Istologia 02 Colorazioni istologiche 1
Istologia 02 Colorazioni istologiche Preparazione di un campione La preparazione di un campione (preparato istologico) da osservare al microscopio comprende 3 fasi:
1. Fissazione
2. Disidratazione e diafanizzazione
3. Inclusione e/o sezionamento
4. Colorazione
Colorazione1 Esistono diverse tecniche di colorazione dei tessuti. Le principali sono le seguenti:
Istologica. Questo tipo di colorazione mette in evidenza lei caratteristiche morfologiche dei
tessuti e delle cellule. A sua volta, comprende tecniche bicromiche (quando si usano due coloranti),
tricromiche (se si usano 3 coloranti) e tecniche elettive (quando si privilegia la colorazione di un
determinato tessuto es. connettivo, nervoso, muscolare - a scapito di altri). Le pi diffuse
colorazioni istologiche sono lEmatossillina-Eosina (bicromica), colorazione di Azan-Mallory
(tricromica) e alcune colorazioni istologiche selettive, quali la Gomori, la Sudan III, la Nissl, la Golgi-
Cajal, la May-Grunwald-Giemsa.
Istochimica. Mette in evidenza le caratteristiche chimiche dei tessuti e delle cellule che li
compongono. Ci avviene sviluppando una reazione chimica vera e propria che dar un precipitato
che si vede al microscopio. Esempio classico la reazione di PAS e lAlcian blu.
Immunoistochimica. Si tratta di una tecnica di colorazione altamente specifica che colora
determinati antigeni presenti nel tessuto. Questa tecnica prevede luso di particolari anticorpi legati
a cromogeni insolubili che permettono la visione delle strutture che interessano mediante
microscopia ottica (si tratta di metalli pesanti, enzimi o fluorocromi).
Alcuni esempi di colorazione istologica.
Colorazione ematossilina-eosina (EE) la tecnica pi comunemente
usata. Lematossilina un colorante basico che si lega a molecole acide
(quindi basofile) conferendo ad esse un colore blu violaceo. Leosina
invece una molecola acida che colora le strutture basiche (acidofile) in
rosso- rosa-arancio. In generale, nei tessuti colorati con HE, le cellule
hanno i nuclei di colore blu-violaceo e il citoplasma di colore rosa-
arancio.
Colorazione Azan-Mallory: una colorazione tricromica utilizzata per
evidenziare le fibre del collagene. Lazocarminio, colora in rosso intenso
le strutture acide (nucleo e, in minor misura, il citoplasma), mentre le
strutture basiche (fibre collagene e muco) vengono colorate dal blu di
anilina o dal violetto arancio dellorange G.
Colorazione di Gomori: una colorazione elettiva per le fibre reticolari,
che appaiono in nero intenso su un fondo grigio-giallo. Si basa
1 La colorazione serve a rendere visibili le cellule, dato che esse sono per natura trasparenti. La maggior parte dei coloranti impiegata per la microscopia ottica, mentre per quella elettronica non si usano coloranti, ma si uniscono i campioni ad alcune sostanze metalliche, che si prestano bene ad essere attraversate dagli elettroni (TEM) o a riflettere il fascio di elettroni, mettendo in evidenza le superfici cellulari (SEM).
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sullaffinit dellargento per le proteine costituenti queste fibre.
Colorazione Sudan III e Sudan Black: serve
per evidenziare le goccioline lipidiche
contenute nelle cellule adipose. Le sezioni
si ottengono da pezzi congelati e tagliati al
criostato (in modo da evitare i successivi
passaggi nei solventi organici) che scioglierebbero le goccioline lipidiche. Il Sudan III colora le
goccioline lipidiche in giallo-arancio mentre il Sudan Black le colora in nero.
Colorazione di Nissl: una colorazione per il sistema nervoso centrale
e si usa su sezioni in paraffina di 10 m di spessore. La peculiarit
quella di mettere in evidenza la zona tigroide del Nissl (accumulo di
ribosomi nel pirenoforo, il corpo cellulare delle cellule nervose),
colorandola con il blu-azzurro tipico del blu di toluidina.
Colorazione di Golgi-Cajal: anchessa una colorazione specifica per il sistema nervoso centrale.
Piccoli pezzi molto freschi di sistema nervoso centrale vengono
immersi per 1-6 giorni in soluzione osmio-bicromica a 25C.
Successivamente, il pezzo viene colorato con nitrato dargento all1%
in acqua. La reazione pu durare fino a 3 giorni. A colorazione
avvenuta si includono i pezzi in paraffina e si tagliano sezioni molto
spesse, intorno a 40-50 m, per avere una visione il pi completa
possibile del tessuto e dei vari costituenti cellulari. Questa una colorazione di difficile riuscita che,
molte volte, presenta problematiche praticamente irrisolvibili. In ogni caso, si ha una buona
colorazione quando le cellule nervose spiccano in nero intenso su un fondo color tabacco. Proprio
perch di difficile e incostante riuscita sono state proposte, da vari autori, diverse varianti (Golgi-
Bubenaite, Golgi-Cox, ecc.) sempre difficoltose da realizzare.
May-Grunwald-Giemsa: una colorazione elettiva per il sangue. Viene
utilizzata per colorare gli strisci di sangue. Il sangue viene strisciato su
un vetrino portaoggetto, fissato per 30 min. allaria e colorato prima
con la miscela di May-Grnwald (blu di metilene e eosina), quindi,
lavato e colorato col Giemsa (composto da eosina, blu di metilene,
azzurro A e B e violetto di metilene). I globuli rossi appaiono rosa-
arancio, i nuclei dei leucociti blu.
Alcuni esempi di colorazione istochimica.
Reazione PAS: Questa una reazione specifica per le mucine neutre (presenti negli epiteli
secernenti, nelle ghiandole endocrine e nel sistema nervoso). Viene
impiegato un ossidante (lacido periodico), che attacca
selettivamente il gruppo funzionale amminico primario o quello
OH delle mucine, provocando la liberazione di un gruppo aldeidico
rivelato, poi, dal reattivo di Shiff (rosso porpora). Si esegue
normalmente in associazione allAlcian blu (che colora le mucine
acide).
Alcian blu: una colorazione utilizzata per evidenziare sia le mucine acide che i glicosaminoglicani
(GAG) contenenti gruppi carbossilici. Di solito si esegue in contemporanea alla PAS reazione, per
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avere un quadro completo delle mucine presenti nel preparato, sia
acide (Alcian, precipitato blu intenso), sia neutre (PAS, rosso).
Alcuni esempi di colorazione immuno-istochimica.
Limmunoistochimica un metodo complesso specifico per la rilevazione di particolari antigeni2
presenti nel tessuto o nelle cellule da
esaminare. Su una sezione di tessuto o su
cellule opportunamente preparate, si
pone lanticorpo specifico che legato a
sostanze evidenziabili alla microscopia
(fluorocromi, metalli pesanti, enzimi).
Sezioni istologiche Quando si osserva un vetrino, si deve saper immaginare la struttura 3D corrispondente allimmagine piatta che vediamo. Se loggetto che si osserva una sfera, ci apparir come un cerchio di dimensione diversa a seconda della zona dove avviene il taglio. Se loggetto una struttura tubulare, possiamo avere tre diversi tipi di sezioni:
Longitudinale: la struttura viene tagliata secondo la sua dimensione maggiore (di lungo);
Trasversale: il taglio avviene lungo la dimensione minore delloggetto (perpendicolare al taglio longitudinale)
Obliqua: il taglio avviene lungo un asse a met tra il trasversale e il longitudinale.
2 Un antigene una sorta di targa che identifica le cellule di un organismo. Un organismo ha cellule diverse tra loro, ma con gli stessi antigeni. Gli antigeni vengono riconosciuti da particolari glicoproteine, gli anticorpi (o immunoglobuline Ig). Essi sono prodotto da un particolare tipo di cellule, i linfociti B. Nei metodi immunoistochimici, il legame antigene-anticorpo causa una fluorescenza, che pu essere rilevata con particolari macchinari.
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Nel taglio longitudinale, un tubo pu apparire o come due pareti distanziate da uno spazio vuoto (se il taglio avviene lungo la cavit del tubo) o come una singola parete (se il taglio non prende la cavit). Nel taglio trasversale il tubo appare come un cerchio il cui interno vuoto. Nel taglio obliquo si ha una forma simile al taglio trasversale, ma pi ovale. Nel caso in cui si osservi un tessuto con cellule strettamente unite tra di loro (come un tessuto epiteliale di rivestimento), le sezioni longitudinale e trasversale daranno lo stesso risultato allosservazione: si vedr uno o pi strati di cellule quadrate o rettangolari ed i nuclei risulteranno sempre allineati per file. Se invece si fa una sezione obliqua, si osserveranno parti di cellule dei vari strati e lo stesso accadr con i loro nuclei. Appariranno pi file di cellule e solo alcune saranno complete, mentre la maggior parte risulter frammentaria. Preparazione microscopia elettronica
Chimica Fissazione Disidratazione Impregnazione: con resina epossidica Taglio: ultramicrotomo (50 nm) Coloranti: sali e idrossidi di metalli pesanti Montaggio: microreti metalliche
Fisica Frozen-fracture (impronta): scansione