IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE ESPECIES BACTERIANASPRACTICA 7

INTRODUCCIN

Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una va metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no; junto con un sistema indicador que puede detectar ya sea la declinacin del sustrato o la presencia de productos metablicos especficos.

Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.

MARCO TERICO

Prueba de la Oxidasa

El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e- . Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a prpura.Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo. Se considera positiva esta prueba cuando toma un color prpura la muestra.

Prueba de la Catalasa

El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa El perxido de hidrgeno se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la produccin de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + O2).

Prueba de la Coagulasa

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinacin de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus.

Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine o Motilidad-Indol-Ornitina)Esta prueba bioqumica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reaccin de Indol a la descarboxilacin de la ornitina.

Prueba TSI (Triple Sugar Iron o Triple Azcar Hierro)

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambin permite la identificacin de la produccin de SH2.

Esta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de gnero en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:

bacterias fermentadoras de la glucosa. bacterias fermentadoras de la lactosa. bacterias fermentadoras de sacarosa. bacterias aerognicas bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgnicas que contengan azufre.

Prueba LIA (Lysine Iron Agar o Agar Lisina Hierro)Esta prueba permite diferenciar los microrganismo que producen descarboxilacin o desafinacin de la lisina. Se pude detectar adems la produccin de SH2 y es ms sensible que el TSI para la deteccin de SH2. Es muy utilizado para descartar Salmonella de aislamientos primaros.

Agar Citrato

La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromo timol que vira al alcalino a pH 7,6.

Indol

El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Erlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptfano. Rojo Metilo

Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixto.

Vogues Proskauer

En la prueba de Voges-Proskauer se determina la va de fermentacin del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.

OBJETIVOS aprender a interpretar algunas de las pruebas bioqumicas de identificacin bacteriana de mayor utilidad. Aplicar la tcnica de agotamiento por estras para la obtencin de cultivos puros. Practicar las tcnicas de trasferencia de cultivos puros. Identificar y conocer algunos medios tiles para la identificacin bioqumica de bacterias. Distinguir las diferentes pruebas bioqumicas y las caractersticas principales que las diferencia. Aprender a interpretar las pruebas bacterianas aplicadas y en que campos profesionales son utilizadas. Reconocer bacterias por sus actividades metablicas.

Materiales

microscopio bacteria: salmonella thypi agar SIM agar TSA caldo lactosado agar TSI caldo peptonado Caldo glucosado (aceite) Caldo glucosado (campana) Cajas de Petri Tubos de ensayo Asas de siembra Mechero

Resultados observados en el laboratorio

M.OColonia (TSA)gramPruebas bioqumicasMorfologaOtras

CircularAmeboplanaConvexoEnteroOndular+-123456789101112Bacilo 1Bacilo 2Bacilo 3cocootra12

azufremovilidadalmidongelatinaPH lacticoindolTSITSITSITSITSIcatalasaox.glucosafer. Glucosa

S.+-+-+--+++--+-+--+-++-----+

Thypi

E.---------------------------

Coli

S.+-+-+-+-----+--+---+---+--+

Aureus

B.+--++--+-+--+--+----+-----+

Cereus

Tabla de resultados consultados

M.OColonia (TSA)gramPruebas bioqumicasMorfologaOtras

CircularAmeboplanaConvEnteroOndu+-123456789101112Bacilo 1Bacilo 2Bacilo 3cocootra12

azufremovilidadalmidongelatinaPH lacticoindolTSITSITSITSITSIcatalasaox.glucosafer. Glucosa

S.+-+-+--+++--+---+--++-----+

Thypi

E.-------+-------------------

Coli

S.-+-+---+++--++--+-++---+--+

Aureus

B.-----++------+-+---+-+----+

Cereus

PRACTICA 7IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE ESPECIES BACTERIANAS. SALMONELLA THYPI

MEDIOINOCULAR CON:RESULTADO ESPERADORESULTADO OBSERVADO

AGAR SIMCon una asa recta, inocular por puncin en el medio del agarSe observa un color negro ante la presencia de H2S.si el microorganismo crece por fuera de la puncin se considera que es mvilLa salmonella presento un color muy oscuro en el agar SIM por lo que se dice que el microrganismo crecio por fuera de la puncion por lo tanto es positivo para la movildad.

AGAR TSASiembra por agotamientoColonias aisladas

Salmonella no presenta colonias aisladas

AGAR ALMIDNSembrar varias estras en el centro de la caja de Petri. Despus de 24 horas de incubacin agregar gotas de lugolEl Lugol reacciona y da un color morado donde existe Almidn, si el lugol no tie el agar donde creci la colonia se considera amilasa positivo.Las colonia de la salmonella al hacerle prueba indol con el lugol no cambio de color por lo que no es negativa para el almidon y entonces ser amilasa positiva

AGAR GELATINATomar una muestra con el asa y realizar una siembra por puncin en el agar si este est dispuesto en tubos. Despus de 24 horas de incubacin pase el tubo a la nevera (5C) y espere 1Hora. Luego agite suavemente la gelatina, si le medio se torn lquido se considera que el microoganismo es gelatiniza +Salmonella es gelatinaza negativo porque el medio no se torno liquida.

CALDO LACTOSADOInocular con el asa en argollaEl caldo lactosado tiene el indicador rojo de fenol que se torna de color amarillo cuando el medio se vuelve cido, indicando la presencia de cido lctico, tambin tiene un tubo invertido de Durham que hace las veces de campana para atrapar los gases producidos.El rojo fenol cambio de rojo a amarillo indicando que hay acido lctico por lo tanto es ph lctico positivo

AGAR TSIInocular con el asa recta hasta la mitad del tubo.La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el M.O solamente fermenta la glucosa.2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el M.O fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo fondo rojo): el M.O es no fermentador de azcares.4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el M.O produce gas.5-El ennegrecimiento del medio indica que el M.O produce cido sulfhdrico.Salmonella en el agar TSI fermenta la glucosa ademas produce gas porq el agar del fondo del tubo corri espacio

PRUEBA CATALASADisolver una colonia en una gota de agua oxigenada al 30%.

La aparicin de espuma al contacto de la colonia con el agua oxigenada revela la presencia de catalasa.En la colonia disuelta si hay presencia de catalasa por la presencia de espuma al contacto con agua oxigenada

OXIDACIN AEROBIA DE GLUCOSAInocular con el asa en argollaSe observa la aparicin de gas en la campana de Durhan.Viraje del medio.Salmonella no oxida la glucosa porque en la campana de Durhan no hay presencia de gases

FERMENTACIN ANAEROBIA DE GLUCOSAInocular con el asa en argollaSe observa la aparicin de gas por debajo del tapn de vas-par que muchas veces lo desplaza hacia arribaSi hay presencia de gas por lo cual la salmonella fermenta la glucosa.

Comparacion de los resultados obtenidos en laboratorio y los consultados Comparando los resultados obtenidos en laboratorio y los consultados tenemos que para salmonella Thypi coisiden los dos resultados es decir:Salmonella typhi pertenece a la familia de enterobacteriaceae, formado por basilos gram negativos anaerobios facultativos, no desarrolan capsulas ni esporas, son bacterias moviles que prodicen sulfuro de hidrogeno, fermentan glucosa esto se debe a que posee una enzima especializada, pero no fermenata lactosa ni ureasa. Es una bacilo primario.

Concluciones Es importante resaltar que la prueba SIM permite mirar si un microrganismo es mvil, si produce azufre y la produccin o la presencia de triptofanasa. El agar TSA permite observar la morfologa de las colonias. El caldo lactosado permite saber que bacterias producen acido lctico y cuales producen gases. el agar TSI permite saber si alguna bacterias solamente fermenta glucosa, fermenta glucosa, lactosa y / o sacarosa, es no fermentador de azucares, es productor de gas o produce acido sulfhdrico. EL caldo peptonado es un indicador de crecimiento bacteriano. la prueba catalasa permite ver la presencia de la enzima catalasa. La prueba de oxidacin aerobica de glucosa permite saber si algn microrganismo es oxidativo y la prueba de fermentacin anaerobia de glucosa que permite saber si algn microrganismo es fermentativo Para poder interpretar cada tipo de pruebas es necesario identificar que caractersticas tiene la prueba como un indicador, la aparicin de algn tipo se estructura (natas, velos), aparicin de espuma, aparicin de gas, aparicin de algn anillo etc, ya que todas estas son especificas e identifican cada tipo de prueba bioqumica. Hay una gran variedad de pruebas bioqumicas que permiten el estudio de microrganismos, las cuales se diferencian tanto por el principio que utilizan como la fermentacin o la oxidacin o por los indicadores como en la prueba de indol, o la produccin de gas como en el caldo lactosado.

Preguntas de consulta

1. Por qu es importante trabajar con cultivos puros?

En los ambientes naturales los microorganismos se encuentran usualmente como poblaciones mixtas, pero si se necesita estudiarlos, caracterizarlos e identificarlos, es fundamental tenerlos como cultivos puros.

2. qu reactivos utiliza la prueba de citocromo oxidasa?

El reactivo de la oxidasa ms recomendado es la solucin acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina.

3. En qu bacterias es til la prueba de reduccin de nitratos?

En bacterias capaces de reducir el nitrato en nitritos , que poseen la enzima nitrato-reductasa

4. Para qu sirve el medio semislido de agar-indol-movilidad-acido sulfhdrico? El medio semislido de agar-indol-movilidad-acido sulfhdrico es un medio semi-slido transparente que pone en evidencia la movilidad, la produccin de triptofanasa y de SH2. Contiene:

Triptofano: la enzima triptofanasa, lo desdobla, produce indol, que se pone de manifiesto con el reactivo de Erlich o Kovac Citrato de hierro y amonio: los microorganismos productores de SH2 ennegrecen el medio de cultivo

Si los microorganismos son mviles, al ser ste un medio semi-slido se produce enturbiamiento del medio de cultivo, caso contrario solo crece en la puncin.

5. Cul es la importancia del medio Hugh-leifson?

La importancia es que permite la determinacin del metabolismo oxidativo o fermentativo de los carbohidratos. El medio de Hugh y Leifson contiene peptonas e hidratos de carbono en una relacin 1:5. Al ser menor la concentracin de peptonas, hay menor produccin de productos de oxidacin a partir de los AA que tienden a elevar el pH y pueden neutralizar los cidos dbiles producidos por los microorganismos no fermentadores.

6. Explique la importancia de la enzima coagulasa

la coagulasa es una enzima termoestable, que tiene la capacidad de convertir el fibringeno del plasma en fibrina y es importante para diferenciar las especies del gnero staphylococus.

7. Explique la reaccin enzima-sustrato, que es especificidad?

Las enzimas logran la disminucin de la energa de activacin de la reaccin, la enzima adquiere las transformaciones qumicas y energticas que tiene lugar en cada celula pero para realizar estas funciones bsicas debe tener una capacidad de interaccionar de una forma especifica y reversible con liandos para que la enzima modifique el sustrato, sta debe encajar en el lugar de la unin de la enzima , es decir hay complementariedad geomtrica entre enzima sustrato, las enzimas suelen ser muy especificas tanto de tipo de reaccin como de sustrato involucrado

8. Porqu las pruebas bioqumicas guardan una relacin con los genes?

Las pruebas bioqumicas guardan una relacin con los genes por la presencia del ADN, es decir en las diferentes pruebas bioqumicas se mantiene una relacin con el ADN patrn de la herencia.

BibliografiaBROCK BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS. 10 Edicion, Michaelt.Madigan, Jhon M. Martinko, Jack Parker

http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simedio.htmhttp://www.laanunciataikerketa.com/trabajos/fregasuelos/medios.pdfhttp://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tsiagar.htm