La Investigación en la Sección Departamental de Bioquímica y Biología Molecular
• Grupo de BIOQUIMICA TISULAR
• Grupo de HEPATOLOGIA EXPERIMENTAL
• Grupo de ESTRÉS OXIDATIVO
• Grupo de PATOLOGÍA AUTOINMUNE
• Grupo de ENZIMOLOGÍA Y BIOQUÍMICA METABÓLICA
• Grupo de CITOMETRÍA Y CITÓMICA
Citometría en Investigación Clínica
José-Enrique O’Connor Grupo de Investigación en Citometría y Citómica
Universidad de Valencia Centro de Investigación Príncipe Felipe
Método analítico por el que se mide la emisión de múltiples
fluorescencias y la dispersión de luz de células o partículas
microscópicas, alineadas mediante una corriente líquida laminar,
cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad frente a una
fuente de iluminación de longitud de onda adecuada
CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO
Método analítico que mide la emisión simultánea de múltiples fluorescencias y dispersión de luz
CITOMETRIA DE FLUJO
Alineadas de forma secuencial por un flujo laminar y presentadas de una en una a gran velocidad en un punto óptimo de iluminación
Células o partículas biológicas individuales en suspensión
CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO
• Proteínas extracelulares • Secuencias de ADN o ARN libres • Complejos inmunes circulantes
CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO
• Viriones individuales • Liposomas • Cromosomas aislados • Orgánulos aislados • Núcleos aislados
• Bacterias • Hongos unicelulares • Células humanas y animales • Protoplastos vegetales
• Hibridomas y fusiones celulares • Esferoides • Cuerpos embrioides • Larvas y embriones • Organismos pluricelulares
Air-cooled Argon Ion Laser
Beam Shaping Lenses
High Sensitivity Quartz Flow Cell
Forward Scatter Detector
Side Scatter Detector
525BP FL1 (FITC)
575BP FL2 (RD1)
620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5)
488DL 488BK
550DL 600DL
645DL
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
FLUOROFORO
FLUOROCROMO
PROPIEDAD BIOLOGICA
FLUOROCROMO
`PROPIEDAD BIOLOGICA
633, 635 nm He-Ne
Allophycocyanin
785 nm
660 nm
Alexa Fluor 750
Alexa Fluor 750
Alexa Fluor 750
785 nm
785 nm
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
FLUOROCROMOS EN TANDEM: ALOFICOCIANINA +ALEXA DYES
Parámetros Citoplasmáticos
Parámetros Nucleares
Parámetros de Superficie
Parámetros Extracelulares
Moléculas de superficie
Enzimas
Enzimas
Enzimas
Proteinas
Proteinas
Pared celular
Proteinas secretadas
Parámetros analizables por Citometría de Flujo
Moléculas de superficie
1. INMUNOFENOTIPAJE DE SUPERFICIE
2. DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES
3. ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS
4. ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES
INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: OBJETIVO
Determinar la presencia y cuantificar la expresión de proteínas (antígenos) o de regiones de las mismas (epitopos) en la superficie de las células de la sangre, tejidos linfoides, líquidos biológicos o cultivos celulares, usando combinaciones adecuadas de anticuerpos fluorescentes.
INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: INFORMACION CLINICA
Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y técnicas de análisis permiten identificar subpoblaciones específicas de células y determinar:
• Linaje celular
• Grado de maduración
• Grado de activación
• Clonalidad de cadenas ligeras de inmunoglobulinas y del receptor TCR
• Expresión de proteínas de fusión en translocaciones cromosómicas
DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES : OBJETIVO
Determinar la presencia y cuantificar la expresión de proteínas (antígenos) o de regiones de las mismas (epitopos) en la cara interna de la membrana plasmática, citoplasma, vesículas o núcleo de las células de sangre, tejidos linfoides, líquidos biológicos o cultivos celulares, utilizando combinaciones de anticuerpos fluorescentes.
DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES : INFORMACION CLINICA
Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y técnicas de análisis permiten identificar:
• Linaje celular
• Grado de maduración
• Grado de activación
• Expresión de enzimas intracelulares
• Activación de enzimas intracelulares
• Expresión de proteínas reguladoras del ciclo celular
• Expresión de antígenos relacionados con la apoptosis
• Expresión de proteínas de fusión en translocaciones cromosómicas.
ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS : OBJETIVO
Determinar la presencia y cuantificar los niveles de ácidos nucleicos (ADN y ARN) en células enteras, células permeabilizadas o suspensiones de núcleos aislados a partir de sangre periférica, tejidos linfoides, líquidos biológicos, biopsias y otras muestras de tejidos sólidos y cultivos celulares, utilizando fluorocromos que se unen a los ácidos nucleicos.
ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS : INFORMACION CLINICA
Las técnicas de análisis basadas en el uso de fluorocromos específicos de ácidos nucleicos en células permeabilizadas permiten:
• Determinar la ploidía celular
• Detectar la presencia de células en proliferación
• Calcular la distribución en las fases del ciclo celular
• Identificar células nucleadas en sangre (leucocitos, eritroblastos)
• Estimar el grado de maduración de precursores de eritrocitos y plaquetas
• Identificar y cuantificar células vivas, apoptóticas y necróticas
ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES : OBJETIVO
Analizar, de forma cualitativa o cuantitativa, fenómenos dinámicos o transitorios de la Bioquímica intracelular, cuya alteración sea causa, consecuencia o esté relacionada con situaciones fisiopatológicas de relevancia clínica.
+ADP
ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES : METODOLOGIA
Se realiza usando fluorocromos, sustratos fluorogénicos específicos o partículas fluorescentes cuyas propiedades varían en función de: • Entorno celular: pH, iones, moléculas oxidantes, reductoras • Actividad de enzimas intracelulares específicos: oxidasas, peptidasas • Transporte a través de membrana plasmática o de orgánulos • Acumulación selectiva en compartimentos intracelulares
El proceso de preparación de la muestra debe respetar la viabilidad y competencia funcional. En muchas aplicaciones en Inmuno-Hematología, el análisis funcional se puede realizar en muestras de sangre entera, con un grado de manipulación mínima. En estudios de activación, se puede requerir una etapa de estimulación celular controlada.
The Evolution of Cytometry: From Cytometry to Cytomics
Cytology Cytometry Cytomics
• Increasing technical complexity and information • Demanding better instrument performance and data management • Exploring new biological parameters and new fields of application
Cytomic Technology: Single-cell Analysis
Hydrodynamic Flow Cytometry
Laser Scanning Cytometry
Automated Bioimage Analysis
Image-in-flow Cytometry
Mass-Spectrometry Flow Cytometry
Acoustic Flow Cytometry
High-Troughput Flow Cytometry
Confocal Microscopy
Inreasing the rate of samples: High-Troughput Cytometry
The HTFC™ Screening System performs high-throughput, multiplexed, single-cell
analysis on cells or particles in suspension:
• Reads a 96-well plate in 3 minutes, or a 384-well plate in 12 minutes
• Samples from 1 microliter or 1 ml
• No sample goes to waste
• With 4 fluorescent channels and 2 light scatter measurements
Clinical Medicine & Clinical Flow Cytometry
• Diagnostic • Prognostic • Therapy assesment
• Molecular Pathology • Predictive Medicine • Target identification • Individualized therapy
Translational Medicine & Translational Cytomics
Phase I
Phase II
Phase III
• Needs • Safety • Efficacy
Cytomics
Chemical Risk Assesment
Toxicity
Drug Discovery
• Acute/Sustained • On/Off target • Environmental • Cytotoxicity • Genotoxicity • Mutagenicity • Reproductive
Cytomics in Drug Discovery and Preclinical Studies
Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Hepatotoxicity
• While acute toxicity of a substance or drug candidate is usually detected in vitro, anticipating long-term toxicity is complicated.
• For the prediction of drug-induced chronic
hepatotoxicity, we have validated two novel cytomic assays of steatosis and cholestasis, the major causes of drug-candidate withdrawal.
Steatosis is approached by an assay consisting of 24-hour exposure of HepG2 cells to fatty acids in the presence of test compounds.
Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Steatosis
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CONTROL0,0
50,1 0,3 0,4 0,6 0,8
Tetracyclin treatment(mM)
% live cellsBODIPYRh123
CONTROL CELLS
0.5 mM FATTY ACIDS
Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Steatosis
Steatosis is approached by an assay consisting of 24-hour exposure of HepG2 cells to fatty acids in the presence of test compounds.
Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Steatosis
CONCENTRATION (µM)
1 10 100 1000 10000
TMRM
(% o
f con
trol)
0
50
100
150
200
250
300FLD VPA DOX AMD TET CIT
CONCENTRATION (µM)
1 10 100 1000 10000
BOD
IPY
ACC
UM
ULA
TIO
N(%
of c
ontro
l)
0
100
150
200
250
CONCENTRATION (µM)
1 10 100 1000 10000
VIA
BILI
TY (%
of c
ontro
l)
0
25
50
75
100
FLDVPA DOX AMD TET CIT
CONCENTRATION (µM)
1 10 100 1000 10000
RO
S (%
of c
ontro
l)
0
50
100
150
200
250
300
Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Steatosis
Cholestasis is predicted from the interference on bile acid uptake by isolated rat hepatocytes, with a kinetic assay of bile-acid fluorescent derivatives.
COOH
OH
OHHN
N
O
N
NO2
Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Cholestasis
Test compound JJ4 (Johnson&Johnson)
Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Cholestasis
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