Download doc - GLucona _ Hoan Chinh

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 _ 2010 Trường Đại học Cần Thơ

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước nông nghiệp, trong thời gian vừa qua, để nâng cao năng

suất thu hoạch người nông dân đã không ngừng sử dụng các loại phân bón hóa học. Sự

canh tác liên tục đã trực tiếp làm cho đất trồng thiếu chất dinh dưỡng nghiêm trọng,

đất bị chai cứng, giảm độ phì nhiêu, tính chất vật lí, hóa học và sinh học của đất trồng

bị thay đổi. Để bù đắp phần chất dinh dưỡng bị mất đi, hàng triệu tấn phân hóa học

được bón xuống đất trồng mỗi năm. Tuy nhiên người ta ước tính lượng phân bón mà

cây hấp thụ chỉ khoảng 40-50% lượng phân bón cho cây trồng. Như vậy lượng phân

bón còn lại sẽ hòa vào không khí, thấm vào đất hoặc theo dòng nước đổ ra sông, suối

và làm ô nhiễm môi trường, điều này gây lãng phí cả về tiền của, sức lao động, làm

tăng cao giá thành sản phẩm, giảm tính cạnh tranh trên thị trường. Bên cạnh đó sự hoạt

động hết công suất của các nhà máy sản xuất phân hóa học, lượng phân bón mà cây

không hấp thụ đã gây ảnh hưởng nặng nề đến môi trường sống và làm ảnh hưởng đến

sức khỏe của con người.

Dân số thế giới gia tăng đòi hỏi lượng lương thực thực phẩm sản xuất ra cũng

tăng, tức là phải tăng năng suất cây trồng. Muốn giải quyết vấn đề này, bên cạnh việc

tạo ra nhiều giống cây trồng mới có năng suất cao còn cần phải bón các loại phân hợp

lý để cải tạo đất, làm cho đất không bị kiệt quệ (Chu Thị Thơm et al., 2006).

Sự xuất hiện và sử dụng phân hóa học từ giữa thế kỉ XX đã được phổ biến trên

khắp thế giới vì những lợi ích thực tế vô cùng to lớn mà nó mang lại. Tuy nhiên, người

ta đã nhận ra nhiều khuyết điểm khi sản xuất và sử dụng loại phân này. Quá trình sản

xuất phân hóa học đòi hỏi chi phí đầu tư lớn, nguyên liệu sản xuất có thể làm kiệt quệ

nguồn tài nguyên không phục hồi được (dầu mỏ). Mặt khác, khi sử dụng phân hóa học

trong một thời gian dài có thể làm độ phì nhiêu của đất giảm, ô nhiễm tầng nước mặt,

nhiễm độc đất (Nguyễn Phú Thọ, 2006), ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm, có

thể gây hại đến sức khỏe con người (Lê Văn Tri, 2001).… và ảnh hưởng đến môi

trường không khí của trái đất…

Để cải tạo đất và khắc phục những hậu quả do việc sản xuất và sử dụng phân

bón hóa học, người ta sử dụng phân hữu cơ để thay thế một phần và có thể tiến tới

thay thế hoàn toàn lượng phân hóa học. Nhưng phân hữu cơ truyền thống (phân xanh,

Chuyên ngành công nghệ sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


phân chuồng, phân rác…) khó có thể đáp ứng được nhu cầu của một nền nông nghiệp

hiện đại. Sự phát triển của một nền khoa học tiên tiến điển hình là sự phát triển của

ngành công nghệ sinh học đã cho ra đời một sản phẩm mới: phân hữu cơ vi sinh (gọi

tắt là phân vi sinh). Kết quả nghiên cứu của nhiều quốc gia trên thế giới cho thấy việc

sử dụng phân bón vi sinh vật có thể cung cấp cho đất từ 30-60 kg nitơ (đạm)/ha/năm,

thay thế đến 50% lượng lân vô cơ cần bón và làm tăng độ phì nhiêu của đất. Các chế

phẩm có chứa vi sinh vật còn làm tăng khả năng trao đổi chất trong cây, nâng cao sức

đề kháng và chống bệnh ở cây trồng, làm tăng chất lượng nông sản, tăng thu nhập cho

nông dân (theo www.vneconomy.vn số ra ngày 29/10/2007)…

Từ lợi ích thực tế và nhu cầu cấp thiết của việc nghiên cứu, sử dụng phân vi

sinh, các nước trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng đang tiến hành nghiên

cứu và triển khai ứng dụng rộng rãi, đã có nhiều sản phẩm được cấp phép và lưu hành

từ nhiều năm nay. Tuy nhiên, để chiếm lĩnh được lòng tin của nông dân và thay thế tập

quán sản xuất của họ từ việc sử dụng phân hóa học sang sử dụng phân vi sinh còn là

một bài toán khó. Lời giải của bài toán này là phải làm sao kết hợp một cách hoàn hảo

giữa chất lượng, giá thành và sự tiện dụng.

Sử dụng những chất mang dễ tìm, rẻ tiền mang tính chất tận dụng các phế thải

từ các quy trình sản xuất các sản phẩm khác là một hướng đi đang được chú ý nhất. Vì

ngoài việc làm giảm chi phí sản xuất, hạn chế việc nhập khẩu phân hóa học, tạo thêm

nhiều công ăn việc làm thì còn góp phần nâng cao lợi nhuận cho nông dân, đóng góp

vào quá trình sản xuất lương thực thực phẩm an toàn, làm giảm ô nhiễm môi trường và

xây dựng mô hình phát triển bền vững trong Công - Nông nghiệp.

Bã bùn mía là một sự lựa chọn phù hợp vì bã bùn mía nếu được xử lý đúng

cách sẽ là một môi trường hữu hiệu để các vi sinh vật phát triển, tạo tiền đề cho một

sản phẩm phân vi sinh chất lượng tốt, giá thành hạ. Không nằm ngoài những mục đích

trên, đề tài “Khảo sát khả năng sống sót của vi khuẩn Gluconacetobacter

diazotrophicus trong chất mang bã bùn mía” được thực hiện.



PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1. Phân vi sinh.

2.1.1. Giới thiệu về phân vi sinh.

2.1.1.1. Khái niệm

Theo TCVN 6169:1996, phân bón vi sinh vật (gọi tắt là phân vi sinh) là sản

phẩm chứa một hay nhiều dòng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn có mật độ đạt

theo tiêu chuẩn hiện hành. Thông qua các hoạt động của chúng sau quá trình bón vào

đất tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng sử dụng được (N, P ,K, . . .) hay các hoạt

chất sinh học, góp phần nâng cao năng xuất và (hoặc) chất lượng nông sản. Phân vi

sinh bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh

thái và chất lượng nông sản.

2.1.1.2. Phân loại

Phân bón vi sinh vật cố định nitơ

Phân bón vi sinh vật cố định nitơ (tên thường gọi: phân đạm vi sinh) là sản phẩm

chứa một hay nhiều dòng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn với mật độ đạt theo tiêu

chuẩn hiện hành, có khả năng cố định nitơ từ không khí cung cấp các hợp chất chứa

nitơ cho đất và cây trồng, tạo điều kiện nâng cao năng suất và (hoặc) chất lượng nông

sản, tăng độ màu mỡ của đất. Phân vi sinh vật cố định nitơ và các dòng vi sinh vật này

không gây ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh thái và chất

lượng nông sản.

Vi sinh vật cố định nitơ là vi sinh vật sống cộng sinh hay hội sinh với cây trồng,

hoặc vi sinh vật sống tự do trong đất, nước, không khí, có khả năng tạo khuẩn lạc đặc

trưng trên môi trường nuôi cấy không chứa hợp chất nitơ (môi trường NfM, YMA,

Ashby…).

Các vi khuẩn cố định Nitơ: vi khuẩn có định nitơ không thuộc cây họ đậu thuộc

các giống Achromobacter, Acetobacter, Alcaliganes, Arthrobacter, Azomonas,

Bacillus, Beijesinekia, Clostridium, Camplylobacter, corynebacterium, Decxia,

Desulfporibrio, Enterobacter, Herbaspirium, Lignobacter, Mycobacterium,

Methyllosinys, Pseudomonas, Rhodopspirillum, Rhodopseudomonas và Xanthobacter



(Wani, 1990). Một số loài được tìm thấy trong vùng rễ cây ngũ cốc chủ yếu là

Azobacter và AzoSpirillum; một số vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong các cây chủ

(mía) được tìm thấy là vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus

Phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất photpho khó tan

Phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất photpho khó tan (tên thường gọi : phân

lân vi sinh) là sản phẩm chứa một hay nhiều dòng vi sinh vật sống đã được tuyển chọn

với mật độ tế bào đạt tiêu chuẩn hiện hành, có khả năng chuyển hoá hợp chất photpho

khó tan thành dạng dễ tiêu cung cấp cho đất và cây trồng, tạo điều kiện nâng cao năng

suất và (hoặc) chất lượng nông sản. Phân lân vi sinh và các dòng vi sinh vật này

không ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng

nông sản.

Thông qua các hoạt động của vi sinh vật phân giải hợp chất photpho khó tan,

các hợp chất photpho khó tan được chuyển hoá thành dạng dễ tiêu đối với cây trồng.

Vi sinh vật phân giải hợp chất khó tan tạo vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc

(vòng phân giải) trên môi trường chứa nguồn photpho duy nhất là Ca3(PO4)2.

Nhóm vi sinh vật được biết có khả năng hòa tan lân (Subba Rao, 1983; Gaus,

1990) bao gồm vi khuẩn Bacillus megaterium, B. Circulans, B. subtilis, Pseudomonas

straita, P. rathonis; nấm Aspergillus awamori, Penicillium digitatum, Trichoderma sp;

nấm men Schwanniomyces occidentails.

Phân bón vi sinh vật phân giải cellulose

Phân bón vi sinh vật phân gải cellulose (tên thường gọi: phân vi sinh phân giải

cellulose) là sản phẩm chứa một hay nhiều dòng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn

với mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành có khả năng phân giải cellulose , để cung cấp

chất dinh dưỡng cho đất và cây trồng, tạo điều kiện nâng cao năng suất và (hoặc) chất

lượng nông sản, tăng độ màu mỡ của đất. Phân vi sinh vật phân giải cellulose và các

dòng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh

thái và chất lượng nông sản.

(http://www.cuctrongtrot.gov.vn/ChuyenTrangPB/chuyentrangPB/indexCTPB.aspx?

tacn=techologystandar&type=first&num=1).


http://www.cuctrongtrot.gov.vn/ChuyenTrangPB/chuyentrangPB/indexCTPB.aspx?tacn=techologystandar&type=first&num=1

http://www.cuctrongtrot.gov.vn/ChuyenTrangPB/chuyentrangPB/indexCTPB.aspx?tacn=techologystandar&type=first&num=1


Phân vi sinh vật kích thích tăng trưởng cây

Phân vi sinh loại này chứa một nhóm nhiều loài vi sinh vật khác nhau, trong đó

có vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn... Nhóm này được các nhà khoa học phân lập ra từ tập

đoàn vi sinh vật đất. Vi khuẩn tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật thường sống

trong vùng rễ của thực vật có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cây gọi là vi khuẩn

vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (PGPR= Plant Growth Promoting Rhizobacter)

(Schoroth và Hancock, 1981). PGPR bao gồm các giống Actinoplanes,Agrobacterium,

Alcaligenes, Amorphosporangium, Arthobacter, Azotobacter, Bacillus,

Brandyrhizobium, cellulomonas, Enterobacter, Pseudomonas, Rhizobium (Weller,

1988).

Nấm rễ dạng bụi (VAM= Vesicular Arbuscular Mycorrhizae): các nấm có

khuẩn ty ăn sâu vào bên trong tế bào nhu mô rễ cây, chúng hút nhiều dưỡng chất từ đất

cung cấp trực tiếp cho thực vật. Ngoài ra nấm còn có khả năng giúp cây chịu hạn trong

vùng đất sa mạc, giúp cây kháng lại các loại nấm gây hại khác (Mosse et al, 1981).

Nấm rễ bao gồm các giống Endogone, Glomus, Entrophosphora, Gigaspora,

Acaulospora, Scutellispora.

Người ta sử dụng những chế phẩm gồm tập đoàn vi sinh vật được chọn lọc để

phun lên cây hoặc bón vào đất làm cho cây sinh trưởng và phát triển tốt, ít sâu bệnh,

tăng năng suất. Chế phẩm này còn làm tăng khả năng nảy mầm của hạt, tăng trọng

lượng hạt, thúc đẩy bộ rễ cây phát triển mạnh. Như vậy, chế phẩm này có tác động

tương đối tổng hợp lên cây trồng.

Để sản xuất chế phẩm vi sinh vật kích thích tăng trưởng của cây, người ta sử

dụng công nghệ lên men vi sinh vật. Ở các nước phát triển người ta sử dụng các thiết

bị lên men tự động, công suất lớn. Ở nước ta, đã dùng kỹ thuật lên men trên môi

trường bán rắn để sản xuất chế phẩm này, bước đầu cho kết quả khá tốt.

(http://agriviet.com/news).

2.1.2. Tiêu chí đánh giá chất lượng phân vi sinh

2.1.2.1. Phân bón vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng

Phân bón vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng là sản phẩm, trong đó chất

mang được tiệt trùng trước khi cấy vi sinh vật hữu ích. Phân vi sinh loại này có mật độ



tế bào vi sinh hữu ích (CFU * /g ( hay ml) phân bón) không thấp hơn 1,0 . 108 tế bào /g

(ml) phân, tế bào vi sinh vật tạp không lớn hơn 1,0 .106 tế bào /g (ml) phân. Phân vi

sinh loại này có thời gian bảo quản từ 6 tháng trở lên.

2.1.2.2. Phân bón vi sinh vật trên nền chất mang không thanh trùng

Phân bón vi sinh vật trên nền chất mang không thanh trùng là sản phẩm, trong

đó chất mang không được tiệt trùng trước khi cấy vi sinh vật hữu ích, có mật độ tế bào

vi sinh hữu ích từ 1,0 . 106 đến 1,0 . 107 tế bào /g (ml) phân. Thời gian bảo quản tối

thiểu 6 tháng (http://www.cuctrongtrot.gov.vn/ChuyenTrangPB).

Chất lượng phân vi sinh đã được nhà nước quy định theo những tiêu chuẩn

riêng biệt như: TCVN 6166:04 đối với phân vi sinh cố định đạm, TCVN 6167:96 đối

với phân vi sinh hòa tan lân... Ngoài ra, theo Nguyễn Thanh Hiền (2003) thì Trung tâm

Nghiên cứu và Ứng dụng Phân bón Vi sinh đã phối hợp với Trung tâm Nghiên cứu Cố

định Nitơ Sunfit thuộc trường Đại học Tổng hợp Sydney có đưa ra một số tiêu chuẩn

khác cũng không kém phần quan trọng:

Giống có hoạt tính (cố định nitơ hoặc phân giải photpho) mạnh.

Phân vi sinh thay được ít nhất 50% lượng phân hóa học.

Không gây bệnh cho cây và tăng năng suất cây trồng từ 10% trở lên.

2.1.3. Tầm quan trọng của việc sử dụng phân vi sinh

2.1.3.1. Khuyết điểm của phân hóa học

Đối với phân đạm (nitơ)

Hàng năm chi phí cho phân đạm trong nông nghiệp trên thế giới khoảng 45 tỉ

USD, và tăng với một tỉ lệ tương đương với dân số thế giới (2%) (Shenoy et al., 2001).

Hầu hết đạm hóa học được sản suất theo quy trình Haber – Bosch, đòi hỏi một lượng

lớn khí tự nhiên, than đá, hoặc dầu mỏ. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng để sản xuất 1

tấn phân đạm hóa học cần 1,3 tấn dầu, để sản xuất 80 triệu tấn phân đạm hóa học cần

100 triệu tấn dầu, bằng 1,4% số dầu sử dụng trên toàn cầu. Dầu cần cho sản xuất công

nghiệp, nông nghiệp, giao thông vận tải… Khai thác quá mức thì nguồn tài nguyên

này cũng sẽ cạn kiệt, không còn cho các thế hệ sau. Thêm vào đó việc sản xuất đạm

sinh học sẽ sinh ra một lượng lớn CO2 – một trong những nguyên nhân gây ra hiệu ứng Chuyên ngành công nghệ sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


nhà kính mà cả thế giới đang tìm cách khắc phục. Hơn nữa, chỉ có khoảng 1/3 lượng

phân bón vào đất cây trồng có thể sử dụng, lượng đạm còn thừa sẽ thất thoát ra môi

trường bên ngoài gây ô nhiễm nguồn nước ngầm và ảnh hưởng đến sức khỏe con

người. Việc sử dụng quá mức lượng đạm hóa học sẽ dẫn đến sự sản sinh N2O cũng gây

ra hiện tượng nóng lên toàn cầu.

Ngoài ra, chưa kể đến chất lượng nông sản khi sử dụng đạm hóa học không

đúng cách. Nếu bón phân đạm vào lúc thời tiết không thuận lợi (trời rét đậm, nắng gắt,

sương nhiều đọng trên lá) chẳng những cây không hấp thu hiệu quả mà còn có thể gây

độc. Bón nhiều phân đạm càng gặp nhiều tác hại hơn. Cây có thể bị giảm năng suất do

phát triển quá nhanh làm thân mềm, phân nhiều nhánh, dễ đổ ngã và chậm ra hoa, khó

đậu trái… Phân đạm dư thừa còn làm cây trồng giảm khả năng chống chịu với sâu

bệnh và thời tiết (Lê Văn Tri, 2001).

Đối với phân lân (Photpho)

Photpho (P) là nguồn dinh dưỡng quan trọng thứ 2 của cây trồng. Cây xanh hấp

thụ lân ở dạng hòa tan nhưng phần lớn lân tồn tại trong đất dưới dạng không hòa tan

(Ca3(PO4)2) hoặc dạng hữu cơ nên cây không hấp thu được. Nếu bổ sung lân cho đất

bằng con đường hóa học có thể gây ô nhiễm môi trường và giá thành cao. Ngoài ra,

việc sản xuất lân bằng con đường hóa học đòi hỏi nguồn nguyên liệu là quặng mỏ,

điều này làm cho nguồn tài nguyên thiên nhiên ngày càng cạn kiệt. Theo Goldstein

(1986), phân lân hóa học sản xuất từ quặng mỏ có thể chuyển thành hợp chất khác từ

70 – 80% gây nên sự lãng phí vô cùng lớn.

Trên đây là một số khuyết điểm đáng chú ý đi kèm với những ưu điểm mà phân

hóa học đã mang lại cho con người từ nửa thế kỉ qua. Mặt hạn chế của phân hóa học đã

đến lúc làm cho chúng ta phải suy nghĩ và gấp rút tiến hành những nghiên cứu tìm ra

hướng đi mới trong vấn đề dinh dưỡng cho cây trồng để đạt được mục đích cuối cùng

là phát triển một nền nông nghiệp bền vững, lâu dài.

2.1.3.2. Ưu điểm của phân vi sinh

Theo đánh giá của các chuyên gia kinh tế nông nghiệp, trường Đại học Sydney, thì

phân vi sinh mang lại lợi ích cho các thành phần sau:

Cho các hộ nông dân sử dụng phân vi sinhChuyên ngành công nghệ sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


Bón phân vi sinh, chi phí cho sản xuất giảm, do giảm được phân hóa học và

giá phân vi sinh rẻ, ít nhất giảm được 16%. Với chế độ bón phân hợp lý, chi phí còn

giảm được nhiều hơn.

Bón phân vi sinh năng suất tăng, với chế độ bón bình thường (khoảng

300kg/ ha), năng suất tăng trung bình 10%. Nếu kết hợp với phân hóa học đúng cách,

năng suất còn có thể tăng cao hơn.

Bón phân vi sinh đất tốt hơn, cây khỏe hơn, giảm sâu bệnh, do vậy giảm chi

phí cho thuốc bảo vệ thực vật.

Đối với địa phương

Nếu công nghệ sản xuất phân vi sinh được chuyển giao cho địa phương và

sản phẩm làm ra cung ứng cho chính nông dân của địa phương đó thì chắc chắn phân

vi sinh góp phần phát triển kinh tế của địa phương.

Đối với nhà nước

Hiện nay, hầu hết các nước đang phát triển phải nhập khẩu phân bón vì vậy

nếu sản xuất được phân vi sinh tại chổ thì sẽ giảm được một lượng lớn ngoại tệ cho

việc nhập phân bón. Ngoài ra, tiêu hao nguyên liệu để sản xuất phân vi sinh không

đáng kể so với sản xuất phân hóa học.

Lợi ích cho môi trường

Những lợi ích phân vi sinh mang lại cho môi trường còn lớn hơn nhiều so với

lợi ích kinh tế. Những lợi ích cho môi trường là:

Sử dụng hiệu quả hơn các chất dinh dưỡng trong đất (lân); trong không khí

(đạm).

Giảm sự rửa trôi phân đạm hóa học, gây nên sự ô nhiễm nguồn nước do

NO3-.

Giảm đáng kể quá trình denitrit hóa, sinh ra khí N2O rất độc, độc hại hơn

NO3- nhiều.

Giảm được lượng khí đốt khi sản xuất phân hóa học.

Các chất còn lại trong đất có thể được phân hủy sinh học.



Từ những đánh giá trên, việc sử dụng phân vi sinh là cần thiết để xây dựng nền nông

nghiệp bền vững trên toàn cầu (Chu Thị Thơm et al., 2006).

Bảng 2.1. Hiệu quả của phân hữu cơ sinh học đối với lúa ở một số quốc gia châu Á

Quốc gia Tỉ lệ % tăng năng suất

Trung Quốc

Triều Tiên

Thái Lan

Ấn Độ

25,2 – 32,6

8 – 12

2,5- 29,5

9,9

Nguồn: Lê Xuân Phương (2005)

2.1.4. Tình hình sản xuất và sử dụng phân vi sinh trong nước và thế giới

2.1.4.1. Trong nước

Ở Việt Nam, phân vi sinh vật cố định đạm, phân giải lân đã được bước đầu

nghiên cứu từ những năm 1960. Năm 1958, Lê Văn Căn và Đặng Văn Ngữ đã nghiên

cứu loài nấm có khả năng phân giải photpho khó tan là Aspergillus niger và đạt được

thành công bước đầu. Chỉ sau 4 tuần nuôi cấy, loài nấm này đã chuyển hóa được

17,2% photpho tổng số trong apatit và 14,2% photpho tổng số trong photphorit. Năm

1980 bắt đầu thử nghiệm phân vi sinh cho cây đậu tương và chế phẩm ViDane,

ViDapho cho cây đậu nành, đậu phộng của Trường Đại học Cần Thơ. Trong chương

trình 52b-01-03 (1987), quy trình sản xuất Nitragin trên nền đất than bùn đã được hoàn

thiện (Lê Văn Tri, 2002). Từ những năm 1989 – 1991 đã có rất nhiều sản phẩm sinh

học, sinh hóa được sản xuất với nhiều tên gọi khác nhau như: Komix (của công ty

Donall); Biomix (công ty phân bón hóa chất Kiên Giang); Biomix C (xí nghiệp than

bùn Củ Chi, Tp. Hồ Chí Minh); Biomix P (xí nghiệp phân Chư Sê Playku); Biofer A

(Trung tâm khuyến nông tỉnh Sông Bé)…(Nguyễn Đăng Diệp, 2000).

Nhu cầu sử dụng phân sinh học hiện nay rất lớn, đặc biệt là phân chuyên dùng

và tận dụng được chế phẩm sẵn có như: phân Komix chuyên dùng cho mía, cà phê,

cacao,… Các xí nghiệp phân sinh học, phân vi sinh được xây dựng ở nhiều nơi như:

La Ngà (Đồng Nai), Nha Trang (Khánh Hòa), Vĩnh Phúc, Hà Tây, Tây Ninh, Long



An… Để tận dụng nguồn phế thải ở địa phương và đáp ứng nhu cầu phân bón hiện

nay.

Trong năm 2003 – 2004 cả nước đã có 34/42 nhà máy đường tận dụng bã bùn

mía để sản xuất phân vi sinh, sản lượng phân vi sinh đạt 200.000 tấn và chỉ mới đáp

ứng 50% nhu cầu cho vùng nguyên liệu của các nhà máy (Bộ Nông nghiệp và Phát

triển Nông thôn Việt Nam, 2004).

2.1.4.2. Thế giới

Phân bón vi sinh đầu tiên do Noble Hiltner sản xuất tại Đức năm 1896 và được

đặt tên là Nitragin (Nitragin là loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizobium do

Beijerink phân lập năm 1888 và được Fred đặt tên vào năm 1889 dùng để bón cho các

loại cây thích hợp của họ đậu). Năm 1900 – 1914 nhiều nước trên thế giới triển khai

sản xuất chế phẩm vi sinh vật: Canada, Tân Tây Lan, Áo (Nguyễn Xuân Thành, 2003).

Ngày nay, phân vi sinh vật cố định đạm đã được sử dụng nhiều nơi trên thế giới

với nhiều tên gọi khác nhau như: Rizonit (Hungary), Nitrobacterin (Anh), Estrasol

(Nga), Mana (Nhật, Philippin), Tian-li-bao (Trung Quốc, Hồng Kong)… (Lê Văn Tri,

2002).

Bên cạnh đó đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc

sản xuất các loại phân bón vi sinh cố định nitơ mà thành phần còn được phối hợp thêm

một số vi sinh vật có ích khác như một số xạ khuẩn cố định nitơ sống tự do Frankia

spp, Azotobacter spp, các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do Clostridium, Pasterium,

Beijerinkiaindica, các xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose, hoặc một số dòng vi

sinh vật có khả năng chuyển hóa các nguồn dự trữ photpho và kali ở dạng khó hoà tan

với số lượng lớn có trong đất mùn, than bùn, trong các quặng apatit, photphoric...

chuyển chúng thành dạng dễ hoà tan, cây trồng có thể hấp thụ được.Bã bùn mía và một

số chất mang khác trong việc sản xuất phân vi sinh

2.1.5. Bã bùn mía

Bã bùn mía là cặn bã sau khi lắng lọc nước mía ở các nhà máy đường. Đây là

hỗn hợp những tạp chất như: bùn đất, bã mía nhỏ, bụi… Ngoài ra, trong bã bùn mía

còn sót lại khoảng 0,5 – 1% đường (Bùi Quang Vinh, 1998).



Để sản xuất đường, hằng năm Việt Nam phải trồng từ 10 - 12 triệu tấn mía cây

với diện tích canh tác từ 250.000 đến 300.000 ha chủ yếu là đất bạc màu và vùng

nhiễm phèn nặng (không trồng được các loại cây khác). Vì thế, để trồng được 250.000

ha mía, ngoài phân hóa học (đạm - lân - kali) tối thiểu phải bón 4 - 5 tấn phân chuồng

cho 1 ha tức là phải có 1 triệu tấn phân chuồng bón cho 250.000 ha.

Trong khi đó, việc chế biến 10 triệu tấn mía để làm đường sinh ra một lượng phế thải

khổng lồ: 2,5 triệu tấn bã mía, 250.000 tấn bã bùn (sau khi đã lấy nước đường) và

250.000 tấn mật rỉ. Trước đây 80% lượng bã mía này được dùng để đốt lò hơi trong

các nhà máy sản xuất đường, sinh ra 50.000 tấn tro và 20% còn lại là 500.000 tấn bã

được dùng làm ván ép, còn mật rỉ dùng để sản xuất cồn, mì chính hoặc dùng cho các

công nghệ vi sinh khác như chế biến thành thức ăn chăn nuôi. Riêng tro và bã bùn

không sử dụng được phải đổ ra các bãi đất trống. Tuy là phế thải nhưng trong bã bùn

mía lại có nhiều chất hữu cơ "bổ béo" mà cây mía đã hút từ đất như protein, lipit, các

chất khoáng, vitamin... Và cả những chất bẩn từ cây mía (vì khi đưa vào máy nghiền,

cây mía không được cọ rửa). Các chất này sau một thời gian đã lên men vi sinh vật có

mùi thối ngấm xuống đất gây ô nhiễm môi trường và ô nhiễm nguồn nước rất nặng.

(http://www.nea.gov.vn/thongtinmt/noidung/home_24_3_03.htm).

Tuy nhiên nếu xử lý đúng cách, chẳng những bã bùn mía không gây ảnh hưởng

môi trường mà còn mang lại nhiều lợi ích cho các nhà máy đường và người dân. Bã

bùn mía là nguồn nguyên liệu tốt cho sản xuất phân sinh học vì sinh khối bã bùn mía

cung cấp cung cấp nguồn carbon hữu ích cho vi sinh vật phát triển (Malik et., al 2001).

Bảng 2.2. Thành phần lý hóa tính của bã bùn mía

Thành phần

Carbon tổng số (%) 50,797

Đạm tổng số (%) 2,322

P2O5 (%) 5,287

K2O (%) 1,789

pH 6,7

Nguồn: Bộ môn Khoa học đất, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ



2.1.6. Một số chất mang khác

2.1.6.1. Than bùn

Than bùn được tạo thành từ xác các loài thực vật khác nhau. Xác thực vật được

tích tụ lại, được đất vùi lấp và chịu tác động của điều kiện ngập nước trong nhiều năm.

Với điều kiện phân huỷ yếm khí các xác thực vật được chuyển thành than bùn. Màu

sắc của than bùn thay đổi theo thành phần cấu tạo, tuổi của than và các điều kiện

khống chế khi hình thành.

Trong than bùn có hàm lượng chất vô cơ là 18 – 24%, phần còn lại là các chất

hữu cơ (Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam). Khoa

học về than bùn đã xác định được 5 nhóm hợp chất hữu cơ căn bản sau:

Các hợp chất hữu cơ hòa tan trong nước.

Các hợp chất hữu cơ hòa tan trong ete và rượu.

Cellulose và hemicellulose

Lignin và các chất dẫn xuất từ lignin.

Hợp chất nitơ.

Theo số liệu điều tra của các nhà khoa học, trên thế giới trữ lượng than bùn có

khoảng 300 tỷ tấn, chiếm 1,5% diện tích bề mặt quả đất. Ở Việt Nam, theo tài liệu của

Tổng cục Địa chất (1978), trữ lượng than bùn của U Minh (U Minh thượng và U Minh

hạ) khoảng 300 triệu tấn. Nhưng đến nay trữ lượng than bùn ở đây đã giảm chỉ còn 1/3

do thiên tai và sự khai thác của con người. Ngoài U Minh, một số nơi khác cũng có trữ

lượng than bùn đáng kể như Phong Điền (Thừa Thiên Huế), Hảo Sơn (Phú Yên)…

(Võ Đình Ngộ et al., 1999).

Đứng trên phương diện nông nghiệp thì than bùn ở Việt Nam là một nguồn tài

nguyên rất có giá trị. Từ than bùn người ta có thể sản xuất ra các chất kích thích và

điều hòa tăng trưởng cho cây trồng, cũng như có thể sản xuất ra các loại phân bón hữu

cơ có tác dụng cải tạo đất, tăng độ phì của đất, giảm được tác hại của việc lạm dụng

phân hóa học trong sản xuất nông nghiệp.

Bảng 2.3. Hàm lượng các chất dinh dưỡng trong than bùn ở miền Đông Nam BộChuyên ngành công nghệ sinh học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


% chất dinh dưỡng Địa điểm lấy than bùn

Tây Ninh Củ Chi Mộc Hoá Duyên Hải

N (%) 0,38 0,09 0,16 – 0,91 0,64

P2O5 (%) 0,03 0,1 – 0,3 0,16 0,11

K2O (%) 0,37 0,1 – 0,5 0,31 0,42

pH 3,4 3,5 3,2 2,6

Nguồn: Hồ Thìn, Võ Đình Ngộ – Trung tâm Địa chất học, Phân viện Khoa học Việt Nam, TP. Hồ Chí Minh

Bảng 2.4. Thành phần lý hóa của than bùn Long An

Thành phần

N (%) 0,3 – 4,0

P2O5 (%) 0,047

K2O (%) 0,02

Axit humic (%) 1,4

Carbon tổng số (%) 12,4

pH 3,0 – 4,6

Nguồn: Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

Trong than bùn có axid humic, có tác dụng kích thích tăng trưởng của cây. Hàm

lượng đạm tổng số trong than bùn cao hơn trong phân chuồng gấp 2 – 7 lần, nhưng chủ

yếu ở dưới dạng hữu cơ. Các chất đạm này cần được phân huỷ thành đạm vô cơ cây

mới sử dụng được.

Chế biến than bùn thành các dạng phân bón khác nhau được thực hiện trong các

xưởng. Thông thường quá trình chế biến thông qua các công đoạn sau đây:

Dùng tác động của nhiệt để khử bitumic trong than bùn. Có thể phơi nắng một

thời gian để Ôxy hoá bitumic. Có thể hun nóng than bùn ở nhiệt độ 70oC.

Dùng vi sinh vật phân giải than bùn. Sau đó trộn với phân hoá học NPK, phân vi

lượng, chất kích thích sinh trưởng, tạo thành loại phân hỗn hợp giàu chất dinh dưỡng.



Hiện nay, ở nước ta có nhiều xưởng sản xuất nhiều loại phân hỗn hợp trên cơ sở

than bùn. Trên thị trường có các loại phân hỗn hợp với các tên thương phẩm sau đây:

Biomix (Củ Chi), Biomix (Kiên Giang), Biomix (Plây Cu), Biofer (Bình Dương),

Komix (Thiên Sinh), Komix RS (La Ngà), Compomix (Bình Điền II), phân lân hữu cơ

sinh học sông Gianh và nhiều loại phân lân hữu cơ sinh học ở nhiều tỉnh phía Bắc.

(http://agriviet.com/news_detail804-c21-s25-p0-Phan_huu_co_-_than_bun, _phan_doi, _tro.html)

2.1.6.2. Phân chuồng

Phân chuồng là phân do các loài gia súc gia cầm thải ra. Phân chuồng có thành

phần không ổn định, phụ thuộc nhiều vào loại gia súc, gia cầm, sức khỏe, tuổi cũng

như khẩu phần thức ăn và phương thức nuôi dưỡng.

Bảng 2.5. Thành phần dinh dưỡng của một số loại phân gia súc (%)

Loại phân H2O N P2O5 K2O CaO MgO

Lợn 82.0 0.80 0.41 0.26 0.09 0.10

Trâu bò 83.1 0.29 0.17 1.00 0.35 0.13

Ngựa 75.7 0.44 0.35 0.35 0.15 0.12

Gà 56.0 1.63 1.54 0.85 2.40 0.74

Vịt 56.0 1.00 1.40 0.62 1.70 0.35

Nguồn: Cục Khuyến nông, khuyến lâm (2004)

Trong 10 tấn phân chuồng có thể lấy ra được một số nguyên tố vi lượng như sau:

Bo: 50 – 200g; Mn: 500 – 2000g; Co: 2 – 10g; Cu: 50 – 150g; Zn: 200 – 1000g; Mo: 2

–25g (http://agriviet.com/news).

Phân chuồng có thể được bón trực tiếp nhưng trong phân có thể chứa những vi

sinh vật gây hại hoặc trứng giun sán gây nhiễm cho rau màu và ảnh hưởng trực tiếp

đến người tiêu dùng. Vì vậy, người ta thường xử lý phân chuồng trước khi đưa vào sử

dụng. Có thể thêm vào những tập đoàn vi sinh vật phù hợp để sản xuất phân vi sinh

vừa tăng thành phần dinh dưỡng của phân vừa có thể tiêu diệt được các mầm bệnh.

Theo nghiên cứu của các chuyên gia thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới, phân lợn,

gà sau khi được thải ra sẽ được xử lý ẩm độ, sau đó ủ với chế phẩm BIO-F, chế phẩm

chứa các vi sinh vật đã được phân lập và tuyển chọn gồm: xạ khuẩn Streptomyces sp.,


http://agriviet.com/news_detail804-c21-s25-p0-Phan_huu_co_-_than_bun


nấm mốc Trichoderma sp. và vi khuẩn Bacillus sp. Sau ba ngày, các vi sinh vật hữu

ích nói trên bắt đầu phát triển, phân giải và làm mất mùi phân. Nhiệt độ trong khối ủ

cũng tăng lên tới 60 - 70 oC, tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh và trứng giun, sán trong

phân. Sau 7 - 10 ngày, giai đoạn kết thúc và sản phẩm thu được là phân bón hữu cơ vi

sinh chất lượng cao, có tác dụng phòng chống nấm hại cây trồng.

2.1.6.3. Rác thải hữu cơ

Thành phần của rác thải hữu cơ gồm các dạng protein (thịt, cá, trứng…); tinh

bột (cơm, các loại vỏ củ quả, một số loại hạt…); cellulose (rau các loại, gỗ, lá…); lipit

(mỡ động vật, dừa, xác bã đậu phộng…); lignin…) là môi trường thuận lợi cho nhiều

vi sinh vật phát triển, các vi sinh vật này sử dụng chất hữu cơ làm nguồn cung cấp

năng lượng và đưa chúng trở lại chu trình vật chất, do vậy chất thải sẽ bị phân hủy

nhanh chóng tạo thành phân hữu cơ (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Quy trình xử lí rác thải hữu cơ bằng công nghệ sinh học bắt đầu được ứng dụng

ở nước ta cách đây khoảng hai thập kỉ. Tuy nhiên, chỉ đến mấy năm gần đây, công

nghệ này mới thật sự được chú trọng. Nhờ sự đầu tư của nhà nước kết hợp với những

dự án đầu tư, sự giúp đỡ của một số nước như: Đức, Hà Lan, Đan Mạch… Chúng ta đã

xây dựng được một số nhà máy chuyên sản xuất phân vi sinh và khí sinh học từ rác

như: Nhà máy Xử lí rác Thanh Trì, Nhà máy Xử lí rác Cầu Diễn, Nhà máy Xử lí rác

Hoóc Môn... Sản phẩm của các nhà máy này bắt đầu được bán ra thị trường, như Nhà

máy Xử lí rác Hóc Môn (Thành phố Hồ Chí Minh) mỗi năm xuất xưởng khoảng

25.000 tấn phân hữu cơ; Xí nghiệp Xử lí rác Cầu Diễn mỗi năm cũng xuất xưởng được

khoảng 7.500 tấn (http://congnghemoi.com.vn).

Trong nước cũng có nhiều đề tài nghiên cứu, xử lý rác thải hữu cơ làm phân vi

sinh từ nhiều năm qua. Gần đây, có đề tài nghiên cứu của PGs.Ts. Đào Châu Thu, Ts.

Nguyễn Ích Tân cùng cộng sự thuộc Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp

bền vững (TTNC & PTNNBV - Trường Đại học Nông nghiệp I) hợp tác với Khoa

Sinh học và Kinh tế Nông nghiệp, Đại học Udine (Italia) mang tên “Sản xuất phân hữu

cơ từ rác thải hữu cơ sinh hoạt và phế thải nông nghiệp để dùng làm phân bón cho rau

sạch vùng ngoại ô thành phố”. TTNC & PTNNBV tiến hành xây dựng quy định sản

xuất phân hữu cơ từ rác thải và phế phẩm vi sinh vật tại trường. Cho tới nay, Trung

tâm đã xây dựng hoàn thiện nhà ở và thiết bị xử lý, ủ phân, chế biến phân hữu cơ bằng



công nghệ vi sinh và ứng dụng được ba chế phẩm vi sinh vật cho quá trình ủ phân.

Xây dựng được một báo cáo tổng quan về công tác tuyên truyền, giáo dục, quy trình

thu gom, phân loại, xử lý các rác thải sinh hoạt hữu cơ thành phân vi sinh và thử

nghiệm trước tại trường Đại học Nông nghiệp I. Kết quả chương trình đã sản xuất

được 2,8 tấn phân vi sinh từ rác thải hữu cơ - đã được kiểm tra chất lượng, đóng gói

bao bì và mang đi tiêu thụ (Khoa học và đời sống, số 89(1702), ngày 5/11/2004, tr.5).

2.1.6.4. Xác bã cà phê

Công trình nghiên cứu của nhóm Phan Thị Thanh Hoài, Đặng Ngọc Huê,

Nguyễn Nữ Quỳnh Giang, Ngô Nữ Quỳnh Như và Nguyễn Bá Dũng (Đại Học Tây

Nguyên) đạt giải nhất cuộc thi “Phát minh xanh Sony 2004” với đề tài “Nghiên cứu

ứng dụng công nghệ sinh học trong xử lý phế thải chế biến ướt cà phê” cho thấy vỏ cà

phê sau khi được các nhà máy sản xuất cà phê thải ra có thể làm phân vi sinh bằng

phương pháp ủ và phối trộn thích hợp.

Theo kết quả phân tích của nhóm nghiên cứu này thì thành phần hóa học của vỏ

cà phê có hàm lượng đường rất cao (14,4%), trong đó đường khử chiếm tới 12,4%,

hàm lượng protein (10,1%). Lượng hữu cơ trong đó cũng rất cao, hàm lượng cellulose

trong vỏ cà phê là 63,2% và lignin là 17,7% - hai thành phần nếu được phân hủy sẽ tạo

mùn. Ngoài ra, còn có hàm lượng protein là 11,2% cùng các loại khoáng vi lượng

khác... Đó quả là nguồn nguyên liệu lý tưởng để làm ra phân vi sinh có hàm lượng hữu

cơ cao, dinh dưỡng khoáng đầy đủ và cân đối.

(http://vietnamnet.vn/khoahoc/trongnuoc/2004/12/359969/)

2.2. Một số chỉ tiêu quan trọng trong việc khảo sát chất lượng bã bùn mía

2.2.1. Độ ẩm

Ảnh hưởng đến khả năng sống sót của các vi sinh vật. Độ ẩm cao hoặc thấp quá

đều có thể gây bất lợi cho các vi sinh vật. Ngoài ra, độ ẩm còn ảnh hưởng tới mức độ

bám dính, độ bền của viên phân khi thành phẩm.


http://vietnamnet.vn/khoahoc/trongnuoc/2004/12/359969/


2.2.2. pH

pH = -lg aH+, là đại lượng biểu thị hoạt độ H+ trong môi trường. Đó là chỉ tiêu

đơn giản đầu tiên về độ chua thường được xác định nhất, nó có ý nghĩa rất lớn trong

việc đánh giá tính chất của bã bùn mía.

2.2.3. Hàm lượng nitơ

Vi sinh vật sử dụng carbon như nguồn năng lượng cần thiết, chúng còn cần nitơ

để tổng hợp protein cho tế bào của chúng. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh

vật là NH3 và NH4+ . Muối nitrat (NO3

-) là nguồn thức ăn nitơ thích hợp đối với nhiều

loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp đối với nhiều loài nấm men và vi

khuẩn (Nguyễn Lân Dũng et al., 2008).

Mỗi loài vi sinh vật có nhu cầu về nitơ nhất định. Lượng nitơ cần thiết này được

tính theo tỉ lệ C/N. Vi khuẩn cần 0,4 – 0,8 %N (tỉ số C/N thích hợp là 10 – 20), xạ

khuẩn cần 1,2 – 2,4 (C/N = 15 – 25) và nấm cần từ 1,2 – 1,6 %N (C/N = 25 – 33)

(Phạm Văn Kim, 2000).

2.2.4. Lượng chất hữu cơ

Thuật ngữ “chất hữu cơ” bao gồm toàn bộ phần không phải khoáng của cơ chất

(đất, phân hữu cơ…) và một ít xác động thực vật ở trong đó (Viện Thổ nhưỡng Nông

hóa, 1998).

Chất hữu cơ là một chỉ tiêu quan trọng. Đó là nguồn cung cấp trực tiếp nhiều

dinh dưỡng cho cây trồng và các vi sinh vật như: C, N, P, K, Ca, Mg…

2.2.5. Lượng lân hòa tan

Photpho (P) bao giờ cũng chiếm tỉ lệ cao nhất trong các nguyên tố khoáng của

tế bào vi sinh vật (nhiều khi P chiếm đến 50% so với tổng số chất khoáng). P có mặt

trong cấu tạo của nhiều thành phần quan trọng của tế bào (axit nucleic,

photphoprotein, photpholipit, nhiều coenzim quan trọng như ADP, ATP, UDP, NAD,

NADP, flavin…; một số vitamin như tiamin, biotin…). (Nguyễn Lân Dũng et al.,

2008)



2.2.6. Kali, canxi và magie

Kali (K) là nguyên tố chiếm một tỷ lệ khá cao trong thành phần khoáng của tế

bào vi sinh vật. Người ta nhận thấy kali thường tồn tại trong dạng ion K+ ở ngoài cấu

trúc tế bào. Kali làm tăng độ ngậm nước của các hệ thống keo do đó ảnh hưởng đến

các quá trình trao đổi chất, nhất là các quá trình tổng hợp. Kali có thể còn tham gia vào

quá trình tổng hợp một số vitamin (như tiamin…) và có những ảnh hưởng đáng kể đến

quá trình hô hấp của tế bào vi sinh vật (Lê Xuân Phương, 2005).

Canxi (Ca) mặc dầu là nguyên tố ít tham gia vào việc xây dựng nên các hợp

chất hữu cơ nhưng nó có vai trò đáng kể trong việc xây dựng các cấu trúc tinh vi của tế

bào. Canxi đóng vai trò là cầu nối trung gian của nhiều thành phần quan trọng trong tế

bào (DNA với protein trong nhân, nucleocid này với nucleocid khác, RNA với protein

trong ribosom…)

Là nguyên tố được vi sinh vật đòi hỏi cũng với lượng khá cao (10 -3 – 10-4 M).

Magie (Mg) mang tính chất một cofactor, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzyme

có liên quan đến các quá trình photphoryl hóa. Mg2+ có thể làm hoạt hóa các

hexokinaza, ATPaza, các men trao đổi protein, các men oxi hóa khử của chu trình

Krebs… Hàm lượng kali tổng số phụ thuộc vào nguồn gốc phát sinh. Khoáng vật chủ

yếu chứa kali ở dạng alumino silicat và nhiều nhất là fenpat. Trong đất, canxi có phổ

biến ở các dạng carbonat, photphat, silicat, florua và sunfat. Nguồn quan trọng nhất là

carbonat, kế đó là photphat và sunfat. Magie có trong các khoáng sét thường gặp như

mica, vecmiculit, clorit và đôi khi tìm thấy ở dạng carbonat. Cùng với canxi, magie có

ý nghĩa về lý hóa tính của đất và dinh dưỡng của cây trồng (Nguyễn Lân Dũng et al.,

2008).

2.3. Quá trình cố định đạm của các vi sinh vật tham gia cố định đạm.

2.3.1. Quá trình cố định đạm (quá trình cố định nitơ phân tử)

Quá trình cố định nitơ phân tử (N) là quá trình đồng hóa nitơ của không khí

thành đạm amon dưới tác dụng của một số vi sinh vật có hoạt tính nitrogenase. Nguồn

nitơ dự trữ nhiều nhất trong tự nhiên là nguồn khí nitơ tự do (N2) trong khí quyển.

Chúng chiếm tỉ lệ rất cao trong không khí (78%) (Dobereiner, 1987). Số lượng nitơ

trong lớp khí quyển bên trên mỗi hecta đất tới 85.000 tấn, còn tổng số nitơ trong cả khí



quyển tới 4.1015 tấn. Trong khí nitơ, hai nguyên tử nitơ liên kết với nhau bằng 3 liên

kết rất bền vững. Năng lượng của 3 liên kết này cao tới 225kcal/M. Chính vì vậy mà

N2 rất khó kết hợp với nguyên tố khác và nitơ có nhiều xung quanh ta nhưng cả người,

động vật lẫn cây trồng đều luôn thiếu thốn nitơ. Muốn phá vỡ 3 liên kết này, người ta

cần phải sử dụng những năng lượng rất lớn. Chẳng hạn ở nhà máy phân đạm hóa học,

muốn làm cho nitơ liên kết được với hidro để tạo thành NH3 người ta phải dùng một

nhiệt độ là 500oC và một áp suất cao tới 350 atm (Nguyễn Lân Dũng et al., 2008).

Trong khi đó vi sinh vật dưới sự trợ giúp của nitrogenase có thể phá vỡ 3 liên

kết của phân tử nitơ một cách dễ dàng ngay trong điều kiện bình thường về nhiệt độ và

áp suất. Có thể nói quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử N2 thành NH3 có xúc

tác của nitrogenase và sự có mặt của ATP.

2.3.2. Các vi sinh vật tham gia quá trình cố định đạm

Vi sinh vật cố định đạm cộng sinh

Các vi khuẩn cố định nitơ bằng cộng sinh được gọi chung là Rhizobium (số

nhiều: Rhizobia), chúng thuộc bộ Rhizobiales, bao gồm 12 chi và 57 loài. Có 5 chi

quan trọng trong nông nghiệp nhờ đặc tính cộng sinh trên cây (Phạm Văn Kim, 2000):

Rhizobium (họ Rhizobiaceae): Các loài quan trọng gồm R. arachis (cộng sinh

trên đậu phọng); R. etli (cộng sinh trên các loại đậu); R. gallicum (cộng sinh trên các

loại đậu); R. hainanense (cộng sinh trên các loài đậu nhiệt đới); R. huautlense (cộng

sinh trên điền thanh); R. indigoferae (cộng sinh trên cây chàm indigo); R.

leguminosarum (cộng sinh trên các loại đậu); R. phaseoli (cộng sinh trên các loại đậu

ve, đậu xanh); R. tropici (Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli).

Bradyrhizobium (họ Bradyrhizobiaceae): Các loài quan trọng gồm B. betae

(cộng sinh trên củ cải đường); B. canariense (cộng sinh trên các cây họ đậu, chịu được

đất chua); B. japonicum (cộng sinh trên đậu nành); B. lupine (cộng sinh trên đậu

lupin).

Mesorhizobium (họ Phyllobacteriaceae): Các loài quan trọng gồm M. huakuii, M.

septentrionale và M. temperatum (cộng sinh trên các loại đậu đồng cỏ); M. loti (cộng

sinh trên sen); M. amorphae, M. mediterraneum và M. tianshanense (cộng sinh trên

đậu chickpea); M. plurifarium (cộng sinh trên các loài keo).



Sinorhizobium (họ Rhizobiaceae): Các loài quan trọng gồm S. abri (cộng sinh

trên các loại đậu nhiệt đới, điên điển); S. americanus và S. terangae (cộng sinh trên

các loài keo); S. aroris (cộng sinh trên các loại đậu của Phi châu); S. medicae và S.

meliloti (cộng sinh trên cỏ alfalfa); S. saheli (cộng sinh trên thân điên điển, điền

thanh); S. xinjiangense (cộng sinh trên các loại đậu ở Trung Quốc).

Azorhizobium (họ Hyphomicrobiaceae): Các loài quan trọng gồm A. caulinodans

(cộng sinh trên rễ và thân điền thanh, điên điển); A. johannae (cộng sinh trên đậu, điền

thanh, điên điển).

Vi sinh vật cố định đạm không cộng sinh

Vi khuẩn Azospirillum là một loại vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong rễ,

vùng đất quanh rễ, thân và lá cây. Chúng sống trong đất hay cộng sinh với rễ của các

loại ngũ cốc, cỏ và cây có củ. Đây là loài vi khuẩn được nghiên cứu và ứng dụng nhiều

vì ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng

như IAA (Indole-3-acetic acid), IBA (Indole-3-butyric acid), ABA (Abscisic acid) và

cytokynins (Bashan và Levanony, 1990). Những thí nghiệm ở Mỹ cho thấy

Azospirillum có thể thay thế được 40kg N/ha/năm (Smith et al., 1978). Ở Brazil,

Azospirillum lipoferum có thể cung cấp cho bắp 2kg nitơ mỗi ngày. Ở Thái Lan, những

thí nghiệm trên bắp năm 1984 – 1985 cho thấy sản lượng bắp tăng 15 – 35% (Vasuvat

et al., 1986)… Ở Việt Nam, thí nghiệm của Nguyễn Thị Phương Tâm (2006) ở Cù Lao

Dung, Sóc Trăng cũng cho thấy dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum HA28 làm tăng

năng suất 6,6 lần so với đối chứng không bón đạm, không chủng vi khuẩn.

Vi khuẩn Azotobacter. Năm 1901, Beyjeirinh đã phân lập được từ đất một loài vi

sinh vật có khả năng cố định nitơ phân tử cao, ông đặt tên cho loài này là Azotobacter.

Vi khuẩn Beijerinskii. Nhà bác học Ấn Độ Stacke (1893) đã phân lập được một

loài vi khuẩn ở ruộng lúa nước pH rất chua có khả năng cố định nitơ phân tử và ông

đặt tên là vi khuẩn Beijerinskii.

Vi khuẩn Clostridium. Loài vi khuẩn này được Vinogratxkii (1939) phân lập đầu

tiên (Lê Xuân Phương, 2005).

Ngoài các vi khuẩn trên, chúng ta còn có rất nhiều loài có khả năng cố định nitơ

phân tử sống tự do như:



+ Xạ khuẩn: Một số loài thuộc giống Streptomyces, Actinomyces, Frankia,

Nocardia, Actinopolyspora, Actinosynoema…

+ Các vi khuẩn quang tổng hợp: Chromatium, Rhodomicrobium,

Rhodopseudomonas, Rhodospirillum..

+ Các tảo lam: Anabaena, Anabaenapsis, Calothris, Nostoc, Tolvcothrix…

(Phạm Văn Kim, 2000).

2.5. Giới thiệu về PVP (polyvinyl Pyrrolidone).

PVP (1-Vinyl-2-pyrrolidinon-Polymere) có công thức phân tử (C6H9NO)n; khối lượng

phân tử từ 2.500 - 2.5000.000 g·mol−1, màu sắc trắng hoặc vàng nhạt, khối lượng riêng

1.2g/cm3, nhiệt độ nóng chảy 110 - 180 °C (theo Wikipedia).

Là một polymer tan trong nước và trong các dung môi hữu cơ phân cực như:

alcolhol, acid, amide,lactam, amine, chlorinate hydrocarbon.

(http://www.greatvistachemicals.com/industrial_and_specialty_chemicals/

polyvinylpyrrolidone.html(22/12/09).

Trong dung dịch nó hình thành một màng mỏng. Lớp màng này tạo một lớp áo

tốt giúp cho vi khuẩn có khả năng sống ở dạng tiềm sinh. Nó có tính hút ẩm, tạo màng

và khả năng tương thích sinh học tốt. PVP được tạo thành từ các đơn phân n-vinyl

pyrrolidone. Những đơn phân này là những carcinogenic và là chất cực độc trong môi

trường sống nhưng polymer của nó thì lại rất an toàn.


Hình 2.1: Công thức hóa học của PVPNguồn: Wikipedia

n


PVP lần đầu tiên được tổng hợp bởi Gs. Walter Reppe và một bằng sáng chế đã

được nộp vào năm 1939 với một trong các dẫn xuất thú vị nhất của hóa học axetylen.

PVP bước đầu đã được sử dụng như một chất thay thế huyết tương và sau này trong

nhiều ứng dụng trong y học, dược phẩm, mỹ phẩm và sản xuất công nghiệp.

Công dụng:

PVP cũng được sử dụng trong nhiều ứng dụng kỹ thuật:

Mỹ phẩm:

PVP-K30 được sử dụng như là một chất tạo màng, tăng độ nhớt...Nó là

thành phần chính trong các sản phẩm chăm sóc tóc, da, mắt, son môi, kem

chống nắng, dầu thơm...

Dược phẩm:

Povidone k30 là một dược liệu mới tuyệt vời. Nó là một tá dược trong

hàng trăm loại thuốc. Nó có khả năng kết dính thuốc, hỗ trợ hòa tan cho tiêm...

Ứng dụng khác:

PVP K30 còn là chất phụ gia trong nghành sơn, phủ, nhựa, sợi thủy tinh,

phim, mực in, vỏ bao thuốc con nhộng, áo bên ngoài tấm hình, trong chế biến

thực phẩm có vai trò như chất ổn định.

2.6. Giới thiệu về vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus

2.6.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus.

Loài vi khuẩn này tình cờ được phát hiện lần đầu tiên trên cây mía. Vào năm

1988, Cavalcante và Dobereiner đã báo cáo về một loài vi khuẩn cố định đạm chịu

được acid, sống nội sinh trong cây mía và gọi đó là vi khuẩn Acetobacter

diazotrophicus. Vi khuẩn này có khả năng cung cấp gần 50% tổng lượng đạm mà cây

sử dụng. Khi dựa vào trình tự của 16rARN của vi khuẩn để phân tích Acetobacter

diazotrophicus được đổi tên lại thành Gluconacetobacter diazotrophicus (Yamada et

al., 1998). Gluconacetobacter diazotrophicus là vi khuẩn sống nội sinh trong mía, củ

cải đường, khoai lang, cà phê, chuối,…(Muthukumarasamy et al., 2002).

2.6.2. Hình dạng và kích thước



Gluconacetobacter diazotrophicus là vi

khuẩn Gram âm, chịu được acid, hiếu khí

bắt buộc, tế bào có hình que thẳng, có kích

thước bề rộng từ 0.7 – 0.9 m và chiều dài

từ 1 - 2 m . Tế bào của chúng có thể được

quan sát dưới kính hiển vi ở dạng đơn,

dạng cặp, hay dạng cấu trúc hình chuỗi.

nhưng không có nội bào tử.

2.6.3. Dinh dưỡng - tăng trưởng.

Vi khuẩn này có thể phát triển trong môi trường có nồng độ đường cao (10%)

và ở pH rất thấp (pH=3.0) và có khả năng cố định nitơ trong điều kiện vi hiếu khí.

Nguồn carbon cung cấp là điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là ở nồng

độ 10%, tuy nhiên vi khuẩn này có thể phát triển tốt ở nồng độ đường 30%. Nguồn

sucrose không thể được vận chuyển hay hô hấp bởi G. diazotrophicus, nó sinh trưởng

bởi sự tiết ra các enzmye ngoại bào, levansucrase - enzyme này có thể cắt sucrose

thành fructose và glucose. Một vài nguồn dinh dưỡng tốt khác chứa gluconate,

glucose, fructose, mannitol, arabinose, meso-inositol, sorbitol, glycerol, galactose,

jaggery và sodium gluconate. Một số aminoacid như Glutamate, serine, alanine và

histidine cũng có thể được sử dụng như nguồn carbon và N cho sự phát triển của

G.diazotrophicus. Tuy nhiên, cellobiose, tinh bột, meso-erythritol và methanol (1%)

thì không thích hợp cho sự phát triển của chúng. Không có acid hữu cơ phổ biến nào

như acid succinate hay dicarboxylic khác hỗ trợ cho sự phát triển của chúng trừ acid 2-

keto gluconic hiện diện trong thân cây mía. Theo báo cáo gần đây, vi khuẩn tận dụng

nó như nguồn carbon để cung cấp cho quá trình cố định N. pH tối ưu cho sự phát triển

là pH=5.5. G. diazotrophicus là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, vì thế oxy là phương tiện

để sản sinh ra một lượng lớn ATP cung cấp cho quá trình cố định đạm. Sự oxi hóa

ngoại bào gluconate đóng một vai trò quan trọng trong bước đầu chuyển hóa glucose

bởi G. diazotrophicus. Pyrroloquinoline quinone (PQQ) liên kết với gluconase

dehyrogenase mang lại sự chuyển hóa glucose thành gluconate. Theo Mería F. Luna et


Hình 2.2: G.diazotrophicusNguồn: sugarcane-breeding.tn.nic.inagronomy.htm

(Nguồn: sugarcane-breeding.tn.nic.inagronomy.htm


al.,(2002), sinh khối của G. diazotrophicus sẽ dưới 30% trong điều kiện cố định N, và

trên 30% trong điều kiện không cố định N khi gluconate được sử dụng như nguồn

carbon.

2.6.4. Phân tích bộ gen của G. diazotrophicus

Trật tự sắp xếp của gen nif và các gene liên kết với nhiễm sắc thể (hoặc

plasmid) có sự khác biệt rất lớn giữa các chủng của vi sinh vật cố định đạm. Dựa vào

phân tích trình tự 16s rDNA người ta thấy nhóm Gluconacetobacter có chứa những

loài Rhodopila, Acidomonas, Acidiphilium và Gluconabacter. Theo một báo cáo gần

đây của Sevilla et al.,1998, sự giống nhau giữa gen nif HDK của G. diazotrophicus

với các loài vi khuẩn cố định đạm khác. Sự giống nhau khoảng 91% về gen nifH (R.

leguminosarum bv. phaseoli), 89% nifD (Herbaspirillum seropedicae vaf Azospirillum

brasilense, 76% nif K (Bradyrhizobium japonicum (Franke et al.,1998).

Sự đa dạng của diazotrophic bacteria được phân lập từ rễ, vùng đất quanh rễ

(Beijerinckia), củ ( Azospirillum, Bacillus, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia), của cây

mía.

Bảng2.6: Nguồn gốc của các chủng vi khuẩn G. diazotrophicus.

Nguồn Phần

Mía Rễ, lông hút, thân, lá

Cỏ Cameroon Rễ, thân

Khoai lang Rễ, thân mầm

Cà phê Rễ, vùng rễ, thân

Ragi Rễ, vùng rễ, thân

Chè (trà) Rễ

Khóm Trái

Xoài Trái

Chuối Vùng rễ

Một vài loài côn trùng khác Môi trường ngoài

Nguồn: CURRENT SCIENCE, VOL.83, NO.2,25 JULY 2002



PHẦN III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Địa điểm nghiên cứu.

Phòng vi sinh vật đất- Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học- Trường Đại

học Cần Thơ.

3.2. Thời gian nghiên cứu.

Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2009- tháng 1/2010.

3.3. Phương tiện nghiên cứu.

3.3.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu.

Chất mang: bã bùn mía (do nhà máy Mía đường Vị Thanh – Hậu Giang cung

cấp).

Vi khuẩn: Gluconacetobacter diazotrophicus do Viện Nghiên Cứu và Phát

Triển Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại học Cần Thơ cung cấp.

3.3.2. Thiết bị và hóa chất.

3.3.2.1.Thiết bị

Máy ép viên, máy ép bọc.

Cân điện tử, cân đồng hồ.

pH kế.

Tủ sấy, tủ ủ, nồi khử trùng, máy lắc.

Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri.

Pipet, Micropipet.

Tủ cấy.

Máy vortex.

3.3.2.2. Hóa chất

Đường cát (sucrose), Bromothymol blue, Acid acetic, yeast extract, agar, khoáng

LGI, Fecl3, Chất bảo quản PVP(polyvinyl pyrrolidone).



3.3.2.3. Môi trường nuôi vi khuẩn.

Các hóa chất thích hợp để pha môi trường nhân nuôi vi khuẩn

Gluconacetobacter diazotrophicus (Cavancante và Dobereiner, 1988) có bổ sung

đạm (V = 100ml):

- K2HPO4 2g

- KH2PO4 6g

- MgSO4.7H2O 2g

- CaCl2.7H2O 0,2g

- Na2MoO4.2H2O 0,02g

- FeCl2.6H2O 0,1g

- Bromothymol blue 0,5% 5ml

- Sucrose 100g

- KNO3 1g

- Thêm nước cất vào vừa đủ 1000ml.

- Bổ sung 20g agar nếu là môi trường thạch để đếm mật số.

- Dùng acid citric chỉnh pH = 4,5 – 5,5

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Sản xuất phân vi sinh dạng viên

3.4.1.1.Xử lý bã bùn mía

Bã bùn mía được phơi khô đến độ ẩm

thích hợp (khoảng 40 – 50%).


Hình 3.1: Bã bùn mía được ép thành viên phân


Dùng máy ép đùn để ép bã bùn mía từ dạng bột thô sang dạng viên khô. Bã bùn mía

sau khi được phơi tới ẩm độ thích hợp và được trộn với PVP theo tỉ lệ 0% và 1% tùy

theo nghiệm thức, sau đó bắt đầu tiến hành ép viên. Sau khi ép viên phân phối khối

lượng vào các nghiệm thức rồi sau đó bổ sung vi khuẩn.

3.4.1.2. Nhân nuôi vi khuẩn

Nuôi giống cấp một dòng vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus.

Trước tiên vi khuẩn được nuôi trong bình tam giác chứa 100ml môi trường lỏng, ủ

hiếu khí ở nhiệt độ thích hợp (có lắc). Sau đó nhân số lượng vi khuẩn trong một đơn vị

thể tích lớn hơn (thể tích cần dùng) bằng cách lấy mẫu vi khuẩn từ bình tam giác đã

nuôi, phần còn lại được trữ trong tủ lạnh. Tiếp tục ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

để đạt được mật số vi khuẩn cần thiết (109 tế bào/ ml). Thời điểm bổ sung PVP vào

dịch vi khuẩn khi bắt đầu tiến hành chủng vi khuẩn vào chất mang.

3.4.1.3. Chủng vi khuẩn vào chất mang

Viên phân sau khi được định hình, tiến hành chủng vi khuẩn vào bọc và hàn kín

miệng bao bì lại. Vi khuẩn được chủng vào chất mang (viên phân được ép từ bã bùn

mía) theo tỉ lệ 2:1 (ví dụ với 1kg chất mang : 0,5 lít vi khuẩn hoặc 0,5kg chất mang :

250 ml vi khuẩn). Bảo quản sản phẩm nơi khô thoáng và tránh ánh nắng trực tiếp.

Phương pháp chủng

Chất mang dạng viên (cân chính xác 50g) được cho vào túi nilong (bịch nhỏ) vô

trùng. Cho 25ml dung dịch vi khuẩn đã chuẩn bị sẵn ứng với từng nghiệm thức. Hàn

kín các túi lại, lắc đều cho dịch vi khuẩn thấm đều các viên phân và để trong một túi

lớn hơn có màu tối. Tỉ lệ chủng là chất mang: vi khuẩn = 2:1.

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí với 8 nghiệm thức độc lập với hai nồng độ đường

sucrose là 10% và 30%/lit dịch vi khuẩn và sự hiện diện của chất bảo quản PVP

(polivinyl pyrrolidone) với hai nồng độ 0% và 1% trong mỗi nghiệm thức, mỗi thí

nghiệm đựơc lặp lại 3 lần.



Bảng 3.1: Bố trí các nghiệm thức

Nồng độ đường Tên nghiệm thứcDịch vi khuẩn

bổ sungPVP(%)

Bã bùn mía bổ

sungPVP(%)

10% sucrose

1A 0 0

2A 1 0

3A 0 1

4A 1 1

30% sucrose

1B 0 0

2B 1 0

3B 0 1

4B 1 1

3.4.2. Khảo sát khả năng sống sót của vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus

trong chất mang

Đếm mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt. Phương pháp này

nhằm xác định số tế bào vi khuẩn còn sống trong sản phẩm cho đến lúc khảo sát.

Phương pháp này có ưu điểm là có số lần lặp lại cao (5 giọt) và khảo sát trên cùng 1

đĩa petri nhiều nồng độ pha loãng, nên cho kết quả tương đối chính xác.

Đếm mật số của vi khuẩn mỗi tuần, tiến hành liên tục trong 6 tháng.

Chuẩn bị mẫu đếm

8 (nghiệm thức) x 1 bịch = 8 bịch (1 bịch có 300g chất mang + 150ml dịch vi

khuẩn)

Bịch chất mang sau khi chủng vi khuẩn được hàn kín miệng, chỉ mở ra khi lấy mẫu và

được bảo quản ở nơi thoáng mát và tránh ánh sáng trực tiếp của mặt trời.

Cách pha loãng:

Cân 1g/túi cho vào bình tam giác chứa 100ml nước cất đã khử trùng và đặt lên

máy lắc với vận tốc 200 vòng/phút trong thời gian 30 phút. Sau đó tiến hành pha loãng

từ 102 đến 109 lần. Đặt bình vào máy trộn trong 2 đến 5 phút sao cho có được một



dung dịch có phân bố đồng đều, để lắng các phân tử nặng trong khoảng 15 phút, gạn

được dung dịch huyền phù ban đầu.

+ Dùng một pipet đã vô trùng lấy 1 ml dịch huyền phù ban đầu (a hoặc b) cho

vào ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn ở nhiệt độ phòng, tránh

chạm pipet vào dịch pha loãng. Trộn kỹ bằng cách hút - thả khoảng 10 lần với một

pipet khác có nút bông ở đầu hút đã vô trùng, để có dịch pha loãng mẫu có nồng độ là

10-2 . Quá trình này được lặp lại liên tục để có dịch mẫu có nồng độ pha loãng theo quy

định của TCVN đối với phân vi sinh vật trên nền chất mang không thanh trùng (sử

dụng nồng độ pha loãng là 10-5 trở lên)

- Cách đếm :

Ở mỗi nồng độ pha loãng hút 10

microlit cho phát triển trên đĩa petri chứa

môi trường nuôi (5 lần lặp lại tại 5 vị trí đã

đánh dấu trước mặt dưới đĩa). Đếm số

khuẩn lạc xuất hiện tại mỗi vị trí đã đánh

dấu. Dựa trên nguyên tắc mỗi khuẩn lạc

phát triển từ một tế bào vi khuẩn, từ đó suy

ra mật số vi khuẩn sống trong1g chất khô

của sản phẩm trong thời gian khảo sát

- Cách tính mật số:


Hình 3.3: Phương pháp đếm sống nhỏ giọt

9ml H2O

9ml H2O

9ml H2O

9ml H2O

9ml H2O

100ml H2O

1g mẫu1ml 1ml1ml 1ml1ml

10-2 10-3 10-5 10-6 10-710-4

Hình 3.2: Cách pha loãng


B =

Trong đó:

B: số lượng tế bào vi khuẩn/gam chất mang

A: số khuẩn lạc trung bình ở độ pha loãng tốt nhất

DF: Độ pha loãng

W: Trọng lượng khô của mỗi gam chất mang.

3.4.2. Xử lý số liệu .

Sử dụng phần mềm Excel để xử lý số liệu, phân tích ANOVA, tính trị số trung

bình, sử dụng LSD.01 hay kiểm định Duncan để so sánh trị số trung bình có ý nghĩa ở

mức độ 1%.

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN



5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20

Thời điểm

Mật

số

vk(L

og/g

chấ

t khô

)

Đường biểu diễn sự sống sót của G. diazotrophicus trên cho thấy mật số vi

khuẩn giảm rõ rệt theo thời gian từ tuần thứ nhất (T1) tới tuần 5 (T5). Điều này được

giải thích do lúc mới chủng vi khuẩn thì vi khuẩn phải mất giai đoạn làm quen với môi

trường mới nên mật số giảm đi rõ rệt. Đến T5, T6, T7 vi khuẩn đã làm quen với môi

trường và bắt đầu ổn định mật số. Mặt khác lượng thức ăn (đường sucrose) cũng giảm

dần theo thời gian nên các vi khuẩn phải cạnh tranh nhau về thức ăn để tồn tại và

lượng chất bài tiết của chúng ra môi trường bên ngoài gia tăng nên mật số vi khuẩn từ

T8 đến T12 giảm đi rất nhiều (< 106 CFU/g chất mang). Tới T13 bắt đầu bổ sung vi

khuẩn vào sản phẩm thì mật số tăng lên rõ rệt, nhưng sau đó lại giảm đi nhanh chóng

vì lúc này lượng vi khuẩn được bổ sung vào nhưng nguồn dinh dưỡng lại ngày càng

nghèo đi nên mật số giảm đi nhanh chóng tới T20 (tuần 25) chỉ còn 5.2. Điều này cho

thấy vi khuẩn Gluconacetorbacter diazotrophicus là vi khuẩn nội sinh bắt buộc, chúng

chỉ có thể tồn tại và phát triển tốt trong điều kiện nội sinh tức là trong thân của cây

trồng như mía, khoai lang, củ cải đường (Muthukumarasamy et al., 2002) …, có thể

ngoài lượng đường cần cung cấp thì còn cần thêm một số chất khác mà chỉ cây chủ

mới có khả năng đáp ứng nên khi sống trong môi trường mới thì chỉ tồn tại được trong

thời gian ngắn. Bên cạnh đó, vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus là loài ưa

acid. Khoảng pH mà nó có thể chịu được từ 2,5 – 7,0 và pH tối ưu là 5,5. Nhưng pH

của bã bùn mía là trung tính (pH 6,9) vì vậy đây không phải là điều kiện thích hợp cho


Hình 4.1: Sự sống sót của G. diazotrophicus theo thời gian

LSD.01=0.165T : Thời điểm lấy mẫu


vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus sinh trưởng và phát triển tốt. Ngoài ra,

bên cạnh nguồn thức ăn được cung cấp trong dịch vi khuẩn lúc đầu thì nguồn thức ăn

có sẵn trong bã bùn mía cũng là một yếu tố quan trọng. Lượng đường tối ưu cho vi

khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus phát triển tốt là 10% và chúng có thể sống

trong điều kiện môi trường có đường đến 30%. Nhưng theo Lê Quang Vinh (2008) thì

lượng đường trong bã bùn mía chỉ có khoảng 0,5 – 1%. Với lượng đường ít như thế thì

bã bùn mía không thể bổ sung thêm nguồn carbon cho vi khuẩn Gluconacetobacter

diazotrophicus. Ngoài ra sự cạnh tranh dinh dưỡng của các vi khuẩn hoang dại trong

bã bùn mía cũng là một nguyên nhân khác dẫn tới sự giảm mật số của vi khuẩn

Gluconacetobacter diazotrophicus khi ở trong sản phẩm. Như vậy, khi vi khuẩn này

sống trong môi trường bên ngoài thì mật số sẽ giảm nhanh chóng nên cần bổ sung vi

khuẩn vào thời điểm tuần thứ 13.

So sánh giữa hai khối nghiệm thức A và B cho thấy, ở giai đoạn đầu từ tuần 1

tới tuần 6 mật số vi khuẩn ở khối nghiệm thức A giảm đi nhanh hơn so với mật số vi

khuẩn ở khối nghiệm thức B. Nguyên nhân do nguồn dinh dưỡng có trong bã bùn mía

và nguồn dinh dưỡng bổ sung vào dưới dạng đường Sucrose ở nghiệm thức B nhiều

gấp 3 lần so với các nghiệm thức A nên khối nghiệm thức B duy trì mật số tốt hơn ở

khối nghiệm thức A. Nhưng sau đó mật số tiếp tục giảm mạnh cho tới tuần thứ 12 do

lúc này chất dinh dưỡng trong bã bùn mía giảm và sự cạnh tranh dinh dưỡng giữa các

loài vi khuẩn hoang dại càng trở nên gay gắt hơn về dinh dưỡng, đồng thời có sự biến

đổi sinh hóa tạo ra các chất ức chế vi khuẩn phát triển ở nghiệm thức B nhiều hơn

nghiệm thức A. Tới tuần thứ 13 (T13) bắt đầu bổ sung vi khuẩn vào cả hai khối

nghiệm thức thì ở Nghiệm thức B giảm đi nhanh hơn rất nhiều. Tới thời điểm T20

(tuần 25) thì mật số vi khuẩn (log(số tế bào/g chất khô) ở nghiệm thức 1B chỉ còn

bằng 4.5 trong khi đó ở nghiệm thức 1A là 5.3.

Các nghiệm thức có bổ sung PVP nhưng vẫn không có sự khác biệt so với

nghiệm thức đối chứng 1A và 1B ở mức ý nghĩa 1%.



Nghiệm Thức A

4

5

6

7

8

9


Tuần

Mật

số

vk (

log/

g ch

ất k

hô)

1A 2A 3A 4A

Nghiệm Thức B

4

5

6

7

8

9


Tuần

Mật

số

vk (

log/

g ch

ất k

hô)

1B 2B 3B 4B


Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn sự sống sót của G. diazotrophicus ở nồng độ đường 10%


NT 1B: 30%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 0% PVP + Bã mía bổ sung 0% PVPNT 2B: 30%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 1% PVP + Bã mía bổ sung 0% PVPNT 3B: 30%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 0% PVP + Bã mía bổ sung 1% PVPNT 4B: 30%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 1% PVP + Bã mía bổ sung 1% PVP

NT 1A: 10%sucrose + dịkhuẩn bổ sung 0% PVP + Bã mía bổ sung 0% PVPNT 2A: 10%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 1% PVP + Bã mía bổ sung 0% PVPNT 3A: 10%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 0% PVP + Bã mía bổ sung 1% PVPNT 4A: 10%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 1% PVP + Bã mía bổ sung 1% PVP



Dưới đây là đồ thị so sánh ảnh hưởng của nồng độ PVP được bổ sung vào trong dịch

vi khuẩn và bã bùn mía đến sự sống sót của vi khuẩn G. diazotrophicus.

DỊCH VI KHUẨN BỔ SUNG 0% PVP

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0


Tuần

Mậ

t s

ố (

log

(số

tế

bà

o/g

ch

ất

kh

ô)

1A 3A 1B 3B

DỊCH VI KHUẨN BỔ SUNG 1% PVP

4

5

6

7

8

9


Tuần

Mậ

t s

ố(l

og

(số

tế

bà

o/g

ch

ất

kh

ô))

2A 4A 2B 4B


Hình 4.4: Ảnh hưởng của 0% PVP được bổ sung trong dịch vi khuẩn đến sự sống sót của vi khuẩn G. diazotrophicus

NT 1A: 10%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 0% PVP + Bã mía bổ sung 0% PVPNT 3A: 10%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 0% PVP + Bã mía bổ sung 1% PVPNT 1B: 30%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 0% PVP + Bã mía bổ sung 0% PVPNT 3B: 30%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 0% PVP + Bã mía bổ sung 1% PVP

Hình 4.5: Ảnh hưởng của 1% PVP được bổ sung trong dịch vi khuẩn đến sự sống sót của vi khuẩn G. diazotrophicus

NT 2A: 10%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 1% PVP + Bã mía bổ sung 0% PVP NT 4A: 10%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 1% PVP + Bã mía bổ sung 1% PVPNT 2B: 30%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 1% PVP + Bã mía bổ sung 0% PVPNT 4B: 30%sucrose + dịch vi khuẩn bổ sung 1% PVP + Bã mía bổ sung 1% PVP


BÃ BÙN MÍA BỔ SUNG 0% PVP

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0


Tuần

Mậ

t s

ố(l

og

(tế

bà

o/g

ch

ất

kh

ô))

1A 2A 1B 2B

BÃ BÙN MÍA BỔ SUNG 1% PVP

4

5

6

7

8

9

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T17 T19 T21 T23 T25Tuần

Mậ

t s

ố(l

og

(số

tế

bà

o/g

ch

ất

kh

ô))

3A 4A 3B 4B


Hình 4.6: Ảnh hưởng của 0% PVP được bổ sung trong bã mía đến sự sống sót của vi khuẩn G. diazotrophicus


Hình 4.7: Ảnh hưởng của 1% PVP được bổ sung trong bã mía đến sự sống sót của vi khuẩn G. diazotrophicus



So sánh giữa bốn đồ thị trên cho thấy được ảnh hưởng của PVP lên cả 8 nghiệm

thức trên là không có sự khác biệt rõ rệt. Giữa bã bùn mía và dịch vi khuẩn bổ sung

0% và 1% PVP (tùy theo mỗi nghiệm thức), sau 6 tháng khảo sát cho thấy mật số vi

khuẩn đều giảm xuống (<106 cfu/g chất mang khô). Sự khác biệt giữa các nghiệm thức

là do môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng tới kết quả và một nguyên nhân cơ bản là do

G. diazotrophicus là vi khuẩn cố định đạm nội sinh bắt buộc, vi khuẩn này chỉ tồn tại

được trong thời gian dài khi ở trong cây chủ . Do đó PVP không tác động trực tiếp đến

sự sống sót của vi khuẩn G. diazotrophicus.

Dưới đây là kết quả so sánh các cặp nghiệm thức, sử dụng LSD .01 để so sánh trị

số trung bình có ý nghĩa ở mức độ 1%.

Bảng 4.1: So sánh các cặp nghiệm thức

Nghiệm Thức Mật số vi khuẩn trung bình (log10(số tế bào / g chất khô)

1A

4B

3A

4A

2A

2B

1B

3B

6.345 a

6.243 ab

6.193 bc

6.097 cd

6.080 de

5.963 f

5.918 fg

5.852 g

LSD.01 = 0.104

CV = 2.64

Các chữ cái theo sau các chữ số giống nhau không khác biệt ở mức ý nghĩa 1%



6.345

6.2436.193

6.097 6.080

5.9635.918

5.852

5.6

5.7

5.8

5.9

6

6.1

6.2

6.3

6.4

1A 4B 3A 4A 2A 2B 1B 3B

Nghiệm thức

Mật

số(

log(

số t

ế bà

o/g

chất

khô

)

Kết quả so sánh cho thấy nghiệm thức 1A (0%PVP bổ sung vào dịch vi khuẩn +

0%PVP bổ sung vào bã bùn mía + 10% đường sucrose) có mật số vi khuẩn trung bình

cao nhất (6.345) và cũng không có sự khác biệt với nghiệm thức 4B (6.243) ở mức ý

nghĩa 1%. Tuy nhiên ở nghiệm thức 4B(1%PVP bổ sung vào dịch vi khuẩn và 1%

PVP bổ sung vào bã bùn mía + 30% đường sucrose) cũng không có sự khác biệt so với

nghiệm thức 3A (0%PVP bổ sung vào dịch vi khuẩn + 1%PVP bổ sung vào bã bùn

mía + 10% sucrose) có mật số vi khuẩn (log(số tế bào/ g chất khô bằng 6.193)… Điều

này cho thấy được vi khuẩn G.diazotrophicus có khả năng phát triển tốt ở nồng độ

đường 10%. Qua các phân tích trên, nghiệm thức 1A có hiệu quả kinh tế nhất vì sử

dụng ít lượng đường cần bổ sung vào và không cần chất PVP. Nếu sử dụng nghiệm

thức 1A sẽ tiết kiệm được rất nhiều chi phí đầu vào trong quá trình sản xuất phân vi

sinh ở quy mô công nghiệp nên góp phần hạ giá thành sản phẩm.

Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus là vi khuẩn nội sinh bắt buộc trong

cây chủ như mía, củ cải đường, khoai lang nên khi sống trong môi trường bên ngoài

cây chủ với chất mang là bã bùn mía thì không tồn tại được trong thời gian dài. Vì thế

bã bùn mía chưa phải là chất mang phù hợp với dòng vi khuẩn nội sinh cố định đạm

này.


LSD.0 1= 0.104CV = 2.64

Hình 4.8: Mật số trung bình của G. diazotrophicus (log(số tế bào/g chất khô)


PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận.

- Bã bùn mía chưa phải là chất mang thích hợp cho vi khuẩn G.diazotrophicus.

- G.diazotrophicus có khả năng phát triển tốt ở nồng độ đường 10%.

- Nghiệm Thức 1A (0%PVP bổ sung vào dịch vi khuẩn + 0%PVP bổ sung vào bã bùn

mía + 10% đường sucrose) là nghiệm thức có mật số vi khuẩn tốt nhất sau 6 tháng

khảo sát (có bổ sung vi khuẩn vào thời điểm T13 (tuần 13)).

- PVP (polyvinyl pyrrolidone) không ảnh hưởng trực tiếp đến sự sống sót của vi khuẩn

G.diazotrophicus.

5.2. Đề nghị

Nghiên cứu các dạng chất mang khác (bã khóm, bã cà phê…) đối với dòng vi khuẩn

này.



TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt:

Bùi Quang Vinh. 1998. Phân tích và quản lý hóa học mía – đường, NXB Nông nghiệp.

Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Mít. 2007. Hiệu quả phân vi khuẩn

Gluconacetobacter diazotrophicus và vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trên

năng suất và trữ lượng đường trong cây mía (Saccharum officinaruml.) trồng

trên đất phù sa tỉnh Hậu Giang.

Hứa Trần Phong. 2008. Xác định hỗn hợp chất mang để sản xuất phân đạm vi sinh bón

cho cây lúa, Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Cần

Thơ.

Khoa học và đời sống, số 89(1702), ngày 5/11/2004, tr.5.

Lê Hoàng Thăng. 2008. Phân lập một số dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trên

lúa, Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ.

Lê Văn Tri. 2001. Hỏi – đáp về phân bón, NXB Nông Nghiệp.

Lê Văn Tri. 2002. Hỏi – đáp về phân bón, NXB Nông Nghiệp.

Lê Xuân Phương. 2005. Giáo trình vi sinh – các quá trình công nghệ sinh học trong

bảo vệ môi trường, Trường Đại học bách khoa Đà Nẵng.

Nguyễn Đăng Diệp. 2000. Đề án kinh tế kĩ thuật xây dựng xưởng sản xuất phân bón

sinh hóa hữu cơ tổng hợp.

Nguyễn Đức Lượng. 2004. Công nghệ vi sinh vật tập 1 – Cơ sở vi sinh vật công

nghiệp, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

Nguyễn Đức Lượng. 2004. Công nghệ vi sinh vật tập 2 – Vi sinh vật công nghiệp,

NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

Nguyễn Hữu Hiệp, Renato Fani, Lê NgọcThúy, Ngô Bảo Ngọc, Trần thị NgọcTố và

Phạm Thị Khánh Vân. 2008. Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh để sản xuất

phân vi sinh ở quy mô phòng thí nghiệm cho cây mía trồng tại tỉnh Sóc Trăng.

Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Ty. 2008. Vi sinh vật học,

NXB Giáo Dục.



Nguyễn Phú Thọ. 2006. Phân vi sinh, Thông tin khoa học – Đại học An Giang, (27),

tr. 10-11.

Nguyễn Quốc Thanh. 2005. Phân lập một số dòng vi khuẩn hòa tan lân khó tan, Luận

văn tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ.

Nguyễn Thanh Hiền. 2003. Phân hữu cơ, phân vi sinh và phân ủ, NXB Nghệ An.

Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toản. 2003. Giáo trình Công nghệ vi

sinh vật trong sản xuất nông nghiệp và bảo vệ môi trường, NXB Nông

Nghiệp.

Phạm Thị Ánh Loan. 2007. Ảnh hưởng của Polyvinyl Pyrrolidone (PVP) lên sự sống

sót và hoạt động của Azospirillum lipoferum và Pseudomonas syringea trên

cây lúa cao sản OM4498, , Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học,

Đại học Cần Thơ.

Phạm Văn Kim. 2000. Giáo trình vi sinh vật và sự chuyển hóa vật chất trong đất,

Trường Đại học Cần Thơ.

Trần Quốc Dẹn. 2009. Khảo sát khả năng sống sót và phát triển của vi sinh vật có ích

trong phân vi sinh với chất mang là bã bùn mía, Luận văn tốt nghiệp Cử nhân

Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ

Trần Thanh Việt. 2005. Chất mang thích hợp cho vi khuẩn Pseudomonas để sản xuất

phân sinh học, Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học

Cần Thơ.

Trần Thị Ngọc Tố. 2006. Nghiên cứu nguồn Carbon thích hợp nuôi vi khuẩn

Gluconacetobacter diazotrophicus và chất mang thích hợp để sản xuất phân

vi sinh cho cây mía, Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại

học Cần Thơ.

Viện Thổ Nhưỡng Nông Hóa. 1998. Sổ tay phân tích đất – nước, phân bón cây trồng.

NXB Nông Nghiệp.

Võ Đình Ngộ, Nguyễn Siêu Nhân, Trần Mạnh Trí. 1997. Than bùn ở Việt Nam và sử

dụng than bùn trong nông nghiệp, NXB Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh.



Võ Văn Phước Quệ. 2007. Hiệu quả của việc chủng vi khuẩn cố định Nitơ

(Azospirillum lipoferum), vi khuẩn hòa tan lân, tổng hợp IAA (Pseudomonas

syringae) lên năng suất và phẩm chất lúa tại Trà Ôn, Vĩnh Long, Luận văn tốt

nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ.

Tiếng Anh:

Cocking, E. C., Stone, P. J., and Davey, M. R. 2006. Intracellular colonization of roots

of Arabidopsis and crop plants by Gluconacetobacter diazotrophicus. In Vitro

Cell Dev Biol–Plant 42: 74–82.

Current science, vol. 83, No.2,25 July 2002.

Franke,I.I., Fegan, M., Hay ward, A.C. and Sly, L.I., lett. Appl M icrobiol. 1998. 12-

16.

Jayandra Kumar Johri, Sanjay Surange and Chandra Shekha nautiyal. 1999.

Occurrence of salt, pH, and temperature-tolarant, phosphate-solubilizing

Bacteria in Alkaline Soils. Current Microbiology (29), 89 – 93.

Kim K.M., D. Jordan, and G. A. Mc Donald. 1998. Enterrobacner agglomerans,

phosphate solubilizing bacteria, and microbial activity in soil: effect of carbon

sourcer. Soil Biochem, (30), 995 – 1003.

Leyval, C. and J. Berthelin. 1989. Interractions between Caria lacata, Agrobacterium

radiobacter and beech roots: Influence on P, K, Mg and Fe mobilization from

minerals and plant growth. Plan and Soil (117): 103

Malik Farhat R., Soaliha Ahmed and Yazdana M.Rizki. 2001. Utilization of

Lignocellulosic Waste for Preparation of Nitrogenous Biofertilizer. Pakistan

Journal of Biological Sciences (4), 1217 - 1220

María F. Luna, Cecilia E. Bernardelli, Carlos F. Mignone, and José L. Boiardi. 2002.

Energy Generation by Extracellular Aldose Oxidation in N2-Fixing

Gluconacetobacter diazotrophicus, in: Applied and Environmental

Microbiology, April 2002, p. 2054-2056, Vol. 68, No. 4.



Muthukumarasamy.R., G.Revathi, S.Seshadri and C.Lakshminarasimhan. 2002.

Gluconacetobacter diazotrophicus (syn. Acetobacter diazotrophicus), a

promising diazotrophic endophyte in tropics, Curr.sci (2): 138-139

Reddy, P. M., James, E. K., and J. K. Ladha. 2002. Nitrogen fixation in rice. In

Nitrogen Fixation at the Millenium, G. J. Leigh edit. Elsevier pp. 421–445.

Sevilla, M., De Oliveira, A., Baldani, I. and Kenedy, C., Symbiosis. 1998. (25), 181-

191.

Shenoy V. L., G. M. Kalagudi, B.V. Gurudatta. 2001. Towards nitrogen autotrophic

rice, Current Science (5), 451 – 457.

Smith R. L., Schank S. C., Bouton J. R. and Quesenbery K. H. 1987. Yeild inceases in

tropical grasses after inoculation with Spirillum lipoferum, Ecological Bulletin

(Stockholm) (26), 380 – 385.

Vasuvat Y., B. Fangcham, S. Siripin, D. Fusang and P. Chanaram. 1986. Yield

maximination of feed grain by associative N2-fixing bacteria, “Proceedings of

International Serminar on Yield Maximination of Feed Grains Though Soil

and Fertilizer Management”, Bangkok, Thailand (12 – 16, May).

Yamada Y Heshino K and ishkawa T. 1998. Gluconacetobacter nom, corrig

(Gluconacetobacter sp.), in: Validation of publication of new names and new

com binations previously effectively published outside the IJSB, List no. 64.

Int. J. Syst. Bacteriol (48): 327 – 328.

Williams, M. C. 1982. 3-Nitropropionic and 3-nitro-1-propanol in species of

Astragalus. Canadian Journal of Botany 60: 1956–1963.

Nguồn Internet:

http://agriviet.com/news. (3/8/2009)

(http://www.cuctrongtrot.gov.vn/ChuyenTrangPB) (3/08/2009)

http://vneconomy.vn/65068P0C19/lon-xon-kinh-doanh-phan-vi-sinh.htm (15/08/2009)

http://www.agro.gov.vn/news/newsDetail.asp?targetID=4165 (15/8/2009)


http://www.agro.gov.vn/news/newsDetail.asp?targetID=4165

http://vneconomy.vn/65068P0C19/lon-xon-kinh-doanh-phan-vi-sinh.htm

http://www.cuctrongtrot.gov.vn/ChuyenTrangPB

http://agriviet.com/news


http://vietbao.vn/Khoa-hoc/Dung-che-pham-sinh-hoc-bien-phan-chuong-thanh-phan-

vi-sinh/20463353/189/ (15/8/2009)

http://vietnamnet.vn/khoahoc/trongnuoc/2004/12/359969/ (15/8/2009)

http://www.ctu.edu.vn/institutes/biotech/18.pdf (27/9/2009)

http://www.oxychemicals.com.vn/ (27/9/2009)

From Wikipedia, the free encyclopedia (22/12/2009)

http://www.greatvistachemicals.com/industrial_and_specialty_chemicals/

polyvinylpyrrolidone.html (22/12/2009)


http://www.greatvistachemicals.com/industrial_and_specialty_chemicals/polyvinylpyrrolidone.html

http://www.greatvistachemicals.com/industrial_and_specialty_chemicals/polyvinylpyrrolidone.html

http://www.oxychemicals.com.vn/

http://www.ctu.edu.vn/institutes/biotech/18.pdf

http://vietnamnet.vn/khoahoc/trongnuoc/2004/12/359969/

http://vietbao.vn/Khoa-hoc/Dung-che-pham-sinh-hoc-bien-phan-chuong-thanh-phan-vi-sinh/20463353/189/

http://vietbao.vn/Khoa-hoc/Dung-che-pham-sinh-hoc-bien-phan-chuong-thanh-phan-vi-sinh/20463353/189/