UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGANICA E INORGANICA
Estudo químico da raiz de Jatropha mollissima (pohl) Baill; identificação de compostos fenólicos em quatro espécies do
gênero Anthurium através de Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas
Jeison Barros Rios
Fortaleza – CE 2011
Estudo químico da raiz de Jatropha mollissima (pohl) Baill; identificação de compostos fenólicos em quatro espécies do gênero
Anthurium através de Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas.
Jeison Barros Rios
Dissertação submetida à coordenação do Curso de Pós-Graduação em Química, como requisito para obtenção do grau de mestre.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Teresa Salles Trevisan
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
Fortaleza, 2011
R453e Rios, Jeison Barros Estudo químico da raiz de Jatropha mollissima (pohl) baill; identificação de compostos fenólicos em quatro espécies do gênero Anthurium através de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas / Jeison Barros Rios. – 2011.
79 f. : il. color., enc.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Teresa Salles Trevisan Área de concentração: Química Orgânica Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências. Depto. de Química Orgânica e Inorgânica, Fortaleza, 2011.
1. Plantas - Análise 2. Jatropha - Química 3.Química vegetal I. Mazzetto, Selma Elaine (Orient.) II. Universidade Federal do Ceará – Programa de Pós-Graduação em Química III. Título
CDD 547
AGRADECIMENTOS
À Deus, por ter me dado a vida, saúde e força para alcançar mais esse objetivo. Aos meus Pais Geraldo e Adazila e meus irmãos Paulo e Joab pelo amor e incentivo a continuar sempre estudando. Ao meu amor Edilane, pela companhia, carinho e atenção nos momentos bons e difíceis da vida e no desenvolvimento desse trabalho. À profesora Maria Teresa Salles Trevisan, pelos ensinamentos, apoio e confiança para a realização desta dissertação. Aos meus amigos de Laboratório Leandro, Ricardo, Ricardo Farias, Francisco Thiago, Thiago, Jack, Edângelo, Mikaelly, Natália, Katarina e Isabel por tornar o ambiente de trabalho mais alegre e produtivo. À todos os amigos de curso pelo carinho e apoio. À Universidade Federal do Ceará, pelo espaço e apoio na minha formação. À CAPES, pelo apoio financeiro durante a realização desse trabalho.
SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS iii LISTA DE TABELAS v LISTA DE FLUXOGRAMAS vi LISTA DE ESQUEMAS vii LISTA DE ABREVIATURAS viii RESUMO ix ABSTRACT x CAPÍTULO 1 1. INTRODUÇÃO 1 CAPÍTULO 2 – CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS 2.1 O gênero Jatropha 3 2.2 Jatropha mollissima (Pohl) Baill 3 2.3 O gênero Anthurium 5 CAPITULO 3- LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO 3.1 Levantamento Bibliográfico de Diterpenos do Gênero Jatropha 6 CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Determinação Estrutural de EHJM-DA1 17 4.2 Determinação Estrutural EHJM-DB(2-3)2 21 4.3 Determinação Estrutural de EHJM-DC3 26 4.5 Inibição da enzima acetilcolinesterase 32 CAPÍTULO 5 – PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 5.1 Material Vegetal 33 5.2 Métodos Cromatográficos 33 5.3 Métodos Físicos 34 5.3.1 Espectroscopia na Região do Infravermelho (IV) 34 5.3.2 Ponto de Fusão 34 5.3.3 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) 34 5.4 Estudo dos constituintes químicos de Jatropha mollissima (Pohl) Baill 35 5.4.1 Preparação dos extratos de J. mollissima 35 5.4.2 Fracionamento cromatográfico de EHJM 36 5.4.3 Fracionamento cromatográfico de EHJM-D e isolamento de EHJM-DA1
36
5.4.4 Fracionamento cromatográfico de EHJM-DB e isolamento de EHJM-DB (2-3)2
37
5.4.5 Fracionamento cromatográfico de EHJM-DC e isolamento de EHJM-DC3
38
i
5.5 Ensaio para inibição da enzima acetilcolinesterase dos extratos 40 CAPÍTULO 6 – CLAE-EM 6.1 Introdução 42 6.2 Espectrômetro de massas 42 6.3 Ionização por electrospray (IES) 42 6.4 Análise por CLAE-IES-EM dos extratos metanólicos de quatro espécies do gênero Anthurium
43
6.4.1 Preparação dos extratos 43 6.4.2 Materiais Químicos 43 6.4.3 Preparo das amostras 44 6.4.4 Condições de injeção CLAE-DAD-IES-EM 44 6.4.5 Compostos fenólicos identificados por CLAE-EM 45 6.4.6 Propostas de fragmentos de massas observados nos espectros dos compostos 1-6.
51
CAPÍTULO 7 - CONCLUSÃO 7. Conclusão 57 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 58
ii
LISTA DE FIGURAS Figura 1: Fotografias da Espécie Jatropha mollissima 4
Figura 2: Diterpenóides isolados de espécies do gênero Jatropha. 11
Figura 3: Espectro na região do infravermelho de EHJM-DA1 (KBr). 17
Figura 4: Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DA1 18
Figura 5: Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DA1 19
Figura 6: Espectro de RMN 2D 1H,13C-HSQC de EHJM-DA1. 19
Figura 7: Espectro na região do infravermelho de EHJM-DB(2-3)2 (KBr) 21
Figura 8: Espectro de RMN 1H (300 MHz, C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2 22
Figura 9: Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz,C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2. 23
Figura 10: Espectro de RMN 13C-DEPT 135º (125 MHz,C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2
23
Figura 11: Espectro na região do infravermelho de EHJM-DC3 (KBr) 26
Figura 12: Espectro de RMN 13C-BB (125MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DC3. 27
Figura 13: Espectro de RMN 2D 1H,13C-HSQC de EHJM-DC3 28
Figura 14: Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DC3 29
Figura 15: Mecanismo para a reação enzimática do teste de Ellman 40
Figura 16: Etapas da metodologia modificada por Rhee 41
Figura 17: Estrutura do padrão Eserina.
41
Figura 18: Cromatogramas CLAE dos extratos metanólicos de (a) A. lindmanianum, (b) A. andraeanum, (c) A. bonplandii, (d) A. plowmanii
45
Figura 19: Espectro UV/Vis do composto 1 46
Figura 20: Espectro UV/Vis do composto 2 46
Figura 21: Espectro UV/Vis do composto 3
46
Figura 22: Espectro UV/Vis do composto 4 47
Figura 23: Espectro UV/Vis do composto 6 47
iii
Figura 24: Compostos fenólicos identificados por CLAE-EM nos extratos metanólicos de quatro espécies de Anthurium
48
Figura 25: Compostos identificados no extrato metanólico de A. bonplandii. 50
Figura 26: Espectro de massas IES (modo positivo) do composto 1. 51
Figura 27: Espectro de massas IES (modo positivo) do composto 2.
52
Figura 28: Espectro de massas IES (modo positivo) do composto 3.
53
Figura 29: Espectro de massas IES (modo negativo) do composto 4.
54
Figura 30: Espectro de massas IES (modo positivo) do composto 5.
55
Figura 31: Espectro de massas IES (modo positivo) do composto 6.
56
iv
LISTA DE TABELAS Tabela 1: Diterpenos de Jatropha e suas atividades biológicas 6
Tabela 2: Deslocamentos químicos de RMN 13C (C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2 em comparação com dados da literatura.
25
Tabela 3: Padrão de hidrogênio de EHJM-DC3 determinado através de análise dos espectros de RMN 1H,13C-HSQC.
28
Tabela 4: Deslocamentos químicos de RMN 13C e 1H (CDCl3) de EHJM-DC3 em comparação com dados da literatura.
31
Tabela 5: Avaliação da atividade anticolinesterásica dos extratos de J. mollissima e de quatro espécies do gênero Anthurium.
32
Tabela 6: Dados referentes ao fracionamento preliminar do extrato hexânico bruto das raízes de J. mollissima.
36
Tabela 7: Descrição do gradiente de eluição do tratamento cromatográfico da fração EHJM-D.
37
Tabela 8: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração EHJM-DB.
37
Tabela 9: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração EHJM-DC.
38
Tabela 10: Dados LC-DAD-IES-EM em modo positivo e negativo dos compostos fenólicos identificados parcialmente.
49
Tabela 11: Dados LC-IES-EM em modo positivo e negativo dos compostos fenólicos identificados obtidos da literatura.
49
v
LISTA DE FLUXOGRAMAS Fluxograma 1 – Esquema da obtenção dos extratos hexânico e etanólico das raízes de J. mollissima
35
Fluxograma 2 – Rota esquemática do isolamento dos constituintes químicos EHJM-DA, EHJM-DB(2-3)2 e EHJM-DC3 a partir do extrato hexânico das raízes de J. mollissima.
39
vi
LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1: Propostas de fragmentos de massas para o composto 1
51
Esquema 2: Propostas de fragmentos de massas para o composto 2
52
Esquema 3: Propostas de fragmentos de massas para o composto 3
53
Esquema 4: Propostas de fragmentos de massas para o composto 4
54
Esquema 5: Propostas de fragmentos de massas para o composto 5
55
Esquema 6: Propostas de fragmentos de massas para o composto 6
56
vii
LISTA DE ABREVIATURAS AChE Enzima acetilcolinesterase AcOEt Acetato de etila C5D5N Piridina deterada CC Cromatografia em coluna CCD Cromatografia em camada delgada CD3OD Metanol deuterado CDCl3 Clorofórmio deuterado CH2Cl2 Dicloro metano CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLAE-EM Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – Espectrometria de Massas D Dupleto Dd Duplo dupleto DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer HPLC High Performance Liquid Chromatography HSQC Heteronuclear Single Quantum coherence Hz Hertz IES-EM Ionização por Electronspray – Espectrometria de Massas IV Infravermelho J Constante de Acoplamento KBr Brometo de potássio M Multipleto m/z Razão massa/carga MeOH Metanol MHz Mega Hertz Ppm Partes por milhão RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono -13 RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1 S Singleto Sl Singleto largo T Tripleto UV-VIS Ultravioleta – visível Deslocamento químico máx Absorção máxima
viii
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivo o estudo químico da raiz de Jatropha
mollissima (Euphorbiaceae), planta nativa do nordeste brasileiro. Nesse estudo
utilizaram-se técnicas cromatográficas na tentativa de isolamento dos constituintes
químicos dos extratos hexânico e etanólico da raiz. O tratamento cromatográfico do
extrato hexânico possibilitou o isolamento de um álcool de cadeia alifática longa
denominado triacontanol, uma mistura dos esteroides -sitosterol e estigmasterol e um
terpeno de esqueleto latirano denominado jatrogrossidiona. Ainda nesse trabalho,
investigou-se a composição de compostos fenólicos presentes nos extratos metanólicos
das folhas de quatro espécies do gênero Anthurium através de CLAE-EM onde foi
possível a identificação de oito compostos fenólicos: 6-C-arabinosil-8-C-glicosil-
apigenina nas folhas de A. lindmanianum; 8-O-ramnosil-(1-3)-C-glicosil-acacetina e 7-
O-[6-O-acetilglicosil(1-2)]ramnosil-(1-6)-glicosil-acacetina nas folhas de A.
andraeanum; ácido 5-cafeoilquínico, vitexina, isovitexina e orientina nas folhas de A.
bonplandii e 6-O-ramnosil-(1-3)-C-glicosil-acacetina nas folhas de A. plowmanii. Os
resultados para o teste de inibição da enzima acetilcolinesterase mostraram que apenas
os extratos hexanico de J. mollissima e metanólico das folhas de A. andraeanum
apresentaram atividade anticolinesterásica.
ix
ABSTRACT This work aimed to study the chemical from the root of Jatropha mollissima
(Euphorbiaceae), a plant native to northeastern Brazil. In this study we used
chromatographic techniques in an attempt to isolate the chemical constituents of hexane
and ethanol extracts of the root. Chromatographic treatment of extract allowed the
isolation of a long aliphatic chain alcohol called triacontanol, a mixture of the steroids
-sitosterol and stigmasterol and a terpene latirano skeleton called jatrogrossidiona.
Also in this work, we investigated the composition of phenolic compounds present in
methanol extracts of leaves of four species of the genus Anthurium using HPLC - MS in
which it was possible to identify eight phenolic compounds: 6- C- arabinosyl -8- C-
glycosyl - apigenin in the leaves of A. lindmanianum; 8-O-ramnosyl-( 1-3)-C-glycosyl -
acacetin and 7-O-[6-O-acetylglicosyl(1-2)]ramnosyl-( 1-6 )-glycosyl - acacetin in the
leaves of A. andraeanum, 5- caffeoylquinic acid, vitexin, isovitexin and Orientin in the
leaves of A. bonplandii and 6- O-ramnosyl-( 1-3)-C-glycosyl-acacetin in the leaves of
A. plowmanii. The results for the inhibition of acetylcholinesterase enzyme showed that
only the hexane extract of J. mollissima and methanol extract from the leaves of A.
andraeanum showed anticholinesterase activity.
x
1. INTRODUÇÃO
A utilização de plantas medicinais pelo homem, como fonte de medicamento é
secular. Registros mostram que antigas civilizações, em especial, a Chinesa, Egípcia e
Romana, lançavam mão das ervas para os mais diversos fins, incluindo para o
tratamento ou prevenção de doenças. Estas práticas têm sido transmitidas de geração em
geração, ao longo dos séculos, perpetuando assim o conhecimento.
Este conhecimento de plantas medicinais é importante para o desenvolvimento
de produtos à base de plantas que podem contribuir grandemente para a prevenção e a
erradicação de muitas doenças (DA SILVEIRA et al., 2003). Portanto, as plantas podem
ser consideradas a base para a descoberta de novos fármacos. De fato, a cada dia as
plantas vêm sendo reconhecidas pela sua capacidade de produzir metabólitos
secundários, muitas vezes, com alto potencial biológico e/ou farmacológico
(FARNSWORTH et al., 1985).
Nas ultimas décadas, os produtos naturais têm desempenhado um importante
papel na descoberta de novos fármacos, quer seja na sua forma original ou modificado
estruturalmente (ROCHA et al., 2006). Uma análise da origem de drogas desenvolvidas
no período entre 1981 a 2002 mostrou que os produtos naturais, ou drogas derivadas
destes, compreendem cerca de 28% de todas as entidades químicas lançadas no mercado
de medicamentos (CHIN et al., 2006).
As plantas medicinais permaneceram como forma alternativa de tratamento em
várias partes do mundo. De acordo com a WHO (World Health Organization), devido à
pobreza e pouco acesso à medicina moderna, cerca de 65 a 80% da população mundial
dependem essencialmente das plantas como forma primária de cuidar da saúde
(CALIXTO et al., 2005). É nesse contexto social que as plantas medicinais e os
fitoterápicos adquirem importância como agentes terapêuticos.
Plantas de Jatropha, especialmente de J. curcas, têm sido cultivadas na África
para aproveitamento do óleo das sementes em velas para iluminação, sabonetes e
também na medicina popular (WATT & BREYER-BRANDWIJK, 1962).
1
Do ponto de vista químico, Jatropha caracteriza-se pela presença de substâncias
pertencentes a vários grupos químicos, tais como flavonoides, ligninas e cianógenos
(WEBSTER, 1994), além de ésteres de forbol e seus derivados, com atividades
biológicas comprovadas (ADOLF et al., 1984; HIROTA et al., 1988).
No Nordeste do Brasil, as espécies de Jatropha, especialmente J. molissima
(Pohl) Baill. são reconhecidas por suas propriedades medicinais (AGRA et al., 1996).
Espécies do gênero jatropha (Euphorbiacae) são uma rica fonte de diterpenoides
macrocíclicos. Alguns desses constituintes possuem atividades biológicas incluindo
propriedades antibactericida e anticâncer (DAS et al., 2009). Este trabalho teve como
objetivo o estudo químico da raiz de Jatropha mollissima (Pohl) Baill, identificação de
compostos fenólicos por CLAE-EM presentes nas folhas de quatro espécies do gênero
Anthurium e avaliação da inibição da enzima acetilcolinesterase dos extratos.
2
2. CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS 2.1 - O Gênero Jatropha
Jatropha (Euphorbiaceae) é um gênero de cerca de 175 plantas suculentas,
arbustos e árvores (algumas são caducifólias, como Jatropha curcas L.).
Espécies do gênero Jatropha são conhecidas por serem muito tóxicas e pela
atividade purgativa do óleo de suas sementes. Jatropha é um grupo de grande
importância econômica, principalmente pela presença de várias espécies referidas por
seus usos medicinais e/ou ornamentais, também empregadas como cercas-vivas, em
várias partes do mundo, especialmente na África, como J. gossypiifolia L., J. curcas L.
e J. multifida L., por exemplo (WATT & BREYER-BRANDWIJK, 1962).
2.2 - Jatropha mollissima (Pohl) Baill
Jatropha mollissima é encontrada como arbusto e é conhecida popularmente
como Pinhão-bravo e Pinhão-de-purga (LEAL & AGRA, 2005). O látex “in natura” é
empregado na medicina popular como antiofídico; as sementes são comercializadas para
extração do óleo fixo, que é utilizado como purgativo, para uso veterinário (AGRA et
al., 1996).
3
Leal C.K.A. & Agram. de F. (2005) descrevem J. mollissima como:
Arbusto com látex avermelhado, 2,0-3,0 m de comprimento; ramos
cilíndricos, glabros, suculentos, estriados; estípulas caulinares, 2,0-4,0 mm,
espinhosas, lignificadas, persistentes. Folhas peltadas; pecíolo 4,0-10,0 cm,
cilíndrico, puberulento, tricomas simples unisseriados; lâmina 3,0-15,0 x 4,0-
10,0 cm, orbicular, 5-palmatilobada, subcrassas; lobos elípticos, puberulentos,
tricomas simples, unisseriados, denteados, glandular-estipitados, base aguda,
ápice glandular-acuminado, broquidródroma. Pedúnculo cilíndrico, 4,0-2,0 cm,
puberulento. Inflorescências em corimbos, terminais, bracteados; 2 flores
pistiladas circundadas por 4 flores estaminadas; pedicelos 0,4-1,5 cm,
cilíndricos, glabrescentes. Flores estaminadas e pistiladas pentâmeras, cálice
0,5-1,5 cm, sépalas soldadas no 1/4 basal, lobos ovalelípticos, estipitados,
glabros; corola até 2,0 cm, pétalas livres, 0,5-1,0 cm, oblongas, face externa
avermelhada e a interna amarela, glabra. Fruto capsular, 1,5-3,0 cm, trilocular,
glauco, com deiscência explosiva; sementes-3, oblongas, 0,8-1,0 cm, glabras,
carúncula evidente, ca. de 1/5 do tamanho da semente; testa lisa, brilhante,
marrom-ferrugínea.
Figura 1: Fotografias da Espécie Jatropha mollissima
4
2.3 - O Gênero Anthurium
Anthurium é um membro da família Araceae (monocotiledôneas), que inclui
mais de 100 gêneros e cerca de 1500 espécies, principalmente a partir dos trópicos
(HIGAKI et al., 1994).
Algumas espécies de Anthurium são utilizadas na medicina popular tradicional
nas regiões tropicais das Américas e das Antilhas para o tratamento de diferentes
doenças (JOLY et al., 1987; ZAMORA-MARTÍNEZ e POLA, 1992), alguns deles
associados com atividade imunoestimulante (DI CARLO et al., 1964).
As flores de várias espécies de Anthurium são cultivadas intensivamente para
fins ornamentais, e as folhas têm usos tradicionais como agente antiinflamatório
(DeFRANK, 1989). Até agora, somente estudos sobre a atividade antiinflamatória de
extratos A. cerrocampanense e no isolamento de antocianinas das flores (SEGURA et
al., 1998) e folhas de algumas espécies de Anthurium (AQUINO et al., 2001) foram
relatados.
5
3. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO
3.1 - Levantamento Bibliográfico de Diterpenos do Gênero Jatropha
Neste capítulo serão registradas as estruturas e atividades biológicas de todos os
diterpenóides isolados das espécies do gênero Jatropha. A busca foi realizada no
programa computacional Scifinder scholar utilizando o termo “Jatropha diterpenoids”.
Este levantamento teve como objetivo atualizar uma revisão publicada recentemente
(DEVAPPA et. al., 2011) que trata de todos os diterpenoides isolados do gênero
Jatropha (1976-2010) e suas atividades biológicas.
Jatropha é uma das mais ricas fontes de fitoquímicos tais como alcalóides,
lignanas e terpenos (DEVAPPA, 2010).
Os terpenos e diterpenos de Jatropha possuem diversas atividades biológicas
como antitumoral, citotóxica, antiinflamatório, moluscicida, inseticida, propriedades
fungicida dentre outras (Tabela 1).
Tabela 1: Diterpenos de Jatropha e suas atividades biológicas. No Diterpenos Espécies Atividades
Biológicas Referências
1 Jatrophona J. gossypifolia J. elliptica
Antitumoral Citotoxica Moluscicida Leishmanicida Gastroprotetor
Devappa et. A.l, 2010 Pertino et. al., 2007 Taylor et. al., 1983 Santos et. al, 1999
2 2α-OH Jatrophona J. gossypifolia Citotóxica Taylor et al, 1983
3 2β-OH jatrophona J. gossypifolia Citotóxica Taylor et al, 1983
4 2β-OH-5,6-isojatrophona J. gossypifolia Citotóxica Taylor et al, 1983
5 9β, 13α-diidroxiisabelliona J. isabelli Citotóxica Pertino et al, 2007
6 Japodagrina J. podagrica Bactericida Aiyelaagbe et al, 2007
7 Japodagrona J. podagrica Bactericida Aiyelaagbe et al, 2007
8 15-O-acetil japodagrona J. multifida NA Das et al, 2009
6
No Diterpenos Espécies Atividades Biológicas
Referências
9 Jatrophatriona J. macrorhiza Antitumoral Torrance et al, 1976
10 Jatrofenona J. gossypifolia Bactericida Ravindranath et al, 1982
11 Riolozatriona J. dioica Bactericida Watson et al, 1982
12 Jatrowediona J. weddelliana NA Brum et al, 1998
13 Integerrimeno J. integerrima NA Sutthivaiyakit et al, 2003
14 Citlalitriona J. dioica J. integerrima J. gossypifolia
NA Villarreal et al, 1988 Das et al, 2008 Yang et al, 2003
15 Caniojano J. grossidentata J. integerrima J. curcas
Antiplasmodial Citotóxica
Sutthivaiyakit et al, 2003 Sutthivaiyakit et al, 2009
16 1,11-bisepicaniojano J. integerrima
Antiplasmodial Sutthivaiyakit et al, 2003 Sutthivaiyakit et al, 2009
17 2-epicaniojano J. integerrima
NA Sutthivaiyakit et al, 2003 Sutthivaiyakit et al, 2009
18 Spruceanol J. divaricata Citotóxica Antitumoral
Denton et al, 2001 Krebs et al, 2004
19 Cleistanthol J. divaricata Antitumoral Denton et al, 2001 Sutthivaiyakit et al, 2003 Krebs et al, 2004
20 ent-3β, 14α-hidroxipimara- 7,9(11),15-trieno-12-ona
J. divaricata NA Denton et al, 2001
21 ent-15(13 - 8)abeo-8β(etil) pimarano
J. divaricata NA Denton et al, 2001
22 Jatrogrossidiona J. grossidentata
Leishmanicida Tripanocida
Schmeda-Hirschmann et al, 1992
23 Isojatrogrossidiona J. grossidentata
NA Das et al, 2008 Schmeda-Hirschmann et al, 1992
7
No Diterpenos Espécies Atividades Biológicas
Referências
24 2-epi-isojatrogrossidiona J. grossidentata
NA Schmeda-Hirschmann et al, 1992
25 2-epi-jatrogrossidiona J. gaumeri Antimicrobiana Can-Ake´ et al, 2004
26 2-hidroxiisojatrogrossidiona J. grossidentata J. wedelliana J. podagrica
Bactericida Fungicida
Schmeda-Hirschmann et al, 1992
27 2-epi-hidroxiisojatrogrossidiona J. grossidentata J. wedelliana J. podagrica
Bactericida Fungicida
Schmeda-Hirschmannn et al, 1992
28 Acetato de (4E)-jatrogrossidentadiona
J. multifida NA Das et al, 2008 Schmeda-Hirschmann et al, 1992
29 (4E)-jatrogrossidentadiona J. multifida NA Das et al, 2008
30 15-epi-(4E)-jatrogrossidentadiona J. grossidentata J. gaumeri
NA Can-Ake´ et al, 2004 Schmeda-Hirschmann et al, 1992
31 15-O-acetil-15-epi-(4E)-jatrogrossidentadiona
J. curcas NA Ravindranath et al, 2004
32 (14E)-14-O-acetil-5,6-epoxijatrogrossidentadiona
J. curcas NA Ravindranath et al, 2004
33 3β-acetoxi-12-metoxi-13-metil-podocarpa-8,11,13- trien-7-ona
J. curcas NA Ravindranath et al, 2004
34 3β,12-dihidroxi-13- metilpodocarpane-8,10,13-trieno
J. curcas NA Ravindranath et al, 2004
35 Jatropholona A J. isabelli Gastroprotetor Citotóxico Moluscicida Antiplasmodial
Pertino et al, 2007 Schmeda-Hirschmann et al, 1996 Sutthivaiyakit et al, 2009
36 Jatropholona B J. isabelli Gastroprotetor moluscicida
Pertino et al, 2007
37 2α-Hidroxijatropholona J. integerrima Bactericida Antiplasmodial
Sutthivaiyakit et al, 2009
8
No Diterpenos Espécies Atividades Biológicas
Referências
38 2β-Hidroxijatropholona J. integerrima Bactericida Citotóxico
Sutthivaiyakit et al, 2009
39 Curcasona A J. curcas Efeito Anti-invasivo em células tumorais
Naengchomnong et al, 1986 Thippornwong et al., 2006
40 Curcasona B J. curcas Efeito Anti-invasivo em células tumorais
Naengchomnong et al, 1986 Thippornwong et. al, 2006
41 Curcasona C J. curcas Citotóxica Naengchomnong et al, 1986 Thippornwong et al., 2006
42 Curcasona D J. curcas Citotóxica Naengchomnong et al, 1986 Thippornwong et al., 2006
43 Jatropherol J. curcas Inseticida Rodenticida
Jing, 2005 Jing et. al., 2005
44 Japodagrol J. podagrica Antitumoral Sanni et al, 1988
45 Curculatirano A J. curcas NA Naengchomnong et al, 1986
46 Curculatirano B J. curcas NA Naengchomnong et al, 1986
47 (+) Jatrophol J. curcas NA Naengchomnong et al, 1994
48 Multifolona J. multifida NA Das et al, 2008
49 Multifidona J. multifida Citotóxica Das et al, 2009
50
Multidiona J. multifida NA Das et al, 2009
9
No Diterpenos Espécies Atividades Biológicas
Referências
51 Jatropha fator C1 J. curcas
52 Jatropha fator C2 J. curcas
53 Jatropha fator C3 J. curcas
54 Jatropha fator C4 J. curcas
55 Jatropha fator C5 J. curcas
56 Jatropha fator C6 J. curcas
Citotóxico
Moluscicida,
Rodenticida
Goel et al, 2007
Devappa et al, 2010
Haas et al, 2002
Li et al, 2010
57 Heudolotinona J. curcas NA Kimbu et al, 1991 Ravindranath, 2003
58 Jatrophalactam J. curcas Citotóxico Wang et al, 2009
59 Favelino J. phyllacantha Citotóxico Endo et al, 1991
60 Deoxofavelino J. phyllacantha Citotóxico Endo et al, 1991
61 Favelino metil éter J. phyllacantha Citotóxico Endo et al, 1991
62 Filacantona J. phyllacantha NA Lemos et al, 1991
63 Palmarumicina CP1 J. curcas Bactericida Ravindranath et al, 2004
64 Palmarumicina JC1 J. curcas Bactericida Ravindranath et al, 2004
65 Palmarumicina JC2 J. curcas Bactericida Ravindranath et al, 2004
10
No Diterpenos Espécies Atividades Biológicas
Referências
67 (4Z)- 15-
Epijatrogrossidentadiona J. grossidentata J.wedelliana J. podagrica
Bactericida Fungicida
Aiyelaagbe et al, 2007 Schmeda-Hirschmann et al, 1992
68 Jaherina J. Zeyheri Bactericida Dekker et al, 1987
69
Spirocurcasona J. curcas NA Giuseppina et al, 2011
70
Curcasona E
J. curcas
NA
Giuseppina et al, 2011
71
Acetoxijatropholona
J. curcas
NA
Giuseppina et al, 2011
NA = não aplicável
Figura 2: Diterpenoides isolados de espécies do gênero Jatropha.
1
O
O
O
O
O
O
HO
2
O
O
O
HO
3
O
O
HO
O
4
O
O
O
H OH
5
O
O
OHO
OH
6
O
O
O
HO
7
O
O
O
AcO
8
O
O
O
H
9
11
Figura 2: Diterpenoides isolados de espécies do gênero Jatropha.
O
H
OAcHO
O
10
O
O
O
H H
H
11
O
O
O
H
H
H
HH
H
12
O
OAcO
H
13
O
O
O
H
HH
OH
14
O
O
OO
OHH
H
H H
H
15, 16-(15 COM 1,11-bisepi)
O
O
OO
OHH
H H H
H
17
H
OH
HO
H
18
H
OH
HO
H
HO
19
20
H
O
HO
HOH
21
H
O
HO
HO
O
OH
HO
22
O
O
O
(23, 2 - H) (24, 2 - H)
O
O
HOH
H
25
O
O
O
HO
(26, 2 -OH) (27, 2 - OH)
12
Figura 2: Diterpenoides isolados de espécies do gênero Jatropha.
O
O
OCOCH3
HO
28
O
O
OH
HO
29, 30 - (29) com - OH
O
O
OH
H3COCO
31
O
H3COCO
OH
32
H
OCH3
H3COCO O
33
OH
O
35
OH
O
36
HO
OH
O
37
H
OH
HO
34
HO
OH
O
38
O
O
R1R2 R1 R2
39 Me H40 H Me41 Me OH42 OH Me
O OH
OH
OHOH
43
O
O
HO
HO
44
O
O
OH
HO
45
13
Figura 2: Diterpenoides isolados de espécies do gênero Jatropha
O
O
O
HO
46
OH
O
OH
47
OOH
HOOH
48
O
O
O
49
O
O
HO
50
O HOOH
OH
H
H H
O
O
O
O
51
OHO
OH
HO
H
H H
O
O
O
O
52
53, 54
OHO
OH
HO
H
HH
O
O
O
O
14
56
O
O
O HO
OH
HO
H
H H
O
Figura 2: Diterpenoides isolados de espécies do gênero Jatropha
O
O
O HO
OH
HO
H
H H
O
55
OH
OH
57
HN
O
H
O
HO
58
HO
OH
59
HO
H
60 H3CO
OH
61H3CO
OH
62
O O
O OH
63
O O
OH OH
O
64
O O
O OH
HO
65
15
Figura 2: Diterpenoides isolados de espécies do gênero Jatropha
66
OOH
HOO
67
OOH
HOO
68
OHO
H H
O
O
O HH
69
O
OHO
H
H H
70
OH
O OO
H
H
71
16
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 - Determinação Estrutural de EHJM-DA1
O fracionamento cromatográfico da fração diclorometano do extrato hexânico
das raízes de J. mollissima (EHJM-D) resultaram no isolamento de um precipitado
branco amorfo denominado EHJM-DA1 com ponto de fusão na faixa de 82,4 – 83,7º C.
O espectro de absorção na região do infravermelho de EHJM-DA1 (Figura 3)
apresentou uma banda larga em máx 3408 cm-1 característica de vibração de
deformação axial da ligação O-H; absorções em máx 2944 e 2859 cm-1 referentes a
vibrações de deformação axial de ligações C-H; absorção em máx 722 cm-1
característico de deformação angular de ligação C-H para compostos de cadeia longa.
4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 03 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
Tran
smitâ
ncia
%
c m -1
Figura 3: Espectro na região do infravermelho de EHJM-DA1 (KBr).
No espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3:CD3OD) (Figura 4, p. 18) de
EHJM-DA1 observou-se sinais à H 0,74 (3H, t), 1,12 (52H, s), 1,40 (2H, t) e 3,43 (2H,
t) que podem ser atribuídos a hidrogênios de hidrocarboneto alifático. O sinal em H
3,43 pode ser atribuído a hidrogênio de carbono oxigenado.
17
Figura 4: Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DA1
O espectro de RMN 13C-BB (125 MHz, CDCl3:CD3OD) (Figura 5, p. 19)
apresentou 7 linhas sendo que o sinal C 62,3 foi atribuído a carbono oxigenado.
A análise do espectro de RMN 1H,13C-HSQC (Figura 6, p. 19) possibilitou a
identificação de um carbono metílico em C 13,9 que correlacionou com o hidrogênio
H 0,74 (3H, t); houve também correlação entre o sinal C 13,9 como o sinal H 1,12
(52H, s) caracterizando carbonos metilênicos em cadeia longa.
O sinal C 62,3 correlacionou-se com o sinal H 3,43 (2H, t) sugerindo a
presença de um carbono metilênico oxigenado.
18
Figura 5: Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DA1.
Figura 6: Espectro de RMN 2D 1H,13C-HSQC de EHJM-DA1.
19
Através dos dados apresentados pode-se concluir que EHJM-DA1 trata-se de um
álcool de cadeia longa denominado triacontanol.
Este composto já foi isolado de outras espécies do gênero Jatropha, bem como
de plantas de outros gêneros como Corchorus capsularis L. (GUTIÉRREZ, 2009) e
Ginkgo biloba (MONTORO & BEEKA, 2009).
OH26
triacontanol
20
4.2 - Determinação Estrutural EHJM-DB(2-3)2
Sucessivos fracionamentos cromatográficos da fração EHJM-D levou ao
isolamento de cristais incolores na forma de agulhas denominado EHJM-DB(2-3)2,
solúvel em clorofórmio que apresentou faixa de fusão de 130,4-132,8º C.
O espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 7) mostrou uma
banda larga em máx 3420 cm-1 referente a deformação axial de ligação O-H; absorções
em máx 2937 e 2863 cm-1 caracteriscas de deformação axial de ligação C-H; bandas de
absorção em máx 1057 e 963 cm-1 referentes a deformação angular da ligação C-H de
alcenos.
4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
Tran
smitâ
ncia
%
c m - 1
Figura 7: Espectro na região do infravermelho de EHJM-DB(2-3)2 (KBr).
O espectro de RMN 1H (Figura 8, p. 22) obtido com C5D5N a 300 MHz
mostrou a presença de sinais H 0,69 (t), 0,88 (s), 1,07 (s) e 1,02 (6H, t) característicos
de grupos metila (CH3); dois sinais em H 5,86 (s) e 5,43 (d) característicos de
hidrogênio olefínico; um sinal em H 3,8 (d) característico de hidrogênio ligado a
carbono oxigenado.
21
Figura 8: Espectro de RMN 1H (300 MHz, C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2
A comparação do espectro de RMN 13C-BB (Figura 9, p. 23) com o espectro de
RMN 13C-DEPT 135º (Figura 10, p. 23) possibilitou a identificação de três carbonos
não-oxigenados (C), onze carbonos metínicos (CH), onze carbonos metilênico (CH2) e
seis carbonos metílicos (CH3).
22
Figura 9: Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz,C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2.
Figura 10: Espectro de RMN 13C-DEPT 135º (125 MHz,C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2.
23
A análise do espectro de RMN 13C-BB mostrou a presença de quatro sinais para
carbono olefínico: C 121,59; 129,86; 139,18 e 142,35. Para sinais observados em H
3,8 e C 71,65 pode-se constatar a presença de um grupo hidroxila na molécula.
A comparação dos dados de RMN 13C-BB de EHJM-DB(2-3)2 com os dados
encontrados na literatura (Tabela 2, p. 25) possibilitou a identificação de uma mistura
de esteróides muito comum em plantas, -sitosterol e estigmasterol.
HO
H H
H
H
-sitosterol
HO
H H
H
H
estigmasterol
24
Tabela 2: Deslocamentos químicos de RMN 13C (C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2 em comparação com dados da literatura. C C C -sitosterol
(literatura*) C C estigmasterol
(literatura*) 1 37,28 37,21 36,78 37,21 2 32,55 31,62 32,55 31,62 3 71,65 71,80 71,00 71,80 4 42,90 42,18 43,20 42,29 5 142,35 140,72 142,35 140,72 6 121,59 121,71 121,59 121,71 7 32,60 31,87 32,60 31,87 8 32,60 31,87 32,60 31,87 9 50,88 50,08 50,88 50,08 10 36,78 36,48 36,78 36,48 11 21,65 21,07 21,65 21,07 12 40,29 39,73 40,29 39,73 13 42,77 42,29 42,77 42,29 14 56,68 56,73 56,82 53,83 15 24,91 24,28 24,91 24,34 16 28,92 28,23 29,87 28,92 17 57,31 56,00 56,68 55,90 18 12,53 11,84 12,38 12,03 19 19,40 19,38 19,40 19,38 20 36,15 36,12 40,69 40,50 21 19,30 18,75 21,65 21,05 22 34,61 33,90 139,18 138,32 23 26,83 25,99 129,86 129,22 24 45,59 45,78 51,80 51,21 25 29,54 29,08 37,89 31,87 26 19,98 19,81 20,34 21,20 27 19,40 19,00 19,30 18,95 28 23,78 23,02 26,05 25,40 29 12,88 11,96 12,65 12,25 *Kongduang et al, 2008
25
4.3 - Derteminação Estrutural de EHJM-DC3
Sucessivos fracionamentos cromatográficos da fração diclorometânica do extrato
hexânico das raízes de J. mollissima (EHJM-D) resultaram na obtenção de um
precipitado denominado EHJM-DC3 com ponto de fusão na faixa de 201,0 -204,4º C.
O espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 11) de EHJM-DC3
apresentou uma banda larga em máx 3415 cm-1 característica de vibração de
deformação axial de ligação O-H; absorções em máx 2944 e 2859 cm-1 referentes a
vibrações de deformação axial de ligações C-H; bandas intensas em máx 1708 e 1685
cm-1 associadas a deformação axial de ligações C=O; além de bandas na faixa de 1245 a
1030 cm-1 condizentes com deformação axial de ligação C-O (SILVERSTEIN, 2007).
4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
Tran
smitâ
ncia
%
c m -1
Figura 11: Espectro na região do infravermelho de EHJM-DC3 (KBr)
O espectro de RMN 13C-BB (Figura 12, p. 27) revelou a presença de 20 sinais
espectrais. Dos sinais observados, dois sinais apresentam deslocamentos químicos
compatíveis com grupos carbonila. O sinal em C 204,1 (C-3) foi atribuído à carbonila
de cetona conjugada, enquanto que o sinal em C 214,4 (C-14) foi atribuído a carbonila
de cetona não conjugada. Dois sinais também foram observados para carbonos
olefínicos [C 153,13 (C-1) e 143,08 (C-2)]. Três sinais na faixa de carbono oxigenado
[C 86,5 (C-15), 62,5 (C-5), 59,2 (C-6)]. Através de uma análise dos espectros de RMN
26
1H,13C-HSQC (Figura 13, p. 28 ) foi possível identificar seis carbonos metínicos [C
153,1; 62,5; 58,3 (C-4), 37,8 (C-13), 29,3 (C-9) e 18,9 (C-11)], três carbonos
metilênicos [C 41,1 (C-7), 24,5 (C-12) e 18,5 (C-8)] e cinco carbonos metílicos [(C 9,9
(C-16), 18,1 (C-17), 18,2 (C-18), 15,4 (C-19) e 14,5 (C-20)] (Tabela 3, p. 28 ).
Figura 12: Espectro de RMN 13C-BB (125MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DC3.
27
Figura 13: Espectro de RMN 2D 1H,13C-HSQC de EHJM-DC3.
Tabela 3: Padrão de hidrogênio de EHJM-DC3 determinado através de análise dos
espectros de RMN 1H,13C-HSQC.
C CH CH2 CH3
214,5 153,1 41,1 18,2
204,2 62,5 24,5 18,1
143,1 58,3 18,5 15,4
86,5 37,8 14,5
59,3 29,3 9,9
16,7 18,9
6C 6CH 3CH2 5CH3
28
O espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3:MeOD) mostrou um sinal singleto
em H 6,7 característico de hidrogênio ligado a carbono sp2; um sinal multipleto em H
3,77 referente a hidrogênio ligado a carbono oxigenado; sinais em H 1,7; 1,4; 0,95;
0,83; 0,62 foram atribuídos a carbonos metílicos.
Figura 14: Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DC3
29
A comparação dos dados de RMN 13C de EHJM-DC3 com os dados encontrados na
literatura (Tabela 4, p. 31), revelou que essa substancia se tratava da
Jatrogrossidiona um diterpeno de esqueleto latirano que foi isolado de Jatropha
grossidentata (SCHMEDA-HIRSCHMANN et al, 1992), mas inédita na espécie J.
mollissima.
O
O
OH
HO
Jatrogrossidiona
12
3 45
6 7
8 9 10
11
1213
14
1516
17
18
19
20
30
Tabela 4: Deslocamentos químicos de RMN 13C e 1H (CDCl3) de EHJM-DC3 em
comparação com dados da literatura.
C C H C (literatura*)
1 153,1 6,6 (s) 152,7
2 143,1 142,7
3 204,2 203,4
4 62,5 2,2 (d, J = 8,6) 62,4
5 58,3 2,7 (d, J = 8,6) 57,7
6 59,3 58,6
7 41,1 2,09 (dd)/0,9 (dd) 41,0
8 18,5 1,6 (dd)/0,8 (dd) 18,4
9 29,3 0,01 (t) 29,1
10 16,7 16,5
11 18,9 0,37 (m) 18,7
12 24,5 1,5 (dq)/1,38 (dq) 24,3
13 37,8 3,76 (m) 37,6
14 214,5 214,0
15 86,5 86,4
16 9,9 1,69 (d, J = 0,9) 10,2
17 18,1 1,24 (s) 18,3
18 28,2 0,84 (s) 28,2
19 15,4 0,63 (s) 15,4
20 14,5 0,95 (d, J = 6,85) 14,6
*Brum et al., 1998
31
4.5 - Inibição da enzima acetilcolinesterase
O objetivo desse ensaio é encontrar extratos e/ou substancias que apresentem a
propriedade de inibir a enzima acetilcolinesterase, inibição essa que esta diretamente
ligada ao tratamento da doença de Alzheimer (RHEE et al., 2001). Atualmente, a
literatura revela atividade relativamente intensa na busca de novos inibidores em
extratos de plantas, verificando-se expressivo interesse no isolamento e na identificação
e novos inibidores da AChE (GUPTA et al.,1997).
Na Tabela 5 estão contidos os resultados para o teste de inibição da enzima
acetilcolinesterase dos extratos hexânico e etanólico das raízes de J. mollissima, extratos
metanólicos das folhas de quatro espécies do gênero Anthurium.
Tabela 5: Avaliação da atividade anticolinesterásica dos extratos de J. mollissima e de quatro espécies do gênero Anthurium.
De acordo com os resultados obtidos, apenas os extratos hexânico das raízes de
J. mollissima e metanólico das folhas de A. andraeanum apresentaram-se
potencialmente ativos contra a enzima acetilcolinesterase.
Extratos Atividade Anticolinesterásica
J. mollissima (hexânico) Positivo
J. mollissima (etanólico) Negativo
A. lindmanianum (metanólico) Negativo
A. andraeanum (metanólico) Positivo
A. bonplandii (metanólico) Negativo
A.plowmanii (metanólico) Negativo
Controle positivo (Eserina) Positivo
32
5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 5.1 - Material Vegetal
A realização deste trabalho baseou-se no estudo fitoquimico das raízes de
Jatropha mollissima e estudo dos compostos fenólicos das folhas de quatro espécies do
gênero Anthurium.
As raízes de J. mollissima foram coletadas na cidade de Beberibe – Ceará em
Setembro de 2009 pela Prof. Luquesio Petrola de Melo Jorge
As folhas de A. lindmanianum, A. andraeanum, A. bonplandii e A. plowmanii
foram fornecidas pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA)
através da Dra. Ana Cecília Castro.
5.2 - Métodos Cromatográficos
As cromatografias de adsorção foram executadas empregando-se gel de sílica 60
(70-230 mesh) da marca Vetec (CC gravitacional). O diâmetro e o comprimento das
colunas variaram de acordo com a alíquota da amostra a ser cromatografada e a
quantidade de sílica utilizada em cada experimento.
Nas cromatografias em camada delgada (CCD) foram utilizadas cromatoplacas
de gel de sílica 60, 5-40m, em suporte de alumínio com indicador de fluorescência na
faixa de 254 nm (Merck).
As substâncias foram reveladas nas cromatoplacas analíticas através da
exposição destas à radiação ultravioleta (UV) no comprimento de onda 254 nm e por
solução vanilina/ácido perclórico/etanol seguida de aquecimento em chapas
aquecedoras.
Os solventes utilizados nas eluições foram n-hexano, diclorometano, acetato de
etila e metanol puros ou em misturas binárias.
33
5.3 - Métodos Físicos
5.3.1 - Espectroscopia na Região do Infravermelho (IV)
Os espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos em espectrômetro
Perkin-Elmer, modelo FT-IR SPECTRUM 1000, utilizando pastilhas de brometo de
potássio (KBr).
5.3.2 - Ponto de Fusão
Os pontos de fusão das substancias isoladas foram obtidos em equipamento MQAPF-
301 da Microquimica a uma taxa de aquecimento de 5º C/min.
5.3.3 - Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e
carbono 13 (RMN 13C), uni- e bidimensionais, foram obtidos em espectrômetro da
Bruker, modelo DPX-300 operando na freqüência de 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C e DRX-500 operando na freqüência de 500 MHZ para 1H e 125 MHz para 13C.
Na dissolução das amostras para obtenção dos espectros foram utilizados
solventes deuterados: metanol (CD3OD), clorofórmio (CDCl3) e piridina (C5D5N)
Os deslocamentos químicos (δforam expressos em parte por milhão (ppm) e
referenciados nos espectros RMN 1H pelo pico do hidrogênio pertencente a fração não
deuterada dos solventes: metanol (cloroformio (e piridina
(e para os espectros de RMN 13C pelos picos de carbonos –13 dos
solventes: metanol (cloroformio (e piridina (123,87; 135,91 e
150,35).
34
5.4 - Estudo dos constituintes químicos de Jatropha mollissima (Pohl)
Baill
5.4.1 - Preparação dos extratos de J. mollissima
4,620 Kg das raízes secas e trituradas de J. mollissima foram submetidas à
extração com n-hexano (3 x 9L) e em seguida com EtOH (3 x 9L) a frio. A solução
resultante foi concentrada à pressão reduzida em evaporador rotativo fornecendo os
extratos denominados EHJM (42 g) e EEJM (70 g) (Fluxograma 1).
Fluxograma 1 – Esquema da obtenção dos extratos hexânico e etanólico das raízes de
J. mollissima.
Material botânico
Extrato hexânico (EHJM)
Torta
Extrato etanólico (EEJM)
Resíduo
Extração com n-hexano
Evaporação sob pressão reduzida
Evaporação sob pressão reduzida
Extração com etanol
5.4.2 - Fracionamento cromatográfico de EHJM
O extrato bruto EHJM (42 g) foi adsorvido em 45,3 g de gel de sílica,
pulverizados em gral de porcelana e acondicionados em 40g de gel de sílica utilizando
como suporte um funil de separação de 2000 mL. Após sucessivas eluições com os
solventes éter de petróleo, hexano, CH2Cl2, AcOEt e MeOH puros, foram obtidas três
frações (Tabela 6).
Tabela 6: Dados referentes ao fracionamento preliminar do extrato hexânico bruto das raízes de J. mollissima. Solvente Fração Massa (g)
Éter de petróleo - -
Hexano - -
CH2Cl2 EHJM-D 22,2
AcOEt EHJM-A 9,5
MeOH EHJM-M 11,3
Total 43,0
5.4.3 - Fracionamento cromatográfico de EHJM-D e isolamento de EHJM-DA1
A Fração EHJM-D (22,2 g) foi adsorvida em 21,3 g de gel de sílica,
pulverizados em gral de porcelana e acondicionados sobre 15 g de gel de sílica em uma
coluna de vidro. Os solventes utilizados foram n-hexano, CH2Cl2 e AcOEt em
concentrações variadas (Tabela 7, p. 37).
35
36
Tabela 7: Descrição do gradiente de eluição do tratamento cromatográfico da fração
EHJM-D.
Eluentes Fração Massa (g)
Hexano EHJM-DA 0,479
Hexano/ CH2Cl2 50% EHJM-DB 12,354
CH2Cl2 EHJM-DC 6,770
CH2Cl2/AcOEt 50% EHJM-DD 0,748
Total 20,351
A fração EHJM-DA (0,479 g) apresentou um sólido branco amorfo. Essa fração
foi filtrada e o material obtido foi lavado com n-hexano exaustivamente para render um
sólido branco amorfo (25 mg) solúvel em piridina que foi denominado EHJM-DA1.
5.4.4 - Fracionamento cromatográfico de EHJM-DB e isolamento de
EHJM-DB (2-3) 2
Uma alíquota de 1,2 g da Fração EHJM-DB (12,354 g) foi adsorvida em 2 g de
gel de sílica, pulverizados em gral de porcelana e acondicionados sobre 10 g de gel de
sílica em uma coluna de vidro. Os solventes utilizados foram n-hexano e AcOEt em
concentrações variadas (Tabela 8).
Tabela 8: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração EHJM-DB.
Eluentes Fr. coletadas Fr. reunidas Massa (g)
Hexano 1 EHJM-DB (1) -
Hexano/AcOEt20% 2-10 EHJM-DB (2-3) 0,568
Hexano/AcOEt30% 11-23 EHJM-DB (4-19) 0,170
Hexano/AcOEt50% 24-26 EHJM-DB (20-26) 0,165
Total 0,903
37
A fração EHJM-DB (2-3) foi submetida a sucessivas CC onde foi possível isolar
um sólido branco (15 mg) solúvel em clorofórmio. Esse precipitado foi denominado
como EHJM-DB (2-3) 2.
5.4.5 - Fracionamento cromatográfico de EHJM-DC e isolamento de
EHJM-DC 3
A Fração EHJM-DC (6,77 g) foi adsorvida em 6 g de gel de sílica, pulverizados
em gral de porcelana e acondicionados sobre 40 g de gel de sílica em uma coluna de
vidro. Os solventes utilizados foram n-hexano e AcOEt em concentrações variadas
(Tabela 9).
Foram obtidas 198 frações que, após analise em CCD, foram reunidas de acordo
com suas semelhanças. As frações 127-154 após serem reunidas apresentou um
precipitado (cristais em forma de agulhas). Após a filtração e sucessivas lavagens com
MeOH o precipitado foi denominado EHJM-DC3 (16 mg).
Tabela 9: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração EHJM-DC.
Eluentes Fr. reunidas Massa (g)
Hexano/AcOEt 10% EHJM-DC (1-51) 0,155
Hexano/AcOEt 20% EHJM-DC (52-126) 4,961
Hexano/AcOEt 30% EHJM-DC (127-154) 1,257
Hexano/AcOEt 40% EHJM-DC (156-198) 0,273
Hexano/AcOEt 50%
Total 6,646
38
Fluxograma 2 – Rota esquemática do isolamento dos constituintes químicos EHJM-
DA, EHJM-DB(2-3)2 e EHJM-DC3 a partir do extrato hexânico das raízes de J.
mollissima.
Ext. hexânico (42 g)
1. Fracionamento cromatográfico 2. Destilação do solvente
EHJM-D (22,2 g)
EHJM-A (9,5 g)
EHJM-M (11,3 g)
Fracionamento cromatográfico
EHJM-DA (25 mg)
EHJM-DB (12,35 g)
EHJM-DC (6,77 g)
EHJM-DD (0,75 g)
C. cromatográfica
EHJM-DB(2-3)2 (15 mg)
C.cromatográfica
EHJM-DC3 (16 mg)
39
5.5 - Ensaio para inibição da enzima acetilcolinesterase dos extratos
Este ensaio é baseado segundo Ellman et al. (1961), adaptado para CCD por
Rhee et al. (2001). É um método rápido e sensível para a seleção de amostras com ação
anticolinesterásica. As reações que estão envolvidas nesse método estão apresentadas na
Figura 15.
SN(CH3)3 I
OAChE
O
O
+ SN(CH3)3
+ 2H
+SN(CH3)3 S
S
HO2C
O2NNO2
CO2H
S
HO2C
O2NS N(CH3)3
S NO2
CO2H
+
Figura 15: Mecanismo para a reação enzimática do teste de Ellman.
A metodologia utiliza uma alíquota de 5 L dos extratos (10mg/mL) aplicados
em uma cromatoplaca. Após a evaporação dos solventes, pulverizou-se uma mistura
(1:1) de iodeto de acetiltiocolina (ATCI) 1mmol.L-1 com o reagente de Ellman (ácido
5,5’ – Ditiobis-(2-nitrobenzóico, DTNB, 1 mmol.L-1), deixando em repouso por 3 min
para a secagem da placa. Em seguida, borrifou-se a enzima acetilcolinesterase 3 U/mL.
Após um período de 10 minutos, ocorre o surgimento de uma coloração amarela na
placa, porém onde houve inibição da enzima, observou-se um halo branco em torno dos
“spots” onde foram aplicadas as amostras. Em 20 - 30 min a coloração desapareceu.
Como controle positivo foi utilizado solução do padrão sal de Eserina (2 mg/mL)
(Figura 17) e solventes utilizados como controle negativo. Na figura 16 estão
apresentados as etapas desse método.
40
Figura 16: Etapas da metodologia modificada por Rhee.
N
NOHN
O
CH3
CH3
CH3
H3C
H
Figura 17: Estrutura do padrão Eserina.
1 – Aplicação das amostras 2 – Evaporação do solvente 3 – Pulverização da solução (1:1) de ATCI + DTNB
Cromatoplaca
4 – Borrifou-se a enzima acetilcolinesterase (3U/mL)
41
6. CLAE-EM 6.1 - Introdução
A espectrometria de massas se tornou nos últimos anos uma das técnicas mais
utilizadas com diversas aplicações nas áreas de química, biologia, ciências médicas e
tecnológicas, isto devido aos avanços na instrumentação e de técnicas de ionização que
a revitalizaram. O número de artigos publicados para esta técnica tem aumentado
mostrando a grande importância desta técnica, seja para simples determinação de massa
molar de substâncias puras, ou na identificação e quantificação de substâncias de
interesse em extratos brutos (CROTTI et al., 2006). O acoplamento da cromatografia
líquida à espectrometria de massas com ionização por electrospray (CL-EM-IES)
tornou-se uma importante técnica para análise qualitativa e quantitativa das mais
variadas fontes de produtos naturais (MORAIS et al., 2007).
6.2 - Espectrômetro de massas
O espectrômetro de massas é um instrumento utilizado para separar espécies
carregadas de acordo com suas razões massa/carga (m/z) e determinar suas intensidades
relacionando-as. Dessa forma, um espectrômetro de massas típico é constituído pelas
seguintes partes: Fonte de ionização, analisador de massas, detector e sistema de
processamento de dados (GATES et al., 2006). Neste estudo, o acoplamento CLAE-EM
é focalizado nos principais aspectos instrumentais e práticos das aplicações para análise
de frações complexas.
6.3 - Ionização por electrospray (IES)
A ionização por electrospray é basicamente uma técnica de transferência dos
analitos da fase líquida pra a fase gasosa. Ela é bastante amena e geralmente é bem
sucedida para moléculas de polaridade mediana. Adicionalmente, a técnica IES produz
com frequência íons com múltiplas cargas para moléculas grandes como proteínas e
peptídeos. Nos últimos anos a ionização por electrospray tem se tornado uma das mais
42
importantes técnicas de ionização em uso. Seus mecanismos permanecem em constante
estudo por ainda não serem bem compreendidos, porém, alguns autores tentam explica
os fenômenos que ocorrem na fonte de ionização.
A IES pode ser dividida em três etapas principais: a nebulização da solução da
amostra em gotículas carregadas produzidas pela aplicação direta de voltagem no
capilar, a liberação dos íons a partir das gotículas e o transporte dos íons da região de
pressão atmosférica da fonte para a região de alto vácuo do analisador (CHAPMAN,
1993). Uma diferença de potencial (2-4 kV) é aplicada ao capilar por onde o liquido
contendo a amostra flui em direção a um contra-eletrodo, o que causa a separação dos
íons com carga positiva e negativa formando uma dupla camada elétrica. A atração
eletrostática dos íons em excesso na camada exterior do liquido, em direção ao contra-
eletrodo, causa uma distorção da sua superfície no formato de um cone conhecido como
“cone de Taylor”. Através do auxilio de um fluxo de gás aquecido, geralmente N2, as
gotículas carregadas com várias unidades de carga sofrem evaporação do solvente
restando apenas os íons da amostra.
6.4 - Análise por CLAE-IES-EM dos extratos metanólicos de quatro
espécies do gênero Anthurium
6.4.1 - Preparação dos Extratos
As folhas secas de A. bonplandii (13g), A. lindmanianum (20g), A. plowmanii
(14g) e A. andraeanum (10g) foram extraídas com hexano (500 mL) e metanol (500
mL) em sistema Soxhlet. Os extratos foram destilados em evaporador rotativo e
armazenados à 4ºC. Apenas os extratos metanólicos foram analisados.
6.4.2 - Materiais Químicos
Acetonitrila e metanol grau HPLC foram adquiridos de Tedia Company Inc.
(Fairfield, OH). Água grau HPLC foi preparada com água destilada usando um sistema
Milli-Q (Millipore Lab., Bedford, MA).
43
6.4.3 - Preparo das amostras
Foram pesados 10mg de cada extrato metanólico das folhas, dissolvidos em
10mL de MeOH : H2O (6:4). As soluções foram mantidas durante 30 minutos em
aparelho Ultra-som e, em seguida, diluídas a uma concentração de 250 ppm, filtradas
em filtros de 20 μm e mantidas à 4º C até serem analisadas.
6.4.4 - Condições cromatográficas CLAE-DAD-IES-EM
O instrumento consistiu de um LC-DAD-ESI/MS 250 Varian HPLC (Varian,
CA), acoplado com um detector de arranjo de diodos (DAD) e um 500-MS IT
espectrômetro de massas (Varian). A coluna C18 Zorbax (Agilent) (5 µM, 150 x 2 mm)
foi utilizada a uma vazão de 0,4 mL/min. A temperatura do forno da coluna foi fixada
em 30ºC.
A fase móvel consistiu de uma combinação de A (0,1% de ácido fórmico em
água) e B (0,1% de ácido fórmico em acetonitrila). O gradiente variou linearmente de
10% para 26% B (v / v) em 40 min, a B 65% em 70 min e, finalmente, a B 100% em 71
min e mantida a B 100% para 75 min.
O DAD foi fixado em 350, 270 e 520 nm de tempo real de leitura para fora e espectros
UV / VIS, 190-650 nm, foram continuamente coletados. Os espectros de massas foram
simultaneamente adquiridos utilizando ionização por electrospray no modo positivo e
negativo de ionização (IP e IN), tensão de fragmentação de 80 V para a faixa de massa
de 100-2000 amu. A pressão do gás de secagem de 35 psi, pressão de gás de
nebulização de 40 psi, a temperatura do gás de secagem de 370º C, as tensões capilares
de 3500 V para IP e 3500 V para o IN, e tensões spray protetor de 600 V foram
utilizados. O sistema de cromatografia líquida foi acoplado diretamente à EM sem
divisão de fluxo. A identificação de compostos foi baseada principalmente em dados de
espectrometria de massas de íons moleculares e íons produto EM-EM e em observações
publicadas para compostos fenólicos.
44
6.4.5 - Compostos fenólicos identificados por CLAE-EM
Estudo através de CLAE-UV/Vis-EM dos extratos de quatro espécies de
Anthurium (Figura 18) indicou a presença de compostos fenólicos e seus glicosídeos.
Foram identificados seis compostos fenólicos diferentes caracterizados através das
fragmentações obtidas em comparação com dados da literatura.
As estruturas propostas para todos os compostos fenólicos identificados neste
trabalho (1-6) com suas respectivas massas podem ser observadas na Figura 24, p. 48.
As propostas de fragmentação encontram-se nos Esquemas 1-6, p. 51-56.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 18: Cromatogramas CLAE dos extratos metanólicos de (a) A. lindmanianum, (b)
A. andraeanum, (c) A. bonplandii, (d) A. plowmanii.
45
Figura 19: Espectro UV/Vis do composto 1.
Figura 20: Espectro UV/Vis do composto 2.
Figura 21: Espectro UV/Vi do composto 3.
46
Figura 22: Espectro UV/Vis do composto 4.
Figura 23: Espectro de UV/Vis do composto 6.
47
O
O
HO
OH
OH
O
HO
HO
HOHO
4C21H20O10
432.38432.105647
Figura 24: Compostos fenólicos identificados por CLAE-EM nos extratos metanólicos de quatro espécies de Anthurium.
O
OH
OCH3
O
HOOHO
O
OH
OHO
HOHO
HO
6C28H32O14
592.55592.179206
O
OH
OCH3
O
HO
OHOO
OH
OHO
HOHO
HO
2C28H32O14
592.55592.179206
O
HO
O
O
OH
OHOH
OH
OH
5C16H18O9
354.31354.095082
OHO
OH
OHO
O
OH
HOHO
OH
OH
HOHO
O
1C26H30O14
566.52566.163556
O O
O H
O C H 3
O
O H O H O
O
O O
H O H O O H
O O H
H O H O
O O
3 C 3 6 H 4 4 O 2 0
7 9 6 . 7 3 7 9 6 . 2 4 2 5 9 4
48
Tabela 10: Dados LC-DAD-IES-EM em modo positivo e negativo dos compostos fenólicos identificados parcialmente. Composto tR (min) UV máx (nm) Íon (m/z) EM-EM
1 22,469 344, 271 565 + 529, 475, 427 2 28,367 336, 271 593 + 447, 429, 327 3 55,321 344, 271 797 + 651, 443, 285 4 28,454 334, 344sh, 270 355 + 337, 163, 135 5 35,164 - 431 - 341, 311 6 29,843 334, 268 593 + 447, 327, 285 Tabela 11: Dados LC-IES-EM em modo positivo e negativo dos compostos fenólicos identificados obtidos da literatura. Composto UV máx (nm) Íon (m/z) EM-EM Referência
1 335, 270 565 + 529, 475, 427 2 329, 273 591 - 445, 429 Aquino et al.,
2001 3 333, 268 797 + 651, 447, 285 Marin et al., 2001 4 334, 344sh, 270 431 - 341, 323, 311,
283, 269 da Silveira et al.
2010 5 - 355 + 377, 355, 163 Termentzi et al.,
2008 6 331, 270 591 - 447, 327, 285 Aquino et al.,
2001
49
A identificação dos compostos 1-6 foi confirmada através da comparação direta com padrões no German Cancer Research Center (DKFZ) pelo Prof. Dr. Robert Wyn Owen e, ainda, foi possível identificar no extrato metanólico de A. bonplandii a presença de isovitexina e orientina. Figura 25: Compostos identificados no extrato metanólico de A. bonplandii.
O
OH
OH
O
HO
OHO
OH
OH
HO
isovitexina
O
OH
OH
O
HO
OHO
OH
OH
HO
OH
orientina
50
6.4.6 - Propostas de fragmentos de massas observados nos espectros dos compostos 1-6.
Esquema 1: Propostas de fragmentos de massas para o composto 1.
Figura 26: Espectro de massas IES (modo positivo) do composto 1.
OHO
OH
OHO
O
OH
HOHO
OH
OH
HOHO
O
OO
OH
OH
O
OH
HOHO
O
O
OHHO
HO
H2O
H
m/z 565
H
OO
OH
OH
O
OH
HOHO
O
HO OH OHO
m/z 427
H
OO
OH
O
O
OHHO
HO
OO
HO OH
H
2H2O
m/z 529OHO
OH
OHO
OH
HOHO
OH
OOH
HO OH
H2C O
H
m/z 475
51
Esquema 2: Propostas de fragmentos de massas para o composto 2.
Figura 27: Espectro de massas IES (modo positivo) do composto 2.
H
2
m/z 593
O
OH
OCH3
O
HO
OHO
OH
OH
HO
O
HOHO
HO
O
OH
OCH3
O
HO
OHOO
OH
OH
O
HOHO
HO
H
m/z 447
O
OH
OCH3
O
HO
OO
OH
OH
H2O
H
m/z 429
O
OH
OCH3
O
HO
OH
O
OH
HO OH
H
m/z 327
52
Esquema 3: Propostas de fragmentos de massas para o composto 3.
Figura 28: Espectro de massas IES (modo positivo) do composto 3.
H
OO
OH
OCH3
O
OHOHO
O
OO
HO HO
OH
O
OH
HOHO
OO
3
m/z 797
OHO
OH
OCH3
O
H
OHOHO
O
OO
HO HO
OH
O
OH
HOHO
OO
m/z 285
OO
OH
OCH3
O
OHOHO
O
HO
O
OH
HOHO
OO
O
HO HO
OH
m/z 651
H
O
OH
HOHO
OO
H
OO
OH
OCH3
O
OHOHO
OH
HO
m/z 447
53
Esquema 5: Propostas de fragmentos de massas para o composto 4.
Figura 29: Espectro de massas IES (modo negativo) do composto 4.
5
m/z 431
O
OH
OH
O
O
OH
O
O
OH
OH
O
HO
OH
m/z 341m/z 311
O
OH
OH
O
HOOHO
OH
OH
HO
HO
H2O
OHHO
O
OH
54
H
4
O
HO
O
O
OHOH
OH
OH
H
HO
O
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
O
O
H2O
m/z 355 m/z 337
m/z 135
m/z 163
m/z 175
Esquema 4: Propostas de fragmentos de massas para o composto 5.
Figura 30: Espectro de massas IES (modo positivo) do composto 5.
55
Esquema 6: Propostas de fragmentos de massas para o composto 6.
Figura 31: Espectro de massas IES (modo positivo) do composto 6.
6
H
m/z 593
O
OH
OCH3
O
HOOHO
OH
OH
HO
O
HOHO
HO
O
O
OH
OCH3
O
HOOHO
OH
OH
O
HOHO
HO
HOHO
OH
OH
HOO
OH
OCH3
O
HO
H
m/z 447m/z 285
56
7. CONCLUSÃO
A investigação química do extrato hexânico das raízes de J. mollissima resultou
no isolamento e caracterização de um álcool de cadeia longa denominado triacontanol,
uma mistura de sitosterol e estigmasterol e um diterpeno de esqueleto latirano
denominado jatrogrossidiona, inédito na espécie.
O estudo cromatográfico do extrato etanólico das raízes de J. mollissima
possibilitou o isolamento de uma substancia que até o momento ainda se encontra em
processo de elucidação estrutural.
Até o momento foram identificados oito compostos por CLAE-EM: 6-C-
arabinosil-8-C-glicosil-apigenina nas folhas de A. lindmanianum; 8-O-ramnosil-(1-3)-
C-glicosil-acacetina e 7-O-[6-O-acetilglicosil(1-2)]ramnosil-(1-6)-glicosil-acacetina nas
folhas de A. andraeanum; ácido 5-cafeoilquínico, vitexina, isovitexina e orientina nas
folhas de A. bonplandii e 6-O-ramnosil-(1-3)-C-glicosil-acacetina nas folhas de A.
plowmanii.
Os resultados para o teste de inibição da enzima acetilcolinesterase mostraram
que apenas os extratos hexanico de J. mollissima e metanólico das folhas de A.
andraeanum apresentaram atividade anticolinesterásica.
57
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