Dr. Astin Prima Sari Pembimbing : Dr. Amriyatun, Sp THT-KL

LATAR BELAKANG Dibutuhkan biomarker untuk deteksi dini dan pemantauan keberhasilan terapi pasien HNSCC (Head and Neck Cell Carsinoma) TUJUAN Menentukan suatu teknologi proteomik baru dapat mengidentifikasi ekspresi protein dengan benar pada sampel serum pasien HNSCC Mendeteksi adanya suatu petanda tumor DESAIN Analisis proteomik langsung dan perbandingan

METODE Sistem ProteinChip waktu desorpsi/ionisasi laser yang diperkuat oleh permukaan dari spektrometri massa aliran (surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF) digunakan untuk menangkap protein yang diekspresikan secara berbeda-beda dalam sampel serum dari 99 pasien dengan HNSCC, 25 perokok sehat, dan 102 kontrol sehat (normal) Dilakukan pengelompokan dan analisis klasifikasi puncak protein dari data spektrum SELDI

HASIL Beberapa protein (massa 2778 - 20800 Da) diekspresikan secara berbeda-beda antara pasien-pasien dengan HNSCC dan kontrol normal pohon klasifikasi sensitivitas 83,3% , spesifisitas 90%, nilai prediktif positif 80%, nilai prediktif negatif 92% Intensitas puncak (10068 Da) dideteksi dalam serum dari pasien HNSCC sebagai biomarker metallopanstimulin-1 (MPS-1) berhubungan secara konsisten (radioimmunoassay ataupun SELDI)

KESIMPULAN Teknik ini memungkinkan dikembangkannya uji penapisan untuk deteksi dini dan diagnosis HNSCC, serta identifikasi potensial terhadap biomarker tumor

HNSCC sering ditemukan dalam tahap lanjut Insiden tinggi, metode diagnosis dini belum ada Rokok dan alkohol sebagai faktor resiko Fokus : menerjemahkan proteome HNSCC untuk petanda diagnostik Proteome manusia : serangkaian penuh protein yang dikode oleh genome Proteomik (analisis pola protein) : karakterisasi dan penghitungan protein dalam jaringan dan cairan tubuh Metode proteomik : untuk membandingkan pola ekspresi protein antara pasien sehat dengan pasien kanker

Elektroforesis jeli 2 dimensi (2D-PAGE) : - teknik utama analisis proteomik konvensional - untuk mendeteksi perbedaan-perbedaan dalam ekspresi protein dalam jaringan dan spesimen cairan tubuh (berdasar ukuran dan muatannya), antara kelompok sehat (kontrol) dan kelompok penyakit -Keterbatasan

Sistem Protein Chip = analisis SELDI-TOF-MS : - waktu desorpsi / ionisasi laser yang diperkuat oleh permukaan dari spektrometri massa aliran (surfaceenhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS) - Serum diaplikasikan ke suatu chip pengikat protein diradiasi dengan laser menyebabkan protein yang melekat mjd terbang sebagai ion bermuatan ion berkelana melalui sebuah pipa vakum dan rasio massa terhadap muatan (m/z) dihitung berdasarkan waktu terbang (TOF) melalui ruang ion (ditinjau dalam Wright dan Wulfkuhle dkk) - Potensi besar untuk deteksi dini berbagai kanker manusia

Tujuan penelitian : - apakah penentuan profil protein dengan menggunakan SELDI-TOF-MS dapat membedakan secara akurat pasien dengan HNSCC dari kontrol sehat (kontrol normal) dan perokok sehat (kontrol perokok) - deteksi suatu petanda tumor yang diketahui (metalopanstimulin-1 / (MPS-1) untuk deteksi HNSCC

SAMPEL SERUM Sampel serum pasien kanker kepala dan leher dan kontrol normal (1997-2004) dibekukan pada suhu -80C sampai mencair khusus untuk analisis SELDI

PENENTUAN PROFIL PROTEIN SELDI - 20 L serum diberi urea 8M dan 1% 3-(3kolamidopropil dimetilammonio)-1-propanesulfonat (CHAPS) dan diputar selama 10 menit pada suhu 4C. - Pengenceran dengan larutan PBS(phosphatebuffered saline) ditambahkan ke ProteinChip dengan bantuan suatu bioprosesor - Setiap sampel serum diperiksa dengan duplikatnya - ProteinChip diinkubasi pada suhu kamar cuci dg PBS dan air dikeringkan di udara ditambahkan larutan jenuh dari asam sinapsinat dalam asetonitrile 50% dan asam trigluoroasetat 0,5% - Susunan ProteinChip dianalisis menggunakan Sistem ProteinChip SELDI

ANALISIS DATA - Data dibagi 2 kelompok : 1. Kelompok pelatihan : 75 sampel dari HNSCC dan 75 sampel dari kontrol normal 2. Kelompok uji : 24 pasien HNSCC, 27 kontrol normal, dan 25 kontrol perokok - Spektrum dianalisis dg perangkat lunak ProteinChip Ciphergen (versi 3.0) dan dinormalisasi dengan menggunakan arus ion total - Pelabelan dan pengelompokan puncak (dg alat Ciphergen s Biomarker Wizard, yang tertuang ke dalam suatu lembar kerja intensitas puncak dirata-rata untuk sampel duplikat - Data dianalisis dengan perangkat lunak Pola Biomarker (Ciphergen Biosystem) pohon klasifikasi

ANALISIS POHON KLASIFIKASI DAN REGRESI Penilaian pada intensitas puncak yang dinormalisasi dari profil ekspresi protein SELDI. Setiap puncak tsb suatu variabel dalam proses klasifikasi CART (classification and regression tree analysis) membagi data menjadi 2, berdasarkan kriteria tertentu dalam satu waktu melalui sebuah pertanyaan Pohon klasifikasi kelompok pelatihan dibandingkan dg kelompok uji

ANALISIS STATISTIK - Spesifisitas : rasio angka sampel negatif terhadap jumlah sampel negatif total - Sensitivitas : rasio jumlah sampel penyakit terhadap jumlah sampel penyakit total - Nilai prediktif negatif dan positif kemudian dihitung - Perbandingan tingkat intensitas puncak di antara kelompok-kelompok dihitung dengan menggunakan uji t

METALLOPANSTIMULIN-1 Sampel Serum - 125 pasien HNSCC diperiksa kadar MPS-1 serumnya, dibandingkan dengan 2 kelompok kotrol. Kelompok kontrol I = 25 relawan sehat yang tidak merokok (kontrol normal). Kelompok kontrol II = 64 relawan perokok aktif yang tidak menderita HNSCC (kontrol perokok) - 821 sampel serum (709 dari kasus [HNSCC], 48 dari kontrol normal, dan 64 dari kontrol perokok) yang dikumpulkan selama periode 24 bulan, dianalisis dengan radioimmunoassay MPS-1 (RIA)

Standar Serum MPS-1 -Sampel serum dikumpulkan berdasarkan hasil RIA -CPS: sangat tinggi (XHCPS > 100 ng/dL) tinggi (HCPS=50-100 ng/dL) medium (MCPS =20-50 ng/dL) rendah(LCPS