5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
1/32
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
2/32
KINETIKA ENZIMAnalisis Rx kimia enzimatik mempunyai beberapa
tujuan
1. Mengetahui karakteristik atau sifat-sifat enzimdalam suatu reaksi enzimatik
2. Meneliti tipe mekanisme kerja serta fungsi enzim
3. Menentukan hubungan antara enzim dengan
substrat, serta hubungan antara enzim dengan zatinhibitor
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
3/32
KINETIKA ENZIM Kinetika enzim merupakan cabang dari ilmu
enzimologi yang mempelajari fungsi-fungsi enzimdalam kecepatan reaksi serta faktor-faktornya. Faktor-
faktor tersebut antara lain :1. Konsentrasi enzim
2. Konsentrasi senyawa ligan termasuk di dalamnya : substrat, produk, inhibitor, aktifator
3. pH lingkungan
4. Kadar ion
5. Temperatur lingkungan
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
4/32
KINETIKA ENZIM
Persamaan MICHAELIS-MENTEN
: Reaksi yang dikatalisis oleh suatu enzim memilikivariasi kecepatan reaksi apabila substrat yang
digunakan mempunyai konsentrasi yang berbeda.
Kenaikan [S] akan diikuti peningkatan kecepatan
reaksi sampai pada batas tertentu, yang kemudianreaksi tersebut akan mencapai konstan danakhirnya mencapai titk dengan kecepatanmaksimum (Vmax)
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
5/32
Michaelis-Menten E bereaksi dengan S membentuk kompleks ES.
Kemudian ES akan mengalami peruraian baik menjadi
E dan S kembali atau membentuk sutu produk (P).Model :
E + S ES E + P
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
6/32
E + S ES E + Pk1
k2
k3
rapidreversible reaction
slowirreversible reaction
Laju konversi substrat menjadi produk (S
P):
V = k3 [ES] (1)
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
7/32
Berdasarkan reaksi di atas dapat diasumsikan bahwasenyawa produk tidak akan berubah kembali menjadisubstrat (S). Tititk tolak yang digunakan ialah bahwalaju katalisis sama dengan hasil perkalian konsentrasikompleks ES dengan K3
V = K3 [ES] (1)[ES] harus dinyatakan dalam kuantitas jumlah yang
telah diketahui. Jaju pembentukan dan lajupemecahan ES diketahui dari :
Laju pembentukan ES = K1 [E] [S] ..(2)
Laju pemecahan ES = (k2+k3) [ES] (3)
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
8/32
Dalam keadaan seimbang (steady state), konsentrasiZat antara [ES] tidak berubah, karena proseskecepatan pembentukan ES akan sama dengan proseskecepatan peruraian ES, sedangkan konsentrasisenyawa awal [S] dan konsentrasi produk [P] berubah.Dengan demikian :
Laju pembentukan ES = laju pemecahan ES
K1 [E] [S] = (K2+K3) [ES] (4)
Dari persamaan tersebut, [ES] dapat dihitung :
[E] [S]
[ES] = (5)
(K2+K3)/K1
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
9/32
Persamaan ini dapat disderhanakan denganmemasukkan suatu tetapan baru, yaitu Km atau
tetapan Michaelis : konsentrasi substrat yangmenyebabkan kecepatan reaksi sama denganseparuh kecepatan maksimum.
Dirumuskan:
K2 + K3Km = .(6)
K1
maka
[E] [S]
[ES] = .(7)
Km
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
10/32
Jika konsentrasi enzim jauh lebih kecil dari padakonsentrasi substrat ( [E]
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
11/32
Atau [S]
[ES] = [ET] ..(11)
[S] + Km
Jika persamaan ini dimasukkan ke dalam persamaan (1)
Untuk menggantikan [ES]V = K3[Es]
[S]
V = K3
[ET
] ..(12)[S] + Km
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
12/32
Kecepatan maksimum V max dicapai bila seluruh situsaktif enzim jenuh dengan substrat, artinya bila [S]jauh lebih besar daripada Km.Akibatnya [S]/([S]+Km)mendekati 1 (satu), sehingga :
V max = K3[ET] .(13)
Bila persamaan (13) dimasukkan ke dalam persamaan(12) diperoleh PERSAMAAN MICHAELIS-MENTEN
Vmax. [S]
V = .(14)
[S] + Km
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
13/32
Persamaan ini menerangkan grafik ketergantungan suatu kecepatan
reaksi terhadap konsentrasi substrat. Kecepatan awal V merupakanfungsi dari konsentrasi substrat [S] dari suatu reaksi enzimatik yang
juga merupakan inetika Michaelis-Menten. Satuan V adalah jumlah
produk yang dihasilkan (mmolatau mol, dsb.) atau jumlah substrat
yang mengalami perubahan per menit. Sedang satuan [S] adalah
mmol atau mol/liter
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
14/32
Dari persamaan (14) bila [S] jauh lebih rendah dari Km,maka kecepatan awal V mempunyai hubungan yang kuatdengan konsentrasi substrat [S], maka
V max. [S]
V = ..(15)
Km
Pada konsentrasi substrat yang tinggi, sehingga [S] jauh
lebih tinggi dari nilai Km maka :Vmax. [S]
V = .(16)
[S]
V = V max. .(17)
Bila [S] = Km , maka V = Vmax. (18)
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
15/32
Penentuan kecepatan awal (V)
Kecepatan awal suatu reaksi (V) dapat dihiunt secarakuantitatif dengan mengukur jumlah produk yang
dihasilkan atau jumlah sisa substrat yang tidak bereaksipada berbagai waktu inkubasi. Kecepatan awal merupakankoefisien arah dari garis lurus pada grafik antarakonsentrasi produk atau konsentrasi sisa subsstrat dengan
waktu inkubasi. Kecepatan awal dapat dihitung dengan jalan mengambil sampel pada
waktu yang berbeda setelah penambahan enzim. Untuk mendapatkansampel dengan variasi waktu inkubasi yang berbeda, maka reaksienzimatik harus dihentikan seawal mungkin setelah pengambilan
sampel. Reaksi dapat dihentikan dengan beberapa cara :1) Mendidihkan
2) Menambah senyawa asam/basa
3) Menambahkan alkohol
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
16/32
PENTINGNYA Km
1. Nilai Km memepunyai hubungan dengan
konsentrasi substrat di dalam sel. Jika [S] di dalamsel > dari nilai Km maka V tidak sensitif terhadap
adanya perubahan konsentrasi substrat yang rendah.2. Oleh karena nilai Km tetap, maka nilai tersebut
dapat digunakan untuk membandingkan Antaraenzim
dari organisme berbedaDari sel atau jaringan yang berbeda dalam satu
organisme
Dari satu sel atau jaringan yang sama pada fase
pertumbuhan yang berbeda
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
17/32
3. Perubahan nilai Km karena pengaruh suatu senyawaligan (ligan-induced) dapat digunakan sebagaimodel dalam proses pengaturan enzim
4. Dengan mengetahui niai Km,maka dapatmengetahui metode analisis berikutnya, jika
konsentrasi substrat [S]>>> Km, maka denganmenghitung V max sama dengan menghitung nilaikonsentrasi enzim total [ET]. Nilai KonstantaMichaelis -Menten memberikan pengertian terhadapkesesuaian antara substrat dengan enzim. Hal iniberarti bahwa substrat dengan nilai Km terendahmempunyai aktifitas tinggi terhadap enzim.Susbstrat mempunyai reaksi terbaik dengan enzimapabila rasio Vmax/Km tinggi.
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
18/32
Menentukan nilai Km (konstanta Michaelis danVmax
Gambar grafik dari data V pada beberapa konsentrasisubstrat [S] akan membentuk grafik dengan tipe hiperbola.Melalui gambar tersebut ternyata mengalami kesukarandalam menghitung nilai Vmax dan kecepatan awal V saat(pada) kondisi konsentrasi substrat sama dengan Vmax,pada titik tersebut sering dikenal sebagai nilai Km. dengandemikian untuk mempermudah perhitungan nilaikonstanta pada reaksi enzimatik, data yang didapat
sebaiknya diplotkan dengan didasarkan pada persamaangaris lurus. Perubahan ini diperoleh dengan membalikkankedua ruas daripersamaan (14)
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
19/32
maxmax
1
][
11
VSV
K
v
M
o
y = m x + bBerg, J. M., Tymoczko, J. L., &
Stryer, L.(2007.) Biochemistry.
(6th ed.) New York:W.H.
Freeman and Company.
Vmax .[S]
V =
[S] + Km
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
20/32
20
Inhibitor Kompetitif yang menempel pada renzimmenghasilkan reaksi
Penambahan EI menurunkan konsentrasi enzimbebas :
PEESSE
k
k
k
k
2
2
1
1
EIIE
k
k
3
3
][][][][ EIESEE tot
][1
][][][
IK
ESEE
I
tot
Penghambatan aktifitas enzim oleh inhibitor
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
21/32
21
M
tot
KS
Sv
k
kk
S
SEkESk
dt
Pdv
][
][
][
][][][
][ max
1
21
22
Compared to the formula for the unihibited enzyme
the apparant KMincreases:
Tradditionally, KI
is defined as a dissociation constant
totEkv ][2max
1
21
k
kkK
M
3
3
k
kK
I
)][
1(][
][
)][
1(][
][][
][
][ max
1
21
2
2
I
M
I
tot
K
IKS
Sv
K
I
k
kkS
SEk
ESkdt
Pd
v
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
22/32
Figure 7.08 Competitive enzyme inhibition.
Competitive inhibitorscompete with the substrate for an enzymes active
site.
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
23/32
INHIBITOR KOMPETITIF MENGUBAH KMTETAPI
TIDAKMENGUBAH Vmax
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
24/32
Figure 7.10.
A LineweaverBurk plot for competitive inhibition.
Competitive inhibitor alters KMbut
not Vmax
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
25/32
Enzyme Inhibition
product, dead-end substrate inhibited enzyme
Competitive inhibition (C):
A competitive inhibitor is a substance that combines with freeenzyme in a manner that prevents substrate binding. Thats, the
inhibitor and the substrate are mutually exclusive, often because
of true competition for the same site.
1/
1/A
[I]
Slope change only
Vmaxis the same
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
26/32
Competitive
inhibition (C):
Active site
of enzymeSubstrate
Inhibitor
Products
Inhibitor prevents
binding of substrate
Substrate and
inhibitor
can bind to the
active site
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
27/32
Mixed inhibition, where the inhibitor does not compete with the substrate for the
active site, but binds elsewhere on the enzyme, causing a conformational change
that makes the active site less efficient.
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
28/32
Figure 7.12.
A mixed inhibitor typically alters both Vmaxand KM.
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
29/32
Enzyme Inhibition
Uncompetitive inhibition (UC):
A classical UC inhibitor is a compound that binds reversibly to
the enzyme-substrate complex yielding an inactive ESI
complex. The I does not bind to free enzyme.
1/
1/S
[I]
E + S ES P + E
+
I
ESI NO REACTIO
KI
K1
K2
K3
Intercept change
Slope is the same
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
30/32
Enzyme InhibitionNoncompetitive inhibition (NC):
A classical NC inhibitor has no effect on substrate binding
and vice versa, Sand I bind reversibly, randomly and
independently at different sites.
1/
1/S
[I]
Slope change
Intercept change
Active site
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
31/32
Noncompetitive
inhibition (NC):
Active site
Inhibitor site
Binding of
inhibitor
distorts the
enzyme
In the absence
of inhibitor,
products areformed
Substrate and
inhibitor can bind
simultaneously
The presence of
the inhibitor
slows the rate of
product formation
5/28/2018 KINETIKA ENZIM (2)
32/32
Effects of Inhibitors on Michaelis-Menten Reactions
Type of
Inhibition
Michaelis-Menten
Equation
Lineweaver-Burk
Equation
Effect of
Inhibitor
NoneVmaxA
Km+ A =
1 = +
Km
VmaxA Vmax1
None
Competitive VmaxAKm+ A
=
1= +
Km
VmaxA Vmax
1
Increase Km
UncompetitiveVmaxA
Km+ A =
1= +
Km
VmaxA Vmax
Decrease Km
and Vmax
NoncompetitiveVmaxA
Km+ A =
1= +
Km
VmaxA Vmax
DecreaseVmax; may
increase
or decrease
Km
= 1 + [I]/KI
= 1 + [I]/K'I