1
13 Meeting di Aggiornamento per Responsabili e Tecnici di Laboratorio del Settore Lattiero Caseario
Roma 4 dicembre 2013
Incertezza di misura nelle prove microbiologiche: le novit introdotte
dall'Amendment 1:2013 della ISO 7218:2007
Dino Spolaor
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 2
ISO 7218:2007 /Amd 1:2013
MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDINGSTUFFS GENERAL REQUIREMENTS ANDGUIDANCE FOR MICROBIOLOGICALEXAMINATION
Scopo e Campo di applicazione - Guida per i laboratori dimicrobiologia - Applicabile ad alimenti e mangimi,allambiente di produzione e manipolazione degli alimenti.
2
ISO 7218:2007 / Amd 1:2013CONTEGGIO
Concentrazione batterica BASSA (10 ufc/g-ml) Terreni solidiEnumerazione su / in terreno solido agarizzato
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 3
ISO 7218:2007 /Amd 1:2013CAMPO DI MISURA
Dimensione della Piastra di Petri
Dimensione della membrana (tecnica MF)
Morfologia della colonia
Caratteristiche da osservare (es. aloni)
Piastra Petri diam 55 mm 110 ufc/piastra
Piastra Petri diam 90 mm 300 ufc/piastra
Piastra Petri diam 140 mm 730 ufc/piastra
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 4
3
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 5
N di piastre per diluizioneISO 7218:2007 par. 10.2.2
Una piastra per almeno due diluizioni
1. per laboratori che operano under quality assurance in accordo con i principi della ISO 17025
Due piastre
1. Laboratori non ISO 17025
2. Se richiesta una sola diluizione
ISO 7218:2007 / Amd 1:2013Metodo di calcolo - caso generale
Formula generale
C = SOMMA delle colonie di 2 piastre consecutive in cui ALMENO UNA con 10 colonie
V = Volume di inoculo
d = diluizione (se non eseguite diluizioni d=1)
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 6
4
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 7
Relazione ISO 7218 e metodi normati
ISO 7218:2007 Par. 1 Scope
The requirements of this International Standard supersede the corresponding ones of existing specific standards.
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 8
ISO 7218:2007 / Amd 1:2013
DA NON DIMENTICARE
Al paragrafo 10.3.1 si afferma:
Nei differenti metodi di calcolo (definiti in 10.3.2, AnnexB e D) si deve tener conto delle piastre non contenenticolonie, se queste piastre sono state prese inconsiderazione in quanto risultano significative nelcalcolo della media ponderata.
5
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 9
ESEMPI APPLICATIVI
ESEMPI I
diluizione
II
diluizioneCHE FARE?
1 230 20Applica la formula
generale utilizzando i dati di conta di
entrambe le piastre
2 20 3
3 10 2
4 10 0
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 10
CASI PARTICOLARI
I
diluizione
II
diluizione
CHE FARE?
9 1 La Tab. B.3 della ISO 7218:2007/Amd.1:2013
dichiara NA (non applicabile) la media
ponderata delle conte delle due diluizioni,
pertanto possibile esprimere il risultato sulla
base della conta della sola prima diluizione.
4 0
3 0
2 0
1 0
6
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 11
CASI PARTICOLARI
I
diluizione
II
diluizione
CHE FARE?
Considera solo la prima diluizione
9 1 9 UFC stimate/g-ml
4 0 4 UFC stimate/g-ml
3 0 m.o. presenti ma inferiori a 4/Vd
2 0 m.o. presenti ma inferiori a 4/Vd
1 0 m.o. presenti ma inferiori a 4/Vd
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 12
CASI PARTICOLARI
I
diluizione
II
diluizione
CHE FARE?
0 0Esprimi il risultato come
inferiore a 1/Vd UFC/g-ml
! Attenzione ! d = diluizione Es. 0,1 o 0,01
7
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 13
Metodo di calcolo caso generaleConta delle colonie totali o colonie tipiche
d 1,1 V
CN
=
)d0,1nV(n
CN
21 +=
ISO 7218:2007/Amd.1:2013Annex D
n piastre per diluizione2 successive diluizioniAlmeno 1 piastra contenga 10 colonie
ISO 7218:2007/Amd.1:2013 10.3.2.31 piastra per diluizione2 successive diluizioniAlmeno 1 piastra contenga 10 colonie ( 10.3.2.2)
ISO 7218:2007/Amd 1:2013Metodo di calcolo con identificazione
Formula generale
a = SOMMA delle colonie confermateb = n colonie in accordo con i criteri di identificazione, confermate
A = n colonie sottoposte a conferma / per piastra (generalmente 5 )
C = n totale di colonie presunte / contate in piastra
V = Volume di inoculo
d = diluizione (se non eseguite diluizioni d=1)
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 14
8
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 15
ISO 7218:2007 Numero di microorganismi dopo identificazione
a = numero colonie dopo identificazione
CA
ba =
b = numero colonie confermateA = numero colonie sottoposte a confermaC = numero colonie presuntive contate
A = generalmente 5 colonie da ciascuna piastra sottoposta a conteggio
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 16
Metodo di calcolo Dopo identificazione
d x 1,1 x V
aN
=)d0,1nV(n
aN
21 +=
ISO 7218:2007/Amd.1:2013Annex D
n piastre per diluizione2 successive diluizioniAlmeno 1 piastra contenga 10 colonie
ISO 7218:2007/Amd.1:2013 10.3.2.31 piastra per diluizione2 successive diluizioniAlmeno 1 piastra contenga 10 colonie ( 10.3.2.2)
9
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 17
10.3.2.4.3.2 ISO 7218:2007Indicazioni errate che si ritrovano ancora nellAmd.1:2013
ISO 7218:2007
ISO 7218:2007 / Amd 1:2013 10.3.2.2ISO 14461-2
il rapporto 1:10 di una diluizione non viene sempre rispettato nella conta delle colonie
La ISO 14461-2 stabilisce con quale tolleranza laconta delle colonie pu allontanarsi dalrapporto 1:10
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 18
10
D.Spolaor, A.Maiello - Validazione, Incertezza di misura, Assicurazione qualit dato analitico 19
10-2
10-3
50 45
6 8
VALUTARE LOMOGENEIT GENERALE TRA LE DILUIZIONI E TRA LE PIASTRE RIPETUTE
Valutare se le variazioni, rispetto ai dati attesi, sono pi elevate di quelle dovute al caso
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 20
ISO 14461-2:2005 IDF 169-2:2005
VALUTAZIONE DATI
Confronto delle conte di piastre parallelecon i dati riportati in Tabella 1 per valutare la
Conformit (Probabilit (P) 99%)
11
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 21
Tab. 1 - Piastre parallele
Esempio. Conte: 193 e 142 Si cerca in Tab. 1 il valore pi alto dei due e si controlla
che il valore della 2a piastra sia allinterno dellintervallo della tabella.
In questo caso 142 non conforme
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 22
ISO 14461-2:2005 IDF 169-2:2005
VALUTAZIONE DATI
Confronto delle conte di 2 diluizioni con i datiriportati in Tabella 2 per valutare
Conformit (Probabilit (P) 99%)
12
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 23
Tab. 2 diluizioni in successione
Prima dil Diluizione successiva
Conte su diluizioni successive:151 e 31.
Si cerca nella tab. 2 il valore della prima diluizione considerata (151).Si verifica se il secondo valore compreso nellintervallo 6 e 26 riportato nella stessa riga. In questo caso il valore 31 al di fuori dellintervallo (non conforme).
ISO 7218:2007 / Amd 1:2013
ARROTONDAMENTI: 2 cifre significative
ESPRESSIONE DEL RISULTATO:
- numero (N) compreso tra 1,0 e 9,9 (moltiplicato perlappropriato fattore 10, relativo alla prima diluizioneconsiderata) o come numero intero
UNITAdi MISURA: microorganismi (UFC) /g o ml
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 24
13
Risultato e intervallo di fiducia
210.000
190.000
170.000
Limite superiore
Limite inferiore
UFC/g191.818
210.970
174.370
Valori non arrotondati
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 25
ISO 7218:2007 / Amd 1:2013BASSE CONTE
PRECISIONE massima DEL CONTEGGIO
Da 10 colonie al LIMITE SUPERIORE (specifico per ogni metodo)
Precisione decrementa considerevolmente se conteggio
14
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 27
UNI ENV ISO 13843:2003 p. 6.1.2
Lincertezza casuale aumenta rapidamente conla riduzione della conta delle colonie.
Nellintervallo di conteggio sotto a dieci circa,che di considerevole interesse per la salutepubblica, le singole misurazioni sono cosimprecise che possono essere a malapenacaratterizzate come migliori che semi-quantitative.
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 28
Nel caso della distribuzione di Poisson, la minor concentrazione di particelle x, quantificabile, data da
( )21
VCx =
10.3.2.4.1 ISO 7218:2007/Amd.1:2013Basse conte (
15
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 29
( )4
500
12
==,
x
Se il limite dello scarto tipo relativo CV scelto = 50%, il limite minimo di quantificazione dato da
CV = 50% - ragionevole in microbiologia (cfr limiti fiduciali in % su Tab B.2 Annex B - ISO 7218: 2007/Amd.1:2013)
4250
1 ==,
x
10.3.2.4.1 ISO 7218:2007/Amd.1:2013Basse conte (
16
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 31
Espressione del risultato
0
3
12
45
8
67
910
m.o. inferiori a 1 /Vd g o ml
m.o. presenti ma inferiori a 4 /Vd g o ml
UFC stimate per g o ml
UFC per g o ml
Annex DD.5.1 Case of two dishes (...) containing less than 10 coloniesD.5.1 Caso di 2 piastre () contenenti meno di 10 colonie
If each of the two dishes from the test sample (liquid products), or from the initial suspension (other products), or from the first dilution inoculated or retained, contains less than 10 colonies (...) and the set of the two dishes contains at least 4 colonies, calculate the estimated number NE of microorganisms present in the test sample as an arithmetical mean of the colonies counted on the two dishes using formula D.3.
Se ciascuna delle 2 piastre contiene meno di 10 colonie e le due piastre assieme contengono almeno 4 colonie, calcolare il numero stimato di microrganismi presenti come media delle colonie contate sulle due piastre usando la formula
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 32
17
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 33
CASI PARTICOLARICONTEGGIO DI LIEVITI E MUFFE
Criteri di scelta delle piastreConteggio prioritario LIEVITI:scegliere le piastre con n. di colonie pi vicino al limite massimodi 150 colonie/piastra.
Conteggio prioritario MUFFE:scegliere le piastre con n. di colonie pi vicino al limite minimo di10 colonie/piastra.
10 15010050
LIEVITIMUFFE
UNA O DUE PIASTRE PER DILUIZIONE
NON E INDIFFERENTE
PIASTRE PER
DILUIZIONE
MASSIMO
NUMERO COLONIE
PER PIASTRA
LIMITE
SUPERIORE
INTERVALLO DI
FIDUCIA
UNA150 174
300 334
DUE150 167
300 324
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 34
18
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 35
CASI PARTICOLARIConfronto Prima e Dopo Amd.1:2013
I
diluizione
II
diluizioneCHE FARE?
>334 9 ISO 7218:2007
Considera solo la conta
della II diluizione
esprimendo il risultato come
UFC stimate/g-ml
>334 9ISO 7218:2007
Amd.1:2013Risultato inaccettabile
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 36
CASI PARTICOLARIISO 7218:2007 Amd.1:2013
I
diluizione
II
diluizione
Limite II dil
CHE FARE?
>334 9 20Risultato inaccettabile
310 8 18 Risultato inaccettabile*
Intervallo 10-300, tolleranza fino a 334 UFC
* La ISO 7218:2007 considerava accettabile il risultato
19
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 37
CASI PARTICOLARIISO 7218:2007 Amd.1:2013
I
diluizione
II
diluizione
Limite II dil
CHE FARE?
>174 9 8UFC stimati sulla base
della II diluizione
160 8 7 Risultato calcolato usando le due piastre (accettabile)
Intervallo 10-150, tolleranza fino a 174 UFC
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 38
CASI PARTICOLARI
I
Diluizione
10-2
II
Diluizione
10-3
CHE FARE?
>300 >300Esprimi il risultato come
superiore a 300.000 UFC/g-ml
>150 >150Esprimi il risultato come
superiore a 150.000 UFC/g-ml
20
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 39
CASI PARTICOLARICOLONIE TIPICHE E CONFERMATE
I
Diluizione
10-2
II
Diluizione
10-3
CHE FARE?
> 300 (presenza di
colonie tipiche o confermate)
33 (assenza di
colonie tipiche o confermate)
Esprimi il risultato come m.o presenti < 1 /V2d2 e > 1/V1d1 /g o ml
inferiore a 103 e superiore a 102 UFC/g-ml(tra 100 e 1.000 UFC/g-ml)
> 300 (assenza di
colonie tipiche o
confermate)
33 (assenza di
colonie tipiche o confermate)
Esprimi il risultato come < 1 /V2d2 microorganismi presenti /g o ml
inferiore a 103 UFC/g-ml
ISO 7218:2007 / Amd 1:2013Intervallo di fiducia, unalternativa
Per valutare la validit di un risultato ed evitare interpretazione del dato in modo eccessivamente restrittivo, necessario stimare lincertezza di misura e quando non possibile, stimare lintervallo di fiducia che caratterizza in modo statistico la distribuzione dei microorganismi nel campione
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 40
21
ISO 7218:2007/Amd1:2013ANNEX B
Intervallo di fiducia- Conteggio
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 41
dove
ISO 7218:2007/Amd1:2013_ANNEX B
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 42
22
ISO 7218:2007 / Amd1:2013ANNEX B
Intervallo di fiducia CASI SPECIALI con basse conte
Tabelle da B2 a B5
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 43
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 44
ISO 7218:2007 / Amd1:2013_ANNEX B
23
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 45
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 46
24
ISO 7218:2007 / Amd1:2013
Determinazione del Most Probable Number (MPN)
Valutazione visiva es.torbidit, produzione gas, viraggio colore
isolamento di m.o. su terreni selettivi
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 47
ISO 7218:2007 / Amd1:2013
3 possibilit di determinare il valore di MPN,
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 48
- Formule matematiche
- Tabelle MPN _ (Annex C)
- Specifici programmi liberamente scaricabili http://standards.iso.org/iso/7218/
25
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 49
ISO 7218:2007 / Amd1:2013
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 50
Il programma computerizzato, come le tabelle, permettono di definire,oltre al valore di MPN,
2 parametri che danno la misura della qualit della prova
RARITY INDEXCATEGORIA
26
RARITY INDEXCATEGORIA
CATEGORIA RARITY INDEX PROBABILITA%
1 Da 0,05 a 1,00 95
2 Da 0,01 a < 0,05 5
3 Da 0,00 a < 0,01 1
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 51
Scelta della combinazione di tubi?
In ISO 7218:2007
Criteri di scelta della combinazione di provette positive (categorie di probabilit, tre diluizioni e numero di tubi positivi)
In ISO 7218:2007 / Amd1:2013
Non corretto scientificamente scegliere la combinazione di tubi. Usare anche pi di 3 diluizioni con MPN calculator
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 52
27
A.Maiello, D.Spolaor - ISO 7218:2007 e ISO 7218:2007/Amd.1:2013 53
Grazie per lattenzione
Dino [email protected]