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LUCAS NOVAES TEIXEIRA
ESTUDO DA EXPRESSÃO DE OSTEOPONTINA EM SISTEMAS DE
COCULTURAS DE CÉLULAS OSTEOBLÁSTICAS E EPITELIAIS
NEOPLÁSICAS HUMANAS E SEUS EFEITOS SOBRE O FENÓTIPO
NEOPLÁSICO E A ATIVAÇÃO OSTEOCLÁSTICA
Piracicaba
2015
ii
iii
Universidade Estadual de Campinas
Faculdade de Odontologia de Piracicaba
LUCAS NOVAES TEIXEIRA
ESTUDO DA EXPRESSÃO DE OSTEOPONTINA EM SISTEMAS DE COCULTURAS DE
CÉLULAS OSTEOBLÁSTICAS E EPITELIAIS NEOPLÁSICAS HUMANAS E SEUS
EFEITOS SOBRE O FENÓTIPO NEOPLÁSICO E A ATIVAÇÃO OSTEOCLÁSTICA
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia
de Piracicaba da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos exigidos
para a obtenção do título de Doutor em
Estomatopatologia, na Área de Patologia.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira
Este exemplar corresponde à versão final da tese
defendida por Lucas Novaes Teixeira e orientada
pelo Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira
_________________________
Assinatura do Orientador
Piracicaba
2015
iv
v
FOLHA DE APROVAÇÃO
vi
vii
RESUMO
O carcinoma espinocelular (CEC) oral representa a neoplasia maligna mais
prevalente das estruturas bucais, podendo invadir o tecido ósseo e promover sua
reabsorção em até 56% dos casos. A expressão da proteína matricelular
osteopontina (OPN) tem sido relacionada a uma maior agressividade de
neoplasias malignas, incluindo o CEC oral. No tecido ósseo, a OPN representa a
proteína mais abundante da matriz não colágena, concentrada nas interfaces
ósseas, i.e. lâminas limitantes, linhas de cimentação e reversas, sendo essencial
para adesão e funções de osteoblastos e osteoclastos. Apesar de no
microambiente tumoral a OPN estar associada a um fenótipo neoplásico mais
agressivo, ainda não está estabelecido o papel da OPN secretada por
osteoblastos sobre células neoplásicas derivadas de CEC oral e o impacto sobre
osteoclastos. O presente estudo teve como objetivos avaliar a expressão de OPN
em sistemas de coculturas de células osteoblásticas e epiteliais neoplásicas
malignas humanas e os efeitos da expressão de OPN secretada por osteoblastos
sobre o fenótipo neoplásico in vitro. Adicionalmente, avaliou-se o efeito das
coculturas sobre a atividade osteoclástica. Células epiteliais neoplásicas malignas
derivadas de CEC oral (SCC9) foram plaqueadas sobre membranas de
Transwell®, recobertas ou não por uma camada fina e uniforme de Matrigel, e
cocultivadas com células osteoblásticas (SAOS-2) durante seu pico de expressão
de OPN (10o dia de cultura). Células SCC9 expostas a culturas SAOS-2
silenciadas para OPN por RNA de interferência (RNAi) e células SCC9 cultivadas
isoladamente foram usadas como controles. Após 24 h de cocultivo, células SCC9
foram avaliadas, quantitativamente, para adesão, proliferação, migração e invasão
de Matrigel. A atividade de osteoclastos derivados de células monocíticas U-937
foi avaliada, quantitativamente, por meio dos ensaios de reabsorção de fosfato
cálcio e de dosagem de citocinas em eluentes obtidos de células SCC9 e SAOS-2
após o cocultivo durante o pico de OPN ou com o seu silenciamento. A análise
estatística foi realizada pelo teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis (p < 0,05). Os
viii
resultados indicaram indução recíproca na expressão de OPN em SAOS-2 e
SCC9 em cocultura. A OPN secretada por células SAOS-2 afetou o fenótipo de
culturas SCC9, promovendo a adesão e a proliferação celulares e a invasão de
Matrigel, a qual também estava aumentada, mas em menor intensidade, com o
silenciamento para OPN. A migração celular não foi afetada. O cocultivo com
SAOS-2, principalmente durante o pico de OPN, resultou na sobre-expressão das
citocinas IL 6 e IL 8 pelas células SCC9, aumentando a capacidade de células
osteoclásticas em reabsorver fosfato de cálcio. Conjuntamente, esses resultados
sugerem que a OPN derivada de osteoblastos afeta as interações entre células
epiteliais neoplásicas malignas, osteoblastos e osteoclastos, possivelmente
contribuindo para a progressão de lesões ósseas do CEC oral.
Palavras-chave: osteoblastos, osteopontina, carcinoma espinocelular oral,
cocultura, invasão óssea.
ix
ABSTRACT
The oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most prevalent malignant
neoplasm of the oral structures. It may invade bone in up to 56% of the cases and
promote osteoclast-mediated bone extracellular matrix (ECM) resorption.
Expression of the matricellular protein osteopontin (OPN) in malignant neoplasms,
including OSCC, has been positively correlated with aggressive tumor behavior.
OPN is the most abundant non collagenous ECM protein in bone, where it
preferentially accumulates at interfaces, including cement lines, laminae limitantes
and reversal lines, being essential for the adhesion and function of osteoblasts and
osteoclasts. Despite the importance attributed to OPN in the tumor
microenvironment, indicative of more aggressive neoplastic phenotypes, the
effects of osteoblast-derived OPN on OSCC cells and on OSCC-induced
osteoclast activity are still not fully understood. The present in vitro study aimed to
evaluate temporal expression of OPN in cocultures of human osteoblastic cells and
malignant neoplastic epithelial cells and the effects of osteoblast-derived OPN on
the neoplastic cell phenotype. Additionally, the effects of cocultures on osteoclastic
activity were evaluated. Human OSCC-derived epithelial cells (SCC9 cell line)
were plated on Transwell® membranes coated or not by a thin uniform layer of
Matrigel and cocultured with human osteoblastic cells (SAOS-2 cell line) during its
peak of OPN expression (day 10 of SAOS-2 culture). SCC9 cells exposed to OPN-
silenced SAOS-2 cultures by means of interference RNA and SCC9 cells cultured
alone were used as controls. At 24 h of coculture, SCC9 cells were quantitatively
evaluated for cell adhesion, proliferation, migration and invasion of Matrigel. The
impact of coculturing SCC9 and SAOS-2 cells either during the OPN peak
expression or under the silencing of OPN was quantitatively evaluated in terms of
calcium phosphate resorption by U-937-derived osteoclastic cells and expression
of cytokines in the culture medium by ELISA assay. The statistical analyses were
carried out using the non-parametric Kruskal-Wallis test (p < 0.05). The results
showed a reciprocal induction of SAOS-2 and SCC9 cells in terms of OPN
x
expression over the coculture interval. SAOS-2-secreted OPN altered the SCC9
cell phenotype, leading to enhanced cell adhesion and proliferation and higher
Matrigel invasion, which was also enhanced, but to a lesser degree, by SAOS-2
cultures silenced for OPN. Cell migration was not affected. Cocultures with SAOS-
2, mainly during the peak expression of OPN, resulted in overexpression of IL 6
and IL 8 by SCC9 cells, which corresponded with an enhanced resorptive capacity
of osteoclastic cells. Taken together, the results suggest that osteoblast-derived
OPN affects the interactions among malignant neoplastic epithelial cells,
osteoblasts and osteoclasts, likely contributing to the progression of bone lesions
in OSCC.
Key Words: osteoblasts, osteopontin, oral squamous cell carcinoma, coculture,
bone invasion.
xi
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA...................................................................................................................xv
AGRADECIMENTOS.........................................................................................................xix
EPÍGRAFE........................................................................................................................xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS.............................................................................................xxv
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................................... 3
2.1 OPN ................................................................................................................................................... 3
2.2 OPN e seu papel na carcinogênese ............................................................................................. 7
2.3 Invasão do CEC oral no tecido ósseo ........................................................................................ 10
3 PROPOSIÇÃO ...................................................................................................................... 15
3.1 Objetivo geral ................................................................................................................................. 15
3.2 Objetivos específicos .................................................................................................................... 15
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................................... 17
4.1 Culturas celulares .......................................................................................................................... 17
4.1.1 Obtenção e cultura de SAOS-2 ............................................................................................ 17
4.1.2 Obtenção e cultura de SCC-9 .............................................................................................. 17
4.1.3 Obtenção e cultura de U-937 ................................................................................................ 18
4.2 Análise do perfil de expressão de OPN em células SAOS-2 e SCC9 .................................. 19
4.2.1 Imunolocalização de OPN por imunofluorescência indireta ............................................ 19
4.2.2 Expressão de OPN por Real Time PCR ............................................................................. 20
4.2.3 Quantificação de OPN por ELISA ........................................................................................ 21
4.3 Análise do perfil de expressão de OPN em coculturas de SAOS-2/SCC9 .......................... 21
4.3.1 Coculturas de SAOS-2/SCC9 ............................................................................................... 22
4.4 Avaliação do efeito da OPN secretada por SAOS-2 sobre a expressão gênica e o
fenótipo de células SCC9 em cocultura ............................................................................................ 22
4.4.1 Silenciamento do transcrito do gene da OPN por RNAi ................................................... 22
4.4.2 Adesão celular ........................................................................................................................ 23
4.4.3 Proliferação celular ................................................................................................................. 23
xii
4.4.4 Migração celular...................................................................................................................... 24
4.4.5 Invasão celular ........................................................................................................................ 24
4.4.6 PCR Array ................................................................................................................................ 25
4.5 Avaliação do efeito da OPN secretada por SAOS-2, em cocultura com células
SCC9, sobre a atividade de osteoclastos humanos e citocinas envolvidas na
diferenciação e ativação osteoclástica .............................................................................................. 26
4.5.1 Avaliação da atividade osteoclástica por meio do ensaio de reabsorção de
fosfato de cálcio ................................................................................................................................ 26
4.5.2 Quantificação de RANKL, OPG, PTHrP e citocinas inflamatórias por ELISA .............. 27
4.6 Análise estatística .......................................................................................................................... 28
5 RESULTADOS ...................................................................................................................... 29
5.1 Análise do perfil de expressão de OPN em células SAOS-2 e SCC9 .................................. 29
5.1.1 Imunolocalização de OPN por imunofluorescência indireta ............................................ 29
5.1.2 Expressão de OPN por Real Time PCR ............................................................................. 31
5.1.3 Quantificação de OPN por ELISA ........................................................................................ 31
5.2 Análise do perfil de expressão de OPN em coculturas de SAOS-2/SCC9 .......................... 32
5.2.1 Imunolocalização de OPN por imunofluorescência indireta ............................................ 32
5.2.2 Expressão de OPN por Real Time PCR ............................................................................. 35
5.2.3 Quantificação de OPN por ELISA ........................................................................................ 36
5.3 Avaliação do efeito da OPN secretada por células SAOS-2 sobre a expressão
gênica e o fenótipo de células SCC9 em cocultura ........................................................................ 38
5.3.1 Adesão celular ........................................................................................................................ 38
5.3.2 Proliferação celular ................................................................................................................. 39
5.3.3 Migração celular...................................................................................................................... 40
5.3.4 Invasão celular ........................................................................................................................ 41
5.3.5 PCR Array ................................................................................................................................ 42
xiii
5.4 Avaliação do efeito da OPN secretada por SAOS-2, em cocultura com células
SCC9, sobre a atividade de osteoclastos humanos e citocinas envolvidas na
diferenciação e ativação osteoclástica .............................................................................................. 44
5.4.1 Avaliação da atividade osteoclástica por meio do ensaio de reabsorção de
fosfato de cálcio ................................................................................................................................ 44
5.4.2 Quantificação de RANKL, OPG, PTHrP e citocinas inflamatórias por ELISA .............. 46
6 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 49
7 CONCLUSÃO ........................................................................................................................ 57
REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 59
APÊNDICE 1 ............................................................................................................................ 97
APÊNDICE 2 .......................................................................................................................... 101
ANEXO ................................................................................................................................... 105
xiv
xv
DEDICATÓRIA
A Deus, por estar presente em minha vida e tornar tudo possível.
Aos meus pais, José Roberto e Goreti, por todos os esforços e sacrifícios
realizados para que eu pudesse estudar e alcançar meus objetivos. A vocês,
minha eterna gratidão.
Às minhas irmãs, Lívia e Letícia, e aos meus sobrinhos, Vítor, Felipe e Igor, pelo
amor, carinho e apoio incondicional.
xvi
xvii
Ao meu orientador, Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira, por ter acreditado em
mim desde o início, quando eu ainda era apenas um aluno de iniciação científica,
pelos conselhos e incentivos constantes, pela humildade e generosidade com as
quais sempre me tratou e, principalmente, pelo exemplo de dedicação à pesquisa
e ao ensino.
xviii
xix
AGRADECIMENTOS
À Larissa Moreira Spinola de Castro Raucci, pelo seu enorme coração,
que muitas vezes a obriga a deixar de lado seus compromissos para socorrer os
amigos. Palavras não são suficientes para agradecer tudo que já fez por mim em
nossos mais de 10 anos de amizade;
Ao Walter Raucci Neto, pela amizade de longa data, pelas conversas e
momentos de descontração compartilhados;
Ao Roger Rodrigo Fernandes, pela amizade, conselhos e, principalmente,
pela certeza de que sempre poderei contar com sua ajuda;
Ao Prof. Dr. Adalberto Luiz Rosa, pelo seu dinamismo, que resultou na
criação dos Laboratórios de Cultura de Células e de Biologia Molecular da
FORP/USP, locais onde pude crescer como pesquisador e onde todo o trabalho
desta Tese de Doutorado foi realizado;
Ao Prof. Dr. Márcio Mateus Beloti, pelas conversas, conhecimentos
compartilhados e pelos exemplos de competência e dedicação à pesquisa;
Ao Prof. Dr. Ricardo Della Coletta, pelas oportunidades que me
proporcionou e pela humildade e educação com as quais sempre me recebeu;
À Fabíola Singaretti de Oliveira, pela amizade e por sua inestimável ajuda
na execução deste trabalho;
À Milla Sprone Tavares Ricoldi, pelo auxílio prestado nos procedimentos
laboratoriais e pelas risadas em momentos de descontração;
xx
À Emanuela Prado Ferraz, pela amizade, conversas e, principalmente,
pelo exemplo de determinação;
À Gabriela Carolina Alonso, pela dedicação e colaboração como aluna de
iniciação científica;
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de
Campinas, na pessoa de seu diretor, Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha
Henriques; por ter me recebido como aluno de pós-graduação;
À Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo, na pessoa de seu diretor, Prof. Dr. Valdemar Mallet da Rocha Barros;
pela infra-estrutura oferecida para execução deste trabalho;
Ao Prof. Dr. Alan Roger dos Santos Silva, coordenador do Programa de
Pós-Graduação em Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia de
Piracicaba – UNICAMP; pela solicitude e exemplo de profissionalismo;
Aos Profs. Drs. Alan Roger dos Santos Silva, Edgard Graner, Jacks
Jorge Júnior, Márcio Ajudarte Lopes, Oslei Paes de Almeida, Pablo Augustin
Vargas e Ricardo Della Coletta, professores das áreas de Patologia e
Semiologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP, pelo
exemplo de dedicação à docência e à pesquisa;
À FAPESP, pelo auxílio financeiro a esta pesquisa (2012/07531-9) e pela
concessão da bolsa de doutorado (2012/08605-6);
xxi
Aos amigos do laboratório Emanuela Ferraz, Fernanda Grilo, Gabriela
Alonso, Gabriela Cerminaro, Gileade Freitas, Helena Bacha, Mayara
Semeghini, Rodrigo Abuna e Thiago Santana, pelos bons momentos
compartilhados e pelo excelente ambiente de trabalho;
Aos amigos da pós-graduação Alícia Rumayor Piña, Ana Lúcia Noronha,
Elizabete Bagordakis, Felipe Paiva, Isadora Luana Flores, Katya, Lara
Alencar, Luciana Yamamoto, Marcondes Sena, Marisol Martínez, Rogério
Gondak, Rose Ortega, Sabino Bezerra, Sabrina Nogueira, Sibele Aquino e
Wilfredo Gonzalez, pelos conhecimentos e momentos de descontração
compartilhados;
Muito obrigado!
xxii
xxiii
EPÍGRAFE
“Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas
usadas, que já tem a forma do nosso corpo, e
esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre
aos mesmos lugares. É o tempo da travessia: e, se
não ousarmos fazê-la, teremos ficado, para sempre, à
margem de nós mesmos.”
Fernando Teixeira de Andrade
xxiv
xxv
LISTA DE ABREVIATURAS
AKT: Proteína quinase B
ANOVA: Análise de variância
ATCC: American Type Culture Collection
BSP: Sialoproteína óssea
cDNA: DNA complementar
CEC: Carcinoma espinocelular
Ct: Ciclo limiar
DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole
DMEM-F12: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium e Ham’s F-12 Nutrient Mixture
DNA: Ácido desoxirribonucleico
EDTA: Ácido etileno-diamino-tetracético
EGF: Fator de crescimento epidérmico
ELISA: Ensaio de imunoabsorbância ligado à enzima
ERK: Quinases reguladores de sinais extracelulares
FGF-2: Fator de crescimento fibroblástico 2
FN: Fibronectina
GAPDH: Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase
GM-CSF: Fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos
h: Hora
HGF: Fator de crescimento hepático
IGF-1: Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1
IL: Interleucina
xxvi
kDa: Quilodaltons
MAPK: Proteína quinase ativadora de mitose
MEC: Matriz extracelular
MEK: Mitogen-activated protein
min: Minuto
mL: Mililitro
mM: Milimolar
MMP: Metaloproteinase
NFkB: Fator nuclear cadeia leve kappa intensificador de células B ativadas
ng: Nanograma
nM: Nanomolar
nm: Nanômetro
OPG: Osteoprotegerina
PB: Tampão fosfato
PBS: Salina tamponada com fosfato
PGE2: Prostaglandina E2
PI3K: Fosfatidilinositol-3-quinase
PTHrP: Peptídeo relacionado ao paratormônio
RAF: RAF proteína quinase serina/treonina
RANK: Receptor ativador do fator nuclear-Kappa B
RANKL: Ligante do receptor ativador do fator nuclear-Kappa B
RAS: Rat Sarcoma vírus
Real Time PCR: Reação em cadeia da polimerase em tempo real
RGD: Sequência arginina-glicina-ácido aspártico
xxvii
RIN: RNA Integrity Number
RNA: Ácido ribonucleico
RNAi: RNA de interferência
RNAm: RNA mensageiro
RPMI: Roswell Park Memorial Institute medium
SAOS-2: Células osteoblásticas humanas
SCC9: Células epiteliais malignas humanas derivadas de CEC oral
Scr: Proteína tirosina-quinase Scr
SIBLING: Small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins
siRNA: Small interfering RNA
SVVYGLR: Sequência serina-valina-valina-tirosina-glicina-leucina-arginina
TA: Temperatura ambiente
TGF-β: Fator de crescimento transformante beta
TIMP: Inibidores teciduais de MMP
TNFSF10: Ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral
TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa
U-937: Linhagem celular de monócitos humanos
UI: Unidades internacionais
µg: Micrograma
µL: Microlitro
uPA: Plasminogênio do tipo uroquinase
VEGF: Fator de crescimento vascular endotelial
xxviii
1
1 INTRODUÇÃO
O CEC oral representa a neoplasia maligna mais comum da região de cabeça e
pescoço e corresponde a mais de 90% de todos os tumores que acometem as
estruturas bucais (Saman, 2012; Simard et al., 2014). Anualmente, estima-se que o
CEC oral seja responsável por aproximadamente 130.000 mortes em todo o mundo,
das quais 75% estão localizadas em países em desenvolvimento (De Camargo
Cancela et al., 2010). No Brasil, apresenta-se como a quinta e a décima segunda
neoplasia maligna mais comum em homens e mulheres, respectivamente; com uma
média de 15 mil novos casos/ano (Instituto Nacional de Câncer - INCA, 2014).
O CEC oral desenvolve-se por um processo multifatorial caracterizado por
alterações genéticas e epigenéticas que resultam em ativação e/ou inativação de proto-
oncogenes e genes supressores de tumores, os quais controlam diferentes atividades
celulares (Feinberg & Tycko, 2004; Campo-Trapero et al., 2008; Lichtenstein, 2010;
Hanahan & Weinberg, 2011). De fato, fatores de crescimento, citocinas e outras
moléculas bioativas exercem efeitos sobre adesão, proliferação, viabilidade, migração e
invasão de células neoplásicas (Gaur et al., 2014; Ohnishi et al., 2014; Ribeiro et al.,
2014; Lee et al., 2015).Entre os mecanismos biológicos envolvidos na progressão das
neoplasias, destaca-se o papel das proteínas da MEC, em particular uma classe de
glicoproteínas denominada SIBLING, da qual faz parte a OPN (Bellahcène et al., 2008;
Shevde & Samant, 2014).
A OPN é uma proteína multifuncional da MEC que foi inicialmente isolada de
células epiteliais neoplásicas, linfócitos T e matriz óssea (Senger et al., 1979; Franzén
& Heinegård, 1985; Weber & Cantor, 1996), sendo posteriormente identificada em
outros órgãos e fluidos biológicos (Young et al., 1990; Brown et al., 1992; Denhardt &
Guo, 1993; Kohri et al., 1993; Bautista et al., 1996). Diversos estudos têm demonstrado
que o potencial de invasão de numerosas neoplasias malignas é maior quando são
altos os níveis de expressão de OPN no parênquima tumoral (Chen R et al., 2011; Lu
et al., 2011; Wang et al., 2011; Zhang R et al., 2011; Zhang Y et al., 2011). Para o CEC
oral, há evidências que indicam que a OPN produzida pelas células neoplásicas
2
promove sua invasão para os tecidos circunjacentes (Matsuzaki et al., 2007; Routray et
al., 2013). Adicionalmente, a OPN tem sido considerada um marcador prognóstico para
neoplasias malignas, incluindo o CEC oral (Weber et al., 2010; Avirović et al., 2013;
Ingale et al., 2014).
No tecido ósseo, a OPN representa a proteína não colágena mais abundante e
atua nos processos de formação e remodelação óssea (Sodek et al., 2000). Enquanto
que a secreção de OPN por osteoblastos contribui para adesão celular e controle do
crescimento de cristais de apatita na MEC colágena (Standal et al., 2004b; Hunter et
al., 2013; Holm et al., 2014), estudos têm demonstrado o papel da OPN nos processos
de adesão e ativação osteoclástica, fisiológica e patologicamente, incluindo neoplasias
e metástases ósseas (Semba, 1996; Guise & Mundy, 1998; Chellaiah et al., 2003; Li et
al., 2006; Reufsteck et al., 2012; Kruger et al., 2014).
Durante a reabsorção óssea, três moléculas são cruciais para diferenciação e
ativação dos osteoclastos: RANKL, RANK e OPG (Gruber, 2014). A via de sinalização
RANK/RANKL regula a diferenciação de monócitos/macrófagos em osteoclastos e ativa
a reabsorção óssea, enquanto que a presença de OPG inibe a osteoclastogênese
(Lacey et al., 2012). Além do sistema RANK/RANKL, várias citocinas inflamatórias
sintetizadas pelas células neoplásicas, como as IL 1α, IL 1β, IL 6, IL 8, IL 11, TNF-α,
GM-CSF e PTHrP, também estão envolvidas na ativação osteoclástica (Guise &
Mundy, 1998; Shibahara et al., 2005; Takayama et al., 2010; Quan et al., 2012).
Embora avanços tenham ocorrido na compreensão dos mecanismos de invasão do
tecido ósseo pelo CEC oral, o papel da OPN secretada por osteoblastos presentes no
microambiente tumoral sobre a ativação osteoclástica mediada por células neoplásicas
malignas não está ainda completamente elucidado. Assim, os resultados do presente
estudo in vitro devem contribuir para uma melhor compreensão das complexas
interações celulares que ocorrem no microambiente tumoral durante a invasão óssea
pelo CEC oral.
3
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 OPN
A OPN é uma proteína matricelular, multifuncional, que atua tanto em processos
fisiológicos como patológicos, entre os quais inflamação, reparação tecidual, formação
e remodelação óssea, aterosclerose e câncer (Sodek et al., 2000; Tuck et al., 2007;
Cho et al., 2009). Descrita inicialmente como uma fosfoproteína secretada por células
epiteliais neoplásicas (Senger et al., 1979), esta proteína foi redescoberta por Craig et
al. (1989) por meio da clonagem molecular do gene 2ar associado à transformação.
Posteriormente, outros cientistas, de modo independente, identificaram a OPN,
juntamente com a BSP, como a principal sialoproteína da MEC óssea (Franzén &
Heinegard, 1985; Fisher et al., 1987; Prince et al., 1987); essas duas moléculas foram
denominadas, inicialmente, BSP I e BSP II, respectivamente (Franzén & Heinegard,
1985).
Nos tecidos do corpo humano, a OPN é encontrada em células epiteliais dos
tratos gastrointestinal, urinário e reprodutor, vesícula biliar, pâncreas, brônquios
pulmonares, glândulas mamárias, glândulas salivares e ductos de glândulas
sudoríparas, em fluidos biológicos, como sangue, leite materno, urina e líquido seminal
(Higashibata, 2004; Takahashi et al., 2004).
O gene que codifica a OPN humana está localizado no braço longo do
cromossomo 4, região 4q21, sendo composto por 7 exons (Young et al., 1990; Hijiya et
al., 1994). A expressão de OPN é influenciada por várias moléculas, como hormônios,
citocinas e fatores de crescimento, que podem modular a transcrição gênica, o
processamento, a estabilidade e a tradução do RNA mensageiro, bem como as
alterações pós-tradução sofridas por esta molécula (Denhardt & Noda, 1998). Embora
essa regulação geralmente seja similar em diferentes tecidos, há algumas diferenças
relevantes, inclusive no contexto de um mesmo tecido; o controle diferencial tem sido
descrito e atribuído, pelo menos em parte, à célula-alvo e ao estágio de maturação
celular (Sodek et al., 2000). A literatura relata a existência do splicing alternativo para
OPN humana, que produz 3 isoformas da proteína: OPN-a, constituída por todos os
exons codificantes do gene, OPN-b e OPN-c, que exibem a ausência dos exons 5 e 4,
4
respectivamente. A distribuição das isoformas nos tecidos humanos está relacionada à
presença de fatores célula-específicos que determinam qual tipo de isoforma
prevalecerá nos diferentes tipos celulares (Gimba & Tilli, 2013).
A sequência de aminoácidos da OPN está disponível para várias espécies,
como a humana (Kiefer et al., 1989), a bovina (Kerr et al., 1991), a suína (Wrana et al.,
1989) e a murina (Oldberg et al., 1986; Craig et al., 1989). De modo geral, a OPN é
extremamente hidrofílica com baixo ponto isoelétrico (3.5) e exibe uma composição
distinta de aminoácidos, com 42 serinas, 48 ácidos aspárticos e 47 resíduos de ácido
glutâmico, que, juntos, constituem mais da metade da proteína. Interessantemente, 27
dos 42 resíduos de serina são fosforilados. A proteína nascente exibe massa molecular
média de 34 kDa. Contudo, a OPN secretada varia entre 41-75 kDa, em função de
suas modificações pós-tradução (Christensen et al., 2008). A OPN é rica em ácidos
aspártico e glutâmico, serina, e contém uma sequência de ácido poliaspártico, por meio
da qual é capaz de se ligar à hidroxiapatita e aos íons cálcio, e uma, de RGD, a qual
medeia a adesão celular. Além disso, sítios de fosforilação em resíduos de serina e
treonina, sítios de N- e O- glicosilação, sítios de clivagem para trombina e sítios para
ação de transglutaminases também já foram identificados na OPN (Kazanecki et al.,
2007). Variações nos níveis de fosforilação, glicosilação e sulfatação geram diferentes
formas funcionais de OPN, as quais podem ser encontradas no mesmo tecido ou em
tecidos distintos (Sodek et al., 2000; Christensen et al., 2007; Zhang et al., 2007).
As interações célula-matriz e célula-célula mediadas por OPN ocorrem entre
sequências específicas presentes na estrutura da proteína e receptores, como as
integrinas, localizadas na membrana plasmática (Sodek et al., 2000). Essas ligações
resultam na ativação de quinases e/ou fatores de transcrição que promovem adesão,
migração e sobrevivência celulares (Hynes, 1992; Shattil et al., 2010). Além disso, as
atividades biológicas da OPN também podem ser moduladas por processos
proteolíticos, que clivam a proteína e separam domínios funcionais ou revelam sítios
crípticos (Senger et al., 1994; Myles & Leung, 2008).
As integrinas são proteínas transmembrana compostas por duas subunidades,
denominadas α e β, que atravessam a membrana plasmática, com uma pequena
cauda C-terminal intracelular e um grande domínio extracelular N-terminal (Schwartz et
5
al., 1995). A porção extracelular do dímero se liga às sequências específicas de
aminoácidos de proteínas da MEC ou aos receptores de superfície presentes em
outras células. A porção intracelular se liga a um complexo de proteínas que interagem
com o citoesqueleto (Wang & Luo, 2010). A OPN, por meio da sequência RGD,
interage com várias integrinas, entre as quais αvβ3, αvβ5, αvβ1, α4β1, α8β1 e α9β1
(Wai & Kuo, 2008; Zou et al., 2013). A sinalização por essas integrinas pode resultar
em ativação do complexo de adesão focal, que inclui várias proteínas reguladoras e
estruturais, como a quinase de adesão focal, quinases da família Src e proteínas
citoesqueléticas (Han et al., 2007; Li et al., 2007; Fong et al., 2009). O recrutamento de
diferentes componentes do complexo de adesão focal ativam diferentes vias de
sinalização que, por sua vez, regulam diferentes parâmetros da atividade celular, como
adesão, migração, proliferação e sobrevivência (Khan et al., 2002; Kang et al., 2008;
Song et al., 2008; Shattil et al., 2010; Zou et al., 2013).
O receptor CD44 é uma glicoproteína transmembrana que possui diferentes
isoformas e modificações pós-tradução (Ponta et al., 1998). Diversos tipos celulares
expressam o receptor CD44, como linfócitos, macrófagos, fibroblastos, osteoblastos,
células musculares lisas, endoteliais e epiteliais (Underhill, 1992; Hughes et al., 1994;
Nakamura et al., 1995; Jain et al., 1996; Schmits et al., 1997; Johnson et al., 2000). O
principal ligante do receptor CD44 é o ácido hialurônico (Underhill, 1992). Contudo,
fatores de crescimento, bem como outras proteínas da MEC, entre as quais colágeno,
sulfato de condroitina, fibronectina, laminina e OPN podem se ligar ao receptor CD44
(Orian-Rousseau & Sleeman, 2014). Assim como descrito para interações OPN-
integrinas, a ativação do receptor CD44 recruta vias de sinalização que promovem
adesão, migração e proliferação celulares (Ponta et al., 2003; Orian-Rousseau, 2010).
A OPN possui um sítio de clivagem pela trombina, contíguo à sequência RGD,
que gera fragmentos contendo diferentes domínios da proteína, como os de ligação às
integrinas e ao receptor CD44, e revela sítios crípticos, como a sequência SVVYGLR
(Senger et al., 1994; Myles & Leung, 2008). Assim, determinadas funções celulares
podem prevalecer sobre outras de acordo com os níveis de cada fragmento aos quais
as células foram expostas. Por exemplo, o fragmento N-terminal da OPN se liga às
integrinas αvβ3 e αvβ5, por meio da sequência RGD, ou às integrinas α9β1 e α4β1,
6
pela sequência SVVYGLR, e promove adesão celular (Yokosaki et al., 1999; Ito et al.,
2009). Por outro lado, o fragmento C-terminal se liga às isoformas 3 e 6 do receptor
CD44 e resulta em migração e invasão celulares (Teramoto et al., 2005). A clivagem
proteolítica da OPN também pode ocorrer por ação de MMPs, particularmente pelas
MMPs 2, 3, 7 e 9, gerando peptídeos que se ligam a integrinas com subunidade β1
e/ou ao receptor CD44, promovendo adesão, migração e invasão celulares (Agnihotri et
al., 2001; Dean & Overall, 2007; Takafuji et al., 2007).
A enzima transglutaminase catalisa a formação de ligações covalentes entre
resíduos de lisina e glutamina presentes na estrutura da proteína, que estabilizam as
interações proteína-proteína, proteína-MEC e/ou proteína-célula (Aeschlimann &
Thomazy, 2000; Iismaa et al., 2009). A OPN possui dois sítios de ação para
transglutaminase, representados pelos resíduos de glutamina localizados próximos à
porção N-terminal da proteína (Sørensen et al., 1994). A polimerização da OPN,
promovida pela transglutaminase, potencializa os efeitos da OPN sobre a adesão, o
espraiamento e a migração celular (Higashikawa et al., 2007; Forsprecher et al., 2011).
Diferentes domínios funcionais da OPN mantiveram-se conservados durante a
evolução de várias espécies, destacando-se os sítios de ligação ao cálcio, constituídos
por sequências ricas em ácido aspártico e serinas fosforiladas (Sodek et al., 2000).
Estudos têm demonstrado a associação entre a expressão de OPN e a formação dos
cristais de hidroxiapatita, seja em situações fisiológicas ou patológicas (Sodek et al.,
2000). Além disso, a expressão diferencial de OPN durante a histogênese do tecido
ósseo, particularmente no estágio inicial de diferenciação osteoblástica e durante a
mineralização da MEC, sugere que esta proteína exerça importante papel no
metabolismo do cálcio e no processo de biomineralização (Aubin, 1998; Sodek et al.,
2000; Hunter, 2013; Zurick et al., 2013). Com efeito, a OPN participa das interações
entre células e MEC no tecido ósseo, promovendo a união de células osteoblásticas às
fases orgânicas e minerais da MEC e controlando as funções de osteoblastos,
osteócitos e osteoclastos (Oldberg et al., 1986; McKee & Nanci, 1996; Sodek et al.,
2000; Staines et al., 2012).
7
2.2 OPN e seu papel na carcinogênese
As primeiras evidências do papel da OPN no desenvolvimento de neoplasias
surgiram a partir de estudos que demonstraram elevados níveis de OPN em culturas
células transformadas (Senger et al., 1983; Senger et al., 1989) e de células tumorais
com alto potencial metastático (Craig et al., 1988; Craig et al., 1990). Posteriormente,
detectou-se alta expressão de RNAm para OPN em vários carcinomas, com as células
positivas para os transcritos de OPN localizando-se predominantemente no fronte
tumoral e em áreas de necrose. Corroborando esses achados, outros trabalhos
também relataram a sobre-expressão de OPN, tanto em níveis de RNAm quanto
proteico, em diversas neoplasias, como em tumores de mama, próstata, pâncreas,
pulmão, ovário, útero e cabeça e pescoço (Bellahcène et al., 2008).
Devido à sua ampla distribuição em diferentes carcinomas e, principalmente, por
ser uma proteína secretada passível de ser quantificada por métodos menos invasivos,
estudos sugerem a utilização da OPN como um biomarcador prognóstico (Wai & Kuo,
2008; Terpos et al., 2009; Weber et al., 2010; Weber et al., 2011), inclusive para o CEC
oral (Ingale et al., 2014; Mardani et al., 2014). Em um estudo clínico prospectivo,
Bramwell et al. (2006) dosaram os níveis plasmáticos de OPN em mulheres com
diagnóstico recente de metástases de carcinoma de mama. Nesse trabalho, os autores
observaram um aumento significativo da OPN em função do tempo, bem como uma
correlação entre níveis plasmáticos elevados de OPN e reduzida taxa de sobrevida das
pacientes. Além da presença no plasma, a expressão de OPN no tecido tumoral
também afeta o prognóstico do paciente. Zhang et al. (2009) demonstraram que
indivíduos com câncer gástrico, cujo tumor mostrou-se positivo para OPN,
apresentavam pior prognóstico e redução de sobrevida em comparação àqueles
portando a neoplasia negativa para OPN. De modo semelhante, níveis de RNAm para
OPN em câncer colorretal exibiram correlações positivas com o estágio da doença,
metástases para linfonodos, invasão de vasos sanguíneos e linfáticos, e correlações
negativas com o período livre da doença e a sobrevida do paciente (Likui et al., 2010).
Para o CEC oral, a expressão de OPN está associada com o tamanho do tumor (T3-
8
T4), envolvimento de linfonodos cervicais (N1-N2), estágios avançados da doença (III-
IV) e redução da taxa de sobrevida (Chien et al., 2009).
A OPN atua em múltiplas etapas da carcinogênese. Em um modelo de
progressão do carcinoma de mama, Cook et al. (2005) demonstraram que a expressão
de diversos genes é modulada pela OPN. Como consequência, diferentes vias de
sinalização podem ser estabelecidas, como AKT, Raf/MEK/ERK (Robertson et al.,
2010), ILK/PI3K/GSK-3β (Robertson et al., 2010) e RAN GTPase/c-Met/PI3 quinase
(Kurisetty et al., 2008; Yuen et al., 2012). Essas alterações resultam em mudanças
fundamentais na fisiologia celular, que, conjuntamente, determinam o fenótipo maligno
(Shevde & Samant, 2014).
A adesão de células neoplásicas à OPN, bem como aos seus diferentes
fragmentos, acontece por meio de inúmeros tipos de integrinas e pelas distintas
variantes do receptor CD44 expressas na superfície das células (Gao et al., 2003;
Marroquin et al., 2004; Beausoleil et al., 2011). Células do mieloma múltiplo, por
exemplo, se ligam à OPN, indicando que o aumento da expressão de OPN no estroma
tumoral, característico de mielomas múltiplos, poderia representar um dos fatores
responsáveis pela retenção das células neoplásicas na medula óssea (Standal et al.,
2004a). Além disso, a OPN também modula positivamente a migração celular. Shevde
et al. (2006) demonstraram que o bloqueio da expressão de OPN reduz o potencial de
migração de linhagens celulares derivadas de carcinoma de mama. Parte desses
efeitos é mediado por diferentes integrinas, entre as quais αvβ1, αvβ5, α4β1, α9β1 e
α8β1 (Hu et al., 1995a; Hu et al., 1995b; Smith et al., 1996; Bayless et al.,1998; Denda
et al., 1998). Contudo, a integrina mais comumente associada aos efeitos da OPN
sobre células malignas é a αvβ3 (Seftor et al., 1999; Jin et al., 2012; Jin et al., 2014;
Zhang et al., 2014). Chen et al. (2009) demonstraram que a interação entre a integrina
αvβ3 e a OPN ativa a via de sinalização FAK/ERK/NF-κB e promove aumento da
migração de células de condrossarcoma. Resultados semelhantes foram observados
para células derivadas de carcinoma de pulmão (Fong et al., 2009).
Assim como descrito para as integrinas, as variantes de 3 a 9 do receptor CD44,
também afetam os processos de adesão e migração celulares (Ponta et al., 2003;
Caers et al., 2006; Orian-Rousseau, 2010; Orian-Rousseau & Sleeman, 2014). Khan et
9
al. (2005) demonstraram que OPN induz a expressão dos receptores CD44v6 e
CD44v9 em células de carcinoma de mama, com consequente aumento da migração
celular. Corroborando esses achados, células derivadas de camundongos knock-out
para OPN exibem reduzida adesão e migração celulares mediadas pelo receptor CD44
(Zohar et al., 2000). A ativação do receptor CD44 pela OPN também pode promover a
adesão e migração de células neoplásicas de forma indireta, por meio da expressão de
integrinas, particularmente as que contem a subunidade β1 (Lee et al., 2007). Como
resultado dessa ativação, as integrinas recrutam as vias de sinalização de HGF e EGF
e promovem o aumento da migração celular (Tuck et al., 2000; Tuck et al., 2003). Além
do papel das integrinas e do receptor CD44, há evidências de que a OPN também
pode afetar a migração celular por meio da interação com os complexos de adesão
focal (Tuck et al., 2000; Li et al., 2007). Dessa forma, a OPN é capaz de modular a
motilidade das células neoplásicas pela ativação de diferentes mecanismos.
O crescimento de tumores malignos ocorre principalmente por desregulação do
ciclo celular, que resulta em proliferação excessiva das células neoplásicas, bem como
pela evasão do processo de apoptose (Hanahan & Weinberg, 2011). A OPN promove a
proliferação celular de várias neoplasias malignas (Angelucci et al., 2004; Khodavirdi et
al., 2006; Phillips et al., 2012; Liu et al., 2014; Yang et al., 2014), sendo seu efeito
mediado, predominantemente, pelo receptor do EGF e pela sinalização do cálcio
intracelular (Lecrone et al., 2000; Angelucci et al., 2004). Como consequência,
diferentes vias são estabelecidas, como, por exemplo, a via das quinases ativadas por
mitógenos (Rangaswami et al., 2006). Por outro lado, o silenciamento da expressão de
OPN reduz a proliferação de células neoplásicas (Muramatsu et al., 2005; Wu et al.,
2014).
A angiogênese, processo de formação de novos vasos sanguíneos a partir dos
já existentes, é fundamental para o crescimento e metástase das neoplasias malignas
(Hanahan & Folkman, 1996; Tomao et al., 2014). Estudos recentes têm demonstrado o
papel da OPN na angiogênese tumoral (Kale et al., 2014; Wu et al., 2014; Yu et al.,
2014). De fato, a expressão de OPN está positivamente correlacionada com a
microdensidade vascular e a neovascularização tumoral (Jain et al., 2006; Tang et al.,
2007; Du et al., 2009). O efeito da OPN sobre a angiogênese pode ser atribuído, pelos
10
menos em parte, à expressão de integrina αvβ3 na membrana plasmática de células
endoteliais, cuja ativação promove a migração celular durante a formação de novos
vasos (Brooks et al., 1994). Outras moléculas, como o VEGF, FGF-2 e o PGE2 podem
induzir a angiogênese via OPN (Shijubo et al.,1999; Leali et al., 2003; Jain et al., 2006).
As neoplasias são capazes de degradar a matriz extracelular por meio de, pelo
menos, duas vias que controlam os mecanismos de proteólise: a dos ativadores de
uPA e a das MMPs (Bellahcène et al., 2008). Diversos estudos demonstram aumento
da invasão celular mediada pela OPN (Khodavirdi et al., 2006; Song et al., 2009; Zhang
R et al., 2011, Courter et al., 2010; Song et al., 2015). Com efeito, a exposição de
células derivadas de carcinoma de mama à OPN resulta em maior invasão celular, bem
como em elevados níveis de expressão de uPA e de atividade de uroquinase (Mi et al.,
2006). Resultados semelhantes foram descritos por Chen R et al. (2011). Nesse
trabalho, os autores induziram a sobre-expressão de OPN em células derivadas de
carcinoma hepático e observaram um aumento da invasão celular, provavelmente
mediado por MMP 2 e uPA. Interessantemente, o silenciamento da expressão de OPN
reduz os níveis de MMP 2 e MMP 9 e, consequentemente, o processo de invasão
celular (Liu et al., 2010a; Liu et al., 2010b).
Devido à sua participação em diferentes etapas do processo de tumorigênese, a
OPN tem sido considerada um potencial alvo terapêutico (Bandopadhyay et al., 2014).
Inibição da expressão, modulação das alterações pós-tradução e bloqueio da proteína
e/ou receptores são possíveis estratégias por meio das quais os efeitos da OPN sobre
as células neoplásicas malignas podem ser reduzidos e/ou eliminados (Johnston et al.,
2008; Ahmed et al., 2011). Contudo, estudos ainda são necessários para a melhor
compreensão dos eventos que controlam a expressão de OPN e as vias que são
estabelecidas após a ligação da OPN com seus receptores (Johnston et al., 2008).
2.3 Invasão do CEC oral no tecido ósseo
O CEC oral invade o tecido ósseo com uma prevalência que varia entre 12% e
56% dos casos (Hoffmannová et al., 2010; Chen Y et al., 2011; Lubek et al., 2011). O
envolvimento do tecido ósseo contribui para os aumentos da morbidade e das taxas de
11
recidiva e de mortalidade do CEC oral (Shaw et al., 2004; Ebrahimi et al., 2011; Fried et
al., 2014). Nesses casos, previamente ao tratamento, o paciente deve ser avaliado,
clinicamente e por exames de imagem, para determinar a extensão da invasão tumoral
(Van Cann et al., 2008). O exame clínico do tumor e das estruturas adjacentes
fornecem sinais sugestivos de invasão, como espessamento cortical, irregularidades da
superfície óssea, parestesia do nervo alveolar inferior e dor (Rao et al., 2004; Pandey
et al., 2009). Em um primeiro momento, as radiografias convencionais (panorâmicas e
periapicais) podem ser utilizadas para identificar sinais de invasão. Contudo, exames
mais sofisticados, como tomografia computadorizada (multi-detector e/ou emissão de
pósitrons), cintilografia e ressonância magnética exibem maior sensibilidade para a
detecção da invasão óssea (Vidiri et al., 2010; Abd El-Hafez et al., 2011). O tratamento
de escolha é a remoção cirúrgica completa do tumor juntamente com o tecido ósseo
comprometido. A ressecção cirúrgica pode ser marginal, com manutenção da
integridade do tecido ósseo, ou segmentar, com perda de sua continuidade (Van Cann
et al., 2008). De modo geral, a ressecção marginal se aplica aos casos em que não há
evidências de invasão óssea ou, quando presente, não envolve o canal mandibular; por
outro lado, a ressecção segmentar está indicada para lesões extensas no tecido ósseo
e para os casos que acometem mandíbulas atróficas. Contudo, recomenda-se que a
decisão final seja tomada no transoperatório, por meio de criteriosa avaliação da
proximidade e da fixação do CEC oral ao tecido ósseo (Rao et al., 2012).
O CEC oral progride no osso por meio de três padrões histopatológicos: erosivo,
infiltrativo e misto, uma combinação entre os dois primeiros. O padrão erosivo é
marcado pela interface nítida entre o tumor e o tecido ósseo e pela ausência de ilhotas
de tecido mineralizado no interior da massa tumoral. Diferentemente, o padrão
infiltrativo é caracterizado por projeções e ninhos de células neoplásicas ao longo de
uma superfície óssea irregular, bem como pela presença de ilhotas residuais de tecido
ósseo no interior da massa tumoral e por invasão dos sistemas haversianos pelas
células neoplásicas (Jimi et al., 2011). O padrão histopatológico de invasão parece
correlacionar-se com o comportamento clínico do tumor. Com efeito, as lesões
infiltrativas exibem uma maior chance de recorrência local e à distância (Wong et al.,
2000). Assim, a classificação histopatológica fornece uma importante informação para
12
o prognóstico do paciente e deve ser rotineiramente solicitada para os casos de CEC
oral que invadem o tecido ósseo (Wong et al, 2000).
A invasão do tecido ósseo pelo CEC oral é um processo altamente coordenado,
podendo ser divido em três fases: 1) inicial, 2) de reabsorção e 3) final (Quan et al.,
2012). Várias moléculas controlam essas fases e exercem funções distintas em cada
uma delas. Na fase inicial, quando os osteoclastos ainda não foram recrutados,
proteases derivadas das células neoplásicas auxiliam na degradação da matriz óssea.
Nessa etapa, atuam predominantemente as MMPs e as catepsinas (Kawamata et al.,
1997; Kawasaki et al., 2002; Erdem et al., 2007; Chuang et al., 2008). Na fase seguinte,
os osteoclastos assumem o papel principal na reabsorção da MEC óssea. Essas
células surgem a partir da fusão de precursores mononucleares da linhagem
monocítica/macrofágica, derivados da medula óssea (Cappariello et al., 2014; Gruber,
2014). A diferenciação osteoclástica é regulada por um complexo sistema de
sinalização que envolve três moléculas principais: RANKL, RANK e OPG (Boyce &
Xing, 2008; Lacey et al., 2012). O RANKL é sintetizado por osteoblastos, osteócitos
(Bellido, 2014) e por células do estroma da medula óssea, e induz a osteoclastogênese
por meio de sua ligação ao RANK, uma proteína transmembrana localizada na
superfície de monócitos/macrófagos e de osteoclastos maduros (Boyce, 2013). A OPG,
secretada por osteoblastos e células do estroma da medula óssea, bloqueia a ação de
RANKL e inibe a osteoclastogênese (Martin & Sims, 2015). Assim, o equilíbrio entre a
expressão de RANKL e OPG é fundamental para a diferenciação e a função
osteoclásticas. Essa via de sinalização está envolvida na invasão do tecido ósseo e na
formação de metástase por neoplasias osteotrópicas (Ibrahim et al., 2011; Casimiro et
al., 2013; Li X et al., 2014; Sigl & Penninger, 2014). No CEC oral, as células
neoplásicas são capazes de promover a diferenciação osteoclástica, diretamente, pela
secreção de RANKL ou, indiretamente, pela indução da síntese de RANKL por células
do estroma tumoral (Ishikuro et al., 2008; Sato et al., 2013). Além disso, as células do
CEC oral são capazes de inibir a expressão de OPG derivada de osteoblastos,
aumentado, assim, os níveis relativos de RANKL e, consequentemente, a diferenciação
osteoclástica (Tada et al., 2005). Paralelamente ao sistema RANK-RANKL, diversas
citocinas atuam ativamente na reabsorção do tecido ósseo promovida pelo CEC oral.
13
Células neoplásicas, com alto potencial de invasão do tecido ósseo, expressam
elevados níveis de IL 6 e são capazes de promover a osteoclastogênese (Kayamori et
al., 2010). Por outro lado, a inibição dessa citocina reduz a invasão óssea pelo CEC
oral (Okamoto et al., 2000). Diversos estudos in vitro e in vivo demonstraram a síntese
de outras citocinas e fatores pelas células neoplásicas, incluindo IL 1α/β, IL 6, IL 8, IL
11, TNF-α e PTHrP (Jimi et al., 2011). Em um estudo sobre o perfil de expressão de
citocinas em CECs orais com invasão óssea, notaram-se níveis significativamente
maiores de IL 6, IL 11 e TNF-α, indicando sua importância nesse fenômeno (Shibahara
et al., 2005). As quimiocinas, uma subfamília das citocinas, exercem seus efeitos por
meio de receptores de membrana acoplados à proteína G (Zlotnik & Yoshie, 2000;
Sarvaiya et al., 2013). Essas moléculas, presentes na MEC óssea e secretadas por
células neoplásicas, ativam, direta ou indiretamente, as células osteoclásticas (Bonfil et
al., 2007; Lee et al., 2012; Palacios-Arreola et al., 2014). Pandruvada et al. (2010)
demonstraram que a quimiocina CXCL13 derivada de CEC oral promove a quimiotaxia
de monócitos do sangue periférico, contribuindo para a formação dos osteoclastos.
Recentemente, Oue et al. (2012) relataram que a quimiocina CXCL2 secretada pelo
CEC oral induz a osteoclastogênese pelo aumento dos níveis de expressão de RANKL
e redução de OPG em células do estroma tumoral. Contudo, essa quimiocina pode
atuar diretamente na diferenciação osteoclástica, promovendo migração, proliferação e
fusão de células precursoras mononucleares (Ha et al., 2010). O PTHrP é responsável
pela ativação osteoclástica e reabsorção do tecido ósseo em diversas neoplasias
(Kayamori et al., 2010; Cafforio et al., 2014). Essa molécula foi descrita inicialmente
como o principal fator de hipercalcemia associada à malignidade (Nakajima et al.,
2013) e é altamente expressa em CECs que invadem o osso (Shibahara et al., 2005;
Deyama et al., 2008). O PTHrP pode atuar de modo sinérgico com outras moléculas
presente no microambiente tumoral, como TGF-β (Takayama et al., 2010). Com a
reabsorção óssea, os níveis de TGF-β aumentam no microambiente tumoral, induzindo
a expressão de PTHrP pelas células neoplásicas. Além desse efeito, o TGF-β promove
a transição epitélio-mesenquimal e, consequentemente, a invasão do CEC oral no
tecido ósseo (Takayama et al., 2010; Quan et al., 2013). Na fase final de invasão, com
a intensa reabsorção do tecido ósseo pelo CEC oral, fatores de crescimento, citocinas
14
e outras moléculas bioativas que estavam incorporadas na MEC mineralizada tornam-
se disponíveis e atuam sobre as células neoplásicas e os demais elementos do
microambiente tumoral, o que inclui o estímulo à osteoclastogênese, estabelecendo,
assim, um círculo vicioso que acelera o processo de reabsorção óssea (Shimo et al.,
2008; Goda et al., 2010; Chappard et al., 2011; Krishnan et al., 2014).
Considerando a complexidade das interações celulares e moleculares que
influenciam a reabsorção óssea induzida pelo CEC oral, é relevante que novos estudos
avaliem os efeitos recíprocos entre os diferentes tipos celulares envolvidos, i.e. células
do parênquima e do estroma tumoral e células ósseas, para identificar moléculas que
promovam os processos de invasão e destruição óssea e, assim, definir possíveis
marcadores prognósticos e potenciais alvos terapêuticos.
15
3 PROPOSIÇÃO
3.1 Objetivo geral
Investigar os efeitos da OPN em sistemas de cocultura de células osteoblásticas
e epiteliais neoplásicas malignas humanas sobre o fenótipo neoplásico e a ativação
osteoclástica.
3.2 Objetivos específicos
1. Determinar o perfil de expressão de OPN em culturas de células
osteoblásticas e epiteliais neoplásicas malignas humanas isoladamente e em sistema
de coculturas.
2. Verificar o efeito da OPN produzida por células osteoblásticas sobre a
expressão gênica e o fenótipo de células epiteliais neoplásicas malignas humanas em
cocultura.
3. Analisar os efeitos da OPN secretada nas coculturas sobre a atividade
osteoclástica e citocinas envolvidas na diferenciação e ativação osteoclástica.
16
17
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Culturas celulares
4.1.1 Obtenção e cultura de SAOS-2
Células SAOS-2 (ATCC, Manassas, VA, EUA) foram descongeladas e
transferidas para tubos de centrífuga contendo 10 mL de McCoy's 5A (Sigma, St. Louis,
MO, EUA) e centrifugadas a 336 g por 3 min. O sobrenadante foi desprezado e as
células foram cultivadas em frascos de cultura de 75 cm2 (Corning Incorporated,
Costar, Corning, Nova York, NY, EUA) contendo McCoy's 5A (Sigma) suplementado
com 15% de soro fetal bovino (Gibco, Invitrogen, Grand Island, Nova York, NY, EUA),
100 IU/mL de penicilina (Invitrogen) e 50 µg/mL estreptomicina (Invitrogen). Na
subconfluência, foi removido o meio de cultura e adicionada solução de tripsina a
0,25% (Gibco) e EDTA a 1 mM (Gibco) para obtenção de suspensão de células. Em
seguida, foram plaqueadas 2x104 células/poço em placas de poliestireno de 24 poços
(Corning Incorporated) e cultivadas em McCoy's 5A (Sigma) suplementado com 10%
de soro fetal bovino (Gibco), 7 mM de β-glicerofosfato (Sigma), 5 µg/mL de ácido
ascórbico (Gibco), 100 IU/mL de penicilina (Invitrogen) e 50 µg/mL estreptomicina
(Invitrogen). As culturas foram mantidas por períodos de até 10 dias e sua progressão
foi avaliada em microscópio de fase invertido (Axiovert 25, Zeiss, Jena, Alemanha). O
meio de cultura foi trocado a cada 2 ou 3 dias. Durante todo o tempo de cultivo as
células foram mantidas a 37ºC em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 e 95%
de ar atmosférico.
4.1.2 Obtenção e cultura de SCC-9
Células SCC9 (ATCC) foram descongeladas e transferidas para tubos de
centrífuga contendo 10 mL de DMEM/Ham’s F12 (Gibco) e centrifugadas a 336 g por 3
min. O sobrenadante foi desprezado e as células foram cultivadas em frascos de
cultura de 75 cm2 (Corning Incorporated) contendo DMEM/Ham’s F12 (Gibco)
suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco), 50 μg/mL de vancomicina (Acros
18
Organics, Geel, Antwerp, Bélgica), 50 µg/mL gentamicina (Invitrogen) e 0,4 μg/mL de
hidrocortisona (Sigma). Na subconfluência, foi removido o meio de cultura e adicionada
solução de tripsina a 0,25% (Gibco) e EDTA a 1 mM (Gibco) para obtenção de
suspensão de células. Em seguida, foram plaqueadas 2x104 células/poço em placas de
poliestireno de 24 poços (Corning Incorporated). As culturas foram mantidas por
períodos de até 10 dias e sua progressão foi avaliada em microscópio de fase invertido
(Zeiss). O meio de cultura foi trocado a cada 2 ou 3 dias. Durante todo o tempo de
cultivo as células foram mantidas a 37ºC em atmosfera umidificada contendo 5% de
CO2 e 95% de ar atmosférico.
4.1.3 Obtenção e cultura de U-937
Células U-937 (ATCC) foram descongeladas e transferidas para tubos de
centrífuga contendo 10 mL de RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA)
e centrifugadas a 336 g por 3 min. O sobrenadante foi desprezado e as células foram
cultivadas em frascos de cultura de 75 cm2 (Corning Incorporated) contendo RPMI
1640 (Life Technologies) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco), 100
IU/mL de penicilina (Invitrogen) e 50 µg/mL estreptomicina (Invitrogen). Para induzir à
diferenciação osteoclástica, as células foram cultivadas com RPMI 1640 suplementado
com 12-O-tetradecanoilforbol 13-acetato (TPA; Sigma) na concentração de 10-7 M.
Após 48 h, o meio foi removido e as culturas foram lavadas uma vez com RPMI 1640
para remover as células não aderidas. Em seguida, foi acrescentado RPMI 1640
suplementado com 1,25 dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3; Sigma) na concentração de
10-8 M por 6 dias (Amoui et al., 2004). A progressão da cultura foi avaliada em
microscópio de fase invertido (Zeiss) e o meio de cultura, trocado a cada 2 ou 3 dias.
Durante todo o tempo de cultivo as células foram mantidas a 37ºC em atmosfera
umidificada contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico.
19
4.2 Análise do perfil de expressão de OPN em células SAOS-2 e SCC9
Para determinar o perfil de expressão de OPN, foram realizadas: 1) detecção de
OPN por imunofluorescência indireta; 2) expressão de OPN por Real Time PCR e 3)
quantificação de OPN por ELISA, conforme metodologia descrita a seguir:
4.2.1 Imunolocalização de OPN por imunofluorescência indireta
Aos 3, 5, 7 e 10 dias, as culturas foram fixadas em paraformaldeído a 4% em PB
a 0,1 M, pH 7,2, por 10 min à TA. Em seguida, as células foram processadas
rotineiramente para imunofluorescência indireta (Schwartz Fo et al., 2007). A
permeabilização foi feita com solução de Triton X-100 a 0,5% em PB por 10 min,
seguida de bloqueio com leite desnatado a 5% em PB por 30 min. Anticorpo primário
para OPN (1:800, MPIIIB10-1, DSHB, Iowa City, IA, EUA) foi utilizado, seguido de
anticorpo secundário conjugado com fluoróforo Alexa Fluor 594 (fluorescência
vermelha; 1:200, Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) em mesma solução de faloidina
conjugada com Alexa Fluor 488 (fluorescência verde; 1:200, Molecular Probes), usada
para visualização do citoesqueleto de actina. A incubação do anticorpo foi feita em
atmosfera úmida por 60 min em TA. Entre cada incubação, as amostras foram lavadas
três vezes (5 min cada) em PB. Antes da montagem para observação microscópica, as
amostras foram lavadas rapidamente com água bidestilada e os núcleos celulares,
marcados com DAPI (Molecular Probes) a 300 nM por 5 min. As lamínulas de
Thermanox® (Nunc Inc., Rochester, NY, EUA) foram montadas sobre lâminas de vidro
com meio de montagem anti-fade (Vectashield, Vector Labs, Burlingame, CA, EUA) e
examinadas utilizando microscópio de fluorescência Zeiss modelo AxioImager M2
(Zeiss), acoplado a uma câmara digital AxioCam MRm. As imagens adquiridas foram
processadas com o programa Adobe Photoshop CS5.1.
20
4.2.2 Expressão de OPN por Real Time PCR
As reações de Real Time PCR foram feitas utilizando-se o sistema TaqMan
(Invitrogen), no aparelho CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). Após o
período de 3, 5, 7 e 10 dias, as células foram coletadas com o reagente Trizol (Gibco) e
a extração do RNA total foi realizada por meio do kit SV Total RNA Isolation System
(Promega, Madison, WI, EUA), de acordo com especificações do fabricante.
Posteriormente, a concentração e a pureza do RNA total foram avaliadas por
espectrofotometria em aparelho NanoVue Plus (GE Healthcare Life Sciences,
Piscataway, NJ, EUA). A leitura foi realizada em diferentes comprimentos de onda (260
nm, 280 nm e 230 nm), para obtenção da concentração de RNA/µL e detecção de
contaminação das amostras por proteínas e fenol. A integridade do RNA foi verificada
previamente aos ensaios de Real Time PCR pela visualização de duas subunidades
ribossômicas características de células eucarióticas (18S e 28S). Essa análise foi
realizada por meio do aparelho 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara,
CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Foram consideradas amostras
viáveis para realização da Real Time PCR aquelas que apresentavam valores de RIN
superiores a 8 (escores variando de 0 a 10; consulte-se o Apêndice 1). Em seguida, foi
confeccionada a fita de cDNA a partir de 1 µg de RNA total. Esse procedimento foi feito
no termociclador Mastercycle Gradient (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) por meio de
reação com a enzima transcriptase reversa, utilizando-se o kit High-capacity cDNA
Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As reações de
Real Time PCR foram realizadas em triplicata com volume final de 10 µL e quantidade
de cDNA correspondente a 11,25 ng do RNA inicial. A reação de amplificação foi
composta por: a) 50°C por 2 min; b) 95°C por 10 min, e c) 40 ciclos a 95°C por 15 s e
60°C por 1 min (desnaturação e extensão). Os resultados foram analisados com base
no valor de Ct, sendo esse o ponto correspondente ao número de ciclos em que a
amplificação das amostras atinge um limiar (determinado entre o nível de fluorescência
dos controles negativos e a fase de amplificação exponencial das amostras), que
permitiu a análise quantitativa da expressão do gene avaliado. Como controle
endógeno, foi avaliada a expressão do gene β-actina. A expressão do controle
21
endógeno foi utilizada para a normalização dos níveis de expressão do gene alvo. Uma
amostra negativa (água) foi submetida à reação com cada uma das sondas utilizadas.
O método de 2-ΔΔCT (Livak & Schmittgen, 2001) foi utilizado para determinar a
expressão de OPN das células osteoblásticas e epiteliais neoplásicas, isoladas e em
sistemas de cocultura.
4.2.3 Quantificação de OPN por ELISA
Ao final de 3, 5, 7 e 10 dias, o sobrenadante das culturas foi coletado para
quantificação de OPN. Brevemente, o meio de cultura foi removido 24 h antes de cada
tempo experimental, e foram acrescentados 500 µL do meio de cultura sem soro. Em
seguida, o meio foi coletado e centrifugado a 336 g por 10 min. Após a centrifugação,
apenas a fração superior foi coletada para eliminar qualquer contaminação celular.
Posteriormente, foi adicionado 1 µL do coquetel de inibidor de protease (Sigma), sendo
o meio aliquotado em tubos Eppendorf de 1,5 mL e estocados em freezer -80°C até o
momento do uso. Para a realização desta técnica foi utilizado o kit DuoSet para OPN
humana (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA), seguindo-se as orientações do
fabricante. Os valores obtidos de expressão de OPN foram normalizados pelo número
de células.
4.3 Análise do perfil de expressão de OPN em coculturas de SAOS-2/SCC9
O efeito do microambiente tumoral sobre o perfil de expressão de OPN foi
avaliado por meio do cocultivo de células SAOS-2 e SCC9, conforme protocolo descrito
no item 4.3.1. Foram avaliadas: 1) detecção de OPN por imunofluorescência indireta; 2)
expressão de OPN por Real Time PCR e 3) quantificação de OPN por ELISA, descritas
nos itens 4.2.1, 4.2.2 e 4.2.3. Especificamente para o ensaio de ELISA, 24 h antes de
cada tempo experimental, as células SAOS-2 e SCC9 em cocultura foram separadas,
acrescentados 500 µL de meio sem soro por 24 h para, em seguida, ser coletado e
centrifugado a 336 g por 10 min. Após a centrifugação, apenas a fração superior foi
coletada para eliminar qualquer contaminação celular. Posteriormente, foi adicionado 1
22
µL do coquetel de inibidor de protease (Sigma), sendo o meio aliquotado em tubos
Eppendorf de 1,5 mL e estocados em freezer -80°C até o momento do uso.
4.3.1 Coculturas de SAOS-2/SCC9
SAOS-2 foram plaqueadas na densidade de 2x104 células/poço em placas de
poliestireno de 24 poços (Corning Incorporated) e cultivadas na presença de McCoy's
5A (Sigma) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco), 7 mM de β-
glicerofosfato (Sigma), 5 µg/mL de ácido ascórbico (Gibco), 100 IU/mL de penicilina
(Invitrogen) e 50 µg/mL estreptomicina (Invitrogen). Em seguida, SCC9 foram
plaqueadas sobre membranas de Transwell® (Corning Incorporated), com poro de 0,4
µm, posicionadas sobre a cultura de SAOS-2. A densidade de plaqueamento foi de 104
células/Transwell®.
4.4 Avaliação do efeito da OPN secretada por SAOS-2 sobre a expressão gênica e
o fenótipo de células SCC9 em cocultura
As respostas de células SCC9 cocultivadas com SAOS-2 foram avaliadas sob as
seguintes condições experimentais:
Cocultura: SCC9 foram cocultivadas durante o pico de expressão de OPN em
culturas de SAOS-2.
Cocultura+RNAi: SCC9 foram cocultivadas com SAOS-2 em que a expressão
de OPN foi silenciada por RNAi.
SCC9: SCC9 cultivadas isoladamente (controle).
4.4.1 Silenciamento do transcrito do gene da OPN por RNAi
O silenciamento gênico da OPN foi realizado por meio da técnica de RNAi,
utilizando-se pequenas moléculas de RNA dupla fita, conhecidas como siRNA, que
possuem sequência específica complementar ao RNAm alvo. Para o presente estudo,
foram adquiridas sequências pré-desenhadas de oligonucleotídeos complementares ao
RNAm da OPN (Silencer® Select siRNA; ID: s13376; Invitrogen) e como agente de
23
transfecção foi utilizada a lipofectamina (Lipofectamine® RNAiMAX Transfection
Reagent; Invitrogen). A eficiência da transfecção foi avaliada por meio do bloqueio do
gene GAPDH. Os resultados dos ensaios de silenciamento estão descritos no
Apêndice 2.
Para análise dos efeitos da OPN derivada de células SAOS-2 sobre o fenótipo
neoplásico foram avaliados os seguintes parâmetros:
4.4.2 Adesão celular
Para a quantificação da adesão celular, as células SCC9 foram avaliadas em 4 e
24 h de cocultivo com SAOS-2, sob as condições experimentais descritas no item 4.4.
Após cada período, o Transwell® (Corning) contendo as células foi transferido para uma
nova placa e os poços foram lavados três vezes com PBS (Gibco) aquecida a 37ºC
para remover as células não aderidas. Em seguida, cada Transwell® foi preenchido
com 200 µL de uma solução de EDTA a 1 mM e tripsina a 0,25% (Gibco) para remover
as células aderidas. O número de células foi contado utilizando hemocitômetro (Fischer
Scientific). A adesão celular foi expressa como porcentagem do número de células
aderidas em relação ao número inicialmente plaqueado (104células/Transwell®).
4.4.3 Proliferação celular
A proliferação celular foi expressa em termos de proporção de células no ciclo
celular por imunomarcação ao antígeno nuclear Ki-67, expresso apenas por células
durante o ciclo celular e não por células em G0 (Scholzen & Gerdes, 2000). Foram
avaliados, por imunofluorescência indireta, 5 espécimes de cada grupo experimental,
em objetiva de 20X, determinando-se a proporção de células Ki-67 positivas de um
total de células aderidas e espraiadas não inferior a 100 (3 a 5 campos microscópicos),
quantificadas pela marcação do DNA nuclear por DAPI (De Oliva et al., 2009). O
método de imunofluorescência indireta está descrito no item 4.2.1.
24
4.4.4 Migração celular
Para o ensaio de migração celular, células SCC9 foram ressuspendidas em 200
μL de McCoy's 5A na ausência de soro e plaqueadas sobre Transwell® (poro: 8 µm;
Corning Incorporated) na densidade de 105 células/Transwell®. Em seguida, as células
SCC9 foram cocultivadas com SAOS-2 sob as condições experimentais descritas no
item 4.4. Após 24 h de cocultivo, as células remanescentes localizadas na parte
superior da membrana foram removidas com o auxílio de um swab. Posteriormente, as
células presentes na parte inferior foram fixadas em metanol (Merck, Darmstadt,
Alemanha) por 2 min à TA e coradas com azul de toluidina a 1% por 2 min. A
quantificação da migração celular foi realizada por contagem em microscópio de luz
Leica modelo DMLB (Leica, Bensheim, Alemanha), acoplado à câmera digital
DFC310FX. As imagens adquiridas foram processadas com o programa Adobe
Photoshop CS5.1. Para cada Transwell® foram selecionados quatro campos aleatórios
em objetiva de 20x. Os dados obtidos foram expressos em porcentagem de migração.
4.4.5 Invasão celular
O ensaio de invasão foi realizado utilizado-se o kit BD BioCoat™ Matrigel™
Invasion Chamber (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA). Esse sistema é composto por
placas de 24 poços contendo Transwell® de politereftalato de etila com poros de 8 μm
recobertos por uma camada fina e uniforme de Matrigel. Esse revestimento mimetiza in
vitro a membrana basal e impede a passagem de células não invasivas pelos poros da
membrana. Para realização deste ensaio, células SCC9 foram ressuspendidas em 200
μL de McCoy's 5A na ausência de soro e plaqueadas sobre BD BioCoat™ Matrigel™
Invasion Chamber na densidade de 105 células/Transwell®. Em seguida, as células
SCC9 foram cocultivadas com SAOS-2 sob as condições experimentais descritas no
item 4.4. Após 24 h de cocultivo, as células remanescentes localizadas na parte
superior da membrana foram removidas com o auxílio de um swab. Posteriormente, as
células presentes na parte inferior foram fixadas em metanol (Merck) por 2 min à TA e
coradas com azul de toluidina a 1% por 2 min. A quantificação da invasão celular foi
25
realizada por contagem em microscópio de luz Leica modelo DMLB (Leica, Bensheim,
Alemanha), acoplado à câmera digital DFC310FX. As imagens adquiridas foram
processadas com o programa Adobe Photoshop CS5.1. Para cada Transwell® foram
selecionados quatro campos aleatórios em objetiva de 20x. Os dados obtidos foram
expressos em porcentagem de invasão, determinada a partir do quociente entre
número de células que invadiram pela média das células que migraram.
4.4.6 PCR Array
A técnica PCR Array permite a análise simultânea de 84 genes envolvidos em
vias específicas de sinalização. Para a reação de PCR Array, foram adicionados em
um tubo Falcon: 1350 μL do tampão 2X SuperArray RT2 qPCR Master Mix; 102 μL de
reação de síntese de cDNA (descrita no item 4.2.2) diluídos 5,6 vezes e 1248 μL de
água deionizada. Foram adicionados 25 μL dessa mistura em cada poço da placa já
contendo pares de primers liofilizados. Em seguida, a reação de Real Time PCR foi
executada no aparelho CFX96 (BioRad) e os cálculos realizados pelo Software RT2
Profiler PCR Array Data Analysis (QIAGEN, Valencia, CA, EUA). Genes apresentando
valores de Ct acima de 35 foram considerados não expressos. No Anexo (consulte-se
Tabela 2) encontra-se a tabela contendo os genes envolvidos nos processos de
invasão e metástase presentes na placa de PCR Array.
A normalização e quantificação relativa da expressão gênica foram realizadas
pelo método de 2-ΔΔCT (Livak & Schmittgen, 2001). Usando esse método, os dados
foram representados como diferença (em vezes) na expressão gênica, que foi
normalizada pela média geométrica dos genes endógenos β-actina e GAPDH e relativa
ao controle, composto por culturas de SCC9 crescidas isoladamente.
26
4.5 Avaliação do efeito da OPN secretada por SAOS-2, em cocultura com células
SCC9, sobre a atividade de osteoclastos humanos e citocinas envolvidas na
diferenciação e ativação osteoclástica
O efeito da OPN secretada em coculturas de SAOS-2/SCC9 sobre a ativação de
osteoclastos humanos foi avaliado sob as seguintes condições experimentais:
SAOS-2: células osteoclásticas foram expostas ao eluente obtido a partir de
SAOS-2 cultivadas isoladamente.
SAOS-2/Cocultura: células osteoclásticas foram expostas ao eluente obtido a
partir de SAOS-2, após seu cocultivo com SCC9.
SAOS-2/Cocultura+RNAi: células osteoclásticas foram expostas ao eluente
destituído de OPN, obtido a partir de SAOS-2, após seu cocultivo com SCC9.
SCC9: células osteoclásticas foram expostas ao eluente obtido a partir de SCC9
cultivadas isoladamente.
SCC9/Cocultura: células osteoclásticas foram expostas ao eluente obtido a
partir de SCC9, após seu cocultivo com SAOS-2.
SCC9/Cocultura+RNAi: células osteoclásticas foram expostas ao eluente
destituído de OPN, obtido a partir de SCC9, após seu cocultivo com SAOS-2.
Para obtenção dos eluentes, após o cocultivo, as células foram separadas e
cultivadas em meio sem soro por 24 h. Após esse período, os meios foram coletados e
centrifugados a 336 g por 5 min. Em seguida, os meios foram aliquotados em tubos
Eppendorf de 1,5 mL e estocados em freezer -80°C até o momento do uso.
4.5.1 Avaliação da atividade osteoclástica por meio do ensaio de reabsorção de fosfato
de cálcio
Para avaliação da atividade osteoclástica foi utilizado o sistema BD BioCoat™
Osteologic™ Bone Cell Culture (BD Biosciences). Esse sistema é composto por uma
fina lâmina de fosfato de cálcio sintético, o qual fornece um substrato sólido e uniforme
27
que pode ser utilizado para caracterizar e mensurar áreas de reabsorção formadas por
osteoclastos. Sendo assim, para avaliar a atividade de osteoclastos por meio do ensaio
de reabsorção de fosfato de cálcio, células U-937 foram cultivadas em placas de 12
poços BD BioCoat™ Osteologic™ Bone Cell Culture (BD Biosciences), na densidade
de 3,2x105 células/poço. No 6o dia de cultura, o meio foi removido e as células foram
cultivadas com os eluentes por 10 dias. Os eluentes eram trocado a cada 2 dias. Como
controle negativo, dois poços desse sistema foram incubados com meio de cultura na
ausência de células. Ao final de 10 dias, o meio foi removido e os poços foram lavados
com água milli-Q. Em seguida, foi acrescentada solução alvejante contendo hipoclorito
de sódio a 6% (Rioquímica, São José do Rio Preto, SP, Brasil) e NaCl a 5,2% (Merck)
e os poços foram deixados à TA por 5 min, para remoção das células aderidas.
Posteriormente, os poços foram lavados três vezes com água destilada e deixados à
TA para secagem. Para quantificação das áreas de reabsorção foram selecionados
aleatoriamente 10 campos de cada grupo experimental utilizando-se a objetiva de 10X
em microscópio de luz Leica modelo DMLB (Leica), acoplado à câmera digital
DFC310FX. As imagens adquiridas foram processadas com o programa Adobe
Photoshop CS5.1. Com auxílio de um analisador de imagens (Image Tool, University of
Texas Health Science Center, San Antonio, TX, EUA), as áreas de reabsorção foram
quantificadas e os dados foram expressos em porcentagem de áreas de reabsorção.
4.5.2 Quantificação de RANKL, OPG, PTHrP e citocinas inflamatórias por ELISA
Para avaliar o papel da OPN em sistemas de cocultura de SAOS-2/SCC9 sobre
a síntese de citocinas envolvidas na ativação osteoclástica, foram quantificadas as
expressões de RANKL, OPG, PTHrP e citocinas inflamatórias (IL 1α, IL 1β, IL 6, IL 8,
TNF-α e GM-CSF), a partir do eluente obtido dos grupos descritos no item 4.5. Para a
realização destes ensaios foram utilizados os kits: 1) Human TRANCE/RANK
L/TNFSF11 DuoSet (R&D Systems) 2) Human Osteoprotegerin/TNFRSF11B DuoSet
(R&D Systems); 3) Human PTHrP (Uscn Life Science, Wuhan, China); 4) Multi-Analyte
ELISArray™ Kit para citocinas inflamatórias humanas (QIAGEN). Todos os ensaios
foram realizados de acordo com as instruções dos fabricantes.
28
4.6 Análise estatística
Os dados quantitativos foram submetidos ao teste não paramétrico de Kruskal-
Wallis, seguido de pós-teste, quando apropriado. Os experimentos foram realizados em
triplicata. O nível de significância estabelecido foi de 5%.
A análise estatística dos resultados do PCR Array foi realizada por meio do
Software RT2 Profiler PCR Array Data Analysis (QIAGEN). O software realizou o teste t
entre o grupo controle (SCC9) e cada grupo experimental (Cocultura e
Cocultura+RNAi), sendo os valores posteriormente submetidos ao teste de correção de
Benjamini-Hochberg. Foram apresentados apenas os dados com cut-off de 1,5. Os
experimentos foram realizados em triplicata. O nível de significância estabelecido foi de
5%.
29
5 RESULTADOS
5.1 Análise do perfil de expressão de OPN em células SAOS-2 e SCC9
5.1.1 Imunolocalização de OPN por imunofluorescência indireta
Em células SAOS-2, a epifluorescência revelou marcação positiva para OPN em
região perinuclear em todos os tempos avaliados (Figura 1A, C, E e G). Em culturas
SCC9, eram raras as áreas positivamente marcadas para OPN. Quando detectadas,
particularmente nos períodos de 3 e 10 dias, exibiam o mesmo padrão perinuclear
observado em células SAOS-2 (Figura 1B e H).
30
Figura 1. Epifluorescência de culturas de células SAOS-2 (A, C, E e G) e SCC9 (B, D, F e H) aos 3 (A-
B), 5 (C-D), 7 (E-F) e 10 (G-H) dias. Cor vermelha para marcação de OPN, cinza para o citoesqueleto de
actina e azul para os núcleos celulares. Barra de escala = 100 µm.
31
5.1.2 Expressão de OPN por Real Time PCR
A expressão de RNAm para o gene da OPN foi distinta entre as duas linhagens
celulares e afetada pelo tempo (Kruskal-Wallis, p < 0,05). Os resultados indicaram
maiores níveis de RNAm em culturas SAOS-2 aos 7 e 10 dias em comparação àqueles
observados para SCC9 (Figura 2).
Figura 2. Expressão relativa de RNAm para OPN em culturas de células SAOS-2 e SCC9, avaliada aos
3, 5, 7 e 10 dias. Os dados foram normalizados pelo gene constitutivo β-actina e calibrados pelo período
de 3 dias. Barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p >
0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.
5.1.3 Quantificação de OPN por ELISA
A quantificação de OPN no sobrenadante das culturas indicou expressão
diferencial entre as linhagens SAOS-2 e SCC9 (Kruskal-Wallis, p < 0,05). Aos 3 dias,
em culturas de SAOS-2 e SCC9, não foram observados níveis detectáveis de OPN.
Contudo, a partir do 5o dia de cultivo, notou-se expressão crescente de OPN para
ambas as linhagens, sendo os maiores valores observados em culturas SAOS-2
(Figura 3).
0
1
2
3
4
5
3 5 7 10
Exp
ressão
rela
tiv
a d
e R
NA
m
Período (dias)
Expressão de OPN
SAOS-2
SCC9a a
b c
d
, e
f
d
32
Figura 3. Quantificação de OPN em sobrenadante de culturas de células SAOS-2 e SCC9, avaliada aos
3, 5, 7 e 10 dias. Barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre
si (p > 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.
5.2 Análise do perfil de expressão de OPN em coculturas de SAOS-2/SCC9
5.2.1 Imunolocalização de OPN por imunofluorescência indireta
O cocultivo de SAOS-2 com SCC9 resultou em aumento da expressão de OPN
em ambas as linhagens, particularmente no 10o dia, como notado, por simples
observação, por epifluorescência, em comparação com as células cultivadas
isoladamente (Figuras 4 e 5). Em todos os tempos avaliados e para ambas as
condições experimentais (células isoladas ou em cocultura), a marcação para OPN era
citoplasmática, predominantemente em região perinuclear.
0
2
4
6
8
10
3 5 7 10
pg
/10
4célu
las
Período (dias)
Quantificação de OPN Extracelular
SAOS-2
SCC9
a
c
d
b a
e
33
Figura 4. Epifluorescência de culturas de células SAOS-2 crescidas isoladamente (A, C, E e G) ou
cocultivadas com SCC9 (B, D, F e H), aos 3 (A-B), 5 (C-D), 7 (E-F) e 10 (G-H) dias. Em vermelho,
marcação para OPN, cinza para o citoesqueleto de actina e azul para os núcleos celulares. Nota-se um
aumento moderado no número de células OPN positivas para SAOS-2 em cocultura. Barra de escala =
100 µm.
34
Figura 5. Epifluorescência de culturas de células SCC9 crescidas isoladamente (A, C, E e G) ou
cocultivadas com SAOS-2 (B, D, F e H), aos 3 (A-B), 5 (C-D), 7 (E-F) e 10 (G-H) dias. Em vermelho,
marcação para OPN, cinza para o citoesqueleto de actina e azul para os núcleos celulares. Nota-se um
aumento moderado no número de células OPN positivas para SCC9 em cocultura. Barra de escala = 100
µm.
35
5.2.2 Expressão de OPN por Real Time PCR
Detectou-se uma expressão diferencial para os níveis de RNAm para OPN entre
culturas SAOS-2 crescidas isoladamente e cocultivadas com SCC9 (Kruskal-Wallis, p <
0,05). Níveis significativamente maiores de expressão de OPN ocorreram para SAOS-2
em cocultura, particularmente no 10o dia (Figura 6). Resultados semelhantes foram
observados para SCC9 em cocultura (Kruskal-Wallis, p < 0,05, Figura 7).
Figura 6. Expressão relativa de RNAm para OPN em culturas de células SAOS-2 crescidas
isoladamente ou cocultivadas com SCC9, avaliada aos 3, 5, 7 e 10 dias. Os dados foram normalizados
pelo gene constitutivo β-actina e calibrados pelo período de 3 dias de culturas SAOS-2 crescidas
isoladamente. Barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre si
(p > 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
SAOS-2ISOLADA
SAOS-2COCULTURA
SAOS-2ISOLADA
SAOS-2COCULTURA
SAOS-2ISOLADA
SAOS-2COCULTURA
SAOS-2ISOLADA
SAOS-2COCULTURA
3º dia 5º dia 7º dia 10º dia
Exp
ressão
rela
tiv
a d
e R
NA
m
Expressão de OPN
a b b
c
d c
e
f
36
Figura 7. Expressão relativa de RNAm para OPN em culturas de células SCC9 crescidas isoladamente
ou cocultivadas com SAOS-2, avaliada aos 3, 5, 7 e 10 dias. Os dados foram normalizados pelo gene
constitutivo β-actina e calibrados pelo período de 3 dias de culturas SCC9 crescidas isoladamente.
Barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os
dados são apresentados como média ± desvio padrão.
5.2.3 Quantificação de OPN por ELISA
A quantificação de OPN em sobrenadante de SAOS-2 cocultivada com SCC9
revelou níveis significativamente maiores da proteína em comparação aos de
sobrenadante de SAOS-2 isolada (Kruskal-Wallis, p < 0,05; Figura 8). Resultados
semelhantes foram observados para sobrenadante de SCC9 em cocultura, em
comparação ao de SCC9 isolada (Kruskal-Wallis, p < 0,05; Figura 9). Aos 3 dias, não
foram observados níveis detectáveis de OPN em sobrenadantes de ambas as
linhagens celulares (Figuras 8 e 9).
0
1
2
3
4
5
SCC9ISOLADA
SCC9COCULTURA
SCC9ISOLADA
SCC9COCULTURA
SCC9ISOLADA
SCC9COCULTURA
SCC9ISOLADA
SCC9COCULTURA
3º dia 5º dia 7º dia 10º dia
Exp
ressão
rela
tiv
a d
e R
NA
m
Expressão de OPN
a
b b
c
d
c
c
e
37
Figura 8. Quantificação de OPN em sobrenadante de culturas SAOS-2 crescidas isoladamente ou em
cocultura com células SCC9, avaliada aos 3, 5, 7 e 10 dias. Barras que apresentam letras semelhantes
não são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são apresentados como média ±
desvio padrão.
Figura 9. Quantificação de OPN em sobrenadante de culturas SCC9 crescidas isoladamente ou em
cocultura com células SAOS-2, avaliada aos 3, 5, 7 e 10 dias. Barras que apresentam letras
semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são apresentados como
média ± desvio padrão.
0
4
8
12
16
20
SAOS-2ISOLADA
SAOS-2COCULTURA
SAOS-2ISOLADA
SAOS-2COCULTURA
SAOS-2ISOLADA
SAOS-2COCULTURA
SAOS-2ISOLADA
SAOS-2COCULTURA
3º dia 5º dia 7º dia 10º dia
pg
/10
4célu
las
Quantificação de OPN Extracelular
0
1
2
3
4
SCC9ISOLADA
SCC9COCULTURA
SCC9ISOLADA
SCC9COCULTURA
SCC9ISOLADA
SCC9COCULTURA
SCC9ISOLADA
SCC9COCULTURA
3º dia 5º dia 7º dia 10º dia
pg
/10
4célu
las
Quantificação de OPN Extracelular
a b
c
d
e
f
a b
c
d
e
f
38
5.3 Avaliação do efeito da OPN secretada por células SAOS-2 sobre a expressão
gênica e o fenótipo de células SCC9 em cocultura
5.3.1 Adesão celular
Em 4 h, não se observaram diferenças significantes entre os grupos em relação
ao número de células SCC9 aderidas ao Transwell® (Kruskal-Wallis, p > 0,05).
Contudo, em 24 h, notou-se maior número de células aderidas no grupo Cocultura em
comparação aos demais (Kruskal-Wallis, p < 0,05). Não houve diferenças significantes
entre Cocultura+RNAi e SCC9 (Figura 10).
Figura 10. Adesão de células SCC9 cocultivadas com células SAOS-2 durante o pico de expressão de
OPN (Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição (Cocultura+RNAi), expressa como
porcentagem de células aderidas em relação ao número inicialmente plaqueado no Transwell® (10
4
células), em 4 e 24 h. Células SCC9 cultivadas isoladamente foram utilizadas como controle (SCC9). Em
cada tempo, barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p
> 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.
0
5
10
15
20
25
30
4 24
% d
e c
élu
las a
deri
das
Período (horas)
Adesão celular
SCC9
Cocultura
Cocultura+RNAia a a
b
a a
39
5.3.2 Proliferação celular
Em 24 h, a proporção de células SCC9 Ki-67 positivas foi maior para o grupo
Cocultura em comparação aos demais (Kruskal-Wallis, p < 0,05) e semelhante entre os
grupos Cocultura+RNAi e SCC9 (Figuras 11 e 12).
Figura 11. Epifluorescência de células SCC9 cocultivadas com SAOS-2, durante o pico de expressão de
OPN (Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição (Cocultura+RNAi). Células SCC9 crescidas
isoladamente foram utilizadas como controle (SCC9). Fluorescência vermelha indica células no ciclo
celular, em atividade proliferativa (Ki-67 positivas). Em azul, DNA nuclear. Barra de escala = 100 µm.
Figura 12. Proliferação de células SCC9 cocultivadas com células SAOS-2, durante o pico de expressão
de OPN (Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição (Cocultura+RNAi), expressa como
porcentagem de células Ki-67 positivas. Células SCC9 cultivadas isoladamente foram utilizadas como
controle (SCC9). Barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre
si (p > 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.
0
5
10
15
20
25
SCC9 Cocultura Cocultura+RNAi
% d
e c
élu
las k
i-67 p
osit
ivas
Proliferação celular
a
b
a
40
5.3.3 Migração celular
Em 24 h, não se observaram diferenças significantes entre os grupos para a
migração de células SCC9 (Kruskal-Wallis, p > 0,05; Figuras 13 e 14).
Figura 13. Migração de células SCC9 cocultivadas com SAOS-2, durante o pico de expressão de OPN
(Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição (Cocultura+RNAi), coradas por azul de toluidina.
Células SCC9 crescidas isoladamente foram utilizadas como controle (SCC9). Notam-se células
espraiadas na superfície inferior do Transwell®, voltada para a cultura SAOS-2, em quantidades
semelhantes entre os grupos. Barra de escala = 100 µm.
Figura 14. Migração de células SCC9 cocultivadas com SAOS-2, durante o pico de expressão de OPN
(Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição (Cocultura+RNAi), expressa como porcentagem de
migração celular. Células SCC9 cultivadas isoladamente foram utilizadas como controle (SCC9). Barras
que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados
são apresentados como média ± desvio padrão.
0
20
40
60
80
100
120
SCC9 Cocultura Cocultura+RNAi
% d
e m
igra
ção
celu
lar
Migração celular
a a a
41
5.3.4 Invasão celular
Em 24 h, maior invasão de Matrigel foi detectada para células SCC9
cocultivadas com SAOS-2 durante o pico de OPN (Cocultura) (Kruskal-Wallis, p < 0,05;
Figuras 15 e 16).
Figura 15. Invasão de células SCC9 em Transwell® recoberto com Matrigel, quando cocultivadas com
SAOS-2 durante o pico de expressão de OPN (Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição
(Cocultura+RNAi), coradas por azul de toluidina. Células SCC9 crescidas isoladamente foram utilizadas
como controle (SCC9). Note-se, para o grupo Cocultura, maior número de células na superfície inferior
do Transwell® (que atravessaram o Matrigel). Barra de escala = 100 µm.
Figura 16. Invasão de células SCC9 em Transwell®
recoberto com Matrigel, quando cocultivadas com
SAOS-2 durante o pico de expressão de OPN (Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição
(Cocultura+RNAi), expressa como porcentagem de invasão celular. Células SCC9 cultivadas
isoladamente foram utilizadas como controle (SCC9). Barras que apresentam letras semelhantes não
são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio
padrão.
0
5
10
15
20
25
30
SCC9 Cocultura Cocultura+RNAi
% d
e i
nv
asão
celu
lar
Invasão celular
a
b
c
42
5.3.5 PCR Array
Células SCC9 cocultivadas com SAOS-2 durante o pico de OPN sobre-
expressaram genes relacionados com adesão e proliferação celulares, remodelação da
MEC e apoptose, nunca superior a 2 vezes dos valores de sobre-expressão em SCC9
expostas a SAOS-2 silenciadas para OPN. Adicionalmente, cerca de 10% dos genes
avaliados em SCC9 foram reprimidos com o silenciamento de OPN (Tabela 1).
Tabela 1. Expressão gênica por PCR Array de células SCC9 cocultivadas com SAOS-2
durante o pico de expressão de OPN (Cocultura) ou com pelo menos 90% de sua inibição
(Cocultura+RNAi). Os valores foram normalizados pela média geométrica dos genes
constitutivos β-actina e GAPDH e calibrados em relação ao grupo SCC9 (controle). Com cut-off
de 1,5 e p < 0,05, utilizando a correção de Benjamini-Hochberg, valor positivo indica sobre-
expressão, valor negativo, inibição de expressão, e traço, expressão inalterada
Cocultura Cocultura+RNAi
1.63 -
- -2.13
3.06 2.8
5.54 2.78
- -2.13
3.76 1.97
1.83 -
2.32 -
2 -
2.71 2.4
7.12 3.6
- -1.71
3.34 2.23
1.55 1.54
7.08 4.62
1.92 1.62
2.68 1.64
Outras proteínas da MEC
COL4A2
HPSE
CTNNA1
FN1
MGAT5
Proteínas da MEC
TIMP3
Metaloproteinases
MMP2
MMP7
MMP9
MMP10
Inibidores de metaloproteinases
TIMP2
Outros genes relacionados com adesão celular
ITGA7
PNN
VEGFA
Receptores transmembrana
ITGA7
ITGB3
Adesão célula-célula
CDH1 (E-cadherin)
Símbolo/FunçãoExpressão Relativa (fold)
Adesão celular
43
Tabela 1. Continuação
Cocultura Cocultura+RNAi
2.09 1.62
2.75 2.86
3.02 2.5
1.58 -
2.36 -
3.46 3.05
5.54 2.78
1.89 -
2.49 2.44
2.03 1.65
2.75 2.86
1.72 -
1.58 -
2.36 -
5.34 5.2
1.99 -
5.54 2.78
5.34 5.2
5.54 2.78
- -2.13
3.14 2.19
1.99 -
2.75 2.86
41.83 28.28
- -2.13
1.56 1.7
2.21 1.64
1.87 -
2.09 1.62
1.89 -
1.7 -
1.54 -
HRAS
MYC
SET
SRC
NR4A3
Outros genes relacionados com proliferação celular
EPHB2
MET
CXCL12
IL18
IL1B
TNFSF10
Receptores
CXCR4
IGF1
VEGFA
Citocinas
CCL7
IL18
VEGFA
Fatores de crescimento e hormônios
IGF1
HRAS
IL1B
KRAS
Regulação negativa da proliferação celular
CTBP1
VEGFA
MYC
RB1
IL1B
MDM2
NF2
NME1
Regulação positiva da proliferação
Ciclo celular
Proliferação celular
NF2
NME1
PTEN
Símbolo/FunçãoExpressão Relativa (fold)
44
Tabela 1. Continuação
5.4 Avaliação do efeito da OPN secretada por SAOS-2, em cocultura com células
SCC9, sobre a atividade de osteoclastos humanos e citocinas envolvidas na
diferenciação e ativação osteoclástica
5.4.1 Avaliação da atividade osteoclástica por meio do ensaio de reabsorção de
fosfato de cálcio
Observaram-se áreas mais extensas de reabsorção de fosfato de cálcio em
culturas de células osteoclásticas expostas ao eluente obtido de células SCC9 após o
cocultivo com SAOS-2, particularmente com o pico de expressão de OPN
(SCC9/Cocultura) (Kruskal-Wallis, p < 0,05; Figuras 17 e 18). Essas áreas eram
significativamente maiores do que as observadas por efeito de eluentes de células
controles (SAOS-2 e SCC9) e de eluentes de SAOS-2 após o cocultivo com SCC9 nas
Cocultura Cocultura+RNAi
- -2.13
2.75 2.86
1.99 -
41.83 28.28
3.28 2.3
1.89 -
- -1.68
1,87 -
2.49 2.44
1.95 1.55
2.52 1.63
3 1.84
2 2.41
- -2.13
1.95 1.85
1.55 -
CD82
KISS1
METAP2
NME4
Outros genes relacionados com invasão e metástase
CTSK
CTSL1
MYCL1
NR4A3
RB1
SMAD4
CHD4
MYC
IL18
TNFSF10
Fatores de transcrição
Aptotose
CXCR4
IL1B
Símbolo/FunçãoExpressão Relativa (fold)
45
duas condições experimentais propostas (Cocultura e Cocultura+RNAi). A exposição
aos eluentes de SAOS-2 após o cocultivo com SCC9, independentemente da
expressão ou não de OPN, resultou em maiores áreas de reabsorção em comparação
àquelas obtidas por efeito de eluentes de SAOS-2 cultivada isoladamente (Kruskal-
Wallis, p < 0,05; Figura 18).
Figura 17. Áreas circulares (brancas) de reabsorção de fosfato de cálcio (escuro), decorrentes da
atividade de células osteoclásticas derivadas da linhagem U-937 após exposição ao eluente obtido de
células SAOS-2 e SCC9 cultivadas isoladamente (A e D) e de células SAOS-2 e SCC9 após o cocultivo
durante o pico de expressão de OPN (B e E) ou com pelo menos 90% de sua inibição (C e F). Barra de
escala = 200 µm.
46
Figura 18. Áreas de reabsorção de fosfato de cálcio decorrentes da atividade de células osteoclásticas,
após exposição ao eluente obtido de células SAOS-2 e SCC9 cultivadas isoladamente e de células
SAOS-2 e SCC9, após o cocultivo durante o pico de expressão de OPN ou com pelo menos 90% de sua
inibição. Barras que apresentam letras semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p >
0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.
5.4.2 Quantificação de RANKL, OPG, PTHrP e citocinas inflamatórias por ELISA
A expressão de IL 6 e IL 8 foi significativamente maior nos grupos SCC9 em
comparação aos grupos SAOS-2 (Kruskal-Wallis, p < 0,05; Figuras 19 e 20). Embora
não tenham sido detectadas diferenças entre SCC9/Cocultura e
SCC9/Cocultura+RNAi, notou-se tendência a maiores níveis de expressão de IL 6 e IL
8 para SCC9/Cocultura (Figuras 19 e 20). Não se detectou a presença de RANKL,
OPG, PTHrP, IL 1α, IL 1β, TNF-α e GM-CSF nos 6 grupos avaliados.
0
10
20
30
40
50
% d
e á
rea r
eab
so
rvid
a
Atividade osteoclástica
a
b b
c
d
e
47
Figura 19. Quantificação da expressão de IL 6 em sobrenadante de culturas de células SAOS-2 e SCC9
cultivadas isoladamente (grupos SAOS-2 e SCC9, respectivamente) e de células SAOS-2 e SCC9 após
o cocultivo durante o pico de expressão de OPN (grupos SAOS-2/Cocultura e SCC9/Cocultura,
respectivamente) ou com pelo menos 90% de sua inibição (grupos SAOS-2/Cocultura+RNAi e
SCC9/Cocultura+RNAi, respectivamente). Barras que apresentam letras semelhantes não são
significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio
padrão.
0
1
2
3
Qu
an
tid
ad
e r
ela
tiv
a
IL 6
a
b
b
48
Figura 20. Quantificação da expressão de IL 8 em sobrenadante de culturas de células SAOS-2 e SCC9
cultivadas isoladamente (grupos SAOS-2 e SCC9, respectivamente) e de células SAOS-2 e SCC9 após
o cocultivo durante o pico de expressão de OPN (grupos SAOS-2/Cocultura e SCC9/Cocultura,
respectivamente) ou com pelo menos 90% de sua inibição (grupos SAOS-2/Cocultura+RNAi e
SCC9/Cocultura+RNAi, respectivamente). Barras que apresentam letras semelhantes não são
significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio
padrão.
0
1
2
3
4
5
Qu
an
tid
ad
e r
ela
tiv
a
IL 8
a b
c
d
d
49
6 DISCUSSÃO
Os resultados do presente estudo utilizando a estratégia de cocultivo celular
mostraram que a OPN secretada por células SAOS-2 afeta o fenótipo de culturas
SCC9, promovendo os fenômenos de adesão e proliferação celulares e invasão de
Matrigel, a qual foi estimulada em menor intensidade com o silenciamento para OPN. O
cocultivo com SAOS-2, sobretudo durante o pico de expressão de OPN, resultou na
sobre-expressão das citocinas IL 6 e IL 8 pelas células SCC9, a que se atribuiu a maior
capacidade de células osteoclásticas em reabsorver fosfato de cálcio. Conjuntamente,
esses resultados sugerem que a OPN derivada de osteoblastos afeta as interações
entre as células epiteliais neoplásicas malignas e as células ósseas durante a invasão
do CEC oral no osso.
A OPN tem sido considerada um biomarcador prognóstico para neoplasias
malignas em razão de oscilações em sua expressão exibirem correlação com
diferentes graus de agressividade dos tumores; a sobre-expressão de OPN está
associada ao desenvolvimento de fenótipos neoplásicos mais agressivos (Wai & Kuo,
2008; Terpos et al., 2009; Weber et al., 2010; Weber et al., 2011; Ingale et al., 2014;
Mardani et al., 2014). No caso de neoplasias malignas osteotrópicas, níveis elevados
de OPN contribuem para adesão, proliferação e sobrevivência das células neoplásicas
no microambiente ósseo; esses efeitos têm sido atribuídos à capacidade do próprio
parênquima tumoral em expressar OPN (Kruger et al., 2014; Buijs & van der Pluijm,
2009). No presente estudo, demonstramos que a OPN derivada de células
osteoblásticas pode também promover características relacionadas ao fenótipo de
invasão de células SCC9. Adicionalmente, observamos que a interação entre as
linhagens SAOS-2 e SCC9 resultou em indução recíproca da expressão de OPN,
sugerindo que a invasão do CEC oral no osso poderia potencializar características
malignas dessa neoplasia, levando a piores prognósticos. Recentemente, um estudo
mostrou que este efeito é particularmente importante quando a neoplasia atinge o osso
esponjoso, mas não quando se restringe ao osso compacto (Fried et al., 2014).
Os sistemas de cocultura de células permitem estudar, em um ambiente
controlado, os efeitos de interações recíprocas entre diferentes tipos e fenótipos
50
celulares, constituindo-se em um importante modelo in vitro para simular as
comunicações entre células que ocorrem in vivo no complexo microambiente tumoral
(Miki et al., 2012). Em nosso trabalho, com as culturas celulares separadas por
membrana de Transwell®, os efeitos sobre adesão, proliferação, migração e invasão de
células SCC9 decorreram da ação direta e/ou indireta da OPN secretada por SAOS-2
ou da ação indireta de SAOS-2 não mediada por OPN, dependendo do parâmetro
avaliado. Especificamente, o aumento da adesão de células SCC9 cocultivadas com
SAOS-2 durante o pico de expressão de OPN poderia estar associado aos efeitos
diretos da OPN (Gao et al., 2003) ou aos indiretos, por meio da modulação da
expressão de genes relacionados com esse fenômeno, que codificam proteínas de
adesão celular e da MEC (Lyons & Jones, 2007). A análise da proliferação celular
revelou uma participação importante da OPN no aumento da proporção de células Ki-
67 positivas, em um contexto de alta complexidade de sobre-expressões e inibições
diferenciais de genes envolvidos nesse processo. Por outro lado, ainda que a presença
de OPN tenha resultado nos maiores valores de invasão de células SCC9 no Matrigel,
a inibição de sua expressão também exerceu efeito positivo, mas em menor
intensidade, indicando uma ação indireta de osteoblastos não mediada por OPN sobre
esse parâmetro. Por fim, apesar de a literatura destacar os efeitos estimuladores da
OPN sobre a migração celular (Polat et al., 2013; Zhang et al., 2014), nossos
resultados não permitiram identificar diferenças significantes entre os grupos
experimentais, o que poderia estar relacionado ao tempo definido para a análise,
possivelmente posterior ao de maior impacto da OPN sobre esse processo.
A progressão dos carcinomas caracteriza-se pela invasão das células
neoplásicas nos tecidos adjacentes e por metástases (Friedl & Alexander, 2011). Esses
processos requerem mudanças nas interações célula-célula e célula-MEC, as quais
são mediadas por diferentes moléculas adesivas, como integrinas, caderinas,
selectinas, lamininas, FN e tenascina (Lyons & Jones, 2007). No presente estudo,
células SCC9 cocultivadas com SAOS-2 durante o pico de expressão de OPN exibiram
maior adesão celular, o que poderia estar diretamente relacionado com níveis
significativamente superiores de RNAm para subunidade β3 de integrina e FN. Com
efeito, atribui-se à expressão de integrina β3 uma maior capacidade de células
51
neoplásicas em aderir a proteínas da MEC do estroma tumoral, por sua ligação com
sequências RGD de BSP, FN, OPN e osteonectina, proteínas matricelulares
multifuncionais reconhecidamente envolvidas nos processos de adesão e migração
celulares (Furger et al., 2003; Shi & Stack, 2010; Okada et al., 2011; Kostourou &
Papalazarou, 2014). A sobre-expressão de β3 resultaria, portanto, em maior adesão da
célula neoplásica à MEC, incluindo a do tecido ósseo (Clëzardin, 2009; Schneider et
al., 2011). Interessantemente, o aumento de expressão de FN em tumores primários de
CEC oral está diretamente relacionado ao desenvolvimento de metástases (Harada et
al., 1994) e, consequentemente, à maior agressividade dessa neoplasia.
O crescimento da massa tumoral decorre da desregulação do ciclo celular, que
resulta em proliferação excessiva das células neoplásicas, bem como da inibição do
processo de apoptose (Hanahan & Weinberg, 2011). No presente estudo, a cocultura
com células osteoblásticas permitiu detectar, em células SCC9, a sobre-expressão de
diferentes genes que regulam tanto positiva como negativamente o ciclo e a
proliferação celulares. Apesar de a expressão desses genes ter sido semelhante em
SCC9 em ambas as coculturas com SAOS-2, maior atividade proliferativa de SCC9
ocorreu com o pico de expressão de OPN. Têm sido identificados efeitos
potencializadores dessa proteína sobre a proliferação celular induzida por fatores de
crescimento (Angelucci et al., 2004), o que, em nosso caso, poderia ter ocorrido na
sinalização mitogênica por IGF-1 (Nam et al., 2000; Duan & Xu, 2005; Zhi et al., 2014),
cuja sobre-expressão ocorria em níveis semelhantes nas condições de cocultivo com
silenciamento ou não da OPN. A sobre-expressão do fator de transcrição MYC também
poderia contribuir para a maior proliferação de SCC9 induzida por OPN, considerando
que a região promotora do gene para OPN exibe sítios de ligação para esse fator de
transcrição (Martinez et al., 2010). Adicionalmente, a análise da expressão gênica de
SCC9 revelou uma sobre-expressão importante do TNFSF10, da ordem de 1,5x
superior para o grupo exposto ao pico de OPN, ainda que não houvesse
correspondência desses resultados moleculares com os aspectos fenotípicos das
culturas à observação por epifluorescência. Uma das explicações para isso estaria
relacionada à reconhecida resistência de células epiteliais neoplásicas malignas aos
efeitos desse ligante (Fukuda et al., 2003). Por outro lado, in vivo, a expressão de
52
TNFSF10 representaria uma estratégia do tumor para evasão do sistema imunológico,
induzindo células imunocompetentes à apoptose (Kassouf &Thornhill, 2008).
A capacidade de células SCC9 de invadir o Matrigel foi modulada positivamente
pela OPN. De fato, observou-se, para os 2 grupos de SCC9, sobre-expressão
diferencial de genes envolvidos no processo de degradação da MEC para invasão
tumoral, incluindo os que codificam as MMPs 7 e 10, TIMP 3, heparanase e catepsinas
L e K. Aumento significativo da expressão das MMPs 7 e 10 foi detectado com o
cocultivo com osteoblastos durante o pico de expressão de OPN. As MMPs pertencem
a uma família de enzimas proteolíticas dependentes de zinco, envolvidas na
remodelação e degradação da MEC em vários tecidos, incluindo o tecido ósseo (Chang
& Werb, 2001; Paiva & Granjeiro, 2014), e em tecidos neoplásicos (Thomas et al.,
1999; Patel et al., 2007; Pereira et al., 2012; Li H et al., 2014; Moro et al., 2014),
quando sua sobre-expressão pode estar associada a níveis teciduais elevados de OPN
(Ogbureke et al., 2006; Chen et al., 2009; Chen et al., 2011; Yang et al., 2011; Tilli et
al., 2012; Liu et al., 2014). Tem-se demonstrado que a expressão das MMPs 1, 3, 7 e
10 correlaciona-se com o processo de metástase e redução da sobrevida de pacientes
com CEC oral (Chiang et al., 2008), sendo que a expressão de MMP 7 está associada
a uma maior invasão do tumor, incluindo a óssea, bem com à presença de metástases
cervicais ocultas e a estágios avançados da doença (Chuang et al., 2008; Li & Cui,
2013; Mäkinen et al., 2014). A MMP 10 também está associada ao processo de
invasão do CEC oral, sendo expressa principalmente no fronte tumoral, região
caracterizada por complexas interações moleculares que afetam a progressão das
neoplasias (Mashhadiabbas et al., 2012).
Os TIMPs são inibidores endógenos de MMPs e, consequentemente,
importantes reguladores da remodelação da MEC (Brew & Nagase, 2010). No presente
estudo, níveis elevados de TIMP 3 foram detectados em células SCC9 cocultivadas
com SAOS-2 durante o pico de expressão de OPN. Contudo, o potencial efeito inibidor
de TIMP 3 sobre a atividade de MMPs não foi suficiente para impedir a invasão celular
no Matrigel, que foi significativamente maior para esse grupo. Estudos recentes têm
demonstrado elevação concomitante nos níveis de MMPs e TIMPs no CEC oral (Gao et
al., 2005; Singh et al., 2010; Singh et al., 2011; Pérez-Sayáns García et al., 2012;
53
Bodnar et al., 2014; Li M et al., 2014) e reduzida capacidade inibidora sobre MMPs de
TIMP 3 em comparação aos demais (Brew & Nagase, 2010). Adicionalmente, a OPN
atua como substrato para MMPs e os fragmentos produzidos por sua clivagem
poderiam potencializar a capacidade de invasão de células neoplásicas (Agnihotri et
al., 2001; Gao et al., 2004). Paralelamente ao reconhecido efeito inibidor sobre MMPs,
diversos estudos destacam o papel da TIMP 3 na modulação, positiva ou negativa, de
atividades de células neoplásicas associadas ao desenvolvimento e progressão de
tumores (Miyazaki et al., 2004; Brew & Nagase, 2010; Kornfeld et al., 2011; Das et al.,
2014).
A presença de outras enzimas, além das MMPs, também poderia estar
relacionada à maior invasão das células SCC9 do grupo Cocultura. De fato, a maior
invasão do Matrigel correspondeu a um aumento significativo nos níveis de expressão
de RNAm para heparanase e catepsinas. No desenvolvimento do CEC oral, a
expressão de heparanase aumenta com a progressão da lesão, sendo os níveis de
expressão maiores em carcinomas in situ ou em CECs orais invasivos em comparação
ao epitélio normal ou displásico (Nagatsuka et al., 2012; Leiser et al., 2014). Em um
modelo de xenoenxerto de CEC oral, Kurokawa et al. (2003) demonstraram que a
degradação da membrana basal associada à invasão do CEC oral correlacionava-se
com um aumento da expressão de RNAm para heparanase. Resultados semelhantes
foram descritos por Ikuta et al. (2001), que observaram uma correlação positiva entre
os níveis de RNAm e a atividade enzimática da heparanase em células neoplásicas
derivadas de CEC oral. Alguns parâmetros clínicopatológicos do CEC oral, como
tamanho do tumor (T3-T4), envolvimento de linfonodos regionais (N1-N3), metástases
à distância (M1) e estágio da doença (III-IV) correlacionam-se significativamente com a
expressão de heparanase (Xia et al., 2014). Além disso, a heparanase é capaz de
liberar MMPs que estão ligadas à proteoglicanas de heparan sulfato, como a MMP 7,
potencializando assim o processo de invasão das neoplasias (Yu & Woessner, 2000).
As catepsinas são enzimas lisossomais que atuam na degradação da MEC.
Essas proteases são classificadas de acordo com sua estrutura e com o substrato
sobre o qual atuam (Nomura & Katunuma, 2005; Kuester, 2008; Turk et al., 2012). No
epitélio oral displásico, a expressão de catepsina L parece não estar relacionada com o
54
desenvolvimento do epitélio neoplásico (Smith et al., 2009). Por outro lado, no CEC
oral, a catepsina L está envolvida nos processos de invasão e metástase para
linfonodos cervicais (Erdem et al., 2007; Nakashima et al., 2012). Por sua vez, a
catepsina K é expressa predominantemente em células osteoclásticas, quando está
envolvida na degradação do colágeno I durante a remodelação óssea (Goto et al.,
2003; Wilson et al., 2009; Gruber, 2014), além de estar associada ao processo de
invasão de diferentes neoplasias (Yan et al., 2011; Ren et al., 2012; Ishida & Okabe,
2013). Recentemente, Bitu et al. (2013) demonstraram que a diminuição da expressão
de catepsina K reduzia a invasão de células derivadas de CEC de língua em um
modelo in vitro tridimensional. Pela análise imunoistoquímica de tumores, no entanto,
os autores demonstraram que a quantidade de catepsina K em células neoplásicas não
estava associada ao prognóstico do paciente e que no microambiente tumoral, parecia
ter um efeito protetor sobre o complexo fenômeno de invasão do CEC de língua. Em
um modelo in vivo de câncer de mama, o bloqueio da catepsina K em células
neoplásicas reduz significativamente as lesões osteolíticas de metástases (Duong et
al., 2014).
O experimento para avaliar os efeitos das induções recíprocas em coculturas
SAOS-2 e SCC9 sobre osteoclastos permitiu identificar a expressão de citocinas
ligadas à reabsorção do tecido ósseo promovida pelo CEC oral (Deyama et al., 2008;
Kayamori et al., 2010; Hwang et al., 2012). As IL 6 e IL 8 promovem o aumento da
atividade osteoclástica pela ligação, respectivamente, aos receptores IL-6R (via de
sinalização gp130) e CXR1 ou pelo aumento da expressão de RANKL (Bendre et al.,
2003; Kudo et al., 2003; Kwan Tat et al., 2004). Independentemente da presença ou
não de OPN nas culturas SAOS-2, o cocultivo com SCC9 resultou no aumento da IL 8
em ambas as linhagens celulares, enquanto que níveis significativamente maiores de IL
6 foram detectados apenas em SCC9. Uma tendência a valores mais altos de IL 6 e IL
8 em SCC9 cocultivadas com SAOS-2 durante o pico de expressão de OPN
correspondia à maior atividade de reabsorção de fosfato de cálcio pelas células
osteoclásticas. A possibilidade de uma adsorção diferencial de OPN ao substrato de
fosfato de cálcio (Gilbert et al., 2000; Gilbert et al., 2003; Pietak et al., 2006) ter
exercido algum efeito sobre osteoclastos deve ser descartada, considerando que não
55
houve diferenças significativas entre os grupos SAOS-2/Cocultura e SAOS-
2/Cocultura+RNAi para a atividade reabsortiva. Sugere-se, assim, que a OPN
secretada por osteoblastos promove o aumento da reabsorção óssea mediada por
osteoclastos induzida por células epiteliais neoplásicas, intensificando a invasão do
CEC oral no tecido ósseo.
Em conclusão, apesar das limitações do método de cocultura utilizado, com três
linhagens representativas de subpopulações de células epiteliais neoplásicas,
osteoblásticas e osteoclásticas, os resultados do presente estudo reforçam a
importância do papel de células não neoplásicas e de MEC não derivada da neoplasia,
presentes no estroma tumoral, como moduladores da agressividade das células
neoplásicas (Kellermann et al., 2008; Sobral et al., 2011a; Sobral et al., 2011b; Shevde
& Samant, 2014), corroborando o conceito que se tem atribuído à OPN como fator
prognóstico de neoplasias. Os efeitos atribuídos à OPN derivada de osteoblastos sobre
células SCC9 assemelham-se àqueles já descritos para a OPN produzida pelo
parênquima tumoral. Adicionalmente, as observações in vitro de induções recíprocas
entre células epiteliais neoplásicas e osteoblásticas contribuem para a sobre-expressão
de OPN que ocorre, in vivo, em neoplasias mais agressivas. A interação com
osteoblastos promove a expressão de citocinas pelas células neoplásicas, que por sua
vez, ativam osteoclastos, tornando-os competentes para digestão de componentes da
matriz óssea, o que permite explicar a ocorrência de áreas ativas de reabsorção óssea
no microambiente tumoral.
56
57
7 CONCLUSÃO
Os resultados do presente estudo permitem concluir que:
1. Em sistemas de coculturas com membrana Transwell®, a OPN secretada por
células osteoblásticas da linhagem SAOS-2 afeta o fenótipo de células epiteliais
neoplásicas SCC9, estimulando os fenômenos celulares de adesão, proliferação
e invasão;
2. O cocultivo de SAOS-2 e SCC9 resulta em induções recíprocas que levam ao
aumento progressivo da secreção de OPN por ambas as culturas;
3. Durante o pico de expressão de OPN em culturas SAOS-2, os mecanismos que
promovem os aumentos de adesão, proliferação e invasão de células SCC9 no
Matrigel envolvem a modulação da expressão de genes relacionados a esses
processos, induzida ou não por OPN extracelular;
4. A migração de células SCC9 não se altera pela presença de SAOS-2 e pela
OPN derivada de osteoblastos;
5. O cocultivo com SAOS-2, principalmente durante o pico de expressão de OPN,
resulta na sobre-expressão das citocinas IL 6 e IL 8 por SCC9 e aumenta a
capacidade reabsortiva de células osteoclásticas;
6. A OPN derivada de osteoblastos afeta as interações entre células epiteliais
neoplásicas malignas, osteoblastos e osteoclastos in vitro, o que possivelmente
contribui para a progressão de lesões ósseas do CEC oral.
58
59
REFERÊNCIAS
Abd El-Hafez YG, Chen CC, Ng SH, Lin CY, Wang HM, Chan SC et al. Comparison of
PET/CT and MRI for the detection of bone marrow invasion in patients with squamous
cell carcinoma of the oral cavity. Oral Oncol. 2011 Apr;47(4):288-95.
Aeschlimann D, Thomazy V. Protein crosslinking in assembly and remodelling of
extracellular matrices: the role of transglutaminases. Connect Tissue Res. 2000;41(1):1-
27.
Agnihotri R, Crawford HC, Haro H, Matrisian LM, Havrda MC, Liaw L. Osteopontin, a
novel substrate for matrix metalloproteinase-3 (stromelysin-1) and matrix
metalloproteinase-7 (matrilysin). J Biol Chem. 2001 Jul 27;276(30):28261-7.
Ahmed M, Behera R, Chakraborty G, Jain S, Kumar V, Sharma P et al. Osteopontin: a
potentially important therapeutic target in cancer. Expert Opin Ther Targets. 2011
Sep;15(9):1113-26.
Amoui M, Suhr SM, Baylink DJ, Lau KH. An osteoclastic protein-tyrosine phosphatase
may play a role in differentiation and activity of human monocytic U-937 cell-derived,
osteoclast-like cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2004 Oct;287(4):C874-84.
Angelucci A, Festuccia C, Gravina GL, Muzi P, Bonghi L, Vicentini C et al. Osteopontin
enhances the cell proliferation induced by the epidermal growth factor in human
prostate cancer cells. Prostate. 2004 May 1;59(2):157-66.
Aubin JE. Advances in the osteoblast lineage. Biochem Cell Biol. 1998;76(6):899-910.
60
Avirović M, Matušan-Ilijaš K, Damante G, Fabrro D, Cerović R, Juretić M et al.
Osteopontin expression is an independent factor for poor survival in oral squamous cell
carcinoma: a computer-assisted analysis on TMA sections. J Oral Pathol Med. 2013
Sep;42(8):620-6.
Bandopadhyay M, Bulbule A, Butti R, Chakraborty G, Ghorpade P, Ghosh P et al.
Osteopontin as a therapeutic target for cancer. Expert Opin Ther Targets. 2014
Aug;18(8):883-95.
Bautista DS, Denstedt J, Chambers AF, Harris JF. Low-molecular-weight variants of
osteopontin generated by serine proteinases in urine of patients with kidney stones.J
Cell Biochem. 1996 Jun 1;61(3):402-9.
Bayless KJ, Meininger GA, Scholtz JM, Davis GE. Osteopontin is a ligand for the
alpha4beta1 integrin. J Cell Sci. 1998 May;111 ( Pt 9):1165-74.
Beausoleil MS, Schulze EB, Goodale D, Postenka CO, Allan AL. Deletion of the
thrombin cleavage domain of osteopontin mediates breast cancer cell adhesion,
proteolytic activity, tumorgenicity, and metastasis. BMC Cancer. 2011 Jan 19;11:25.
Bellahcène A, Castronovo V, Ogbureke KU, Fisher LW, Fedarko NS. Small integrin-
binding ligand N-linked glycoproteins (SIBLINGs): multifunctional proteins in cancer. Nat
Rev Cancer. 2008 Mar;8(3):212-26.
Bellido T. Osteocyte-driven bone remodeling. Calcif Tissue Int. 2014 Jan;94(1):25-34.
Bendre MS, Montague DC, Peery T, Akel NS, Gaddy D, Suva LJ. Interleukin-8
stimulation of osteoclastogenesis and bone resorption is a mechanism for the increased
osteolysis of metastatic bone disease. Bone. 2003 Jul;33(1):28-37.
61
Bitu CC, Kauppila JH, Bufalino A, Nurmenniemi S, Teppo S, Keinänen M et al.
Cathepsin K is present in invasive oral tongue squamous cell carcinoma in vivo and in
vitro. PLoS One. 2013 Aug 7;8(8):e70925.
Bodnar M, Szylberg L, Kazmierczak W, Marszalek A. Tumor progression driven by
pathways activating matrix metalloproteinases and their inhibitors. J Oral Pathol Med.
2014 Sep 22.
Bonfil RD, Chinni S, Fridman R, Kim HR, Cher ML. Proteases, growth factors,
chemokines, and the microenvironment in prostate cancer bone metastasis. Urol Oncol.
2007 Sep-Oct;25(5):407-11.
Boyce BF, Xing L. Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling.
Arch Biochem Biophys. 2008 May 15;473(2):139-46.
Boyce BF. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. J Dent
Res. 2013 Oct;92(10):860-7.
Bramwell VH, Doig GS, Tuck AB, Wilson SM, Tonkin KS, Tomiak A et al. Serial plasma
osteopontin levels have prognostic value in metastatic breast cancer. Clin Cancer Res.
2006 Jun 1;12(11 Pt 1):3337-43.
Brew K, Nagase H. The tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): an ancient
family with structural and functional diversity. Biochim Biophys Acta. 2010
Jan;1803(1):55-71.
Brooks PC, Clark RA, Cheresh DA.Requirement of vascular integrin alpha v beta 3 for
angiogenesis.Science. 1994 Apr 22;264(5158):569-71.
62
Brown LF, Berse B, Van de Water L, Papadopoulos-Sergiou A, Perruzzi CA, Manseau
EJ et al. Expression and distribution of osteopontin in human tissues: widespread
association with luminal epithelial surfaces. Mol Biol Cell. 1992 Oct;3(10):1169-80.
Buijs JT, van der Pluijm G. Osteotropic cancers: from primary tumor to bone. Cancer
Lett. 2009 Jan 18;273(2):177-93.
Caers J, Günthert U, De Raeve H, Van Valckenborgh E, Menu E, Van Riet I et al. The
involvement of osteopontin and its receptors in multiple myeloma cell survival, migration
and invasion in the murine 5T33MM model. Br J Haematol. 2006 Feb;132(4):469-77.
Cafforio P, Savonarola A, Stucci S, De Matteo M, Tucci M, Brunetti AE et al. PTHrP
produced by myeloma plasma cells regulates their survival and pro-osteoclast activity
for bone disease progression. J Bone Miner Res. 2014 Jan;29(1):55-66.
Campo-Trapero J, Cano-Sánchez J, Palacios-Sánchez B, Sánchez-Gutierrez JJ,
González-Moles MA, Bascones-Martínez A. Update on molecular pathology in oral
cancer and precancer. Anticancer Res. 2008 Mar-Apr;28(2B):1197-205.
Cappariello A, Maurizi A, Veeriah V, Teti A. The Great Beauty of the osteoclast. Arch
Biochem Biophys. 2014 Sep 15;558:70-8.
Casimiro S, Mohammad KS, Pires R, Tato-Costa J, Alho I, Teixeira R et al.
RANKL/RANK/MMP-1 molecular triad contributes to the metastatic phenotype of breast
and prostate cancer cells in vitro. PLoS One. 2013 May 16;8(5):e63153.
Chang C, Werb Z. The many faces of metalloproteases: cell growth, invasion,
angiogenesis and metastasis. Trends Cell Biol. 2001 Nov;11(11):S37-43.
63
Chappard D, Bouvard B, Baslé MF, Legrand E, Audran M. Bone metastasis: histological
changes and pathophysiological mechanisms in osteolytic or osteosclerotic
localizations. Morphologie. 2011 Jun;95(309):65-75.
Chellaiah MA, Kizer N, Biswas R, Alvarez U, Strauss-Schoenberger J, Rifas L et al.
Osteopontin deficiency produces osteoclast dysfunction due to reduced CD44 surface
expression. Mol Biol Cell. 2003 Jan;14(1):173-89.
Chen RX, Xia YH, Xue TC, Ye SL. Osteopontin promotes hepatocellular carcinoma
invasion by up-regulating MMP-2 and uPA expression. Mol Biol Rep. 2011
Aug;38(6):3671-7.
Chen YL, Kuo SW, Fang KH, Hao SP. Prognostic impact of marginal mandibulectomy in
the presence of superficial bone invasion and the nononcologic outcome. Head Neck.
2011 May;33(5):708-13.
Chen YJ, Wei YY, Chen HT, Fong YC, Hsu CJ, Tsai CH et al. Osteopontin increases
migration and MMP-9 up-regulation via alphavbeta3 integrin, FAK, ERK, and NF-
kappaB-dependent pathway in human chondrosarcoma cells. J Cell Physiol. 2009
Oct;221(1):98-108.
Chiang YY, Tsai MH, Lin TY, Chiang IP. Expression profile of metastasis-related genes
in invasive oral cancers. Histol Histopathol. 2008 Oct;23(10):1213-22.
Chien CY, Su CY, Chuang HC, Fang FM, Huang HY, Chen CH et al. Comprehensive
study on the prognostic role of osteopontin expression in oral squamous cell carcinoma.
Oral Oncol. 2009 Sep;45(9):798-802.
Cho HJ, Cho HJ, Kim HS. Osteopontin: a multifunctional protein at the crossroads of
inflammation, atherosclerosis, and vascular calcification. Curr Atheroscler Rep. 2009
May;11(3):206-13.
64
Christensen B, Kazanecki CC, Petersen TE, Rittling SR, Denhardt DT, Sørensen ES.
Cell type-specific post-translational modifications of mouse osteopontin are associated
with different adhesive properties. J Biol Chem. 2007 Jul 6;282(27):19463-72.
Christensen B, Petersen TE, Sørensen ES. Post-translational modification and
proteolytic processing of urinary osteopontin. Biochem J. 2008 Apr 1;411(1):53-61.
Chuang HC, Su CY, Huang HY, Huang CC, Chien CY, Du YY et al. Active matrix
metalloproteinase-7 is associated with invasion in buccal squamous cell carcinoma.
Mod Pathol. 2008 Dec;21(12):1444-50.
Clëzardin P. Integrins in bone metastasis formation and potential therapeutic
implications. Curr Cancer Drug Targets. 2009 Nov;9(7):801-6.
Cook AC, Tuck AB, McCarthy S, Turner JG, Irby RB, Bloom GC et al. Osteopontin
induces multiple changes in gene expression that reflect the six "hallmarks of cancer" in
a model of breast cancer progression. Mol Carcinog. 2005 Aug;43(4):225-36.
Courter D, Cao H, Kwok S, Kong C, Banh A, Kuo P et al. The RGD domain of human
osteopontin promotes tumor growth and metastasis through activation of survival
pathways. PLoS One. 2010 Mar 10;5(3):e9633.
Craig AM, Bowden GT, Chambers AF, Spearman MA, Greenberg AH, Wright JA et al.
Secreted phosphoprotein mRNA is induced during multi-stage carcinogenesis in mouse
skin and correlates with the metastatic potential of murine fibroblasts. Int J Cancer.
1990 Jul 15;46(1):133-7.
Craig AM, Nemir M, Mukherjee BB, Chambers AF, Denhardt DT. Identification of the
major phosphoprotein secreted by many rodent cell lines as 2ar/osteopontin: enhanced
expression in H-ras-transformed 3T3 cells. Biochem Biophys Res Commun. 1988 Nov
30;157(1):166-73.
65
Craig AM, Smith JH, Denhardt DT. Osteopontin, a transformation-associated cell
adhesion phosphoprotein, is induced by 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate in
mouse epidermis. J Biol Chem. 1989 Jun 5;264(16):9682-9.
Das AM, Seynhaeve AL, Rens JA, Vermeulen CE, Koning GA, Eggermont AM et al.
Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in
melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration.
Angiogenesis. 2014 Jan;17(1):163-77.
de Camargo Cancela M, de Souza DL, Curado MP. International incidence of
oropharyngeal cancer: a population-based study. Oral Oncol. 2012 Jun;48(6):484-90.
de Oliva MA, Maximiano WM, de Castro LM, da Silva PE Jr, Fernandes RR, Ciancaglini
P et al. Treatment with a growth factor-protein mixture inhibits formation of mineralized
nodules in osteogenic cell cultures grown on titanium. J Histochem Cytochem. 2009
Mar;57(3):265-76.
Dean RA. Overall CM. Proteomics discovery of metalloproteinase substrates in the
cellular context by iTRAQ labeling reveals a diverse MMP-2 substrate degradome. Mol
Cell Proteomics. 2007 Apr;6(4):611-23.
Denda S, Reichardt LF, Müller U. Identification of osteopontin as a novel ligand for the
integrin alpha8 beta1 and potential roles for this integrin-ligand interaction in kidney
morphogenesis. Mol Biol Cell. 1998 Jun;9(6):1425-35.
Denhardt DT, Guo X. Osteopontin: a protein with diverse functions. FASEB J. 1993
Dec;7(15):1475-82.
Denhardt DT, Noda M. Osteopontin expression and function: role in bone remodeling. J
Cell Biochem Suppl. 1998;30-31:92-102.
66
Deraz EM, Kudo Y, Yoshida M, Obayashi M, Tsunematsu T, Tani H et al. MMP-
10/stromelysin-2 promotes invasion of head and neck cancer. PLoS One.
2011;6(10):e25438.
Deyama Y, Tei K, Yoshimura Y, Izumiyama Y, Takeyama S, Hatta M et al. Oral
squamous cell carcinomas stimulate osteoclast differentiation. Oncol Rep. 2008
Sep;20(3):663-8.
Du XL, Jiang T, Sheng XG, Gao R, Li QS. Inhibition of osteopontin suppresses in vitro
and in vivo angiogenesis in endometrial cancer. Gynecol Oncol. 2009 Dec;115(3):371-
6.
Duan C, Xu Q. Roles of insulin-like growth factor (IGF) binding proteins in regulating
IGF actions. Gen Comp Endocrinol. 2005 May 15;142(1-2):44-52.
Duong le T, Wesolowski GA, Leung P, Oballa R, Pickarski M. Efficacy of a cathepsin k
inhibitor in a preclinical model for prevention and treatment of breast cancer bone
metastasis. Mol Cancer Ther. 2014 Dec;13(12):2898-909.
Ebrahimi A, Murali R, Gao K, Elliott MS, Clark JR. The prognostic and staging
implications of bone invasion in oral squamous cell carcinoma.Cancer. 2011 Oct
1;117(19):4460-7.
Erdem NF, Carlson ER, Gerard DA, Ichiki AT. Characterization of 3 oral squamous cell
carcinoma cell lines with different invasion and/or metastatic potentials. J Oral
Maxillofac Surg. 2007 Sep;65(9):1725-33.
Feinberg AP, Tycko B. The history of cancer epigenetics. Nat Rev Cancer. 2004
Feb;4(2):143-53.
67
Fisher LW, Hawkins GR, Tuross N, Termine JD. Purification and partial characterization
of small proteoglycans I and II, bone sialoproteins I and II, and osteonectin from the
mineral compartment of developing human bone. J Biol Chem. 1987 Jul
15;262(20):9702-8.
Fong YC, Liu SC, Huang CY, Li TM, Hsu SF, Kao ST et al. Osteopontin increases lung
cancer cells migration via activation of the alphavbeta3 integrin/FAK/Akt and NF-
kappaB-dependent pathway. Lung Cancer. 2009 Jun;64(3):263-70.
Forsprecher J, Wang Z, Goldberg HA, Kaartinen MT. Transglutaminase-mediated
oligomerization promotes osteoblast adhesive properties of osteopontin and bone
sialoprotein. Cell Adh Migr. 2011 Jan-Feb;5(1):65-72.
Franzén A, Heinegård D. Isolation and characterization of two sialoproteins present only
in bone calcified matrix. Biochem J. 1985 Dec 15;232(3):715-24.
Fried D, Mullins B, Weissler M, Shores C, Zanation A, Hackman T et al. Prognostic
significance of bone invasion for oral cavity squamous cell carcinoma considered T1/T2
by American joint committee on cancer size criteria. Head Neck. 2014 Jun;36(6):776-
81.
Friedl P, Alexander S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and
reciprocity. Cell. 2011 Nov 23;147(5):992-1009.
Fukuda M, Hamao A, Tanaka A, Kitada M, Suzuki S, Kusama K et al. Tumor necrosis
factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/APO2L) and its receptors expression in
human squamous cell carcinoma of the oral cavity. Oncol Rep. 2003 Sep-
Oct;10(5):1113-9.
68
Furger KA, Allan AL, Wilson SM, Hota C, Vantyghem SA, Postenka CO et al. Beta(3)
integrin expression increases breast carcinoma cell responsiveness to the malignancy-
enhancing effects of osteopontin. Mol Cancer Res. 2003 Sep;1(11):810-9.
Gao C, Guo H, Downey L, Marroquin C, Wei J, Kuo PC. Osteopontin-dependent
CD44v6 expression and cell adhesion in HepG2 cells. Carcinogenesis. 2003
Dec;24(12):1871-8.
Gao YA, Agnihotri R, Vary CP, Liaw L. Expression and characterization of recombinant
osteopontin peptides representing matrix metalloproteinase proteolytic fragments.
Matrix Biol. 2004 Nov;23(7):457-66.
Gao ZB, Duan YQ, Zhang L, Chen DW, Ding PT. Expression of matrix
metalloproteinase 2 and its tissue inhibitor in oral squamous cell carcinoma. Int J Mol
Med. 2005 Oct;16(4):599-603.
Gaur P, Singh AK, Shukla NK, Das SN.Inter-relation of Th1, Th2, Th17 and Treg
cytokines in oral cancer patients and their clinical significance. Hum Immunol. 2014
Apr;75(4):330-7.
Gilbert M, Giachelli CM, Stayton PS. Biomimetic peptides that engage specific integrin-
dependent signaling pathways and bind to calcium phosphate surfaces. J Biomed Mater
Res A. 2003 Oct 1;67(1):69-77.
Gilbert M, Shaw WJ, Long JR, Nelson K, Drobny GP, Giachelli CM, Stayton PS.
Chimeric peptides of statherin and osteopontin that bind hydroxyapatite and mediate
cell adhesion. J Biol Chem. 2000 May 26;275(21):16213-8.
Gimba ER, Tilli TM. Human osteopontin splicing isoforms: known roles, potential clinical
applications and activated signaling pathways. Cancer Lett. 2013 Apr 30;331(1):11-7.
69
Goda T, Shimo T, Yoshihama Y, Hassan NM, Ibaragi S, Kurio N et al. Bone destruction
by invading oral squamous carcinoma cells mediated by the transforming growth factor-
beta signalling pathway. Anticancer Res. 2010 Jul;30(7):2615-23.
Goto T, Yamaza T, Tanaka T. Cathepsins in the osteoclast.J Electron Microsc (Tokyo).
2003;52(6):551-8.
Gruber R. Molecular and cellular basis of bone resorption.Wien Med Wochenschr.2014
Sep 16.
Guise TA, Mundy GR. Cancer and bone. Endocr Rev. 1998 Feb;19(1):18-54.
Ha J, Choi HS, Lee Y, Kwon HJ, Song YW, Kim HH. CXC chemokine ligand 2 induced
by receptor activator of NF-kappa B ligand enhances osteoclastogenesis. J Immunol.
2010 May 1;184(9):4717-24.
Han M, Wen JK, Zheng B, Liu Z, Chen Y. Blockade of integrin beta3-FAK signaling
pathway activated by osteopontin inhibits neointimal formation after balloon injury.
Cardiovasc Pathol. 2007 Sep-Oct;16(5):283-90.
Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch
during tumorigenesis. Cell. 1996 Aug 9;86(3):353-64.
Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011 Mar
4;144(5):646-74.
Harada T, Shinohara M, Nakamura S, Oka M.An immunohistochemical study of the
extracellular matrix in oral squamous cell carcinoma and its association with invasive
and metastatic potential. Virchows Arch. 1994;424(3):257-66.
70
Higashibata Y, Sakuma T, Kawahata H, Fujihara S, Moriyama K, Okada A et al.
Identification of promoter regions involved in cell- and developmental stage-specific
osteopontin expression in bone, kidney, placenta, and mammary gland: an analysis of
transgenic mice. J Bone Miner Res. 2004 Jan;19(1):78-88.
Higashikawa F, Eboshida A, Yokosaki Y. Enhanced biological activity of polymeric
osteopontin. FEBS Lett. 2007 Jun 12;581(14):2697-701.
Hijiya N, Setoguchi M, Matsuura K, Higuchi Y, Akizuki S, Yamamoto S. Cloning and
characterization of the human osteopontin gene and its promoter. Biochem J. 1994 Oct
1;303 ( Pt 1):255-62.
Hoffmannová J, Foltán R, Vlk M, Sipos M, Horká E, Pavlíková G et al.
Hemimandibulectomy and therapeutic neck dissection with radiotherapy in the
treatment of oral squamous cell carcinoma involving mandible: a critical review of
treatment protocol in the years 1994-2004. Int J Oral Maxillofac Surg. 2010
Jun;39(6):561-7.
Holm E, Gleberzon JS, Liao Y, Sørensen ES, Beier F, Hunter GK, Goldberg HA.
Osteopontin mediates mineralization and not osteogenic cell development in vitro.
Biochem J. 2014 Dec 15;464(3):355-64.
Hu DD, Hoyer JR, Smith JW. Ca2+ suppresses cell adhesion to osteopontin by
attenuating binding affinity for integrin alpha v beta 3. J Biol Chem. 1995a Apr
28;270(17):9917-25.
Hu DD, Lin EC, Kovach NL, Hoyer JR, Smith JW. A biochemical characterization of the
binding of osteopontin to integrins alpha v beta 1 and alpha v beta 5. J Biol Chem.
1995b Nov 3;270(44):26232-8.
71
Hughes DE, Salter DM, Simpson R. CD44 expression in human bone: a novel marker of
osteocytic differentiation. J Bone Miner Res. 1994 Jan;9(1):39-44.
Hunter GK. Role of osteopontin in modulation of hydroxyapatite formation. Calcif Tissue
Int. 2013 Oct;93(4):348-54.
Hwang YS, Lee SK, Park KK, Chung WY. Secretion of IL-6 and IL-8 from
lysophosphatidic acid-stimulated oral squamous cell carcinoma promotes
osteoclastogenesis and bone resorption. Oral Oncol. 2012 Jan;48(1):40-8.
Hynes RO. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell. 1992
Apr 3;69(1):11-25.
Ibrahim T, Sacanna E, Gaudio M, Mercatali L, Scarpi E, Zoli W et al. Role of RANK,
RANKL, OPG, and CXCR4 tissue markers in predicting bone metastases in breast
cancer patients. Clin Breast Cancer. 2011 Dec;11(6):369-75.
Iismaa SE, Mearns BM, Lorand L, Graham RM. Transglutaminases and disease:
lessons from genetically engineered mouse models and inherited disorders. Physiol
Rev. 2009 Jul;89(3):991-1023.
Ikuta M, Podyma KA, Maruyama K, Enomoto S, Yanagishita M. Expression of
heparanase in oral cancer cell lines and oral cancer tissues. Oral Oncol. 2001
Feb;37(2):177-84.
Ingale Y, Routray S, Kheur SM, Kheur M, Mohanty N. Evaluating the efficacy of
osteopontin expression as a prognostic marker in oral squamous cell carcinoma in the
Indian subpopulation. J Oral Maxillofac Pathol. 2014 Sep;18(Suppl 1):S11-5.
Instituto Nacional de Câncer. Ministério da Saúde. Estimativa 2014 Incidência de
câncer no Brasil. Brasil: 2014.
72
Ishida M, Okabe H. Basaloid squamous cell carcinoma of the maxillary sinus: Report of
two cases in association with cathepsin K expression. Oncol Lett. 2013 Jun;5(6):1755-
1759.
Ishikuro M, Sakamoto K, Kayamori K, Akashi T, Kanda H, Izumo T et al. Significance of
the fibrous stroma in bone invasion by human gingival squamous cell carcinomas.
Bone. 2008 Sep;43(3):621-7.
Ito K, Kon S, Nakayama Y, Kurotaki D, Saito Y, Kanayama M et al. The differential
amino acid requirement within osteopontin in alpha4 and alpha9 integrin-mediated cell
binding and migration. Matrix Biol. 2009 Jan;28(1):11-9.
Jain M, He Q, Lee WS, Kashiki S, Foster LC, Tsai JC et al. Role of CD44 in the reaction
of vascular smooth muscle cells to arterial wall injury. J Clin Invest. 1996 Feb
1;97(3):596-603.
Jain S, Chakraborty G, Kundu GC. The crucial role of cyclooxygenase-2 in osteopontin-
induced protein kinase C alpha/c-Src/IkappaB kinase alpha/beta-dependent prostate
tumor progression and angiogenesis. Cancer Res. 2006 Jul 1;66(13):6638-48.
Jimi E, Furuta H, Matsuo K, Tominaga K, Takahashi T, Nakanishi O. The cellular and
molecular mechanisms of bone invasion by oral squamous cell carcinoma. Oral Dis.
2011 Jul;17(5):462-8
Jin Y, Chen JN, Feng ZY, Zhang ZG, Fan WZ, Wang Y et al. OPN and αvβ3 expression
are predictors of disease severity and worse prognosis in hepatocellular carcinoma.
PLoS One. 2014 Feb 3;9(2):e87930.
Jin Y, Tong DY, Chen JN, Feng ZY, Yang JY, Shao CK et al. Overexpression of
osteopontin, αvβ3 and Pim-1 associated with prognostically important clinicopathologic
variables in non-small cell lung cancer. PLoS One. 2012;7(10):e48575.
73
Johnson P, Maiti A, Brown KL, Li R. A role for the cell adhesion molecule CD44 and
sulfation in leukocyte-endothelial cell adhesion during an inflammatory response?
Biochem Pharmacol. 2000 Mar 1;59(5):455-65.
Johnston NI, Gunasekharan VK, Ravindranath A, O'Connell C, Johnston PG, El-Tanani
MK. Osteopontin as a target for cancer therapy. Front Biosci. 2008 May 1;13:4361-72.
Kale S, Raja R, Thorat D, Soundararajan G, Patil TV, Kundu GC. Osteopontin signaling
upregulates cyclooxygenase-2 expression in tumor-associated macrophages leading to
enhanced angiogenesis and melanoma growth via α9β1 integrin. Oncogene. 2014 May
1;33(18):2295-306.
Kang JA, Zhou Y, Weis TL, Liu H, Ulaszek J, Satgurunathan N et al. Osteopontin
regulates actin cytoskeleton and contributes to cell proliferation in primary erythroblasts.
J Biol Chem. 2008 Mar 14;283(11):6997-7006.
Kassouf N, Thornhill MH. Oral cancer cell lines can use multiple ligands, including Fas-
L, TRAIL and TNF-alpha, to induce apoptosis in Jurkat T cells: possible mechanisms for
immune escape by head and neck cancers. Oral Oncol. 2008 Jul;44(7):672-82.
Kawamata H, Nakashiro K, Uchida D, Harada K, Yoshida H, Sato M. Possible
contribution of active MMP2 to lymph-node metastasis and secreted cathepsin L to
bone invasion of newly established human oral-squamous-cancer cell lines. Int J
Cancer. 1997 Jan 6;70(1):120-7.
Kawasaki G, Kato Y, Mizuno A. Cathepsin expression in oral squamous cell carcinoma:
relationship with clinicopathologic factors. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod. 2002 Apr;93(4):446-54.
74
Kayamori K, Sakamoto K, Nakashima T, Takayanagi H, Morita K, Omura K et al. Roles
of interleukin-6 and parathyroid hormone-related peptide in osteoclast formation
associated with oral cancers: significance of interleukin-6 synthesized by stromal cells in
response to cancer cells. Am J Pathol. 2010 Feb;176(2):968-80.
Kazanecki CC, Uzwiak DJ, Denhardt DT. Control of osteopontin signaling and function
by post-translational phosphorylation and protein folding.J Cell Biochem. 2007 Nov
1;102(4):912-24.
Kellermann MG, Sobral LM, da Silva SD, Zecchin KG, Graner E, Lopes MA et al.
Mutual paracrine effects of oral squamous cell carcinoma cells and normal oral
fibroblasts: induction of fibroblast to myofibroblast transdifferentiation and modulation of
tumor cell proliferation. Oral Oncol. 2008 May;44(5):509-17.
Kerr JM, Fisher LW, Termine JD, Young MF. The cDNA cloning and RNA distribution of
bovine osteopontin. Gene. 1991 Dec 15;108(2):237-43.
Khan SA, Cook AC, Kappil M, Günthert U, Chambers AF, Tuck AB et al. Enhanced cell
surface CD44 variant (v6, v9) expression by osteopontin in breast cancer epithelial cells
facilitates tumor cell migration: novel post-transcriptional, post-translational regulation.
Clin Exp Metastasis. 2005;22(8):663-73.
Khan SA, Lopez-Chua CA, Zhang J, Fisher LW, Sørensen ES et al. Soluble osteopontin
inhibits apoptosis of adherent endothelial cells deprived of growth factors. J Cell
Biochem. 2002;85(4):728-36.
Khodavirdi AC, Song Z, Yang S, Zhong C, Wang S, Wu H et al. Increased expression of
osteopontin contributes to the progression of prostate cancer. Cancer Res. 2006 Jan
15;66(2):883-8.
75
Kiefer MC, Bauer DM, Barr PJ. The cDNA and derived amino acid sequence for human
osteopontin. Nucleic Acids Res. 1989 Apr 25;17(8):3306.
Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, Nagata T, Yoshioka K, Iguchi M et al. Structure and
expression of the mRNA encoding urinary stone protein (osteopontin). J Biol Chem.
1993 Jul 15;268(20):15180-4.
Kornfeld JW, Meder S, Wohlberg M, Friedrich RE, Rau T, Riethdorf L et al.
Overexpression of TACE and TIMP3 mRNA in head and neck cancer: association with
tumour development and progression. Br J Cancer. 2011 Jan 4;104(1):138-45.
Kostourou V, Papalazarou V. Non-collagenous ECM proteins in blood vessel
morphogenesis and cancer. Biochim Biophys Acta. 2014 Aug;1840(8):2403-13.
Krishnan V, Vogler EA, Sosnoski DM, Mastro AM.In vitro mimics of bone remodeling
and the vicious cycle of cancer in bone. J Cell Physiol. 2014 Apr;229(4):453-62.
Kruger TE, Miller AH, Godwin AK, Wang J. Bone sialoprotein and osteopontin in bone
metastasis of osteotropic cancers. Crit Rev Oncol Hematol. 2014 Feb;89(2):330-41.
Kudo O, Sabokbar A, Pocock A, Itonaga I, Fujikawa Y, Athanasou NA. Interleukin-6 and
interleukin-11 support human osteoclast formation by a RANKL-independent
mechanism. Bone. 2003 Jan;32(1):1-7.
Kuester D, Lippert H, Roessner A, Krueger S. The cathepsin family and their role in
colorectal cancer.Pathol Res Pract. 2008;204(7):491-500.
Kurisetty VV, Johnston PG, Johnston N, Erwin P, Crowe P, Fernig DG et al. RAN
GTPase is an effector of the invasive/metastatic phenotype induced by osteopontin.
Oncogene. 2008 Dec 4;27(57):7139-49.
76
Kurokawa H, Katsube K, Podyma KA, Ikuta M, Iseki H, Nakajima M et al. Heparanase
and tumor invasion patterns in human oral squamous cell carcinoma xenografts. Cancer
Sci. 2003 Mar;94(3):277-85.
Kwan Tat S, Padrines M, Théoleyre S, Heymann D, Fortun Y. IL-6, RANKL, TNF-
alpha/IL-1: interrelations in bone resorption pathophysiology. Cytokine Growth Factor
Rev. 2004 Feb;15(1):49-60.
Lacey DL, Boyle WJ, Simonet WS, Kostenuik PJ, Dougall WC, Sullivan JK et al. Bench
to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of
denosumab. Nat Rev Drug Discov. 2012 May;11(5):401-19.
Leali D, Dell'Era P, Stabile H, Sennino B, Chambers AF, Naldini A et al. Osteopontin
(Eta-1) and fibroblast growth factor-2 cross-talk in angiogenesis. J Immunol. 2003 Jul
15;171(2):1085-93.
Lecrone V, Li W, Devoll RE, Logothetis C, Farach-Carson MC. Calcium signals in
prostate cancer cells: specific activation by bone-matrix proteins. Cell Calcium. 2000
Jan;27(1):35-42.
Lee CH, Chang JS, Syu SH, Wong TS, Chan JY, Tang YC et al. IL-1β Promotes
Malignant Transformation and Tumor Aggressiveness in Oral Cancer. J Cell Physiol.
2015 Apr;230(4):875-84.
Lee JH, Kim HN, Kim KO, Jin WJ, Lee S, Kim HH et al. CXCL10 promotes osteolytic
bone metastasis by enhancing cancer outgrowth and osteoclastogenesis. Cancer Res.
2012 Jul 1;72(13):3175-86.
77
Lee JL, Wang MJ, Sudhir PR, Chen GD, Chi CW, Chen JY. Osteopontin promotes
integrin activation through outside-in and inside-out mechanisms: OPN-CD44V
interaction enhances survival in gastrointestinal cancer cells. Cancer Res. 2007 Mar
1;67(5):2089-97.
Leiser Y, Shilo D, Abu El Naaj I, Rachmiel A. Heparanase, a potential marker for
premalignant oral cavity cancer. In Vivo. 2014 Sep-Oct;28(5):769-77.
Li H, Zhang K, Liu LH, Ouyang Y, Bu J, Guo HB et al. A systematic review of matrix
metalloproteinase 9 as a biomarker of survival in patients with osteosarcoma. Tumour
Biol. 2014 Jun;35(6):5487-91.
Li JJ, Han M, Wen JK, Li AY. Osteopontin stimulates vascular smooth muscle cell
migration by inducing FAK phosphorylation and ILK dephosphorylation. Biochem
Biophys Res Commun. 2007 Apr 27;356(1):13-9.
Li M, Amizuka N, Takeuchi K, Freitas PH, Kawano Y, Hoshino M et al. Histochemical
evidence of osteoclastic degradation of extracellular matrix in osteolytic metastasis
originating from human lung small carcinoma (SBC-5) cells. Microsc Res Tech. 2006
Feb;69(2):73-83.
Li M, Wang Z, Xing Y, Yu J, Tian L, Zhang D et al. A multicenter study on expressions
of vascular endothelial growth factor, matrix metallopeptidase-9 and tissue inhibitor of
metalloproteinase-2 in oral and maxillofacial squamous cell carcinoma. Iran Red
Crescent Med J. 2014 Mar;16(3):e13185.
Li TJ, Cui J. COX-2, MMP-7 expression in oral lichen planus and oral squamous cell
carcinoma. Asian Pac J Trop Med. 2013 Aug;6(8):640-3.
78
Li X, Liu Y, Wu B, Dong Z, Wang Y, Lu J et al. Potential role of the OPG/RANK/RANKL
axis in prostate cancer invasion and bone metastasis. Oncol Rep. 2014
Dec;32(6):2605-11.
Lichtenstein AV. Cancer: evolutionary, genetic and epigenetic aspects. Clin Epigenetics.
2010 Dec;1(3-4):85-100.
Likui W, Hong W, Shuwen Z. Clinical significance of the upregulated osteopontin mRNA
expression in human colorectal cancer. J Gastrointest Surg. 2010 Jan;14(1):74-81.
Liu H, Chen A, Guo F, Yuan L.A short-hairpin RNA targeting osteopontin downregulates
MMP-2 and MMP-9 expressions in prostate cancer PC-3 cells. Cancer Lett. 2010b Sep
1;295(1):27-37.
Liu H, Chen A, Guo F, Yuan L. Influence of osteopontin short hairpin RNA on the
proliferation and invasion of human renal cancer cells. J Huazhong Univ Sci Technolog
Med Sci. 2010a Feb;30(1):61-8.
Liu J, Liu Q, Wan Y, Zhao Z, Yu H, Luo H et al. Osteopontin promotes the progression
of gastric cancer through the NF-κB pathway regulated by the MAPK and PI3K. Int J
Oncol. 2014 Jul;45(1):282-90.
Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time
quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 Dec;25(4):402-8.
Lu JG, Li Y, Li L, Kan X. Overexpression of osteopontin and integrin αv in laryngeal and
hypopharyngeal carcinomas associated with differentiation and metastasis. J Cancer
Res Clin Oncol. 2011 Nov;137(11):1613-8.
79
Lubek J, El-Hakim M, Salama AR, Liu X, Ord RA. Gingival carcinoma: retrospective
analysis of 72 patients and indications for elective neck dissection. Br J Oral Maxillofac
Surg. 2011 Apr;49(3):182-5.
Lyons AJ, Jones J. Cell adhesion molecules, the extracellular matrix and oral squamous
carcinoma. Int J Oral Maxillofac Surg. 2007 Aug;36(8):671-9.
Mäkinen LK, Häyry V, Hagström J, Sorsa T, Passador-Santos F, Keski-Säntti H et al.
Matrix metalloproteinase-7 and matrix metalloproteinase-25 in oral tongue squamous
cell carcinoma. Head Neck. 2014 Dec;36(12):1783-8.
Mardani M, Andisheh-Tadbir A, Khademi B, Fattahi MJ, Shafiee S, Asad-Zadeh M.
Serum levels of osteopontin as a prognostic factor in patients with oral squamous cell
carcinoma. Tumour Biol. 2014 Apr;35(4):3827-9.
Marroquin CE, Downey L, Guo H, Kuo PC. Osteopontin increases CD44 expression
and cell adhesion in RAW 264.7 murine leukemia cells. Immunol Lett. 2004 Aug
15;95(1):109-12.
Martin TJ, Sims NA. RANKL/OPG; Critical role in bone physiology. Rev Endocr Metab
Disord. 2015 Jan 4.
Martinez C, Churchman M, Freeman T, Ilyas M. Osteopontin provides early proliferative
drive and may be dependent upon aberrant c-myc signalling in murine intestinal
tumours. Exp Mol Pathol. 2010 Apr;88(2):272-7.
Mashhadiabbas F, Mahjour F, Mahjour SB, Fereidooni F, Hosseini FS. The
immunohistochemical characterization of MMP-2, MMP-10, TIMP-1, TIMP-2, and
podoplanin in oral squamous cell carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral
Radiol. 2012 Aug;114(2):240-50.
80
Matsuzaki H, Shima K, Muramatsu T, Ro Y, Hashimoto S, Shibahara T et al.
Osteopontin as biomarker in early invasion by squamous cell carcinoma in tongue. J
Oral Pathol Med. 2007 Jan;36(1):30-4.
McKee MD, Nanci A. Osteopontin: an interfacial extracellular matrix protein in
mineralized tissues. Connect Tissue Res. 1996;35(1-4):197-205.
Mi Z, Guo H, Wai PY, Gao C, Kuo PC. Integrin-linked kinase regulates osteopontin-
dependent MMP-2 and uPA expression to convey metastatic function in murine
mammary epithelial cancer cells. Carcinogenesis. 2006 Jun;27(6):1134-45.
Miyazaki T, Kato H, Nakajima M, Faried A, Takita J, Sohda M et al. An
immunohistochemical study of TIMP-3 expression in oesophageal squamous cell
carcinoma. Br J Cancer. 2004 Oct 18;91(8):1556-60.
Miki Y, Ono K, Hata S, Suzuki T, Kumamoto H, Sasano H. The advantages of co-
culture over mono cell culture in simulating in vivo environment. J Steroid Biochem Mol
Biol. 2012 Sep;131(3-5):68-75.
Moro N, Mauch C, Zigrino P. Metalloproteinases in melanoma.Eur J Cell Biol. 2014 Jan-
Feb;93(1-2):23-9.
Muramatsu T, Shima K, Ohta K, Kizaki H, Ro Y, Kohno Y et al. Inhibition of osteopontin
expression and function in oral cancer cell lines by antisense oligonucleotides. Cancer
Lett. 2005 Jan 10;217(1):87-95.
Myles T, Leung LL. Thrombin hydrolysis of human osteopontin is dependent on
thrombin anion-binding exosites. J Biol Chem. 2008 Jun 27;283(26):17789-96.
81
Nagatsuka H, Siar CH, Tsujigiwa H, Naomoto Y, Han PP, Gunduz M et al. Heparanase
and cyclooxygenase-2 gene and protein expressions during progression of oral
epithelial dysplasia to carcinoma. Ann Diagn Pathol. 2012 Oct;16(5):354-61.
Nakajima K, Tamai M, Okaniwa S, Nakamura Y, Kobayashi M, Niwa T et al. Humoral
hypercalcemia associated with gastric carcinoma secreting parathyroid hormone: a
case report and review of the literature. Endocr J. 2013;60(5):557-62.
Nakamura H, Kenmotsu S, Sakai H, Ozawa H. Localization of CD44, the hyaluronate
receptor, on the plasma membrane of osteocytes and osteoclasts in rat tibiae. Cell
Tissue Res. 1995 May;280(2):225-33.
Nakashima T, Yasumatsu R, Masuda M, Clayman GL, Komune S. Prognostic value of
cathepsin L and its inhibitor headpin in oral squamous cell carcinoma. J Laryngol Otol.
2012 Nov;126(11):1134-7.
Nam TJ, Busby WH Jr, Rees C, Clemmons DR. Thrombospondin and osteopontin bind
to insulin-like growth factor (IGF)-binding protein-5 leading to an alteration in IGF-I-
stimulated cell growth. Endocrinology. 2000 Mar;141(3):1100-6.
Nomura T, Katunuma N. Involvement of cathepsins in the invasion, metastasis and
proliferation of cancer cells. J Med Invest. 2005 Feb;52(1-2):1-9.
Ogbureke KU, Nikitakis NG, Warburton G, Ord RA, Sauk JJ, Waller JL et al. Up-
regulation of SIBLING proteins and correlation with cognate MMP expression in oral
cancer. Oral Oncol. 2007 Oct;43(9):920-32.
Ohnishi Y, Watanabe M, Yasui H, Kakudo K. Effects of epidermal growth factor on the
invasive activity and cytoskeleton of oral squamous cell carcinoma cell lines. Oncol Lett.
2014 May;7(5):1439-1442.
82
Okada Y, Nishikawa J, Semma M, Ichikawa A. Induction of integrin β3 in PGE₂-
stimulated adhesion of mastocytoma P-815 cells to the Arg-Gly-Asp-enriched fragment
of fibronectin. Biochem Pharmacol. 2011 Apr 1;81(7):866-72.
Okamoto M, Hiura K, Ohe G, Ohba Y, Terai K, Oshikawa T et al. Mechanism for bone
invasion of oral cancer cells mediated by interleukin-6 in vitro and in vivo. Cancer. 2000
Nov 1;89(9):1966-75.
Oldberg A, Franzén A, Heinegård D. Cloning and sequence analysis of rat bone
sialoprotein (osteopontin) cDNA reveals an Arg-Gly-Asp cell-binding sequence. Proc
Natl Acad Sci U S A. 1986 Dec;83(23):8819-23.
Orian-Rousseau V, Sleeman J. CD44 is a multidomain signaling platform that integrates
extracellular matrix cues with growth factor and cytokine signals. Adv Cancer Res.
2014;123:231-54.
Orian-Rousseau V. CD44, a therapeutic target for metastasising tumours. Eur J Cancer.
2010 May;46(7):1271-7.
Oue E, Lee JW, Sakamoto K, Iimura T, Aoki K, Kayamori K et al. CXCL2 synthesized
by oral squamous cell carcinoma is involved in cancer-associated bone destruction.
Biochem Biophys Res Commun. 2012 Aug 3;424(3):456-61.
Paiva KB, Granjeiro JM. Bone tissue remodeling and development: focus on matrix
metalloproteinase functions. Arch Biochem Biophys. 2014 Nov 1;561:74-87.
Palacios-Arreola MI, Nava-Castro KE, Castro JI, García-Zepeda E, Carrero JC,
Morales-Montor J. The role of chemokines in breast cancer pathology and its possible
use as therapeutic targets. J Immunol Res. 2014;2014:849720.
83
Pandey M, Rao LP, Das SR. Predictors of mandibular involvement in cancers of the
oromandibular region. J Oral Maxillofac Surg. 2009 May;67(5):1069-73.
Pandruvada SN, Yuvaraj S, Liu X, Sundaram K, Shanmugarajan S, Ries WL et al. Role
of CXC chemokine ligand 13 in oral squamous cell carcinoma associated osteolysis in
athymic mice. Int J Cancer. 2010 May 15;126(10):2319-29.
Patel BP, Shah SV, Shukla SN, Shah PM, Patel PS. Clinical significance of MMP-2 and
MMP-9 in patients with oral cancer. Head Neck. 2007 Jun;29(6):564-72.
Pereira AC, Dias do Carmo E, Dias da Silva MA, Blumer Rosa LE. Matrix
metalloproteinase gene polymorphisms and oral cancer. J Clin Exp Dent. 2012 Dec
1;4(5):e297-301.
Pérez-Sayáns García M, Suárez-Peñaranda JM, Gayoso-Diz P, Barros-Angueira F,
Gándara-Rey JM, García-García A. Tissue inhibitor of metalloproteinases in oral
squamous cell carcinomas - a therapeutic target? Cancer Lett. 2012 Oct 1;323(1):11-9.
Phillips RJ, Helbig KJ, Van der Hoek KH, Seth D, Beard MR. Osteopontin increases
hepatocellular carcinoma cell growth in a CD44 dependant manner. World J
Gastroenterol. 2012 Jul 14;18(26):3389-99.
Pietak AM, Sayer M. Functional atomic force microscopy investigation of osteopontin
affinity for silicon stabilized tricalcium phosphate bioceramic surfaces. Biomaterials.
2006 Jan;27(1):3-14.
Polat B, Wohlleben G, Katzer A, Djuzenova CS, Technau A, Flentje M. Influence of
osteopontin silencing on survival and migration of lung cancer cells. Strahlenther Onkol.
2013 Jan;189(1):62-7.
84
Ponta H, Sherman L, Herrlich PA. CD44: from adhesion molecules to signalling
regulators. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003 Jan;4(1):33-45.
Ponta H, Wainwright D, Herrlich P. The CD44 protein family. Int J Biochem Cell Biol.
1998 Mar;30(3):299-305.
Quan J, Elhousiny M, Johnson NW, Gao J. Transforming growth factor-β1 treatment of
oral cancer induces epithelial-mesenchymal transition and promotes bone invasion via
enhanced activity of osteoclasts. Clin Exp Metastasis. 2013 Jun;30(5):659-70.
Quan J, Johnson NW, Zhou G, Parsons PG, Boyle GM, Gao J. Potential molecular
targets for inhibiting bone invasion by oral squamous cell carcinoma: a review of
mechanisms. Cancer Metastasis Rev. 2012 Jun;31(1-2):209-19.
Rangaswami H, Bulbule A, Kundu GC. Osteopontin: role in cell signaling and cancer
progression. Trends Cell Biol. 2006 Feb;16(2):79-87.
Rao LP, Das SR, Mathews A, Naik BR, Chacko E, Pandey M. Mandibular invasion in
oral squamous cell carcinoma: investigation by clinical examination and
orthopantomogram. Int J Oral Maxillofac Surg. 2004 Jul;33(5):454-7.
Rao LP, Shukla M, Sharma V, Pandey M. Mandibular conservation in oral cancer. Surg
Oncol. 2012 Jun;21(2):109-18.
Ren G, Tian Q, An Y, Feng B, Lu Y, Liang J et al. Coronin 3 promotes gastric cancer
metastasis via the up-regulation of MMP-9 and cathepsin K. Mol Cancer. 2012 Sep
14;11:67.
Reufsteck C, Lifshitz-Shovali R, Zepp M, Bäuerle T, Kübler D, Golomb G et al. Silencing
of skeletal metastasis-associated genes impairs migration of breast cancer cells and
reduces osteolytic bone lesions. Clin Exp Metastasis. 2012 Jun;29(5):441-56.
85
Ribeiro FA, Noguti J, Oshima CT, Ribeiro DA. Effective targeting of the epidermal
growth factor receptor (EGFR) for treating oral cancer: a promising approach.
Anticancer Res. 2014 Apr;34(4):1547-52.
Robertson BW, Bonsal L, Chellaiah MA. Regulation of Erk1/2 activation by osteopontin
in PC3 human prostate cancer cells. Mol Cancer. 2010 Sep 26;9:260.
Routray S, Kheur SM, Kheur M. Osteopontin: a marker for invasive oral squamous cell
carcinoma but not for potentially malignant epithelial dysplasias. Ann Diagn Pathol.
2013 Oct;17(5):421-4.
Saman DM. A review of the epidemiology of oral and pharyngeal carcinoma: update.
Head Neck Oncol. 2012 Jan 13;4:1
Sarvaiya PJ, Guo D, Ulasov I, Gabikian P, Lesniak MS. Chemokines in tumor
progression and metastasis. Oncotarget. 2013 Dec;4(12):2171-85.
Sato K, Lee JW, Sakamoto K, Iimura T, Kayamori K, Yasuda H et al. RANKL
synthesized by both stromal cells and cancer cells plays a crucial role in osteoclastic
bone resorption induced by oral cancer. Am J Pathol. 2013 May;182(5):1890-9.
Schmits R, Filmus J, Gerwin N, Senaldi G, Kiefer F, Kundig T et al. CD44 regulates
hematopoietic progenitor distribution, granuloma formation, and tumorigenicity. Blood.
1997 Sep 15;90(6):2217-33.
Schneider JG, Amend SR, Weilbaecher KN. Integrins and bone metastasis: integrating
tumor cell and stromal cell interactions. Bone. 2011 Jan;48(1):54-65.
Schwartz Fo HO, Novaes AB Jr, de Castro LM, Rosa AL, de Oliveira PT. In vitro
osteogenesis on a microstructured titanium surface with additional submicron-scale
topography. Clin Oral Implants Res. 2007 Jun;18(3):333-44.
86
Schwartz MA, Schaller MD, Ginsberg MH. Integrins: emerging paradigms of signal
transduction. Annu Rev Cell Dev Biol. 1995;11:549-99.
Seftor RE, Seftor EA, Hendrix MJ. Molecular role(s) for integrins in human melanoma
invasion. Cancer Metastasis Rev. 1999;18(3):359-75.
Semba I, Matsuuchi H, Miura Y. Histomorphometric analysis of osteoclastic resorption
in bone directly invaded by gingival squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med. 1996
Sep;25(8):429-35.
Senger DR, Asch BB, Smith BD, Perruzzi CA, Dvorak HF.A secreted phosphoprotein
marker for neoplastic transformation of both epithelial and fibroblastic cells.Nature. 1983
Apr 21;302(5910):714-5.
Senger DR, Perruzzi CA, Papadopoulos A. Elevated expression of secreted
phosphoprotein I (osteopontin, 2ar) as a consequence of neoplastic transformation.
Anticancer Res. 1989 Sep-Oct;9(5):1291-9.
Senger DR, Perruzzi CA, Papadopoulos-Sergiou A, Van de Water L. Adhesive
properties of osteopontin: regulation by a naturally occurring thrombin-cleavage in close
proximity to the GRGDS cell-binding domain. Mol Biol Cell. 1994 May;5(5):565-74.
Senger DR, Wirth DF, Hynes RO. Transformed mammalian cells secrete specific
proteins and phosphoproteins. Cell. 1979 Apr;16(4):885-93.
Shattil SJ, Kim C, Ginsberg MH. The final steps of integrin activation: the end game. Nat
Rev Mol Cell Biol. 2010 Apr;11(4):288-300.
Shaw RJ, Brown JS, Woolgar JA, Lowe D, Rogers SN, Vaughan ED. The influence of
the pattern of mandibular invasion on recurrence and survival in oral squamous cell
carcinoma. Head Neck. 2004 Oct;26(10):861-9.
87
Shevde LA, Samant RS, Paik JC, Metge BJ, Chambers AF, Casey G et al. Osteopontin
knockdown suppresses tumorigenicity of human metastatic breast carcinoma, MDA-
MB-435. Clin Exp Metastasis. 2006;23(2):123-33.
Shevde LA, Samant RS. Role of osteopontin in the pathophysiology of cancer. Matrix
Biol. 2014 Jul;37:131-41.
Shi Z, Stack MS. Molecules of cell adhesion and extracellular matrix proteolysis in oral
squamous cell carcinoma. Histol Histopathol. 2010 Jul;25(7):917-32.
Shibahara T, Nomura T, Cui NH, Noma H.A study of osteoclast-related cytokines in
mandibular invasion by squamous cell carcinoma. Int J Oral Maxillofac Surg. 2005
Oct;34(7):789-93.
Shijubo N, Uede T, Kon S, Maeda M, Segawa T, Imada A et al. Vascular endothelial
growth factor and osteopontin in stage I lung adenocarcinoma. Am J Respir Crit Care
Med. 1999 Oct;160(4):1269-73.
Shimo T, Kubota S, Goda T, Yoshihama Y, Kurio N, Nishida T et al. Clinical significance
and pathogenic function of connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) in osteolytic
mandibular squamous cell carcinoma. Anticancer Res. 2008 Jul-Aug;28(4C):2343-8.
Sigl V, Penninger JM. RANKL/RANK - from bone physiology to breast cancer. Cytokine
Growth Factor Rev. 2014 Apr;25(2):205-14.
Simard EP, Torre LA, Jemal A. International trends in head and neck cancer incidence
rates: differences by country, sex and anatomic site. Oral Oncol. 2014 May;50(5):387-
403.
88
Singh RD, Haridas N, Patel JB, Shah FD, Shukla SN, Shah PM et al. Matrix
metalloproteinases and their inhibitors: correlation with invasion and metastasis in oral
cancer. Indian J Clin Biochem. 2010 Jul;25(3):250-9.
Singh RD, Nilayangode H, Patel JB, Shah FD, Shukla SN, Shah PM et al. Combined
evaluation of matrix metalloproteinases and their inhibitors has better clinical utility in
oral cancer. Int J Biol Markers. 2011 Jan-Mar;26(1):27-36.
Smith J, Rattay T, McConkey C, Helliwell T, Mehanna H. Biomarkers in dysplasia of the
oral cavity: a systematic review. Oral Oncol. 2009 Aug;45(8):647-53.
Smith LL, Cheung HK, Ling LE, Chen J, Sheppard D, Pytela R et al. Osteopontin N-
terminal domain contains a cryptic adhesive sequence recognized by alpha9beta1
integrin. J Biol Chem. 1996 Nov 8;271(45):28485-91.
Sobral LM, Bufalino A, Lopes MA, Graner E, Salo T, Coletta RD. Myofibroblasts in the
stroma of oral cancer promote tumorigenesis via secretion of activin A. Oral Oncol.
2011b Sep;47(9):840-6.
Sobral LM, Zecchin KG, Nascimento de Aquino S, Lopes MA, Graner E et al. Isolation
and characterization of myofibroblast cell lines from oral squamous cell carcinoma.
Oncol Rep. 2011a Apr;25(4):1013-20.
Sodek J, Ganss B, McKee MD. Osteopontin. Crit Rev Oral Biol Med. 2000;11(3):279-
303.
Song G, Ming Y, Mao Y, Bao S, Ouyang G. Osteopontin prevents curcumin-induced
apoptosis and promotes survival through Akt activation via alpha v beta 3 integrins in
human gastric cancer cells. Exp Biol Med (Maywood). 2008 Dec;233(12):1537-45.
89
Song G, Ouyang G, Mao Y, Ming Y, Bao S, Hu T. Osteopontin promotes gastric cancer
metastasis by augmenting cell survival and invasion through Akt-mediated HIF-1alpha
up-regulation and MMP9 activation. J Cell Mol Med. 2009 Aug;13(8B):1706-18.
Song J, Ge Z, Yang X, Luo Q, Wang C, You H et al. Hepatic stellate cells activated by
acidic tumor microenvironment promote the metastasis of hepatocellular carcinoma via
osteopontin. Cancer Lett. 2015 Jan 28;356(2 Pt B):713-20.
Sørensen ES, Rasmussen LK, Møller L, Jensen PH, Højrup P, Petersen TE.
Localization of transglutaminase-reactive glutamine residues in bovine osteopontin.
Biochem J. 1994 Nov 15;304 ( Pt 1):13-6.
Staines KA, MacRae VE, Farquharson C. The importance of the SIBLING family of
proteins on skeletal mineralisation and bone remodelling. J Endocrinol. 2012
Sep;214(3):241-55.
Standal T, Borset M, Sundan A. Role of osteopontin in adhesion, migration, cell survival
and bone remodeling. Exp Oncol. 2004b Sep;26(3):179-84.
Standal T, Hjorth-Hansen H, Rasmussen T, Dahl IM, Lenhoff S, Brenne AT et al.
Osteopontin is an adhesive factor for myeloma cells and is found in increased levels in
plasma from patients with multiple myeloma. Haematologica. 2004a Feb;89(2):174-82.
Tada T, Jimi E, Okamoto M, Ozeki S, Okabe K. Oral squamous cell carcinoma cells
induce osteoclast differentiation by suppression of osteoprotegerin expression in
osteoblasts. Int J Cancer. 2005 Aug 20;116(2):253-62.
Takafuji V, Forgues M, Unsworth E, Goldsmith P, Wang XW. An osteopontin fragment
is essential for tumor cell invasion in hepatocellular carcinoma. Oncogene. 2007 Sep
27;26(44):6361-71.
90
Takahashi F, Takahashi K, Shimizu K, Cui R, Tada N, Takahashi H et al. Osteopontin is
strongly expressed by alveolar macrophages in the lungs of acute respiratory distress
syndrome. Lung. 2004;182(3):173-85.
Takayama Y, Mori T, Nomura T, Shibahara T, Sakamoto M. Parathyroid-related protein
plays a critical role in bone invasion by oral squamous cell carcinoma. Int J Oncol. 2010
Jun;36(6):1387-94.
Tang H, Wang J, Bai F, Hong L, Liang J, Gao J et al. Inhibition of osteopontin would
suppress angiogenesis in gastric cancer. Biochem Cell Biol. 2007 Feb;85(1):103-10.
Teramoto H, Castellone MD, Malek RL, Letwin N, Frank B, Gutkind JS et al. Autocrine
activation of an osteopontin-CD44-Rac pathway enhances invasion and transformation
by H-RasV12. Oncogene. 2005 Jan 13;24(3):489-501.
Terpos E, Kiagia M, Karapanagiotou EM, Charpidou A, Dilana KD, Nasothimiou E et al.
The clinical significance of serum markers of bone turnover in NSCLC patients:
surveillance, management and prognostic implications. Anticancer Res. 2009
May;29(5):1651-7.
Thomas GT, Lewis MP, Speight PM. Matrix metalloproteinases and oral cancer. Oral
Oncol. 1999 May;35(3):227-33.
Tilli TM, Mello KD, Ferreira LB, Matos AR, Accioly MT, Faria PA et al. Both osteopontin-
c and osteopontin-b splicing isoforms exert pro-tumorigenic roles in prostate cancer
cells. Prostate. 2012 Nov;72(15):1688-99.
Tomao F, Papa A, Rossi L, Zaccarelli E, Caruso D, Zoratto F et al. Angiogenesis and
antiangiogenic agents in cervical cancer. Onco Targets Ther. 2014 Dec 3;7:2237-48.
91
Tuck AB, Chambers AF, Allan AL. Osteopontin overexpression in breast cancer:
knowledge gained and possible implications for clinical management. J Cell Biochem.
2007 Nov 1;102(4):859-68.
Tuck AB, Elliott BE, Hota C, Tremblay E, Chambers AF. Osteopontin-induced, integrin-
dependent migration of human mammary epithelial cells involves activation of the
hepatocyte growth factor receptor (Met). J Cell Biochem. 2000 Jun 6;78(3):465-75.
Tuck AB, Hota C, Wilson SM, Chambers AF. Osteopontin-induced migration of human
mammary epithelial cells involves activation of EGF receptor and multiple signal
transduction pathways. Oncogene. 2003 Feb 27;22(8):1198-205.
Turk V, Stoka V, Vasiljeva O, Renko M, Sun T, Turk B et al. Cysteine cathepsins: from
structure, function and regulation to new frontiers. Biochim Biophys Acta. 2012
Jan;1824(1):68-88.
Underhill C. CD44: the hyaluronan receptor. J Cell Sci. 1992 Oct;103 ( Pt 2):293-8.
Van Cann EM, Koole R, Oyen WJ, de Rooy JW, de Wilde PC, Slootweg PJ et al.
Assessment of mandibular invasion of squamous cell carcinoma by various modes of
imaging: constructing a diagnostic algorithm. Int J Oral Maxillofac Surg. 2008
Jun;37(6):535-41.
Vidiri A, Guerrisi A, Pellini R, Manciocco V, Covello R, Mattioni O et al. Multi-detector
row computed tomography (MDCT) and magnetic resonance imaging (MRI) in the
evaluation of the mandibular invasion by squamous cell carcinomas (SCC) of the oral
cavity. Correlation with pathological data. J Exp Clin Cancer Res. 2010 Jun 17;29:73.
Wang W, Luo BH. Structural basis of integrin transmembrane activation.J Cell Biochem.
2010 Feb 15;109(3):447-52.
92
Wai PY, Kuo PC. Osteopontin: regulation in tumor metastasis. Cancer Metastasis Rev.
2008 Mar;27(1):103-18.
Wang ZM, Cui YH, Li W, Chen SY, Liu TS. Lentiviral-mediated siRNA targeted against
osteopontin suppresses the growth and metastasis of gastric cancer cells. Oncol Rep.
2011 Apr;25(4):997-1003.
Weber GF, Cantor H. The immunology of Eta-1/osteopontin. Cytokine Growth Factor
Rev. 1996 Oct;7(3):241-8.
Weber GF, Lett GS, Haubein NC. Categorical meta-analysis of Osteopontin as a clinical
cancer marker. Oncol Rep. 2011 Feb;25(2):433-41.
Weber GF, Lett GS, Haubein NC. Osteopontin is a marker for cancer aggressiveness
and patient survival. Br J Cancer. 2010 Sep 7;103(6):861-9.
Wilson SR, Peters C, Saftig P, Brömme D. Cathepsin K activity-dependent regulation of
osteoclast actin ring formation and bone resorption. J Biol Chem. 2009 Jan
23;284(4):2584-92.
Wong RJ, Keel SB, Glynn RJ, Varvares MA. Histological pattern of mandibular invasion
by oral squamous cell carcinoma. Laryngoscope. 2000 Jan;110(1):65-72.
Wrana JL, Zhang Q, Sodek J. Full length cDNA sequence of porcine secreted
phosphoprotein-I (SPP-I, osteopontin). Nucleic Acids Res. 1989 Dec 11;17(23):10119.
Wu XL, Lin KJ, Bai AP, Wang WX, Meng XK, Su XL et al. Osteopontin knockdown
suppresses the growth and angiogenesis of colon cancer cells. World J Gastroenterol.
2014 Aug 14;20(30):10440-8.
93
Xia F, Xu JC, Zhang P, Zhang YY, Zhang QW, Chao ZH et al. Glucose-regulated
protein 78 and heparanase expression in oral squamous cell carcinoma: correlations
and prognostic significance. World J Surg Oncol. 2014 Apr 25;12:121.
Yan X, Takahara M, Xie L, Oda Y, Nakahara T, Uchi H et al. Stromal expression of
cathepsin K in squamous cell carcinoma. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2011
Mar;25(3):362-5.
Yang G, Zhang S, Zhang Y, Zhou Q, Peng S, Zhang T et al. The inhibitory effects of
extracellular ATP on the growth of nasopharyngeal carcinoma cells via P2Y2 receptor
and osteopontin. J Exp Clin Cancer Res. 2014 Jun 24;33:53.
Yang G, Zhang Y, Wu J, Xiong J, Deng H, Wang J et al. Osteopontin regulates growth
and migration of human nasopharyngeal cancer cells. Mol Med Rep. 2011 Nov-
Dec;4(6):1169-73.
Yokosaki Y, Matsuura N, Sasaki T, Murakami I, Schneider H, Higashiyama S et al. The
integrin alpha(9)beta(1) binds to a novel recognition sequence (SVVYGLR) in the
thrombin-cleaved amino-terminal fragment of osteopontin. J Biol Chem. 1999 Dec
17;274(51):36328-34.
Young MF, Kerr JM, Termine JD, Wewer UM, Wang MG, McBride OW et al. cDNA
cloning, mRNA distribution and heterogeneity, chromosomal location, and RFLP
analysis of human osteopontin (OPN). Genomics. 1990 Aug;7(4):491-502.
Yu TT, Han ZG, Shan L, Tao J, Zhang T, Yuan SF, Shen HL. Expression of osteopontin
in non-small cell lung cancer and correlative relation with microvascular density. Asian
Pac J Cancer Prev. 2014;15(1):29-32.
94
Yu WH, Woessner JF Jr. Heparan sulfate proteoglycans as extracellular docking
molecules for matrilysin (matrix metalloproteinase 7). J Biol Chem. 2000 Feb
11;275(6):4183-91.
Yuen HF, Chan KK, Grills C, Murray JT, Platt-Higgins A, Eldin OS et al. Ran is a
potential therapeutic target for cancer cells with molecular changes associated with
activation of the PI3K/Akt/mTORC1 and Ras/MEK/ERK pathways. Clin Cancer Res.
2012 Jan 15;18(2):380-91.
Zhang H, Guo M, Chen JH, Wang Z, Du XF, Liu PX et al. Osteopontin knockdown
inhibits αv,β3 integrin-induced cell migration and invasion and promotes apoptosis of
breast cancer cells by inducing autophagy and inactivating the PI3K/Akt/mTOR
pathway. Cell Physiol Biochem. 2014;33(4):991-1002.
Zhang H, Hunter GK, Goldberg HA, Lajoie GA, Yeung KK. An integrated procedure of
selective injection, sample stacking and fractionation of phosphopeptides for MALDI MS
analysis. Anal Chim Acta. 2007 Jan 9;581(2):268-80.
Zhang R, Pan X, Huang Z, Weber GF, Zhang G. Osteopontin enhances the expression
and activity of MMP-2 via the SDF-1/CXCR4 axis in hepatocellular carcinoma cell lines.
PLoS One. 2011;6(8):e23831.
Zhang X, Tsukamoto T, Mizoshita T, Ban H, Suzuki H, Toyoda T et al. Expression of
osteopontin and CDX2: indications of phenotypes and prognosis in advanced gastric
cancer. Oncol Rep. 2009 Mar;21(3):609-13.
Zhang Y, Forootan SS, Kamalian L, Bao ZZ, Malki MI, Foster CS et al. Suppressing
tumourigenicity of prostate cancer cells by inhibiting osteopontin expression. Int J
Oncol. 2011 Apr;38(4):1083-91.
95
Zhi X, Lamperska K, Golusinski P, Schork NJ, Luczewski L, Golusinski W et al.
Expression levels of insulin-like growth factors 1 and 2 in head and neck squamous cell
carcinoma. Growth Horm IGF Res. 2014 Aug;24(4):137-41.
Zlotnik A, Yoshie O. Chemokines: a new classification system and their role in
immunity. Immunity. 2000 Feb;12(2):121-7.
Zohar R, Suzuki N, Suzuki K, Arora P, Glogauer M, McCulloch CA et al. Intracellular
osteopontin is an integral component of the CD44-ERM complex involved in cell
migration. J Cell Physiol. 2000 Jul;184(1):118-30.
Zou C, Luo Q, Qin J, Shi Y, Yang L, Ju B et al. Osteopontin promotes mesenchymal
stem cell migration and lessens cell stiffness via integrin β1, FAK, and ERK pathways.
Cell Biochem Biophys. 2013 Apr;65(3):455-62.
Zurick KM, Qin C, Bernards MT. Mineralization induction effects of osteopontin, bone
sialoprotein, and dentin phosphoprotein on a biomimetic collagen substrate. J Biomed
Mater Res A. 2013 Jun;101(6):1571-81.
96
97
APÊNDICE 1
Resultados das análises de integridade do RNA
A integridade do RNA foi verificada previamente aos ensaios de Real Time PCR
pela visualização de duas subunidades ribossômicas características de células
eucarióticas (18S e 28S). Essa análise foi realizada por meio do aparelho 2100
Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), de acordo com as
instruções do fabricante. Foram consideradas amostras viáveis para realização do Real
Time PCR aquelas que apresentavam valores de RIN superiores a 8 (escores variando
de 0 a 10).
Integridade do RNA para análise do perfil de expressão de OPN em células
SAOS-2 e SCC9
Figura 21. Ensaio de integridade do RNA ribossômico extraído aos 3, 5, 7 e 10 dias de culturas
de células SAOS-2 e SCC9.
98
Integridade do RNA para análise do perfil de expressão de OPN em coculturas
SAOS-2/SCC9
Figura 22. Ensaio de integridade do RNA ribossômico extraído aos 3, 5, 7 e 10 dias de coculturas
SAOS-2/SCC9.
99
Integridade do RNA para o ensaio de silenciamento do transcrito do gene da OPN
por RNAi
Figura 23. Ensaio de integridade do RNA ribossômico extraído aos 10 dias de culturas controles de
células SAOS-2 e de culturas de células SAOS-2 silenciadas para expressão de OPN e GAPDH aos 5 e
7 dias.
100
Integridade do RNA para o ensaio de PCR Array
Figura 24. Ensaio de integridade do RNA ribossômico de células SCC9 cocultivadas com SAOS-2.
101
APÊNDICE 2
Resultados do silenciamento do transcrito do gene da OPN por RNAi
Imunolocalização de OPN por imunofluorescência indireta
Nos grupos Controle e Controle Negativo, o ensaio de fluorescência revelou
marcação positiva para OPN em região perinuclear, compatível com sua localização
majoritária no complexo de Golgi, aos 5 e 7 dias (Figura 25). Contudo, nos grupos em
que foi realizado o silenciamento, notou-se redução da marcação para OPN,
particularmente para as células silenciadas aos 5 dias (Figura 25, compare C com F).
Figura 25. Epifluorescência de culturas de células SAOS-2 aos 10 dias, após o silenciamento para OPN
aos 5 e 7 dias. Vermelho indica marcação para OPN, cinza, o citoesqueleto de actina, e azul, os núcleos
celulares. Notem-se abundante marcação para OPN em região perinuclear para os grupos Controle (A e
D) e Controle Negativo (B e E) e marcação reduzida nos grupos em que a expressão de OPN foi
silenciada (C e F), particularmente no 5o dia (C). Barra de escala = 100 µm.
102
Expressão de OPN por Real Time PCR
Aos 10 dias, verificou-se que o silenciamento realizado aos 5 e 7 dias resultou
em redução significativa do RNAm para OPN (Kruskal-Wallis, p < 0,05) em relação aos
controles, com inibição de 99% e 97% de sua expressão, respectivamente (Figura 26).
O silenciamento no 5o dia foi significativamente maior do que aquele no 7o dia (p <
0,05).
Figura 26. Expressão relativa de RNAm para o gene OPN aos 10 dias em culturas de células SAOS-2
controles e após o silenciamento ao 5o ou ao 7
o dia. Note-se redução expressiva dos níveis de RNAm
para OPN nas culturas submetidas ao silenciamento, particularmente no 5o dia. Os dados foram
normalizados pelo gene constitutivo GAPDH e calibrados pelo Controle. Barras que apresentam letras
semelhantes não são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são apresentados como
média ± desvio padrão.
Como controle positivo da transfecção foi avaliado o silenciamento do gene
constitutivo GAPDH. De acordo com o fabricante, a transfecção deve ser considerada
adequada quando o silenciamento desse for superior a 97%. No presente estudo, em
todos os ensaios realizados foi observada inibição dos transcritos para GAPDH
superior a 98% (Figura 27).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Controle ControleNegativo
OPN -RNAi
Controle ControleNegativo
OPN -RNAi
5º dia 7º dia
Exp
ressão
rela
tiv
a d
e R
NA
m
Expressão de OPN
a a
b
a
c
d
103
Figura 27. Expressão relativa de RNAm para o gene constitutivo GAPDH aos 10 dias em culturas de
células SAOS-2 controle e após o seu silenciamento ao 5o ou ao 7
o dia. Note-se redução importante dos
níveis de RNAm para GAPDH em comparação ao controle. Os dados foram normalizados pelo próprio
GAPDH e calibrados pelo controle. Barras que apresentam letras semelhantes não são
significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio
padrão.
Quantificação de OPN por ELISA
Culturas SAOS-2 silenciadas para o gene da OPN aos 5 e 7 dias exibiram
redução da expressão da proteína aos 10 dias em comparação aos grupos controles,
sendo os menores níveis observados em culturas silenciadas aos 5 dias (Kruskal-
Wallis, p < 0,05, Figura 28).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
GAPDH -Controle
GAPDH - RNAi GAPDH -Controle
GAPDH - RNAi
5º dia 7º dia
Exp
ressão
rela
tiv
a d
e R
NA
m
Expressão de GAPDH
a
b
a
b
104
Figura 28. Quantificação de OPN aos 10 dias em sobrenadantes de culturas de células SAOS-2
controles e após o seu silenciamento ao 5o ou ao 7
o dia. Note-se redução importante de OPN nas
culturas submetidas ao silenciamento, particularmente no 5o dia. Barras que apresentam pelo menos
uma letra semelhante não são significativamente diferentes entre si (p > 0,05). Os dados são
apresentados como média ± desvio padrão.
0
4
8
12
16
Controle ControleNegativo
RNAi Controle ControleNegativo
RNAi
5º dia 7º dia
pg
/10
4célu
las
Quantificação de OPN extracelular
a b
c
d a,e
f
105
ANEXO
Tabela 2. Relação de genes envolvidos no processo de invasão e metástase presentes na placa de PCR
Array (SuperArray)
Posição Número/Acesso Símbolo Descrição
A01 NM_000038 APC Adenomatous polyposis coli
A02 NM_015399 BRMS1 Breast cancer metastasis suppressor 1
A03 NM_006273 CCL7 Chemokine (C-C motif) ligand 7
A04 NM_000610 CD44 CD44 molecule (Indian blood group)
A05 NM_004360 CDH1 Cadherin 1, type 1, E-cadherin (epithelial)
A06 NM_001797 CDH11 Cadherin 11, type 2, OB-cadherin (osteoblast)
A07 NM_004932 CDH6 Cadherin 6, type 2, K-cadherin (fetal kidney)
A08 NM_000077 CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits CDK4)
A09 NM_001273 CHD4 Chromodomain helicase DNA binding protein 4
A10 NM_001846 COL4A2 Collagen, type IV, alpha 2
A11 NM_003650 CST7 Cystatin F (leukocystatin)
A12 NM_001328 CTBP1 C-terminal binding protein 1
B01 NM_001903 CTNNA1 Catenin (cadherin-associated protein), alpha 1, 102kDa
B02 NM_000396 CTSK Cathepsin K
B03 NM_001912 CTSL Cathepsin L1
B04 NM_000609 CXCL12 Chemokine (C-X-C motif) ligand 12
B05 NM_003467 CXCR4 Chemokine (C-X-C motif) receptor 4
B06 NM_003677 DENR Density-regulated protein
B07 NM_004442 EPHB2 EPH receptor B2
B08 NM_001986 ETV4 Ets variant 4
B09 NM_005243 EWSR1 Ewing sarcoma breakpoint region 1
B10 NM_005245 FAT1 FAT tumor suppressor homolog 1 (Drosophila)
B11 NM_002011 FGFR4 Fibroblast growth factor receptor 4
B12 NM_002020 FLT4 Fms-related tyrosine kinase 4
C01 NM_002026 FN1 Fibronectin 1
C02 NM_014164 FXYD5 FXYD domain containing ion transport regulator 5
C03 NM_000825 GNRH1 Gonadotropin-releasing hormone 1 (luteinizing-releasing hormone)
C04 NM_032551 KISS1R KISS1 receptor
C05 NM_000601 HGF Hepatocyte growth factor (hepapoietin A; scatter factor)
C06 NM_006665 HPSE Heparanase
C07 NM_005343 HRAS V-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog
C08 NM_006410 HTATIP2 HIV-1 Tat interactive protein 2, 30kDa
C09 NM_000618 IGF1 Insulin-like growth factor 1 (somatomedin C)
C10 NM_001562 IL18 Interleukin 18 (interferon-gamma-inducing factor)
C11 NM_000576 IL1B Interleukin 1, beta
C12 NM_001557 CXCR2 Chemokine (C-X-C motif) receptor 2
D01 NM_002206 ITGA7 Integrin, alpha 7
D02 NM_000212 ITGB3 Integrin, beta 3 (platelet glycoprotein IIIa, antigen CD61)
D03 NM_002231 CD82 CD82 molecule
D04 NM_002256 KISS1 KiSS-1 metastasis-suppressor
D05 NM_004985 KRAS V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
D06 NM_002295 RPSA Ribosomal protein SA
D07 NM_006500 MCAM Melanoma cell adhesion molecule
D08 NM_002392 MDM2 Mdm2 p53 binding protein homolog (mouse)
D09 NM_000245 MET Met proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor)
D10 NM_006838 METAP2 Methionyl aminopeptidase 2
D11 NM_002410 MGAT5 Mannosyl (alpha-1,6-)-glycoprotein beta-1,6-N-acetyl-glucosaminyltransferase
D12 NM_002425 MMP10 Matrix metallopeptidase 10 (stromelysin 2)
E01 NM_005940 MMP11 Matrix metallopeptidase 11 (stromelysin 3)
106
Tabela 2. Continuação
Posição Número/Acesso Símbolo Descrição
E02 NM_002427 MMP13 Matrix metallopeptidase 13 (collagenase 3)
E03 NM_004530 MMP2 Matrix metallopeptidase 2 (gelatinase A, 72kDa gelatinase, 72kDa type IV collagenase)
E04 NM_002422 MMP3 Matrix metallopeptidase 3 (stromelysin 1, progelatinase)
E05 NM_002423 MMP7 Matrix metallopeptidase 7 (matrilysin, uterine)
E06 NM_004994 MMP9 Matrix metallopeptidase 9 (gelatinase B, 92kDa gelatinase, 92kDa type IV collagenase)
E07 NM_004689 MTA1 Metastasis associated 1
E08 NM_014751 MTSS1 Metastasis suppressor 1
E09 NM_002467 MYC V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)
E10 NM_005376 MYCL V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog 1, lung carcinoma derived (avian)
E11 NM_000268 NF2 Neurofibromin 2 (merlin)
E12 NM_000269 NME1 Non-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed in
F01 NM_002512 NME2 Non-metastatic cells 2, protein (NM23B) expressed in
F02 NM_005009 NME4 Non-metastatic cells 4, protein expressed in
F03 NM_006981 NR4A3 Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 3
F04 NM_002659 PLAUR Plasminogen activator, urokinase receptor
F05 NM_002687 PNN Pinin, desmosome associated protein
F06 NM_000314 PTEN Phosphatase and tensin homolog
F07 NM_000321 RB1 Retinoblastoma 1
F08 NM_006914 RORB RAR-related orphan receptor B
F09 NM_003011 SET SET nuclear oncogene
F10 NM_005901 SMAD2 SMAD family member 2
F11 NM_005359 SMAD4 SMAD family member 4
F12 NM_005417 SRC V-src sarcoma (Schmidt-Ruppin A-2) viral oncogene homolog (avian)
G01 NM_001050 SSTR2 Somatostatin receptor 2
G02 NM_003177 SYK Spleen tyrosine kinase
G03 NM_005650 TCF20 Transcription factor 20 (AR1)
G04 NM_000660 TGFB1 Transforming growth factor, beta 1
G05 NM_003255 TIMP2 TIMP metallopeptidase inhibitor 2
G06 NM_000362 TIMP3 TIMP metallopeptidase inhibitor 3
G07 NM_003256 TIMP4 TIMP metallopeptidase inhibitor 4
G08 NM_003810 TNFSF10 Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10
G09 NM_000546 TP53 Tumor protein p53
G10 NM_002420 TRPM1 Transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 1
G11 NM_000369 TSHR Thyroid stimulating hormone receptor
G12 NM_003376 VEGFA Vascular endothelial growth factor A
H01 NM_004048 B2M Beta-2-microglobulin
H02 NM_000194 HPRT1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
H03 NM_012423 RPL13A Ribosomal protein L13a
H04 NM_002046 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
H05 NM_001101 ACTB Actin, beta
H06 SA_00105 HGDC Human Genomic DNA Contamination
H07 SA_00104 RTC Reverse Transcription Control
H08 SA_00104 RTC Reverse Transcription Control
H09 SA_00104 RTC Reverse Transcription Control
H10 SA_00103 PPC Positive PCR Control
H11 SA_00103 PPC Positive PCR Control
H12 SA_00103 PPC Positive PCR Control
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