Latar Belakang
VAKSIN
PREVENTIF
KUALITAS & STABILITAS
JUMLAH BAKTERI HIDUP
Colony Forming Unit ( CFU)
1. Waktu pengujian
yang lama 2. Tergantung pada
medium pertumbuhan
>> waktu inkubasi hingga 5 pekan.
Metode Alternatif
Metode ATP-Bioluminesens
Belum ada laporan Validasi
metode Pengembangan & Validasi metode ATP
Metode ATP-Bioluminesens
Reaksi Enzimatik ( Sistem Luciferin-Luciferase) dengan ATP :
Luminometer :
SAMPEL
Vaksin BCG SSI
Danish strain 1331
1 vial >> 0.75mg BGC liofilisasi & 3.75mg
Na.glutamat
Low Viability Sample
Suhu 37˚C selama 28 hari
Intermediate Viability Sample
Suhu 2-8˚C selama 12-18 bulan.
High Viability Sample
Suhu 2-8˚C selama 1-3 bulan.
2. Reagen :
• Medium Dubos (0.045% Tween & 0.5% Bovine
Albumin) • Reagen ATP-SL ( rekonstitusi dengan 10 mL
aqua pro injectione) • Dapar Tris-asetat 0.1 M (dengan 2 mM EDTA,
pH 7.75) • ATP-Standar , 1 x 10-5 M. • Sauton SSI encer. • Apyrase
Larutan Kerja
Larutan Kerja Standar
METODE ANALISIS
1. Penetapan ATP dalam Vaksin BCG - Ekstraksi ATP, sampel tanpa inkubasi
- Ekstraksi ATP, sampel dengan pre-inkubasi 37˚C.
- Pengukuran ATP
2. Penetapan CFU
3. Korelasi antara ATP – CFU
4. Validasi metode dengan tahapan
Pre-inkubasi.
5. Analisis data
1. Penetapan ATP
Ekstraksi ATP
Tanpa Inkubasi
Dengan Pre-inkubasi
24 jam, 37˚C
Pengukuran ATP
1 vial Vaksin BCG + 400 µl sauton SSI dan 100 µl Apyrase. Didiamkan 10 menit. Ekstraksi ATP (tiap vial 3 x 100 µl suspensi BCG) dengan Buffer Tris-Asetat dengan
EDTA ( 3 x 500 µl ) yang sebelumnya dipanaskan pada suhu 98-99°C. Campuran BCG-Buffer dijaga pada suhu 98-99°C selama 6 menit, ekstrak lalu didinginkan pada
suhu kamar.
1 vial vaksin BCG + 1.0 ml Media pertumbuhan mikroba ( Medium Dubos dengan Tween dan Bovine Albumin ), Nitrogen dialirkan selama 10-15 menit, vial ditutup. Inkubasi 24 jam suhu 37˚C sebelum ATP diekstraksi. Prosedur ekstraksi ATP, mengikuti prosedur
ekstraksi ATP tanpa inkubasi.
Pengukuran ATP
Ekstrak ATP ( 100 µg Suspensi BCG +
500 µl buffer)
100 µl reagen ATP
Diukur dengan Luminometer 1251
Blanko (100 µl
Sauton/Apyrase atau medium Dubos)
Suhu 25°C, signal 10 detik
( mV x 10 detik )
10/20µl Larutan ATP Standar
Konsentrasi standar 1.0-15
x 10-12 mol ATP
Reagen ATP
Output RLU (Relative Light Unit) >> ng ATP
2. Penetapan CFU
8 vial BCG, direkonstitusi dengan Sauton SSI hingga diperoleh konsentrasi 0.75mg BCG/ml.
3 seri pengenceran diinokulasikan pada Medium Lowenstein-Jansen, diinkubasi pada suhu 37˚C selama 5 pekan dan kemudian dihitung jumlah CFU.
www.themegallery.com
3. KORELASI ATP -CFU
Tujuan :
Melihat hubungan viabilitas sampel lyophilised BCG dengan berbagai level
berbeda hasil pengukuran dengan metode ATP dan CFU
Korelasi positif ( P < 0.01) koefisien korelasi r = 0.53 Untuk pengukuran dengan
metode ATP : overlapping antara viabilitas rendah dan tinggi
Sampel BCG tidak.di pre-inkubasi dalam
media pertumbuhan sebelum pengukuran
ATP. Samples (n = 43)
● : viabilitas rendah
▀ : viabilitas tinggi
3. KORELASI ATP -CFU
Sampel BCG di pre-inkubasi dalam media
pertumbuhan selama 24 jam sebelum
pengukuran ATP. Samples (n = 43)
● : viabilitas rendah
▲ : viabilitas sedang
▀ : viabilitas tinggi
Korelasi positif ( P < 0.01) koefisien korelasi r = 0.93
Metode pengukuran ATP dengan pre-inkubasi dalam media pertumbuhan
meningkatkan korelasi antara ATP-CFU secara signifikan
4. Validasi Metode dengan Tahapan Preinkubasi
1. Robustness
2. Linearitas dan Rentang
3. Akurasi
4. Presisi
www.themegallery.com
www.themegallery.com
Tujuan
Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode dengan cara dibuat perubahan metode dengan kondisi-kondisi tertentu, apakah berbagai faktor tersebut berpengaruh terhadap respon yang dihasilkan.
Prosedur Desain Faktorial (Software statistik JMP 6.0) Menggunakan 16 vial Vaksin BCG dengan
Intermediate Viability Terdiri dari 8 faktor kondisi percobaan dengan
2 level
1. Robustness (Kekuatan)
Desain Percobaan Robustness
www.themegallery.com
Faktor Level
A. Pre-Inkubasi
•Vial airing time before incubation •Incubation temperature •Incubation time •pH in Dubos medium
5 or 30 min 35 or 39 C 21 or 27 h pH 6.6 atau 7.0
B. Ekstraksi ATP
•Time to preheat extraction buffer •Extraction buffer temperature •Heat treatment time •Covering cuvettes during extraction
10 or 20 min 97 or 100 C 5 or 10 min With or without
Hasil Robustness
www.themegallery.com
Untuk masing-masing faktor, metode menunjukkan robust di masing2 level percobaan α =0.05 , tidak ada perbedaan yang signifikan pada masing2 hasil pengukuran ATP di berbagai kondisi percobaan
2. Linearitas dan Rentang
Linearitas
Kemampuan metode analisis untuk memperoleh hasil uji yang proporsional (sepadan) terhadap konsentrasi analit dalam sampel dan dalam rentang konsentrasi yang digunakan.
Rentang
Menunjukkan nilai terendah dan tertinggi hasil pengujian yang dapat ditentukan dengan cermat dan seksama.
www.themegallery.com
www.themegallery.com
Prosedur Linearitas
Linearitas
Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG
Linearitas Standar ATP Dibuat Variasi Konsentrasi Standar ATP dengan rentang 1.0-25 x10-12 mol ATP per kuvet
Total konsentrasi BCG (bakteri hidup dan mati) dalam sampel dibuat konstan dengan penambahan BCG yang telah dimatikan dengan pemanasan dan hanya konsentrasi ekstrak ATP yang dibuat bervariasi.
Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG
www.themegallery.com
500µl Buffer Tris-
EDTA
total100 µl suspensi
BCG
Untuk Vial Suspensi BCG dengan volume : 20 µl 40 µl 60 µl 80 µl Volume dibuat konstan dengan penambahan BCG yang telah dimatikan dengan pemanasan
ATP standar dengan rentang konsentrasi 1.0-
15 x 10-12 mol ATP/kuvet
untuk mengkonversi respon BCG-ATP ke dalam
mol-ATP
Hasil Linearitas
www.themegallery.com
1. Kurva Linearitas ATP standar 1.0-25 x10-
12 mol ATP -> Koefisien Korelasi r ≥ 0,99 (kurva tidak ditampilkan) 2. Kurva Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG dengan viabilitas yang berbeda pada konsentrasi BCG konstan -> Koefisien Korelasi r ≥ 0,99
Hasil Rentang
Kurva ATP standard dengan rentang konsentrasi 1.0-15 x 10-
12 mol ATP menghasilkan respon dibawah konsentrasi standar (pada vial dengan low viability dengan volume terkecil ) dan respon diatas konsentrasi standar pada vial dengan high viability dengan volume terbesar.
Rentang pengukuran adalah tidak kurang dari 1.0-15 x 10-12 mol ATP untuk 100 µl suspensi BCG atau setara dengan 10-150 x 10-
12 mol ATP per vial vaksin
www.themegallery.com
3. AKURASI
Tujuan
Untuk mengukur ketepatan atau kedekatan hasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya.
Prosedur
1. Menggunakan 15 sampel baru yang di pre-inkubasi
2. Hasil yang didapat kemudian dibandingkan dengan data korelasi antara ATP dengan jumlah CFU
3. Dibuat kurva regresi linier dengan derajat kepercayaan 95%.
4. Data hasil 15 sampel baru kemudian diplotkan tehadap kurva korelasi yang telah ada.
www.themegallery.com
Hasil Akurasi
www.themegallery.com
www.themegallery.com
Hasil Akurasi
Terdapat korelasi positif yang signifikan dengan nilai P < 0.0001, r = 0.934
Perhitungan hubungan antara metode ATP dan CFU : log (CFU) = -1.426 + 1.398 LOG (ATP) atau CFU = 0.037 ATP1.398
www.themegallery.com
4 .Presisi
Definisi
Tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual dengan rata-rata hasil pengujian berulang
Prosedur 1. Presisi dilakukan oleh 3 analis dalam 3 hari
2. Desain faktorial dilakukan untuk menguji repeatability dan intermediate precision dari sampel dengan low viability dan high viability.
3. Repeatability: pengujian dengan 2 sampel (2x8 vial), diukur koefisien variasinya (CV) untuk repeatability.
4. Intermediate precision: Data dari desain percobaan dianalisa, dihitung sesuai dengan perhitungan intermediate precision.
www.themegallery.com
Hasil Presisi
www.themegallery.com
Hasil Presisi
Low Viability
1. Repeatability : 5.5%
2. Intermediate Precision : 15%
High Viability
1. Repeatability : 5.1%
2. Intermediate Precision : 9.0%
www.themegallery.com
Parameter dan Hasil Validasi
Hasil Syarat Akurasi >70%
Presisi -Repeatability -Intermediate Precision
5,1%-5,5% 9%-15%
Cfu/plate 30-300 <15% 10-30 <25% <10 <35%
Linearitas 99% r > 099 >95%
Robustness Statistik tidak berbeda signifikan
Kesimpulan
Metode ATP dengan pre-inkubasi memiliki tingkat kecepatan (rapid), kekuatan (robust), ketepatan (akurasi) dan keseksamaan (presisi) yang baik untuk mengetahui estimasi dari BCG viability.
Metode ATP telah sesuai untuk tujuan pengujian rutin quality control BCG.
www.themegallery.com
LOGO