ISOLASI, PURIFIKASI, KINETIKA, DAN KARAKTERISASI ENZIM INVERTASE
Amar Muslim (G84090019)1, Didit Haryadi2, dan Popi Asri Kurniatin3
Mahasiswa Praktikum1, Asisten Praktikum2, Dosen Praktikum3
Pengantar Penelitian BiokimiaDepartemen Biokimia, FMIPA, IPB
2012
AbstrakEnzim invertase merupakan enzim yang dapat menghidrolisis sukrosa menjadi fruktosa dan glukosa. Enzim ini diketahui dihasilkan oleh Saccharomyces cereviseae sebagai produk intraselulernya. Praktikum ini bertujuan untuk isolasi dan purifikasi enzim invertase. Selain itu, praktikum ini bertujuan juga untuk menentukan karakterisasi enzim invertase. Enzim diisolasi dengan memecah sel menggunakan metode solid shear mechanic dan didapat tiga fraksi,yaitu fraksi I, fraksi II, dan fraksi III. Ketiga fraksi ditentukan kadar protein dan aktivitasnya dengan metode Nelson’s dan Lowry untuk menentukan fraksi terbaik. Unit aktivitas rata-rata tiap fraksi adalah 24.462 Unit untuk fraksi I, 25.76 unit untuk fraksi II, 8.816 unit untuk fraksi III. Aktivitas spesifik fraksi I adalah 82.2575, fraksi 2 adalah 68.4620, dan fraksi III adalah 145.3834 unit/mg. Yield enzim sebesar 300.16 % sedangkan fold purification sebesar 1.7674. Nilai Km dan Vmaks
berturut-turut 0,231 µmol dan -0,146 µmol/menit. Berat molekul enzim yang paling mendekati standar BSA sebesar 56744.0 g/mol.
Kata kunci: enzim invertase, assay Nelson, metode Lowry, kinetika, SDS-PAGE.
Pendahuluan
Invertase atau β-fruktofuranosida fruktohidrolase merupakan enzim yang
mengkatalis ikatan antara molekul α-D-glukosa dan β-D-Fruktosa dari fruktosa
dengan cara menghidrolisisnya menjadi monosakarida-monosakarida glukosa dan
fruktosa (Barlikova et al. 1991). Enzim ini juga menhidrolisis β-fruktan seperti
rafinosa menjaedi gula-gula sederhana (Nakano et al. 2004). Pemanfaatan enzim
invertase banyak dilakukan dalam industri makanan dan minuman khususnya
pada pengolahan selai, permen, produk gula-gula, dan produksi asam laktat dari
fermentasi sirup tebu. Invertase digunakan untuk memproduksi etanol untuk
sumber karbon (Lee Huang 2000). Enzim ini juga digunakan dalam industri
farmasi, seperti pada obat tablet cerna, susu bubuk untuk bayi, dan makanan bayi
lainnya (Sanchez et al. 2001).
Invertase diproduksi oleh bakteri, fungi, tumbuhan tingkat tinggi, dan
beberapa sel hewan (Lee Huang 2000). Invertase tumbuhan mengkatalis hidrolisis
pemecahan ikatan pada sukrosa yang merupakan bentuk transport utama dari
karbohidrat pada tumbuhan tingkat tinggi. Sukrosa ditranspor dari jaringan
sumber (daun dewasa) melalui floem ke jaringan sink yang lain (akar, batang,
organ reproduksi, dan organ penyimpanan vegetatif) (Tymowska dan Kries 1998).
Enzim ini verperan dalam metabolisme karbohidrat tumbuhan karena dalam
vakuola sel tumbuhan terjadi reaksi pemecahan sukrosa dalam pembentukan
fruktan (Heldt dan Heldt 2005). Sukrosa merupakan produksi akhir asimilasi
karbon (C) pada proses fotosintesis yang terjadi di daun (Kim et al. 2000) dan
bentuk karbohidrat yang mudah ditransportasikan ke jaringan simpan atau sink
tissues (Cheng et al. 1996). Organ penting seperti buah atau umbi akan memiliki
aktivitas invertase yang tinggi. Hal ini ditunjukkan pada buah anggur yang akan
meningkat aktivitas invertasenya ketika mendekati maturasi buah (Alam et al.
2007).
Khamir yang kini diketahui menghasilkan dapat memproduksi enzim
invertase adalah Saccharomyces cerevisiae (Bokosa et al. 1992). Khamir ini
memiliki invertase di dinding selnya. Enzim ini akan menghidrolisis sukrosa
untuk memanfaatkan glukosa dan ftuktosa yang dihasilkan dari hidrolisisnya
(Amin et al. 2010). Enzim invertase yang dihasilkan oleh Saccharomyces
cerevisiae mempunyai aktivitas paling tinggi pada pH 4.5 dan temperature 30 oC
(Bergamasco et al. 2000). Straathof et al. (1986) merupakan orang pertama yang
melaporkan bahwa invertase dari Saccharomyces cerevisiae membentuk 6-kestosa
pada konsentrasi sukrosa tinggi (2.34 M, 800 g/L). Saccharomyces cerevisiae
banyak digunakan sebagai ragi dalam pembuatan roti.
Studi kinetika dan karakterisasi dari invertase ragi ini telah banyak
dilakukan. Pada praktikum ini dilakukan isolasi, purifikasi, studi kinetika, dan
karakterisasi enzim invertase ragi. Isolasi enzim dilakukan dengan menggunakan
metode presipitasi. Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan
metode Lowry sedangkan aktivitasnya diukur dengan menggunakan metode
Nelson’s. Bobot molekul enzim diukur menggunakan metode SDS-PAGE.
Metode Praktikum
Praktikum dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Departemen Biokimia
FMIPA IPB setiap hari Rabu tanggal 21 Februari-27 Maret 2012 pukul 10.00-
13.00 WIB.
Praktikum dilaksanakan dengan peralatan berupa mortar, sentrifus,
refrigerator Sorvall, rotor S5-34, pipet Pasteur, bulb, tabung sentrifus 50 mL,
inkubator, gelas ukur, gelas piala 100 mL dan 600 mL, magnetic stirer, tabung
reaksi bertutup, waterbath, vortex, spektrofotometer (UV-Vis), stopwatch,
mikropipet, dan seperangkat peralatan SDS-PAGE.
Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu ragi (Saccharomyces
cerevisiae), pasir (glassbead), toluena, akuades, asam asetat 1 N, parafilm, dan
amonium sulfat untuk isolasi invertase ragi. Bahan untuk penentuan aktivitas dan
kadar protein enzim invertase ialah glukosa 4 mM, fruktosa 4 mM, sukrosa 4 mM,
reagen Nelson, reagen arsenomolibdat, bufer asetat 0.2 M pH 4.5, bufer Tris HCl
0.05 M pH 7.3, reagen A (2% Na2CO3 dalam NaOH 0.1 N), reagen B (2.7% Na-
K-tartrat), reagen C (1% CuSO4 dalam H2O), reagen D (Folin Cioucalteu yang
telah diencerkan dengan air sampai 1 N dalam asam), dan fraksi enzim I-III. Studi
kinetika enzim invertase menggunakan bufer asetat 0.2 M pH 4.5, sukrosa 0.5 M,
akuades, reagen Nelson, glukosa 4 mM, dan fraksi terbaik. Prediksi bobot
molekul enzim invertase dengan SDS-PAGE menggunakan bahan berupa larutan
monomer, 4 x running gel bufer (1.5 M Tris-HCl pH 8.8), 4 x stacking gel bufer
(0.5 M Tris HCl pH 6.8), SDS 10%, amonium persulfat 10%, 2 x treatment bufer
(0.125 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% v/v gliserol, 0.2 M DTT, 0.02% bromphenol
blue pH 6.8), tank bufer (0.025 M Tris, 0.192 M glisin, 0.1% SDS pH 8.3), water-
saturated n-butanol, TEMED, standar BM protein campuran (marker), larutan
fiksasi (25% isopropanol, 10% asam asetat), dan larutan pewarna Commasie blue
(0.06 Commasie Blue G-250, 10% asam asetat).
Isolasi invertase ragi
Ekstraksi invertase ragi. Ekstraksi invertase ragi diawali dengan
dicampurkannya 5 g ragi, 2 g glass bead, dan secara perlahan 10 mL toluena
dalam mortar sambil digerus hingga terbentuk pasta. Kemudian ditambah 20 mL
akuades secara bertahap selama 30 menit sambil digerus. Selanjutnya isi mortat
tersebut dipindah dalam tabung sentrifugasi 50 mL dan disentrifus selama 15
menit 12.000 rpm. Lapisan air di tengah hasil sentrifugasi diambil secara hati-hati.
Ekstrak protein dikumpulkan dan diukur volumenya. Sebanyak 3 mL aliquot
diambil sebagai sampel ekstrak kasar (fraksi I). Sisa larutan dipindahkan dalam
tabung sentrifugasi 50 mL dan ditambah 3 tetes asam asetat 1 N.
Pemanasan ekstrak invertase ragi. Ekstrak diinkubasi pada suhu 50 0C
selama 30 menit. Selanjutnya ekstrak didinginkan segera dalam wadah es dan
disentrifugasi 15 menit 15.000 rpm. Volume supernatan diukur volumenya dan
diambil 2 mL aliquot (fraksi II).
Fraksinasi ekstrak invertase ragi. Fraksinasi pengendapan amonium
sulfat dibuat dengan dicampurkannya garam amonium sulfat dengan volume yang
berbeda hingga dicapai konsentrasi 20, 40, 60, dan 80%. Selanjutnya dilakukan
sentrifugasi selama 30 menit 30.000 g. Kemudian supernatan ditambah amonium
sulfat dengan berbagai konsentrasi tersebut dan disimpan pada suhu -20 0C.
sementara itu, endapan dilarutkan dengan bufer 0.05 M Tris-HCl pH 7.3 dan diuji
kadar aktivitasnya.
Uji aktivitas invertase ragi dengan assay Nelson
Pembuatan kurva standar. Sebanyak 8 tabung reaksi diisi masing-
masing dengan glukosa 4 mM sebanyak 0.02 mL, 0.05 mL, 0.1 mL, 0.15 mL, 0.2
mL, 0.25 mL, dan 0.3 mL untuk tabung 2-8. Sementara itu tabung reaksi pertama
digunakan sebagai blanko (1 mL akuades). Selanjutnya ditambahkan masing-
masing untuk tabung reaksi 2-8 akuades sebanyak 0.98 mL, 0.95 mL, 0.9 mL,
0.85 mL, 0.8 mL, 0.75 mL, dan 0.7 mL. Kemudian ditambahkan pada setiap
tabung reaksi 1 mL reagen Nelson dan didihkan dalam waterbath selama 20
menit. Saat dingin dicampurkan 1 mL reagen arsenmolibdat dengan vortex dan
disimpan selama 5 menit. Akhirnya ditambah dengan 1 mL akuades dan divortex
lalu dibaca pada %T pada 510 nm.
Uji aktivitas enzim invertase. Uji ini digunakan 8 tabung reaksi dan
masing-masing diisi dengan bufer asetat 0.2 M pH 4.5 sebanyak 0.2 mL kecuali
tabung 8. Selanjutnya ditambahkan H2O 0.6 mL pada tabung pertama, 0.55 mL
pada tabung 2,4, dan 6, dan 0.1 mL pada tabung 3,5, dan 7. Tabung terakhir berisi
0.8 mL H2O dan 0.2 mL glukosa 4 mM. Untuk tabung 2-7 diisi fraksi secara
berurutan 0.05 mL dan 0.5 mL. Tabung 2 dan 3 merupakan fraksi I, tabung 4 dan
5 diisi dengan fraksi II, dan tabung 6 dan 7 adalah fraksi III. Kemudian mulai
assay dengan penambahan 0.2 mL sukrosa 0.5 M pada setiap tabung dan prosedur
selanjutnya dilakukan seperti pembuatan kurva standar.
Penentuan kadar protein dengan metode Lowry
Pembuatan kurva standar. Sebanyak 10 tabung reaksi diisi secara
berurutan dengan standar BSA (400 µg/ml) 0.05 mL-0.45 mL (interval 0.05 mL)
kecuali tabung pertama. Kemudian setiap tabung ditambah H2O 0.5 mL-0.05 mL
(interval 0.05 mL). Percobaan dilanjutkan dengan ditambahkannya masing-
masing reagen A 4.9 mL, reagen B 0.05 mL, dan reagen C 0.05 mL lalu divortex
dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah 10 menit, ditambahkan
0.5 mL reagen D pada setiap tabung dengan interval waktu 30 detik untuk
ditambahkannya reagen D pada tabung berikutnya. Semua tabung diinkubasi pada
suhu ruang selama 30 menit dan dibaca pada A700.
Pengukuran kadar protein enzim invertase. Sebanyak 7 tabung reaksi
disiapkan untuk fraksi I dan II yang telah diencerkan dahulu dengan air (1:4).
Tabung 2-4 diisi dengan fraksi I sedangkan tabung 5-7 diisi fraksi II sebanyak
0.05 mL, 0.2 mL, dan 0.5 mL. Selanjutnya ditambahkan H2O hingga volume 0.5
mL. Kemudian prosedur dilanjutkan dengan metode Lowry dalam pembuatan
kurva standar protein. Sementara itu untuk fraksi III disuspensi dalam bufer Tris
dengan pengenceran air (1:1). Tabung reaksi 1-3 diisi dengan bufer Tris 0.5 M
sedangkan tabung 4-6 diisi fraksi tiga dengan volume sama yakni 0.05 mL, 0.2
mL, dan 0.5 mL. Akhirnya setiap tabung diisi dengan H2O hingga volume 0.5 mL
dan prosedur mengikuti metode Lowry dalam pembuatan kurva standar protein.
Studi kinetika enzim invertase
Pengaruh konsentrasi substrat pada aktivitas invertase. Tabung reaksi
1-8 diisi dengan 0.2 ml bufer asetat 0.2 M pH 4.5. Kemudian ditambahkan
sukrosa 0.5 M sebanyak 0.02 mL-0.4 mL (interval 0.02 mL) pada tabung 2-8.
Tabung 2-8 kemudian ditambah dengan H2O hingga volume 0.9 mL sedangkan
tabung 9 dan 10 diisi dengan 1 mL dan 0.8 mL. Semua tabung reaksi diinkubasi
pada suhu ruang selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan ditambahkannya 1
mL reagen Nelson pada semua tabung. Lalu ditambahkan fraksi terbaik pada
tabung 1-8 sebanyak 0.1 mL sedangkan tabung 10 ditambah dengan 0.2 mL
glukosa 4 mM. Selanjutnya tabung ditutup dan diletakkan pada air mendidih
selama 20 menit. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 510 nm.
Prediksi bobot molekul enzim invertase
Pembuatan gel. Semua bahan untuk running gel dicampur dan diaduk
dengan magnetik stirer kecuali amonium persulfat dan TEMED. Bahan tersebut
berupa larutan monomer, 4 x running bufer, 10% SDS, ddH2O dengan berbagai
volume. Amonium persulfat dan TEMED ditambah perlahan agar tidak terbentuk
gelembung udara. Campuran lalu dimasukkan dalam plat kaca hingga diperoleh
ketebalan 4 cm. Selanjutnya ditambah dengan n-butanol pada permukaannya. Saat
gel membeku, n-butanol dibuang dan gel dibilas dengan 1 mL running gel
overlay. Akhirnya dibuat delapan sumur dengan sisir.
Elektroforesis SDS-PAGE. Sampel protein dicampur dengan 2 x
treatmen bufer dalam ependorf dan didihkan selama 90 detik. Sampel disimpan
pada 0 0C hingga siap digunakan. Sampel protein dan standar dimasukkan dalam
sumur gel dengan pipet mikro. Sistem elektroforesis dilakukan pada 50 volt.
Pewarnaan standar. Gel disimpan dalam larutan fiksasi pewarnaan cepat.
Kemudian gel digoyang perlahan selama 15 menit dan larutan pewarna diganti
dengan commasie blue. Lalu gel digoyang perlahan selama 24 jam hingga protein
pita terlihat. Larutan pewarna diganti dengan larutan destaining II hingga latar
belakang jernih. Hasilnya disimpan dalam asam asetat 7% atau ddH2O.
Hasil dan Pembahasan
Isolasi Invertase Ragi. Ragi roti digunakan sebagai sumber enzim
invertase karena ragi banyak mengandung Saccharomyces cereviseae. Tahapan
isolasi yang dilakukan melalui tiga tahap, yaitu isolasi, perlakuan terhadap
pemanasan, dan fraksinasi. Isolasi enzim invertase dilakukan dengan cara
memecah selnya terlebih dahulu menggunakan cara mekanik, yaiut solid shear
mechanic. Metode ini dilakukan dengan cara menggerus sel (tanaman, khamir,
atau bakteri) bersama pasir kuarsa steril. Solid shear tidak digunakan untuk
memecah sel mikroorganisme karena selnya terlalu kecil (Bintang 2010).
Pemecahan sel dilakukan karena enzim invertase merupakan enzim intraseluler.
Enzim ini berada pada lapisan dinding sel khamir (Amin et al. 2010). Ekstrak
toluene digunakan sebagai pelarut untuk mengekstrak enzim invertase. Fraksi I
yang diperoleh dari ekstraksi toluene merupakan ekstrak kasar enzim. Pemisahan
enzim dilakukan dengan cara disentrifuse dengan kecepatan 12000 rpm selama 15
menit. Hal ini berguna untuk memisahkan pecahan dinding dinding sel dari
supernatanya. Prinsipnya yaitu didasarkan pada berat molekul dengan
menggunakan gaya sentrifugal. Berat molekul yang ringan akan berada diatas dan
yang berat berada di bawah (Koolman 2000). Setelah disentrifuse, supernatan
didekantasi dari residu/pecahan dinding-dinding sel, maka hasil yang diperoleh
berupa ekstrak kasar enzim invertase yang berwarna cokelat pada lapisan toluene.
Berdasarkan komposisi tersebut maka jumlah ekstrak kasar enzim invertase yang
diperoleh sebesar 15.74 gram
Penentuan aktivitas dan kadar protein enzim invertase. Penentuan
aktivitas enzim ditentukan dengan menggunakan metode Assay Nelson dengan
prinsipnya yaitu pengukuran jumlah gula pereduksi. Pada metode ini aktivitas
enzim invertase ditunjukan oleh bertambahnya produk reaksi (glukosa dan
fruktosa) atau berkurangnya substrat (fruktosa/ satuan waktu). Kedua
monosakarida yang merupakan gula pereduksi akan bereaksi dengan reagen
Nelson’s dan warna biru yang terbentuk dapat diukur pada panjang gelombang
510 nm (Perumalla 1994).
Penambahan reagen Nelson berguna sebagai pewarna dan selanjutnya
segera dipanaskan untuk memperjelas warna yang dihasilkan (Elok dan Surya
2010). Reagen Nelson berisi ZnSO4, Ba(OH)2, dan pereaksi tembaga alkali
(Bintang 2010). Hasil penambahan kemudian didinginkan sehingga diperoleh
padatan berwarna biru hingga biru kehijauan. Semakin tinggi konsentrasi gula
invert maka warna hijau semakin dominan. Penambahan arsenomolibdat betujuan
untuk melarutkan padatan yang terbentuk sehingga warna biru semakin pekat.
Warna yang terlalu pekat dapat dikurangi dengan penambahan akuades.
Nilai absorbansi yang diperoleh sebanding dengan jumlah gula pereduksi
yang dihasilkan dan dinyatakan sebagai konsentrasi glukosa pada tabel 1. Standar
yang digunakan dalam assay Nelson’s ini adalah glukosa. persamaan garis Y =
0.119x - 0.197 dengan R2 = 0.969 (Gambar 1), melalui persamaan garis ini dapat
ditentukan konsentrasi gula invert yang terbentuk. Nilai R2 = 0.969 setara dengan
96.9% atau mendekati 1, hal ini menunjukkan kelinieran kurva tersebut.
0
0.0800000000000002 0.2 0.4
0.600000000000001 0.8 1 1.20
0.2
0.4
0.6
0.8f(x) = 0.119880952380953 x − 0.197464285714286R² = 0.969567863640752
Gambar 1 Kurva standar pengukuran kadar glukosa
Aktivitas enzim dinyatakan dalam istilah unit (U). Satu unit adalah sejumlah
enzim yang mengkatalisis konversi dari 1 mikromol substrat per unit dalam
kondisi normal. Pada beberapa kasus, ukuran unit terlalu besar, sehingga sesuai
digambarkan dalam ketentuan nmol/menit atau pmol/menit. Unit satuan
internasional (SI) untuk aktivitas enzim adalah katal (kat) yang diwakili oleh
perubahan dari 1 mol substrat per detik. Unit ini besar dan lebih dapat dihitung
sehingga didapatkan gambaran aktivitas enzim yang dinyatakan dalam
mikrokatal, nanokatal, dan pikokatal. Kemurnian suatu enzim didasarkan pada
aktivitas spesifik yaitu sejumlah unit enzim per milligram protein. Aktivitas
spesifik dalam unit SI diperoleh berdasarkan katal molaritasnya, yaitu sejumlah
substrat yang dapat diubah dalam satu menit oleh satu molekul enzim dalam
keadaan optimal. Aktivitas molar dari katalase, misalnya dalam kisaran 5 x 106
(Bintang 2010).
Banyaknya produk yang terbentuk atau berkurangnya suatu substrat
merupakan salah satu pengujian aktifitas enzim invertase. Berdasarkan data tabel
2 dapat terlihat bahwa konsentrasi glukosa rata-rata tertinggi (pada tabel 3)
dihasilkan oleh fraksi I. Konsentrasi glukosa yang paling tinggi juga terdapat pada
fraksi I (0.5 mL ) yakni sebesar 12.2521 µmol. Rendahnya aktivitas enzim
invertase pada fraksi II dan III karena pada fraksi II dilakukan pemisahan fraksi
dengan pemanasan yang kemungkinan merusak enzim sedangkan fraksinasi fraksi
III dilakukan dengan menambahkan garam amonium terlebih dahulu yang dapat
mengganggu aktivitas enzim. Sedangkan fraksi I hanya dimurnikan dengan
sentrifugasi sehingga aktivitas enzim kemungkinan masih lebih tinggi dibanding
dua fraksi lainnya.
Tabel 2 Hasil pengukuran uji aktivitas enzim invertase
Tabung Absorbansi (A) [glukosa] (µmol)Blanko 0,000 0
Fraksi I (0,05 mL) 0,287 4,0672Fraksi I (0,5 mL) 1,261 12,2521
Fraksi II (0,05 mL) 0,015 1,7815Fraksi II (0,5 mL) 0,244 3,7059
Fraksi III (0,05 mL) -0,015 1,5294Fraksi III (0,5 mL) 0,081 2,3361Standar glukosa I -0,100 0,8151Standar glukosa II 0,097 2,4706
Berdasarkan perhitungan unit aktivitas enzim invertase tertinggi yakni
fraksi I (0.05 mL) sebesar 40.672 unit, dan rataan aktivitas tiap fraksi dengan data
tertinggi adalah fraksi I yakni sebesar 26.462 unit, fraksi II sebesar 25.76 unit dan
fraksi III sebesar 8.861 unit (tabel 3). Aktivitas enzim umumya didefinisikan
dalam satuan unit. Untuk enzim invertase, satu unit enzim artinya enzim tersebut
akan menghidrolisis 1.0 μmol sukrosa menjadi gula invert (glukosa dan fruktosa)
dalam waktu satu menit pada pH 4.5 dan suhu 55°C (Watiyasita L. 2011)
Tabel 3 Data uji aktivitas enzim invertase
Sampel[glukosa] (µmol)
Faktor Pengenceran
Unit Enzim(unit/mL)
Unit Aktivitas (unit)
Rataan (unit)
Fraksi I (0,05 mL) 4,0672 5 4.0672 40.67226.462
Fraksi I (0,5 mL) 12,2521 5 1.2252 12.252Fraksi II (0,05 mL) 1,7815 5 1.7815 17.815
25.76Fraksi II (0,5 mL) 3,7059 5 3.3705 33.705
Fraksi III (0,05 mL) 1,5294 5 1.5294 15.2968.816
Fraksi III (0,5 mL) 2,3361 5 0.2336 2.336Standar glukosa I 0,8151 - - - -Standar glukosa II 2,4706 - - - -
Pengukuran kadar protein invertase dilakukan dengan menggunakan
metode Lowry. Kandungan protein yang diukur dalam penelitian ini adalah
protein terlarut dan protein total. Metode Lowry didasarkan pada reaksi Biuret dan
reduksi reagen arsenomolibdat menghasilkan warna biru (Hasanah Putra 2010).
Reduksi cupritartat dan reaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu yang menghasilkan
perubahan warna biru dapat diukur dengan nilai absorbansinya pada panjang
gelombang 750 nm (Harisha 2007). Metode Lowry-Folin hanya dapat mengukur
molekul peptida pendek dan tidak dapat mengukur molekul peptida panjang
(Alexander & Griffiths 1992). Standar yang digunakan adalan BSA. Pembuatan
kurva standar pengukuran konsentrasi protein dilakukan dengan menggunakan
standar Bovine Serum Albumin (BSA), akuades, dan reagen pada berbagai volume
yang berbeda. Doolittle (1995) menyatakan bahwa inkubasi pada suhu ruang
dilakukan sebagai upaya optimalisasi reaksi sehingga warna yang terbentuk
semakin optimal untuk meminimalisasi kesalahan percobaan.
Kurva yang dihasilkan memiliki kelinearan yang cukup baik dengan
persamaan garis y = 0.057x - 0.058 R² = 0.966. Penggunaan BSA sebagai standar
karena sifatnya yang relatif stabil sehingga warna yang ditimbulkannya sebagai
akibat pembentukan kompleks koordinasi antara logam Cu2+ dengan atom
nitrogen pada rantai peptida akan bertahan secara stabil dalam waktu relatifnya
tersebut (Hartree 1972).
Gambar 1 Reaksi Lowry
0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
f(x) = 0.0571575757575758 x − 0.0580666666666666R² = 0.966564288428974
Gambar 2 Kurva standar pengukuran kadar protein
Tabel 5 menunjukkan konsentrasi protein yang diperoleh dari masing-
masing fraksi perlakuan isolasi yang berbeda. Fraksi 1 merupakan ekstrak kasar
dari toluene sehingga seharusnya memiliki konsentrasi protein yang lebih banyak
daripada fraksi lain karena dalam ekstrak kasar dimungkinkan adanya protein lain
sebagai pengotor yang ikut bereaksi dengan reagen Lowry.
Rataan terbanyak ditunjukkan oleh fraksi I (tabel 6). Namun, meski kadar
total protein fraksi I yang paling besar, pada percobaan kami tidak
menggunakannya untuk menentukan kinetika enzim. Hal ini berdasarkan alasan
bahwa kemungkinan besar protein yang terukur pada fraksi I bukan murni berasal
dari enzim invertase melainkan disebabkan adanya komponen sel lain yang masih
bercampur dengan enzim. Karena alasan tersebut, fraksi yang digunakan adalah
fraksi III yang menunjukkan rataan aktivitas spesifik paling tinggi (Tabel 7).
Hasil pengukuran kadar protein tiap fraksi menunjukkan hasil yang
beragam. Nilai absorbansi tertinggi diperoleh pada fraksi I (0.50 mL) yakni 0.371
dengan nilai konsentrasi enzim 7.5263 µg/mL (tabel 5). Hal ini dapat terjadi
karena fraksi I belum mengalami pemanasan dan penambahan ammonium sulfat,
sehingga ikatan peptidanya belum ada yang rusak.
Tabel 5 Hasil pengukuran kadar protein invertase
Tabung Absorbansi [enzim] (µg/mL)Fraksi I 0,05 mL 0,082 2,4561Fraksi I 0,20 mL 0,185 4.2631Fraksi I 0,50 mL 0,371 7.5263Fraksi II 0,05 mL -0,004 0.9474Fraksi II 0,20 mL 0,054 1.9649Fraksi II 0,50 mL 0,168 3.9649Fraksi III 0,05 mL -0,031 0.4737Fraksi III 0,20 mL 0,044 1.7895Fraksi III 0,50 mL 0,044 1.7895
Protein total merupakan pengukuran kandungan nitrogen (N) dalam
sampel. Oleh karena itu, terdapat senyawa non-protein yang ikut terdeteksi dan
terkalkulasi. Namun, interferensi ini relatif kecil dan dapat diabaikan. Berdasarkan
rataan total protein diperoleh fraksi I memiliki nilai tertinggi yakni sebesar 0.321
mg, fraksi II sebesar 0.134 mg dan fraksi III sebesar 0.057 mg (tabel 6).
Tabel 6 Data total protein
Sampel [Enzim] (
µg/mL)
FP [enzim] terkoreksi (mg/mL)
Total protein (mg)
Rataan (mg)
Fraksi 1 0.05 mL 2,4561 5x 0.0491 0.491 0.321Fraksi 1 0.5 mL 7.5263 5x 0.0150 0.150Fraksi 2 0.05 mL 0.9474 5x 0.0189 0.189 0.134Fraksi 2 0.5 mL 3.9649 5x 0.0079 0.079Fraksi 3 0.05 mL 0.4737 5x 0.0095 0.095 0.057Fraksi 3 0.5 mL 1.7895 5x 0.0018 0.018
Aktivitas spesifik enzim tidak menunjukkan kinerja enzim yang spesifik
dalam mengkatalisis reaksi. Aktivitas spesifik enzim merupakan perbandingan
rataan unit enzim dengan konsentrasi protein terkoreksi.Semakin tinggi
konsentrasi protein maka aktivitas spesifik semakin rendah artinya banyak
terdapat kontaminan yang mengganggu perubahan sukrosa menjadi produk.Yield
enzim merupakan perbandingan antara total unit dalam fraksi yang dimurnikan
dengan total unit dalam ekstrak kasar sedangkan fold purifcation merupakan
perbandingan antara aktivitas spesifik dari fraksi yang dimurnikan dengan
aktivitas spesifik ekstrak kasar. Teller (1950) mengemukakan bahwa enzim yang
diinginkan sebagai sumber substrat dalam reaksi adalah yang memiliki aktivitas
tinggi sehingga dapat menyediakan kondisi optimum dalam membuat produk
(lebih cepat). Percobaan ini menghasilkan yield enzim sebesar 300.16 %
sedangkan fold purification sebesar 1.7674 Enzim dalam percobaan diharapkan
memiliki fold purification yang tinggi sehingga juga memiliki aktivitas tinggi
dalam perubahan substrat secara spesifik (Polaina dan McCabe 2007).
Tabel 7 data aktivitas spesifik enzim
Tabung Unit enzim (unit/ml)
[enzim] terkoreksi (mg/mL)
Aktivitas spesifik
(unit/mg)
Rataan (unit/mg)
Fraksi 1 0.05 mL
4.06720.0491 82.8350
82.2575Fraksi 1 0.5 mL 1.2252 0.0150 81.68
Fraksi 2 0.05 mL
1.78150.0189 94.2593
68.4620Fraksi 2 0.5 mL 3.3705 0.0079 42.6646
Fraksi 3 0.05 mL
1.52940.0095 160.989
145.3834Fraksi 3 0.5 mL 0.2336 0.0018 129.7778
Studi Kinetika Eznim Invertase (Penentuan Kinetika Enzim) Variabel
kinetika enzim merupakan salah satu tahapan penentuan dan identifikasi enzim
yang penting. Variabel kinetika enzim terdiri atas nilai Km dan Vmaks. Nilai Km
menunjukkan derajat afinitas suatu enzim terhadap substrat. Nilai Km merupakan
konsentrasi substrat saat kecepatan maksimum enzim dicapai. Penentuan kinetika
enzim dilakukan pada fraksi terbaik enzim, yaitu fraksi I. Sejumlah sampel
percobaan disiapkan sebagai blanko, sampel yang diukur dan standar sukrosa.
Blanko terdiri atas bufer asetat 0.2 M (pH 4.5), sukrosa 0.5 M, air dan fraksi
terbaik enzim (fraksi I), sedangkan sampel yang diukur berisi bufer asetat 0.2 M
(pH 4.5), sukrosa 0.5 M, air dan fraksi enzim terbaik pada interval. Sedangkan
standar sukrosa terdiri atas air dan sukrosa. Semua tabung dicampur dengan
reagen Nelson’s pada saat pengukuran akan dilakukan. Reagen Nelson’s berfungsi
untuk membentuk senyawa kompleks berwarna antara enzim invertase dan reagen
Nelson’s yang membentuk larutan berwarna ungu (Harjadi 1986). Pengukuran
konsentrasi enzim invertase dilakukan pada panjang gelombang 510 nm karena
larutan yang diukur berwarna ungu dengan kuning hijau sebagai warna
komplementer yang menyerap warna radiasi sinar yang dipancarkan saat
pengukuran berlangsung (Bintang 2010). Pengukuran konsentrasi substrat
dilakukan secara stoikiometri menggunakan konsentrasi sukrosa (500 mM),
volume sukrosa (pada berbagai tingkat konsentrasi) dan volume total (1 mL).
Sedangkan pengukuran nilai Vo dilakukan dengan pembagian konsentrasi glukosa
tiap sampel percobaan terhadap waktu inkubasi (10 menit). Hasil perhitungan
tersebut digunakan untuk menentukan nilai Vmaks dan Km.
Menurut Whitaker (1996), nilai Vmaks dan Km dalam studi kinteika
umumnya ditentukan dengan menggunakan persamaan Lineweaver Burk.
Persamaannya yaitu 1/Vo = 1/Vmaks + (Km/ Vmaks). 1/[S] dengan y = 1/V dan x
= 1/[S]. Kemiringan garis pada persamaan ini banyak dipengaruhi oleh aktivitas
pengukuran substrat pada konsentrasi rendah dan kenyataannya ketepatan yang
didapat ternyata sangat rendah. Alternatif plot lainnya adalah [S]/ Vo terhadap [S]
dan plot ini lebih disukai karena ketelitianya lebih tinggi dari persamaan
Lineweaver Burk (Bintang 2010).
Km (tetapan Michaelis-Menten), yaitu suatu konsentrasi substrat bila
kecepatan reaksi enzimatis telah mencapai setengah deari kecepatan maksimum.
Nilai Km digunakan selain sebagai ukuran afinitas E-S juga berhubunga dengan
tetapan keseimbangan disosiasi kompleks E-S menjadi E. Menurut Fayyaz (1995),
bila nilai Km kecil berarti kompleks E-S mantap dan afinitas enzim terhadap
substrat tinggi, sednagkan bila nilai km besar afinitasnya menjadi rendah. Harga
Km enzim sangat bervariasi tergantung dari jenis substrat, keadaan lingkungan
dan kekuatan ion.
Berdasarkan hasil perhitungan, persamaan Lineweave-Burk yaitu y = -
0.006x + 0.057 Nilai Vmaks dan Km dapat diperoleh dari persamaan tersebut
berturut-turut 17.5438 µmol/menit dan 0.1053 µmol. Nilai Vmaks sebesar 17.5438
µmol/menit menunjukkan bahwa enzim invertase dapat menghidrolisis sukrosa
menjadi glukosa dan fruktosa sebanyak 17.5438 µmol setiap menit. Nilai Km
sebesar 0.1053 µmol menunjukkan bahwa enzim invertase akan aktif setelah
substrat berupa sukrosa sudah mencapai konsentrasi sebesar 0.1053.
Percobaan kali ini menggunakan persamaan Michaelis Menten dan
Lineweaver-Burk (Gambar 3). Kurva Michaelis Menten yaitu y = 0.231x - 0.146
R² = 0.916, sedangkan kurva Lineweaver Burk y = -0.006x + 0.057, R² = 0.212.
Hasil pengukuran berdasarkan dua metode tersebut memberikan nilai Km dan
Vmaks yang berbeda. Metode Michaelis-Menten memberikan nilai nilai Km =
0,231 µmol dan nilai Vmaks = -0,146 µmol/menit sedangkan metode Lineweaver-
Burk memberikan nilai Vmaks = 17,5438 µmol/menit dan Km = 0,1053 µmol. Nilai
Km yang baik ditunjukkan oleh metode Lineweaver-Burk, yaitu nilai terkecil.
Namun jika dilihat berdasarkan nilai R2, perhitungannya Michaelis-Menten dapat
lebih dipercaya karena kurva Michaelis-Menten menunjukkan nilai terbaik yakni
mendekati 1.
Tabel 8 Hasil analisis kinetika enzim invertase
Tabung Absorbansi V0
(µmol/menit)[substrat]
(mM)1/V0
(menit/µmol)1/[substrat]
(1/mM)1 0,000 0,1655 0 6,0423 ∞2 0,054 0,2109 10 4,7416 0,1003 0,683 0,7395 20 1,3523 0,0504 0,340 0,4513 30 2,2158 0,0335 1,023 1,0252 40 0,9754 0,025
6 1,444 1,3790 50 0,7252 0,0207 1,695 1,5899 100 0,6290 0,0108 1,710 1,6025 200 0,6240 0,005
0 10 20 30 40 50 100 2000
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
f(x) = 0.231504761905 x − 0.146296428571R² = 0.916569238751952
[substrat] (mM)
V0(µmol/menit)
6.0423
4.7416
1.3523
2.2158
0.9754
0.7252
0.6290
0.6240
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
f(x) = − 0.006107142857143 x + 0.057857142857143R² = 0.212898716389874
1/[substrat]
1/V0
Gambar 3 Kurva Michaelis-Menten dan Lineweaver-Burk
Prediksi Bobot Molekul Enzim Invertase. Penentuan bobot molekul
enzim invertase menggunakan metode SDS-PAGE. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl
Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis) merupakan salah satu metode PAGE
yang umum digunakan untuk analisis campuran protein secara kualitatif. Prinsip
penggunakan metode ini adalah migrasi komponen akrilamida dengan N,N-
bisakrilamida. Partikel-Partikelnya tersebut berfungsi sebagai saringan molekul
sehingga konsentrasi atau rasio akrilamida dengan bisakrilamida dapat diatur
dengan mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein elain untuk
memurnikan protein (Wilson 1994). Selain untuk pemisahan protein, metode ini
dapat digunakan untuk pemisahan asam nukleat berdasarkan muatan molekul,
ukuran dan massa molekul, dan kekuatan medan listrik (Wenk dan Fernandes
2007).
SDS-PAGE dilakukan terhadap protein tak larut dengan kekuatan ion
rendah dan dapat digunakan untuk menentukan suatu protein termasuk
monomerik atau oligometrik, menetapkan berat molekul dan jumlah rantai
polipeptida sebagai subunit atau monomer. Penggunaan SDS-PAGE bertujuan
untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisis. Protein yang
terdenaturasi sempurna akan mengikat SDS dalam jumlah yang setara dengan
berat molekul protein tersebut (Dunn 1989). SDS merupakan deterjen anionik
yang mendenaturasi protein dengan berikatan pada tulang punggung
polipeptidanya. Hal ini mengakibatkan molekul protein menjadi bermuatan
negatif (Wenk dan Fernendes 2007).
SDS-Page terdiri dari dua bagian yaitu bagian stacking dan resolving gel.
Bagian stacking gel bergungsi untuk menyamakan start dari protein yang
dirunning pada SDS-PAGE, sedangkan bagian resolving gel berfungsi untuk
pemisahan protein. Bagian resolving gel merupakan bagian yang pertama
disiapkan dalam membuat SDS-PAGE. Komposisinya yaitu akrilamida, tris-HCL
pH 8.8, SDS 10%, APS (Ammonium persulphate) 10% (disiapkan dalam keadaan
segar), TEMED(N,N,N,N-tetramethylethylenediamine), dan aquades. Semua
bahan tersebut dicampur menjadi satu dengan urutan sebagai berikut : aquades,
akrilamida, tris-HCL, SDS, APS, dan terakhir TEMED. Penambahan APS dan
TEMED berfungsi sebagai penginisiasi polimerasi dari akrilamida menjadi
poliakrilamida. Semua bahan yang telah dicampur tersebut dimasukan ke dalam
cetakan SDS-PAGE. Untuk membuat permukaan resolving gel menjadi rata maka
setelah dimasukkan ke dalam cetakan ditambahkan sejumlah n-butanol pada
bagian permukaannya hingga semua bagian cetakan yang tersisa penuh oleh n-
butanol.
Stacking gel ditambahkan pada resolving gel setelah resolving gel
memadat atau membeku. Komposisi dari stacking gel sama dengan komposisi
resolving gel hanya berbeda pada jumlah tiap komponennya. Semua bahan
dicampur dengan urutan seperti pada bagian resolving. Setelah dicampur, bahan
tersebut dimasukkan ke dalam cetakan dibagian permukaan resolving gel hingga
semua bagian cetakan yang tesisa dipenuhi oleh stacking gel. Lalu dibiarkan
hingga membeku.
Persiapan sampel dilakukan dengancara memanaskan sampel protein
untuk mendenaturasi protein enzim sehingga struktur protein tersier akan rusak
membentuk polipeptida struktur primer. Setelah dipanaskan, sampel tersebut
dipipet dan dimasukan ke dalam sumur pada bagian stacking gel yang sebelumnya
gel SDS-PAGE tersebut direndam dalam buffer. Setelah dirunning, gel direndan
dalam Coomassie Briliiant Blue untuk mewarnai (staining) pita-pita protein yang
terbentuk selama lebih dari 2 jam dengan terus digoncang menggunakan shaker
agar terwarnai dengan baik. Pewarna ini akan berikatan dengan semua jenis
protein. Setelah proses staining, dilanjutkan dengan proses destaining untuk
menghilangkan sisa-sisa Coomassie Brilliant Blue yang tidak berikatan degnan
protein menggunakan larutan campluran methanol dan asam asetat sehingga pita-
pita protein yang terwarnai terlihat jelas. Gel direndam dalam larutan destaining
hingga warna biru gelnya hilang.
Berdasarkan hasil percobaan diperoleh data nilai Rf seperti pada tabel 9.
Hasil tersebut menunjukkan bahwa hasil elektroforesis dengan jarak Rf terjauh
adalah meja 7 fraksi 1 sebesar 0.175. Hal lain yang bisa dibandingkan adalah
hanya meja 7 fraksi 1 saja yang menghasilkan 3 pita sekaligus menunjukkan
bahwa hasil pemurnian belum terlalu baik. Hal ini sesuai dengan tabel 6, yaitu
jumlah protein total terbanyak diperoleh dari fraksi I Perbedaan nilai Rf
disebabkan karena keterbatasan pengamatan yang disebabkan kecilnya ukuran
pita yang terbentuk. Hasil elektroforesis SDS-PAGE dapat diamati dari gambar 4.
Tabel 9 Hasil pengukuran berat molekul (BM) protein sampel
Sampel Jarak pita (cm) Jarak gel (cm) RfFraksi 5 pita 1 0.6 5.7 0.105Fraksi 6.1 pita 1 0.5 5.7 0.087Fraksi 6.2 pita 1 0.7 5.7 0.122Fraksi 6.3 pita 1 0 5.7 0.000Fraksi 7.1 pita 1 0.4 5.7 0.070Fraksi 7.1 pita 2 0.7 5.7 0.122Fraksi 7.1 pita 3 1.0 5.7 0.175Fraksi 7.2 pita 1 0.7 5.7 0.122Fraksi 7.3 pita 1 0 5.7 0.000
Gambar 4 Hasil elektroforesis SDS PAGE.Sampel 7.3, 5, 6.1, 6.2, marker, 6.3, 7.1, 7.2 (dari kiri ke kanan)
Simpulan
Isolasi, purifikasi, kinetika, dan karakterisasi enzim invertase dapat
dilakukan dengan melakukan tahapan awal terlebih dahulu dengan mengisolasi
dan purifikasi ragi (mikroorganisme penghasil enzim invertase). Pengukuran
aktivitas enzim invertase dan kadar protein menentukan tingkat kemurnian dari
suatu protein yang merupakan fraksi terbaik dari pengukuran tersebut. Fraksi
terbaik dapat digunakan untuk uji kinetika enzim dan karakterisasi dengan
menggunakan metode elektroforesis SDS PAGE untuk melihat hasil yang terbaik
dan optimal sehingga data yang diperoleh akurat. Berdasarkan percobaan yang
telah dilakukan enzim dengan total protein terbesar dihasilkan oleh fraksi I yakni
0.321 mg. Sedangkan aktivitas spesifik terbesar dihasilkan oleh fraksi III sebesar
145.3834 unit/mg. Yield enzim sebesar 300.16 %, sedangkan fold purification
sebesar 1.7674. Nilai Km dan Vmaks berturut-turut 0,231 µmol dan -0,146
µmol/menit. Hal ini terlihat dari persamaan garis Kurva Michaelis Menten yaitu y
= 0.231x - 0.146, R² = 0.916, sedangkan kurva Lineweaver Burk y = -0.006x +
0.057, R² = 0.212. Bobot molekul yang paling mendekati standar BSA sebesar
56744.0 g/mol.
Daftar PustakaAcosta N, Beldarrain A, Alonso Y. 2000. Characterization of recombinant
invertase expressed in methylotropic yeasts Biotechnology and Applied Biochemistry 32: 179-187.
Alexander RR dan Griffiths JM. 1992. Basic Biochemical Methods. New York: Wiley-Liss.
Amin F, Bhatti HN, dan Asgher M. 2010. Partial purification and characterization of an acid invertase from Saccharum offinarium L. Pak. J. Bot., 42(4): 2531-2540.
Barlikova A, Svorc, Miertus. 1991. Invertase for inverted syrup production and
sugar determination. Anal. Chim. Acta., 247 ; 83-87.
Bergamasco R, Bassetti FJ, Moraes FF, Zanin GM. 2000. Characterization of free and immobilized invertase regarding acrivity and energy of activation. Brazilian Journal of Chemical Engineering 17 :873-880.
Berggren K et al. 2000. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21: 2509-2521.
Bokosa I, Krastanov, Roshkova. 1992. Invertase biosynthesis by Saccharomyce cerevisiae. Nauchni. Tr. J., 39: 269-279.
Bintang M. 2010. Teknik Penelitian Biokimia. Jakarta: Erlangga.
Cheng, WH, Im KH, Chourey PS. 1996. Sucrose phosphate synthase expression at the cell and tissue level is coordinated with sucrose sink’tosource transitions in maize leaf. Plant Physiol 111 : 1021-1029.
Doolittle RF. 1995. The multiplicity of domains in protein. Annu Rev Biochem. 64: 287-314.
Dinu D. 2001. Enzymatic hydrolysis of pectic acid and pectins by polygalacturonase from Aspergillus niger. Roum Biotechnol. 6: 397-402.
Dunn MJ. 1989. Determination of Total Protein Concentration. Diacu dalam : Protein Methods. Harris, ELV dan S Angal. Editor. Oxford: IRL Pr.
Elok NIH dan Surya RP. 2010. Karakterisasi ekstrak kasar enzim invertase yang diamobilisasi dengan Na-alginat. Skripsi. Fakultas Matematika dan IPA, Institut Teknologi Sepuluh November. Surabaya.
Fayyaz A et al. 1995. Kinetics of papaya pectinesterase. Jurnal of Food Chemistry 53 : 129-135.
Hames BD dan Rickwood. 1990. A Practical Approach: Gel elektrophoresis protein. Huntington: Robert E Krieger Pub.
Hartree EE. 1972. Determination of protein: a modification of the Lowry method that gives a linear photometric response. Anal. Biochem. 48:422-427.
Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: Mc Graw Hill.
Held, Heldt. 2005. Plant Biochemistry. San Diego: Elsvier Academic Pr.s
Heger A dan Holm L. 2000. Rapid automatic detection and alignment in protein sequences. Protein. 41: 224-237.
Lee WC dan Huang CT. 2000. Modelling of ethanol production using Zymomonas mobilis ATTC 10988 grown on the media containing glucose and fructose. Biochemical Engineering Journal. 4: 13-16.
Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid ke-1. Maggy Thenawidjaja; penerjemah. Terjemahan dari: Principles Of Biochemistry. Erlangga: Jakarta.
Marks DB et al. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar: sebuah pendekata klinis. Pendit BU, penerjemah; Suyono J, editor. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Basic medichal biochemistry: a clinical approach.
Olson dan Markwell. 2007. Assay for determination of protein concentration. New York: John Wiley & Sons.
Polaina J dan McCabe AP. 2007. Industrial Enzymes. Netherland: Springer.
Poedjiadi A. 2006. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI Pr.
Teller J. 1950. Measurement of amylase activity. J Biol Chem. 15: 153-156.
Weinken CJ et al. 2010. Protein binding assay in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 10: 1038-1042.
LAMPIRAN
Tabel 1 Kurva standar pengukuran kadar glukosaTabung Absorbansi (A) [glukosa] (µmol)
1 0,000 02 0,039 0,083 0,104 0,24 0,270 0,45 0,365 0,66 0,498 0,87 0,616 1,08 0,844 1,2
Contoh perhitungan pengukuran uji aktivitas enzim invertase (Tabel 2)Fraksi I 0,05 mL y = AbsorbansiA = 0,119 [glukosa] – 0,1970,119 [glukosa] = 0,287 + 0,1970,119 [glukosa] = 0,484[glukosa] = 4,0672 µmol
Contoh perhitungan Tabel 3
Unit enzim invertase/mL = µmol /menitvol fraksi X 2
= 4,0672
0.05 X 2 = 4.0672 unit/mL
Unit aktivitas = unit enzim x FP x vol terkoreksi = 4.0672 unit/mL x 200 kali x 2 mL= 40.672 unit
Rataan = total fraksi
2
= 40.672+12.2 .52
2= 26.462 unit
Tabel 4 Kurva standar pengukuran kadar proteinTabung Absorbansi (A) [BSA] (µmol)
1 0,001 02 0,083 203 0,052 404 0,153 605 0,267 806 0,296 1007 0,377 1208 0,370 1409 0,473 16010 0,491 180
Contoh perhitungan Tabel 5
Persamaan garis kurva standar : y = 0.057x - 0.058Contoh perhitungan (Fraksi I 0,05 mL :y = Absorbansix = [protein/enzim]0,057 [protein/enzim] = 0,082 + 0,058[protein/enzim] = 2,4561 µg/mL
Contoh perhitungan Tabel 6
[ enzim ]terkoreksi mg /mL=2.4561 x 10 -3 mg /❑0.05 mL
= 0.0491 mg / mL
Total Protein = 0.0491 mg /mL x 5 x 2 mL = 0.491 mg
Rataan = total protein fraksi
2
= 0.079+0.189
2= 0.134 mg
Contoh perhitungan Tabel 7
Aktivitas spesifik ( unit /mg ) = unit enzim[enzim ] terkoreksi
=unit /mg
Aktivitas spesifik ( unit /mg ) = 1.78150.0189
= 94.2593 unit/ mg
Yield enzim = rataanunit fraksi dimurnikan
rataan unit ekstrak kasarX 100%
=26.4628.816
X 100 %
= 300.16 %
Fold purification = rataanaktivitas spesifik fraksi yangdimurnikan
rataan ekstrak kasar
= 145.383482.2575
= 1.7674 Contoh perhitungan Tabel 8Persamaan garis kurva standar : y = 0,119x – 0,197dengan y = Absorbansi, x = konsentrasi glukosaTabung 2 :A = 0,0540,054 = 0,119x – 0,1970,119x = 0,054 + 0,1970,119x = 0,251 x = 2,1092 µmol
V0 = x
10 menit =
2,1092 µmol10 menit
= 0,2109 µmol/menit
[Substrat] = [ sukrosa ] x volume sukrosa
volumetotal
= 500 mM x0,02 mL
1 mL
= 10 mM
Persamaan Michaelis-Menten :y = 0.231x - 0.146dengan y = V0 , x = [substrat], a = -0,146 , b = 0,231 Sehingga nilai Km = 0,231 µmol dan nilai Vmaks = -0,146 µmol/menit
Persamaan Lineweaver-Burk :Persamaan garis : y = -0.006x + 0.057dengan y = 1/V0 , x = 1/[substrat], a = 1/Vmaks , b = Km/Vmaks
sehingga,nilai Vmaks = 1/0,057 = 17,5438 µmol/menit Km = Vmaks x b
= 17,5438 µmol/menit x (-0,006) = 0,1053 µmol
Hasil pengukuran elektroforesis
Rf = jarak pitajarak gel
=0.65.7
= 0.105