Impact sur les parametres agronomiques et
physiologiques de l’ozone tropospherique sur le maıs en
Ile-de-France
Ahmed Rakmani
To cite this version:
Ahmed Rakmani. Impact sur les parametres agronomiques et physiologiques de l’ozone tro-pospherique sur le maıs en Ile-de-France. Biodiversite et Ecologie. Universite Paris-Est, 2015.Francais. <NNT : 2015PESC1157>. <tel-01323942v2>
HAL Id: tel-01323942
https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01323942v2
Submitted on 6 Jun 2016
HAL is a multi-disciplinary open accessarchive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come fromteaching and research institutions in France orabroad, or from public or private research centers.
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, estdestinee au depot et a la diffusion de documentsscientifiques de niveau recherche, publies ou non,emanant des etablissements d’enseignement et derecherche francais ou etrangers, des laboratoirespublics ou prives.
Soutenue le 15 décembre 2015, devant le jury composé de :
Jean Christophe Avice Pr., Université de Caen
Rapporteur
Juliette Leymarie
MC, Université Pierre et Marie Curie
Rapporteur
Jean-Francois Castell
MC, AgroParisTech
Examinateur
Giacomo Gerosa
Pr. Associé, Université C. de Brescia
Examinateur
Daniel Laffray
Pr., Université Paris Est Créteil
Examinateur
Anis Limami
Pr., Université d'Angers
Examinateur
Remerciements En premier lieu, je tiens à remercier Anne Repellin, pour toutes les opportunités qu’elle m’a offertes et la confiance qu’elle m’a témoignée. Merci d’avoir cru en moi alors que je n’étais qu’étudiant et d’avoir accepté d’encadrer ce travail de thèse. Je tiens également à remercier Luis Leitao qui a codirigé cette thèse. Merci à lui pour son soutien quotidien dans mes péripéties laborantines, pour ses conseils, sa disponibilité et son infinie patience. Je souhaite remercier Mme Juliette Leymarie, Maître de conférence à l’Université Pierre et Marie Curie et M. Jean Christophe Avice, Professeur à l’Université de Caen, pour avoir accepté d’évaluer ce travail en tant que rapporteur malgré un délai très court. Je remercie également Messieurs Jean François Castel, Maître de conférence à l’AgroParisTech, Anis Limami, Professeur à l’université d’Angers, Giacomo Gerosa, Professeur associé à l’université Catholique de Brescia et Daniel Laffray, Professeur à l’Université Paris Est Créteil. Merci à Mme Marie-Claire Gazeau et M. Denis Duhamel, directeurs de l’école doctorale SIE, pour m’avoir offert la possibilité de réaliser cette thèse et à Brigitte David pour sa bonne humeur, sa patience, son humour et pour avoir toujours su trouver les solutions à mes problèmes administratifs. Merci à nos collègue de l’INRA de Grignon, Messieurs Olivier Bethenod et Jean François Castel pour leur précieuse aide et sans qui ce projet n’aurait pu aboutir. Je tiens à remercier le Pr. Yasmine Zuily Fodil pour avoir su stimuler ma soif de connaissances. Je remercie à nouveau le Pr. Daniel Laffrray, un mentor, un monument, un intarissable puits de savoir qui jusqu’au bout m’aura sauvé la mise… Je remercie Matthieu, pour être bien plus qu’un collègue et m’avoir fait profiter de son spectre de connaissances qui ne semble pas avoir de limites, Christophe pour son sens du protocole autant que pour sa bonne humeur, Manuel pour son pragmatisme et nos discussions stimulantes. Un incommensurable merci à Mme Juliette Rochet, pour être Juliette Rochet, qui restera pour moi un modèle de compétences, d’humanité et d’humilité. Un merci des plus raisonnables pour Ruben et Marien, parce que je sais qu’ils n’affectionnent pas ces démonstrations de gratitude, merci pour tous les rires et l’aide que vous m’avez apportés. Une pensée également toute particulière pour Mme Grekis et Mme Martin pour qui mille mercis ne seraient pas suffisants.
Je tenais également à remercier tous les collègues de labo que je n’ai pas cités mais qui ont d’une manière où d’une autre contribué à cette thèse, en vrac et de manière non exhaustive, Mireille, Eric, Xavier, Corinne, Charlotte, Tetiana, Pascal, Déborah… Merci à mes chiens Talia et Tao qui ont veillé à ce que je prenne l’air au moins une fois par jour, à mes chats, Bounty pour m’avoir laissé en paix pendant les longues heures de rédaction et Leinhardt pour m’avoir rappelé de sauvegarder mes progressions en se couchant sur le clavier. Je remercie également ma famille qui a toujours cru en moi et particulièrement mes parents à qui je dois tant, les mots ne suffiront jamais pour leur exprimer ma gratitude. Enfin, merci à celle qui au quotidien veille sur moi, croit en moi et me soutient, celle sans qui cette thèse n’aurait ni pu aboutir ni même commencer. Merci Mélanie pour m’avoir accompagné au cours de cette aventure et toutes mes autres folies.
SOMMAIRE I] Introduction ......................................................................................................................................................... 1
II] Synthèse bibliographique ................................................................................................................................... 4
II]-1 Le maïs ............................................................................................................................................................. 4
II]-1-1 Généralités ............................................................................................................................................... 4
II]-1-2 Exigences climatiques ............................................................................................................................... 5
II]-2 Plantes et changement climatique .................................................................................................................. 6
II]-2-1 Plantes et CO2 ........................................................................................................................................... 7
II]-2-2 Plantes et température ............................................................................................................................ 9
II]-2-3 Plantes et sécheresse .............................................................................................................................. 10
II]-3 L’ozone atmosphérique ................................................................................................................................. 11
II]-3-1 L’ozone stratosphérique ......................................................................................................................... 12
II]-3-2 L’ozone troposphérique ......................................................................................................................... 14
II]-3-2-1 Formation ........................................................................................................................................ 14
II]-3-2-2 Répartition de l’ozone troposphérique ........................................................................................... 15
II]-3-2-3 Evolution des concentrations en ozone troposphérique ................................................................ 16
II]-4 Impact de l’ozone troposphérique sur la santé humaine .............................................................................. 18
II]-5 Impact de l’ozone troposphérique sur les couverts végétaux ....................................................................... 19
II]-5-1 Phénologie et sensibilité à l’ozone ......................................................................................................... 21
II]-5-2 Impact de l’ozone troposphérique sur le maïs ....................................................................................... 21
II]-5-3 Symptômes foliaires ............................................................................................................................... 23
II]-5-4 Effets «cellulaires».................................................................................................................................. 25
II]-5-4-1 Entrée de l’ozone dans les feuilles .................................................................................................. 25
II]-5-4-2 Systèmes antioxydants : détoxication des ros ................................................................................ 27
II]-5-5 Régulation hormonale ............................................................................................................................ 29
II]-5-5-1 Ethylène ........................................................................................................................................... 29
II]-5-5-2 Acide salicylique .............................................................................................................................. 30
II]-5-5-3 Acide jasmonique ............................................................................................................................ 31
II]-5-5-4 Acide abscissique ............................................................................................................................. 32
II]-6 Modification des protéines en réponse aux stress oxydants ........................................................................ 32
II]-6-1 Evolution des teneurs en protéines carbonylées durant le développement foliaire ............................. 34
II]-6-2 Evolution du niveau de protéines carbonylées dans les feuilles en réponse à un stress abiotique ....... 35
II]-7 Protéolyse chez les plantes ............................................................................................................................ 36
II]-7-1 Mécanisme d’action des protéases et classes de protéases .................................................................. 36
II]-7-2 Protéases à cystéine ............................................................................................................................... 37
II]-7-3 Protéolyse et ozone ................................................................................................................................ 38
III] Objectifs ........................................................................................................................................................... 40
IV] Matériels et méthodes .................................................................................................................................... 42
IV]-1 Site expérimental ......................................................................................................................................... 42
IV]-2 Système de fumigation et condition d’exposition à l’ozone ........................................................................ 42
IV]-3 Indice d’exposition à l’ozone ........................................................................................................................ 44
IV]-4 Matériel végétal et culture du maïs ............................................................................................................. 44
IV]-4 1 Prélèvements des échantillons végétaux .............................................................................................. 45
IV]-5 Paramètres agronomiques ........................................................................................................................... 46
IV]-5-1 Estimation des surfaces foliaires sur le maïs ......................................................................................... 46
IV]-5-2 Quantification des Biomasses aériennes ............................................................................................... 46
IV]-5-3 Détermination de la teneur en amidon dans les caryopses .................................................................. 47
IV]-5-4 Détermination des teneurs en carbone et azote dans les tiges, feuilles et grains ................................ 47
IV]-6 Paramètres physiologiques .......................................................................................................................... 47
IV]-6-1 Mesure des teneurs en chlorophylles totales ....................................................................................... 47
IV]-6-2 Mesure des échanges gazeux ................................................................................................................ 48
IV]-7 Paramètres Biochimiques ............................................................................................................................. 48
IV]-7-1 Extraction des protéines foliaires solubles et mesures des activités endoprotéolytiques ................... 48
IV]-7-1-1 Extraction ....................................................................................................................................... 48
IV]-7-1-2 Mesure des activités endoprotéolytiques totales .......................................................................... 49
IV]-7-1-3 Evaluation des activités spécifiques au moyen d’inhibiteurs ......................................................... 50
IV]-8 Dosage des espèces réactives de l’oxygène foliaires dans l’extrait.............................................................. 51
IV]-9 Evaluation de l’oxydation des lipides par la méthode thiobarbituric acid-reactive-substances (TBARS) .... 52
IV]-10 Extraction des protéines foliaires solubles et détermination du niveau de carbonylation des protéines
.......................................................................................................................................................................... 54
IV]-10-1 Extraction ........................................................................................................................................ 54
IV]-10-2 Détermination du niveau d’oxydation (groupement carbonyle) d’extraits protéiques foliaires .... 54
IV]-10-3 Séparation des protéines foliaires solubles par électrophorèse sur gels de polyacrylamide en
conditions dénaturantes (SDS-PAGE) ............................................................................................................ 55
IV]-10-4 Transfert sur membrane de nitrocellulose et visualisation des protéines oxydées par
immunochémiluminescence ......................................................................................................................... 55
IV]-10-5 Visualisation des protéines oxydées après coloration au bleu de Coomassie et analyse par
densitométrie des signaux acquis ................................................................................................................. 56
IV]-11 Dosage des protéines solubles de feuilles de maïs .................................................................................... 56
IV]-12 Analyses statistiques .................................................................................................................................. 57
IV] Résultats .......................................................................................................................................................... 58
V]-1 Exposition à l’ozone ....................................................................................................................................... 58
V]-1-1 Fréquence horaire des niveaux d’ozone ................................................................................................ 58
V]-1-2 Variations des valeurs d’AOT40 ............................................................................................................. 59
V]-2 Paramètres de rendement ............................................................................................................................ 61
V]-2-1 Poids de 1000 grains .............................................................................................................................. 61
V]-2-2 Teneur en amidon dans les caryopses ................................................................................................... 62
V]-2-3 Determination du nombre de rangs par épi et du nombre de grains par rang ...................................... 62
V]-2-4 Rapport C/N dans les feuilles, les tiges (et les caryopses)...................................................................... 63
V]-2-5 Quantification de la biomasse aérienne ................................................................................................. 66
V]-2-6 Indice de récolte ..................................................................................................................................... 67
V]-2-7 Surfaces foliaires .................................................................................................................................... 68
V]-2-8 Masses surfaciques ................................................................................................................................ 69
V]-2-9 Pourcentage de germination .................................................................................................................. 69
V]-3 Paramètres physiologiques ........................................................................................................................... 70
V]-3-1 Conductance stomatique et assimilation nette ..................................................................................... 70
V]-3-2 Teneur en protéines solubles totales dans les feuilles ........................................................................... 72
V]-3-3 Teneurs en chlorophylles totales ........................................................................................................... 73
V]-4 Effet de l’ozone sur les activités endoprotéolytique ..................................................................................... 74
V]-4-1 Détermination du pH optimal pour les mesures d’activités endoprotéolytique totale ......................... 74
V]-4-2 Activités endoprotéolytiques totales ..................................................................................................... 75
V]-4-3 Activités protéolytiques spécifiques ...................................................................................................... 76
V]-5 Evaluation des teneurs en ROS dans les feuilles ........................................................................................... 79
V]-6 Niveau d’oxydation globale des protéines solubles ...................................................................................... 80
V]-7 Peroxydation lipidique ................................................................................................................................... 81
VI] Discussion ........................................................................................................................................................ 83
VI]-1 Niveaux d’exposition à l’ozone ..................................................................................................................... 83
VI]-2 Impact de l’ozone sur le rendement ............................................................................................................ 84
VI]-2-1 Arguments en faveur de la tolérance du maïs à l’ozone ....................................................................... 84
VI]-2-1 Limites de la relation exposition-réponse pour le maïs ........................................................................ 90
VI]-3 Evolution des teneurs en protéines foliaires au cours du développement et en réponse à l’ozone. ...... 91
VI]-4 Impact du stress oxydant induit par l’ozone sur les composants cellulaires de feuilles de maïs ................. 94
VI]-4-1 Evolution du niveau de carbonylation des protéines au cours du développement du maïs et en
réponse à l’ozone .............................................................................................................................................. 94
VI]-4-2 Caractérisation des teneurs en ROS au cours du développement du maïs et en réponse à l’ozone .... 95
VI]-4-3 Evolution du niveau de peroxydation lipidique au cours du développement du maïs et en réponse à
l’ozone ............................................................................................................................................................... 96
VI]-5 Caractérisation de la protéolyse en réponse à l’ozone ................................................................................ 97
VI]-5-1 Activités endoprotéolytiques totales .................................................................................................... 97
VI]-5-2 Activités endoprotéolytiques spécifiques ........................................................................................... 100
VII] Conclusions et perspectives.......................................................................................................................... 101
VII] Bibliographie ................................................................................................................................................. 105
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Stades de développement du maïs (ressource FAO WATER) .................................................... 5
Figure 2: Relation entre la photosynthèse nette et la température de la canopée pour le maïs ............ 10 Figure 3 : Répartition de l'ozone atmosphérique (Ressource NASA – Eath Observing System Plan
Web) ..................................................................................................................................................................... 12
Figure 4 : Superficie annuelle maximale atteinte pour le trou de la couche d’ozone (ressource Ozone hole
watch NASA) ....................................................................................................................................................... 13
Figure 5 : Répartition de l'ozone en Ile de France (Ressource Airparif - Dossier sur l'ozone) ............... 16 Figure 6 : Evolution de la concentration en ozone troposphérique depuis 1840 et prévision jusqu’en
2100. Les barres d'erreurs correspondent aux différents scénarios IPCC. D'après Vingarzan (2004). 18 Figure 7 : Perte en rendement relative à l'ozone pour les années 2000 (A) et 2030 (B) d’après le
scénario A2 du GIEC (Avnery et al. 2011) ..................................................................................................... 23 Figure 8 : Dommages sur la biomasse aérienne du maïs, induits par une surexposition à l'ozone.
(Singh et al., 2014) ............................................................................................................................................. 24 Figure 9 : Induction par l'ozone d'une décroissance rapide de la conductance stomatique (Vahisalu et
al., 2010) .............................................................................................................................................................. 26 Figure 10 : Cycle Halliwell-Asada-Foyer ; Réactions d'oxydo-réduction dans une cellule végétale en
réponse à l'ozone (Castagna & Ranieri, 2009). ............................................................................................. 28 Figure 11 : Regulation de la mort cellulaire, induite par l'ozone, par l'antagonisme réciproque de
l'éthylène et l'acide jasmonique (Tuominen et al., 2004) .............................................................................. 31
Figure 12 : Effet de l'âge sur la carbonylation des protéines foliaires, pour les feuilles 1 à 12, avec les
feuilles 1 et 12 respectivement les plus âgées et les plus jeunes (Prins et al., 2011). ............................ 35 Figure 13 : Mécanismes de clivage des protéines des quatre principales classes de protéases (Van
der Hoorn, 2008) ................................................................................................................................................ 37
Figure 14 : Schéma du dispositif de fumigation à l’ozone ............................................................................ 44
Figure 15 : Réaction entre le MDA et l’acide thiobarbiturique (d’après Pourrut et al., 2008) .................. 53
Figure 16 : A : Fréquence horaire des niveaux d’ozone pour chaque traitement. .................................... 59 Figure 17 : Cumul d’AOT40 au cours de la période de fumigation en fonction du traitement considéré.
Les points colorés indiquent les dates de prélèvements. Les mesures des conditions 3,5 m et 2 m ont
été effectuées en aval de la source d’ozone, les mesures de la condition contrôle ont été effectuées
15 m en amont de la source d’ozone. ............................................................................................................. 60
Figure 18 : Poids de mille grains mesurés sur des plants de maïs (Zea mays L., cv NK Perform)
cultivés en air ambiant ou enrichi en ozone. Les valeurs pour la Récolte 1 représentent la moyenne ±
ET avec n=10. Les valeurs pour la Récolte 2 représentent la moyenne ± ET avec n=16. Les
traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m correspondent à des plantes respectivement exposées à des
AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de 60 jours. ............................................................. 61 Figure 19 : Pourcentage d’amidon dans les caryopses récoltés sur des plants de maïs (Zea mays L.,
cv NK Perform) cultivés en air ambiant ou enrichi en ozone. Les valeurs pour la Récolte 1
représentent la moyenne ± ET avec n=10. Les valeurs pour la Récolte 2 représentent la moyenne ±
ET avec n= 16 Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des plantes respectivement
exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de 60 jours. ................................. 62 Figure 20 : A : Nombre de rang par épi observés sur des épis de plants de maïs (Zea mays L., cv NK
Perform) cultivés en atmosphère ambiante ou enrichi en ozone. Les valeurs pour la Récolte 1
représentent la moyenne ± ET avec n=10. Les valeurs pour la Récolte 2 représentent la moyenne ±
ET avec n= 16. B : Nombre de grains par rang. Les valeurs pour la Récolte 1 représentent la moyenne
± ET avec n=10. Les valeurs pour la Récolte 2 représentent la moyenne ± ET avec n= 16. Les
traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des plantes respectivement exposées à des
AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de 60 jours. ............................................................. 63
Figure 21 : Teneurs en azote et en carbone dans les tiges des plants de maïs pour la récolte
R1(05/09/2011).. (A) : azote (en g.kg-1), avec la condition contrôle significativement différente de la
condition 2 m (ANOVA p<0,05). (B) : carbone (en g.kg-1
). (C) : rapport C/N, avec la condition contrôle
significativement différente de la condition 2 m (ANOVA p<0,05). Les valeurs des différents graphes
représentent les moyennes ± ET avec n=5. Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à
des plantes respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de
60 jours. ............................................................................................................................................................... 65 Figure 22 : Teneurs en azote et en carbone dans les tiges des plants de maïs pour la récolte R2
(03/10/2011).. (A) : azote (en g.kg-1), avec la condition contrôle significativement différente de la
condition 2 m (ANOVA p<0,05). (B) : carbone (en g.kg-1). (C) : rapport C/N. Les valeurs des différents
graphes représentent les moyennes ± ET avec n=5. Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m,
correspondent à des plantes respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h
sur une durée de 60 jours. ................................................................................................................................ 66
Figure 23: Biomasses aériennes fraîche (A) et sèche (B) produites par des plants de maïs soumis à
un air ambiant ou enrichi en ozone. Les valeurs pour la biomasse aérienne fraîche représente la
moyenne ± ET avec n=64 pour les plants contrôles et les plants à 3,5m, n=63 pour les plants à 2m.
Les valeurs pour la biomasse aérienne sèche représentent la moyenne ± ET avec n=48 pour les
plants contrôle et les plants 3,5 m, n= 47 pour les plants à 2 m. Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2
m, correspondent à des plantes respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h
sur une durée de 60 jours. ................................................................................................................................ 67
Figure 24 : Indices de récolte déterminés sur des plants de maïs cultivés en air ambiant ou enrichi en
ozone. Les valeurs représentent la moyenne ± ET avec n=48 pour les plants contrôles et les plants à
3,5m ; n=47 pour les plants à 2m Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des plantes
respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de 60 jours...... 68
Figure 25 : Surface foliaire de plants de maïs soumis à un air ambiant ou enrichi en ozone. Les valeurs
représentent la moyenne ± ET avec n=16 (Contrôle, 2 m) et n=15 (3,5 m). Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m,
correspondent à des plantes respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée
de 60 jours. ............................................................................................................................................................ 68
Figure 26 : Surface foliaire de plants de maïs soumis à un air ambiant ou enrichi en ozone. Les valeurs
représentent la moyenne ± ET avec n=16 (Contrôle, 2 m) et n=15 (3,5 m). Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m,
correspondent à des plantes respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée
de 60 jours. ............................................................................................................................................................ 69 Figure 27 : Pourcentage de germination de semences récoltées sur des plants de maïs cultivés en air
ambiant ou enrichi en ozone. Les valeurs représentent le nombre de semences ayant germé à
différents intervalles de temps, avec n=16. Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à
des plantes respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de
60 jours. ............................................................................................................................................................... 70
Figure 28 : A : Assimilation nette (An en µmols.m-2
.s-1
) de plants de maïs soumis à un air ambiant ou
enrichi en ozone. Les moyennes sont établies sur des périodes de 10 jours (incluant les dates des
prélèvements P1-P4), les barres d’erreurs représentent les erreurs standards et n≥6. B : Conductance
stomatique (gs en mmol.m-2
.s-1
) du même matériel végétal que A. Les valeurs présentées sont des
moyennes de mesures étalées sur 10 jours, les barres d’erreurs représentent les erreurs standards et
n≥6. Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des plantes respectivement exposées,
au JJ 243, à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h. .............................................................................. 72
Figure 29 : Teneurs en protéine solubles totales (µg.mg-1
MF) dans la feuille de l'épi de plants de maïs soumis à
différentes concentrations d'ozone. Les valeurs représentent les moyennes ± ET, avec n≥3 P1, P2, P3 et P4,
prélèvements des tissus foliaires respectivement effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ; 223. Avec les conditions :
contrôle exposé à l’ozone ambiant ; 3,5 m exposé à 3,5 m de la rampe de fumigation ; 2 m exposé à 2 m de la
rampe de fumigation............................................................................................................................................. 73
Figure 30 : Teneurs en chlorophylles totales (µg.cm-²) dans la feuille de l'épi de plants de maïs soumis à
différentes concentrations d'ozone. Les valeurs représentent les moyennes ± ET, avec n=10, sauf pour les
échantillons du prélèvement P3 à3,5 m, dont les données sont manquantes. P1, P2, P3 et P4, prélèvements des
tissus foliaires respectivement effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ; 223. Avec les conditions : contrôle exposé à
l’ozone ambiant ; 3,5 m exposé à 3,5 m de la rampe de fumigation ; 2 m exposé à 2 m de la rampe de
fumigation ............................................................................................................................................................. 74
Figure 31: Activités endoprotéolytiques totales mesurées à différents pH réactionnels dans des extraits
protéiques préparés à partir de feuilles de l’épi de plants de maïs exposés à un air enrichi en ozone (2 m) et à
l’air ambiant (Contrôle). Les valeurs correspondent aux signaux de fluorescence (en unité arbitraire U.A) faisant
suite à la dégradation du substrat BODIPY-Caséine. ............................................................................................ 75
Figure 32 : Variations des activités endoprotéolytiques totales dans les feuilles de plants de maïs pendant la
période de fumigation à l'ozone. Les valeurs représentent la moyenne ± ES avec n=4. P1, P2, P3 et P4,
prélèvements des tissus foliaires respectivement effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ; 223. Avec les conditions :
contrôle exposé à l’ozone ambiant ; 3,5 m exposé à 3,5 m de la rampe de fumigation ; 2 m exposé à 2 m de la
rampe de fumigation............................................................................................................................................. 76
Figure 33 : Pourcentage d’inhibition (%) des activités endoprotéolytiques totales par des inhibiteurs de deux
classes d'endoprotéases. Les extraits protéiques ont été obtenus à partir de feuilles de plants de maïs soumis à
un air ambiant ou enrichi en ozone, sur une période de 60 jours. A : Inhibition des protéases à cystéine par le
E64. B : Inhibition des protéases à sérine par le Péfabloc. Les valeurs représentent la moyenne ± ET avec n=4. P1,
P2, P3 et P4, prélèvements des tissus foliaires respectivement effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ; 223. Avec les
conditions : contrôle exposé à l’ozone ambiant ; 3,5 m exposé à 3,5 m de la rampe de fumigation ; 2 m exposé à
2 m de la rampe de fumigation ............................................................................................................................. 78
Figure 34 : Teneur en ROS (fluorescence UA. G MF-1
) dans la feuille de l'épi de plants de maïs soumis à un air
ambiant ou enrichi en ozone sur une période de 60 jours. Les valeurs représentent la moyenne ± ET avec n≥3.
P1, P2, P3 et P4, prélèvements des tissus foliaires respectivement effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ; 223. Avec les
conditions : contrôle exposé à l’ozone ambiant ; 3,5 m exposé à 3,5 m de la rampe de fumigation ; 2 m exposé à
2 m de la rampe de fumigation ............................................................................................................................. 79
Figure 35 : Teneurs en groupements carbonyle sur les protéines solubles des feuilles de l'épi de plants de maïs
soumis à un air ambiant ou enrichi en ozone sur une période de 60 jours. Les valeurs représentent la moyenne ±
ET avec n=4. P1, P2, P3 et P4, prélèvements des tissus foliaires respectivement effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ;
223. Avec les conditions : contrôle exposé à l’ozone ambiant ; 3,5 m exposé à 3,5 m de la rampe de fumigation ;
2 m exposé à 2 m de la rampe de fumigation ....................................................................................................... 81
Figure 36 : Niveau de peroxydation lipidique dans la feuille de l’épi de plants de maïs soumis à un air ambiant ou
enrichi en ozone sur une période de 60 jours. exprimée en équivalents MDA (nmol.mL-1
). Les valeurs
représentent la moyenne ± ET avec n=4. P1, P2, P3 et P4, prélèvements des tissus foliaires respectivement
effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ; 223. Avec les conditions : contrôle exposé à l’ozone ambiant ; 3,5 m exposé à
3,5 m de la rampe de fumigation ; 2 m exposé à 2 m de la rampe de fumigation ................................................ 82
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Quantité moyenne d'eau (en litres), nécessaire à la production d'un kilogramme de
matière sèche. (Ressource CNRS – Dossier scientifique sur l’eau : usages-cultures, 2000) .................. 6
Tableau 2 : Récapitulatif des campagnes d’échantillonnages : dates, durées de fumigation, nomenclature et
organes prélevés. .................................................................................................................................................. 46
Tableau 3 : Inhibiteurs de protéases utilisés et classes de protéases inhibées ..................................................... 51
LISTE DES ABREVIATIONS
1-MCP 1-methylcyclopropène
ABA acide abscissique
ACC Aminocyclopropane 1-carboxylique
AOT40 Accumulated ozone exposure over a threshold of 40 ppb (moyennes horaires cumulées de concentration en ozone au-dessus de 40 ppb)
APX Ascorbate Peroxydase
AsA Ascorbate apoplastique
Ca Ci concentrations : atmosphériques, interne en CO2
Canaux anionique de type : R (rapidly deactivating) - S (slowly deactivating)
CFC Chlorofluocarbones
COV Composés organiques volatils
DHA Déhydroascorbate
ERPURS Evaluation des Risques de la Pollution URbaine sur la Santé
ET Ethylène
FACE Free-Air Carbon dioxyde Enrichment (système de fumigation à l’air libre)
GIEC Groupe d’Experts Intergouvernemental sur le Climat
GR Glutathion Réductase
gs conductances stomatiques
GSH glutathion réduit
GSSG Glutathion oxydé
H2O2 Peroxyde d'hydrogène
HO° Radical hydroxyle
IR Rayonnement infrarouge
JA Acide jasmonique
MCII métacaspase de type II
MDHA Monodéhydroascorbate
MDHAR Monodéhydroascorbate Réductase
NADP-ME enzyme malique à NADP
NO2 Dioxyde d’azote
NOx Oxydes d’azotes
O2-° Ion superoxyde
O3 Ozone
OMS Organisation Mondiale de la Santé
ORS Ile-de-France Observatoire régional de santé Ile-de-France
OTCs Open Top Chambers (Chambre à ciel ouvert)
PCD Programmed Cell Death (programme de mort cellulaire)
PEPc Phosphoénol Pyruvate Carboxylase
ppb Parties par milliards, en volume
ppm Parties par millions, en volume
ROS Reactive oxygene species (espèces réactives de l’oxygène)
Rubisco Ribulos-1,5-biphosphate carboxylase/oxygénase
SA Acide salicylique
SOD Superoxyde dismutase
SPAR Soil-Plant-Atmosphere Research
TRX Thioredoxine
UV Ultraviolets
Introduction
1
I] INTRODUCTION
L’ozone troposphérique, de part son rôle dans le forçage radiatif et son impact
sur les organismes, mérite doublement notre attention. De plus, c’est un polluant
photochimique secondaire d’origine anthropique dont les concentrations ont
dangereusement augmenté depuis le début du XXème siècle (Vingarzan, 2004). Il
apparait donc essentiel de renforcer les mesures limitant l’augmentation de ses
concentrations et d’approfondir nos connaissances sur la manière dont il affecte les
plantes. En effet, en plus des risques avérés pour la santé humaine (maladies
dégénératives, arthrose, troubles cardiaques, troubles nerveux, cancers) (Kampa
and Castanas, 2008)(Kampa and Castanas, 2008) l’impact de l’ozone sur les plantes
est connu depuis plusieurs décennies (Haagen-smit, 1952) et toujours pas
entièrement compris. Ses effets sur les couverts végétaux perturbent un certain
nombre de processus physiologiques et biochimiques essentiels au développement
des plantes. Par exemple, l’ozone entraine l’apparition de lésions foliaires, une
baisse de la photosynthèse et une diminution des rendements (Fiscus et al., 2005;
Wittig et al., 2007; Feng and Kobayashi, 2009). De plus, dans un contexte climatique
changeant son action détrimentale s’ajoute à celles d’autres contraintes
environnementales (Ehhalt et al., 2001). Ainsi, pour les espèces végétales cultivées,
les conséquences sociétales de l’intensification des effets de l’ozone pourraient être
dramatiques (Avnery et al., 2013) à cause de pertes économiques potentielles
(Avnery et al., 2011a) dans un contexte mondiale où la sécurité alimentaire est un
réel enjeu.
Les connaissances actuelles de l’impact de l’ozone sur les plantes C4 sont
limitées, y compris pour le maïs, qui est pourtant la céréale la plus cultivée au
monde. Les lacunes portent tant sur les conséquences que l’ozone peut avoir sur les
rendements, que sur celles affectant la physiologie et la biochimie de la plante.
Concernant les rendements, la seule relation exposition-réponse proposée dans la
littérature (Mills et al., 2007) n’est guère satisfaisante. Toutefois sur la base de celle-
ci, Avnery et al. (2011) projettent dans un futur proche des pertes de rendement pour
le maïs de l’ordre de 2,5% à 6%, selon les régions du globe. Approfondir nos
connaissances dans ce domaine permettrait d’une part de mieux comprendre les
2
risques pour le maïs et d’autre part de fournir des éléments qui aideront à la prise de
décision visant à limiter les conséquences de l’ozone sur cette culture.
L’ensemble du travail présenté dans ce mémoire de thèse a été supporté par
l’Agence Nationale de la Recherche (France) et prend part au projet VULNOZ (ANR-
08-VULN-012). La démarche expérimentale mise en place repose sur le suivi des
effets d’une exposition chronique à l’ozone de plants de maïs cultivés en champ. Les
résultats attendus ont pour ambition d’aider à mieux appréhender les risques que
l’ozone représente pour le maïs, en limitant au maximum les biais expérimentaux.
Pour ce faire, un dispositif original d’enrichissement de l’air en ozone, utilisant les
vents dominants comme agents de dispersion, a été mis en place en champ. De
plus, le maïs ayant un fort intérêt agronomique, notre travail s’est placé à différents
niveaux d’intégration dans le but de pouvoir répondre à des questions concernant
aussi bien la communauté scientifique que les acteurs du monde agricole, afin de les
aider dans leur prise de décision.
C’est pourquoi une première partie de notre travail s’est focalisée sur des
paramètres agronomiques et a consisté à décortiquer les effets sur le rendement. En
plus d’enrichir les connaissances sur les réponses du maïs à l’ozone, les résultats
obtenus pourraient permettre de mieux définir la part que cette grande culture
pourrait tenir dans les agroécosystèmes futurs. Toutefois, le rendement étant la
résultante de nombreux processus intermédiaires, il n’indique qu’une tendance
comportementale du maïs en réponse à l’ozone (sensible/tolérant). Une seconde
partie de notre étude a donc été consacrée à certains paramètres physiologiques et
biochimiques. Nous avons ainsi analysé d’une part, l’évolution des échanges gazeux
afin d’évaluer les réponses de la conductance stomatique à l’ozone et les
conséquences que pouvait avoir un influx d’ozone sur l’assimilation nette à l’origine
de la production de biomasse végétale. D’autre part, nous avons suivi les teneurs en
chlorophylles totales et en protéines foliaires solubles tout au long de la période
expérimentale afin d’avoir des indicateurs sénescence foliaire, chez les plants de
maïs exposés à l’ozone ambiant et aux atmosphères enrichies. Nous nous sommes
également intéressés à un certain nombre de paramètres susceptibles de varier en
réponse à un stress oxydant, tels que : les teneurs en ROS, la peroxydation lipidique
et la carbonylation des protéines foliaires. Enfin, dans l’optique de déterminer dans
3
quelle mesure les activités endoprotéolytiques foliaires pourraient être de bons
indicateurs de contrainte à l’ozone, nous avons mesuré les activités
endoprotéolytiques totales régulièrement pendant notre expérimentation et tenté de
déterminer la part d’activité spécifique due à deux classes de protéases
classiquement répertoriées comme majeures dans les processus de sénescence et
de réponses aux contraintes de l’environnement (les protéases à cystéine et sérine).
Ce mémoire de thèse se compose de quatre parties qui font suite à cette
introduction. La première partie correspond à une synthèse bibliographique sur les
conséquences du changement climatique et de l’ozone sur les plantes, avec un
focus sur le maïs lorsque la bibliographie existante le permet. Une deuxième partie
présente le matériel végétal étudié et le dispositif expérimental utilisé pour soumettre
les plantes à l’ozone, ainsi que les techniques mises en œuvre afin d’étudier les
conséquences de l’exposition à l’ozone sur le maïs. La troisième partie présente les
résultats obtenus au cours de notre étude. Enfin la dernière partie consiste en une
discussion de ces résultats et leurs confrontations avec les connaissances de la
littérature actuelle ainsi qu’avec les ambitions initiales de ce projet de thèse, dans le
but de proposer de nouvelles perspectives à ce travail.
Synthèse bibliographique
4
II] SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
II]-1 LE MAÏS
II]-1-1 GENERALITES
Le maïs (Zea mays L.), avec le sorgho et la canne à sucre, fait partie des
plantes dites en C4 à fort intérêt économique. Il occupe une place essentielle dans
l’alimentation humaine et animale et trouve ses origines, il y a de 7000 à 10 000 ans,
au Mexique avec la téosinte. Aujourd’hui, on le retrouve cultivé à travers le monde
(Source USDA) et il représente 41% de la production mondiale de céréales (d’après
l’Association Générale des Producteur de Maïs). Les usages qui en sont faits varient
avec les zones de culture. Dans les pays les plus pauvres, son usage premier
concerne l’alimentation humaine alors que dans les pays industrialisés, il doit
principalement son succès à son importance dans l’alimentation animale. Aux Etats-
Unis par exemple, c’est 80% de la production de maïs qui sont destinés au bétail
(Ahmad, 2012) et à de multiples autres usages annexes. Ainsi, il peut être valorisé
au travers de ses feuilles, de ses rafles ou de ses grains, comme matière première
pour la fabrication d’un certain nombre de produits tels que des édulcorants, de
l’huile, des boissons, de la colle, de l’alcool et surtout des agrocarburants ; cette
dernière application concerne environ 40 % de la production de maïs aux Etats-Unis
(Ranum et al., 2014)
Classiquement, la phénologie du maïs comprend deux grandes phases, la
phase végétative et la phase reproductive (Fig.1). Chacune de ces phases peut elle-
même être subdivisée en périodes plus courtes que l’on caractérise par le nombre de
feuilles pleinement développées. On note généralement Vn et Rn ces sous-phases (n
correspondant au nombre de feuilles). Toutefois, pour l’émergence du coléoptile, on
parle de VE et la fin de la phase végétative est notée VT, qui correspond au stade ou
l’inflorescence mâle ou panicule est parfaitement développée.
Synthèse bibliographique
5
Figure 1: Stades de développement du maïs (ressource FAO WATER)
II]-1-2 EXIGENCES CLIMATIQUES
Le maïs est une plante d’origine tropicale avec des exigences climatiques bien
définies. D’après la FAO (2015), il supporte difficilement les températures inférieures
à 10°C qui compromettent la germination. Cependant, un certain nombre de cultivars
existants à ce jour s’accommodent des climats tempérés, pendant les périodes
exemptes de gel et quand les températures journalières dépassent 15°C. Il reste
toutefois préférable de le cultiver dans des environnements où les températures
journalières dépassent 20°C afin d’éviter les problèmes associés à la maturation des
grains. Par ailleurs, si les températures sont optimales, la durée d’un cycle de culture
pour le maïs à grains est courte : de 80 jours pour les variétés les plus précoces à
140 jours pour les plus tardives. Les relations qui unissent un cultivar donné à la
température sont bien documentées et il est possible d’anticiper le développement
de la plante en faisant la somme des degrés jours (Bonhomme, 2000). Le maïs tolère
bien les températures élevées (jusqu’à 45°C) et les atmosphères sèches à condition
d’être correctement alimenté en eau, en particulier durant la floraison et la période de
Synthèse bibliographique
6
pollinisation. En effet, ces deux processus sont particulièrement sensibles aux
déficits hydriques édaphiques qui peuvent se développer rapidement du fait de la
superficialité du système racinaire. L’efficience de l’eau du maïs est toutefois assez
élevée en comparaison de celle d’autres grandes cultures comme l’orge, le blé, le
soja, la pomme de terre, le riz pluvial, ou le coton (Tableau 1). Cette particularité,
combinée à une grande surface foliaire et à une fixation du carbone de type C4, fait
du maïs la céréale présentant le potentiel de rendement en grain le plus élevé.
Tableau 1 : Quantité moyenne d'eau (en litres), nécessaire à la production d'un kilogramme de matière
sèche. (Ressource CNRS – Dossier scientifique sur l’eau : usages-cultures, 2000)
Maïs ensilage 238
Banane 346
Maïs grain 454
Orge 524
Pomme de terre 590
Blé
Soja 900
Riz pluvial 1600
Riz inondé 5000
coton 5263
II]-2 PLANTES ET CHANGEMENT CLIMATIQUE
Le Groupe d’Experts Intergouvernemental sur le Climat (GIEC) a mis en
évidence la responsabilité des émissions de gaz à effet de serre d’origines
anthropiques, dans l’augmentation globale des températures et du changement
rapide des conditions climatiques actuelles et de celles prévues pour le siècle à venir
(IPCC, 2013). Or, le développement, la physiologie et la biochimie des plantes sont
directement impactés par ces changements, en particulier par l’augmentation des
concentrations de CO2 et des températures et par la baisse de la disponibilité en eau
(Vörösmarty et al., 2010). Dans un contexte de croissance démographique record
associé à une exigence grandissante concernant la qualité et la quantité des
ressources alimentaires, il est primordial d’anticiper la façon dont ces perturbations
Synthèse bibliographique
7
environnementales peuvent impacter les grandes cultures, parmi lesquelles le maïs
occupe une place prépondérante. C’est pourquoi afin de mieux appréhender l’intérêt
potentiel du maïs dans ce contexte environnemental incertain, nous proposons une
revue succincte des principaux effets du changement climatique sur les plantes de
grandes cultures.
II]-2-1 PLANTES ET CO2
Depuis 1750, l’activité humaine est responsable d’une importante
augmentation des concentrations atmosphériques en CO2 qui sont passées de 270
µL.L-1 (ppb) avant l’ère industrielle, à 394 µL.L-1 en 2013. Les prévisions actuelles
tablent sur une accélération de l’élévation de ces concentrations, qui devraient
atteindre 550 µL.L-1 à la moitié du siècle et 800 µL.L-1 à la fin du siècle (Jin et al.,
2015)
Si dans certains cas ces concentrations élevées en CO2 inhibent l’assimilation
des nitrates (Ghannoum, 2009), il semble plus probable qu’elles puissent améliorer
les capacités photosynthétiques des plantes, agissant alors comme un « fertilisant »
(Kimball et al., 2002) Pour expliquer ce phénomène, il faut s’intéresser aux
mécanismes de fixation du carbone. Chez les plantes en C3, les augmentations de la
photosynthèse nette, de la biomasse et plus généralement des rendements en
réponse à des concentrations atmosphériques en CO2 élevées découlent de deux
propriétés de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase (Rubisco),
carboxylase responsable de la fixation du CO2. D’une part, l’enzyme n’est pas
saturée par les concentrations atmosphériques actuelles en CO2 (Ca). Une
augmentation de ces dernières a donc pour conséquence directe, une augmentation
de la vitesse de carboxylation dont découle une augmentation de la photosynthèse
nette et de la synthèse de matière organique. D’autre part, le CO2 est un inhibiteur
compétitif de la réaction d’oxygénation de la Rubisco. Une augmentation de sa
concentration limite donc la photorespiration et par là même les pertes nettes en
matière organique qui en découlent (Long et al., 2005). Ainsi, Kimball (1983),
prévoyait qu’une augmentation des concentrations en CO2 jusqu’à 550 µmol.mol-1
aurait pour conséquence une augmentation de 25 % des rendements chez les C3.
Cependant, à ce jour, aucune des augmentations de rendement observées lors
Synthèse bibliographique
8
d’expérimentations en chambre à ciel ouvert (Open Top Chambers, OTCs)
n’atteignent une telle valeur.
Chez les plantes en C4, les concentrations en CO2 dans la gaine périvasculaire sont
largement supérieures aux concentrations atmosphériques, saturant la Rubisco et
limitant également la compétition avec les réactions d’oxygénation. Ainsi, la
photosynthèse de ces espèces végétales est rapportée comme généralement
insensible aux augmentations de teneurs en CO2 atmosphérique (Ruiz-Vera et al.,
2015).
Cependant, Kim et al. (2007), ont observé, sur des maïs cultivés en chambre
de type Soil-Plant-Atmosphere Research (SPAR), des baisses de l’efficacité de la
carboxylation en réponse à un enrichissement de l’air en CO2. Les chercheurs
expliquent ces baisses par une « acclimatation » du cycle C4, correspondant à une
diminution de l’activité de la Phosphoénol Pyruvate Carboxylase (PEPc) et de
l’enzyme malique à NADP (NADP-ME), en réponse à l’enrichissement de l’air en
CO2. A l’inverse, certains modèles étudiant l’impact sur le rendement des plantes en
C4 et sur celui du maïs en particulier prévoient dans le cas d’élévations du CO2 à 550
µmol.mol-1, des augmentations allant jusqu’à 10 % (Long et al., 2005). Comme pour
les C3, ces prévisions n’ont pas été vérifiées en conditions expérimentales
d’enrichissement d’air libre en CO2 (Free-Air Carbon dioxyde Enrichment, FACE)
(Leakey et al., 2004; Leakey et al., 2006; Markelz et al., 2011), qui n’ont montré
aucune augmentation significative de rendement, malgré des conditions optimales de
culture (Long et al., 2005). L’étude la plus récente menée en FACE par Ruiz-Vera et
al. (2015), conclut elle aussi à une absence d’effet d’une atmosphère enrichie en
CO2 (les concentrations de CO2 ambiant étaient d’environ 390 µmol.mol-1, contre
environ 585 µmol.mol-1 pour les concentrations élevées de CO2), sur le maïs, que ce
soit sur la photosynthèse, les biomasses souterraines et aériennes ou le rendement.
De plus, cette étude, en adéquation avec les études en FACE antérieures (Leakey et
al., 2006; Markelz et al., 2011), met en évidence chez les plants de maïs cultivés en
atmosphère enrichie en CO2 des conductances stomatiques (gs) plus faibles
(réduction de l’ordre de 33%), ce qui semble indiquer que le seul effet positif que
pourrait avoir une augmentation des concentrations atmosphériques en CO2
passerait par une diminution de l’évapotranspiration.
Synthèse bibliographique
9
II]-2-2 PLANTES ET TEMPERATURE
Les plantes C4 sont sensibles aux variations de températures et de plus
présentent le plus souvent, des températures optimales de croissance bien
supérieures à celles des plantes C3 (Sage and Kubien, 2007). D’après Kim et al.
(2007), la photosynthèse foliaire répond à l’augmentation de température selon une
courbe gaussienne, avec un optimum à 34°C ; Ben-Asher et al. (2008), ont obtenu
des résultats similaires mais avec un maximum photosynthétique à 32°C (Fig.2). Sur
cette base, une augmentation des températures actuelles pourrait avoir un effet
positif sur l’assimilation du carbone chez le maïs. Cependant, ces augmentations de
la photosynthèse ne se traduisent pas nécessairement par des augmentations de
rendement. En effet, l’augmentation de la température et par conséquence celle de
la somme des degrés jours peut raccourcir le cycle de vie du maïs en limitant la
durée des phases de reproduction et de remplissage des grains (Badu-Apraku et al.,
1983; Muchow, 1989). De plus, les sensibilités du pollen et de l’albumen (pendant la
phase de division cellulaire) aux températures supérieures à 35°C, et la faible activité
de réplication des amyloplastes au-delà de 30°C (Hatfield et al., 2011) suggèrent
également que des élévations de température, tout en stimulant la photosynthèse,
n’entraîneront pas nécessairement des gains de rendement. Enfin, la croissance
foliaire est elle aussi affectée négativement par les hausses de températures. Kim et
al. (2007) ont mis en évidence que les surfaces foliaires maximales obtenues pour
des températures de 19/13°C (jour/nuit) ne sont pas atteintes pour des températures
de 31/25°C et 38,5/32,5°C (jours/nuit), même si la surface des feuilles s’accroît plus
précocement. En tenant compte de tous ces éléments d’information, Schlenker and
Roberts (2009), proposent finalement pour le maïs, le seuil de 29°C au-delà duquel
des pertes de rendement seraient observées, malgré l’écart avec l’optimum
photosynthétique de 32-34°C.
Synthèse bibliographique
10
Figure 2: Relation entre la photosynthèse nette et la température de la canopée pour le maïs
(Ben-Asher, 2008))
II]-2-3 PLANTES ET SECHERESSE
Malgré l’importance des plantes C4 dans le cycle global du carbone et pour la
sécurité alimentaire, les modifications de leurs capacités photosynthétiques en
réponse au déficit hydrique ont fait l’objet de peu d’études en comparaison de celles
menées sur les plantes C3.
La disponibilité en eau est sans aucun doute déjà une préoccupation majeure
pour la plupart des acteurs de l’agriculture à travers le monde. Les plantes C4 sont
réputées pour être plus tolérantes aux contraintes hydriques que les C3. Cependant
toutes les C4 ne réagissent pas de la même manière. Le sorgho par exemple, est
connu pour être plus résistant à la sécheresse que le maïs, ce qui serait du à son
réseau racinaire dense et s’enfonçant profondément dans le sol (Farré and Faci,
2006). Le maïs quant à lui est particulièrement sensible aux déficits hydriques
pendant la floraison (Çakir, 2004) et dans une moindre mesure, pendant la phase
végétative de part l’importance de la surface et de la vitesse de croissance de ses
feuilles qui favoriserait l’évapotranspiration (Kakani et al., 2011). Le maïs connaît
également, lors des périodes de sécheresse, une inhibition de la photosynthèse
Synthèse bibliographique
11
généralement attribuée à une fermeture stomatique (Foyer et al., 1998). L’effet de la
fermeture stomatique sur l’assimilation du CO2 n’est pas immédiat car les plantes C4
saturent leur Rubisco en CO2, même à de faibles concentrations en CO2
intercellulaire. De plus, les faibles quantités de CO2 résultant de la photorespiration,
généralement peu intense chez les C4, sont susceptibles d’être fixées avant de
diffuser hors de la gaine périvasculaire. Ces particularités structurales et
fonctionnelles propres aux C4 limitent les baisses de photosynthèse pendant une
sécheresse mais assurent aussi une reprise rapide de la photosynthèse dès la fin de
la contrainte hydrique (Foyer et al., 1998).
Les propriétés culturales du maïs, comme sa capacité à se développer sous
des températures élevées, son mode de fixation du carbone en C4 et l’efficience l’eau
qui en découle, le définissent comme une culture potentiellement tolérante au
changement climatique amorcé par l’intensification des activités anthropiques. De
plus, ces activités sont également responsables de l’augmentation des
concentrations en ozone troposphérique (O3) qui représente aujourd’hui et pour les
années à venir une menace pour les écosystèmes. Il est donc important de
s’interroger sur les impacts connus et/ou prévus de ce polluant phytotoxique sur le
rendement du maïs, ce qui sera fait après une brève description des origines de
l’ozone anthropique et de l’évolution des concentrations.
II]-3 L’OZONE ATMOSPHERIQUE
L’ozone est une molécule, formée de trois atomes d’oxygène, au fort pouvoir
oxydant. Sa facilité à réagir avec les autres composés de l’atmosphère terrestre fait
qu’on ne le trouve, le plus souvent, qu’à l’état de trace de 0 à 0,07 ppm selon
l’altitude. En effet, l’ozone connait une répartition verticale hétérogène et selon les
couches de l’atmosphère (Fig.3), il impacte différemment le vivant. En effet de part
son fort pouvoir oxydant (potentiel d’oxydation de 2,076 V), l’ozone peut réagir avec
de nombreux composés biologiques et perturber le fonctionnement des organismes
qui y sont exposés ; cependant ses propriétés d’absorption de la lumière ont un
impact considérable sur la chimie de l’atmosphère. D’une part il préserve la surface
terrestre des rayonnements ultraviolets (UV) et d’autre part il participe au forçage
radiatif en absorbant le rayonnement infrarouge (IR).
Synthèse bibliographique
12
Figure 3 : Répartition de l'ozone atmosphérique (Ressource NASA – Eath Observing System Plan Web)
II]-3-1 L’OZONE STRATOSPHERIQUE
Dans la stratosphère (entre 12 et 50 km d’altitude en moyenne), l’ozone est le
produit réactionnel de la rencontre d’une molécule de dioxygène et d’un atome
d’oxygène, lui-même issu de la photodissociation d’une molécule de dioxygène sous
l’effet de rayonnements UV ; de plus l’ozone peut être à son tour décomposé en
dioxygène par les rayonnements UV ce qui contribue à maintenir un équilibre
dynamique entre sa formation et sa dégradation. L’ozone stratosphérique représente
la majorité de l’ozone atmosphérique, près de 90 %, et forme ce qu’on appelle
couramment la couche d’ozone. Il est couramment admis que cette dernière a été
indispensable à l’évolution de la vie à la surface de la Terre et aujourd’hui elle est
indispensable à son maintien. En effet comme dit précédemment, l’ozone préserve le
vivant des effets nocifs des rayonnements solaires UV, en particulier ceux de courtes
longueurs d’ondes (de hautes énergies), comprises entre 100 et 280nm (Lodyga et
al., 2015). Toutefois depuis la fin des années 70, on constate une diminution de
l’ozone stratosphérique, en particulier au niveau des pôles, où l’on parle de trou dans
la couche d’ozone (Fig.4). Cette diminution est en grande partie due à la pollution par
Synthèse bibliographique
13
les halogénoalcanes, les oxydes d’azotes (NOx) et les chlorofluocarbones (CFC), qui
sous l’action des rayonnements UV se photodissocient et réagissent avec les
molécules d’ozone. Ces composés réduisent ainsi directement les teneurs en ozone
stratosphérique, mais également indirectement en absorbant une partie du
rayonnement UV, ce qui limite d’autant la photodissociation du dioxygène et donc la
régénération de l’ozone. Bien que des mesures aient été prises avec succès pour
réduire les émissions de CFC (Protocole de Montréal et de Kyoto, 1987 et 1997), la
grande stabilité de ces polluants fait qu’ils persistent plusieurs décennies dans
l’atmosphère.
La réduction de la couche d’ozone a de lourdes conséquences sur les
écosystèmes et les agrosystèmes. En effet, les UV filtrés moins efficacement et
l’altération du forçage radiatif due à l’ozone peut avoir de lourdes conséquences sur
la chimie de l’atmosphère. Certaines de ces conséquences sont directes et
concernent la santé des systèmes biologiques ; toutefois ces variations impactent le
bilan énergétique de la Terre et il est difficile d’en prévoir toutes les conséquences
indirectes Il a par exemple été établi que la diminution de la couche d’ozone affectait
les « patterns » des précipitations, les courants océaniques et aériens, ainsi que la
fonte des glaces, ce qui pourrait se traduire à la fois par des sécheresses sévères
dans certaines régions et des inondations dans d’autres (World Meteorological
Organization (WMO), 2014).
Figure 4 : Superficie annuelle maximale atteinte pour le trou de la couche d’ozone (ressource Ozone hole watch
NASA)
Synthèse bibliographique
14
II]-3-2 L’OZONE TROPOSPHERIQUE
II]-3-2-1 FORMATION
La troposphère qui s’étend de 8 à 16 km, selon que l’on se situe aux pôles ou
à l’équateur, rassemble l’essentiel de la masse d’air de l’atmosphère mais seulement
10 % de l’ozone total qui constitue, à ce niveau un polluant. Bien qu’il existe entre la
stratosphère et la troposphère des échanges d’ozone au niveau de la tropopause
(via les jet stream), l’essentiel de l’ozone troposphérique est issu de synthèses
locales par photochimie (Grewe, 2005). La faiblesse du rayonnement UV au niveau
de la troposphère limitent les réactions de formation similaires à celles qui
surviennent dans la stratosphère ; de plus l’ozone produit de cette façon reforme
rapidement du dioxygène (Bagard, 2008). La synthèse de l’ozone dans la
troposphère résulte donc principalement d’interactions entre les rayonnements UV et
des gaz issus d’activités anthropiques et/ou des composés organiques volatils (COV)
issus soient d’activités anthropiques soient des couverts végétaux. L’O3 est donc
qualifié de polluant photochimique secondaire.
Certaines activités industrielles et la circulation routière entrainent d’importantes
libérations d’oxydes d’azotes (NOx) dans la troposphère. Parmi ceux-ci, le monoxyde
d’azote (NO) réagit avec le dioxygène ambiant et forme du dioxyde d’azote (NO2) :
2 NO + O2 → 2 NO2
Ce dernier, sous l’effet du rayonnement UV de basses énergies, se photodissocie en
NO2 + hƲ → NO + O
L’atome d’oxygène libéré réagit avec une molécule de dioxygène pour former de l’O3 :
O + O2 → O3.
En absence de COV, l’ozone formé peut réagir de nouveau avec le NO, ce qui limite
son accumulation dans la troposphère :
O3 + NO → O2 + NO2.
Toutefois certains COVs court-circuitent le cycle de formation-destruction de l’ozone.
Ceux-ci réagissent en effet avec le dioxygène selon la réaction:
RH + O2 (COV) → RO2,
ces produits de réaction réagissent à leur tour avec le monoxyde d’azote :
RO2 + NO → RO + NO2,
entrant ainsi en compétition avec l’O3, ce qui entraine l’accumulation de ce dernier
Synthèse bibliographique
15
dans la troposphère (Jenkin and Clemitshaw, 2002).
II]-3-2-2 REPARTITION DE L’OZONE TROPOSPHERIQUE
De part les conditions de formation et d’accumulation de l’ozone, les
concentrations en ozone troposphérique présentent une hétérogénéité spatiale :
zones urbaines / zones rurales, et temporelle : journalière et saisonnière
(Domínguez-López et al., 2014). A l’origine de ces variations, une relation positive
entre rayonnement solaire et synthèse d’O3 et une relation négative entre teneurs
troposphériques en O3 et NOx. La synthèse de l’O3 a en effet lieu le jour, la nuit,
l’absence de rayonnement UV ne la permet pas et l’O3 accumulé est éliminé par
réaction avec le NO. Les différences d’intensités lumineuses entre les périodes
d’automne-hiver et printemps-été expliquent de la même façon les variations
saisonnières de concentrations en O3 troposphérique. En zone urbaine, les
émissions de NOx dues aux activités humaines sont élevées. Par exemple, le trafic
routier matinal libère une importante quantité de monoxyde d’azote qui permet
l’élimination de l’O3, alors que les températures plutôt basses ne permettent pas
l’émission de COV par les plantes, leurs présences se limitant à ceux d’origines
anthropiques. Les villes connaissent donc des concentrations en ozone maximales
lorsque les températures et l’ensoleillement sont élevés. Les pics d’ozone urbain se
rencontrent l’été, lors des périodes de fortes chaleurs durant lesquels la faiblesse des
vents favorise sa stagnation. Dans les zones périurbaines et rurales, le NO est
présent à des concentrations trop faibles pour éliminer totalement l’O3 synthétisé. De
plus, ces zones se caractérisent par une grande proportion de couverts végétaux,
sources importantes de COVs, auxquels viennent s’ajouter ceux d’origines
industrielles transportés par les vents depuis les centres urbanisés. Ceci entraîne
leur accumulation au-dessus des couverts végétaux, augmentant le risque
d’exposition des grandes cultures à l’ozone (Fig.5).
Synthèse bibliographique
16
Figure 5 : Répartition de l'ozone en Ile de France (Ressource Airparif - Dossier sur l'ozone)
II]-3-2-3 EVOLUTION DES CONCENTRATIONS EN OZONE
TROPOSPHERIQUE
Dans l’hémisphère Nord, la teneur basale moyenne en ozone troposphérique
est passée de 10-15 ppb au début du XXème à environ 35 ppb de nos jours
(Vingarzan, 2004; Fuhrer, 2009). La cause principale d’une telle augmentation est le
développement considérable des activités industrielles humaines depuis l’ère
préindustrielle, qui s’est traduit par une augmentation des émissions des précurseurs
de l’ozone (NOx et COVs). Le niveau basal d'ozone troposphérique continue
d’ailleurs d'augmenter, à hauteur de 0,3 ppb par an (Wilkinson et al., 2012). Cette
augmentation des niveaux d’ozone se voit également accompagnée de pics de
pollution. En Ile-de-France par exemple, les concentrations les plus élevées se
retrouvent dans le sud-ouest de la région et peuvent atteindre les 150 ppb (ressource
Airparif).
L’augmentation de l’activité anthropique s’accompagne également de
changements climatiques. Si rien n’est fait, ces derniers, devraient d’ici 2050 (IPCC,
2013), favoriser l’augmentation des concentrations moyennes d’O3, durant les
Synthèse bibliographique
17
périodes sensibles, au niveau des régions polluées et diminuer les concentrations
moyennes d’O3 au-dessus des océans tropicaux. Des mesures efficaces ont toutefois
été prises avec la signature du protocole de Montréal en 1987 par les pays
occidentaux (Amérique du Nord et Europe de l’Ouest) afin de réduire les émissions
de CFC (Solberg et al., 2005). En se basant sur des modélisations et en considérant
que les pays signataires respectent leurs engagements, d’ici 2050, les
concentrations moyennes d’O3 devraient alors avoir diminué durant les périodes les
plus sensibles et ce malgré le changement climatique. Cependant, dans les régions
où les législations sont moins contraignantes, les émissions de précurseurs de
l’ozone devraient continuer d’augmenter : ainsi en Amérique du Sud, en Asie et en
Afrique, on s’attend à des augmentations des niveaux d’ozone ambiant et des
fréquences des épisodes de pollutions (The Royal Society, 2008). En se basant sur
les évolutions prévisionnelles des teneurs en ozone dans les basses couches de
l'atmosphère (d'après les scénarios du GIEC), à l’échelle mondiale, les teneurs
basales en O3 devraient donc continuer d’augmenter jusqu’à atteindre des
concentrations de 35-48 ppb en 2040 et de 42-84 ppb en 2100 (Fig.6 ; (Vingarzan,
2004).
Synthèse bibliographique
18
Figure 6 : Evolution de la concentration en ozone troposphérique depuis 1840 et prévision jusqu’en 2100.
Les barres d'erreurs correspondent aux différents scénarios IPCC. D'après Vingarzan (2004).
II]-4 IMPACT DE L’OZONE TROPOSPHERIQUE SUR LA SANTE
HUMAINE
L’ozone est un gaz irritant oxydant capable de pénétrer le système respiratoire.
Ses effets connus sur la santé humaine dépendent à la fois des concentrations dans
l’atmosphère, des quantités inhalées et de la durée d’exposition. Cependant, il est
difficile d’anticiper toutes les conséquences que pourrait avoir l’ozone sur notre
organisme. En effet, comme celui de l’ensemble des eucaryotes, notre métabolisme
génère en continu des radicaux libres, dans un contexte « normal » et cette
Synthèse bibliographique
19
production peut être exacerbée par le contact avec des polluants tels que l’ozone. Le
problème étant que, si les concentrations en radicaux dépassent un certain seuil,
l’organisme entre dans un état de stress oxydant qui peut être à l’origine d’un large
panel de maladies dégénératives, d’arthrose, de troubles cardiaques, de troubles
nerveux, de cancers… (Kampa and Castanas, 2008). Le programme d’Evaluation
des Risques de la Pollution URbaine sur la Santé (ERPURS), initié en 1990 et mis en
place par l’Observatoire régional de santé Ile-de-France (ORS Ile-de-France), a mis
en évidence une augmentation de 6,1% de la mortalité liée à des problèmes
respiratoires et cardiovasculaires pendant les périodes de forte pollution à l’ozone.
L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a récemment réévalué les risques que
peut représenter une exposition à l’ozone pour la santé humaine (World Health
Organization, 2013). Si les synthèses précédentes mettaient l’accent sur l’impact des
pics de pollutions, cette dernière revue relève la difficulté à déterminer des seuils en
deçà desquels l’ozone ne serait pas dangereux et suggère plutôt que les
concentrations ambiantes d’ozone représentent une menace permanente pour la
santé.
En France, les effets de l’ozone sur la santé ont poussé les autorités à mettre
en place des niveaux d’alerte reposant sur les concentrations en ozone
troposphérique. Le premier niveau correspond à un seuil d'information et de
recommandation, il est atteint lorsque les moyennes horaires des concentrations en
ozone ambiant dépassent 180 µg.m-3 (environ 90 ppb). Les niveaux d’alerte plus
élevés sont définis par trois seuils :
Le 1er seuil est atteint lorsque les moyennes horaires dépassent 240 µg.m-3
(environ 120 ppb).
Le 2ème seuil est atteint lorsque les moyennes horaires dépassent 300 µg.m-3
(environ 150 ppb) pendant 3 heures consécutives.
Le 3ème seuil est attient lorsque les moyennes horaires dépassent les 360
µg.m-3 (environ 180 ppb).
II]-5 IMPACT DE L’OZONE TROPOSPHERIQUE SUR LES COUVERTS
VEGETAUX
(Haagen-smit, 1952) sont les premiers à mettre en évidence l’effet nocif de
Synthèse bibliographique
20
l’ozone sur les plantes. Depuis la publication de leurs travaux, la phytotoxicité de
l’ozone a fait l’objet de nombreuses études. Il est aujourd’hui considéré comme le
premier polluant mondial pour les plantes. Bien qu’à l’échelle des temps géologiques,
l’O3 reste une contrainte très récente, les recherches menées sur ses effets ont tout
de même permis de mettre en évidence une variabilité dans la sensibilité à l’ozone,
au sein d’un petit groupe d’espèces végétales considérées : les plantes qualifiées de
sensibles (blé, tomate, soja…), les plantes modérément tolérantes (parmi lesquelles
le maïs a été placé) et les plantes résistantes (orge, fraisier…) (Mills et al., 2007).
Comme c’est le cas pour toute contrainte environnementale, la réponse des plantes
dépend de leur sensibilité intrinsèque mais également des modalités de la contrainte
subie. Lorsque celle-ci correspond à des concentrations élevées pendant un laps de
temps court, on parle alors d’une exposition aigüe. On parle d’exposition chronique
lorsque l’exposition est régulière et correspond à des doses d’ozone plus ou moins
élevées. Dans les deux situations, les rendements des cultures considérées sont
limités. Des expositions chroniques entraînent souvent une réduction de la
photosynthèse et une accélération de la sénescence alors que des expositions
aigües conduisent à des réponses des plantes s’apparentant à des réponses
d’hypersensibilité incluant des lésions foliaires par mort cellulaire programmée, telles
que celles causées par des agents pathogènes (Castagna and Ranieri, 2009).
La sélection variétale et les techniques culturales visant à optimiser les
rendements amplifient involontairement l’effet délétère de l’ozone sur les grandes
cultures, car pour favoriser l’assimilation du carbone par les plantes, des
conductances stomatiques élevées sont recherchées. Or ces dernières augmentent
le flux entrant d’ozone dans les tissus foliaires. De plus, les périodes de croissance
des principales grandes cultures céréalières coïncident avec les périodes où les
teneurs en ozone troposphérique sont maximales (Cf Répartition de l’ozone
troposphérique). Par exemple, en Ile-de-France, durant la période estivale et lorsque
les conditions climatiques sont favorables à son accumulation, il n'est pas rare de
dépasser les 90 ppb d’ozone et plus ponctuellement d'atteindre les 150-180 ppb
(Source Airparif). Les plantes cumulent donc les effets d’une exposition chronique
avec ceux consécutifs des pics d’ozone, ce qui peut doublement affecter la
physiologie de la plantes et à terme son rendement.
Synthèse bibliographique
21
II]-5-1 PHENOLOGIE ET SENSIBILITE A L’OZONE
La phénologie des plantes joue un rôle dans leur sensibilité aux contraintes de
l’environnement. Ainsi, il est admis que la période de reproduction et plus
spécifiquement celle de la floraison sont les périodes les plus critiques dans le cycle
de vie d’une plante (Black et al., 2000). Ceci serait d’autant plus vrai dans le cas des
céréales dont les rendements dépendent directement de la fécondation. Pleijel et al.
(1998) ont observé qu’une surexposition à l’ozone durant la période s’étalant de
l’anthèse à la fin du remplissage des grains avait pour conséquence une baisse des
rendements en grain significative chez le blé tendre. Des perturbations de la
germination des pollens et de la croissance du tube pollinique, de la floraison et de la
fécondation ont ainsi été rapportées (Black et al., 2000). Une exposition à l’ozone
durant la phase végétative peut également avoir un impact négatif sur le rendement
du blé tendre. Le polluant, en limitant la fixation du carbone durant cette période,
compromettrait le remplissage des grains par translocation de carbone (Mulholland et
al., 1997-1998). Dans leur méta-analyse, Black et al. (2000) confirment l’impact
potentiel de l’ozone tout au long du cycle de développement des plantes et chiffrent
les pertes de rendement chez de nombreuses espèces cultivées. Toutefois, certaines
espèces, comme Brassica napus et B. campestris présentent des rendements en
grains non impactés par une exposition à l’ozone, alors que les tissus végétatifs ne
sont pas épargnés. Cela suggère l’existence de mécanismes de compensation entre
tissus végétatifs et reproducteurs, en faveur de l’investissement reproducteur (Black
et al., 2007)
II]-5-2 IMPACT DE L’OZONE TROPOSPHERIQUE SUR LE MAÏS
Le maïs est la céréale la plus cultivée au monde, devant le blé (Source
USDA). Les pertes potentielles de rendement chez le maïs, en réponse aux
concentrations croissantes d’ozone représentent donc de possibles menaces pour la
sécurité alimentaire dans le monde. Bien qu’il soit primordial d’évaluer l’impact que
l’ozone pourrait avoir sur cette culture, les études traitant de ce sujet sont rares.
(Leitao et al., 2007a-b) sont les premiers à étudier l’impact de l’ozone troposphérique
sur des plants de maïs cultivés en chambre à ciel ouvert (Open Top Chambers,
OTCs), d’un point de vue physiologique et biochimique. Leurs résultats montrent que
Synthèse bibliographique
22
les activités Rubisco et PEPc diminuent en réponse à l’ozone tout comme la
production de biomasse aérienne. Bien que la rareté des études traitant de l’effet de
l’ozone sur le rendement du maïs soit un frein à leur compréhension, il existe une
fonction exposition-réponse pour l’ozone (en AOT40) et le rendement du maïs (voir
ci-dessous) (Mills et al., 2007).
Y= -0.0036x + 1.02 (r²=0.35)
D’après cette relation, une exposition à un AOT40 de 13,9 ppm.h (niveau critique)
pendant trois mois, entraîne des pertes de rendement de 5%, ce qui classe le maïs
parmi les espèces modérément tolérantes à l’ozone (Mills et al., 2007).
En se basant sur cette relation pour établir des modèles d’impact globaux,
Van Dingenen et al. (2009) ont montré que les pertes en rendement des grandes
cultures (dont le maïs) imputables à l’ozone sont supérieures à celles dues au
changement climatique. De même, Avnery et al. (2011a-b), se basant sur cette
même relation, abordent la question de l’impact de l’ozone sur le rendement global
du maïs, de nos jours et dans les décennies à venir. Les pertes de rendement, dues
à l’ozone, sont d’une part estimées pour l’année 2000 et d’autre part projetées pour
l’année 2030, en fonction de différents scénarios climatiques établis par le GIEC.
Pour l’année 2000, l’estimation de la perte de rendement global pour le maïs varie
entre 2,2% à 5%. Pour l’année 2030 les pertes de rendement sont estimées entre
2,5 et 6% (Fig.11).
Synthèse bibliographique
23
Figure 7 : Perte en rendement relative à l'ozone pour les années 2000 (A) et 2030 (B) d’après le scénario
A2 du GIEC (Avnery et al. 2011)
II]-5-3 SYMPTOMES FOLIAIRES
Les symptômes foliaires furent les premiers témoignages de l’effet de l’O3 sur
les plantes (Haagen-smit, 1952). Ils peuvent se traduire par des taches chlorotiques
ou nécrotiques réparties en pointillés sur les feuilles, et/ou par une augmentation des
teneurs en anthocyanes (Fig.7 ) (Wilkinson et al., 2012; Singh et al., 2014b). Ces
symptômes correspondent à une accumulation de radicaux libres qui agissent
directement sur l’intégrité des cellules ou se comportent comme des molécules signal
Synthèse bibliographique
24
entrainant des phénomènes de mort cellulaire (Iriti and Faoro, 2007; Tamaoki, 2008).
Ce type d’altérations foliaires a fréquemment été observé en Amérique du Nord et en
Europe, où les cultures irriguées méditerranéennes sont les plus touchées (Ashmore,
2005) mais également en Asie (Singh et al., 2014a). De tels dégâts visibles ont des
conséquences négatives sur les rendements des plantes cultivées car ils
correspondent à une diminution de la surface foliaire fixatrice de carbone. De plus,
les pertes de rendement sont encore plus sévères pour les cultures dont la biomasse
aérienne représente le produit récolté (laitue, luzerne, maïs...), ou pour les plantes
horticoles dont l’aspect général détermine la valeur marchande (Wilkinson et al.,
2012).
Figure 8 : Dommages sur la biomasse aérienne du maïs, induits par une surexposition à l'ozone. (Singh et
al., 2014)
L’ozone représente un risque pour les plantes, cependant comme dit
Synthèse bibliographique
25
précédemment, elles présentent différents niveaux de sensibilité. Afin de comprendre
à quoi sont dues ces différences de vulnérabilité, nous proposons une rapide
approche du devenir de l’ozone dans les tissus foliaires et les mécanismes de
défenses dont dispose les végétaux pour lutter contre l’ozone.
II]-5-4 EFFETS «CELLULAIRES»
II]-5-4-1 ENTREE DE L’OZONE DANS LES FEUILLES
Pour comprendre les effets nocifs de l’ozone sur les rendements des cultures,
il est nécessaire de comprendre comment il pénètre dans les tissus. La perméabilité
de la cuticule des feuilles étant quasiment nulle (Kerstiens and Lendzian, 1989), c’est
par les stomates que l’O3 pénètre dans la cavité sous-stomatique. Il est largement
admis que la première défense des plantes correspond d’ailleurs à une fermeture
des stomates, ce qui constituerait une stratégie d’évitement (Pearson, 1995;
Overmyer et al., 2008). Ainsi, le nombre de stomates, leur taille et leur ouverture
régulent l’intensité des flux d’O3 depuis le milieu extérieur vers la cavité sous-
stomatique.
La fermeture des stomates dépend du fonctionnement des cellules de gardes
dont l’activité dépend elle-même des canaux ioniques. Chez Arabidopsis thaliana,
par exemple, l’une des premières réponses de la plante à une exposition à l’ozone,
est l’augmentation de l’activité des canaux calciques (de la membrane plasmique et
du tonaplasme) en réponse à la présence de ROS. Ceci entraîne une augmentation
des teneurs en calcium cytosolique dans les cellules de gardes, à l’origine de leur
fermeture (Evans et al., 2005; Fiscus et al., 2005). Les canaux anioniques jouent
également un rôle essentiel dans la régulation de la conductance stomatique. Deux
types en particulier permettent la fermeture stomatique en réponse à l’ozone : ceux
de type R (rapidly deactivating) et ceux de type S (slowly deactivating) (Vainonen and
Kangasjärvi, 2015). Cependant la réponse des stomates à l’ozone peut s’avérer plus
complexe.
Par exemple, Vahisalu et al. (2010) ont mis en évidence chez Arabidopsis
thaliana, qu’une exposition à 250 nL.L-1 d’ozone entraîne une diminution de 40% de
Synthèse bibliographique
26
la conductance stomatique en moins de 10 minutes. Cet effet s’estompe dans les 40
minutes qui suivent (Fig.8) et précède une nouvelle diminution de la conductance
stomatique qui pourrait correspondre aux effets de l’ozone sur les stomates
généralement rapportés dans la littérature. L’usage de mutants slac1 a permis de
mettre en évidence l’importance des canaux anioniques de type S dans la réponse
rapide des stomates à l’ozone.
Notons également que dans certains cas, l’ozone est responsable de
perturbations dans le processus de fermeture des stomates (Mills et al., 2009;
Wilkinson and Davies, 2010), ce qui facilite l’influx du polluant à l’intérieur des tissus
foliaires. Par exemple, dans le cas d’études combinant une exposition à l’ozone et
des contraintes connues pour réduire la conductance stomatique, (sécheresse,
augmentation du CO2 atmosphérique), l’effet protecteur attendu n’est pas aussi
efficace que celui prévu par les modèles de conductance stomatique et des réponses
stomatiques ralenties sont observées (« Sluggishness »).
Figure 9 : Induction par l'ozone d'une décroissance rapide de la conductance stomatique
(Vahisalu et al., 2010)
Dans tous les cas, la fermeture des stomates n’est jamais immédiate et
Synthèse bibliographique
27
complète dès le début d’une exposition à de fortes concentrations en ozone. Ainsi,
des molécules du polluant se retrouvent dans les tissus foliaires, plus précisément
dans les chambres sous-stomatiques où elles peuvent : 1) réagir avec les parois et
membranes cellulaires, selon des réactions d’ozonolyse qui entraînent des
peroxydations lipidiques et une altération de la fluidité membranaire ; 2) se
décomposer spontanément en espèces réactives de l'oxygène (ROS, Reactive
oxygene species) telles que le peroxyde d'hydrogène (H2O2), l'ion superoxyde (O2-°)
et le radical hydroxyle (HO°) (Castagna and Ranieri, 2009; Caregnato et al., 2013). A
notre connaissance, les paramètres influençant l’équilibre entre les points 1) et 2) ne
sont pas encore connus.
II]-5-4-2 SYSTEMES ANTIOXYDANTS : DETOXICATION DES ROS
Les plantes disposent d’autres mécanismes de défense que la régulation
stomatique, pour faire face à l’ozone. L’un d’entre eux consiste à mettre en œuvre
leurs capacités de détoxication des ROS, via par exemple, les réactions du cycle
d’Halliwell-Asada-Foyer (Fig.9) qui représentent d’une manière générale la principale
voie métabolique de prévention des stress oxydants (Castagna and Ranieri, 2009).
L’ascorbate apoplastique (AsA) est considéré comme le principal anti-oxydant
permettant de lutter contre les sous-produits de l’O3, en présence desquels il est
oxydé en déhydroascorbate (DHA) (Foyer and Noctor, 2009). L’AsA peut également
servir de substrat à l’Ascorbate Peroxydase (APX) qui réduit l’H2O2 en H2O et produit
du Monodéhydroascorbate (MDHA). Le MDHA peut être recyclé par réduction en AsA
dans le cytosol grâce à la Monodéhydroascorbate Réductase (MDHAR), réaction
consommant une molécule de NADPH2 issue de la photosynthèse. Toutefois, si la
charge oxydante est élevée, l’AsA présent dans l’apoplasme ne suffit pas à éliminer
l’excès de ROS et à prévenir les risques pour la plante. Le pool d’AsA apoplasmique
peut être rapidement renforcé par transfert d’anti-oxydants provenant du cytosol,
compartiment dans lequel l’activité déhydroascorbate réductase (DHAR) permet la
régénération du DHA en AsA grâce à l’oxydation d’une molécule de glutathion réduit
(GSH). Le GSH peut également réagir directement avec les ROS cytoplasmiques.
Dans toutes ces réactions d’oxydoréduction, c’est la forme réduite GSH qui est
impliquée et qui se retrouve oxydée (GSSG). Le GSH peut être régénéré par la
Synthèse bibliographique
28
Glutathion Réductase (GR) et une molécule de NADPH2 issu de la photosynthèse
(Foyer and Noctor, 2011). Les ROS qui n’ont pas été neutralisés par les mécanismes
de détoxication apoplasmiques peuvent diffuser vers le cytosol et créer un
environnement pro-oxydant à l’intérieur des cellules et entraîner une néosynthèse de
ROS endogènes dont certains jouent le rôle de molécules signal (Suzuki et al., 2011).
Ce processus de génération de ROS peut se propager dans le cytoplasme et affecter
les mitochondries, les peroxysomes et les chloroplastes. De plus, temporellement, il
peut se poursuivre au-delà de l’épisode de pollution, occasionnant des séries de
vagues de radicaux libres qui, similairement à des réactions en chaîne, atteignent les
cellules voisines. Ce phénomène est appelé «burst oxydatif ». Il est comparable à
celui déclenché lors de la réaction d’hypersensibilité à certains pathogènes, qui se
traduit par des altérations des protéines membranaires et pariétales et peut aboutir
au programme de mort cellulaire (Programmed Cell Death, PCD) (Joo et al., 2005;
Kangasjärvi et al., 2005) et à l’émission de molécules signal (Langebartels et al.,
2002). A l’échelle macro-cellulaire, il en résulte un ensemble de dommages foliaires,
tels que des nécroses, une sénescence précoce et l’abscission des feuilles (Leitao et
al., 2007a; Bagard, 2008).
Figure 10 : Cycle Halliwell-Asada-Foyer ; Réactions d'oxydo-réduction dans une cellule végétale en
réponse à l'ozone (Castagna & Ranieri, 2009).
Synthèse bibliographique
29
II]-5-5 REGULATION HORMONALE
En plus de leurs effets potentiellement négatifs sur le métabolisme cellulaire,
les ROS jouent également des rôles dans la signalisation, notamment dans les voies
de réponse de certaines phytohormones. En effet, en réponse à la présence d’O3
et/ou de ROS, les phytohormones jouent des rôles importants dans la mise en place
des mécanismes de transduction du signal et du PCD. Il n’est donc pas surprenant
de constater leur accumulation chez les plantes surexposées à l’ozone (Kangasjärvi
et al., 2005). Ainsi, l’éthylène (ET) favorise la production des ROS endogènes et des
lésions tout comme l’acide salicylique (SA), qui est également impliqué dans la
régulation du PCD ; l’acide jasmonique (JA) quant à lui s’oppose à la propagation
des lésions et contribue à contenir le processus de PCD ; enfin l’acide abscissique
(ABA) influence l’ouverture des stomates (Overmyer et al., 2003; Kangasjärvi et al.,
2005; Overmyer et al., 2008).
II]-5-5-1 ETHYLENE
L’éthylène est connu pour répondre aux stress biotiques et abiotiques ; il est
également connu pour son implication majeure dans les processus de maturation,
d’abscision et de sénescence accélérée (Wagstaff et al., 2002; Koyama, 2014). Ce
dernier point est confirmé par l’étude de Lim et al. (2007) qui rapportent le cas de
deux mutants d’A. thaliana, ethylene-resistant 1 (etr1) et ethylene-insensitive 2 (ein2).
Ils connaissent tous deux des retards de sénescence et se caractérisent
respectivement par des défauts dans la perception de l’éthylène et par des défauts
dans la transduction du signal. Ces observations confirment l’importance de l’ET
endogène dans les processus de sénescence. Lors d’une exposition à l’ozone, l’une
des premières réponses transcriptionnelles est l’induction des gènes codant pour la
synthèse de l’éthylène ou pour celle de son précurseur immédiat, l’acide 1-
aminocyclopropane 1-carboxylique (ACC) (Langebartels et al., 2002; Overmyer et al.,
2008). L’ET étant connu également pour ses effets inhibiteurs sur la croissance des
tiges et des racines, il a été suggéré que l’effet de l’ozone sur la perte de biomasse
aérienne et racinaire pouvait être due à l’ET plutôt qu’à une diminution de la fixation
du carbone ou tout du moins à une combinaison de ces deux effets (Wilkinson et al.,
Synthèse bibliographique
30
2012). L’augmentation des teneurs en ET induite par l’ozone serait également
responsable de la réduction de sensibilité des stomates à l’ABA et donc de l’action
négative de l’ozone sur la fermeture stomatique de certaines espèces végétales
(Wilkinson and Davies, 2009-2010). Il semble que ce soit le cas chez l’astéracée
Leontodon hispidus, chez qui les stomates en réponse à l’ozone perdent leur
sensibilité à l’ABA, ce qui les empêche de fermer leurs stomates. Toutefois les
plantes prétraitées au 1-methylcyclopropène (1-MCP), un antagoniste de l’éthylène
retrouvent leur sensibilité à l’ABA et régulent normalement leur conductance
stomatique, démontrant ainsi l’impact négatif de l’ET sur la fermeture stomatique
(Wilkinson and Davies, 2009-2010).
Yoshida et al. (2009) ont mis en évidence chez des mutants d’A. thaliana ein2
l’existence de fortes teneurs en radicaux O2-° en réponse à l’ozone (pas chez le
phénotype sauvage Col-0). Contrairement aux précédents, ces résultats suggèrent
une action protectrice de l’éthylène face à l’ozone. Pour approfondir cette idée, les
auteurs ont réalisé une analyse macroarray dont les résultats montrent un effet positif
de l’éthylène sur le métabolisme du glutathion réduit. L’action protectrice de l’ET
contre l’ozone semble impliquer une synthèse de novo de GSH, ce qui est confirmé
par une augmentation des teneurs en GSH chez Col-0. Ainsi Yoshida et al. (2009)
avancent l’hypothèse d’une concentration optimale d’éthylène pour expliquer les
réponses contradictoires observées chez les plantes surexposées à l’ozone.
II]-5-5-2 ACIDE SALICYLIQUE
D’une manière générale, l’acide salicylique (SA) est impliqué dans le
déclenchement du processus de PCD. Le rôle de cette hormone en réponse à
l’ozone a été établi grâce aux travaux menés sur des plants d’A. thaliana, NahG qui
dégradent le SA (Rao and Davis, 1999) et npr1 qui sont insensibles à SA (Overmyer
et al., 2003; Kangasjärvi et al., 2005). Pour ces deux génotypes, l’induction du PCD
induite par traitement à l’ozone a été supprimée. Toutefois, comme pour l’ET, les
effets de l’acide salicylique sont dépendants de la concentration : l’hormone est
nécessaire à la plante pour affronter les différents stress auxquels elle est soumise
mais une accumulation de SA déclenche le PCD.
Synthèse bibliographique
31
II]-5-5-3 ACIDE JASMONIQUE
Contrairement aux composés présentés précédemment, l’acide jasmonique
(JA) est une phytohormone connue pour limiter les lésions foliaires induites par
l’ozone. Encore une fois, ceci a été établi chez des mutants d’A. thaliana affectés
dans la voie de signalisation à JA et qui sont le plus souvent hyper-sensibles à
l’ozone (Tamaoki, 2008). Sa propriété d’inhibition des lésions foliaires passerait par
son action antagoniste à celle de l’éthylène. Tuominen et al. (2004) ont étudié
comment l’ET et le JA influencent le développement des lésions foliaires en réponse
à l’ozone. Ils ont démontré que l’effet protecteur de l’acide jasmonique est en partie
dû au fait qu’il s’oppose à l’action de l’éthylène en bloquant la voie de signalisation à
l’ET au niveau de ses récepteurs (Fig.10). Toutefois, le mutant JA-insensitive (jin1)
est lui tolérant à l’ozone, ce qui suggère que JA joue lui aussi des rôles contrastés
dans la réponse des plantes à l’ozone (Kangasjärvi et al., 2005).
De plus, Tosti et al. (2006) ont montré sur Arabidopsis une réponse précoce de JA à
l’ozone. Ils ont en effet identifié cinq gènes de la voie de biosynthèse de JA qui sont
surexprimés peu de temps après le début de l’exposition à l’ozone. (Castagna et al.,
2007) ont quant à eux observé chez la tomate une accumulation des transcrits AOS2
et AOC (d’autres gènes de biosynthèse de JA).
Figure 11 : Regulation de la mort cellulaire, induite par l'ozone, par l'antagonisme réciproque
de l'éthylène et l'acide jasmonique (Tuominen et al., 2004)
Synthèse bibliographique
32
II]-5-5-4 ACIDE ABSCISSIQUE
Comme on l’a indiqué précédemment l’effet de l’ozone sur les stomates est
variable : il semble pouvoir déclencher ou gêner leur fermeture, ce qui limite ou
facilite son entrée dans les tissus foliaires. Compte tenu du rôle prépondérant de
l’acide abscissique (ABA) dans la régulation de la fermeture stomatique, il semble
justifié d’étudier son métabolisme en réponse à une exposition à l’ozone. Il a ainsi
été mis en évidence que l’ozone entraînait, chez certaines plantes, la synthèse de
novo d’ABA. Par exemple, la fabacée Pueraria thomsonii Benth. synthétise
rapidement de l’ABA en fonction de la concentration en polluant (Sun et al., 2012).
Des mutants d’A. thaliana insensibles à l’ABA ont permis d’établir le rôle protecteur
joué par cette phytohormone dans la réponse des plantes à l’ozone. Par exemple
chez le mutant abi2-1 qui exprime une version non fonctionnelle de la phosphatase
ABI2 indispensable à la réponse à l’ABA, une exposition à l’ozone n’entraîne pas la
fermeture des stomates, contrairement à ce qui est observé chez le phénotype
sauvage (Vahisalu et al., 2010). Toutefois cette fonction protectrice peut être
amoindrie par l’ET qui réduit la sensibilité des stomates à l’ABA, comme on l’a vu
précédemment (Mills et al., 2009).
Cette approche des rôles de l’éthylène de l’acide salicylique, de l’acide
jasmonique et de l’acide abscissique dans la réponse des plantes à l’ozone est sans
doute un peu simpliste compte tenu de leurs nombreuses interactions. L’étude
récente de Xu et al. (2015) sur des mutants A. thaliana suggère en effet une action
combinée (agonistes et antagonistes) des phytohormones dans la régulation des
ROS apoplastiques, du PCD et des changements dans l’expression des gènes en
réponse à l’ozone.
II]-6 MODIFICATION DES PROTEINES EN REPONSE AUX STRESS
OXYDANTS
Les cellules végétales produisent continuellement des ROS comme composés
secondaires du métabolisme aérobie. L’impact des stress environnementaux se
Synthèse bibliographique
33
traduit généralement par une augmentation de la production de ROS endogènes.
Les ROS peuvent réagir avec l’ensemble des macromolécules (ADN, ARN, lipides,
protéines…) (Iriti and Faoro, 2007). Parmi celles-ci, les protéines semblent
particulièrement sensibles et constituent des marqueurs fiables du stress oxydant.
Compte tenu de leurs rôles clefs dans les processus physiologiques des cellules
vivantes (catalyse, réception chimique, architecture cellulaire), toute modification des
protéines par oxydation peut s’avérer néfaste. Néanmoins, ces modifications peuvent
également servir à lutter contre les dommages oxydatifs en contribuant à la
transduction de signaux (Foyer and Noctor, 2011). Les plantes semblent en effet
disposer de systèmes de perception leur permettant de distinguer l’origine des ROS
et d’adapter leurs réponses en induisant l’expression spécifique de gènes dans les
compartiments cellulaires concernés (Gadjev et al., 2006). Si le fonctionnement de
ces systèmes est encore méconnu, une des hypothèses avancées est que ce sont
les peptides issus de la dégradation des protéines oxydées qui jouent le rôle de
messagers secondaires des ROS et permettent la spécificité du signal. L’origine des
protéines dégradées informe sur la localisation du stress oxydant, le nombre de
peptides détectés traduit quant à lui l’intensité du stress et enfin le type de résidus
aminoacides affectés est un indicateur du type de ROS en cause (Møller and
Sweetlove, 2010; Chmielowska-Bak et al., 2015).
Les résidus cystéyle et méthionyle sont parmi les plus sensibles à l’oxydation,
cette sensibilité étant à mettre sur le compte du groupement souffre qu’ils
contiennent. Certaines des modifications qui les touchent sont réversibles, ce qui leur
permet de jouer un rôle important dans le métabolisme cellulaire, permettant des
gains et des pertes de fonctions protéiques (Shacter, 2000). C’est le cas de la
formation des ponts disulfures entre deux résidus cystéyle, qui fait suite à l’oxydation
du groupement thiol par les ROS et dont la forme réduite peut être régénérée via la
thioredoxine (Trx) (Møller et al., 2007). L’oxydation de la méthionine peut également
être réversible. Gustavsson et al. (2002) rapporte le cas d’une petite protéine
chaperon chloroplastique, la Heat shock protein 21 (HSP21), inactivée par
sulfoxydation de la méthionine mais qui peut retrouver son activité grâce à la
methionine sulfoxide réductase qui catalyse la réaction de réduction par la Trx.
Synthèse bibliographique
34
La carbonylation est la forme la plus courante de modification par oxydation
des protéines. C’est une forme d’oxydation irréversible pouvant affecter les chaînes
latérales de nombreux acides aminés tels que l’arginine, l’histidine, la lysine, la
proline, la thréonine et le tryptophane. Le fait que la carbonylation concerne des
acides aminés non sulfurés indique l’existence de contraintes oxydantes fortes
(Shacter, 2000; Møller et al., 2007). Elle résulte soit de l’oxydation directe des
protéines par les ROS, soit de réactions indirectes avec des aldéhydes dérivés de la
peroxydation lipidique, ou avec des groupements carbonyle issus de la réduction des
glucides (Berlett, 1997; Smakowska et al., 2014). La fréquence, la stabilité,
l’irréversibilité de la carbonylation et la relative simplicité des méthodes de détection
font des protéines carbonylées un bon indicateur global des contraintes oxydantes
(Bozaykut et al., 2013). Enfin, il faut préciser que l’irréversibilité de ce type de
modification rend nécessaire l’élimination des protéines oxydées par les cellules, rôle
qui incombe au système protéolytique par le biais des protéases et des protéasomes
(Basset et al., 2002; Djebali et al., 2008).
II]-6-1 EVOLUTION DES TENEURS EN PROTEINES CARBONYLEES
DURANT LE DEVELOPPEMENT FOLIAIRE
Chez A. thaliana, la teneur en protéines carbonylées augmente au cours de la
phase végétative puis décroît rapidement au début de la phase de reproduction, se
stabilisant à un niveau faible (Johansson et al., 2004). L’hypothèse avancée par les
auteurs pour expliquer cette chute soudaine de la teneur en protéines carbonylées
est celle d’une stratégie visant à limiter le transfert de protéines altérées à la
descendance, améliorant ainsi sa valeur sélective. Toutefois, dans le modèle de ces
auteurs, le niveau d’oxydation des protéines n’augmente pas lors de la sénescence,
ce qui est en contradiction avec l’idée généralement admise que le vieillissement est
lié à une augmentation de la charge oxydante des tissus. (Junqua et al., 2000; Qiu et
al., 2008) ont par ailleurs observé chez A. thaliana des teneurs en groupements
carbonyle plus élevés chez les feuilles de rangs supérieurs (feuilles jeunes). Chez le
maïs, les feuilles les plus jeunes présentent également des niveaux d’oxydation
globaux supérieurs à ceux des feuilles plus âgées (Fig.12) (Prins et al., 2011).
Synthèse bibliographique
35
Figure 12 : Effet de l'âge sur la carbonylation des protéines foliaires, pour les feuilles 1 à 12,
avec les feuilles 1 et 12 respectivement les plus âgées et les plus jeunes (Prins et al., 2011).
Les informations concernant les teneurs en groupements carbonyle au cours
du développement des feuilles sont contradictoires ; il ressort toutefois que les
feuilles qui se mettent en place le plus tardivement sont celles qui présentent le plus
de protéines carbonylées.
II]-6-2 EVOLUTION DU NIVEAU DE PROTEINES CARBONYLEES DANS
LES FEUILLES EN REPONSE A UN STRESS ABIOTIQUE
Comme évoqué précédemment, lorsque les plantes sont soumises à des
contraintes environnementales, leur métabolisme surproduit des ROS endogènes
avec pour conséquence fréquemment observée, l’augmentation des teneurs en
protéines carbonylées.
Ainsi, les teneurs en protéines carbonylées de feuilles de blé tendre, Triticum
aestivum L. augmentent en conditions de sécheresse, tout particulièrement dans les
mitochondries et les peroxysomes (Bartoli, 2004). Une atmosphère enrichie en CO2
ainsi qu’une exposition à l’ozone entraînent similairement des augmentations des
teneurs en protéines carbonylées, chez A. thaliana et chez le soja (Qiu et al., 2008).
De tels effets de l’ozone ont aussi été observés chez le haricot, Phaseolus vulgaris L.
Les résultats montrent de plus, que la réponse est dépendante de la dose d’ozone
reçue, le niveau de carbonylation de la petite sous-unité de la Rubisco augmentant
Synthèse bibliographique
36
linéairement avec l’ozone (Leitao et al., 2003). Toutefois, l’âge des tissus joue sur la
sensibilité au polluant, les plus jeunes apparaissant comme moins sensibles (Junqua
et al., 2000; Leitao et al., 2003). Des travaux de la même équipe (Leitao et al., 2008)
ont montré une diminution de l’activité Rubisco pouvant être expliquée en partie par
les carbonylations subies. Les auteurs émettent toutefois quelques réserves à ce
propos, précisant que la chute de l’activité Rubisco est également corrélée à une
baisse des quantités des sous-unités de cette carboxylase et qu’une modification de
l’activité de la Rubisco-activase n’est pas à écarter, tout comme une combinaison de
ces facteurs (Leitao et al., 2008).
D’autres contraintes environnementales, comme une exposition au cadmium,
entraînent également l’augmentation du niveau de carbonylation des protéines, dans
les feuilles d’A. thaliana (Polge et al., 2009), du maïs (Rellán-Álvarez et al., 2006) et
de la tomate (Djebali et al., 2008). Ces derniers auteurs présentent toutefois des
résultats surprenants pour les racines où la teneur en groupements carbonyle
diminue avec la dose de cadmium accumulée dans les tissus. Ces résultats
suggèrent que les racines sont plus efficacement équipées que les feuilles pour
gérer un stress oxydant induit par le cadmium.
II]-7 PROTEOLYSE CHEZ LES PLANTES II]-7-1 MECANISME D’ACTION DES PROTEASES ET CLASSES DE
PROTEASES
Les protéases peuvent se regrouper en deux grandes catégories, les
endoprotéases et les exopeptidases, respectivement celles qui clivent les liaisons
peptidiques à l’intérieur des protéines et celles qui les clivent aux extrémités des
chaînes polypeptidiques. Les exopeptidases sont elles même subdivisées en deux
sous-catégories relatives à leurs substrats, les aminopeptidases et les
carboxypeptidases, respectivement celles qui clivent les liaisons peptiques au niveau
du N-terminal et celles qui les clivent au niveau de l’extrémité C-terminal de la
protéine ou du peptide. Les protéases procèdent toutes selon la même méthode.
Elles stabilisent l’oxygène du groupement carbonyle de la liaison peptidique faisant
office de substrat au niveau d’un trou oxyanion, ce qui rend l’atome de carbone plus
vulnérable au nucléophile. Il existe quatre déclinaisons principales à cette méthode
qui donnent leurs noms aux quatre classes principales de protéases : les protéases à
Synthèse bibliographique
37
cystéine, les protéases à sérine, les protéases à aspartate et les métalloprotéases.
La différence majeure entre ces quatre classes repose sur les natures des
nucléophiles et des trous oxyanions (Fig.13) (van der Hoorn, 2008). Il existe enfin
une dernière classification pour les protéases, établie sur la base de données
MEROPS, qui les subdivise en familles puis en clans, en fonction de leurs relations
évolutives (van der Hoorn, 2008; Simova-Stoilova et al., 2010; González-Rábade et
al., 2011).
Figure 13 : Mécanismes de clivage des protéines des quatre principales classes de protéases (Van der
Hoorn, 2008)
II]-7-2 PROTEASES A CYSTEINE
Les protéases à cystéine, également appelées protéase à thiol, sont parmi les
plus abondantes puisqu’on les retrouve chez les procaryotes et les eucaryotes.
L’activité catalytique de ces enzymes inclut l’usage d’une cystéine comme
nucléophile. Chez les plantes, il existerait au moins 140 protéases à cystéine,
réparties en 15 familles et en 5 clans (van der Hoorn, 2008; Rawlings et al., 2010).
Elles sont impliquées dans la maturation des protéines, dans le recyclage des
Synthèse bibliographique
38
protéines altérées, dans la protéolyse lors de la sénescence. Elles joueraient
également un rôle dans l’accumulation des protéines de stockage dans les graines et
dans leur remobilisation. Elles participent à la réponse des plantes aux stress et sont
impliquées dans les voies de signalisation ainsi que dans le programme de mort
cellulaire (Grudkowska and Zagdańska, 2004; González-Rábade et al., 2011;
Martínez et al., 2012). Enfin elles sont responsables d’une part importante de
l’activité endoprotéolytique totale des plantes bien que celle-ci varie en fonction de
l’espèce et de l’organe étudié. Cependant, s’il est impossible de définir précisément
la proportion de l’activité protéolytique totale qui leur est due, Grudkowska and
Zagdańska (2004), avancent une part supérieure à 30 % de l’activité protéolytique
totale des organes matures non sénescents allant jusqu’à 90 % pour le blé tendre
(Wiśniewski and Zagdańska, 2001). Ces résultats élevés sont confirmés par Havé
(2013), qui obtiennent des proportions allant jusqu’à 70 % de l’activité protéolytique
totale chez un blé tendre non stressé et jusqu’à 80 % pour des individus surexposés
à l’ozone.
II]-7-3 PROTEOLYSE ET OZONE
L’influence de l’ozone sur la protéolyse n’a fait l’objet que de peu d’études
jusqu’à présent qui de plus concernent un nombre réduit d’espèces végétales.
Chez le peuplier une exposition à des doses d’ozone comprises entre 60 et 100
ppb, quatre heures par jour pendant 60 jours, entraîne une baisse des activités
protéolytiques totales (Landry and Pell, 1993). Chez une variété de tabac
sensible à l’ozone, une exposition aigüe pendant 5 heures à 150 ppb d’ozone
stimule l’activité protéolytique totale et l’usage d’inhibiteurs spécifiques suggère
l’implication de protéases à cystéine et sérine (Pasqualini et al., 2003). L’étude la
plus complète à ce jour a été réalisée chez le blé. Les activités protéolytiques
totales et spécifiques des quatre grandes classes de protéases ont été suivies
chez deux cultivars de blé exposés de façon chronique à l’ozone, pendant 56
jours. Les conclusions de cette étude révèlent une augmentation chez les deux
cultivars de l’activité totale en réponse à l’ozone. De plus cette augmentation
survient d’autant plus précocement que les niveaux d’expositions sont élevés.
Les auteurs rapportent également le rôle principal joué par les protéases à
Synthèse bibliographique
39
cystéine dans cette augmentation (Havé, 2013). Enfin, chez le maïs, il a été
montré qu’une exposition chronique à l’ozone pendant 50 jours pouvait entra îner
à la fois une augmentation des transcrits de métacaspase de type II (MCII) mais
également de leurs activités chez les plants exposés aux plus fortes doses
d’ozone (21,6 ppm.h après 50 jours d’exposition) suggérant une régulation post-
transcriptionnelle et l’existence d’un effet seuil (Ahmad, 2012)
Objectifs
40
III] OBJECTIFS
Les connaissances actuelles sur les réponses du maïs à l’ozone sont limitées.
Au vu de l’importance économique de cette espèce végétale, il nous a apparu
essentiel de contribuer à pallier aux lacunes dans ce domaine. Pour y parvenir, nous
avons choisi de focaliser notre étude sur l’impact de l’ozone sur le rendement du
maïs, résultante finale du cycle de développement des plantes, donc totalement
intégré à l’échelle de la plante. De plus, le rendement est un paramètre transversal
qui rassemble sans difficulté les mondes de la recherche et de l’agriculture. Ce
caractère pourrait faciliter les retombées de l’étude d’un domaine vers l’autre, s’il y a
lieu.
L’approche scientifique adoptée dans ce travail est elle aussi transversale et
inclut des mesures agronomiques, physiologiques et biochimiques dont l’objectif
global est d’élargir la base de données sur les effets de l’ozone sur le maïs afin de
reconsidérer l’ensemble des connaissances acquises sur le sujet. En effet,
préalablement à ce travail, seules des études réalisées en chambres de fumigation
d’ozone à ciel ouvert (OTCs) ont été mises en œuvre pour évaluer les effets de
l’ozone sur la physiologie et les rendements du maïs. Si elles ont permis de
modéliser les conséquences potentielles qu’auraient les concentrations futures
d’ozone sur les rendements de maïs, elles ne suffisent pas à établir des projections
réalistes de rendement pour les années à venir. C’est pourquoi, dans la mesure du
possible, les différents éléments assemblés dans ce travail s’accorde avec à la
réalité d’une exploitation agricole. Ainsi, un nouveau système d’enrichissement de
l’air en ozone simulant au mieux les épisodes de pollution actuels et futures et
limitant au maximum les effets collatéraux sur le microclimat des plantes a été mise
au point. La parcelle expérimental est installée sur la station de l’INRA-
AgroParisTech, à Thivernal Grignon (48° 50’ N, 1° 57’ E), c'est-à-dire dans un
espace totalement ouvert aux conditions classiques de culture (pratiques culturales,
variations climatiques, échelle de culture…). Le cultivar de maïs NK Perform
(Syngenta), est un hybride fréquemment cultivé par les agriculteurs et a été choisi
pour ce motif et pour ses qualités agronomiques
Objectifs
41
Le choix qui a été fait d’aborder cette expérimentation à différents niveaux
d’intégration au travers de paramètres agronomiques, physiologiques et
biochimiques, devrait permettre d’esquisser une vision d’ensemble et réaliste du
comportement du maïs sous l’effet de l’ozone. Les résultats obtenus dans telles
conditions, devraient donc permettre de mieux comprendre le comportement du maïs
en réponse à des doses croissantes et réalistes d’ozone et de contribuer à
l’établissement de projections d’impact de l’ozone sur cette culture.
Matériels et Méthodes
42
IV] MATERIELS ET METHODES
IV]-1 SITE EXPERIMENTAL
En 2011, des plants de maïs (Zea mays, L. cv. NK Perform) ont été cultivés
sur la parcelle expérimentale de la ferme de l’AgroParisTech (Thiverval Grignon,
France, 48° 51'N, 1° 55'E et à une altitude d’environ 130 m), située à environ 40 km
à l’ouest de Paris (France). La parcelle expérimentale s’étend sur 19 ha et se
compose d’un sol de loam limoneux. Le climat est semi continental, avec des
épisodes pluvieux répartis sur toute l’année. Les vents dominants viennent de l’ouest
mais il arrive que des vents de nord ou de nord-est prédominent pendant les
périodes anticycloniques.
IV]-2 SYSTEME DE FUMIGATION ET CONDITION D’EXPOSITION A
L’OZONE
. Le principe de base de ce système repose sur l’installation d’une rampe
linéaire de fumigation (e.g. source d’ozone) orientée perpendiculairement à la
direction du vent dominant de façon à ce que la concentration en ozone décroisse
régulièrement en aval de la rampe, au fur et à mesure de sa dilution dans le flux d’air.
Ce dispositif de fumigation est constitué de deux cylindres linéaires inoxydables de
50 mètres de long placés respectivement à 1.3 m et 1.4 m du sol et muni chacun
d’aiguilles de diamètres calibrés placées tous les 25 cm afin d’assurer une diffusion
homogène du polluant. Ces rampes sont reliées à un générateur d’ozone (CMGL
100-4, Innovatec Gerätetechnik GmbH, Germany) à l’aide de tuyaux en téflon. La
production d’ozone est automatisée et résulte de l’application de décharges
électriques dans un flux d’oxygène dès lors qu’un certain nombre de conditions
énoncées ci-dessous sont remplies. Le débit et la pression du système sont régulés
afin d’avoir un flux/dose constante d’ozone au niveau des aiguilles de la rampe (60g
h-1). Les vents dominants ont été utilisés comme vecteurs naturels de dispersion de
l’ozone (Grünhage and Jäger, 2003). Ce dernier point présente comme avantage de
permettre l’établissement d’un gradient de concentration à partir de la source d’ozone
(e.g. de la rampe). Le fonctionnement du générateur d’ozone est dépendant d’un
Matériels et Méthodes
43
certain nombre de conditions climatiques suivies en temps réel au moyen de deux
stations météo. Ces stations ont permis de suivre des paramètres comme la
température, l’éclairement, l’hygrométrie, la direction, vitesse du vent… Lorsque
l’intensité lumineuse correspondait à un rayonnement global supérieur à 50 W.m-2,
avec des vents d’ouest (270° ± 45°), une vitesse comprise entre 0,8 m.s-1 et 4 m.s-1,
le dispositif de fumigation était activé générant et diffusant l’ozone en continu. Le
générateur était automatiquement éteint la nuit, lors des épisodes pluvieux, ou
lorsque la direction du vent ne correspondait pas à celle des vents dominants. Grace
au dispositif, les concentrations d'ozone à proximité de la rampe étaient supérieures
aux niveaux naturels observables à proximité de la source de fumigation, et
diminuaient régulièrement avec la distance depuis la zone d’émission (Fig.14). Les
mesures (par absorption UV ; analyseurs 41M and 42M, Environnement SA, France)
et l’enregistrement périodique des concentrations en ozone sont automatisées et
informatisées.
La période de fumigation s’est étendue du 2 juillet 2011 (Jours Julien JJ 183)
au 31 août 2011 (JJ 243). L’étude des effets sur le maïs d’une exposition à l’ozone
est basée sur la comparaison entre des plantes témoins, qui se sont développées à
15 m en amont du panache de la source d’ozone, et des plantes exposées à l’ozone,
qui ont poussé à 3,5 m et 2 m en aval du panache de la rampe de fumigation
(Fig.14). Les concentrations d’ozone ont été mesurées pendant toute la durée de
l’expérimentation au niveau de ces points.
Matériels et Méthodes
44
Figure 14 : Schéma du dispositif de fumigation à l’ozone
IV]-3 INDICE D’EXPOSITION A L’OZONE
Tout au long de la période de fumigation, les concentrations en ozone ont été
mesurées toutes les 10 minutes à l’aide de deux analyseurs. Les données collectées
ont servi à calculer les concentrations horaires moyennes et le cumul des
concentrations d’ozone au-delà d’un seuil de 40 ppb, c'est-à-dire l’AOT40
(Accumulated Ozone over a Treshold of 40 ppb). L’AOT40 a été calculé comme la
somme des différences entre la concentration moyenne horaire d’ozone et la valeur
seuil de 40 ppb quand la moyenne des concentrations horaires d’ozone dépassait ce
seuil de 40 ppb et que le rayonnement global était d’au moins 50 W.m-2. Ce
paramètre d’exposition à l’ozone est défini comme étant la concentration critique
permettant d’évaluer l’effet de l’ozone sur les cultures en Europe (Fuhrer, 1997;
Grünhage et al., 1999).
IV]-4 MATERIEL VEGETAL ET CULTURE DU MAÏS
Les caryopses de maïs (Zea mays, L. cv. NK Perform) ont été semés le 21
avril 2011 à 5 cm de profondeur en rangs espacés de 75 cm, pour une densité de
9,24 plants.m-2, selon une orientation nord-ouest / sud-est sur une parcelle
Orientation des vents dominants
Matériels et Méthodes
45
prélalablement fertiliséeavec du fumier de vache. Les pratiques culturales
classiquement mises en œuvre en région Il De France ont été utilisées. Des
traitements herbicides ont été appliqués le 13 mai 2011 et correspondaient aux
substances actives suivantes, nicosulfuron (Milagro), mesotrione (Callisto) et de
bromoxynil (Cadeli), aux dosages respectifs de 0,5 L.ha-1 pour les deux premiers et
de 0,4 L.ha-1 pour le dernier. L’émergence du coléoptile a eu lieu le 3 mai et la
floraison observée le 11 juillet 2011. Les précipitations étant suffisantes et régulières,
il n’a pas été utile d’irriguer la parcelle au cours de l’expérimentation.
IV]-4 1 PRELEVEMENTS DES ECHANTILLONS VEGETAUX
Pour chaque date de prélèvement, les portions médianes (environ 10 cm) de 6
feuilles de l’épi ont étés prélevées sur 6 plants témoins et 4 plants surexposés à
l’ozone situés à 2 m et 3,5m de la source d’ozone, dans le sens des vents
dominants. Les échantillons de feuilles prélevés ont été congelés immédiatement
après récolte dans l’azote liquide et conserver à -80°C en vue des analyses
biochimiques ultérieures.
De plus, deux campagnes de récolte des plants entiers ont également été
réalisées sur des plants matures. Le 5 septembre 2011 ; 20 plants entiers ont été
collectés par condition d’exposition alors que 32 l’ont été par condition d’exposition le
3 octobre 2011 (Tableau.2). Ces plants ont été séchés en serre avant broyage au
moulin à grains des différents organes destinés aux analyses agronomiques.
Matériels et Méthodes
46
Tableau 2 : Récapitulatif des campagnes d’échantillonnages : dates, durées de fumigation, nomenclature et organes prélevés.
Date Jours
Julien
Durée de fumigation
(jours) à la date de
prélèvement ou de récolte
Numéro de
prélèvement
/ de récolte
Organes
prélevés
11 juillet 2011 192 9 P1
Feuilles de
l’épi
28 juillet 2011 209 26 P2
11 août 2011 223 40 P3
31 août 2011 243 60 P4
5 septembre 2011 248
-
R1 Biomasse
totale
aérienne 3 Octobre 2011 276 R2
IV]-5 PARAMETRES AGRONOMIQUES IV]-5-1 ESTIMATION DES SURFACES FOLIAIRES SUR LE MAÏS
Afin d’étudier l’effet des l’ozone sur les surfaces foliaires, celles-ci ont été calculées
de la façon suivante (Sanderson et al., 1981) :
Surface folaire = Longuer de la feuille x largeur maximale de la feuille x k,
Où
k constitue un facteur correctif égal à 0,75 (Birch et al., 2003)
la longueur de la feuille est mesurée depuis la pointe jusqu’à la ligule.
IV]-5-2 QUANTIFICATION DES BIOMASSES AERIENNES
La biomasse aérienne sèche et le rendement en grains sont déterminés en
pesant les organes récoltés pour chaque condition d’exposition ou controle et
chaque réplicat biologique, après séchage en serre ; la biomasse aérienne fraiche a
été obtenue par pesée juste après récolte des plants.
Matériels et Méthodes
47
IV]-5-3 DETERMINATION DE LA TENEUR EN AMIDON DANS LES
CARYOPSES
La détermination de la teneur en amidon des grains de maïs est effectuée sur
environ 100 mg de farine de maïs en utilisant le kit Total Starch Megazyme Assay
Procedure (Megazyme, Ireland) en suivant les préconisations du fournisseur. Ce kit
reconnu par l’AOAC et l’AACC comme méthode officielle se base sur une série de
digestions de l’amidon aboutissant à la libération de H2O2 qui après réaction avec
une sonde quinoneimine permet la quantification par colorimétrie de la teneur en
amidon, exprimé en pourcentage.
IV]-5-4 DETERMINATION DES TENEURS EN CARBONE ET AZOTE DANS
LES TIGES, FEUILLES ET GRAINS
Les dosages de carbone et d’azote dans les organes cibles ont été réalisés
par combustion sèche au laboratoire départemental d’analyse et de recherche de
l’Ain. Les analyses ont été réalisées sur les échantillons issus des deux récoltes R1
et R2. Les tiges, les feuilles et les grains ont été traités à partir de matériel végétal
préalablement réduit en poudre à l’aide de broyeur à grains.
IV]-6 PARAMETRES PHYSIOLOGIQUES
IV]-6-1 MESURE DES TENEURS EN CHLOROPHYLLES TOTALES
Les indices de teneurs en chlorophylles (Chlorophyll Content Index, CCI) ont
été mesurés à l’aide d’un chlorophylle-mètre CCM-200 (Opti-Sciences, USA) sur dix
feuilles par traitement lors des différentes campagnes d’échantillonnage (P1-P4 ; voir
tableau.2). Pour chaque feuille, deux mesures ont été effectuées au niveau de ses
parties proximale, médiane et distale, soit un totale de six points de mesure par
feuille. Ces six points de mesure ont ensuite été moyennés pour avoir un indice de
teneurs en chlorophylles moyen par feuille. Les valeurs de CCI ont été converties en
teneur de chlorophylles totales en µg.cm-² en utilisant la relation de Cerovic et al.
(2012)
Matériels et Méthodes
48
IV]-6-2 MESURE DES ECHANGES GAZEUX
Les mesures d’échanges gazeux ont été réalisées par l’équipe de l’INRA de
Grignon. La conductance stomatique (gs) et l’assimilation nette (A) ont été mesurées
au cours la période de fumigation sur la feuille de l’épi, à l’aide d’un système portatif
de mesure d’échanges gazeux Li-6400 (LiCor, Inc., Lincoln, NE, USA). Ce système
permet de mesurer à la fois l’évolution de la concentration en CO2 et en vapeur d’eau
d’une surface foliaire déterminée dans une chambre étanche. L’évolution de la
concentration en CO2 permet de déterminer le taux d’assimilation nette de CO2 par
unité de surface. Tandis que l’évolution de la concentration en vapeur d’eau permet
de déterminer la conductance stomatique au travers des calculs du taux de
transpiration et de la résistance à la diffusion de la vapeur d’eau. Les mesures ont
été regroupées en moyennes flottantes centrées sur les dates de prélèvement (P1 à
P4).
IV]-7 PARAMETRES BIOCHIMIQUES
IV]-7-1 EXTRACTION DES PROTEINES FOLIAIRES SOLUBLES ET
MESURES DES ACTIVITES ENDOPROTEOLYTIQUES
IV]-7-1-1 EXTRACTION
Toutes les opérations sont réalisées à 4°C. Environ 250 mg de feuilles
préalablement broyées dans de l’azote liquide sont mises en suspension et
homogénéisées par broyage au mortier et pilon dans 5 ml de tampon d’extraction
(Tris-HCl pH 7.5 (50 mM) ; β-mercaptoéthanol (10 mM) ; Polyvinylpolypyrrolidone
(1% m/v)). Afin d’éliminer les débris cellulaires, les broyats sont centrifugés à 25000
x g pendant 10 minutes à 4°C. Les surnageants sont prélevés et centrifugés à
nouveau dans les mêmes conditions que précédemment. Le surnageant final
constitue l’extrait protéique soluble. Son volume est mesuré précisément. Une
première fraction de l’extrait est diluée au dixième dans du tampon d’extraction pour
la mesure des activités endoprotéolytiques. Une seconde fraction est destinée à la
détermination des teneurs en protéines solubles selon Bradford (1976 ; cf IV]-7).
Matériels et Méthodes
49
IV]-7-1-2 MESURE DES ACTIVITES ENDOPROTEOLYTIQUES
TOTALES
Principe
La mesure d’activité endoprotéolytique foliaire se base sur le suivi de la
dégradation d’un substrat protéique artificiel. Le plus souvent, il s’agit de caséine,
décrite comme un substrat universel. Elle est effectivement facilement digérée par
les protéases cellulaires. Couplée à des chromophores ou à des fluorochromes, il est
facile de suivre sa dégradation, soit par des mesures colorimétriques, soit par des
mesures fluorométriques. Dans notre cas, nous avons développé une technique
basée sur la dégradation d’un substrat fluorescent, de la caséine couplée à des
fluorochromes de type BODIPY TR-X (EnzChek Protease Assay Kit, E6639).
Lorsque la caséine couplée au substrat est intacte, il y a un effet de « quenching » et
les fluorochromes n’émettent aucun signal. Lorsque le substrat est dégradé les
résidus fluorescents sont libérés annulant progressivement le « quenching ». Le
signal émis étant proportionnel à la quantité de substrat dégradé, il est possible de
suivre la protéolyse en temps réel. Cette technique à l’avantage de permettre au
moyen d’un fluorimètre une mesure en temps réel, évitant ainsi les étapes de
précipitation et de séparation des protéines que l’on rencontre avec les techniques
colorimétriques classiques.
Mesures
Les mesures d’activités endoprotéolytiques ont été réalisées en microplaques
opaques noires de 96 puits compatibles pour la fluorimétrie. Les mélanges
réactionnels se composent de 100 µl de substrat « BODIPY TR-X casein »
resuspendus à 10 µg.ml-1 dans un tampon réactionnel (MES-KOH pH 6 (200 mM),
NaN3 (2 mM)) et de 100 µl d’extrait dilué au dixième. Le blanc consiste en 100 µl
d’extrait dilué au dixième et 100 µl d’eau ultrapure. Après homogénisation, les essais
sont incubés pendant 30 minutes à 37°C à l’obscurité puis l’acquisition des mesures
de fluorescence est réalisée à intervalles de temps réguliers de 30 minutes pendant
12 heures sur un fluorimètre Biotek Synergy HT afin de suivre la cinétique de
digestion du substrat. Le suivi du signal sur une période largement supérieure à celle
nécessaire pour nos mesures permet de s’assurer des bonnes conditions
expérimentales (substrat non limitant, blanc stable…). L’excitation se fait à 590 ± 20
Matériels et Méthodes
50
nm, l’émission à 645 ± 40 nm et la sensibilité du lecteur de microplaques est réglée
sur 50 (unité arbitraire). Le temps retenu pour évaluer l’activité endoprotéolytique
d’un extrait est de 60 minutes.
Les essais sont réalisés en triplicats (tant pour le blanc que pour l’échantillon).
Pour chaque échantillon, la valeur moyenne du signal des fluorescences du blanc est
soustraite à la valeur moyenne des fluorescences de l’échantillon analysé. La valeur
de fluorescence alors obtenue correspond à l’activité endoprotéolytique de
l’échantillon (en unités arbitraires de fluorescence). L’activité endoprotéolytique étant
dépendante du pH, une gamme de tampon de pH variant entre 5 et 9 a donc été
préalablement réalisée pour définir le pH optimal utilisable dans nos conditions. . Le
tampon initial est un tampon de dosage mixte Tris-HCl (200 mM), MES (100mM),
Acétate de sodium (100 mM) au pH considéré. In fine, l’activité endoprotéolytique
totale est exprimée en UA de fluorescence / mg de matière fraîche .
IV]-7-1-3 EVALUATION DES ACTIVITES SPECIFIQUES AU MOYEN
D’INHIBITEURS
L’emploi d’inhibiteurs de protéases permet d’évaluer la contribution d’une
famille de protéases à l’activité endoprotéolytique totale. Pour chaque mesure, 10 µL
d’inhibiteur est ajouté à 120 µL d’extrait protéique dilué au dixième. La référence
contient 120 µL d’extrait dilué au dixième et 10 µL de solvant de resuspension de
l’inhibiteur concerné (Tableau.3). Le mélange est incubé 20 minutes à 37°C avant
prélèvement de 105 µL de chaque puit que l’on transvase dans les puits d’une
nouvelle microplaque préalablement rempli avec 100 µL de substrat BODIPY TR-X
casein (IV]-7-1-2). Le suivi de la dégradation du substrat est réalisé comme décrit
précédemment (IV]-7-1-2). Les essais sont réalisés en triplicats (pour le blanc, la
référence et l’extrait). Pour chaque échantillon, la valeur moyenne du signal des
fluorescences du blanc est soustraite à la valeur moyenne des fluorescences de
l’échantillon analysé. Les résultats sont exprimés en pourcentage d’inhibition de
l’activité endoprotéolytique totale. Deux familles principales de protéases ont été
ciblées au moyen de deux inhibiteurs (Tableau.3).
Matériels et Méthodes
51
Tableau 3 : Inhibiteurs de protéases utilisés et classes de protéases inhibées
Nom de l’inhibiteur
Famille de
protéases
inhibées
[Solution
mère]
(mM)
Concentration
finale (mM)
Solvant de
resuspension
E64 (trans-Epoxysuccinyl-L-
leucylamido(4-
guanidino)butane)
Protéases
à cystéine 42 µM 2 µM
Eau distillée Pefabloc (4-(2-
Aminoethyl)benzenesulfonyl
fluoride hydrochloride)
Protéases
à sérine 42 mM 42 mM
IV]-8 DOSAGE DES ESPECES REACTIVES DE L’OXYGENE
FOLIAIRES DANS L’EXTRAIT
Le 2’,7’-dichlorofluorescéine diacétate (H2DCFDA) est une forme réduite de la
fluorescéine utilisée comme indicateur de présence des espèces réactives de
l’oxygène (ROS). Une fois déacétylé par les estérases cellulaires, le H2DCFDA (non
fluorescent) peut être oxydé par les ROS en 2’,7’-dichlorofluorescéine (DCF)
hautement fluorescent.
Une quantité connue de matière fraîche (environ 100 mg) préalablement
broyée dans de l’azote liquide est resuspendu dans un 1 mL de tampon d’extraction
(Tris-HCl pH 7,2 (10 mM)). La suspension est homogénéisée à l’aide d’un pilon. Afin
d’éliminer les débris cellulaires, l’homogénat est centrifugé à 14000 x g pendant 5
minutes, à 4°C. La centrifugation est répétée une fois dans les mêmes conditions. Le
surnageant final constitue extrait végétal.
Pour le dosage, le mélange réactionnel se compose de 100 µL d’extrait
végétal auxquels sont ajoutés 100 µL de H2DCFDA (resuspendu à 20 µM dans du
diméthylsulfoxyde (DMSO)), le mélange etant homogénéisé à la pipette. Les blancs
contiennent 100 µL de tampon Tris-HCl 10 mM, pH 7,2, et de 100 µL de H2DCFDA.
Après 10 minutes d’incubation à 22°C (température ambiante) et à l’obscurité, les
Matériels et Méthodes
52
valeurs de fluorescence des essais sont mesurées à l’aide du fluorimètre (Biotek
synergy HT) avec des valeurs respectives d’excitation et d’émission de 492-495 nm
et 517-527 nm.
Pour chaque échantillon, les dosages sont effectués sur trois réplicats techniques, de
même que pour les blancs. Pour chaque échantillon, la valeur moyenne des signaux
de fluorescence du blanc est soustraite à la valeur moyenne de fluorescence émise
par l’extrait analysé. La valeur de fluorescence alors obtenue est rapportée à la
quantité de matière fraiche utlisée pour la préparation de l’extrait.
IV]-9 EVALUATION DE L’OXYDATION DES LIPIDES PAR LA METHODE
THIOBARBITURIC ACID-REACTIVE-SUBSTANCES (TBARS)
Principe
Le malondialdéhyde (MDA) est un produit secondaire de l’oxydation des
acides gras polyinsaturés et une technique couramment utilisée depuis les années
50 pour doser le MDA se base sur l’usage d’acide thiobarbiturique (TBA) ; on parle
de thiobarbituric acid-reactive-substances (TBARS) assay. Le MDA se forme par
auto-oxydation et par dégradation enzymatique des acides gras insaturés dans la
cellule. Le principe de la méthode TBARS repose sur la réaction du MDA et du TBA
incubés ensemble à 95°C en présence d’hydroxytoluène butylé (BHT, qui prévient la
suroxydation du mélange). La réaction aboutit à un complexe de couleur rose/rouge
dont on peut mesurer l’absorbance à 532 nm. Cependant de nombreuses plantes
présentent des composés qui interférent avec les mesures d’absorbances (A532 nm),
ce qui a pour conséquence une surestimation des teneurs en MDA. Il est possible de
corriger ce biais en soustrayant l’absorbance mesurée à 532 nm d’un extrait incubé
sans TBA, à l’absorbance d’un même extrait auquel du TBA a été ajouté. Afin de
tenir compte des interférences imputables aux sucres, il est également recommandé
de mesurer et de soustraire l’absorbance maximale due aux saccharoses, glucose et
fructose mesuré à 440 nm, à l’absorbance de l’échantillon lue à 532 nm.
Matériels et Méthodes
53
Figure 15 : Réaction entre le MDA et l’acide thiobarbiturique (d’après Pourrut et al., 2008)
Mesures
L’extraction des lipides se fait en homogénéisant une masse donnée de
matière fraîche dans 25 fois cette masse d'éthanol à 80 %. Le mélange est centrifugé
à 3000 x g à 4°C pendant 10 minutes. Le surnageant constitue l’extrait lipidique. Un
volume d’extrait est mélangé avec un volume de solution d’acide thiobarbiturique
(TBA 0.65% (m/v), TCA 20% (m/v), BHT 0.01% (m/v)). Un autre volume d’extrait est
mélangé avec un volume de solution sans TBA (TCA 20% (m/v), BHT 0.01%
(m/v)). Les deux mélanges sont placés au bain marie à 95°C pendant 25 minutes. La
lecture des absorbances se fait au spectrophotomètre (Shimadzu CPS-240A) à 532
nm, 440 nm et 600 nm.
Ces valeurs d'absorbance sont traitées pour obtenir la valeur en MDA équivalent en
nmol de TBARS par mg de matière fraiche au moyen des équations de Hodges et al.
(1999) :
[A532 (avec TBA) – A600 (avec TBA)] – [A532 (sans TBA) – A600 (sans TBA)] = A
[A440 (avec TBA) – A600 (avec TBA)] x 0,0571 = B
MDA équivalents (nmol.ml-1) = [(A – B) / 157 000] x 106
Pour rapporter les équivalents MDA à la masse de matière fraîche, on divise la
valeur obtenue d’après les équations par la masse de matière fraîche utilisée pour
préparer l’extrait lipidique.
Matériels et Méthodes
54
IV]-10 EXTRACTION DES PROTEINES FOLIAIRES SOLUBLES ET
DETERMINATION DU NIVEAU DE CARBONYLATION DES PROTEINES
IV]-10-1 EXTRACTION
Toutes les opérations sont réalisées à 4°C. Environ 200 mg de feuilles
préalablement broyées dans de l’azote liquide sont resuspendus dans 1 mL de
tampon d’extraction (Tris-HCl pH 7,5 (50 mM)). La suspension est ensuite
homogénéisée au vortex. Afin d’éliminer les débris cellulaires, l’homogénat est
centrifugé à 5000 x g pendant 5 minutes à 4°C. L’opération est répétée deux fois (un
total de 3 centrifugations). Le surnageant récupéré constitue l’extrait protéique
soluble.
IV]-10-2 DETERMINATION DU NIVEAU D’OXYDATION
(GROUPEMENT CARBONYLE) D’EXTRAITS PROTEIQUES FOLIAIRES
Principe
Le niveau d’oxydation des protéines foliaires a été déterminé par le biais du
dosage des groupements carbonyle présents sur les protéines solubles des feuilles
de maïs. Ces mesures ont été réalisées par immunodétermination après dérivation
des extraits cellulaires au moyen de 2,4-dinitrophényldrazine (DNPH). Ce composé
réagit avec les groupements carbonyle présents sur certains acides aminés suite à
leur oxydation par les ROS et forme du 2-4-dinitrophenylhydrazone. Les extraits
protéiques ainsi traités sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d’acrylamide
en conditions dénaturantes, et font l’objet d’une immuno-détection avec des
anticorps anti-(2-4DNP). Les signaux obtenus par immuno-chimiluminescence sont
quantifiés par densitométrie et sont normalisés à partir d’un signal de référence
obtenu à partir d’un échantillon contrôle du prélèvement P2 et arbitrairement fixé à 1.
Mesures
Une solution mère de DNPH à 20 mM est préparée par resuspension de
poudre de DNPH pur dans 1 volume d’acide trifluoroacétique pour 9 volumes d’eau
ultra-pure. On prépare également une solution neutralisante de Tris 2 M dans du
Matériels et Méthodes
55
glycérol à 30 % (m/v), à laquelle on ajoute extemporanément du β-mercaptoéthanol
(28 µL pour 164 µL de solution neutralisante).
La dérivation des groupements carbonyle est réalisée dans un microtube (1,5 mL).
80 µL d’extrait protéique contenant 100 µg de protéine sont mélangés avec 100 µL
de DNPH (20 mM) et 20 µL de sodium dodécylsulfate (SDS) (30 % m/v). Le mélange
réactionnel est incubé 20 minutes à température ambiante. La réaction est stoppée
par l’ajout de 80 µL de solution neutralisante.
IV]-10-3 SEPARATION DES PROTEINES FOLIAIRES SOLUBLES PAR
ELECTROPHORESE SUR GELS DE POLYACRYLAMIDE EN CONDITIONS
DENATURANTES (SDS-PAGE)
28 µL de mélange réactionnel décrit ci-dessus, soit 10 µg de protéines
dérivées au DNPH, sont séparées sur gel de polyacrylamide. Une tension de 150 V
ainsi qu’une intensité maximale de 30 mA sont appliquées au système pendant la
migration des protéines (système Bio-Rad MiniProtean, Tetracell, Bio-Rad
Laboratories, France).
Pour chaque extrait le dépôt est dupliqué sur deux gels distincts. Après migration, le
premier gel fera l’objet d’un transfert sur membrane, le second d’une coloration au
bleu de Coomassie.
La composition des gels de concentrations et de séparation est respectivement 4 %
et 12 % d’acrylamide / polyacrylamide (37.5/1). Ils sont respectivement préparés
dans un tampon Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8, SDS (0,1 % m/v) et un tampon Tris-HCl 1.5
M, pH 8,5, SDS (0,1 % m/v).
IV]-10-4 TRANSFERT SUR MEMBRANE DE NITROCELLULOSE ET
VISUALISATION DES PROTEINES OXYDEES PAR IMMUNOCHEMILUMINESCENCE
Après séparation des protéines, le transfert se fait sur membrane de
nitrocellulose (Amersham Protran Premium 0.45 NC, GE Healtcare Life Sciences)
dans un assemblage de papier Whatman™ (Gel Blotting-Papiere, Whatman 3MM,
Roth). Il est réalisé en condition semi-sèche (Trans-Blot® Turbo™ Transfert System,
Matériels et Méthodes
56
Bio-Rad Laboratories, France). Le voltage est maintenu à 25 V pour une intensité
maximale de 2,5 A pendant 15 minutes dans le tampon de transfert du kit Trans-Blot
Turbo Transfer Packs (Bio-Rad Laboratories, France) complété avec du SDS (0,2 %
m/v final). La membrane est incubée toute la nuit sous agitation à 4°C dans un
tampon TBS, Tween 0,2 % (V/V) complété avec 5 % (m/v) de caséine. L’anticorps
primaire est dilué au 1 : 40 000° final dans un tampon TBS complété avec 0,5% (m/v)
de caséine et mis au contact de la membrane pendant 3 h sous agitation à
température ambiante ; l’anticorps secondaire est dilué au 1 : 80 000° final dans un
tampon TBS complété avec 0,5% (m/v) de caséine et la membrane est incubée
pendant 1 h sous agitation à température ambiante, avant révélation.
IV]-10-5 VISUALISATION DES PROTEINES OXYDEES APRES
COLORATION AU BLEU DE COOMASSIE ET ANALYSE PAR DENSITOMETRIE DES
SIGNAUX ACQUIS
Les protéines du second gel sont colorées au bleu de Coomassie (éthanol 30
% (v/v), acide acétique 7 % (v/v), bleu de Coomassie 0,25 % (m/v)) pendant 24
heures puis décolorées toute la nuit dans le mélange décrit précédemment sans
colorant. Les signaux persistant dans le gel décoloré sont enregistrés à l’aide d’un
transluminateur Gel Doc™ EZ System (Bio-Rad Laboratories, France). L’image
obtenue est ensuite analysée à l’aide du logiciel Image Lab version 4.1 (Bio-Rad
Laboratories, France) par densitomètrie après acquisition des signaux. Les analyses
sont réalisées en utilisant la fonction « volume tool » du logiciel Image LabTM, selon
les recommandations du fabricant.
IV]-11 DOSAGE DES PROTEINES SOLUBLES DE FEUILLES DE MAÏS
La teneur en protéines solubles de chaque échantillon est déterminée selon la
méthode de Bradford (1976).
Les mélanges préparés sont composés de 40 µL d’extrait protéique soluble dilué au
dixième avec de l’eau ultra pure, 760 µL d’eau ultra pure, 200 µL de bleu de
Coomassie (Protein Assay Dye Reagent Concentrate, Bio-Rad). Le mélange de
Matériels et Méthodes
57
témoin contient 800 µL d’eau ultra pure et 200 µL de bleu de Coomassie. Après
homogénéisation et incubation pendant 15 minutes à température ambiante,
l’absorbance est mesurée à 595 nm. Pour chaque extrait protéique, trois répétitions
techniques sont effectuées. Une gamme étalon (1 µg à 20 µg) est réalisée avec de
l’albumine sérique bovine (BSA) diluée dans le tampon d’extraction ayant servi à la
préparation de l’extrait protéique concerné. La teneur en protéines solubles de
chaque échantillon, exprimée en mg.mg-1 de masse foliaire fraîche, est obtenue en
moyennant les valeurs obtenues avec les trois réplicats techniques.
IV]-12 ANALYSES STATISTIQUES
L’ensemble des analyses statistique a été réalisée au moyen du logiciel R.
Pour les mesures effectuées sur les échantillons issus des récoltes R1 et R2,
l’évaluation de l’effet du traitement à l’ozone est réalisée par une analyse de la
variance (ANOVA) avec le traitement à l’ozone comme facteur, suivi d’un test post
hoc de Tukey.
Pour les paramètres mesurés sur les prélèvements P1 à P4, les analyses
statistiques ont été réalisées en deux temps : Une première analyse statistique est
menée en comparant l’ensemble du jeu de données et une comparaison entre l’effet
de l’âge des plantes et du traitement à l’ozone est réalisée par une analyse de la
variance (ANOVA) à deux facteurs, avec l’âge et le traitement à l’ozone comme
facteurs, suivi d’un test post hoc de Tukey. Une seconde analyse est ensuite menée
sur chaque date de prélèvement individuellement afin de se concentrer sur l’effet
potentiel de l’ozone. Celui-ci est analyse par ANOVA et suivi d’un test post hoc de
Tukey.
La relation entre deux variables est testée par régression linéaire. La
significativité entre la variable dépendante et la variable explicative est déterminée
par ANOVA, en utilisant la loi de Fisher-Snedecor.
Résultats
58
IV] RESULTATS
V]-1 EXPOSITION A L’OZONE V]-1-1 FREQUENCE HORAIRE DES NIVEAUX D’OZONE
Les fréquences horaires des niveaux d’ozone ont été calculées pendant la
période de fumigation, lorsque le rayonnement globale était supérieur à 50 W.m-²
(Fig.17-A), c’est-à-dire quand les conditions environnementales sont propices à
l’augmentation des concentrations d’ozone ambiant. Sur le total de 739 heures
d’enregistrement pendant l’expérimentation, la durée totale de la fumigation s’élève à
environ 296 heures. Selon leur position par rapport à la source d’ozone, les plants de
maïs à 2m ont été soumis à des concentrations d’ozone supérieures à 40 ppb
pendant 53 % du temps de fumigation, contre 25,7 % pour les plants témoins. Les
concentrations d’ozone les plus élevées ont rarement dépassé 200 ppb pour les
plants de maïs sous le panache de la rampe de fumigation.
Les moyennes des concentrations journalières sont basées sur les moyennes
horaires en ozone calculées pour l’ensemble de la période de fumigation et
représentée en fonction de la distance à la rampe de fumigation (Fig.17-B). Comme
attendu, les concentrations journalières en ozone sont plus élevées à 2 m qu’à 3,5 m
de la source d’ozone et sont systématiquement supérieures aux concentrations
ambiantes d’ozone. Quelle que soit la distance à la source d’ozone, les variations
journalières des concentrations au cours sont similaires : elles augmentent
rapidement de 8h à 11h, puis continuent à augmenter plus lentement jusqu’à 19h
environ, heure à laquelle elles chutent assez brutalement.
Résultats
59
Figure 16 : A : Fréquence horaire des niveaux d’ozone pour chaque traitement.
B : Exposition journalière moyenne en ozone.
V]-1-2 VARIATIONS DES VALEURS D’AOT40
Durant la période de fumigation, les plants contrôle, cultivés à 15 m de la
source d’ozone, ont été exposés à un AOT40 de 2,40 ppm.h (Fig.18). Durant cette
même période, les plants situés à 3,5 m et 2 m, ont été respectivement exposés à
des AOT40 de 14,93 ppm.h (+622 % d’ozone) et 24,30 ppm.h (+1013% d’ozone)
(Tableau.4). La progression de l’indice AOT40 n’est pas régulière dans le temps ; ces
variations sont imputables aux fluctuations des conditions climatiques qui déclenche
(ou non) le système de génération et diffusion de l’ozone. La période de fumigation
Résultats
60
se terminant au jour julien 243, l’indice AOT40 n’augmente guère au-delà de cette
période.
Figure 17 : Cumul d’AOT40 au cours de la période de fumigation en fonction du traitement considéré. Les
points colorés indiquent les dates de prélèvements. Les mesures des conditions 3,5 m et 2 m ont été
effectuées en aval de la source d’ozone, les mesures de la condition contrôle ont été effectuées 15 m en
amont de la source d’ozone.
Tableau 4 : Valeurs d’AOT40 calculées à chaque date de prélèvement
Date Jours
Julien
Durée de
fumigation
(jours) à la
date de
prélèvement
Numéro de
prélèvement
AOT 40 à la date de
prélèvement au point de
prélèvement considéré
Contrôle 3,5 m 2m
Début de la
fumigation 02-juil-2011 183 0 - 0 0 0
Prélèvements
des feuilles de
l'épi
11-juil-2011 192 9 P1 750 2110 3010
28-juil-2011 209 26 P2 1312 7177 11823
11-août-
2011 223 40 P3 1943 10250 16843
31 août
2011 243 60 P4 2399 14927 24300
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
190 210 230 250 270
AO
T40 p
pb
.h
jour calendaire
Contrôle 3,5 m 2 m
Résultats
61
V]-2 PARAMETRES DE RENDEMENT
Les différents paramètres de rendement ont été analysés après récolte des
parties aériennes des plants situés à 2 m et 3,5 m de la source d’ozone en aval des
vents dominants, ainsi que chez les plants contrôles situés à 15 m de la rampe en
amont des vents dominants. Les échantillons sont issus de deux campagnes de
récolte de plants matures, ayant eu lieu le 05 septembre 2011 et le 03 octobre 2011.
V]-2-1 POIDS DE 1000 GRAINS
Le poids de 1000 grains (PMG) est en moyenne de 321 g, tous traitements et
toutes récoltes confondues (Fig.19). Pour chaque traitement, le PMG augmente en
moyenne de 3 % entre la récolte 1 et la récolte 2. L’augmentation n’est cependant
pas significative (p>0,05). De plus, les traitements appliqués n’ont pas d’effet
significatif sur le PMG, les plants de maïs exposés à l’ozone présentant des valeurs
de PMG équivalentes à celles des maïs contrôles (p>0,05).
Figure 18 : Poids de mille grains mesurés sur des plants de maïs (Zea mays L., cv NK Perform) cultivés
en air ambiant ou enrichi en ozone. Les valeurs pour la Récolte 1 représentent la moyenne ± ET avec
n=10. Les valeurs pour la Récolte 2 représentent la moyenne ± ET avec n=16. Les traitements Contrôle,
3,5 m et 2 m correspondent à des plantes respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30
ppm.h sur une durée de 60 jours.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Contrôle 3,5m 2m
Po
ids
de
mill
e g
rain
s (g
)
Récolte 1 Récolte 2
Résultats
62
V]-2-2 TENEUR EN AMIDON DANS LES CARYOPSES
Les caryopses de maïs présentent une teneur moyenne en amidon de 65 %
(Fig.20). Les traitements à l’ozone n’ont pas d’effet significatif sur cette valeur
(p>0,05). De plus, aucune différence n’est observée entre les deux récoltes (p>0,05).
Figure 19 : Pourcentage d’amidon dans les caryopses récoltés sur des plants de maïs (Zea mays L., cv
NK Perform) cultivés en air ambiant ou enrichi en ozone. Les valeurs pour la Récolte 1 représentent la
moyenne ± ET avec n=10. Les valeurs pour la Récolte 2 représentent la moyenne ± ET avec n= 16 Les
traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des plantes respectivement exposées à des AOT40
de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de 60 jours.
V]-2-3 DETERMINATION DU NOMBRE DE RANGS PAR EPI ET DU
NOMBRE DE GRAINS PAR RANG
Les traitements à l’ozone n’ont d’influence significative (p>0,05) ni sur le
nombre de rangs par épi récolté (13 rangs par épi en moyenne), ni sur le nombre de
grains par rang (31 grains par rang en moyenne) (Fig.21). De plus, des valeurs
équivalentes sont obtenues pour les deux récoltes (p>0,05).
0
10
20
30
40
50
60
70
Contrôle 3,5m 2m
Ten
eu
r e
n a
mid
on
(%
)
Récolte 1 Récolte 2
Résultats
63
Figure 20 : A : Nombre de rang par épi observés sur des épis de plants de maïs (Zea mays L., cv NK
Perform) cultivés en atmosphère ambiante ou enrichi en ozone. Les valeurs pour la Récolte 1
représentent la moyenne ± ET avec n=10. Les valeurs pour la Récolte 2 représentent la moyenne ± ET
avec n= 16. B : Nombre de grains par rang. Les valeurs pour la Récolte 1 représentent la moyenne ± ET
avec n=10. Les valeurs pour la Récolte 2 représentent la moyenne ± ET avec n= 16. Les traitements
Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des plantes respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ;
14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de 60 jours.
V]-2-4 RAPPORT C/N DANS LES FEUILLES, LES TIGES (ET LES
CARYOPSES)
Globalement, les teneurs en azote dans les tiges des plants de maïs matures
varient entre 3,89 ± 0,22 et 4,87 ± 0,62 g.kg-1 pour la récolte R1, et entre 4,21 ± 0,35
Résultats
64
et 4,99 ± 0,96 g.kg-1 pour la récolte R2. Les teneurs en C sont extrêmement stables,
elles sont de l’ordre de 377,71 ± 20,82 g.kg-1 pour R1 et de 340,35 ± 32,51 g.kg-1
pour R2 (Fig.22 et fig.23) Au moment de la récolte 1 (05/09/2011), les traitements à
l’ozone n’avait pas eu d’effet significatif sur les teneurs en C (p>0,05) (Fig.22). En
revanche, les teneurs en azote sont significativement plus élevées chez les plants
cultivés à 2 mètres de la source d’ozone que chez les plants contrôles (p<0,05). Le
rapport C/N est quant à lui significativement plus élevé chez les plants contrôles que
chez les chez les plants cultivés à 2 m de la rampe de fumigation –(e.g de la source
d’ozone) (p<0,05) (Fig.22).
A la récolte 2 (03/10/2011), les tiges des plants maïs présentent des teneurs
en carbone et des rapports C/N équivalents (p>0,05), quel que soit le traitement à
l’ozone appliqué. Comme pour la récolte 1, les teneurs en azote sont
significativement plus élevées chez les plants cultivés à 2 m de la rampe de
fumigation que chez les plants contrôles (p<0,05) (fig.23).
Il faut noter que les teneurs en azote dans les tiges n’ont pas varié
significativement entre les deux récoltes. En revanche, on a mesuré significativement
moins de C dans les tiges à la récolte 2 qu’à la récolte 1 (p<0,05). Par conséquent,
les rapports C/N à la récolte 1 sont significativement (p<0,05) supérieurs à ceux de la
récolte 2.
Résultats
65
Figure 21 : Teneurs en azote et en carbone dans les tiges des plants de maïs pour la récolte
R1(05/09/2011).. (A) : azote (en g.kg-1), avec la condition contrôle significativement différente de la
condition 2 m (ANOVA p<0,05). (B) : carbone (en g.kg-1
). (C) : rapport C/N, avec la condition contrôle
significativement différente de la condition 2 m (ANOVA p<0,05). Les valeurs des différents graphes
représentent les moyennes ± ET avec n=5. Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des
plantes respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de 60 jours.
Résultats
66
Figure 22 : Teneurs en azote et en carbone dans les tiges des plants de maïs pour la récolte R2
(03/10/2011).. (A) : azote (en g.kg-1), avec la condition contrôle significativement différente de la condition
2 m (ANOVA p<0,05). (B) : carbone (en g.kg-1). (C) : rapport C/N. Les valeurs des différents graphes
représentent les moyennes ± ET avec n=5. Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des
plantes respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de 60 jours.
V]-2-5 QUANTIFICATION DE LA BIOMASSE AERIENNE
Les valeurs de biomasse aérienne ont été mesurées sur des plants de maïs
récoltés le 03 octobre 2011 (R2). Les différents traitements à l’ozone n’ont d’effet
significatif (p>0,05) ni sur la quantité de biomasse aérienne fraîche, ni sur la quantité
de biomasse aérienne sèche (p>0,05) produites par les plants de maïs (Fig.24).
Résultats
67
Figure 23: Biomasses aériennes fraîche (A) et sèche (B) produites par des plants de maïs soumis à un air
ambiant ou enrichi en ozone. Les valeurs pour la biomasse aérienne fraîche représente la moyenne ± ET
avec n=64 pour les plants contrôles et les plants à 3,5m, n=63 pour les plants à 2m. Les valeurs pour la
biomasse aérienne sèche représentent la moyenne ± ET avec n=48 pour les plants contrôle et les plants
3,5 m, n= 47 pour les plants à 2 m. Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des plantes
respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de 60 jours.
V]-2-6 INDICE DE RECOLTE
L’indice de récolte ne varie pas significativement entre les plants de maïs
surexposés à l’ozone et les témoins (p>0,05). Les valeurs oscillent entre 0,493 et
0,502 (Fig.24)
0
100
200
300
400
500
600
700
Contrôle 3,5m 2m
Bio
mas
se a
éri
en
ne
fra
ich
e (
g)
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
300,00
350,00
Contrôle 3,5m 2m
Bio
mas
se a
éri
en
ne
sè
che
(g)
B
A
Résultats
68
Figure 24 : Indices de récolte déterminés sur des plants de maïs cultivés en air ambiant ou enrichi en
ozone. Les valeurs représentent la moyenne ± ET avec n=48 pour les plants contrôles et les plants à
3,5m ; n=47 pour les plants à 2m Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des plantes
respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de 60 jours.
V]-2-7 SURFACES FOLIAIRES
A la date de la récolte des épis (R2, 03/10/2011), les plants de maïs
présentent des surfaces foliaires totales moyennes allant de 483 ± 34,24 cm-2 à
581,21 ± 57,31 cm-2 (Fig.25). Les différents traitements à l’ozone imposés n’ont pas
d’effet significatif (p<0,05) sur ce paramètre.
Figure 25 : Surface foliaire de plants de maïs soumis à un air ambiant ou enrichi en ozone. Les valeurs représentent la
moyenne ± ET avec n=16 (Contrôle, 2 m) et n=15 (3,5 m). Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des
plantes respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de 60 jours.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Contrôle 3,5 m 2 m
Ind
ice
de
ré
colt
e
0
100
200
300
400
500
600
700
Contrôle 3,5 m 2 m
cm²
Résultats
69
V]-2-8 MASSES SURFACIQUES
A la date de la récolte des épis (R2, 03/10/2011), les feuilles des plants de
maïs présentent des masses surfaciques moyennes allant de 6,24 ± 0,56 mg.cm-2 à
6,51 ± 0,69 cm-2 (Fig.26). Les différents traitements à l’ozone imposés n’ont pas
d’effet significatif (p<0,05) sur ce paramètre.
Figure 26 : Surface foliaire de plants de maïs soumis à un air ambiant ou enrichi en ozone. Les valeurs représentent la
moyenne ± ET avec n=16 (Contrôle, 2 m) et n=15 (3,5 m). Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des
plantes respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de 60 jours.
V]-2-9 POURCENTAGE DE GERMINATION
Le pourcentage de germination des semences récoltées sur les plants de
maïs traités n’est pas affecté par l’ozone (Fig.27). Quel que soit le traitement
appliqué, les pourcentages de germination obtenus sont compris entre 97 % et
100%, 60h après le début de l’imbibition.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Contrôle 3,5 m 2 m
mg.
cm-²
Résultats
70
Figure 27 : Pourcentage de germination de semences récoltées sur des plants de maïs cultivés en air
ambiant ou enrichi en ozone. Les valeurs représentent le nombre de semences ayant germé à différents
intervalles de temps, avec n=16. Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des plantes
respectivement exposées à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h sur une durée de 60 jours.
V]-3 PARAMETRES PHYSIOLOGIQUES V]-3-1 CONDUCTANCE STOMATIQUE ET ASSIMILATION NETTE
L’évolution des valeurs d’assimilation nette (An) a été suivie régulièrement au
cours de la période de fumigation sur les feuilles de l’épi (Fig.28-A). Pour les plants
contrôles, l’An varie entre 8,38 1,26 µmol.m².s-1 et 15,07 1,21 µmol.m².s-1. Pour
les plants surexposés à l’ozone, les valeurs d’An sont comprises entre 4,14 0,54
µmol.m².s-1 et 8,07 1,67 µmol.m².s-1.
L’analyse statistique de l’ensemble du jeu de données indique un effet
significatif (p<0,05) du traitement et de la période de mesure. Dans le cas de l’effet
du traitement cela se traduit par des différences significatives entre plants contrôles
et plants surexposés à l’ozone (3,5 m et 2 m). Pour l’effet de la période de mesure,
cela se traduit par des différences significatives entre la période (en JJ) 225-235 et
les périodes 200-210 et 235-245 (p<0,05).
De plus, une analyse statistique centrée sur les données obtenues aux
différentes périodes de mesure indique un effet significatif des traitements appliqués
aux plants pour les périodes (en JJ), 215-225 ; 225-235 et 235-245. Des analyses
post hoc menées sur chacune de ces périodes indiquent : pour la période 215-225
une différence significative entre plants contrôles et plants surexposés à l’ozone à 2
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
% g
rain
es
germ
ée
s
Heures Contrôle 3,5m 2m
Résultats
71
m (p<0,05) ; pour les périodes 225-235 et 235-345 les différences significatives se
situent entre les plants contrôles et les plants exposés à l’ozone (2 m et 3,5 m).
L’évolution des conductances stomatiques des feuilles de l’épi a été suivie au
cours de la période de fumigation (Fig.28-B). Globalement, les valeurs de
conductance se situent entre 142,48 10,22 mmol.m².s-1 et 254,45 58,49
mmol.m².s-1, tous traitements confondus.
L’analyse statistique menée sur l’ensemble du jeu de données montre que la
gs est significativement affectée par la période durant laquelle les mesures ont été
réalisée (p<0,05) mais pas par les traitements appliqués (p>0,05). L’effet de la
période de mesure se traduit par des valeurs de gs significativement plus hautes pour
la période 235-245 (JJ) que pour la période 200-210 (JJ).
De plus, l’analyse statistique centrée sur les données obtenues aux différentes
périodes de mesure indique que le traitement n’a un effet significatif que pour la
période de mesure 235 à 245 (JJ) (p<0,05). L’analyse post hoc indique que les
plants contrôles présentent des conductances stomatiques significativement plus
élevées que les plants surexposés à l’ozone (p<0,05) (Fig.28-B).
Résultats
72
.
Figure 28 : A : Assimilation nette (An en µmols.m-2
.s-1
) de plants de maïs soumis à un air ambiant ou
enrichi en ozone. Les moyennes sont établies sur des périodes de 10 jours (incluant les dates des
prélèvements P1-P4), les barres d’erreurs représentent les erreurs standards et n≥6. B : Conductance
stomatique (gs en mmol.m-2
.s-1
) du même matériel végétal que A. Les valeurs présentées sont des
moyennes de mesures étalées sur 10 jours, les barres d’erreurs représentent les erreurs standards et
n≥6. Les traitements Contrôle, 3,5 m et 2 m, correspondent à des plantes respectivement exposées, au JJ
243, à des AOT40 de 2,40 ; 14,93 ; 24,30 ppm.h.
V]-3-2 TENEUR EN PROTEINES SOLUBLES TOTALES DANS LES
FEUILLES
Résultats
73
Les teneurs en protéines totales solubles dans les feuilles de l’épi des plants
de maïs varient entre 12,85 2,34 µg.mg -1 MF au début de l’expérience et 6,03
3,64 µg.mg -1 MF, 60 jours plus tard, tous traitements confondus (Fig.29).
Si l’on considère l’ensemble des données, l’analyse statistique ne révèle pas
d’interdépendance des effets de la date de prélèvement et des traitements (p<0,05).
Cependant des effets significatifs (p<0,05) de la date de prélèvement et des
traitements appliqués sont observés, sur la teneur en protéine foliaires solubles. Pour
l’effet associé au prélèvement, cela se traduit par une différence significative des
teneurs en protéines solubles des échantillons du prélèvement P4 par rapport aux
autres (p<0,05). Pour ce qui est de l’effet associé aux conditions d’exposition, cela se
traduit par une différence significative des teneurs en protéines solubles, des
échantillons des conditions contrôle et 2 m (p<0,05).
Lorsque l’on considère chaque date de prélèvement indépendamment,
l’analyse statistique révèle un effet significatif des traitements uniquement pour P4,
toutefois une analyse post hoc n’indique pas de différences significatives entre les
traitements (p>0,05).
.
Figure 29 : Teneurs en protéine solubles totales (µg.mg-1
MF) dans la feuille de l'épi de plants de maïs soumis à différentes concentrations d'ozone. Les valeurs représentent les moyennes ± ET, avec n≥3 P1, P2, P3 et P4, prélèvements des tissus foliaires respectivement effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ; 223. Avec les conditions : contrôle exposé à l’ozone
ambiant ; 3,5 m exposé à 3,5 m de la rampe de fumigation ; 2 m exposé à 2 m de la rampe de fumigation
V]-3-3 TENEURS EN CHLOROPHYLLES TOTALES
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
P1 P2 P3 P4
Pro
téin
es
solu
ble
s (µ
g.m
g-1 M
F)
Contrôle
3,5 m
2 m
Résultats
74
Les feuilles de l’épi des plants de maïs contiennent en moyenne 49,83 3,45
µg de chlorophylles par cm -2 de surface foliaire (Fig.30).
L’analyse statistique menée sur l’ensemble du jeu de donnée indique que
teneur moyenne en chlorophylles totales n’évolue pas significativement aux cours de
l’expérimentation (p<0,05). En revanche, cette même analyse statistique montre que
les plants cultivés à 2 m de la source d’ozone présentent globalement des teneurs en
chlorophylles significativement inférieures à celles des contrôles (p<0,05).
Lorsque les données sont analysées séparément, pour chaque date de
prélèvement, une différence significative (p<0,05) induite par les traitements est
observée en fin d’expérimentation (P4) : à cette date, les plants 2 m présentent des
teneurs en chlorophylles significativement plus faibles que celles des plants 3,5 m.
Figure 30 : Teneurs en chlorophylles totales (µg.cm-²) dans la feuille de l'épi de plants de maïs soumis à différentes
concentrations d'ozone. Les valeurs représentent les moyennes ± ET, avec n=10, sauf pour les échantillons du prélèvement P3 à3,5 m, dont les données sont manquantes. P1, P2, P3 et P4, prélèvements des tissus foliaires respectivement effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ; 223. Avec les conditions : contrôle exposé à l’ozone ambiant ; 3,5 m
exposé à 3,5 m de la rampe de fumigation ; 2 m exposé à 2 m de la rampe de fumigation
V]-4 EFFET DE L’OZONE SUR LES ACTIVITES
ENDOPROTEOLYTIQUE V]-4-1 DETERMINATION DU PH OPTIMAL POUR LES MESURES
D’ACTIVITES ENDOPROTEOLYTIQUE TOTALE
Résultats
75
L’hydrolyse d’un substrat de type caséine-Bodipy a été mesurée dans des
extraits protéiques foliaires de maïs, sur une gamme de pH s’étalant de 5 à 9, dans
l’objectif de déterminer le pH optimal pour les mesures de l’activité protéolytique
totale. Les extraits ont été préparés à partir de feuilles de plants contrôles et soumis
au traitement à l’ozone le plus sévère (2 m de la source). Les résultats indiquent
clairement, pour les deux extraits, un pic d’activité unique aux alentours de pH 6
(Fig.31). Ainsi, cette valeur de pH a-t-elle été retenue pour l’ajustement des milieux
réactionnels employés pour suivre les variations des activités protéolytiques foliaires
en réponse aux traitements à l’ozone.
Figure 31: Activités endoprotéolytiques totales mesurées à différents pH réactionnels dans des extraits protéiques préparés à partir de feuilles de l’épi de plants de maïs exposés à un air enrichi en ozone (2 m) et à l’air ambiant (Contrôle). Les valeurs correspondent aux signaux de fluorescence (en unité arbitraire U.A) faisant suite à la dégradation du substrat BODIPY-Caséine.
V]-4-2 ACTIVITES ENDOPROTEOLYTIQUES TOTALES
L’évolution des activités endoprotéolytiques totales dans les feuilles de l’épi a
été suivie pendant la période de fumigation à l’ozone (Fig.32). Tous traitements
confondus, ces activités sont faibles et constantes pendant la majeure partie de la
période de fumigation et augmentent nettement, à la fin de la période de fumigation
(P4). Une analyse statistique sur l’ensemble du jeu de donnée indique que cette
augmentation est significative (p<0,05). De plus cette augmentation est
particulièrement marquée pour les plants à 2 m qui présentent une activité
0
20
40
60
80
100
5 6 7 8 9 10
Flu
ore
sce
nce
A.U
Contrôle
2 m
Résultats
76
protéolytique totale moyenne significativement supérieure à toutes les autres.
Contrairement à ce qui est établi pour les teneurs en protéines foliaires, les
traitements à l’ozone n’influencent pas les activités protéolytiques de manière
significative. En revanche, un effet croisé significatif existe entre la date de
prélèvement et les traitements à l’ozone (p<0,05).
Lorsque les données d’activités endoprotéolytiques obtenues aux différentes
dates de prélèvement sont traitées de manière indépendante, les analyses
statistiques concluent encore une fois à l’absence d’effet significatif des traitements à
l’ozone (p>0,05). Ceci s’applique aussi à la date P4 à laquelle on relève toutefois une
nette tendance à l’augmentation de ces activités en réponse à l’ozone (+118 % entre
3,5 m et 2 m ; +318 % entre les plants contrôles et 2 m). Il est à noter que le jeu de
données P4 se caractérise par une forte variabilité des valeurs d’activités obtenues
pour une même condition, ce qui se reflète dans la valeur des erreurs standard.
Figure 32 : Variations des activités endoprotéolytiques totales dans les feuilles de plants de maïs pendant la période de fumigation à l'ozone. Les valeurs représentent la moyenne ± ES avec n=4. P1, P2, P3 et P4, prélèvements des tissus foliaires respectivement effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ; 223. Avec les conditions : contrôle exposé à l’ozone ambiant ;
3,5 m exposé à 3,5 m de la rampe de fumigation ; 2 m exposé à 2 m de la rampe de fumigation
V]-4-3 ACTIVITES PROTEOLYTIQUES SPECIFIQUES
-500
500
1500
2500
3500
4500
5500
6500
7500
P1 P2 P3 P4
Flu
ore
sce
nce
(A
U)
Contrôle
3,5 m
2 m
Résultats
77
La contribution de deux classes d’endoprotéases (les protéases à cystéine et
les protéases à sérine) à l’activité endoprotéolytique totale dans les extraits
protéiques de feuilles de maïs a été établie au moyen de d’inhibiteurs spécifiques de
chacune de ces classes (E64 pour les protéases à cystéine, Péfabloc pour les
protéases à sérine) (Fig.33-A-B). Pour la majorité des extraits protéiques analysés, la
somme des pourcentages d’inhibition des deux classes de protéases considérées
dépasse 100 %. C’est un phénomène connu et dû à l’imparfaite spécificité des
inhibiteurs.
En ce qui concerne la part de l’activité endoprotéolytique totale dans les
feuilles de maïs imputable aux protéases à cystéine, l’analyse statistique menée sur
l’ensemble des données révèle des effets significatifs des traitements et des dates de
prélèvement (p<0.05) sans toutefois faire ressortir d’effets croisés de ces deux
facteurs. Pour ce qui est de l’effet des traitements, cela se traduit par des
pourcentages d’inhibition significativement plus faible chez le contrôle que chez les
maïs exposés à l’ozone (3,5 m et 2 m). Pour l’effet des dates de prélèvement cela se
traduit par une augmentation des pourcentages d’inhibition avec l’âge des plantes,
cette hausse étant systématiquement significative entre chaque date de prélèvement
(p<0.05), sauf pour P1 et P2 qui présentent des niveaux d’activités similaires
(p>0.05).
L’analyse statistique menée séparément pour chaque date de prélèvement
révèle quant à elle un effet des traitements pour les prélèvements P1 et P3, ce qui
suite à une analyse post hoc, se traduit par des différences significatives entre plants
contrôles et plants 2 m (p<0.05) (Fig.33-A).
La part de l’activité protéolytique totale dans les feuilles de maïs, imputable
aux protéases à sérine est constante pendant la majeure partie de l’expérimentation.
L’analyse statistique menée sur l’ensemble du jeu de données montre cependant un
effet significatif de la date de prélèvement sur les valeurs d’activités (p<0,05). Ceci se
traduit par une différence significative entre les prélèvements P3 et P4 (p<0,05), qui
sont respectivement ceux qui présentent les valeurs d’inhibition maximale et
minimale. (Fig.33-B). Bien qu’il semble y avoir tendance à l’augmentation du
pourcentage d’inhibition en réponse aux traitements à l’ozone, ce dernier n’a pas
d’effet significatif sur le pourcentage d’inhibition (p= 0,058). Il n’y a pas non plus
Résultats
78
d’interaction entre les traitements à l’ozone et la date de prélèvement sur le
pourcentage d’inhibition pour cette classe d’endoprotéases (p<0,05).
L’analyse statistique menée séparément pour chaque date de prélèvement,
montre un effet significatif des traitements à l’ozone uniquement pour le prélèvement
P3 (p<0,05). Ceci se traduit, suite à une analyse post hoc, par une différence
significative entre plants contrôles et plants 2 m (p<0.05) (Fig.33-B).
Figure 33 : Pourcentage d’inhibition (%) des activités endoprotéolytiques totales par des inhibiteurs de deux classes d'endoprotéases. Les extraits protéiques ont été obtenus à partir de feuilles de plants de maïs soumis à un air ambiant ou enrichi en ozone, sur une période de 60 jours. A : Inhibition des protéases à cystéine par le E64. B : Inhibition des protéases à sérine par le Péfabloc. Les valeurs représentent la moyenne ± ET avec n=4. P1, P2, P3 et P4, prélèvements des tissus foliaires respectivement effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ; 223. Avec les conditions : contrôle exposé à l’ozone
ambiant ; 3,5 m exposé à 3,5 m de la rampe de fumigation ; 2 m exposé à 2 m de la rampe de fumigation
B
A
Résultats
79
V]-5 EVALUATION DES TENEURS EN ROS DANS LES FEUILLES
Les variations des teneurs en ROS dans les feuilles de l’épi ont été suivies
pendant la période de fumigation. Ces teneurs sont exprimées en unités de
fluorescence rapportées à la quantité de matière fraîche considérée (Fig.34). L’allure
de la courbe de variation de ce paramètre est celle d’une cloche inversée, montrant
des valeurs de ROS élevées en début et fin d’expérience et relativement plus basses
en milieu de période expérimentale.
Une analyse statistique du jeu de données entier indique un effet significatif de
la date de prélèvement, du traitement et de l’interaction de ces deux facteurs
(p<0,05). L’influence de la date de prélèvement se traduit par des teneurs en ROS
significativement plus élevées pour le prélèvement P1 par rapport au prélèvement P2
et par des teneurs en ROS significativement plus élevées pour le prélèvement P4 par
rapport aux prélèvements P2 et P3. L’effet du traitement se traduit quant à lui, par
des teneurs en ROS significativement plus élevées chez les plants exposés à 2 m
que chez les plants contrôles (p<0,05).
L’analyse statistique menée séparément pour chaque date de prélèvement,
montre un effet significatif des traitements à l’ozone uniquement pour les
prélèvements P3 et P4 (p<0,05). Ceci se traduit, suite à une analyse post hoc, par
une différence significative entre plants contrôles et plants 2 m (p<0.05) (Fig.34).
Figure 34 : Teneur en ROS (fluorescence UA. G MF-1
) dans la feuille de l'épi de plants de maïs soumis à un air ambiant ou enrichi en ozone sur une période de 60 jours. Les valeurs représentent la moyenne ± ET avec n≥3. P1, P2, P3 et P4, prélèvements des tissus foliaires respectivement effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ; 223. Avec les conditions : contrôle
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
R1 R2 R3 R4
Flu
ore
sce
nce
(U
A).
gMF-1
Contrôle
3,5 m
2 m
a ab b a ab b a a a a a b
Résultats
80
exposé à l’ozone ambiant ; 3,5 m exposé à 3,5 m de la rampe de fumigation ; 2 m exposé à 2 m de la rampe de
fumigation
V]-6 NIVEAU D’OXYDATION GLOBALE DES PROTEINES SOLUBLES
Les variations des teneurs en groupements carbonyle sur les protéines
foliaires solubles (feuilles de l’épi) ont été mesurées pendant l’expérimentation
(Fig.35). Ces valeurs sont exprimées en unités arbitraires de fluorescence,
relativement à la valeur de la teneur en groupements carbonyle d’un échantillon
contrôle récolté neuf jours après le début de la fumigation. L’échantillon contrôle
présente en théorie les niveaux de carbonylation les plus faibles. Pour ce paramètre,
et comparativement à ce qui est observé pour les teneurs en groupements carbonyle
dans les protéines, l’allure des variations des teneurs en groupements carbonyle est
celle d’une cloche inversée avec des maxima en début et fin d’expérimentation.
Une analyse statistique du jeu de données entier indique un effet significatif de
la date de prélèvement (p<0,05), mais pas du traitement (p>0,05). L’influence de la
date de prélèvement ne se traduit pas des différences significatives des teneurs en
groupements carbonyle entre chaque prélèvement.
L’analyse statistique menée séparément pour chaque date de prélèvement,
montre un effet significatif des traitements à l’ozone uniquement pour le prélèvement
P4 (p<0,05). Ceci se traduit, suite à une analyse post hoc, par une différence
significative entre les plants contrôles et les plants 3,5 m (p<0.05) (Fig.35) et une
forte tendance à la baisse entre les plants contrôles et les plants 2 m avec une valeur
de p de 0,051.
Résultats
81
Figure 35 : Teneurs en groupements carbonyle sur les protéines solubles des feuilles de l'épi de plants de maïs soumis à un air ambiant ou enrichi en ozone sur une période de 60 jours. Les valeurs représentent la moyenne ± ET avec n=4. P1, P2, P3 et P4, prélèvements des tissus foliaires respectivement effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ; 223. Avec les conditions : contrôle exposé à l’ozone ambiant ; 3,5 m exposé à 3,5 m de la rampe de fumigation ; 2 m exposé à 2 m de la rampe de
fumigation
V]-7 PEROXYDATION LIPIDIQUE
L’intensité du processus de peroxydation lipidique a été mesurée au cours de
la période d’expérimentation (Fig.36). Ce paramètre est exprimé en nmol
d’équivalent MDA par mL d’extrait foliaire, selon la méthode des TBARS. Les
résultats montrent une forte diminution des équivalents MDA entre P1 et P2. Les
valeurs sont ensuite stables jusqu’à la fin de l’expérimentation (de P2 à P4).
Une analyse statistique du jeu de données entier indique un effet significatif de
la date de prélèvement (p<0,05) et du traitement (p<0,05 sur les équivalents MDA.
Ces derniers ne sont cependant pas significativement impactés par l’interaction de
ces deux facteurs (p>0,05). L’influence de la date de prélèvement se traduit pas des
différences significatives de la peroxydation lipidique des échantillons du
prélèvement P1 par rapport à tous les autres (P2, P3, P4) (p<0,05). L’effet du
traitement se traduit quant à lui, par des niveaux d’équivalent MDA significativement
plus élevés chez les plants exposés à 2 m que chez les plants contrôles (p<0,05).
L’analyse statistique menée séparément pour chaque date de prélèvement,
montre un effet significatif des traitements à l’ozone uniquement pour les
Résultats
82
prélèvements P2 et P3 (p<0,05). Cela se traduit, suite à des analyses post hoc : pour
P2 par une différence significative des niveaux de d’équivalent MDA des plants
contrôles par rapport à ceux des plants exposés à l’ozone (3,5 m et 2 m) (p<0.05) ;
pour P3 par une différence significative des niveaux d’équivalent MDA des plants 2 m
par rapport à ceux des deux autres conditions (Contrôle et 3,5 m) (p<0.05) (Fig.36).
Figure 36 : Niveau de peroxydation lipidique dans la feuille de l’épi de plants de maïs soumis à un air ambiant ou enrichi en ozone sur une période de 60 jours. exprimée en équivalents MDA (nmol.mL
-1). Les valeurs représentent la moyenne ±
ET avec n=4. P1, P2, P3 et P4, prélèvements des tissus foliaires respectivement effectué aux JJ : 183 ; 192 ; 209 ; 223. Avec les conditions : contrôle exposé à l’ozone ambiant ; 3,5 m exposé à 3,5 m de la rampe de fumigation ; 2 m exposé à 2 m de la rampe de fumigation
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
P1 P2 P3 P4
Equ
ival
ent
MD
A n
mo
l.m
l-1
Contrôle
3,5 m
2 m
a a a a b b a a a a a b
Discussion
83
VI] DISCUSSION
La démarche expérimentale de notre étude a consisté à exposer des plants de
maïs en champ à des doses croissantes d’ozone et de comparer les réponses des
plants soumis à des atmosphères enrichies artificiellement en O3 à celles de plants
exposés aux concentrations ambiantes. Notre but a été d’évaluer les risques que
pourrait représenter l’évolution des concentrations d’ozone sur le maïs dans les
années à venir, au travers de paramètres de rendement et de paramètres
biochimiques et physiologiques.
VI]-1 NIVEAUX D’EXPOSITION A L’OZONE
L’atmosphère des plants exposés à l’ozone a été enrichie au moyen d’un
système de fumigation, ce qui a permis, grâce à l’usage du vent comme facteur de
dispersion, la création d’un gradient de concentration. Ce type de système présente
l’avantage de maintenir les conditions expérimentales au plus proche des conditions
conventionnelles de culture du maïs. La fumigation a débuté le 2 juillet 2011, soit 9
jours avant la floraison qui a eu lieu le 11 juillet 2011 (date des prélèvements foliaires
P1), et s’est poursuivie pendant 60 jours (jusqu’au 31 août 2011), soit 5 jours avant
la première récolte de plants entiers (R1). Au vu des concentrations utilisées dans
d’autres études (Mulchi et al., 1995; Rudorff et al., 1996; Leitao et al., 2007b; Bagard
et al., 2015), les niveaux d’exposition à l’ozone pour les plants à 3,5 m et 2 m de la
source d’ozone apparaissent comme relativement modestes. Ils correspondent
toutefois à des enrichissements en ozone du site de culture dépassant le niveau
critique actuellement admis. En effet, le niveau critique admis au-delà duquel une
perte de 5 % des rendements est attendue pour le maïs est de 13,9 ppm.h (Mills et
al., 2007). Dans notre étude, ce niveau critique n’est jamais dépassé pour les plants
contrôles, pour lesquels l’AOT40 culmine à 2,4 ppm.h à la fin de la période de
fumigation. De plus, les plants contrôles n’ont été exposés qu’une seule heure à des
concentrations dépassant 80 ppb ce qui devrait prévenir l’apparition d’éventuels
effets dus à une exposition aiguë à l’ozone. Les conditions ambiantes d’ozone sur le
site de l’expérimentation n’ont donc pas été susceptibles d’avoir un effet négatif sur
les rendements. Pour les plants surexposés à l’ozone, le niveau critique est atteint
Discussion
84
dans les deux conditions de culture, à 3,5 m et 2 m de la source d’ozone,
respectivement aux jours juliens 239 (soit 56 jours après le début de la fumigation) et
217 (soit 34 jours après le début de la fumigation). Ainsi, chez les plants de maïs
surexposés à l’ozone, les niveaux d’exposition atteints dans notre étude sont
susceptibles d’entraîner des pertes de rendement significatives. Les plants exposés
à 3,5 m et 2 m présentent en fin de période de fumigation des AOT40 respectifs de
14,9 ppm.h et 24,3 ppm.h, ce qui d’après l’équation liant l’exposition à l’ozone au
rendement chez le maïs (Mills et al., 2007), devrait entraîner des pertes de
rendement théoriques respectives de 3,4 % et 6,7%.
VI]-2 IMPACT DE L’OZONE SUR LE RENDEMENT VI]-2-1 ARGUMENTS EN FAVEUR DE LA TOLERANCE DU MAÏS A
L’OZONE
Jusqu’à présent les quelques données bibliographiques disponibles laissaient
à penser que le maïs était modérément tolérant à l’ozone (Mills et al., 2007) et les
prévisions les plus optimistes pour l’horizon 2030 tablaient sur des pertes de
rendement de l’ordre de 4,4 à 8,7 % (Avnery et al., 2011a). Toutefois ces estimations
se basent sur une relation exposition-réponse établie à partir d’un faible nombre
d’expérimentations (2 dans les années 1980 et 1990) menées sur un seul cultivar de
maïs et pour un seul type de conditions pédoclimatiques (Holland et al.; Mills et al.,
2007). Afin de compléter les connaissances actuelles dans ce domaine, l’effet des
surexpositions à l’ozone décrites précédemment a été suivi depuis la floraison
jusqu’à la fin du remplissage des caryopses en analysant les différentes
composantes du rendement et de la qualité des grains. L’ensemble des données que
nous avons obtenues appuie l’idée que le maïs serait tolérant à l’ozone et que
l’impact du polluant modélisé jusqu’à présent a été surestimé. En effet, l’ozone n’a
d’effet sur aucun des paramètres de rendement mesurés à l’exception de la teneur
en azote dans les tiges. De plus, la comparaison entre nos valeurs de rendement et
celles de la fiche technique de référence du cultivar NK Perform (Syngenta), nous
indique que les résultats obtenus correspondent à ceux attendus pour ce cultivar
pour des concentrations ambiantes d’ozone.
Pour comprendre l’écart entre nos résultats et les données de la littérature, il
nous est apparu pertinent de nous intéresser en premier lieu à certaines spécificités
Discussion
85
du maïs. Tout d’abord, il s’agit d’une plante à métabolisme C4 et il est généralement
admis qu’elles sont moins sensibles à l’ozone que les plantes à métabolisme C3.
Cette plus grande résistance pourrait être attribuée à des facteurs structurels et
biochimiques.
La diffusion de l’ozone ne pouvant pas se faire au travers de la cuticule, la
première ligne de défense des végétaux (en C3 ou en C4) contre les polluants
atmosphériques se compose des stomates qui assurent les échanges bidirectionnels
de vapeur d’eau et de CO2 ou de tout autre gaz. De fait, le maïs présente, en
conditions ambiantes d’ozone, une conductance stomatique (gs) faible, environ deux
fois plus faible que celle du blé. De plus, il a été montré qu’une exposition à l’ozone
de plants de maïs jeunes, au stade 5 feuilles, cultivés en pots, en conditions
contrôlées sous faible éclairement (350 µphotons.m-2.s-1) réduit la conductance
stomatique de l’ordre de 50 % et l’assimilation nette de 25 à 30% (Bagard et al.,
2015). On pourrait donc penser que l’ajustement stomatique est un des processus
biologiques expliquant la tolérance du maïs à l’ozone, une faible gs limitant l’entrée
du polluant photochimique. Cependant, les mesures de conductances stomatiques
effectuées au cours de cette étude ne sont pas en adéquation avec cette proposition.
En effet, à l’exception des derniers jours de fumigation, elles ne diminuent pas en
réponse à l’ozone.
Une diminution de la gs, s’accompagne généralement d’une diminution de
l’assimilation ; toutefois, le maïs comme toutes les plantes en C4, présente une
photosynthèse en deux étapes avec une spécialisation des cellules aboutissant à un
système de concentration du CO2 au niveau de la Rubisco, enzyme responsable de
la fixation du carbone. La feuille est structurée avec deux types de cellules
photosynthétiques, les cellules du mésophylle, avec des chloroplastes riches en
grana et dépourvus de Rubisco et les cellules de la gaine périvasculaire, avec des
chloroplastes de très grande taille pauvres en grana mais riches en Rubisco. Lorsque
les stomates sont ouverts, le CO2 diffuse dans la cavité sous-stomatique et passe
dans les cellules du mésophylle où il est converti en bicarbonate par une anhydrase
carbonique cytosolique. C’est sous cette forme qu’il est additionné par la PEPc
cytosolique au phosphoénolpyruvate pour former de l’oxaloacétate qui est transféré
dans les chloroplastes et réduit en malate. Ce dernier est ensuite exporté vers les
Discussion
86
cellules chlorophylliennes constituant la gaine périvasculaire pour y être décarboxylé
libérant ainsi une molécule de CO2 qui participe au cycle de Calvin grâce à la
Rubisco. Ce système de fixation en deux temps bien que plus coûteux en énergie
que la photosynthèse C3 (coût = 2 ATP supplémentaires par CO2 fixé) présente
l’avantage de saturer la fonction carboxylase de la Rubisco en augmentant d’un
facteur 3 à 10 (Sage and Stata, 2015) la concentration en CO2 au site actif et limitant
ainsi la fonction oxygénase (associée à la photorespiration) qui représente en
moyenne sur une plante en C3 en air ambiant 30% de l’activité totale de cette
enzyme. Par ailleurs, les caractéristiques de la PEPc, qui présente une Km six fois
plus petite pour HCO3- et donc une affinité six fois plus élevée pour le CO2 (sous sa
forme dissoute) que la Rubisco et une absence de fonction oxygénase, permettent
d’obtenir des vitesses de carboxylation d’environ 2 à 3 fois supérieures à celles des
plantes C3. Ainsi, le maïs peut assurer une forte photosynthèse sans avoir besoin
d’ouvrir très largement ses stomates, ce qui le préserve en théorie d’un flux entrant
d’ozone trop élevé. Cependant comme décrit précédemment, Bagard et al. (2015)
observent en réponse à l’ozone une diminution de l’assimilation nette allant jusqu’à
40%, qui peut être mise en relation avec des baisses de l’activité PEPc pouvant
atteindre 70%, la Rubisco présentant une baisse plus limitée (-30%) de son activité.
Nous ne disposons malheureusement pas d’information sur l’activité de ces enzymes
dans le cadre de notre expérimentation mais nos résultats montrant une baisse
significative de l’assimilation nette de l’ordre de 50% en réponse à l’ozone, il est donc
vraisemblable que l’activité Rubisco et/ou celle de la PEPc ont été affectées
négativement dans le cadre de notre étude. Cependant, cette sensibilité de l’appareil
photosynthétique ne se traduit pas par une perte au niveau du rendement. Ainsi, en
fonction du niveau d’intégration choisi dans la biologie des réponses du maïs à
l’ozone (biochimie photosynthétique ou rendement en biomasse), les conclusions
peuvent être en décalage (sensibilité ou résistance).
Les résultats décrits ci-dessus indiquent que d’autres éléments que ceux liés à
la gs et à la photosynthèse sont à prendre en compte pour expliquer l’absence d’effet
sur le rendement. La feuille de maïs possède une architecture particulière et est
organisée de telle façon qu’avant d’atteindre les cellules de la gaine et la Rubisco, le
parcours diffusif de l’O3 est particulièrement long et les cellules du mésophylle, bien
supérieures en nombre à celles de la gaine, représentent autant de sites
d’élimination potentielle de l’O3 et des ROS asociés. Après diffusion stomatique, il est
Discussion
87
admis que la réactivité de l’ozone ou de ses sous-produits (ROS) entraîne leur
élimination au contact des cellules du mésophylle dans ou à proximité de la chambre
sous-stomatique (Laisk 1989). Chez les plantes C3, la structure du parenchyme
lacunaire très lâche permet aux gaz et à l’ozone de diffuser jusqu’au parenchyme
palissadique, siège principal de la photosynthèse. Chez les plantes C4, l’absence de
parenchyme palissadique et la densité des cellules du mésophylle qui entourent la
gaine périvasculaire, sont des éléments qui peuvent assurer une certaine forme de
protection physique des cellules de la gaine, en allongeant le parcours diffusif de
l’ozone et en offrant par la même des opportunités supplémentaires au système
antioxydant de circonscrire les ROS avant qu’ils ne puissent entraîner des dégâts sur
la gaine, lieu de la fixation du carbone par la Rubisco. Ces éléments pourraient
fournir une explication aux résultats de Bagard et al. (2015), qui constatent, en
réponse à l’ozone, d’importantes baisses des activités PEPc (-70 %) tandis que
celles de la Rubisco sont moindres (-30 %). Les travaux de Singh et al. (2014) sur le
maïs mettent en évidence une augmentation des teneurs en radicaux hydroxyle et en
peroxyde d’hydrogène en réponse à l’ozone qui semble se limiter aux cellules de
garde des stomates et des trichomes. L’hypothèse avancée précédemment sur la
barrière physique que pourrait représenter le mésophylle chez les plantes C4 serait
une explication possible au confinement du stress oxydant et viendrait fournir un
argument supplémentaire en faveur d’une action protectrice de celui-ci sur les
cellules de la gaine périvasculaire. Ainsi, l’architecture cellulaire des feuilles de maïs
pourrait constituer une autre explication de l’absence d’effet de l’ozone sur le
rendement.
Cependant si la Rubisco semble relativement épargnée, la PEPc se retrouve
quant à elle clairement exposée à l’action oxydante des ROS. Les expériences
réalisées en FACE (Free-Air Carbon dioxyde Enrichment) ont mis en évidence que la
photosynthèse chez le maïs et plus généralement chez les plantes C4 était insensible
à l’augmentation de concentration en CO2 atmosphérique. Ces résultats s’expliquent
par le fait que les concentrations en CO2 à l’intérieur de la gaine périvasculaire sont
largement supérieures aux concentrations atmosphériques. Ils indiquent également
que les capacités d’assimilation primaire du carbone sont, à la différence des C3,
largement saturées chez les C4. La Rubisco apparaît alors comme l’enzyme limitant
la photosynthèse, ce qui suggère que l’activité PEPc est en excès chez le maïs.
Ainsi, une diminution de cette dernière, consécutive au stress oxydant, n’affecterait
Discussion
88
pas les niveaux d’assimilation demeurant suffisants pour garantir les rendements. Il
semble toutefois important de rappeler que les mesures que nous avons réalisées
n’ont concerné que la feuille de l’épi. Il n’est pas impossible que les autres feuilles
présentent des réponses photosynthétiques différentes ayant pu jouer un rôle dans
le maintien du rendement chez les plants ozonés.
Un élément supplémentaire à l’explication de la tolérance du maïs à l’ozone
pourrait impliquer les capacités antioxydantes. Une relation flux-réponse serait un
bon indicateur de son efficacité ; malheureusement la littérature est pauvre à ce
sujet, ce qui semble symptomatique des difficultés à établir une relation entre dose
d’ozone et rendement pour cette espèce végétale. Bagard et al. (2015) ont effectué
une synthèse entre paramètres physiologiques (échanges gazeux, teneurs en
chlorophylles), photosynthèse et activités Rubisco et PEPc. Le meilleur indice qu’ils
aient pu obtenir pour le maïs est le POD0,5. Le seuil de flux instantané de 0,5 nmol.m-
2.s-1 reflète un flux stomatique d’ozone entrant faible chez le maïs mais suggère
aussi de faibles capacités de détoxication des ROS. Les résultats de l’étude citée
montrent en effet des baisses des teneurs en chlorophylles (ainsi que des baisses
des activités PEPc et Rubisco, de l’assimilation), paramètres tous mesurés sur la
5ème feuille de plants juvéniles. Ces résultats sont-ils transposables à la feuille de
l’épi (en général de rang 10) et aux feuilles de rang supérieur ? En effet, des travaux
sur les niveaux de transcrits de la PEPc et de la Rubisco ont souligné des différences
physiologiques entre les 5ème feuilles et celles de l’épi. Si sur la première on
enregistre bien une diminution du nombre de transcrits en réponse à l’ozone, les
feuilles de l’épi présentent des comportements plus complexes avec dans certaines
conditions une augmentation du niveau des transcrits en réponse à l’ozone (Leitao et
al., 2007b), ce qui témoigne des réponses différentielles chez la plante en fonction
de l’étage foliaire. Toutefois, dans le cadre de notre expérimentation, des relations
dose-réponse ont pu être établies pour l’assimilation nette suggérant un indice POD
avec un seuil de flux instantané compris entre 0 et 1 nmol.m-2.s-1, valeurs qui sont
similaires à celles obtenues en conditions contrôlées (Bagard et al., 2015) et qui
suggèrent donc de faible capacité de détoxification chez le maïs.
La littérature rapporte des effets négatifs de l’ozone sur les capacités
photosynthétiques du maïs qui s’apparentent à la diminution de l’assimilation nette
Discussion
89
observée au cours notre expérimentation chez les plants de maïs surexposés à
l’ozone. Les études citées tout comme nos travaux n’appuient donc pas l’hypothèse
d’une résistance à l’ozone due à une régulation de son influx ; il faut donc rechercher
d’autres explications à l’absence d’impact de l’ozone sur nos rendements.
Une piste à creuser pour comprendre la stabilité des rendements dans
conditions de surexposition à l’ozone repose sur l’évolution du maïs depuis sa
domestication à nos jours. Les pressions de sélection qui lui on été appliquées ont
essentiellement cherché à améliorer les rendements. Ainsi, la commercialisation des
premiers cultivars de maïs hybrides dans les années 1930 a initié le début d’une
période de forte augmentation des rendements qui s’est intensifiée dans les années
1990 avec les progrès des biotechnologies et le développement des OGMs (Troyer,
2006). Plus récemment, il a été montré que l’augmentation des rendements chez les
cultivars les plus récents était due à l’amélioration des capacités photosynthétiques
et à leur maintien au-delà de l’anthèse (Li et al., 2014). Il semblerait par ailleurs que
les augmentations de rendement induites par l’amélioration génétique des hybrides
reposent avant tout sur une augmentation de leurs tolérances aux stress (Tollenaar
and Lee, 2002). Ainsi la sélection de cultivars toujours plus performants dans un
contexte où les teneurs en ozone troposphérique augmentent, serait une explication
plausible de l’absence d’effet de l’ozone sur le rendement.
Enfin le potentiel d’assimilation/translocation pourrait permettre au maïs de
maintenir des niveaux de rendements élevés malgré une diminution de ses capacités
photosynthétiques, grâce à une remobilisation efficace des ressources pour le
bouclage du cycle. Un tel phénomène a été suggéré chez Brassica campestris, chez
qui une exposition à l’ozone n’impacte pas les rendements en grains mais entraîne
une altération des tissus végétatifs (Black et al., 2007). Nous ne disposons
malheureusement pas d’information sur la remobilisation des ressources dans les
plants de notre dispositif. Cependant, il a été montré que chez le maïs la
remobilisation rapide du carbone depuis les tiges participait grandement au
remplissage des grains (Dwyer et al., 1995). Il est donc fortement possible que la
remobilisation des ressources carbonées et azotées par des mécanismes
d’hydrolyse depuis les tissus végétatifs jusqu’aux grains en cours de développement
participent au maintien des niveaux de rendements en réponse à l’ozone. La
Discussion
90
recherche de mécanismes compensatoires visant à pallier l’effet négatif de l’ozone
sur les capacités d’assimilation semble une voie intéressante pour permettre
l’établissement d’un nouveau type d’indice de POD spécifique au maïs en définissant
une intensité de stress ozoné au-delà de laquelle les mécanismes de compensation
ne seraient plus suffisants pour éviter les pertes de rendement.
Comme nous l’avons déjà répété, notre étude montre que le maïs est capable
de maintenir les niveaux de rendement classiquement attendus malgré une
exposition à des niveaux d’ozone qui dépassent le niveau critique de 13,9 ppb.h, au-
delà duquel on peut s’attendre à observer des pertes de rendement significatives.
Après avoir tenté de synthétiser les éléments physiologiques et génétiques qui
pourraient participer à ce maintien des rendements, il nous apparaît maintenant
légitime de nous interroger sur le bien-fondé de la relation exposition-réponse
actuellement retenue pour le maïs.
VI]-2-1 LIMITES DE LA RELATION EXPOSITION-REPONSE POUR LE
MAÏS
La relation disponible qui a permis la mise en place de l’essentiel des
modélisations de pertes de rendement du maïs en réponse à l’ozone (Van Dingenen
et al., 2009; Avnery et al., 2011b) se base sur la relation liant AOT40 et rendement
établie par Mills et al. (2007). Pour établir cette équation, les auteurs se sont basés
sur des données issues de trois articles de(Kress and Miller, 1985; Mulchi et al.,
1995; Rudorff et al., 1996) reposant sur deux expérimentations de fumigation en
chambres à ciel ouvert (open-top chambers, OTC). Chacune de ces études montre
un impact négatif de l’ozone sur le rendement du maïs. Nous allons discuter des
différences expérimentales entre ces trois études et la nôtre.
Une différence majeure réside dans le fait que nous avons mené notre étude
en champ à l’aide d’un système de fumigation ouvert, afin de s’approcher au plus
près des conditions réelles de cultures, alors que les trois études citées
précédemment ont toutes été menées en chambre à ciel ouvert. Or, les limites ce
type de système sont connues depuis longtemps et sont responsables de nombreux
biais expérimentaux (Fuhrer, 1997). Le simple fait que les OTCs soient des
chambres transparentes induit des différences environnementales importantes entre
Discussion
91
l’intérieur et l’extérieur de la chambre bien que leur sommet soit ouvert. Les plantes
qui y poussent ne sont pas exposées aux mêmes conditions que celles se
développant en champ. Le rayonnement solaire qui pénètre les chambres est en
partie intercepté par les parois, tout comme les précipitations, les pathogènes n’y
circulent pas librement. L’accumulation et la distribution des gaz sont également
modifiées du fait de l’existence de turbulences. Dans le cas d’une exposition à l’O3,
les concentrations en ozone ambiant sont plus élevées à l’intérieur qu’à l’extérieur de
la chambre (Fuhrer, 1997; Long et al., 2005). Au champ, les feuilles basses d’un
couvert végétal échangent moins avec l’atmosphère que les feuilles plus hautes. Or,
dans les OTCs, les turbulences permettent des transferts de gaz vers l’ensemble des
feuilles, souvent sans relation avec leur position verticale. Ainsi, en augmentant la
surface foliaire d’échanges gazeux, les effets étudiés sont souvent exacerbés. De
plus, en agronomie et en écologie, les expérimentations menées en petites parcelles
isolées ont tendance à surestimer les effets des traitements sur la biomasse, la
productivité et le rendement (Roberts et al., 1993). Les expériences menées en OTC
ne représentent donc pas des expérimentations agronomiques robustes et devraient
idéalement s’accompagner d’expérimentations en champ afin d’infirmer ou d’affirmer
les résultats observés en chambre (McLeod and Long, 1993)
Les données qui ont conduit à l’établissement de la relation exposition-
réponse de Mills et al. (2007) pour le rendement du maïs correspondent à un petit jeu
de données qui de plus ne satisfait pas aux trois critères énoncés par Holland et al.
(2006) qui, d’après les auteurs, garantissent une certaine robustesse à ce type
d’équation. Ces critères sont : un minimum de cinq cultivars testés, dans au moins
deux zones climatiques différentes, le tout pour un minimum de 20 expérimentations
conduites. Le décalage entre nos observations et les prévisions issues de ces
modélisations est donc très certainement due aux lacunes dans nos connaissances
des effets de l’ozone sur le maïs et invite à remettre en cause la relation exposition-
réponse liant ozone et maïs en tenant compte de nos résultats.
VI]-3 Evolution des teneurs en protéines foliaires au cours du développement et en réponse à l’ozone .
Discussion
92
Afin d’évaluer la progression de la sénescence foliaire au cours de la période
de fumigation, deux paramètres indicateurs de ce processus ont été mesurés : la
teneur en protéines foliaires solubles, connue pour diminuer avec l’âge et en réponse
aux contraintes environnementales, par l’intermédiaire de mécanismes d’autolyse
(Breeze et al., 2011; Guiboileau et al., 2013) ; la teneur en chlorophylles totales,
considérée comme un bon indicateur de la sénescence (Gepstein, 2004; Munné-
Bosch and Alegre, 2004).
Les mesures effectuées sur la feuille de l’épi de plants exposés aux
concentrations ambiantes d’ozone montrent une diminution continue et progressive
des teneurs en protéines foliaires solubles totales avec l’âge des feuilles, confirmant
ainsi le lien entre vieillissement et teneur en protéines foliaires évoqué plus haut. La
teneur en protéines foliaires solubles totales diminue également en réponse à
l’ozone et ceci d’autant plus que le niveau d’exposition à l’ozone est élevé. Ces
résultats viennent appuyer l’idée d’une accélération de la sénescence induite par
l’ozone.
L’hypothèse d’une relation entre rendement et sénescence est ancienne
(Thomas and Stoddart, 1980) et se base sur les postulats que : 1) la teneur en
chlorophylles totales est un bon indicateur de la sénescence et que 2) le maintien de
l’activité photosynthétique à des niveaux élevés a un effet positif sur le rendement.
Chez le maïs, en adéquation avec 1) le rendement dépend principalement du
maintien des capacités photosynthétiques (Borrás et al., 2004). C’est en tout cas ce
que semble confirmer notre étude, en effet, si l’assimilation nette est bien réduite par
l’ozone, les teneurs en chlorophylles totales quant à elles varient peu. Les plants de
maïs exposés aux niveaux ambiants d’ozone présentent en effet des teneurs en
chlorophylles totales constantes pour la feuille de l’épi tout au long de la période de
fumigation. Ceci pourrait indiquer que la feuille de l’épi n’a pas amorcé son entrée
en sénescence durant la période de nos observations. Bien que l’analyse statistique
révèle une diminution significative des teneurs en chlorophylles en réponse à l’ozone
pour les plants fortement exposés, la différence avec les plants contrôles est
néanmoins très faible et empêche de conclure à une entrée en sénescence
accélérée. Nos résultats diffèrent de ceux obtenus chez d’autres espèces végétales
dont les teneurs foliaires en chlorophylles diminuent en réponse aux traitements à
Discussion
93
l’ozone (Bagard, 2008; Feng et al., 2011; Caregnato et al., 2013). Cependant, ils
présentent certaines similitudes avec ceux d’autres études sur le maïs. Tout d’abord,
avec celle de (Leitao et al., 2007a) montrant que des teneurs en chlorophylles totales
et en caroténoïdes augmentent dans les feuilles de l’épi exposées à des AOT40 de
plus de 10 ppm.h. En revanche, des AOT40 plus élevés, de l’ordre de 14,6 ppm.h,
entraînent une baisse de 20% des teneurs en chlorophylles totales. Dans notre
étude, une AOT comparable de 14,9 ppm.h n’impacte pas du tout ce paramètre. Il
faut noter que l’étude de Leitao et al. (2007a) a été conduite en OTC, avec les limites
de ce type de système, décrites dans le paragraphe (5]-2-1) (notamment les risques
de surexposition). Une seconde étude, celle de (Singh et al., 2014b) également
conduite en OTC, montre des augmentations des teneurs en chlorophylles totales et
en caroténoïdes en réponse à l’ozone et ceci pour des niveaux d’AOT40 allant
jusqu’à 20,6 ppm.h. Parallèlement, ces auteurs observent une diminution des
teneurs en protéines en réponse à l’ozone et à l’âge. L’ensemble de ces éléments
indiquent que le maïs parvient à maintenir, voire à augmenter dans certaines
conditions expérimentales, ses teneurs en chlorophylles totales et en caroténoïdes
malgré l’exposition à des doses d’ozones conséquentes. Ce maintien/ajustement des
teneurs en pigments foliaires observé assez fréquemment semble correspondre à
une spécificité de réponse du maïs qui participerait à sa tolérance à l’ozone. Les
pigments chlorophylliens offriraient l’avantage d’aider au maintien de la
photosynthèse en captant l’énergie lumineuse, alors que la très probable
augmentation des caroténoïdes fournirait un surplus de pouvoir réducteur permettant
de limiter les effets de l’ozone.
Cependant, comme décrit précédemment, les mécanismes de sélection ont
favorisé le maintien des capacités photosynthétiques au cours du développement du
maïs (LI et al., 2015). Ceci invite à remettre en cause le consensus selon lequel les
teneurs en chlorophylles sont des indicateurs de sénescence, rôle les teneurs en
protéines foliaires sont plus à même de tenir.
Discussion
94
VI]-4 IMPACT DU STRESS OXYDANT INDUIT PAR L’OZONE SUR LES
COMPOSANTS CELLULAIRES DE FEUILLES DE MAÏS
VI]-4-1 EVOLUTION DU NIVEAU DE CARBONYLATION DES PROTEINES
AU COURS DU DEVELOPPEMENT DU MAÏS ET EN REPONSE A L’OZONE
La teneur en groupements carbonyle est considérée comme un bon indicateur
du niveau global d’oxydation des protéines (Møller et al., 2011). Dans les feuilles de
l’épi, les profils globaux d’oxydation observés au cours de notre étude (données non
montrées) révèlent un signal de carbonylation sur une large gamme de protéines.
Ces résultats semblent en adéquation avec ceux de la littérature, en effet Prins et
al.(2011), ont montré que le niveau de carbonylation est fortement corrélé à l’âge des
feuilles chez le maïs, et les profils d’oxydation qu’ils présentent pour les feuilles 9 à
12 sont similaires à ceux que nous avons obtenus pour la feuille 10 (feuille de l’épi).
Au cours de l’expérimentation, les variations des niveaux de carbonylation
dans les feuilles des plants traités ont une allure de cloche inversée, avec des
niveaux maximum au moment de la floraison et en fin de traitement à l’ozone. Ces
résultats soulignent l’importance du stade de développement sur le niveau global
d’oxydation des protéines. La pré-floraison - floraison en particulier apparaît comme
un stade critique durant lequel les ROS endogènes joueraient le rôle de molécules
signal (Tripathi, 2007; Martín et al., 2013) et pendant lequel un niveau élevé
d’oxydation global des protéines peut être mesuré (Johansson et al., 2004; Havé et
al., 2015). Après la floraison, on observe une diminution du niveau d’oxydation global
des protéines foliaires, qui a également été observé chez Arabidopsis (Johansson et
al., 2004; Qiu et al., 2008) Ces résultats soulèvent des questions intéressantes qui
dépassent le cadre de notre étude, sur le rôle possible de la carbonylation au cours
du développement des plantes et sur les mécanismes mis en place par les plantes
pour gérer les niveaux d’oxydation de leurs protéines au cours de leur cycle de
développement.
L’augmentation du niveau de carbonylation des protéines dans les feuilles
âgées et surexposées à l’ozone est vraisemblablement liée à la progression de la
sénescence et à la baisse des capacités antioxydantes dans la feuille de l’épi. Il est
en effet admis que la sénescence s’accompagne d’une baisse des activités de
Discussion
95
certaines enzymes antioxydantes (Foyer and Noctor, 2009). Toutefois, si les résultats
concernant le dernier prélèvement foliaire (P4) indiquent bien une augmentation des
teneurs en groupements carbonyle pour toutes les conditions testées, ils indiquent
également une baisse significative de ces dernières en réponse à l’ozone, ce qui va
à l’encontre de ce que l’on pourrait attendre.(Fig.35). Cependant, la littérature
rapporte des résultats indiquant le maintien ou l’activation de la machinerie
antioxydante en réponse à une contrainte hydrique par exemple (Hameed et al.,
2011; Pyngrope et al., 2012). Singh et al. (2014) ont également relevé une
augmentation des activités des enzymes antioxydantes, telles que la superoxyde
dismutase, la glutathion réductase ou l’ascorbate peroxydase, chez des plants de
maïs surexposés à l’ozone. La baisse des niveaux de carbonylation observée dans
notre étude serait alors une conséquence de la lutte contre les ROS.
Cependant il est important de rappeler que ces dernières observations
s’opposent aux conclusions tirées précédemment sur le PODy qui suggère de faibles
capacités détoxifiantes de la machinerie antioxydante. Nous ne disposons
malheureusement pas d’élément permettant d’expliquer ce décalage, mais cela invite
à poursuivre les investigations sur les capacités antioxydantes du maïs.
VI]-4-2 CARACTERISATION DES TENEURS EN ROS AU COURS DU
DEVELOPPEMENT DU MAÏS ET EN REPONSE A L’OZONE
Les teneurs en ROS chez les plants exposés aux concentrations ambiantes
d’ozone sont maximales en début d’expérimentation et diminuent significativement
ensuite pour se maintenir à un niveau plus ou moins constant. Ces résultats
semblent corroborer la discussion précédente concernant l’importante implication des
ROS durant la floraison. De plus, ils peuvent directement expliquer les niveaux
d’oxydation des protéines foliaires observés à ce stade de développement.
En réponse aux traitements à l’ozone, ce n’est que pour les plants les plus
fortement exposés et en fin d’expérimentation que l’on observe une forte
augmentation des teneurs foliaires en ROS qui peuvent être imputée à l’intensité du
niveau d’ozonation. Pour ces plantes, on n’observe pas d’augmentation de la teneur
en groupements carbonyle, comme cela pourrait être attendu (Fig.34). Une
Discussion
96
explication possible à cette apparente contradiction est que la formation de
groupements carbonyle sur les protéines nécessite l’intervention d’espèces
radicalaires de type hydroxyle (Blakeman et al., 1998) alors que les ROS mesurés ne
sont pas de nature radicalaire. De fait, la technique utilisée pour mesurer les ROS fait
appel à une sonde H2DCFDA développée pour être spécifique du peroxyde
d’hydrogène et dont quelques auteurs ont pu montrer qu’elle pouvait réagir avec
d’autre ROS tel que le radical hydroxyle HO° (Myhre et al., 2003; Gomes et al.,
2005). L’accumulation de ROS observée dans les échantillons foliaires et fortement
exposés à l’ozone pourrait donc correspondre essentiellement à une accumulation
de H2O2, incapable d’induire des carbonylations sur les protéines. Cette
accumulation de H2O2 pourrait provenir de la réaction de dismutation de l’anion
radicalaire superoxyde O2- en H2O2 catalysée par la superoxyde dismutase dont la
stimulation en réponse à l’ozone a été évoquée précédemment (Singh et al., 2014b).
VI]-4-3 EVOLUTION DU NIVEAU DE PEROXYDATION LIPIDIQUE AU
COURS DU DEVELOPPEMENT DU MAÏS ET EN REPONSE A L’OZONE
Les niveaux de peroxydation lipidique ont été évalués en mesurant les
niveaux de MDA grâce à la méthode TBARS (Hodges et al., 1999)). Bien que cette
technique ne permette qu’une détermination indirecte de la peroxydation lipidique,
elle demeure celle qui est la plus utilisée.
Comme les deux paramètres discutés précédemment, le niveau de
peroxydation lipidique est maximal en début d’expérimentation et plus ou moins
constant pendant le reste de la période d’observation. Différentes études ont
montrées que les lipides constituaient des cibles privilégiées des ROS (Anjum et al.,
2015; Chmielowska-Bak et al., 2015). Des augmentations de la peroxydation
lipidique en réponse à l’ozone ont d’ailleurs été observées : chez la pomme de terre
(Kumari et al., 2015), mais également chez le maïs pour lequel il existe une
corrélation entre niveau de peroxydation lipidique et teneur en ROS (Singh et al.,
2014b). Ceci pourrait donc expliquer les similitudes dans l’évolution des teneurs en
ROS et de celles de la peroxydation lipidique au cours de la période de fumigation.
Discussion
97
La condition d’exposition à l’ozone à un effet significatif sur la
peroxydation lipidique (p<0,05). En effet, si les plants surexposés à l’ozone
connaissent des évolutions de leur peroxydation lipidique similaires à celle des plants
exposés aux niveaux d’ozone ambiants, les plants cultivés à 2 m de la rampe
affichent des niveaux significativement inférieurs à ceux des plants contrôles. Ainsi la
logique habituelle consistant à expliquer des niveaux de peroxydation lipidique par
des teneurs en ROS rencontre ici ses limites. Néanmoins, la mise en place de
mécanismes antioxydants en réponse à l’ozone, déjà évoquée précédemment dans
l’étude de Singh et al. (2014), pourrait fournir une explication à nos résultats
originaux. Il est tout de même important de noter que les auteurs ont observé une
augmentation des teneurs en MDA pendant leur expérience, contrairement à nous. Il
est néanmoins possible que ces différences des niveaux de peroxydation lipidique
entre notre étude et la leur soient dues aux conditions expérimentales : en effet, au
cours de notre expérimentation, le maïs n’a pas été irrigué (les précipitations ont été
considérées comme suffisantes) et bien que 2011 ne fut pas une année
particulièrement aride, il reste toutefois possible que les conditions en champ
(intensité lumineuse, par exemple) aient induit la synthèse de molécules
antioxydantes telles que le tocophérol. Ce dernier est connu pour être produit en
réponse à la sécheresse et aux stress oxydants. L’α-tocopherol en particulier, a la
particularité d’inhiber la propagation de la peroxydation lipidique et de l’oxygène
singulet (Munné-Bosch and Alegre, 2004). Bien que le rôle joué par ces molécules
dans notre étude demeure de l’ordre du postulat, il présente l’avantage d’expliquer
en partie les évolutions des teneurs en ROS, des niveaux de peroxydations
lipidiques et de carbonylation des protéines. Tout ceci ouvre d’intéressantes voies de
recherche. De plus, chez le maïs, ces molécules semblent jouer un rôle dans
l’exportation des photoassimilats depuis les feuilles vers les organes puits (Sattler et
al., 2003), ce qui pourrait avoir contribué au maintien des rendements pour les plants
ozonés de notre étude.
VI]-5 CARACTERISATION DE LA PROTEOLYSE EN REPONSE A
L’OZONE VI]-5-1 ACTIVITES ENDOPROTEOLYTIQUES TOTALES
Discussion
98
Les données de la littérature concernant l’impact de l’ozone sur l’activité
protéolytique des feuilles de maïs sont très limitées. Les travaux d'Ahmad et al
(2012-2014) ont mis en évidence le rôle des métacaspases dans de telles réponses.
D’une manière générale, les protéases présentent des pH d’activité optimale très
variables (Tsiatsiani et al., 2011). C’est pourquoi nous avons établi un profil de
l’activité endoprotéolytique totale en fonction du pH (Fig.36). Ce dernier a montré que
les essais menés à partir d’extraits foliaires de maïs obtenus dans nos conditions
expérimentales présentaient un maximum d’activité en réponse à l’ozone aux
alentours de pH=6. Ceci laisse à penser que l’essentiel des activités
endoprotéolytiques dans les feuilles de maïs correspond aux protéases vacuolaires
(Vierstra, 1996).
En condition ambiante d’ozone, les activités endoprotéolytiques dans la feuille
de l’épi augmentent brutalement en fin d’expérimentation, augmentation en lien avec
le processus de sénescence naturelle. L’augmentation des activités
endoprotéolytiques vacuolaires avec la sénescence a déjà été mise en évidence
chez d’autre espèces : chez le blé (Triticum sp) (Martínez et al., 2007; Havé et al.,
2015), chez le haricot niébé (Vigna unguiculata) (Khanna-Chopra et al., 1999) et le
haricot (Phaseolus vulgaris) (Hieng et al., 2004)
Une stimulation de l’activité protéolytique en réponse à une exposition
chronique à l’ozone a déjà été montrée chez le maïs (Ahmad, 2012), mais également
chez le blé (Havé, 2013). Cependant, dans le cadre de notre étude, l’ozone n’a pas
d’effet significatif sur l’activité endoprotéolytique totale bien qu’une tendance à
l’augmentation de cette activité se dessine très clairement en fin d’expérience
(fig.32). Ces résultats peuvent paraître surprenant au regard des différences entre
les valeurs de fluorescence moyennes constatées pour les différentes conditions
(fig.32) ; cependant la dispersion des points en fin d’expérimentation (P4) semble
correspondre à une période charnière, à partir de laquelle l’effet combiné de l’âge et
de l’ozone fait augmenter considérablement l’activité des protéases vacuolaires dans
une partie des individus analysés, tandis que d’autres semblent parvenir à maintenir
une certaine homéostasie cellulaire.
Discussion
99
L’augmentation des activités endoprotéolytiques foliaires a pu être associée à
la baisse des teneurs en protéines solubles chez le blé, en réponse à la sécheresse
(Simova-Stoilova et al., 2010) et à l’ozone (Havé, 2013). Nos résultats fournissent
peu d’arguments en faveur d’une telle relation chez le maïs. En effet la baisse
observée des teneurs en protéines, en réponse à l’ozone est progressive, alors que
l’augmentation des activités endoprotéolytiques est brutale, en fin d’expérience. Les
baisses de teneurs en protéines au cours de la période de fumigation, liées à la
sénescence et celles dues à l’ozone doivent donc dépendre de différents
mécanismes de régulation de la protéolyse.
Le rôle du protéasome 26S en réponse aux contraintes biotiques (Dielen et
al., 2010) et abiotiques (Kumar and Venkateswarlu, 2011) est largement reconnu
comme un mécanisme de régulation et défense des plantes permettant la
dégradation des protéines altérées. Toutefois, la dégradation des protéines oxydées
est généralement attribuée au protéasome 20S (Basset et al., 2002; Kurepa and
Smalle, 2008; Polge et al., 2009). Les agrégats que les protéines oxydées ont
tendance à former lors de contraintes oxydantes sévères en font de mauvais
substrats pour le protéasome 20S (Basset et al., 2002) et seraient alors dégradés par
les protéases de la vacuole, vers lesquelles les agrégats sont transportés par macro-
autophagie (Xiong et al., 2006). Bien qu’hypothétique, l’action du protéasome 20S
pourrait être responsable des baisses de teneurs en protéines foliaires solubles
mises en œuvre progressivement, tandis que les protéases vacuolaires seraient
majoritairement responsables de celles observées en toute fin d’expérience.
On peut également proposer que l’augmentation de l’activité des protéases
vacuolaires à P4 soit la résultante des deux processus suivants : la progression de la
sénescence des feuilles (ce qui correspondrait aux mécanismes de remobilisation de
l’azote et du carbone depuis les tissus foliaires vers les grains) et la présence de
l’ozone qui ne fait que modifier l’intensité des mécanismes déjà en place. Si ce
surcroît d’activité protéolytique chez les plants exposés correspond à une
augmentation de la remobilisation des ressources depuis les tissus foliaires vers les
grains, les plants disposeraient ainsi d’un mécanisme supplémentaire pour limiter les
effets du polluant sur le remplissage de leurs grains.
Discussion
100
VI]-5-2 ACTIVITES ENDOPROTEOLYTIQUES SPECIFIQUES
L’utilisation d’inhibiteurs dits spécifiques a eu pour but de déterminer le niveau
d’implication des quatre grandes classes de protéases (protéases à cystéine,
protéases à sérine, protéases à aspartate et métalloprotéases) dans la protéolyse
globale discutée ci-dessus. Des difficultés d’ordre technique nous ont poussé à
écarter les résultats concernant les classes des protéases à aspartate et des
métalloprotéases.
Le suivi des activités des protéases à cystéine et à sérine a permis de mettre
en évidence des implications différentes de ces deux classes de protéases, au cours
du développement et en réponse à l’ozone. Les protéases à sérine sont peu
affectées par l’ozone, tandis que les protéases à cystéine présentent des activités
qui augmentent progressivement à la fois avec l’âge des feuilles et avec la dose
d’ozone. En fin d’expérimentation, elles finissent par représenter la classe majoritaire
de protéases (Fig.33-A). Si nous avons été surpris par les faibles proportions
d’activités totales mesurées pour cette classe de protéase sur les échantillons
provenant des trois premiers prélèvements, en comparaison de ce que la littérature
rapporte (Wiśniewski and Zagdańska, 2001; Grudkowska and Zagdańska, 2004), ces
résultats restent cohérents avec le rôle généralement attribué aux protéases à
cystéine : en effet ces dernières sont connues pour être spécifiquement impliquées
dans les mécanismes de remobilisation lors des phénomènes de sénescences,
naturels ou induits (Grudkowska and Zagdańska, 2004; Lim et al., 2007)
Les réponses à l’ozone de ces deux classes de protéases indiquent que le
maïs, tout en affichant des niveaux d’activités endoprotéolytiques totales peu
influencés par l’ozone, connaît d’importantes variations dans l’activité spécifique de
ses protéases vacuolaires. A la suite de cette étude les protéases à cystéine
apparaissent comme de meilleures candidates au rôle de marqueurs de sénescence
en réponse à une exposition à l’ozone que l’activité endoprotéolytiques totale et
invite à poursuivre les recherche sur les activités spécifiques.
Conclusions et Perspectives
101
VII] CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Au cours de cette étude nous avons cherché à mieux appréhender les
conséquences qu’une augmentation des teneurs en ozone troposphérique pourrait
avoir sur le rendement de maïs. Il s’agit d’un paramètre intégratif et les lacunes sur
sa variabilité en réponse à l’ozone sont importantes. C’est pourquoi nous avons
délibérément choisi une approche transversale qui nous a permis d’aborder la
question en interrogeant différents niveaux d’intégration et de reconsidérer la
sensibilité du maïs à l’ozone.
Contrairement aux attentes des concepteurs de l’expérimentation et
contrairement à ce que la littérature laissait présager, les conséquences sur les
paramètres de rendement qui ont été mesurés sont pour ainsi dire insignifiantes
« agronomiquement ». Ainsi, une grande partie de nos efforts a consisté à explorer
différents paramètres physiologiques et biochimiques, dans le but de découvrir
quelles pouvaient être les propriétés du maïs responsables de cette absence d’effet.
Les différentes techniques utilisées et leurs résultats ont permis d’avancer un certain
nombre d’hypothèses sur les processus déclenchés par l’ozone, sans pour autant
permettre de proposer d’explications totalement satisfaisantes. Ce qui est sûr
néanmoins, c’est que nos conclusions relatives aux conséquences de l’ozone sur le
maïs ne sont pas aussi alarmantes que celles tirées des modélisations actuelles. De
plus, nos conclusions appellent à une reconsidération de la relation exposition-
réponse communément admise actuellement, ainsi qu’à une modification du niveau
critique associé à cette relation. Enfin, nos résultats ont montré que le maïs apparaît
comme résistant à l’ozone au regard des paramètres de rendement, mais également
sensible à l’ozone en fonction de certains paramètres biologiques qui sont perturbés
en réponse au polluant. Cette dernière observation laisse présager de véritables
pertes de rendement en cas d’expositions à l’ozone plus longues ou/et plus intenses.
Importance du dispositif expérimental
Le premier point sur lequel il semble bon de revenir concerne le dispositif
expérimental. L’essentiel des connaissances sur le comportement du maïs en
Conclusions et Perspectives
102
réponse à l’ozone est tiré d’expérimentations en conditions contrôlées. Si les
avantages et les limitations de ce type de protocoles expérimentaux sont connus
depuis longtemps, il apparaît primordial de compléter ces études par des
expérimentations en champ afin de s’approcher au mieux des conditions « réelles »
de culture, en particulier pour les plantes de forts intérêts agronomiques et
économiques telles que le maïs. Ceci devrait permettre de proposer des relations
dose-réponse plus robustes et donc la mise en place de modèles plus réalistes. Au
final, les acteurs du milieu agricole obtiendraient des éléments solides pouvant les
aider à des prises de décision raisonnables.
Impact de l’ozone sur la physiologie du maïs
Comme expliqué plus haut, l’absence d’effet observé des traitements à
l’ozone sur le rendement n’est pas synonyme d’absence d’effet biologique et un
certain nombre de modifications physiologiques et biochimiques sont à noter. La
faible conductance stomatique des C4 est souvent considérée comme le premier
argument en faveur de leur tolérance à l’ozone. Il est intéressant de rappeler, en ce
qui concerne notre étude, la faible différence entre les plants ayant poussé en
condition ambiante et ceux ayant été exposés à l’ozone, pour ce paramètre. Il
semble donc que la régulation stomatique ne corresponde pas, chez le maïs, à un
mécanisme de défense face à l’ozone. Par conséquent, sa capacité à maintenir des
rendements élevés est basée sur des propriétés de tolérance intracellulaires. L’une
des conséquences majeures de l’influx d’ozone est la diminution de l’assimilation
nette, qui correspond plus à une altération probable de la PEPC qu’à celle de la
Rubisco (moins exposée) ou qu’à une diminution des chlorophylles totales
(maintenues à un niveau stable tout au long de la période expérimentale). Il
semblerait donc qu’une des stratégies du maïs pour maintenir ses niveaux de
rendement en réponse à l’ozone, passerait par une préservation des pigments
foliaires. Une telle stratégie présente les avantages de préserver la machinerie
énergétique de la plante tout en limitant le stress oxydant induit par l’ozone et le
stress photo-oxydatif propre à la photosynthèse. Les causes des pertes en protéines
foliaires en réponse à l’ozone n’ont pu être clairement déterminées. En effet, ces
pertes ne semblent pas être liées uniquement à des augmentations de l’activité
endoprotéolytique totale. C’est pourquoi il faut considérer d’autres phénomènes
Conclusions et Perspectives
103
comme une diminution des activités de synthèse protéique, et/ou l’implication
d’autres mécanismes de dégradation protéiques incluant le protéasome 26S, ou plus
probablement sa sous-unité 20S.
Impact de l’ozone sur les niveaux d’oxydation des molécules biologiques et
sur les teneurs en ROS dans les feuilles
Bien que les valeurs de PODy obtenues laissent entrevoir de faibles capacités
antioxydantes, l’impact de l’ozone sur les protéines et les lipides correspond à une
baisse de leur niveau d’oxydation. On ne peut donc pas écarter l’hypothèse d’une
prise en charge rapide des éléments oxydés et une sur-activation des enzymes
antioxydantes. La SOD en particulier est une bonne candidate pouvant assurer la
limitation de la multiplication des groupements carbonyles tout en expliquant
l’accumulation des ROS (sous la forme H2O2). Une caractérisation précise des
niveaux d’activités des enzymes antioxydantes et des teneurs en composés
antioxydants non-enzymatiques (ascorbate, tocophérols…) permettrait sans doute
d’éclaircir ces observations.
Activités endoprotéolytiques foliaires en réponse à l’ozone
Les activités endoprotéolytiques foliaires totales ne sont pas induites par
l’ozone, ce dernier ne faisant qu’exagérer les variations des activités
endoprotéolytiques liées à l’avancée en âge des tissus. Toutefois, l’étude de la
protéolyse totale complétée par le suivi d’activités spécifiques à certaines classes
d’endoprotéases a présenté un intérêt certain. Elle a permis, entre autre, de montrer
l’implication croissante des protéases à cystéine dans l’activité endoprotéolytique
totale, en réponse à une augmentation de l’intensité du stress et à la durée de
l’exposition. Ceci suggère que ce type d’activité protéolytique pourrait constituer un
bon indicateur de l’impact de l’ozone sur le maïs.
De plus d’un point de vue méthodologique, cette étude a permis de
développer une méthode de suivi en temps réel de la protéolyse. Cette méthode
présente l’avantage d’être rapide et reproductible, tout en permettant le suivi
simultané des activités endoprotéolytiques totales et spécifiques. La caractérisation
Conclusions et Perspectives
104
d’autres classes de protéases devrait permettre d’établir rapidement des profils
d’activités et ainsi de mieux comprendre le rôle de chaque classe de protéase dans
la réponse aux stress.
La conclusion principale de ce travail de thèse reste la mise en évidence de la
tolérance du maïs à l’ozone, qui malgré des niveaux conséquents d’exposition,
parvient à maintenir son rendement au niveau de celui de plants exposés à des
conditions ambiantes d’ozone. Nos observations soulèvent également de
nombreuses interrogations quant à la compréhension des raisons de cette tolérance
et ouvre de nombreuses perspectives de recherche, que ce soit dans la
compréhension de ses mécanismes de défenses ou dans celles des mécanismes de
compensation.
Bibliographie
105
VII] BIBLIOGRAPHIE
Ahmad R (2012) Effet de l ’ ozone troposphérique sur la physiologie des feuilles de
maïs ( Zea mays L .) : étude de gènes impliqués dans le catabolisme cellulaire.
Ahmad R, Zuily-Fodil Y, Passaquet C, Bethenod O, Roche R, Repellin A (2012)
Ozone and aging up-regulate type II metacaspase gene expression and global
metacaspase activity in the leaves of field-grown maize (Zea mays L.) plants.
Chemosphere 87: 789–795
Ahmad R, Zuily-Fodil Y, Passaquet C, Bethenod O, Roche R, Repellin A (2014)
Identification and characterization of MOR-CP, a cysteine protease induced by
ozone and developmental senescence in maize (Zea mays L.) leaves.
Chemosphere 108: 245–50
Anjum NA, Sofo A, Scopa A, Roychoudhury A, Gill SS, Iqbal M, Lukatkin AS,
Pereira E, Duarte AC, Ahmad I (2015) Lipids and proteins—major targets of
oxidative modifications in abiotic stressed plants. Environ Sci Pollut Res 22:
4099–4121
Ashmore MR (2005) Assessing the future global impacts of ozone on vegetation.
Plant, Cell Environ 28: 949–964
Avnery S, Mauzerall DL, Fiore AM (2013) Increasing global agricultural production
by reducing ozone damages via methane emission controls and ozone-resistant
cultivar selection. Glob Chang Biol 19: 1285–99
Avnery S, Mauzerall DL, Liu J, Horowitz LW (2011a) Global crop yield reductions
due to surface ozone exposure: 2. Year 2030 potential crop production losses
and economic damage under two scenarios of O3 pollution. Atmos Environ 45:
2297–2309
Avnery S, Mauzerall DL, Liu J, Horowitz LW (2011b) Global crop yield reductions
due to surface ozone exposure: 1. Year 2000 crop production losses and
economic damage. Atmos Environ 45: 2284–2296
Badu-Apraku B, Hunter R, Tollenaar M (1983) Effect of temperature during grain
filling on whole plant and grain yield in maize (Zea mays L.). Can J Plant … 363:
357–363
Bagard M (2008) Impact de l’ozone sur les processus photosynthétiques et
photorespiratoires du peuplier (Populus x canescens [Aiton] Sm.) au cours du
développement foliaire.
Bagard M, Jolivet Y, Hasenfratz-Sauder M-P, Gérard J, Dizengremel P, Le Thiec
D (2015) Ozone exposure and flux-based response functions for photosynthetic
Bibliographie
106
traits in wheat, maize and poplar. Environ Pollut 206: 411–420
Bartoli CG (2004) Mitochondria are the main target for oxidative damage in leaves of
wheat (Triticum aestivum L.). J Exp Bot 55: 1663–1669
Basset G, Raymond P, Malek L, Brouquisse R (2002) Changes in the expression
and the enzymic properties of the 20S proteasome in sugar-starved maize roots.
evidence for an in vivo oxidation of the proteasome. Plant Physiol 128: 1149–
1162
Ben-Asher J, Garcia Y Garcia a., Hoogenboom G (2008) Effect of high
temperature on photosynthesis and transpiration of sweet corn (Zea mays L. var.
rugosa). Photosynthetica 46: 595–603
Berlett BS (1997) Protein Oxidation in Aging, Disease, and Oxidative Stress. J Biol
Chem 272: 20313–20316
Birch CJ, Vos J, Van der Putten PEL (2003) Plant developement and leaf area
production in contrasting cultivars of maize grown in a cool temperature
environment in the field. Eur J Agron 173–188.
Black VJ, Stewart C a., Roberts J a., Black CR (2007) Ozone affects gas
exchange, growth and reproductive development in Brassica campestris
(Wisconsin Fast Plants). New Phytol 176: 150–163
Blakeman DP, Ryan TP, Jolly R a, Petry TW (1998) Protein oxidation: examination
of potential lipid-independent mechanisms for protein carbonyl formation. J
Biochem Mol Toxicol 12: 185–90
Bonhomme R (2000) Bases and limits to using “degree.day” units. Eur J Agron 13:
1–10
Borrás L, Slafer GA, Otegui ME (2004) Seed dry weight response to source–sink
manipulations in wheat, maize and soybean: a quantitative reappraisal. F Crop
Res 86: 131–146
Bozaykut P, Sozen E, Kaga E, Ece A, Ozaltin E, Ek B, Ozer NK, Grune T,
Bergquist J, Karademir B (2013) The role of heat stress on the age related
protein carbonylation. J Proteomics 89: 238–254
Breeze E, Harrison E, McHattie S, Hughes L, Hickman R, Hill C, Kiddle S, Kim Y
-s., Penfold CA, Jenkins D, et al (2011) High-Resolution Temporal Profiling of
Transcripts during Arabidopsis Leaf Senescence Reveals a Distinct Chronology
of Processes and Regulation. Plant Cell 23: 873–894
Çakir R (2004) Effect of water stress at different development stages on vegetative
and reproductive growth of corn. F Crop Res 89: 1–16
Caregnato FF, Bortolin RC, Divan Junior AM, Moreira JCF (2013) Exposure to
Bibliographie
107
elevated ozone levels differentially affects the antioxidant capacity and the redox
homeostasis of two subtropical Phaseolus vulgaris L. varieties. Chemosphere.
doi: 10.1016/j.chemosphere.2013.04.084
Castagna a., Ranieri a. (2009) Detoxification and repair process of ozone injury:
From O3 uptake to gene expression adjustment. Environ Pollut 157: 1461–1469
Castagna A, Ederli L, Pasqualini S, Mensuali-Sodi A, Baldan B, Donnini S,
Ranieri A (2007) The tomato ethylene receptor LE-ETR3 (NR) is not involved in
mediating ozone sensitivity: Causal relationships among ethylene emission,
oxidative burst and tissue damage. New Phytol 174: 342–356
Cerovic Z, Masdoumier G, Ben Ghozlen N, Latouche G (2012) A new optical leaf-
clip meter for simultaneous non-destructive assessment of leaf chlorophyll and
epidermal flavonoids. Physiol Plant 251–260
Chmielowska-Bak J, Izbiańska K, Deckert J (2015) Products of lipid, protein and
RNA oxidation as signals and regulators of gene expression in plants. Front
Plant Sci 6: 6–10
Dielen A-S, Badaoui S, Candresse T, German-Retana S (2010) The ubiquitin/26S
proteasome system in plant-pathogen interactions: a never-ending hide-and-
seek game. Mol Plant Pathol 11: 293–308
Van Dingenen R, Dentener FJ, Raes F, Krol MC, Emberson L, Cofala J (2009)
The global impact of ozone on agricultural crop yields under current and future
air quality legislation. Atmos Environ 43: 604–618
Dizengremel P, Le Thiec D, Bagard M, Jolivet Y (2008) Ozone risk assessment for
plants: Central role of metabolism-dependent changes in reducing power.
Environ Pollut 156: 11–15
Djebali W, Gallusci P, Polge C, Boulila L, Galtier N, Raymond P, Chaibi W,
Brouquisse R (2008) Modifications in endopeptidase and 20S proteasome
expression and activities in cadmium treated tomato (Solanum lycopersicum L.)
plants. Planta 227: 625–639
Domínguez-López D, Adame J a., Hernández-Ceballos M a., Vaca F, De La
Morena B a., Bolívar JP (2014) Spatial and temporal variation of surface ozone,
NO and NO2 at urban, suburban, rural and industrial sites in the southwest of
the Iberian Peninsula. Environ Monit Assess 186: 5337–5351
Dwyer L, Andrews C, Stewart D, Ma D, Dugas J (1995) Genotypes, Carbohydrate
levels in field-grown leafy and normal maize. Crop Sci 35: 1020–1027
Ehhalt D, Prather M, Dentener F, Al. E (2001) Atmospheric chemistry and
greenhouse gases. Cambridge Univ Press pp. 239–287
Evans NH, McAinsh MR, Hetherington AM, Knight MR (2005) ROS perception in
Bibliographie
108
Arabidopsis thaliana: the ozone-induced calcium response. Plant J 41: 615–626
Farré I, Faci JM (2006) Comparative response of maize (Zea mays L.) and sorghum
(Sorghum bicolor L. Moench) to deficit irrigation in a Mediterranean environment.
Agric Water Manag 83: 135–143
Feng Z, Kobayashi K (2009) Assessing the impacts of current and future
concentrations of surface ozone on crop yield with meta-analysis. Atmos Environ
43: 1510–1519
Feng Z, PANG J, KOBAYASHI K, ZHU J, ORT DR (2011) Differential responses in
two varieties of winter wheat to elevated ozone concentration under fully open-
air field conditions. Glob Chang Biol 17: 580–591
Fiscus EL, Booker FL, Burkey KO (2005) Crop responses to ozone : uptake ,
modes of action , carbon assimilation and partitioning. 997–1011
Foyer CH, Noctor G (2009) Redox regulation in photosynthetic organisms: signaling,
acclimation, and practical implications. Antioxid Redox Signal 11: 861–905
Foyer CH, Noctor G (2011) Ascorbate and glutathione: the heart of the redox hub.
Plant Physiol 155: 2–18
Foyer CH, Valadier MH, Migge a, Becker TW (1998) Drought-induced effects on
nitrate reductase activity and mRNA and on the coordination of nitrogen and
carbon metabolism in maize leaves. Plant Physiol 117: 283–292
Fuhrer J (1997) ★1882 Critical levels for ozone effects on vegetation in Europe.pdf.
97:
Fuhrer J (2009) Ozone risk for crops and pastures in present and future climates.
Naturwissenschaften 96: 173–94
Gadjev I, Vanderauwera S, Gechev TS, Laloi C, Minkov IN, Shulaev V, Apel K,
Inzé D, Mittler R, Van Breusegem F (2006) Transcriptomic footprints disclose
specificity of reactive oxygen species signaling in Arabidopsis. Plant Physiol 141:
436–445
Gepstein S (2004) Leaf senescence--not just a “wear and tear” phenomenon.
Genome Biol 5: 212
Ghannoum O (2009) C4 photosynthesis and water stress. Ann Bot 103: 635–644
Gomes A, Fernandes E, Lima JLFC (2005) Fluorescence probes used for detection
of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods 65: 45–80
González-Rábade N, Badillo-Corona JA, Aranda-Barradas JS, Oliver-Salvador
MDC (2011) Production of plant proteases in vivo and in vitro — A review.
Biotechnol Adv 29: 983–996
Bibliographie
109
Grewe V (2005) The origin of ozone. Atmos Chem Phys Discuss 5: 9641–9668
Grudkowska M, Zagdańska B (2004) Multifunctional role of plant cysteine
proteinases. Acta Biochim Pol 51: 609–624
Grünhage L, Jäger H-J (2003) From critical levels to critical loads for ozone: a
discussion of a new experimental and modelling approach for establishing flux–
response relationships for agricultural crops and native plant species. Environ
Pollut 125: 99–110
Grünhage L, Jäger HJ, Haenel HD, Löpmeier FJ, Hanewald K (1999) The
European critical levels for ozone: Improving their usage. Environ Pollut 105:
163–173
Guiboileau A, Avila-Ospina L, Yoshimoto K, Soulay F, Azzopardi M, Marmagne
A, Lothier J, Masclaux-Daubresse C (2013) Physiological and metabolic
consequences of autophagy deficiency for the management of nitrogen and
protein resources in Arabidopsis leaves depending on nitrate availability. New
Phytol 199: 683–94
Gustavsson N, Kokke BP a, Härndahl U, Silow M, Bechtold U, Poghosyan Z,
Murphy D, Boelens WC, Sundby C (2002) A peptide methionine sulfoxide
reductase highly expressed in photosynthetic tissue in Arabidopsis thaliana can
protect the chaperone-like activity of a chloroplast-localized small heat shock
protein. Plant J 29: 545–553
Haagen-smit (1952) Small, Speckled,. 18–34
Hameed A, Bibi N, Akhter J, Iqbal N (2011) Differential changes in antioxidants,
proteases, and lipid peroxidation in flag leaves of wheat genotypes under
different levels of water deficit conditions. Plant Physiol Biochem 49: 178–185
Hatfield JL, Boote KJ, Kimball B a, Ziska LH, Izaurralde RC, Ort D, Thomson a
M, Wolfe D (2011) Climate impacts on Agriculture: Impalications for Crop
Production. Agron J 103: 351–370
Havé M (2013) Effets de l’ozone troposphérique sur le blé tendre (Triticum aestivum
L.) : caractérisation de l'endoprotéolyse vacuolaire et du niveau d'oxydation des
protéines dans la feuille drapeau.
Havé M, Leitao L, Bagard M, Castell J-F, Repellin A (2015) Protein carbonylation
during natural leaf senescence in winter wheat, as probed by fluorescein-5-
thiosemicarbazide. Plant Biol 17: 973–979
Hieng B, Ugrinović K, Sustar-Vozlic J, Kidric M (2004) Different classes of
proteases are involved in the response to drought of Phaseolus vulgaris L.
cultivars differing in sensitivity. J Plant Physiol 161: 519–30
Hodges DM, DeLong JM, Forney CF, Prange RK (1999) Improving the
Bibliographie
110
thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in
plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds. Planta
207: 604–611
Holland M, Kinghorn S, Emberson L ( Natural Environment Research Council )
CEH Project No . C02309NEW Defra Contract EPG 1 / 3 / 205 Development of a
framework for probabilistic assessment of the economic losses caused by ozone
damage to crops in Europe. Reading
van der Hoorn R a L (2008) Plant proteases: from phenotypes to molecular
mechanisms. Annu Rev Plant Biol 59: 191–223
Implications P, Editors R, Buchanan B, Dietz KJ, Pfannschmidt T (2009) Redox
Regulation in Photosynthetic Organisms. Regulation 11: 861–905
Iriti M, Faoro F (2007) Oxidative Stress, the Paradigm of Ozone Toxicity in Plants
and Animals. Water Air Soil Pollut 187: 285–301
V. J. Black, C. R. Black, J. a. Roberts C a. S (2000) Impact of ozone on the
reproductive development of plants. New Phytol 140: 385 – 410
Jenkin ME, Clemitshaw KC (2002) Chapter 11 Ozone and other secondary
photochemical pollutants: chemical processes governing their formation in the
planetary boundary layer. Dev Environ Sci 1: 285–338
Jin J, Tang C, Sale P (2015) The impact of elevated carbon dioxide on the
phosphorus nutrition of plants: a review. Ann Bot. doi: 10.1093/aob/mcv088
Johansson E, Olsson O, Nyström T (2004) Progression and Specificity of Protein
Oxidation in the Life Cycle of Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 279: 22204–
22208
Joo JH, Wang S, Chen JG, Jones AM, Fedoroff N V (2005) Different Signaling and
Cell Death Roles of Heterotrimeric G Protein a and b Subunits in the Arabidopsis
Oxidative Stress Response to Ozone. 17: 957–970
Junqua M, Biolley J, Pie S, Kanoun M (2000) In vivo occurrence of carbonyl
residues in Phaseolus vulgaris proteins as a direct consequence of a chronic
ozone stress. Plant Physiol Biochem 38: 853–861
Kakani VG, Vu JCV, Allen LH, Boote KJ (2011) Leaf photosynthesis and
carbohydrates of CO2-enriched maize and grain sorghum exposed to a short
period of soil water deficit during vegetative development. J Plant Physiol 168:
2169–2176
Kampa M, Castanas E (2008) Human health effects of air pollution. Environ Pollut
151: 362–7
Kangasjärvi J, Jaspers P, Kollist H (2005) Signalling and cell death in ozone-
Bibliographie
111
exposed plants. Plant, Cell Environ 28: 1021–1036
Kerstiens G, Lendzian KJ (1989) Interactions between ozone and plant cuticles. I.
Ozone deposition and permeability. New Phytol 112: 13–19
Khanna-Chopra R, Srivalli B, Ahlawat YS (1999) Drought induces many forms of
cysteine proteases not observed during natural senescence. Biochem Biophys
Res Commun 255: 324–7
Kim S, Gitz D, Sicher R, Baker J, Timlin D, Reddy V (2007) Temperature
dependence of growth, development, and photosynthesis in maize under
elevated CO2. Environ Exp Bot 61: 224–236
Kimball B, Kobayashi K, Bindi M (2002) Responses of agricultural crops to free-air
CO 2 enrichment. Adv Agron. doi: 10.1016/S0065-2113(02)77017-X
Kimball BA (1983) (1983) Carbon Dioxide and Agricultural Yield: An Assemblage
and Analysis of 430 Prior Observations (AJ).
Koyama T (2014) The roles of ethylene and transcription factors in the regulation of
onset of leaf senescence. Front Plant Sci 5: 650
Kress LW, Miller JE (1985) No Title. Can J Bot 63: 2408–2415
Kumar a, Venkateswarlu B (2011) Abiotic Stress Response in Plants. Physiol ,
Biochem Genet Perspect. doi: 10.5772/1762
Kumari S, Agrawal M, Singh A (2015) Effects of ambient and elevated CO2 and
ozone on physiological characteristics, antioxidative defense system and
metabolites of potato in relation to ozone flux. Environ Exp Bot 109: 276–287
Kurepa J, Smalle J a (2008) Structure, function and regulation of plant proteasomes.
Biochimie 90: 324–335
Landry LG, Pell EJ (1993) Modification of Rubisco and Altered Proteolytic Activity in
O3-Stressed Hybrid Poplar (Populus maximowizii x trichocarpa). Plant Physiol
101: 1355–1362
Langebartels C, Wohlgemuth H, Kschieschan S, Grün S, Sandermann H (2002)
Oxidative burst and cell death in ozone-exposed plants. Plant Physiol Biochem
40: 567–575
Leakey ADB, Bernacchi CJ, Dohleman FG, Ort DR, Long SP (2004) Will
photosynthesis of maize (Zea mays) in the US Corn Belt increase in future [CO2]
rich atmospheres? An analysis of diurnal courses of CO2 uptake under free-air
concentration enrichment (FACE). Glob Chang Biol 10: 951–962
Leakey ADB, Uribelarrea M, Ainsworth E a, Naidu SL, Rogers A, Ort DR, Long
SP (2006) Photosynthesis, productivity, and yield of maize are not affected by
open-air elevation of CO2 concentration in the absence of drought. Plant Physiol
Bibliographie
112
140: 779–790
Leitao L, Delacote E, Dizengremel P, Le Thiec D, Biolley JP (2007a) Assessment
of the impact of increasing concentrations of ozone on photosynthetic
components of maize (Zea mays L.), a C-4 plant. Environ Pollut 146: 5–8
Leitao L, Dizengremel P, Biolley J-P (2008) Foliar CO2 fixation in bean (Phaseolus
vulgaris L.) submitted to elevated ozone: Distinct changes in Rubisco and PEPc
activities in relation to pigment content. Ecotoxicol Environ Saf 69: 531–540
Leitao L, Goulas P, Biolley J-P (2003) Time-course of Rubisco oxidation in beans
(Phaseolus vulgaris L.) subjected to a long-term ozone stress. Plant Sci 165:
613–620
Leitao L, Maoret JJ, Biolley JP (2007b) Changes in PEP carboxylase, Rubisco and
Rubisco activase mRNA levels from maize (Zea mays) exposed to a chronic
ozone stress. Biol Res 40: 137–153
LI C, TAO Z, LIU P, ZHANG J, ZHUANG K, DONG S, ZHAO M (2015) Increased
grain yield with improved photosynthetic characters in modern maize parental
lines. J Integr Agric 14: 1735–1744
Li T, Liu L-N, Jiang C-D, Liu Y-J, Shi L (2014) Effects of mutual shading on the
regulation of photosynthesis in field-grown sorghum. J Photochem Photobiol B
137: 31–8
Lim PO, Kim HJ, Gil Nam H (2007) Leaf Senescence. Annu Rev Plant Biol 58: 115–
136
Lodyga M, Polan A, Skotarczak K, Mazur M, Adamski Z (2015) Photoprotection :
facts and controversies. 98–112
Long SP, Ainsworth E a, Leakey ADB, Morgan PB (2005) Global food insecurity.
treatment of major food crops with elevated carbon dioxide or ozone under large-
scale fully open-air conditions suggests recent models may have overestimated
future yields. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 360: 2011–2020
Markelz RJC, Strellner RS, Leakey ADB (2011) Impairment of C4 photosynthesis
by drought is exacerbated by limiting nitrogen and ameliorated by elevated
[CO2] in maize. J Exp Bot 62: 3235–3246
Martín M, Distefano A, Zabaleta E, Pagnussat G (2013) New insights into the
functional roles of reactive oxygen species during embryo sac development and
fertilization in Arabidopsis thaliana. Plant Signal Behav 8: 1–5
Martínez DE, Bartoli CG, Grbic V, Guiamet JJ (2007) Vacuolar cysteine proteases
of wheat (Triticum aestivum L.) are common to leaf senescence induced by
different factors. J Exp Bot 58: 1099–107
Bibliographie
113
Martínez M, Cambra I, González-Melendi P, Santamaría ME, Díaz I (2012) C1A
cysteine-proteases and their inhibitors in plants. Physiol Plant 145: 85–94
McLeod AR, Long SP (1993) Free air carbon dioxide enrichment (FACE) in global
change research: a review. Adv Ecol Res 28: 1–55
Mills G, Buse a., Gimeno B, Bermejo V, Holland M, Emberson L, Pleijel H (2007)
A synthesis of AOT40-based response functions and critical levels of ozone for
agricultural and horticultural crops. Atmos Environ 41: 2630–2643
Mills G, Hayes F, Wilkinson S, Davies WJ (2009) Chronic exposure to increasing
background ozone impairs stomatal functioning in grassland species. Glob
Chang Biol 15: 1522–1533
Møller IM, Jensen PE, Hansson A (2007) Oxidative Modifications to Cellular
Components in Plants. Annu Rev Plant Biol 58: 459–481
Møller IM, Rogowska-Wrzesinska A, Rao RSP (2011) Protein carbonylation and
metal-catalyzed protein oxidation in a cellular perspective. J Proteomics 74:
2228–2242
Møller IM, Sweetlove LJ (2010) ROS signalling – specificity is required. Trends
Plant Sci 15: 370–374
Muchow RC (1989) Comparative productivity of maize, sorghum and pearl millet in a
semi-arid tropical environment II. Effect of water deficits. F Crop Res 20: 207–
219
Mulchi C, Rudorff B, Lee E, Rowland R, Pausch R (1995) Morphological
responses among crop species to full-season exposures to enhanced
concentrations of atmospheric CO2 and O3. Water Air Soil Pollut 85: 1379–1386
Mulholland BJ, Craigon J, Black CR, Colls JJ, Atherton J, Landon G (1997)
Effects of elevated carbon dioxide and ozone on the growth and yield of spring
wheat (Triticum aestivum L). J Exp Bot 48: 113–122
Mulholland BJ, Craigon J, Black CR, Colls JJ, Atherton J, Landon G (1998)
Effects of elevated CO2 and O-3 On the rate and duration of grain growth and
harvest index in spring wheat (Triticum aestivum L.). Glob Chang Biol 4: 627–
635
Munné-Bosch S, Alegre L (2004) Die and let live: Leaf senescence contributes to
plant survival under drought stress. Funct Plant Biol 31: 203–216
Myhre O, Andersen JM, Aarnes H, Fonnum F (2003) Evaluation of the probes 2′,7′-
dichlorofluorescin diacetate, luminol, and lucigenin as indicators of reactive
species formation. Biochem Pharmacol 65: 1575–1582
Overmyer K, Brosché M, Kangasjärvi J (2003) Reactive oxygen species and
Bibliographie
114
hormonal control of cell death. Trends Plant Sci 8: 335–342
Overmyer K, Kollist H, Tuominen H, Betz C, Langebartels C, Wingsle G,
Kangasjärvi S, Brader G, Mullineaux P, Kangasjärvi J (2008) Complex
phenotypic profiles leading to ozone sensitivity in Arabidopsis thaliana mutants.
Plant Cell Environ 31: 1237–49
Pasqualini S, Piccioni C, Reale L, Ederli L, Della Torre G, Ferranti F (2003)
Ozone-induced cell death in tobacco cultivar Bel W3 plants. The role of
programmed cell death in lesion formation. Plant Physiol 133: 1122–1134
Pearson M (1995) Effects of ozone on growth and gas exchange of Eucalyptus
globulus seedlings. Tree Physiol 15: 207–10
Pleijel H, Danielsson H, Gelang J, Sild E, Selldén G (1998) Growth stage
dependence of the grain yield response to ozone in spring wheat (Triticum
aestivum L.). Agric Ecosyst Environ 70: 61–68
Polge C, Jaquinod M, Holzer F, Bourguignon J, Walling L, Brouquisse R (2009)
Evidence for the Existence in Arabidopsis thaliana of the Proteasome Proteolytic
Pathway: ACTIVATION IN RESPONSE TO CADMIUM. J Biol Chem 284:
35412–35424
Prins A, Mukubi JM, Pellny TK, Verrier PJ, Beyene G, Lopes MS, Emami K,
Treumann A, Lelarge-Trouverie C, Noctor G, et al (2011) Acclimation to high
CO2 in maize is related to water status and dependent on leaf rank. Plant Cell
Environ 34: 314–331
Pyngrope S, Bhoomika K, Dubey RS (2012) Oxidative stress, protein
carbonylation, proteolysis and antioxidative defense system as a model for
depicting water deficit tolerance in Indica rice seedlings. Plant Growth Regul 69:
149–165
Qiu Q-S, Huber JL, Booker FL, Jain V, Leakey ADB, Fiscus EL, Yau PM, Ort DR,
Huber SC (2008) Increased protein carbonylation in leaves of Arabidopsis and
soybean in response to elevated [CO2]. Photosynth Res 97: 155–66
Ranum P, Peña-Rosas JP, Garcia-Casal MN (2014) Global maize production,
utilization, and consumption. Ann N Y Acad Sci 1312: 105–112
Rao M V., Davis KR (1999) Ozone-induced cell death occurs via two distinct
mechanisms in Arabidopsis: the role of salicylic acid. Plant J 17: 603–614
Rawlings ND, Barrett a. J, Bateman a. (2010) MEROPS: the peptidase database.
Nucleic Acids Res 38: D227–D233
Rellán-Álvarez R, Ortega-Villasante C, Álvarez-Fernández A, Campo FF Del,
Hernández LE (2006) Stress Responses of Zea mays to Cadmium and Mercury.
Plant Soil 279: 41–50
Bibliographie
115
Roberts MJ, Long SP, Tieszen LL, Beadle CL (1993) Measurement of plant
biomass and net primary production of herbaceous vegetation. Photosynth Prod
a Chang Environ a F Lab manua 1–21
Rudorff BFT, Mulchi CL, Lee EH, Rowland R, Pausch R (1996) No Title. Environ
Pollut 94: 53–60
Ruiz-Vera UM, Siebers MH, Drag DW, Ort DR, Bernacchi CJ (2015) Canopy
warming caused photosynthetic acclimation and reduced seed yield in maize
grown at ambient and elevated [CO 2 ]. Glob Chang Biol. doi: 10.1111/gcb.13013
Sage RF, Kubien DS (2007) The temperature response of C3 and C4
photosynthesis. Plant, Cell Environ 30: 1086–1106
Sage RF, Stata M (2015) Photosynthetic diversity meets biodiversity: The C4 plant
example. J Plant Physiol 172: 104–119
Sanderson JB, M., Daynard TB, Tollenaar (1981) A mathematical model of the
shape of corn leaves. Can J Plant Sci 1009–1011.
Sattler SE, Cahoon EB, Coughlan SJ, Dellapenna D (2003) Characterization of
Tocopherol Cyclases from Higher Plants and Cyanobacteria . Evolutionary
Implications for Tocopherol Synthesis and Function. Plant Physiol 132: 2184–
2195
Schlenker W, Roberts MJ (2009) Nonlinear temperature effects indicate severe
damages to U.S. crop yields under climate change. Proc Natl Acad Sci U S A
106: 15594–15598
Shacter E (2000) Quantification and Significance of Protein Oxidation in Biological
Samples*. Drug Metab Rev 32: 307–326
Siddharth Kaushal Tripathi NT (2007) Integrated Signaling in Flower Senescence.
437–445
Simova-Stoilova L, Vaseva I, Grigorova B, Demirevska K, Feller U (2010)
Proteolytic activity and cysteine protease expression in wheat leaves under
severe soil drought and recovery. Plant Physiol Biochem 48: 200–6
Singh AA, Agrawal SB, Shahi JP, Agrawal M (2014a) Assessment of growth and
yield losses in two Zea mays L. cultivars (quality protein maize and nonquality
protein maize) under projected levels of ozone. Environ Sci Pollut Res Int 21:
2628–41
Singh AA, Agrawal SB, Shahi JP, Agrawal M (2014b) Investigating the response of
tropical maize (Zea mays L.) cultivars against elevated levels of O3 at two
developmental stages. Ecotoxicology 23: 1447–1463
Smakowska E, Czarna M, Janska H (2014) Mitochondrial ATP-dependent
Bibliographie
116
proteases in protection against accumulation of carbonylated proteins.
Mitochondrion 19: 245–251
Solberg S, Bergstrom R, Langner J, Laurila T, Lindskog a (2005) Changes in
Nordic surface ozone episodes due to European emission reductions in the
1990s. Atmos Environ 39: 179–192
Sun L, Su H, Zhu Y, Xu M (2012) Involvement of abscisic acid in ozone-induced
puerarin production of Pueraria thomsnii Benth. suspension cell cultures. Plant
Cell Rep 31: 179–185
Suzuki N, Miller G, Morales J, Shulaev V, Torres MA, Mittler R (2011) Respiratory
burst oxidases: the engines of ROS signaling. Curr Opin Plant Biol 14: 691–699
Tamaoki M (2008) The role of phytohormone signaling in ozone ‑ induced cell death
in plants by Ozone. 3: 166–174
The Royal Society (2008) Ground-level ozone in the 21st century: future trends,
impacts and policy implications.
Thomas H, Stoddart JL (1980) LEAF SENESCENCEl +7685. Plant Breed 83–111
Tollenaar M, Lee E a. (2002) Yield potential, yield stability and stress tolerance in
maize. F Crop Res 75: 161–169
Tosti N, Pasqualini S, Borgogni A, Ederli L, Falistocco E, Crispi S, Paolocci F
(2006) Gene expression profiles of O3-treated Arabidopsis plants. Plant, Cell
Environ 29: 1686–1702
Troyer AF (2006) Adaptedness and heterosis in corn and mule hybrids. Crop Sci 46:
528–543
Tsiatsiani L, Van Breusegem F, Gallois P, Zavialov A, Lam E, Bozhkov P V
(2011) Metacaspases. Cell Death Differ 18: 1279–1288
Tuominen H, Overmyer K, Keinänen M, Kollist H, Kangasjärvi J (2004) Mutual
antagonism of ethylene and jasmonic acid regulates ozone-induced spreading
cell death in Arabidopsis. Plant J 39: 59–69
Vahisalu T, Puzõrjova I, Brosché M, Valk E, Lepiku M, Moldau H, Pechter P,
Wang Y-S, Lindgren O, Salojärvi J, et al (2010) Ozone-triggered rapid
stomatal response involves the production of reactive oxygen species, and is
controlled by SLAC1 and OST1. Plant J 62: 442–453
Vainonen JP, Kangasjärvi J (2015) Plant signalling in acute ozone exposure. Plant
Cell Environ 38: 240–252
Vierstra RD (1996) Proteolysis in plants: mechanisms and functions. Plant Mol Biol
32: 275–302
Bibliographie
117
Vingarzan R (2004) A review of surface ozone background levels and trends. Atmos
Environ 38: 3431–3442
Vörösmarty CJ, McIntyre PB, Gessner MO, Dudgeon D, Prusevich a, Green P,
Glidden S, Bunn SE, Sullivan C a, Liermann CR, et al (2010) Global threats to
human water security and river biodiversity. Nature 467: 555–561
Wagstaff C, Leverentz MK, Griffiths G, Thomas B, Chanasut U, Stead AD,
Rogers HJ (2002) Cysteine protease gene expression and proteolytic activity
during senescence of Alstroemeria petals. J Exp Bot 53: 233–40
Wilkinson S, Davies WJ (2010) Drought, ozone, ABA and ethylene: new insights
from cell to plant to community. Plant Cell Environ 33: 510–25
Wilkinson S, Davies WJ (2009) Ozone suppresses soil drying- and abscisic acid
(ABA)-induced stomatal closure via an ethylene-dependent mechanism. Plant
Cell Environ 32: 949–959
Wilkinson S, Mills G, Illidge R, Davies WJ (2012) How is ozone pollution reducing
our food supply? J Exp Bot 63: 527–36
Wiśniewski K, Zagdańska B (2001) Genotype-dependent proteolytic response of
spring wheat to water deficiency. J Exp Bot 52: 1455–63
Wittig VE, Ainsworth E a., Long SP (2007) To what extent do current and projected
increases in surface ozone affect photosynthesis and stomatal conductance of
trees? A meta-analytic review of the last 3 decades of experiments. Plant Cell
Environ 30: 1150–1162
World Health Organization (2013) Review of evidence on health aspects of air
pollution – REVIHAAP Project. 309
World Meteorological Organization (WMO) (2014) Scientific Assessment of Ozone
Depletion: 2014.
Xiong Y, Contento AL, Nguyen PQ, Bassham DC (2006) Degradation of Oxidized
Proteins by Autophagy during Oxidative Stress in Arabidopsis. Plant Physiol 143:
291–299
Xu E, Vaahtera L, Brosché M (2015) The Role of Defense Hormones in Regulation
of Ozone-Induced Changes in Gene Expression and Cell Death. Mol Plant. doi:
10.1016/j.molp.2015.08.008
Yoshida S, Tamaoki M, Ioki M, Ogawa D, Sato Y, Aono M, Kubo A, Saji S, Saji H,
Satoh S, et al (2009) Ethylene and salicylic acid control glutathione biosynthesis
in ozone-exposed Arabidopsis thaliana. Physiol Plant 136: 284–298
Bibliographie
118
Impact sur les paramètres agronomiques et physiologiques de l’ozone troposphérique sur le maïs en Ile-de-France
Résumé :L’augmentation des concentrations de fond en ozone dans la troposphère depuis le XXéme siècle est responsable de baisses conséquentes des rendements des grandes cultures. Le maïs ne semble pas épargné et les pertes de rendement pour l’année 2000 seraient de l’ordre de 2,2% à 5%. Toutefois, ces estimations sont établies à partir des résultats d’un nombre très faible d’expérimentations, toutes réalisées en chambres d’ozonation à ciel ouvert. Afin de vérifier si ces projections sont véritablement transposables aux champs de maïs cultivé en conditions conventionnelles, des plants de la variété NK Perform ont été mis en culture et exposés en champ à différentes concentrations d’ozone, en conditions semi-contrôlées. Pendant le développement des plantes, des séries d’échantillons ont été prélevées afin de comprendre comment le stress oxydatif, potentiellement induit par l’ozone, pourrait les avoir affectées. Ainsi les niveaux d’activités endoprotéolytiques des feuilles de l’épi (précédemment proposés comme indicateurs du degré de contrainte hydrique) ont été mesurés à l’aide d’une méthode par fluorescence (nouvellement adaptée chez les plantes). Parallèlement, les variations des teneurs en protéines oxydées (groupements carbonyles), de la peroxydation lipidiques et de la teneur en espèces réactives de l’oxygène (ROS) ont également été analysées. Nos résultats mettent en évidence une stimulation des activités endoprotéolytiques en réponse aux niveaux élevés d’exposition à l’ozone, ainsi qu’une différence significative de teneurs en protéines oxydées entre les plants contrôles et les plants les plus exposés. De mêmes les teneurs en ROS et les niveaux de peroxydation lipidique témoignent d’un effet de l’exposition à l’ozone. Toutes ses réponses cellulaires sont également influencées par l’âge des tissus foliaires.Ces résultats semblent abonder dans le sens des modèles en démontrant un impact certain de l’ozone sur le maïs, cependant toutes les analyses menées sur les paramètres de rendement (poids de mille grains, biomasse, teneur en amidon…) ne laisse entrevoir aucune perte, nous obligeant alors à reconsidérer la sensibilité du maïs à l’ozone, généralement admise jusqu’ici.
Bibliographie
119
Abstract :For the past 150 years, background tropospheric ozone concentrations have been increasing constantely to the point where they now affect grain yield in major cereals, such as maize. In 2000, it has been estimated that yield loss was between 2.2% and 5% in this crop. Such estimates have been established from a very low number of experiments, all carried out in open top ozone fumigation chambers.To verify the accuracy of these estimations, we cultivated maize plants and exposed them to various ozone concentrations in the field. During plant development, series of cob-leaf samples have been collected in order to analyze the impact of ozone-induced oxidative stress on various biochemical processes. Thus, we studied changes in leaf endoproteolytic activities (a parameter previously used as a dehydration stress indicator), using a fluorescence-based method newly adapted to plant tissues. Concurrently, changes in protein oxidation levels (carbonyl groups) were analyzed, along with lipid peroxidation and accumulation of reactive oxygen species (ROS).Our results indicate that ozone induced increases in the global level of protein oxidation, endoproteolytic processes and lipid peroxidation, most likely as a result of an over-accumulation of ROS in the leaf tissues. Furthermore, the impact of ozone is enhanced by aging.To some extent, these conclusions agree with those obtained from impact modeling that also show that maize is midly sensitive to ozone. However, because yield was not affected whatsoever in our experiment (1000 grain weight, biomass, starch accumulation), it is our opinion that the general consensus about the sensitivity of maize to ozone should be revised.