KROMATOGRAFİKromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin,birisabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriylekarışmayan iki fazlı
bir sistemde ayrılması,
tanınması
ve saflaştırılması
yöntemlerinin genel adıdır.Çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla,sabit fazüzerinde, değişik hızlarla hareket etmeleri veyasürüklenmeleri esasına dayanır
Kromatografi
tekniğinin temelinde üç
ana unsur yer alır.•
Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir
"katı
destek üzerine emdirilmiş
bir sıvı tabakasından" oluşur.
•
Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur.•
Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer
alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide
"yüzey tutunması
veya
adsorpsiyon" ile "çözünürlük" gibi olgular temel etkileşim türlerini
oluştururlar.
İlk kez Rus botanikçi Mikhail
Tsvett
(1903)tarafından geliştirilen bir yöntemdir.
Tsvett
bu yöntemi bitki pigmentlerinin(klorofil A,klorofilB
ve
ksantofil)renkli bileşenlerini ayırmakta kullanılmıştır.Kullandığı
kolonda renkli bandlar
oluştuğundan, bu ayırma yönteminekromatografi
adını
vermişti
Bir parça kağıt şeridin aşağı
hizasından1 cm kadar yukarısına bir damla siyahmürekkep damlatınız
Kağıt şeridi, mürekkep damlattığınızkısım su hizasının üstünde kalacakşekilde su tankına batırınız ve dik birşekilde tutunuz. Su,kapiler
etkisiyle
kağıt üzerinde yukarı
doğru yürürkenmürekkebi çözer ve sürüklemeyebaşlar. Mürekkebin içindeki bileşenlerkağıt üzerinde farklı
hızlarda ilerleyerek
ayrılmış
olur.
Kromatografi
‘nin
Sınıflandırılması
1-Uygulama Biçimine Göre2-Ayrılma Mekanizmalarına Göre3-Faz Tiplerine Göre
1-Uygulama Biçimine Göre
-
Düzlemsel kromatografiKağıt kromatografisiİnce tabaka kromatografisi
(TLC)
-Kolon kromatografisiGaz kromatografisi
(GC)
Yüksek basınçlı
sıvı
kromatografisi
(HPLC) Süperkritik
akışkan kromatografisi
2-Ayrılma Mekanizmalarına Göre
•
Adsorpsiyon
kromatografisi•
Dağılma kromatografisi
•
İyon değiştirme kromatografisi•
Jel filtrasyon
(Moleküler eleme)
kromatografisi•
İyon çifti kromatografisi
•
Afinite
kromatografisi
3-Faz Tiplerine Göre
-Sıvı
kromatografisiSıvı-Katı
kromatografisi
Sıvı-Sıvı
kromatografisi-Gaz kromatografisi
Gaz-Katı
kromatografisiGaz-Sıvı
kromatografisi
KOLON KROMATOGRAFİSİ
depo(tampon)
sabit faz(katı
porlu matriks)
mobil faz(tampon)
elüent
Proteinkarışımı
•Kolon
kromatografisi:biyomoleküllerinsaflaştırılmasında sıklıkla kullanılır
•Kolon, biyomolekülleri
seçici adsorblayan
bir maddeyle (katı
porlu
matriks) doldurulur SABİT FAZ•biyomolekül
karışımı
kolona tatbik
edilir HAREKETLİ FAZ•Tampon çözelti (MOBİL FAZ) ile
yıkanan kolon tarafından,adsorbe
edilmeyenler önce
adsorbe
edilenler daha geçkolonu terkeder.
Başlıca katı
dolgu maddeleri
(hareketsiz faz) şunlardır:•
Silika jel: Genellikle nötür
ve asidik yapıdaki bileşikler
için uygundur.•
Alumina: Genellikle nötür
ve bazik yapıdaki bileşikler
için uygundur.•
Sellüloz: Genellikle biyokimyasal maddeler için uygundur.Hareketli faz görevini üstlenecek çözücüler; Sikloheksan, Kloroform (kansorojen), Metanol, Petrol eter, Metilen klorür, Etanol, Benzen(kansorojen), Etil asetat, Aseton, Toluen, Dietil
eter, Karbon
tetraklorür(kansorojen), n-Butanol
İzopropanol olabilir.
1903 yılında Tsvet
bitki pigmentleriyle çalışırkenkolon dolgu maddesi olarak kireç
kullanmıştı.
Günümüzde ise çoğunlukla silika jel
ve aluminakullanılmaktadır.
Kolon Kromatografi
TipleriKolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyonmetoduna göre gruplandırılır:
i.Jel filtrasyonu büyüklükii.İyon değişim yükiii.Affinite (bağlanma)
i.Jel Filtrasyon KromatografiKarışımdaki moleküllerin molekül büyüklüklerinde göre ayrılması
esasına dayanır
•Kolon, jel boncuklar(belli büyüklüğe sahip ve karışımdaki bileşenlerle etkileşmeyen bir madde) ile doldurulur katı matriks•Biyomolekül
karışımını
içeren tampon, kolondan geçirilir
Küçük moleküller,jel boncuklar arasındakiboşluklara girer,kolondan geç
çıkarlar.
Büyük moleküller,jel boncuklar arasındakiboşluklara giremez ve kolondan hızlı
bir
biçimde sürüklenerek önce çıkarlar.
Kromatografik
ayırma sırasında bozunması
veya degişikliğeuğraması
istenmeyen protein ya da enzim gibi biyolojik
moleküllerin birbirinden ayrılması
için kullanılır.Bu yöntem ile polimerlerin molekül ağırlığı
dağılımı
da tayin
edilebilir
•Avantaj Büyük miktarda
:
biyomolekül karışımı
saflaştırılabilir
•Dezavantaj: Yavaş
ayırım
ii.İyon exchange
(değiş-tokuş)Kromatografi
Maddelerin iyonik grupları
ile iyon değiştiricideki iyonik grupların eşdeğer miktarlarının karşılıklı
yer değiştirmesi
esasına dayanır
İyon değiştirme kromatografisi, kullanılan iyon değiştiricinin anyon veya katyon aktarmasına göre sırasıyla anyon değiştirme
kromatografisi
veya katyon değiştirme kromatografisi
olarakadlandırılır.Anyon değiştirme kromatografisinde,kolon içindeki sabit tabaka olan matrixe
kovalent
bağlı
iyonlar pozitif yüklüdür,bu
iyonlar kolondan geçirilen çözeltideki anyonları
kendine çeker,çözeltideki anyonlar ayrılır,sadece katyonlar ortamdan çıkar.Katyon değiştirme kromatografisinde
ise,benzer sistemle
çözeltideki katyonlar ayrılır,anyonlar ortamdan çıkar.
Cl-
ve I-
karışımının nitrat bağlanmış
anyon
değiştirici RNO3
ile bileşenlerine ayrılmasındageçerli dengeler aşağıdaki biçimdedir:
Cl-
+ RNO3
RCl
+ NO3
I-
+ RNO3
RI + NO3
R: Çözünmeyen Matriks RNO3
: Anyon Değiştirici
AnyonDeğiştirici
I
Cl-
İyon değiştirmeyi etkileyen faktörlerHareketli faz derişimiHareketli faz pH’sıKompleks oluşturucu etki
İyon değiştirme kromatografisinin
uygulanmasıAyrılmaları
güç
olan bazı
iyonları
ve asitlerin
AminoasitlerSeyreltik iyon çözeltileri deriştirmedeAsit ve baz elde edilmesinde
NaCl↔NaOH
+ Cl
iii.Affinite
KromatografisiEnzim, hormon,vb spesifik proteinlerin
saflaştırılmasında kullanılır.Kolonun dolgu maddesine,(dekstran, poliakrilamid, selüloz vb)spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand bağlanır:
Ligand ile kompleks yapan spesifik protein,katı
desteğe bağlanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonu terkederler.Bağlı
protein, daha sonra, pH
değişikliği / tuz çözeltileri
veya ligand
ilavesiyle kolondan elüe
edilir
Seçiciliği fazla olan bu yöntem,kromatografi tekniklerinin en yenisidir.
Antijen –
Antikor Enzim –
Substrat
Reseptör–
İlaç
gibi oldukça spesifik etkileşimlere dayanır.
Seçiciliği fazla olan bu yöntem,kromatografi tekniklerinin en yenisidir.
Kolon Kromatografisi
b)Yüksek Basınçlı
Sıvı
Kromatografi(HPLC)
a)Gaz Kromatografi(GC)
a)
Gaz kromatografisiGC
Bir karışımda gaz halinde bulunan veya kolayca buharlaştırılabilen bileşenlerin birbirinden ayrılması
amacıyla gaz kromatografisi
yöntemi kullanılır. Bu yöntemde ayrılma, bileşenlerin farklı
katı
yüzeylerdeki farklı
adsorpsiyon
ilgilerine göre gerçekleşir. Numunede bulunan bileşenler bir cihazla spektrum haline getirilir ve bu spektrumda bulunan her pik ayrı
bir bileşeni gösterir.
Hareketli faz olarak helyum, azot veya argon gibi inert
bir gaz kullanılır ve bu gaza taşıyıcı
gaz adı
verilir. Kolon içinde kullanılan sabit faz; silika,
alumina
veya karbon gibi bir katı
ise yöntem, gaz-katı
kromatografisi
adını alır. Eğer sabit faz kiezelguhr
gibi inert
katı
bir dolgu maddesi üzerine
tutturulmus
uçucu olmayan bir sıvı
film ise yöntem gaz-sıvı
kromatografisi adını
alır. Bu şekilde kullanılan kolonlara dolgulu kolonlar
denilir.
Gaz kromatografisi
yönteminde kolonlar 2-10 mm iç
çapında ve 1-5 m boyundadır. Fakat inert
bir katı
dolgu maddesi üzerine uçucu olmayan bir
sıvı
kaplanması
yerine, bu sıvı
filminin doğrudan ince bir cam veya silika kapiler
borunun iç
yüzeyine tutundurulmasi
ile 0.2-0.5 mm iç
çapinda
ve
10-50 m gibi çok uzun kapiler
kolonların kullanılması
mümkün olabilir. Bu nedenle kapiler
kolonların verimliligi
ve ayırıcılığı, dolgulu kolonlara oranla
çok daha iyidir.
Gaz kromatografisinde, ilk olarak örneğin buharlaştırılması
için ısıtılan bir bölme vardır. Hemen ardından sıcaklığı
programlanabilen bir fırın içine
yerleştirilmiş
olan kolon gelmektedir. Sıvı
örnekler bir şırıngayla bir septumdan
giriş
kısmına enjekte edilirler. Kolon çıkışına yerleştirilen bir
dedektörden
sinyal izlenir ve bir integratör
ile kaydedilir.
Gaz kromatografisi
yönteminde incelenebilen maddeler için belli sıcaklıktaki alıkonma sürelerinin birbirinden farklı
olmasından yararlanarak
nitel analiz
yapılabilir.Bir maddenin alıkonulma süresi, belli bir kolon için, belli sıcaklıkta ve belli taşıyıcı
gaz akış
hızında sabit bir değerdir. Bu
sebeple de,bir iç
standart maddesinin analiz örneğine eklenmesi ve sonuçların bu maddeye bağlı
olarak belirtilmesi daha çok tercih edilen bir
yoldur.Gaz kromatografisi
yönteminde nicel analiz
ise kromatogramdaki
piklerin altlarında kalan alanların hesaplanması
ile veya pik yüksekliğinin ölçülmesi ile yapılır.Örneğin, enjekte ettigimiz
bir karışımda baslangıçta
eşit miktarlarda A ve B bilesenlerinin
olduğunu varsaydığımız bir durumda, kromatogramda
bu bilesenlere
ait piklerin altında kalan alanlar
da birbirine eşit olacaktır.
Bir bileşen kolondan ne kadar erken çıkarsa, o bileşene ait pik de o kadar keskin elde edilirken, kolondan geç
çıkan
bileşenlere ait pikler ise geniş
ve yayvan olarak elde edilmektedir. Bu ise istenmeyen bir durumdur. Bu durumu önlemek için sıcaklık programlaması
yöntemi
uygulanır.
Baslangıçta
kolon sıcaklığı
düşük tutulur ve zamanla doğrusal bir biçimde arttırılır.
b)
Yüksek basınçlı
sıvı
kromatografisiHPLC
Sıvı
kromatografi
bir ayırma tekniğidir. Bir sıvıda çözünmüş
ayrılacak bileşenler, bir kolon içerisinde bulunan genellikle katı
bir destek üzerindeki
sabit faz ile farklı
etkileşmelere girerek, kolon içinde değişik hızlarda ilerler. Kolonu değişik zamanlarda terkederler
ve böylece birbirlerinden
ayrılırlar. Burada taşıyıcı
faz olan sıvı, pompalarla kolona basıldığından yüksek akış
hızındadır. Bu nedenle ayırma daha kısa sürede ve tam olarak
gerçekleşmektedir. Ayrılan bileşik, kolon çıkışına bağlanan uygun bir dedektörle
tesbit
edilip miktarıyla orantılı
olarak kaydedilir. Yüksek hızda
gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı
sıvı
kromatografi
sistemlerine, Yüksek Basınç
Sıvı
Kromatografi
(HPSC)
denir
Normal Faz Sıvı
Kromatografisi:
Polar sabit faz ve apolar
veya düşük polariteye sahip hareketli faz
Ters Faz Sıvı
Kromatografisi:
Sabit faz apolar, hareketli faz ise polardır
Ters faz kromatografisinin
avantajları
1. Normal faz kromatografide, sıvı
fazın kontrolü
çok önemli ve kritiktir.Hareketli faz bileşimindeki küçük değişiklikler kromatogramda
belirgin farklılıklara neden olabilir.
2. Dengeye ulaşma normal faz kromatografide
çok yavaştır.
3. Normal faz kromatografide
polar maddelerin elüsyonu çok yavaştır ve yayvan piklere sebep olu
4. Apolar
çözücüler çok pahalıdır, ayrıca nemden uzak tutmak zordur.
•
HPLC kolonu, rejenerasyon
gerekmeksizin pek çok kezkullanılabilir.
•
HPLC tekniği kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır vetekrarlanabilirlik daha yüksektir.
•
Nicel analiz kullanılabilir.
•
Analiz süresi kısadır.
•
Duyarlık yüksektir.
HPLC’nin
avantajları