Ver 0.9iVEC : in Vivo E. coli Cloning

使用法と解説

　最近、相同な配列間の組換え反応を使いPCR断片をベクターへクローニングする方法が活用されています。いわゆるシームレスクローニングです。２０bpほどの相同な配列を付加したPCRプライマーを合成し、挿入DNA断片とベクターをまずはPCR増幅させます。その後、精製した組換え酵素のin vitro反応でPCR断片をベクターへクローニングするというものです。この組換え反応に関連する試薬は、現在ではさまざまな

メーカーから商品化されています。Gibson Assembly Master Mix、In-Fusion® HD Cloning Kit, GeneArt® Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mixなどです。

　でも、とある大腸菌の変異体を使えば、PCR増幅した挿入DNA断片とベクターDNAを同時にトランスフォームするだけでクローニングができるのです。

　今回、このin vivo E. coli Cloningが可能な大腸菌の変異体をNBRP大腸菌リソースから紹介します。

概要 　NBRP大腸菌リソースに寄託されているAQ3625はsbcA23変異により、Racプロファージ領域のRecE、RecTレコンビナーゼが過剰発現している。このRecE、RecTレコンビナーゼにより大腸菌細胞内で相同組換えの効率が高まりシームレスクローニングを行うことができる。DNAはPCRの反応液をそのままをAQ3625株のコンピテントセルに直接加えるだけで良く、精製などする必要はない。特別な試薬も使うこともなく、非常に簡単なクローニング方法である。決して新しい方法ではなく実は1993年にはすでに報告されている(Oliner et al., Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 22 5192-5197, 1993) .

AQ3625 遺伝子型: thr-1 leuB6 thi-1 lacY1 galK2 ara-4 xyl-5 mtl-1 proA2 his-60 argE3 rpsL31 tsx-33 supE44 recB21 recC22 sbcA23

AQ3625 大腸菌株の入手先:　

ナショナルバイオリソースプロジェクト(NBRP) 大腸菌のホームページ https://shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/から、”　AQ3625 ”　を検索してME NO. ME9276の本大腸菌株を購入してください。

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Ver 0.9１、ベクター及びインサートの準備

●　ベクターとインサートは両端に20-30bp程度の相同的な"のりしろ"部分が必要となる。

●　ベクターは直線化したものを使用する。RCR増幅したものを使用する。また制限酵素で切断し、直線化したものも使用可能である。その際には切断末端の形状は特に問題にならない。

●　インサートは両端は平滑末端であるほうが組換えの効率が良いので、3’->5’ Exonuclease活性を持つPCR用のDNAポリメラーゼを使用する。一般に高正確性のDNAポリメラーゼを3’->5’ Exonuclease活性を校正機能として持っている。

●　ベクターをRCR増幅する場合、テンプレートとするベクターはPCR溶液中で1pg/µl（50µl反応系だと50pg）以下になるようにしておく。こうすると、テンプレートに由来するハズレのコロニーが減る。また、DpnI処理によるテンプレートの切断をしなくても、無くてもほとんどバックグラウンドのコロニーは出てこなくなる。

２、トランスフォーメーション用のコンピテントセルの調整

●　トランスフォーメーション用のコンピテントセルはCaCl2法で調整したものでも使用可能であるが、推奨するModified TSS法で調整したコンピテントセルの方が、この変異株でのトランスフォーメーション効率が断然良い。

　オリジナルのTSS法のリファレンスはこちら: Chung et al., PNAS, Vol. 86, 2172-2175 (1989) ●　Modified TSS法のコンピテントセル作製方法及び形質転換の方法は下記の通りである。オリジナルのTSS法では、 PEG3500から使用可となっている。

準備するもの

・LB培地 ・2xTSS溶液 (10mlで200本程度のコンピテントセルが作製できる） PEG8000 　　　　　　　　　　　　2 g (最終濃度20 % (w/v)) 80 % グリセロール 　　　　　　　　 2.5 ml (最終濃度20%) 1M MgSO4 (MgCl2でも代用可） 1 ml (最終濃度100 mM ) LB培地 to 10 ml

オートクレーブ 120 ºC 15分後、4ºCで長期保存可能。使用前によく混ぜる。 ・DMSO

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Ver 0.9

コンピテントセル作製

1日目

・AQ3625のLB寒天プレートのコロニーを3mlのLB培地に植菌して、37ºCで一晩　(16時間程度)培養する。

2日目 ・1mlの一晩培養液を60mlの37 ºCに暖めておいたLB培地に植菌して、37ºCで90分培養する。これで通常は、OD600 = 0.4-0.5　程度になる。 ・培養を止め氷中で冷やす。以降の操作はすべて冷やした状態で行う。 ・5000g、4ºCで5分間遠心後、上清を捨てる。 ・大腸菌のペレットを2mlの氷冷したLB培地に懸濁する。 ・1.6mlの氷冷した2xTSS溶液を加えて混ぜる。 ・0.4mlのDMSO (この時のDMSOは凝固するため室温でOK)を加えて混ぜる。 ・0.1mlずつ氷上で分注する。（この状態でもコンピテントセルとして使用できるが、-80ºC凍結させて使用するほうが形質転換効率が１００倍ほど向上する。） ・使用しない分は液体窒素で凍結後-80ºCで保存する。

３、シームレスクローニングの方法

挿入DNA断片とベクターDNAを、AQ3625株に形質転換するだけです。出現してきた形質転換体の９割以上で挿入DNA断片はクローン化されています。

●　シームレスクローニングの形質転換方法

・調整したコンピテントセルを氷上に置く。または凍結しておいたコンピテントセルの場合は、氷上でまず溶かす。 ・ベクターとインサートのPCR産物を1µlずつコンピテントセルに加え、優しくピペッティングして混ぜる。DNA量はそれぞれ50-100ngあれば十分である。

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Ver 0.9 ・氷上で30分静置する。 ・LB培地を1ml加えて37ºCで45分培養する。 ・遠心して培地の大半を捨て、100µ程度残す。 ・残った培地に沈殿してきた菌体を再度懸濁して、プレートに塗り広げる。

・37ºCで一晩培養すれば、コロニーが出現する。

備考

●　のりしろは12bpまで短くすることが可能であるが、効率は悪くなる。 ●　のりしろを20bpよりも長くすると効率は良くなるが、プライマーが高くなる。 ●　RecE, RecTの過剰発現によりプラスミド同士のダイマー、マルチマーを形成する。BL21等のrecA+の菌株でもダイマー形成は起こるので発現やクローニングに使用する分には特に問題ない。

●　相同配列の部分で塩基置換が生じることがある（市販の酵素キットでも起こる）。そのため、必要なら配列を確認する。塩基置換は必ず起こるわけではなく、何らかの配列依存性がありそうである。現在、その検証進めている。 ●　2つのDNA断片を同時に入れることも可能。 ●　3つのDNA断片を同時に入れることも可能であるが効率は悪い。相同配列を30bpまで増やすとクローン化したコロニーの出現の効率は高まる。 ●　導入するDNAの5’末端をリン酸化すると形質転換したコロニーが２倍程度多くなる。コロニーが出ない場合は試してみても良いかもしれない。 ●　プライマーをリン酸化しておくとPCR産物を直接トランスフォーメーションに使用できるので簡単。

プライマーのリン酸化　（PCRマシンを使うと熱失活まで簡単にできる。） 反応液

H2O 34µl 10xPNK buffer 5µl 10 mM ATP 5µl 50 µM primer 5 µl (250 pmol)

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Ver 0.9PNK 1 µl (10U)

PCRでの反応条件 37 ºC x 30 min 65 ºC x 20 min この状態で通常のプライマーと同じように使用することができる。

●　本菌株の他の研究室への二次分譲はできない。また、RecE、RecTレコンビナーゼに関する細胞内でのクローニング法は特許になっている。そのため学術研究以外での利用には注意すること。

iVECに関する問い合わせなどは NBRP 大腸菌 まで

国立遺伝学研究所　NBRP 大腸菌 ４１１-８５４０　三島市谷田1111番地

ホームページ　　https://shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/ メールアドレス　genkaku@nig.ac.jp

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iVEC 法の相同領域の長さとクローン化の効率

1PCR 用の合成 DNA プライマー

通常は、PCR 用の合成 DNA プライマーはベクター側と 20〜30bp 程度の相同的な

配列、いわゆる“のりしろ”を持つように設計する。

図 1に pUC19 ベクターへの pACYC184 由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を

クローニングする時に使用したプライマーの例を示す。

図 1:プライマーデザインの例

このクローニングで、のりしろの長さを 12bp から 30bp まで変えて、形質転

換効率がどのように影響するかを調べた。ベクターは 2.6kb、インサート DNA は

1kb でこのインサート DNA の両端に付加するベクターとの相同配列長を変えた。

インサート DNAとベクターの PCR 産物のアガロースゲル電気泳動の結果を図３

に示す。ベクター及びインサート DNA の 1µl あたりの量はそれぞれ 80ng(0.05

pmol)及び 100ng(0.15pmol)であった。iVEC 形質転換には未精製 DNA のま

ま、この PCR 反応液 1µl をじかに使用した。

図 2:形質転換に使用した DNA

2相同領域長とクローン化の効率

上記の未精製 PCR 産物を 1µl ずつ用いて、AQ3625 の形質転換を TSS 法により

行った結果を図 3に示す。のりしろの長さが 12bp であっても形質転換体が得

られた。また、のりしろを 20bp、30bp と長くするにしたがって、得られる形

質転換体の数が 10 倍、100 倍程度と増加した。形質転換体のうちインサートを

含むプラスミドの割合は、のりしろの長さにはあまり影響されず、多くの場合

で 90%以上の高い割合で目的クローンが得られた。

図 3:のりしろの長さと組換え効率

３形質転換効率

AQ3625 株は通常のカルシウム法による形質転換方法での形質転換効率は低い。

カルシウム法に替えて TSS 法を推奨する。TSS 法では 20bp の相同配列長でも数

個 20 個程度のコロニーが得られる。さらに、この効率を上げるため改良した結

果、グリセロールを加え、一度凍結したコンピテントセルを使うことで形質転

換効率を著しく向上させることができた。この modifiedTSS 法とオリジナルの

TSS 法を比較した結果を図 4に示す。

modifiedTSS 法では、のりしろが 20bp の

条件で、形質転換体の出現数が 5倍程度増加

した。いずれも 95%程度の高頻度で形質転

換体の中から目的クローンが得られた。

図4:グリセロール添加したmodified TSS法の効率

４マルチインサート DNA のクローン化

2 断片及び 3断片の PCR 産物の同時クローニングについて、のりしろ部分の長

さを 20bp,25bp,30bp に変えて調べた結果を図 5に示す。

形質転換はmodifiedTSS法で、1µlずつの未精製のPCR産物を用いて行った。

いずれの場合も、のりしろ部分が長くなるほど形質転換体の数が増加した。2断

片のクローニングでは、90%程度の高頻度で形質転換体の中から目的クローン

が得られた。3断片のクローニングでも、プレート当たり数個から 10 個程度と

少ないながらも形質転換体が得られた。また、30bp の“のりしろ”部分を持た

せた場合では、70%の割合で目的クローンを得ることができた。

図 5:複数断片のクローニング

５プラスミド DNA のマルチマー化

AQ3625 で調整したプラスミドではラダー状のバンドがあらわれる（図 6）。これ

は大腸菌内でプラスミド同士が組換えを起こし生じたマルチマーDNA によるも

のである。従って、このプラスミド内に１箇所の認識部位を持つ BamHI で処理

すると、全て同じ長さの一本鎖 DNA になる。

タンパク質発現に良く使われる BL21(DE3)のような recA+株でもダイマー、マル

チマーは生じている（図 6）。BL21(DE3)では特に問題なく発現やクローニングに

使用できることから、プラスミドのマルチマー化は発現などには支障はない。

モノマーの分子に揃えたい時には、大腸菌に再度、形質転換してマルチマーが

ないことを確認する。

図 6:DH5α、BL21(DE3)、AQ3625 で調整した pUC19

５組換えに伴う PCR プライマー内での点突然変異

AQ3625 株でのクローニング産物をシークエンスした結果を図 7に示す。pUC19

へのクロラムフェニコール耐性遺伝子のクローニングでは、８クローン調べて、

変異が入ったものは一つもなかった。pET28a への spo0J 遺伝子（枯草菌の染色

体分配に関わる遺伝子）のクローニングではインサートが入ったものを 5クロ

ーン調べて全てのクローンでのりしろ付近の N末側に変異が入っていた。

図 7:のりしろ付近での変異

C 末側の相同配列や内部の spo0J の配列にも変異は見られなかったことから、N

末のプライマー内の配列依存的に変異が入ったと考えられる。また、Gibson に

よる精製組換え酵素の反応によっても 8クローン中の 7クローンで同様の変異

が生じていた。これらのことからこれは組換え反応中に変異が生じたものと思

われる。

変異が生じたプライマーでは、パリンドローム構造がありその部位に変異が集

中していた。おそらくそれが原因と推定される。相同配列とそれに隣接するプ

ライマーの配列の中にパリンドローム構造を入れないようにした方が無難であ

る。