UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE ESTOMATOLOGÍA
“EFECTO IN VITRO DE 04 DERIVADOS COMERCIALES DEL CACAO SOBRE EL
CRECIMIENTO DEL STREPTOCOCCUS MUTANS”
TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE
BACHILLER EN ESTOMATOLOGÍA
AUTOR:
ROSAS URBINA, MARCO ANTONIO
TRUJILLO – PERÚ
2009
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I. RESUMEN
Este trabajo se realizó en el laboratorio de Microbiología Médica de la
Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo en el año
2008. Su propósito fue el análisis del efecto “in Vitro” de 04 derivados
comerciales del cacao sobre el crecimiento del Streptococcus mutans;
para ello, fue necesario evaluar de manera independiente los efectos del
cacao en polvo, manteca de cacao, chocolate no azucarado y el chocolate
azucarado sobre el crecimiento de Streptococcus mutans y luego hacer
una comparación entre ellos. Se realizó un sembrado de Streptococcus
mutans en 27 placas petri y se les adicionó discos de difusión preparados
con diluciones de los derivados de cacao a distintas concentraciones para
los grupos experimentales y con agua bidestilada como grupo control. Las
placas petri fueron incubadas a 37 °C en microanaerobiosis por espacio
de 18 horas. Al análisis posterior se obtuvo la generación de halos
inhibitorios de pequeña longitud para el cacao en polvo, chocolate no
azucarado y chocolate azucarado; y la generación de halos de gran
longitud para la manteca de cacao; así mismo la no generación de
inhibición alguna para el grupo de control con lo que se concluyó que los
04 derivados comerciales del cacao presentan efecto inhibitorio sobre el
crecimiento de Streptococcus mutans “in Vitro”.
Palabras clave: Cacao, derivados del cacao, inhibición de crecimiento
bacteriano, Streptococcus mutans.
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II. ABSTRACT
This present work has been done in the Microbiology Laboratory of the
Medical School of the “Universidad Nacional de Trujillo” in the 2008. It
purpose was the analysis of the “in Vitro” effect of 04 commercial derivates
of cacao over the Streptococcus mutans growth.
For that it was necessary to evaluate in an independent way the effects of
cacao powder, cacao fat, no sugar chocolate and sugar chocolate over the
growth of Streptococcus mutans and then make a comparison between
them.
A seeding was performed in 27 petri dishes with diffusion discs of the
cacao derivates in different concentration for the experimental group and
bi-distilled water for the control group.
The petri dishes were incubated at 37 ºC in microaerobiosis for 18 hours
and result in generation of low width inhibition rings for the cacao powder,
no sugar chocolate and sugar chocolate and the generation of a high
width for the cacao fat as well the no generation of inhibition ring in any of
the control groups with the conclusion that the 04 chocolate derivates
present an inhibitory effect over the Streptococcus mutans growth “in
Vitro”.
Keywords: Cacao, derivates of cacao, inhibition of bacterial growth,
Streptococcus mutans.
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EVALUACIÓN DE LA TESIS
El Jurado deberá:
a. Consignar las observaciones y objeciones pertinentes relacionados a los
siguientes ítems
b. Anotar el calificativo final
c. Firmar los tres miembros del jurado
TESIS:.......................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
1. DE LAS GENERALIDADES :
El Título:.......................................................................................................
........................................................................................................................
Tipo de Investigación:..................................................................................
........................................................................................................................
2. DEL PLAN DE INVESTIGACIÓN :
Antecedentes:................................................................................................
Justificación:.................................................................................................
Problema:......................................................................................................
........................................................................................................................
Objetivos:......................................................................................................
Hipótesis:.......................................................................................................
Diseño de Contrastación:............................................................................
Tamaño Muestral:.......................................................................................
Análisis Estadístico:....................................................................................
3. RESULTADOS:...................................................................................................
4. DISCUSIÓN:
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
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5. CONCLUSIONES:
...................................................................................................................................
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:............................................................
...............................................................................................................................
7. RESUMEN:..........................................................................................................
...............................................................................................................................
8. RELEVANCIA DE LA INVESTIGACIÓN:
...............................................................................................................................
9. ORIGINALIDAD: ...............................................................................................
10. SUSTENTACION
10.1 Formalidad:
................................................................................................
10.2 Exposición:
.................................................................................................
10.3 Conocimiento del Tema:
...........................................................................
CALIFICACIÓN:
(Promedio de las 03 notas del Jurado)
JURADO: Nombre Código Docente Firma
Presidente: Dr...................................... …………… ………………..
Grado Académico:……………………………………….…………………
Secretario: Dr...................................... …………… .…….………...
Grado Académico: …………………………………………………………
Miembro: Dr...................................... .…………… ……..….……..
Grado Académico: ……………………………………………….………
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RESPUESTAS DE TESISTAS A OBSERVACIONES DEL
JURADO
El Tesista deberá responder en forma concreta a las observaciones del jurado
a manuscrito en el espacio correspondiente:
a. Fundamentando su discrepancia
b. Si está de acuerdo con la observación también registrarla.
c. Firmar
TESIS:.......................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
1. DE LAS GENERALIDADES:
El Título:.......................................................................................................
........................................................................................................................
Tipo de Investigación:..................................................................................
........................................................................................................................
2. DEL PLAN DE INVESTIGACIÓN:
Antecedentes:................................................................................................
Justificación:.................................................................................................
Problema:......................................................................................................
........................................................................................................................
Objetivos:......................................................................................................
Hipótesis:.......................................................................................................
Diseño de Contrastación:............................................................................
Tamaño Muestral:.......................................................................................
Análisis Estadístico:....................................................................................
3. RESULTADOS: ..................................................................................................
4. DISCUSIÓN: .......................................................................................................
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5. CONCLUSIONES: .............................................................................................
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:............................................................
...............................................................................................................................
7. RESUMEN:..........................................................................................................
...............................................................................................................................
8. RELEVANCIA DE LA INVESTIGACIÓN:
...............................................................................................................................
9. ORIGINALIDAD: ..............................................................................................
10. SUSTENTACIÓN
10.1. Formalidad:
..............................................................................................
10.2. Exposición:
..............................................................................................
10.3. Conocimiento del Tema:
..............................................................................................
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Firma
Nombre:
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ÍNDICE
Pág.
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
RESUMEN
ABSTRACT
I. INTRODUCCIÓN 1 - 11
II. MATERIAL Y MÉTODO 12 - 21
III. RESULTADOS 22 - 32
IV. DISCUSIÓN 33 - 35
V. CONCLUSIONES 36 - 37
VI. RECOMENDACIONES 38
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 39 - 43
VIII. ANEXOS 44 - 55
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I. INTRODUCCIÓN
1.1. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA:
La caries, según Bhaskar, es la enfermedad más común del ser humano. 1
F. V. Domínguez la describe como una secuencia de sucesos de
destrucción localizada en los tejidos duros dentarios que evoluciona en
forma progresiva e irreversible y que comienza en la superficie del diente
y luego avanza en profundidad. 2
Centrándonos en los microorganismos responsables de la caries dental,
la evidencia actual apoya la idea de que la iniciación de la caries está
asociada a Estreptococos acidogénicos específicos. 3
Cuantiosos estudios longitudinales han intentado demostrar una relación
directa entre la presencia de Streptococcus mutans y la aparición de
lesiones cariosas.
Rimondia S. Percival y col. en sus investigaciones epidemiológicas sobre
el tema, efectuaron comparaciones de muestras de placa a partir de dos
poblaciones humanas, una con alta y la otra con baja incidencia de caries
demostrando una relación entre la presencia de Streptococcus mutans y
la incidencia de lesiones cariosas. En el estudio, el 71% de fisuras
cariadas tenían cuentas de Streptococcus mutans mayores al 10% del
total de microorganismos mientras que el 70% de fisuras libres de caries
no tenían ninguna cuenta perceptible. 4
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Newman en sus investigaciones obtiene datos que muestran cierta
discrepancia con los estudios de Rimondia S. Percival y col., en cuanto a
que; aunque la dominación de un sitio con los Streptococcus mutans
ocurre frecuentemente antes de la iniciación de caries, un alto conteo de
Streptococcus mutans se encuentra más a menudo después de la
ocurrencia de caries y más específicamente en las profundidades de la
lesión cariosa. 3
Esto permite concluir que ninguna especie parece estar asociada
únicamente al inicio de lesiones cariosas, es probable que éste sea el
resultado de un ataque combinado de todos los microorganismos
generadores de ácido de la placa, pero no hay duda de que el
Streptococcus mutans es una de las bacterias de mayor potencial
acidogénico y virulencia de la placa dental evidenciando así su gran
importancia en la aparición de lesiones cariosas.1- 4
La ciencia médica ha estado siempre en la constante búsqueda de
insumos y productos con propiedades benefactoras para la salud, que
pudiesen ser incorporados en la alimentación habitual de la persona
humana, dentro de una dieta equilibrada y en cantidades moderadas.
El cacao, ha sido estudiado por la medicina desde antaño, y en su
extenuante investigación se ha logrado evidenciar numerosas
propiedades medicinales que van desde la mejora del estado nutricional
hasta su uso a modo de agente preventivo y coadyuvante en el
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tratamiento de enfermedades crónico degenerativas como ciertas
afecciones cardíacas y la diabetes mellitus. 5 – 9
En el campo de la ciencia estomatológica, desde tiempos remotos han
surgido controversias en cuánto al potencial cariogénico de determinados
alimentos y el cariostático de otros, teniendo como prejuicio, que toda
sustancia manejada en la constitución de golosinas está considerada
dentro del grupo de los alimentos cariogénicos.
Es así que, el cacao, ingrediente principal del chocolate y otros derivados,
ha sido siempre motivo de controversia, ya que permanecen
discrepancias en cuánto a su potencial cariogénico por la imagen popular
que siempre ha imperado y por otra parte, en cuánto a su potencial
cariostático que numerosos estudios han intentado demostrar mediante
experimentos de diversa índole. 10 – 16
Una de las más antiguas investigaciones relacionadas; el experimento de
Vipeholm (Suecia) en el año 1954, en el que un total de 436 pacientes
fueron estudiados durante 5 años, intentó establecer la cariogenicidad de
los alimentos con hidratos de carbono. En éste, un grupo control
consumía una dieta estándar mientras que el grupo experimental
consumía la misma dieta suplementada con diferentes tipos de hidratos
de carbono durante y entre las comidas; dentro de la realización de la
investigación se encontró qué el grupo de pacientes que recibió dosis
diarias de chocolate entre comidas obtuvo mayor conteo de caries que el
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grupo de control, pero a la vez, éstos produjeron menos cantidad de
caries que aquellos con un consumo de toffes y caramelos como
suplemento en su dieta. 10
Stralfors en el año l966, publicó un estudio en el cuál se incorporó en la
dieta de hámsteres extracto de cacao. Según informa su experimento el
chocolate redujo la ocurrencia de caries dental en los hámsteres a los
cuales se agregó el extracto comparados con el grupo de control.11
Rozeik y col. encontraron en sus experimentos con ratas blancas una cifra
considerablemente menor de caries dentales en los animales alimentados
con una dieta que contenía la ceniza de semilla de cacao que en los
animales del grupo control desprovistos de dicha dieta.12
Estas investigaciones condujeron a muchos autores a concluir que la
ceniza de la semilla de cacao es inhibidora de la formación de caries. Con
el tiempo, estudios más recientes han intentado esclarecer si existe una
verdadera relación entre los componentes del cacao y el efecto
cariostático. 13 – 16
En el año 2000 T. Ooshima y col intentaron demostrar la actividad
inhibitoria del extracto de la cáscara del haba del cacao en la caries dental
realizando estudios tanto “in Vitro” como en animales de experimentación.
Este trabajo aisló Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus
mediante caldos de cultivo selectivo e intentó examinar el efecto del
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extracto de cáscara del haba del cacao en el crecimiento celular de las
bacterias, así como la producción de ácido y adherencia celular de las
mismas. Los resultados arrojaron que el extracto del cacao inhibió el
crecimiento celular de Streptococcus mutans en un 69% y del
Streptococcus sobrinus en un 72%. Asimismo la producción de ácido se
vio afectada arrojando un resultado de un Ph de 4.2 en el grupo de
control contra un Ph de 4.5 en el grupo experimental a las 12 horas de
tiempo de incubación. La adherencia bacteriana de los microorganismos
se vio también disminuida mediante la evaluación de la síntesis de
glucanos insolubles necesarios para ésta, los resultados demostraron
una supresión del 15%. Para la investigación en animales se utilizó 75
ratas que fueron divididas al azar en 5 grupos para su estudio, a las
mismas les fue administrada una dieta usual y el aditamento de agua con
diversas concentraciones del extracto de la cáscara del haba del cacao.
Los resultados del experimento mostraron una inhibición de caries en
aquellos grupos que recibieron una concentración del extracto de cacao
mayor al 5%. 13
En el mismo año los autores realizaron una investigación similar pero esta
vez utilizaron extracto de la masa del cacao, el principal componente del
chocolate, en lugar de la cáscara de haba del anterior experimento. En
contraposición al anterior estudio se encontraron valores poco
significativos “in Vitro” en cuanto a la inhibición del crecimiento y
producción de ácido de los Streptococcus mutans, pero la investigación
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arrojó nuevos resultados de importancia. El extracto de la masa del
cacao redujo la hidrofobicidad de la superficie de las células del
Streptococcus mutans, así mismo, se obtuvo una reducción poco
significativa de la adhesividad de los mismos. En el experimento en
animales, esta vez la dieta se basó en extracto de masa de cacao en
conjunto con un 40% de sacarosa y agua potable, resultando en
reducción de la caries dental y acumulación de la placa en ratas
infectadas con Streptococcus sobrinus aunque no de manera significativa.
Esos resultados indicaron a los autores que el extracto de masa del cacao
posee cierto potencial anticariogénico pero no lo suficientemente fuerte
como para suprimir la actividad cariogénica de la sacarosa. 13, 14
En el año 2003, Kyoko Ito y col intentaron demostrar las propiedades
anticariogénicas del agua con extracto de cacao disuelto; el experimento
adicionó un extracto de polvo de cacao disuelto en agua a un modelo de
comida cariogénica y un chocolate blanco que contenía 35% de azúcar.
Se seleccionó aleatoriamente cuatro grupos de ratas, el primer grupo no
fue infectado por ser el grupo de control, los 3 grupos restantes fueron
infectados diariamente por 6 días consecutivos con 0.1ml con una
suspensión con 4 x 109 unidades formadoras de colonias de
Streptococcus sobrinus (resistentes a la estreptomicina) y 50ug de
estreptomicina para obtener una flora microbiana oral selectiva. Todos los
grupos fueron expuestos al extracto de polvo de cacao disuelto pero la
alimentación fue distinta para los grupos; el grupo de control y uno de los
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grupos infectados fueron alimentados con una dieta cariogénica libre del
chocolate blanco y los 2 grupos restantes infectados con la misma dieta
cariogénica y chocolate blanco adicionado. A los 56 días se analizaron los
resultados obteniendo puntajes de caries mediante una plantilla
preparada (escala de medición por conteo de lesiones cariosas). El grupo
de control obtuvo un puntaje de 10, el grupo infectado sin dieta de
chocolate blanco obtuvo un puntaje de 35, mientras que los grupos
infectados y que fueron alimentados con una dieta rica en chocolate
blanco obtuvieron un puntaje mayor a 10 y menor a 20 en la escala de
medición. Estos resultados llevaron a los autores a concluir que existe
una significativa reducción de caries en el chocolate a pesar del contenido
de azúcar del mismo.15
En un estudio similar por Wynfrey Wynn y col, los investigadores utilizaron
ratas albinas como animales de experimentación. Dividieron los animales
en 3 grupos, un grupo de control y 2 grupos experimentales. Al grupo de
control se le alimentó con una dieta con alto contenido de azúcar. Al
primer grupo experimental se le agregó 2mg de ceniza de haba de cacao
por cada 100mg de dieta básica. Al segundo grupo experimental se le
agregó además de los 2mg de ceniza de haba de cacao 20mg de
margarina vitaminada. Los resultados obtenidos en el experimento fueron;
para el primer grupo experimental la no existencia de reducción de caries
dental significativa, mientras que en el segundo grupo experimental se
obtuvieron resultados significativos de reducción de la misma. Este
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experimento llevó a la conclusión de los autores de que la grasa
adicionada a la dieta con contenido de cacao es la responsable de efectos
inhibitorios de caries dental. 12
En el año 2006, Rimondia y col realizaron un estudio que apuntaba a
determinar si los polifenoles del cacao podían interferir con la formación
del biofilm por Streptococcus mutans o el Streptococcus sanguinis, así
como en la formación de ácido del Streptococcus mutans. La actividad
antimicrobiana de los polifenoles fue determinada contra la especie
cariogénica (Streptococcus mutans) y la especie que ayuda a su
supervivencia (Streptococcus sanguinis) por análisis inhibitorio mínimo de
concentración. Los dímeros, tetrámeros y pentámeros de polifenol del
cacao inhibieron el crecimiento de los Streptococcus sanguinis, mientras
el crecimiento del Streptococcus mutans era inafectado. Sin embargo el
tratamiento previo de superficies con el pentámero de polifenol del cacao
redujo la formación del biofilm por el Streptococcus mutans en 4 y 24 hrs,
mientras que los efectos sobre S. sanguinis eran menores. En cambio, la
breve exposición de biofilms preformados al pentámero del polifenol no
tenía ningún efecto significativo. Además también se observó un efecto
reductor de la formación de ácido por el Streptococcus mutans en
condiciones similares. Los autores concluyeron que los polifenoles
pueden reducir la formación del biofilm por el Streptococcus mutans y el
S. sanguinis e inhiben la producción del ácido por el Streptococcus
mutans en ausencia de colonias preformadas. 16
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Como muestran los antecedentes existen ciertas discrepancias en el
campo en cuánto al efecto del cacao sobre la caries dental.
Al haber quedado demostrado por la ciencia médica las propiedades
benéficas del cacao y chocolate sobre la salud del ser humano, resulta
irónico que en el quehacer odontológico, pudiésemos estar privando a las
personas de dichas propiedades benefactoras, por la diatriba de sus
supuestos efectos cariogénicos.
Los derivados del cacao como el chocolate, polvo de cacao y otros,
poseen como materia básica el cacao mismo y por lo tanto gozan de las
propiedades básicas inherentes a su componente principal, además, de
las añadidas por sus elementos agregados y procesamiento; y por ello, al
ser incluidos en la diatriba mencionada y hacer extensiva su prohibición
de consumo también posiblemente incurriríamos en la interdicción de un
grupo de alimentos saludables para el ser humano con base en
aseveraciones infundadas, por lo cual, resultó necesario evidenciar
mediante un estudio propio de la región el efecto de los derivados del
cacao sobre el crecimiento de Streptococcus mutans (al ser considerados
éstos de gran importancia en el origen de la caries dental), a fin de
reafirmar o finiquitar las ideas en cuánto a sus efectos cariostáticos o
cariogénicos y dilucidar nuestras recomendaciones o censura hacia su
consumo no cayendo en una posible privación injusta de alimentos
beneficiosos para la salud oral y sistémica del individuo.
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La importancia científica del presente proyecto se basa en haber
generado en nuestro país mediante una investigación propia de la región,
el conocimiento del efecto de 04 derivados comerciales del cacao: cacao
en polvo, manteca de cacao, chocolate no azucarado y chocolate
azucarado; sobre el crecimiento de los Streptococcus mutans y la difusión
de este conocimiento para los fines antes mencionados. Además, con los
resultados obtenidos, el impacto generado podrá ser aplicado en la
producción de nuevos productos en nuestro medio, derivados del cacao,
que contribuyan al control de la caries y mejora de la salud general
además de satisfacer el gusto del paladar más exigente.
La realización del presente pretendió esclarecer el problema:
¿Cuál es el efecto del cacao en polvo, la manteca de cacao, el
chocolate no azucarado y el chocolate con azúcar sobre el
crecimiento “in Vitro” del Streptococcus mutans?
Para lo que se formuló la siguiente hipótesis:
El cacao en polvo, la manteca de cacao, el chocolate no
azucarado y el chocolate con azúcar inhiben el crecimiento de
Streptococcus mutans “in Vitro”.
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1.2. OBJETIVOS:
Los objetivos propuestos fueron los siguientes:
Objetivo General:
Determinar el efecto “in Vitro” de 04 derivados comerciales del
cacao sobre el crecimiento del Streptococcus mutans.
Objetivos específicos:
Determinar el efecto del cacao en polvo sobre el crecimiento del
Streptococcus mutans “in Vitro”.
Determinar el efecto de la manteca de cacao sobre el crecimiento
de Streptococcus mutans “in Vitro”.
Determinar el efecto del chocolate no azucarado sobre el
crecimiento de Streptococcus mutans “in Vitro”.
Determinar el efecto del chocolate azucarado sobre el crecimiento
de Streptococcus mutans “in Vitro”.
Comparar el efecto del cacao en polvo, la manteca de cacao, el
chocolate no azucarado y el chocolate azucarado sobre el
crecimiento de Streptococccus mutans “in Vitro”.
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II. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. TIPO Y ÁREA DE ESTUDIO:
La presente investigación es de tipo Experimental y, básica de acuerdo a
su orientación.
El área de estudio la constituyeron los ambientes de la Sección de
Microbiología Médica de la Facultad de Ciencias Médicas de la
Universidad Nacional de Trujillo durante los meses de octubre y
noviembre del 2008.
2.2. DEFINICIÓN DE LA POBLACIÓN MUESTRAL:
La población muestral fue creada de acuerdo a los parámetros
microbiológicos experimentales revisados. 18
2.3. UNIDAD DE ANÁLISIS
La unidad de análisis la constituyó el diámetro de halo inhibitorio de
los discos de difusión.
2.4. CRITERIOS DE INCLUSIÓN
Placas petri con el caldo de cultivo agar sangre que fueron
sometidas a un proceso de esterilización.
2.5. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN
Placas petri que hubiesen presentado algún tipo de daño o
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rajadura en su estructura durante el proceso de esterilización.
Placas petri que se hubiesen contaminado accidentalmente luego
del proceso de esterilización.
Aquellas placas petri cuyo resultado en el proceso de esterilización
hubiese sido dudoso.
2.6. TAMAÑO DE LA MUESTRA: Se determinó un tamaño de muestra experimental de 27 placas petri; 9
placas petri por cada concentración, las operaciones se muestran en el
anexo número uno y siguiendo las indicaciones del autor.17
2.7. DEFINICIÓN DE VARIABLES:
2.7.1 DERIVADOS COMERCIALES DEL CACAO:
Productos comerciales con modificación de la forma o propiedades del
cacao y adición de algunas sustancias, como la manteca del cacao, el
chocolate u otros.
CACAO EN POLVO:
El cacao en polvo es el producto comercial que resulta de la
fermentación y el secado de las semillas (habas o maracas) del fruto
del árbol del cacao y su procesamiento industrial. Se utilizó en el
presente trabajo el producto comercial: Cocoa Hersheys®.
MANTECA DE CACAO: La manteca del cacao es el producto comercial que resulta de la
industrialización de la materia grasa que contiene la pasta de cacao.
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Se utilizó en el presente la manteca de cacao Mycryo.
CHOCOLATE AZUCARADO:
Aquel derivado del cacao que se obtiene de la mezcla de azúcar con
pasta de cacao y manteca de cacao y su industrialización. Se utilizó
en el presente trabajo el chocolate azucarado Prime Peruvian Dark
Chocolate de la marca comercial Winters®.
CHOCOLATE NO AZUCARADO: Chocolate que usa para su edulcoración elementos distintos al
azúcar. Para la presente investigación se utilizó el chocolate “Non
sugar free” de la marca comercial Cavalier® que emplea para su
edulcoración xilitol.
Los productos comerciales fueron elegidos por haber sido los
que contienen el más alto contenido de Cacao y pureza en el
mercado.
2.7.2. STREPTOCOCCUS MUTANS:
Cepa de Streptococcus mutans procedentes del laboratorio de
microbiología de la Universidad Nacional de Trujillo, la cepa que se
utilizó corresponde a la cepa 2657263 ATCC.
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2.8. OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES:
Cuadro Nº 01: Operacionalización De Variables
Variable Indicador Tipo Escala
Cacao en polvo
Exposición al cacao No exposición al
cacao
Independiente Cualitativa Nominal
Manteca de Cacao
Exposición a la
manteca de cacao
No exposición a la manteca de cacao
Independiente Cualitativa Nominal
Chocolate no azucarado
Exposición al chocolate no azucarado
No exposición al
chocolate no azucarado
Independiente Cualitativa Nominal
Chocolate azucarado
Exposición al
chocolate azucarado
No exposición al chocolate azucarado
Independiente Cualitativa Nominal
Crecimiento de Streptococcus mutans
Inhibición y cantidad de efecto inhibitorio (diámetro de halo
inhibitorio)
No inhibición (halo inhibitorio = 0)
Dependiente Cuantitativa
discreta Dependiente Cuantitativa
discreta
De razón
De razón
DE
RIV
AD
OS
CO
ME
RC
IALE
S D
EL
CA
CA
O
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2.9. DISEÑO EXPERIMENTAL
El diseño del presente proyecto de investigación es de tipo
experimental. El experimento siguió un modelo de diseño
completamente aleatorizado que se muestra en el siguiente esquema:
Esquema Nº 01: Esquema del diseño experimental.
MC
E3
E4
C
E1
E2
E32
E42
C2
E12
E22
E33
E43
C3
E13
E23
E31
E41
C1
E11
E21
E34
E44
C4
E14
E24
C-A
C+A
A
CP
H2O
18h
18h
18h
18h
18h
24h
24h
24h
24h
24h
48h
48h
48h
48h
48h
72h
72h
72h
72h
72h
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Donde:
Grupo 1: Estuvo representado por E1; constituyó el área de las placas
petri con cultivo de Streptococcus mutans a la cual le fueron aplicados los
discos de la variable independiente cacao en polvo y en el cuál se
efectuaron observaciones a las 18, 24, 48 y 72 horas.
Grupo 2: Estuvo representado por E2; constituyó el área de las placas
petri con cultivo de Streptococcus mutans a la cual le fueron aplicados los
discos de la variable independiente manteca de cacao y en el cuál se
efectuaron observaciones a las 18, 24, 48 y 72 horas.
Grupo 3: Estuvo representado por E3; constituyó el área de las placas
petri con cultivo de Streptococcus mutans a la cual le fueron aplicados los
discos de la variable independiente chocolate no azucarado y en el cuál
se efectuaron observaciones a las 18, 24, 48 y 72 horas.
Grupo 4: Estuvo representado por E4; constituyó el área de las placas
petri con cultivo de Streptococcus mutans a la cual le fueron aplicados los
discos de la variable independiente chocolate azucarado y en el cuál se
efectuaron observaciones a las 18, 24, 48 y 72 horas.
Grupo 5: Estuvo representado por C; constituyó el área de las placas
petri con cultivo de Streptococcus mutans a la cual le fueron aplicados los
discos de la variable control (agua bidestilada) y en el cuál se efectuaron
observaciones a las 18, 24, 48 y 72 horas.
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2.10. PROCEDIMIENTO Y CAPTACIÓN DE INFORMACIÓN
El procedimiento de este experimento se realizó teniendo como base la
prueba de susceptibilidad de difusión en discos de Bauer – Kirby.18, 19, 20
1. OBTENCIÓN DE LA CEPA
El Streptococcus mutans ATCC 2652263 fue obtenido del cepario
del Laboratorio de la Sección de Microbiología de la Facultad de
Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo.
2. PREPARACIÓN DE LA CEPA
Una vez obtenida la cepa, ésta se cultivó en tubos de ensayo con
tapa rosca conteniendo el medio Soya tripticasa, incubándose a 37
ºC con el fin de obtener colonias jóvenes. Luego de 24 horas de
cultivadas se les agregó solución salina estéril, hasta obtener una
turbidez semejante al tubo número 1 de la escala de Mac Farland
(Anexo 05 Fotografía Nº 01). Luego, los tubos con la bacteria
estudiada fueron girados entre las manos durante 30 segundos
antes de proceder a su sembrado con el fin de haber logrado una
distribución adecuada de los microorganismos.
3. SEMBRADO
Se utilizaron hisopos estériles, los cuales, luego de ser embebidos
con la cepa preparada de Streptococcus mutans y a una distancia
de 10 cm de la llama del mechero se emplearon para el sembrado
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en placas petri, conteniendo Agar Sangre, hisopando
uniformemente sobre toda la superficie del agar y girando cada
placa 30 grados por 10 veces aproximadamente (Anexo 05
Fotografía Nº 02). Las placas recién sembradas fueron colocadas
dentro de una estufa a 37 ºC de temperatura durante 10 minutos.
4. PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
Para la prueba de susceptibilidad, se prepararon diluciones al
5%, 10 % y 15% teniendo como marco referencial las
investigaciones previas para este proceso de investigación.
Las diluciones utilizaron como soluto: cacao en polvo,
manteca de cacao, chocolate no azucarado y chocolate
azucarado de cada una de las tres concentraciones
respectivamente, utilizando agua destilada como diluyente; y a
una temperatura de 45º C para conseguir una fase uniforme
sin modificación de las propiedades de cada soluto. (Anexo 05
Fotografía Nº 03).
Se utilizó el método de difusión en discos. Se prepararon
discos de papel de filtro estériles, los cuales se sumergieron
dentro de cada dilución de los subgrupos de estudio, para el
grupo de control los discos fueron sumergidos en agua
destilada estéril q.p. (Anexo 05 Fotografía Nº 04).
Posteriormente, con una aguja estéril, los discos fueron
colocados sobre los cultivos de Streptococcus mutans en las
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placas petri previamente preparadas (Anexo 05 Fotografía Nº
05) y utilizando la disposición de los discos que se muestra
mediante gráfico en el anexo número 02. El total de Placas
Petri empleadas fue de 9, según el tamaño de muestra
obtenido en el cálculo estadístico (anexo 1); en
concentraciones de 5, 10 y 15 por ciento; lo que arrojó un total
de 27 placas petri con 135 discos de inhibición. (Anexo 05
Fotografía Nº 06).
A continuación las placas petri se incubaron a 37ºC en
microaerobiosis utilizando la Jarra Gas-Pack (con el método
de la vela, mediante el cual se procuró obtener un ambiente
aproximado de 5 a 10 % de CO2). (Anexo 05 Fotografía Nº
07).
Todo el procedimiento se llevó a cabo dentro del diámetro de 10
cm. de la llama de un mechero.
5. Lectura y Registro:
Pasadas las 18, 24, 48 Y 72 hrs. se procedió a la observación
de las placas petri examinando los grupos experimentales y el
grupo de control. (Anexo 05 Fotografía Nº 08).
Los discos que presentaron la generación de un halo alrededor
de los mismos fueron considerados con inhibición de
crecimiento bacteriano, contabilizados como tal y anotados en
el anexo número 03.
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Los discos que presentaron crecimiento bacteriano sobre ellos
fueron considerados sin inhibición de crecimiento bacteriano,
contabilizados como tal y anotados en el anexo número 03.
Además se midió el diámetro del halo inhibitorio de cada disco
de sensibilidad (mayor inhibición a mayor diámetro de disco),
incluyendo el área del disco de papel de filtro y los datos se
registraron en el anexo número 04 para su evaluación e
interpretación.
Del registro total se evaluó por medio de análisis de promedios
de halos inhibitorios en qué período se generó la mayor
inhibición y dichos valores fueron considerados en el análisis e
interpretación estadística.
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III. RESULTADOS
Los resultados de la presente investigación son presentados en cuadros
del 1 al 6.
En el cuadro N° 01 apreciamos según la prueba exacta de Fisher que:
El derivado cacao en polvo; representado por E1, presentó una diferencia
significativa (p< 0.05) en la presencia de inhibición de crecimiento de los
Streptococcus mutans comparado con el grupo de control a una
concentración del 5 y 15 por ciento; asimismo, presentó una diferencia
altamente significativa (p< 0.001) en la presencia de inhibición de
crecimiento de Streptococcus mutans comparado con el grupo control (C)
a la concentración del 10%.
El derivado manteca de Cacao; representado por E2, presentó una
diferencia altamente significativa (p< 0.001) en la presencia de inhibición
de crecimiento de los Streptococcus mutans comparado con el grupo de
control (C) en todas las concentraciones (5, 10 y 15 por ciento).
El derivado chocolate no azucarado; representado por E3, presentó una
diferencia muy significativa (p< 0.01) en la presencia de inhibición de
crecimiento bacteriano comparado con el grupo de control (C) en las
concentraciones del 5 y 10 por ciento, y una diferencia altamente
significativa (p< 0.001) a la concentración del 15 por ciento.
El derivado chocolate azucarado; representado por E4, presentó una
diferencia significativa (p< 0.05) en la presencia de inhibición de
crecimiento bacteriano comparado con el grupo de control (C) en las
concentraciones del 5 y 10 por ciento, y una diferencia altamente
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significativa (p< 0.001) a la concentración del 15 por ciento.
Ningún disco del grupo de control presentó generación de halo inhibitorio
positiva por lo tanto no presentó inhibición bacteriana alguna.
En el cuadro N° 02, al aplicar una prueba de promedios marginales para
el derivado cacao en polvo, representado por E1, encontramos qué,
presentó un promedio marginal de 4,44 mm. de sus diámetros de halo
inhibitorio de crecimiento de Streptococcus mutans, esto a una
concentración del 5 por ciento, 8.89 mm. al 10 por ciento y 3.5 mm. al 15
por ciento. Por haber presentado este derivado una mayor significancia
mediante la prueba de Fisher a una concentración del 10%, se consideró
el valor de 8,89 mm. como su diámetro promedio de inhibición de
crecimiento de Streptococcus mutans.
En el cuadro N° 03, al aplicar una prueba de promedios marginales para
el derivado manteca de cacao (E2); encontramos qué, presentó un
promedio marginal de 12.56 mm. de sus diámetros de halo inhibitorio de
crecimiento bacteriano a una concentración del 5 por ciento, 15.63 mm. al
10 por ciento y 19.22 mm. al 15 por ciento. Por haber presentado este
derivado una alta significancia en todas sus concentraciones, se
consideró el valor de 15.806 mm. como su diámetro promedio de
inhibición de crecimiento de Streptococcus mutans.
En el cuadro N° 04, el derivado chocolate no azucarado (E3), al aplicar
una prueba de promedios marginales, presentó un promedio marginal de
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5.56 mm. de sus diámetros de halo inhibitorio de crecimiento bacteriano,
esto a una concentración del 5 por ciento, 6.19 mm. al 10 por ciento y
9.67 mm. al 15 por ciento. Por haber presentado este derivado una mayor
significancia en sus resultados a una concentración del 15 por ciento, se
consideró el valor de 9.67 mm. como su diámetro promedio de inhibición
de crecimiento de Streptococcus mutans.
En el cuadro N° 05, el derivado chocolate azucarado, representado por
E4, presentó un promedio marginal de 3.5 mm. de sus diámetros de halo
inhibitorio de crecimiento bacteriano, esto a una concentración del 5 por
ciento, 3.66 mm. al 10 por ciento y 8.94 mm. al 15 por ciento. Por haber
presentado este derivado una mayor significancia en sus resultados a una
concentración del 15 por ciento, se consideró el valor de 8.94 mm. como
su diámetro promedio de inhibición de crecimiento de Streptococcus
mutans.
En el cuadro N° 05, el derivado chocolate azucarado, representado por
E4, presentó un promedio marginal de 3.5 mm. de sus diámetros de halo
inhibitorio de crecimiento bacteriano a una concentración del 5 por ciento,
3.66 mm. al 10 por ciento y 8.94 mm. al 15 por ciento. Por haber
presentado este derivado una mayor significancia en sus resultados a una
concentración del 15 por ciento, se consideró el valor de 8.94 mm. como
su diámetro promedio de inhibición de crecimiento de Streptococcus
mutans.
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En el cuadro N° 06 A, al aplicar el análisis de Varianza para un diseño
factorial completo al azar, se aprecia en las pruebas F que al menos una
concentración y derivado del cacao, presentan diferencia altamente
significativa comparados con las demás concentraciones y derivados
respectivamente. Con dicha información; en el cuadro N° 06 B, se
promedió a realizar un análisis de Duncan; obteniendo:
Al analizar las concentraciones; se obtuvo que la concentración del 5 por
ciento logró diferir significativamente de las otras 2, asimismo, las
concentraciones del 10 y 15 por ciento, no presentan una diferencia
significativa entre ellas.
Al analizar los tipos de derivado, se encontró que el promedio marginal de
diámetro de inhibición de crecimiento de Streptococcus mutans del
derivado manteca de cacao; representado por E2, difiere
significativamente del resto de derivados comerciales del cacao,
asimismo, el promedio marginal de los diámetros de inhibición de
crecimiento bacteriano del cacao en polvo, chocolate no azucarado y
chocolate azucarado no presentan diferencia significativa entre ellos.
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CUADRO N° 01
PRUEBA EXACTA DE FISHER
Significancia:
Si p > 0.05; No hay.
Si p < 0.05; Si hay.
Si p < 0.01; Existe muy significativa
Si p < 0.001; Existe altamente significativa
5% 10% 15%
Grupo Inhibición
p Grupo Inhibición
p Grupo Inhibición
p SI NO SI NO SI NO
C 0 9 p = 0.0147 p < 0.05|
C 0 9 p = 0.00021 p < 0.001
C 0 9 p = 0.0412 p < 0.05 E1 5 4 E1 8 1 E1 4 5
C 0 9 p = 0.000021 p < 0.001
C 0 9 p = 0.000021 p < 0.001
C 0 9 p = 0.000021 p < 0.001 E2 9 0 E2 9 0 E2 9 0
C 0 9 p = 0.0045 p < 0.01
C 0 9 p = 0.0045 p < 0.01
C 0 9 p = 0.00021 p < 0.001 E3 6 3 E3 6 3 E3 8 1
C 0 9 p = 0.0412 p < 0.05
C 0 9 p = 0.0412 p < 0.05
C 0 9 p = 0.000021 p < 0.001 E4 4 5 E4 4 5 E4 9 0
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CUADRO N° 02
PROMEDIOS MARGINALES E1
E1 5%
(mm.)
E1 10%
(mm.)
E1 15%
(mm.)
01 7.5 9 10.5
02 0 0 6
03 7.5 11 6
04 0 8 0
05 8 11.5 0
06 8 8 0
07 9 9 9
08 0 14 0
09 0 9.5 0
Promedio marginal 4.444444 8.888889 3.5
Significancia p = 0.0147
p < 0.05 p = 0.00021 p < 0.001
p = 0.0412 p < 0.05
Significancia:
Si p > 0.05; No hay.
Si p < 0.05; Si hay.
Si p < 0.01; Existe muy significativa
Si p < 0.001; Existe altamente significativa
Variable
N°placa
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CUADRO N° 03
PROMEDIOS MARGINALES E2
E2 5%
(mm.)
E2 10%
(mm.)
E2 15%
(mm.)
01 10.5 10 22
02 8 16 11.5
03 15 11 18.5
04 10 8.75 20
05 15.5 16 22
06 15 13.5 24.5
07 15 16 23.5
08 10.5 31.5 15
09 13.5 18 16
Promedio marginal 12.55556 15.63889 19.22222
Promedio final 15.806
Significancia p = 0.000021
p < 0.001 p = 0.000021
p < 0.001 p = 0.000021
p < 0.001
Significancia:
Si p > 0.05; No hay.
Si p < 0.05; Si hay.
Si p < 0.01; Existe muy significativa
Si p < 0.001; Existe altamente significativa.
Variable
N°placa
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CUADRO N° 04
PROMEDIOS MARGINALES E3
E3 5%
(mm.)
E3 10%
(mm.)
E3 15%
(mm.)
01 7 7 11.5
02 0 0 11.5
03 8 8.5 10
04 0 0 9
05 8.5 0 12.5
06 9 12.5 0
07 10.5 9.5 13.5
08 7 8.25 11
09 0 10 8
Promedio marginal 5.55556 6.194444 9.666667
Significancia p = 0.0045
p < 0.01 p = 0.0045 p < 0.01
p = 0.00021 p < 0.001
Significancia:
Si p > 0.05; No hay.
Si p < 0.05; Si hay.
Si p < 0.01; Existe muy significativa
Si p < 0.001; Existe altamente significativa
Variable
N°placa
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CUADRO N° 05
PROMEDIOS MARGINALES E4
E4 5%
(mm.)
E4 10%
(mm.)
E4 15%
(mm.)
01 7 0 11
02 0 0 9
03 0 8 10
04 0 0 8.5
05 8 0 8
06 0 0 8
07 9.5 10 10
08 7 7 10
09 0 8 6
Promedio marginal 3.5 3.666667 8.944444
Significancia p = 0.0412
p < 0.05 p = 0.0412 p < 0.05
p = 0.000021 p < 0.001
Significancia:
Si p > 0.05; No hay.
Si p < 0.05; Si hay.
Si p < 0.01; Existe muy significativa
Si p < 0.001; Existe altamente significativa
Variable
N°placa
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CUADRO N° 06
ANÁLISIS DE VARIANZA PARA UN DISEÑO FACTORIAL COMPLETO AL AZAR
Significancia:
Si p > 0.05; No hay.
Si p < 0.05; Si hay.
Si p < 0.01; Existe muy significativa
Si p < 0.001; Existe altamente significativa
Fuente de variación
Suma de cuadrados gl
Cuadrado Medio F p
Concentración 263.310 2 131.655 7.124 0.001 Derivado Cacao 1980.792 3 660.264 35.726 0.000 Concentración * Derivado Cacao 346.792 6 57.799 3.127 0.008
Error 1774.194 96 18.481 Total 4365.088 107
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CUADRO N° 07
ANÁLISIS DE DUNCAN
Y
Significancia:
Si p > 0.05; No hay.
Si p < 0.05; Si hay.
Si p < 0.01; Existe muy significativa
Si p < 0.001; Existe altamente significativa
Concentración N Alfa 0.05
1 2
5% 36 6.514
10% 36 8.597
15% 36 10.333
p 1.000 .090
Tipo Chocolate
E4 27 5.370
E1 27 5.611
E3 27 7.139
E2 27 15.806
p 0.157 1.000
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IV. DISCUSIÓN
Resultados de experimentos previos al presente11-16, demuestran que
existe un efecto inhibitorio de caries en el cacao y sus componentes, pero
ninguno efectuó un experimento utilizando como agentes de estudio
derivados comerciales del mismo; el presente trabajo al hacerlo, reitera
los conocimientos de los estudios previos acerca de las propiedades
inhibitorias de crecimiento bacteriano que posee el cacao y además
ofrece el conocimiento de que dichas propiedades se mantienen aún
después de su procesamiento industrial, específicamente, la propiedad
inhibitoria sobre el crecimiento de los Streptococcus mutans.
Los estudios realizados por Wynfrey Wyn y col 12 encontraron en sus
investigaciones que la grasa adicionada al cacao es la responsable de
sus efectos inhibitorios sobre la caries dental, en relación a dichas
conclusiones, el presente trabajó encontró cierta similitud en cuánto a qué
el derivado manteca de cacao (de naturaleza grasa) fue el que presentó
un efecto inhibitorio altamente significativo comparado con el resto de los
otros derivados, con un efecto de más del doble respecto a los promedios
de diámetros de halo inhibitorio de los otros derivados (2.62 a 1).
En otros estudios previos al presente trabajo de investigación13-15, se
encuentra una contraposición de ponencias en cuanto a los efectos
anticariogénicos del chocolate en ausencia o presencia de azúcares. En
la presente investigación se encontró tras aplicar una prueba de Duncan
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qué, tanto el chocolate no azucarado como el chocolate azucarado
presentaron un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de los
Streptococcus mutans, además ambos efectos fueron similares entre sí
por no presentar diferencia significativamente estadística entre los
promedios de sus diámetros de halo inhibitorio. Estos resultados nos
llevarían a cierta inclinación por los resultados de las investigaciones de
Kyoto ito y col. 15, los cuales aseveran que el chocolate posee un efecto
anticariogénico aún en presencia de azúcar; no obstante, no podríamos
censurar por completo las aseveraciones de T. Ooshima y col.13,14, las
que indican que el chocolate posee cierto potencial anticariogénico
aunque no suficiente como para contrarrestar el efecto cariogénico del
azúcar, ya que sus investigaciones se realizaron en animales de
experimentación mientras que los de la presente fueron en condiciones “in
Vitro”, pero si podemos afirmar que a pesar del contenido de azúcar, el
chocolate azucarado posee cierto efecto inhibitorio contra el crecimiento
de los Streptococcus mutans en condiciones experimentales de primer
grado.
En contraposición a los experimentos de Rimondia y col.16, quienes
afirman que el cacao puede reducir la formación del biofilm por
Streptococcus mutans sólo en ausencia de colonias preformadas, la
presente investigación obtuvo valores de diámetro inhibitorio mayores a
las 72 horas de su observación, demostrando un efecto de inhibición de
crecimiento que se propagaba hacia las colonias de Streptococcus
mutans formadas previamente desde su primera incubación.
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Debe tenerse en consideración que el diámetro inhibitorio antibacteriano
que generan las sustancias no sólo depende de su potencia sino de su
capacidad de difusión, por lo cuál, los diámetro de inhibición de
crecimiento de Streptococcus mutans generados en el presente, no sólo
reflejan la fuerza antibacteriana del derivado del cacao utilizado, sino que
conjuntamente reflejan la capacidad de difusión del derivado del cacao en
materia a través del medio agar sangre conejo. 18-20
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V. CONCLUSIONES
1. Los 04 derivados comerciales del cacao: cacao en polvo, la
manteca de cacao, el chocolate no azucarado y el chocolate con
azúcar inhiben el crecimiento de Streptococcus mutans “in Vitro”.
2. El cacao en polvo inhibe el crecimiento “In Vitro” de Streptococcus
mutans en un promedio de 8.89 mm. de halo inhibitorio.
3. La manteca de cacao inhibe el crecimiento “In Vitro” de
Streptococcus mutans en un promedio de 15.806 mm. de halo
inhibitorio.
4. El chocolate no azucarado inhibe el crecimiento “In Vitro” de
Streptococcus mutans en un promedio de 9.67 mm. de halo
inhibitorio.
5. El chocolate con azúcar inhibe el crecimiento “In Vitro” de
Streptococcus mutans en un promedio de 8.94 mm. de halo
inhibitorio.
6. El cacao en polvo, el chocolate no azucarado y el chocolate con
azúcar poseen una cantidad de efecto de inhibición “In Vitro” de
crecimiento de Streptococcus mutans similar, mientras que la
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manteca de cacao posee un efecto 2.62 veces mayor a los otros
derivados comerciales.
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VI. RECOMENDACIONES
Según el presente estudio se recomienda:
En cuanto a las concentraciones del 5, 10 y 15 por ciento que se
emplearon en el presente trabajo; cabe resaltar qué, se encontró
que a partir de una concentración del 10 por ciento no existe
diferencia significativa en los resultados obtenidos a
concentraciones mayores (15 por ciento) por lo cuál para futuras
investigaciones podría establecerse la concentración del 10 por
ciento como óptima para efectos de experimentación.
Considerando los resultados positivos en cuánto a los efectos
inhibitorios de los derivados del cacao sobre el crecimiento de los
Streptococcus mutans en el presente trabajo que es de
experimentación de primer grado, se recomienda efectuar estudios
experimentales de segundo y tercer grado para poder reforzar la
imagen anticariogénica de los derivados del cacao.
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VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Argentina. Editorial El Ateneo; 1977. p 107.
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Money. Operatoria dental. Tercera ed. Buenos aires, Argentina.
Editorial Panamericana; 1999. p 239.
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5. Ckett. S. La ciencia del chocolate. Primera Ed. Zaragoza,
España. Editorial Acribia; 2001. p 18 – 55.
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Disponible en:
http://www.acc.org/media/releases/highlights/2008/june08/cocoa.
7. Heiss C, Kleinbongard. P, Dejam A, Perré S, Schroeter H, Sied H.
Acute consumption of flavanol- rich cocoa and the reversal of
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College of Cardiology 2005; 46(7): 1276 – 1281. Disponible en:
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(Theobroma cacao) on glucose levels and lipid profiles in
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Food and Agriculture 2008; 88: 1442 – 1447. Disponible en:
http://www.worldcocoafoundation.org/info-center/document-
research-center/documents/Ruzaidi2008.pdf
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9. Gabinete de Comunicación del Instituto del Cacao y el Chocolate.
Dossier de Prensa 2005. [citado 02 de jun. 2008]. Disponible en:
www.minag.gob.pe/dgpa1/ARCHIVOS/cacao_doc4.pdf
10. Gustafsson BE, Quensel CE, Lanke LS. The Vipeholm dental
caries study: The effect of diferents levels of carbohydrate intake
on caries activity in 436 individuals observed for 5 years. Act
Deontological Scand 1954; 11: 232 – 364. [Citado 06 de jun. 2006
via Hinari Perú] http://www.concytec.gob.pe/alicia/hinari.html
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fatted cocoa and the absence of activity in cocoa fat. Archives of
Oral Biology 1966. 11; 149 – 161; [Citado 07 de jun. 2006 via
Hinari Perú] http://www.concytec.gob.pe/alicia/hinari.html
12. Wynn W, Haldi J, Law M. Influence of the Ash of the Cacao on the
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Dentistry, Atalnta 22, Georgia; Journal of Dentistry Resources
February 1960. Text complet. [Citado 20 de jun. 2006 via Hinari
Perú]
http://www.concytec.gob.pe/alicia/hinari.html
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Oral Biology 2000. 45(8); 639 – 645. Text complet. [Citado 16 de
jul. 2006 via Hinari Perú]
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14. Ooshima T, Osaka, Sasaki H, Osawa K, Yasuda H, Matsumoto
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Biology 2000. 45(8); 805 – 808. Text complet. [Citado 04 de jun.
2006 via Hinari Perú]
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15. Kyoko I, Nakamura Y, Tokunaga T, Lijima S, Fukushima K. Anti-
cariogenic Properties of a Water-soluble Extract from Cacao.
Bioscience; Biotecnology and Biochemistry 2003. 67(12); 2567 –
2573. Text complet. [Citado 04 de jun. 2006 via Hinari Perú]
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16. Cole AS, Eastoe JE, Wrigth. Biochemistry and oral Biology. 2nd
Edition. Washington, EE. UU.; 1988. p 532-538. Text complet.
[Citado 04 de jun. 2006 via Hinari Perú]
http://www.concytec.gob.pe/alicia/hinari.htm
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17. Steel R, Tarnie J. Bioestadística: Principios y procedimientos.
Traducción Ricardo Martínez. 2da Edición. EE.UU. Editorial Mc
Graw-Hill; 1985. p 116.
18. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn
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Argentina. Editorial Médica Panamericana; 1999. p 610 -615.
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Clínico. Tomo II. Octava ed. Buenos Aires: Panamericana; 1983.
p 215 -255
20. Brooks G, Batel J, Morse S. Microbiología Médica de Jawest,
Meldick y Adelberg. 16ª ed. Mexico: El Manual Moderno; 1999. p
310 -351
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VIII. ANEXOS
ANEXO 01
OBTENCIÓN DEL TAMAÑO DE MUESTRA
2
222/ )(
E
SZZn
Dónde:
96.12/ Z Usando un coeficiente de confiabilidad 05.0
84.0Z Usando un coeficiente de confiabilidad 20.0
Se asume que S = E por no haber estudios anteriores.
Entonces:
22/ )( ZZn
2)84.096.1( n --
884.7 n
Obtención de n final:
)12
32(
gl
glnn f Donde: 1 ngl
Entonces:
)114
314(8
fn
906.9)
15
17(8 fn
Con estos datos el tamaño de muestra por cada grupo será de 9.
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ANEXO 02
DISPOSICIÓN DE LOS DISCOS DE INHIBICIÓN EN
LAS PLACAS PETRI
C
E2
E4
E3
E1
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ANEXO 03
FICHA DE REGISTRO DE ACTIVIDAD INHIBITORIA
Placa Número:..............
Cepa: ...................................
Concentración: .....................................
Medio De Cultivo: ........................................................
Inclusión De Las Variables: Fecha: …/…./.….
Hora: …....………
Horas transcurridas después de la inclusión de las variables:
Horas: ……………..
Variables
Inhibición
Cacao en
polvo
Manteca
de
Cacao
Chocolate
no
azucarado
Chocolate
azucarado
Agua
destilada
Presencia de
Inhibición
Ausencia
de
Inhibición
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ANEXO 04
FICHA DE REGISTRO DE DIÁMETRO DE INHIBICIÓN
Placa Número:..............
Cepa: ...................................
Concentración: .....................................
Medio De Cultivo: ........................................................
Inclusión De Las Variables: Fecha: …/…./.….
Hora: ………….
Horas transcurridas después de la inclusión de las variables:
Horas: ……………..
Diámetro del Halo en mm.
PROMEDIO
dm. DM
CACAO EN
POLVO
MANTECA DE
CACAO
CHOCOLATE NO
AZUCARADO
CHOCOLATE
AZUCARADO
AGUA
DESTILADA
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ANEXO 05
FOTOGRAFÍAS
FOTOGRAFÍA N° 01
Comparación de la turbidez de los tubos con cepas de Streptococcus mutans recién replicadas con la escala N° 01 de Mac Farland
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ANEXO 05
FOTOGRAFÍAS
FOTOGRAFÍA N° 02
Sembrado de las cepas de Streptococcus mutans en las placas petri con el caldo de cultivo agar sangre conejo
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ANEXO 05
FOTOGRAFÍAS
FOTOGRAFÍA N° 03
Diluciones de los solutos de los 04 derivados de cacao en tubos de ensayo a concentraciones del 5, 10 y 15 por ciento
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FOTOGRAFÍA N° 04
Impregnado de los discos de difusión en placas petri con las diluciones de los 04 derivados comerciales del cacao
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ANEXO 05
FOTOGRAFÍAS
FOTOGRAFÍA N° 05
Colocación de los discos de inhibición en las placas petri ya sembradas con Streptococcus mutans
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ANEXO 05
FOTOGRAFÍAS FOTOGRAFÍA N° 06
Número total de placas petri (27) sembradas y con los discos de inhibición presentes
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ANEXO 05
FOTOGRAFÍAS
FOTOGRAFÍA N° 07
Colocación de las placas petri preparadas en un medio de microanaerobiosis con la Jarra Gas-Pack
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ANEXO 05
FOTOGRAFÍAS
FOTOGRAFÍA N° 08
Observación de halos de inhibición en una placa petri preparada a las 72 horas de su incubación
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