reseptör ilişkisinin GnRHnöronal kontrolu araçılığıile merkezi üremefonksiyondüzenlenmesindekirolüne ek olarak periferikdüzenlemelerde görevaldığı gösterilmişir.

Tuba Uterina - NBK/NK3R ve kisspeptin/KISS1R

İmmünohistokimya

Uterus lümen epitelinde ve tuba uterina da ; Kisspetin ve NBK peptit sistemlerininbirlikte ekspresyonları gösterilerek ; sperm transportu, oosit fertilizasyonu, blastosist implantasyonu gibi epitel fonksiyonlarının düzenlenmesinde rolalabilcekleri öne surulmuştur.

İmmünohistokimya

NK3B

NKB

İmmünohistokimya

Ovaryumda NBK/NK3R immünoreaktivitesinin corpus luteum da yuksek,gelişmekte olan foliküllerde duşuk seviyede olmasını ; folikül gelişiminbaşlangıç aşamasında östrojen miktarının yuksekliği ve buna bağlı olarak NK3R ekspresyonunu baskılanması ile açıklanabilir.

Corpus luteum da NBK/NK3R ve Kisspeptin / KISS1R immünoreaktivitegöstermesi peptit sisteminin lokal ovulasyon kontrolünde yada postovulatuarovaryan süreclerde, ovaryan steroidogenesis’ in kontrolünde potansiyel roloynadığını duşundurmektedir

NBKNK3R

KISSKISS1R

U

T

E

R

U

S

Myometrium

Bağ Doku Vasküler Düz

Kas Myometrial

Düz kas

Bağ Doku Vasküler Düz

Kas Myometrial

Düz kas

Mast hücreleri

Endometrium Lümen ve Bez Epitel Hücreleri

Tuba Uterina Epitel Hücreleri

Ovaryum Corpus Luteum Antral Folikül

GranülozaHücreleri

Teka Hücreleri

Çalışma da NBK/NK3R ve kisspeptin/KISS1R sitemlerinin uterus (myometrium – endometrium ),ovaryum ve tuba uterina da mRNA ekspresyonları ve proteinlerin lokalizasyonlarıgösterilmiştir.

NBK/NK3R ligand - reseptör ilişkisinin hem merkezi hemde periferal anlamda üremefonksiyonlarında önemli rolü olduğu gösterilmiştir.

İlk kez NBK/NK3R ligand ve reseptör düzeyinde ekspresyonu endometrium ve tuba uterinaepitelinde, myometriumdaki vasküler düz kas ve bağ doku hücrelerinde, mast hücrelerindegösterilmişitir.

NBK/NK3R ve Kisspeptin / KISS1R peptit sistemlerinin immünoreaktivitesi göz önündebulundurulduğunda üreme hastalıkları ile ilgili bir biomarker özellik taşımadığı ve pregenitörolarak kullanılamayacağı tespit edilmiştir.

Genel olarak çalışmada NBK/NK3R ve Kisspeptin / KISS1R peptit sistemlerinin non-nöronalüreme hücrelerinde birlikte eksprese oldukları gösterilmiş ve bu bulguların periferalüremedeki rollerinin gelecekte araştırlması için öncülük edeceği duşunulmektedir.