Evaluasi Antara
Immunohistochemistry StainingCD4, Kolagen & P53
AryaDOSENDOKTOR
1IHCDiambil dari kata immune proses yg menggunakan antibody dan
histo menunjukkan jaringan secara mikroskopisAdanya antigen
spesifik didapat antibodi(Ab) spesifik Ab primer dilabel atau sudah
berlabel pengecatanAg bisa diamatiPada sel terdapat berbagai macam
struktur protein yg AG spesifik baik tingkat selular maupun tingkat
molekuler.Contoh protein spesifik selular : LCA, Vimentin, CD 20,
CD 3Contoh protein spesifik molekuler: RE, RP, Her 2,p53, Bcl 2-
Tahu jenis protein yg akan dideteksi- Tahu lokasi protein tersebut
- Kalau pabrik sudah membuat Ab primernya- Kalau lab.PA punya
kemampuan pem.IHCLabel ada 2 macam: fluorescent - enzym /
peroksidase Label fluorescent tak perlu dicat lagiLabel enzim perlu
cat chromogen : DAB , AEC Untuk mengukur dan mengidentifikasi
karakteristik seluler spt proses proliferasi sel, apoptosis sel,
mengetahui distribusi dan lokasi biomarker atau protein terekspresi
pada jaringan tubuh2Prinsip Utama Imunohistokimia2
Metode imunohistokimia Merupakan metode Imunohistokimia tertua.
Memanfaatkan metode reaksi antara antibodi primer yang telah diberi
label enzim dengan antigen pada jaringan. Keunggulan metode ini
cepat krn hanya menggunakan satu antibodin dan reaksi nonspesifik
dapat diminimalisir. Kelemahan krn hanya menggunakan satu label
antibodi amplifikasi sinyal/pewarnaan kurang memadai dan mulai
kurang sensitif untuk permintaan diagnosa akhir2 iniDirectTerdapat
beberapa metode yang digunakan diantaranya adalahTwo step
indirectmethodPrinsip utama metode ini antibodi primer yang
dikatkan dgn antigen, antibodi sekunder diikatkan pada antibodi
primer dilanjutkan dengan larutan substrat kromogen.Metode ini
lebih serbaguna dibanding metode direct lebih banyak jenis antibodi
primer dr spesies yg sama yg dpt digunakan bersama dengan antibodi
sekunder yg terkonjugasi, serta lbh sensitif krn beberapa antibodi
sekunder dpt bereaksi terhadap beberapa epitop primer shg
memperkuat hasil.Three step indirectmethod
Metode ini melanjutkan metode sebelumnya, antibodi tersier yg
dikonjugasi enzim ditempelkan pd antibodi sekunder. Antibodi
tersier ini harus spesifik terhadap antibodi sekunder. Kedua
antibodi tsb juga harus dikonjugasikan pd enzim yg sama.Penambahan
lapisan ketiga ini memperkuat hasil krn lbh banyak antibodi yg
terikat, jg sangat membantu pada pewarnaan pada epitop (epitop mjd
lbh banyak)ABC,LAB/LSAB,Avidin-Biotin-Complex (ABC) menggunakan
afinitas terhadap molekul avidin- biotin oleh tiga enzim
peroksidase. Situs pengikatan bbrp biotin dlm molekul avidin
tetravalen bertujuan untuk amplifikasi dan merespon sinyal yang
disampaikan oleh antigen target.Labelled avidin biotin (LAB), 4-8
kali lebih sensitif dr ABC. Avidin sekarang tlh tergantikan oleh
streptavidin shg menjadi metode baru yaitu labelled
streptavidin-biotin (LSAB) dan modifikasi lain dr ABC seperti
CSA.
ABC Protocol
FixationFiksasi sangat penting dalam menentukan outcome reaksi
antigen-antibodiManfaat fiksasi :Menjaga keutuhan komponen sel
(protein struktural dan soluble)Mencegah autolisis dan perubahan
penyusun sel (antigen dan enzim)Stabilisasi material sel dari
akibat prosedur tindakanFasilitasi pengecatan konvensional dan
imunostainingAda dua macam cara fiksasiFiksasi cross linking (non
koagulasi)Coagulating fixatives
Cross-linking FixationGold standard : formaldehidMekanisme dasar
fiksasi : pembentukan addition product antara formalin dan grup
amino reaktif yg tak bermuatan (-NH atau NH2) membentuk
cross-linkJika terdapat hidrogen reaktif kedua maka akan terbentuk
methylene bridge
Antigen retrievalAR bertujuan untuk optimalisasi
imunoreaksiTahap fiksasi akan mengubah struktur tersier protein
(antigen) sehingga sulit bereaksi dengan antibodiMetode untuk
memulihkan perubahan akibat fiksasiAR terutama diperlukan pada
jaringan yang difiksasi dengan cross-link fixativeTanpa AR, Ab
poliklonal lebih mudah deteksi Ag dibanding Ab monoklonalProsedur
AR yang paling banyak dipakaiMetode enzimatikMetode heat-based
retrievalCara lain : inkubasi slide dalam larutan alkali kuat,
urea, larutan asam, borohidrid, larutan sukrosaA.R enzimatikHuang
et al mengenalkan metode protease-induced epitope retrieval
(PIER)Enzim yang dipakai : tripsin, proteinase K, pronase, ficin,
pepsinEfek dipengaruhi : konsentrasi dan tipe enzim, parameter
inkubasi (waktu, suhu, pH), dan durasi fiksasiWaktu digesti
enzimatik berbanding terbalik dengan lama fiksasiKelemahan metode
PIERRendahnya jumlah antigenPerubahan morfologi jaringanDestruksi
epitopA.R heat-basedHeat-induced epitope retrieval (HIER)
dikenalkan oleh Shi et alKonsep : reaksi kimia antara protein dan
formalin dapat dipulihkan/dibalik dengan pemanasan atau hidrolisis
dengan alkali kuatPemanasan dapat membuka epitop melalui hidrolisis
cross-link metilenPemanasan suhu tinggi (100C) dengan durasi
singkat (10 menit) akan mendapat hasil yang lebih baik dibanding
pemanasan suhu rendah dengan waktu yang lama
Imunohistokimia CD4BACKGROUND:Setelah diketahui bahwa limfosit
dapat dibagi menjadi sel B dan sel T, diketahui jg bhw sel T
berfungsi sebagai helper, supresor dan sel sitotoksik. Molekul CD4
mrp glikoprotein nonpolimorfik anggota superfamili gen Ig yg
berekspresi pada permukaan membran subpopulasi sel T. Molekul CD4
bertindak sebagai ko-reseptor dan berikatan dengan region
nonpolimorfik molekul MHC kelas II. SOURCES/CLONES:Ancell (QS4120),
Becton Dickinson (Leu3), Biodesign (13B8.2, BL4), Biogenesis
(T138A), Biotest (T4, TT1), Coulter (T4), Cymbus Bioscience
(MEM115), Dako (MT310), GenTrak, Immunotech (BL4,13B8.2), Oncogene
(VIT4), Sanbio (BL-TH4), MEM115), Seralab, Serotec (B-A1, B-F5,
B-B14,13B8.2) and Pharmingen (RM-4-4, RM-4-5) Imunohistokimia
CD4APPLICATION:Antibodi CD4 berguna utk identifikasi Thelper/sel
inducer, memeriksa limfosit reaktif (karena terdapat pada 45%
limfosit darah perifer), kelainan limfoproliferatif dan monosit.
Juga terdapat pada 80% thymocyt. Walaupun juga diekspresikan pada
monosit/makrofag, sel langerhans dan sel dendritik lainnya, Cd4
tidak diekspresikan oleh sel B.ADDITIONAL INFORMATION:Positive
Control: Tonsil, spleen, thymus Negative Control: Omit primary
antibody, isotype control or absorption controlStandard Method: ABC
Method or LSAB Method.Chromogen Substrate: DAB
(3,3'-DIAMINOBENZIDINE)Counterstain: Mayer's Hematoxylin
Gambar A dan B negative controlGambar C dan D positive control
terwarnai coklat
Imunohistokimia KolagenBACKGROUND:Lamina densa mrp lapisan
setebal 40-60 nm salah satu pembentuk lamina basalis selain lapisan
lamina lucida. Kolagen tipe IV terdapat dibagian lamina densa, bila
menggunakan mikroskop elektron bisa teramati pada lamina densa dan
lamina lucida. SOURCES/CLONES:Accurate (COL-4), Axcel (CIV22),
Biodesign (1o42, MC4HA), Biogenesis (2D8/29), Biogenex (CIV22),
Biotec (XCD02), Dako (CIV22), ICN (polyclonal, 1042), Immunotech
(CIV22), Milab, Sanbio (SB11), SeraLab (1042) and Serotec (CIV22,
PHM-12)Imunohistokimia Kolagen (tipe IV)APPLICATION:Diagnosis IHC
kolagen tipe IV kebanyakan terpusat pada tumor invasif pada lamina
basalis, sebagian tumor epitelial. IHC kolagen tipe IV juga
digunakan utk membedakan hiperplasia sel C dengan karsinoma medular
pada tiroid. ADDITIONAL INFORMATION:Positive Control: Skin,
kidneyNegative Control: Omit primary antibody, isotype control,
absorption control Standard Method: ABC Method atau LSAB
MethodChromogen Substrate: DABCounterstain: Mayer's
HematoxylinKolagen cancer mamae(+) Kolagen pada ginjal (+)
Imunohistokimia P53BACKGROUND:P53 berfungsi utk memprogram
kematian sel, diferensiasi sel dan mengontrol mekanisme siklus sel.
Terdapat pd nukleus (terikat dgn DNA), pd lengan pendek kromosom
17. P53 mewakili sebagai molekul yg paling sering berubah dlm
perubahan genetis pada kanker.SOURCES/CLONES:Biodesign (Pab1801,
53-12), BioSource, Bioprobe (BP53-12), Chemicon, Cymbus Bioscience,
Medac (CM-1), Dako (DO-7), GibcoBRL, Immunotech, Novocastra,
Oncogene (Pab1801, Pab421, Pab122), Oncor, Pharmingen (G59-12),
Serotec (Pab1801, BP53-12) and Signet.Antibodies to mutant
p53Biogenesis, Chemicon and Oncogene (Pab240)Antibodies to
Wild-Type p53Biodesign (Pab246), Oncogene (Pab1620) and Serotec
(Pab246)Imunohistokimia P53APPLICATION:Deteksi P53 berdasarkan
peningkatan konsentrasi protein pada tingkatan yg dpt terdeteksi.
Umumnya, frekuensi hasil pengecatan positif sejalan dgn tumor yg
disertai mutasi pada pemeriksaan sekuensing DNA. Analisis P53 pada
kondisi neoplastic atau preneoplastik merupakan alat yg kuat dlm
menyediakan informasi molekuler pd proses onkogen serta
kemampuannya utk mendeteksi bentuk abnormal pada protein
jaringan.ADDITIONAL INFORMATION:Positive Control: Skin cancer,
tumorsNegative Control: Omit primary antibody, isotype control,
absorption control Standard Method: ABC Method atau LSAB
MethodChromogen Substrate: DABCounterstain: Mayer's
Hematoxylinc-erbB2 staining is positive in (A) and negative in (B).
p53 staining is positive in (C) and negative in (D). Slides were
counterstained with Mayer's hemalum solution. Magnification,
100
Terima kasih
