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MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL
2011
ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA
FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
INGENIERÍA AMBIENTAL
ESTUDIANTE: Carlos Alberto Casiano Inga
PROFESORA: Dra. Flor García Huamán
CURSO: Microbiología Ambiental
TEMA: Prácticas de Microbiología Ambiental
CHACHAPOYAS 2011
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MEDIOS DE CULTIVO
I. INTRODUCCIÓN:
Nos maravilla el conocimiento que hoy tenemos sobre la gran diversidad microbiana.
Sin embargo, poco se habla de ello, a pesar de su enorme importancia. Abordar el
tema de la microbiología ambiental resulta largo y complejo, pero seleccionandoalgunos ejemplos es posible dar una idea clara de la importancia de conocer la
interacción entre los parámetros ambientales y los microorganismos.
Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razón
por la cual es difícil aislarlas. Pero debemos estar preparados para aislar, cultivar e
identificar a la misma. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de
microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales
preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los
microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el
Cultivo.
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que
permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos. La diversidad metabólica
de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo también
lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos.
Las condiciones que reúne un medio de cultivo artificial para que los microorganismos
crezcan son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así
como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos es
fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe
reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el
que se desarrollan.
La utilización de los medios de cultivo son necesarios para:
- Separación y aislamiento de las distintas especies microbiales presentes en una
muestra.
- Estudio de identificación de un microorganismo problema.
- Estudios macroscópicos. Visualizar las características de las colonias en medios
sólidos.
- Para la conservación de especies microbiales o muestras, etc.
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Clasificación de los medios de cultivo:
1.- Según su naturaleza:
Medios naturales o complejos: constituido por sustancias complejas de origen
animal o vegetal, así como minerales y otras sustancias.
Medios definidos o sintéticos: Composición química definida cualitativamente
y cuantitativamente.
2.- Según su uso:
Medios de enriquecimiento: Son medios líquidos, favorecen el crecimiento de
un tipo de microorganismo en particular
Medios Selectivos: Parecidos a los de enriquecimiento, con la diferencia de ser
sólidos, diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.
Medios Diferenciales: Contiene indicadores de productos derivados de la
actividad microbiana. Permite revelar características fisiológicas de los
microorganismos.
Almacenamiento de los medios de cultivo:
Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y
protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves,
hornos ni otra fuente de calor o vapor. Una vez que el medio de cultivo ha sido
preparado y esterilizado, puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo
máximo de 2 semanas protegido de la luz, o por periodos mayores a 12 -15°C. Sin
embargo, almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los
mismos, (nunca por debajo de 0°C porque se destruye la estructura del gel). Los
medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su
deshidratación.
Características de los microorganismos al momento de preparar un medio de cultivo:
1.- Trófico: requerimientos de carbono y energía, según los cuales se clasifica en
autótrofos, heterótrofos, quimiótrofos (litótrofos u organótrofos) y fotótrofos.
2.- Respiratorio: Aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerófilos.
3.- Temperatura óptima de Crecimiento: según el rango de temperatura al cual el
microorganismo presenta su mayor crecimiento, se los clasifica en sicrófilos, mesófilos
y termófilos.
4.- Rango de pH: El rango óptimo de pH para la mayoría de bacterias oscila entre 6,6 y
7,2.
En el laboratorio, los medios de cultivopueden presentarse en forma líquida, encuyo caso se los denomina caldos, o enforma sólida si se le agrega agar al caldo.
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Constituyentes habituales de los medio de cultivo: Los siguientes elementos son
frecuentemente utilizados en la preparación de los medios de cultivo.
1.- Agua destilada o desionizada: Libre de inhibidores del crecimiento.
2.- Agar: Utilizado como agente gelificante, para dar solidez a los medios de cultivo. El
componente dominante en el agar es un polisacárido, al que acompañan algunas
impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se
solubiliza en agua a ebullición (funde hacia los 98°C) y al enfriarse forma un gel
inodoro e insípido (se gelifica alrededor de los 42°C), dependiendo de su grado de
pureza, por lo que tiene la ventaja de ser sólido a la temperatura de incubación. Con la
excepción de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como
nutriente. Para preparar un medio sólido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea
visualizar movilidad se usa agar blando y se le agrega agar al 3 %.
3.- Extractos: Para su preparación, se utilizan ciertos órganos, tejidos animales o
vegetales (por ejemplo carne, hígado, semillas, etc.). Son extraídos con agua y calor, y
posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparadosdeshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo.
Por ejemplo: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el caso del extracto de
carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas,
mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitrógeno y
carbono.
4.- Peptonas: Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales
minerales, carecen de identidad química definida; se obtienen por digestión
enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína,
etc.). Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser
deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteosas, peptonas,polipéptidos y aminoácidos.
5.- Fluidos Corporales: Sangre completa, plasma o suero sanguíneo son
frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos
patógenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en
condiciones asépticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no
solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino también con sustancias que
neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.
6.- Sistemas amortiguadores: Algunos componentes son incorporados al medio de
cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Los
microorganismos más comunes son los neutrófilos (el pH óptimo para su crecimientoestá próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o
sustancias como las peptonas, previenen una desviación del pH.
7.- Indicadores de pH: Los indicadores ácido base se añaden a menudo a los medios
de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH.
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8.- Agentes selectivos: La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo
puede convertirlo en selectivo, por ejemplo: cristal violeta, sales biliares, azida sódica,
telurito potásico, antibióticos, etc., a la concentración adecuada, actúan como agentes
selectivos frente a determinados microorganismos.
II. MATERIALES:Además de un ambiente apto para el trabajo microbiológico, el laboratorio demicrobiología requiere de una instrumentación básica de uso corriente enmicrobiología, y para la práctica de Medios de cultivo se utilizaron los siguientesinstrumentos:
Tubos de ensayo: Destinados a conservarmedios de cultivo en pequeños volúmenes. Seutilizan tubos de diversos tamaños. El vidriodebe ser de buena calidad, neutro, transparentee inalterable a los tratamientos.
Placas Petri: Cajas de vidrio de seccióncircular, con tapa. Existen de diferentestamaños según su uso, aunque las másfrecuentemente utilizadas tienen 10 cm dediámetro.
Pipetas graduadas: Para su uso en ellaboratorio de microbiología se les coloca untapón de algodón en el extremo superior, con lafinalidad de que el operador no aspire loslíquidos potencialmente contaminados, o quecontamine el medio de cultivo al aspirarlo. Seutiliza para realizar inoculaciones y diluciones.
Matraz de Erlenmeyer: Utilizado para lapreparación de los medios de cultivo, o para edesarrollo de microorganismos en mediolíquido con agitación o aireación.
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Mechero de alcohol: Destinado a proporcionarcalor por combustión.
Balanza: Diseñados para la determinación demasas de diversas sustancias.
Fósforo yCucharita: para tomar muestras de ciertassustancias.
Varillas de vidrio: Llamados agitadores obaguetas.
Gradillas para tubos de prueba: de metal o demadera para portar los tubos de prueba duranteel trabajo.
Cocinas eléctricas: utilizadas para fundirciertas sustancias.
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TSI: Agar de tres azúcares (lactosa, sacarosa y glucosa) e hierro (citrato férrico), tiosulfato
de sodio, elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador.
LIA:
Citrato: Esta prueba es muy utilizada para la investigación de bacilos Gram -.
Mc. Conkey: Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que varía hacia rojo a pHácido cuando la lactosa es fermentada.
Caldo Brila: Caldo verde brillante.
Extracto de levadura:
III. MÉTODOS:Empezaré por explicar la preparación del caldo brila, el cual nos permitirá tener unaidea de la elaboración de los otros medios de cultivo que ya lo teníamos preparadosen diferentes matraces.
III.I) Caldo BrilaLeer las indicaciones del recipiente de Caldo Brila, éste nos permite manejar las
cantidades apropiadas, para el Caldo Brila utilizar 40 g. con 100 ml de agua; nosotrosdeseamos utilizar 400 ml de agua, ¿Qué hacemos? Mediante una regla de tres simplecalculamos la cantidad de Caldo Brila a utilizar; de la siguiente manera:
Una vez calculada la cantidad requerida de Caldo Brila procedemos a pesarla. Estos 16g de Caldo Brila los vertimos en una fiola. Haciendo uso de una pipeta adicionamosagua destilada a la misma. Con leves movimientos circulatorios diluimos la solución.
Luego haciendo uso de una cocina eléctrica se calienta la solución hasta que éstaadquiera el color verde (color característico del Caldo Brila).Se deja enfriar por unos minutos; luego se hace uso de una pipeta para verter lasolución a los tubos de ensayo, aproximadamente hasta la parte superior de un tubo o“campana” Durham que se encuentran dentro de estos. Estos microtubos deben deser llenados, para esto se inclina levemente los tubos de ensayos.Hay que recordar que mientras realizamos todo este trabajo, hacemos uso del calor deun mechero para mantener estéril nuestros instrumentos de trabajo.
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Por último se tapan los tubos de ensayo con porciones de algodón para mantenerestéril nuestro preparado de Caldo Brila. Colocamos los tubos de ensayo en undepósito forrado con papel blanco, el depósito contiene algodón en el interior para no
causar daños. Se rotula y se coloca en la autoclave (121° x
- 1 atm). Deben seguirselas instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para asegurarse la obtención demedios de cultivo útiles. Debe tenerse en mente que la presión varía de acuerdo conla altura y por tanto no es un factor constante. De tal manera que son el tiempo y latemperatura los parámetros que deben tomarse en consideración en el proceso deautoclavado.
III.II) TSIAhora cogemos el TSI, el cual está contenido en un matraz y se encuentra solidificado.Para que esta sustancia se encuentre como está ha tenido que seguir los pasos de laelaboración del Caldo Brila. Para fundirlo utilizaremos una cocina eléctrica. Con la
ayuda de una pinza se coge el matraz con TSI, se coloca y se retira de la cocina sindejar de agitarlo levemente, con la finalidad de que el material no se sobrecaliente ycause prejuicios. Al cabo de unos minutos se tendrá el TSI líquido.
Se deja enfriar el matraz por unos minutos, mientras eso se prepara los tubos deensayo en los cuales se depositará el TSI, también el mechero con alcohol. Una vezque el matraz se encuentra relativamente frío se procede a depositar el TSI en lostubos de ensayo, pero para mantener nuestros materiales esterilizados y mientras serealiza el intercambio de depósito del TSI se hace uso del calor del mechero (calor
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seco-fuego directo). Luego raudamente se tapan los tubos de ensayo con algodón deigual forma con el matraz, y se titulan los tubos de ensayo.
Luego de verter el TSI en los tubos de ensayo se colocan con una leve inclinación. Unavez que estos se solidifican se colocan en la gradilla.
“Los pasos realizados con el TSI también son aplicados al LIA y al Citrato”
También tenemos las siguientes sustancias solidificadas en los matraces conprocedimientos de preparación muy parecidos a los del caldo brila: Mc. Conkey yextracto de levadura, pero con la única diferencia de que estos serán depositados enplacas Petri. El procedimiento es el mismo, se funde las sustancias Mc. Conkey y el
extracto de levadura, se deja enfriar, luego se vierte en las placas Petri (1/3), seesparce de forma uniforme en toda la placa petri, se tapa y se rotula. Para laesterilización de los materiales al verter se utiliza el calor del mechero (calor seco-fuego directo).
IV. RESULTADOS:Los procedimientos anteriores nos permiten elaborar medios de cultivo, conociendosu tremenda diversidad, para bacterias que serán analizadas y estudiadas en nuestroproceso de aprendizaje. Las diversas sustancias que se utilizan para la elaboración deun medio de cultivo nos permiten predecir el inmenso número de microorganismoque podemos encontrar.
Hemos elaborado dos medios de cultivo según su presentación: Medios sólidos en placas Petri: estos ocupan una superficie losuficientemente grande como para poder visualizar perfectamente lascolonias microbianas. El sistema en placa es uno de los medios que permitemejor el aislamiento de microorganismos que puedan crecer en él. Estosmedios de cultivo fueron: Mc. Conkey (color rojizo) y Extracto de Levadura(color marrón).
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Medios sólidos en tubos: que corresponden a tubos con agar inclinado ysolidificado con el fin de aumentar la superficie donde se va a producir elcrecimiento microbiano una vez sembrado. Estos fueron los siguientes: TSI(color anaranjado), LIA (color purpura claro), Citrato (color verde) y Brila(verde brillante).
V. DISCUSIÓN:¿Qué es un medio de cultivo? ¿Qué tipos de cultivos se ajustan más a las condiciones
naturales?
Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientesindispensables en la concentración adecuada, cantidad necesaria de sales y agua, quetenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estéril y que no contenga sustanciasinhibidoras.
Caldo Brila Citrato
|
TSI Mc. Conkey
LIA Extracto de Levadura
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Por ejemplo el TSI (Triple Sugar Iron) contiene tres azúcares (lactosa, sacarosa yglucosa), citrato férrico y tiosulfato de sodio, elevada concentración de aminoácidos yrojo fenol como indicador. Este medio de cultivo en clases futuras nos permitirádeterminar variedad de bacterias, su composición, etc. Y continuando con esteejemplo podemos citar que las bacterias cultivadas se inoculan en picadura
(microaerobiosis) y extensión superficial. Las fermentadoras generan color amarillopor acidificación y las oxidativas rosa sobre la superficie (basificación). Las bacteriassulfito-reductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros en la zonaanaeróbica. ¿Por qué es importante el conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los
microorganismos?
Es importante porque nos permite seleccionar el medio de cultivo más adecuado delmismo. Así un medio de cultivo reúne los requisitos de los microorganismos yreproduce el ambiente natural en el que se desarrollan.¿Cuál es el principio del TSI?
En TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar los hidratos decarbono glucosa, lactosa y/o sacarosa, con producción o no de gases (CO2 y H2), juntocon la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S).
VI. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA:Manacorda, Ana M., Cuadros, Daniela P. y Álvarez, Anahí. Manual Práctico deMicrobiología Ambiental. edición: 2007.Granados Pérez, R. y Villaverde Peris C. Microbiología: Bacteriología, mediosde cultivo y pruebas bioquímicas. Editorial Paraninfo.España, 1998.httpwww.microinmuno.qb.fcen.uba.arguia.pdf http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm
Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos.Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de MétodosGenerales (2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de
Venezuela.Madigan, M. T.; Martinko G. M.; Parker J. Brock, Biología de losMicroorganismos. Ed. Pretice Hall. 8ª edición. 2004.Koneman Elmer W. The Enterobacteriaceae in Diagnostic Microbiology. 5ª.Edición, Washington Square: Lippincott – Raven Publishers, 1997: 173- 203
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PREPARACIÓN DE TINCIONES BACTERIANAS
I. INTRODUCCIÓN:
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver
con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula
y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es lautilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos
diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, etc.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente,
aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y
alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores
cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en
células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el
agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación producehabitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las
células aparezcan mayores de lo que son realmente, de manera que las medidas de las
células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia
son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los
polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el
cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente
(aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente,tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el
rojo Congo.Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con
otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se
denomina mordiente; un mordiente habitual es el lugol. El mordiente se combina con
un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía,
son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen
colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que noproduce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente
útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la
mayor parte del material no celular no se tiñe.
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II. MATERIALES Y MÉTODOS
- Muestra de agua con bacterias
- Mechero con alcohol
- Lamina portaobjetos
- Asa bacteriológica
- Azul de Metileno
- Cristal Violeta
- Lugol (Mordiente)
- Alcohol Cetona (Descolorante)
- Safranina (Colorante de contraste)
En la preparación de tinciones bacterianas hemos trabajado las de coloración simple y
las de coloración Gram.
Coloración Simple:
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la
misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
Cogemos nuestra muestra y con ayuda de un asa bacteriológica extendemos y fijamos
la muestra a un portaobjetos, mientras mantenemos un mechero para mantener
esterilizado la muestra y los materiales. Luego se agrega el colorante azul de metileno;
se lava para quitar el exceso de colorante de modo, que el agua no golpee
directamente la muestra y se lave todo. Luego se deja secar, y nuestra coloración
simple está lista para observar al microscopio a un aumento de 100x.
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Coloración Gram:
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la
desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias
pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los
términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sinosimplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).
Contamos con nuestra muestra, la extendemos y la fijamos a una lámina portaobjetos
con ayuda de un asa bacteriológica; siempre contando con nuestro mechero para la
esterilización. Se agrega Cristal violeta por lo tanto nuestra muestra se colorea de azul,
se deja reposar de 3-5 minutos. Luego se lava como se muestra en el dibujo. Se
procede a agregar lugol (mordiente), en este proceso unas se fijan con mayor
intensidad; se deja reposar de 3-5 minutos y se lava nuevamente. Se agrega el alcohol
cetona (descolorante), en este procedimiento las bacterias que no se han fijado bien
se despintan, se deja reposar de 3-5 minutos y se lava. Por último agregamos safranina(colorante de contraste) que es la que tiñe a las bacterias que no se han fijado en el
procedimiento anterior, se lava y se deja secar a temperatura ambiente para luego
observar al microscopio con un aumento de 100x.
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III. RESULTADOS
Coloración Simple: Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los
microorganismos aplicando sólo una solución colorante (azul de metileno).
Coloración gram:
ETAPAS EN LA TINCIÓN
Pasos Método Gram positivas Gram negativas
Colorante BásicoCristal Violeta
(luego de unos minutos selava con agua el
exceso de colorante)
Se tiñe de violeta Se tiñe de violeta
Mordiente Lugol (pasado unos min.se lava con agua el
exceso de lugol)
Permanece violeta Permanece violeta
Descoloración
Alcohol-acetona (luego deunos minutos
lavarcon agua para
eliminar el resto dedisolvente)
Permanece violeta Se descolora
ContrasteFucsina o Safranina
(luego de unos minutos selava con agua el
exceso de colorante)
Permanece violeta Se tiñe de rosa
Observar al microscopioColocar sobre el
frotis una gota deaceite de inmersión.
Violeta Rosa
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IV. DISCUSIÓN
¿Por qué teñir una muestra?
Porque nos permite distinguir a cada una de ellas, diferenciarlas por sus características
morfológicas, taxonómicas, etc.
¿Cómo debe de ser la descoloración de una muestra?
La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las
células grampositivas. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un
cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.
¿Qué se hace en la coloración simple?
Se cubre el frotis, después de fijado, con la solución colorante y se deja actuar el
tiempo preciso. Se cubre el preparado con la solución de uso (azul de metileno
alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos.
¿Se puede agregar un álcali a la solución de azul de metileno de uso? ¿Por qué si? ¿Por
qué no?
Si se puede agregar un álcali (KOH) como intensificante, que actúa haciendo másrápida e intensa la reacción de coloración.
V. BIBLIOGRAFÍA
Manual Práctico de Microbiología. R. Díaz, y colaboradores, 2a edición. Ed.Masson, Barcelona, 1999
Forbes, B. A.- Sahm D. F. – Weissfeld A. S. Bailey y Scott, DiagnósticoMicrobiológico, 11ª Edición. Editorial Médico Panamericana. 2004
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OBSERVACIÓN DE LA DIFERENTES FORMAS Y AGRUPACCIONES BACTERIANAS
I. INTRODUCCIÓN:
Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo
humano, y para observarlos es esencial el microscopio. El uso de este dispositivo es
indispensable en el Laboratorio de Microbiología para el estudio de agrupaciones,morfología y estructura de los microorganismos, así como su reacción a diferentes
colorantes, lo cual junto con otros criterios, permitirá su identificación, por lo tanto, es
importante conocer su adecuado manejo.
Para contrastar o realzar de forma específica distintas características morfológicas o
estructurales se emplean tinciones diferenciales. Estas técnicas tienen un gran interés
en la identificación y clasificación de las bacterias. La tinción diferencial más utilizada
es la tinción de Gram. Otras tinciones de gran importancia son las que diferencian
bacterias “ácido- alcohol resistentes”, las que diferencian estructuras significativas
como las esporas o la tinción negativa de cápsulas.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Aceite de inmersión
Microscopio
Muestra de lactobacilos
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A continuación damos algunos detalles de un microscopio compuesto, con la finalidad
de conocer mejor los instrumentos a utilizar.
Un microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o más lentes de aumento. Un
microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema óptico.
1) SOPORTE: Es la pieza fija en la que sólo la platina y el condensador tienen un
cierto movimiento. Sus principales partes son:
a) Base: Normalmente alberga la fuente de iluminación, en determinados modelos
incorpora además, un sistema porta filtros con varios filtros y un diafragma de
campo luminoso.
b) Brazo: Soporta todo el sistema óptico, el cabezal porta oculares y el revólver porta
objetivos. En él se dispone también un sistema de anclaje de la platina (movimiento de
enfocado de la preparación).
c) Platina. Es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su
observación.
d) El Macrométrico y el Micrométrico: Ambos permiten enfocar la preparación. El
primero se emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con objetivo de menos
18 de aumento (x10), mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se
utilizan los objetivos de mayor aumento (x40, x100).
2) SISTEMA ÓPTICO: Está formado por un cuerpo tubular donde se instalan las
lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto.
Para poder realizar las observaciones y agrupaciones bacterianas es indispensable
conocer las partes de un microscopio y su manejo; en la parte inferior se muestra laspartes de un microscopio.
Lo primero en esta práctica fue contar con una muestra (preparada en una lámina
portaobjetos), se procede a enfocar las láminas con objetivo de 100x y se pone una
gotita de aceite de inmersión para visualizar.
III. RESULTADOS
Los modelos de agrupamiento celular de las bacterias son característicos de especies
definidas y se utiliza como uno de los criterios de clasificación. Cuando las células
microbianas como los cocos se dividen, pueden permanecer unidas unas con otras,
formando arreglos característicos.Los bacilos se dividen únicamente en un plano pero en algunas ocasiones pueden
encontrarse células unidas por los extremos o por los lados debido a la etapa del
desarrollo en que se encuentren o a las condiciones del cultivo. Las bacterias en
espiral generalmente no se agrupan, crecen individuales y aisladas.
A continuación algunas de nuestras observaciones como: estructuras de cocos, bacilos
y de estos algunas agrupaciones como diplococos, estafilococos y estreptococos.
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Forma Agrupación Representación
Coco (esférico)
Coco único o micrococo Cuando los cocos se dividen en un solo plano vertical,se separan y conservan su individualidad.
Diplococo cuando las células hijas se presentan enparejas
Estreptococo en cadenaCuando las células hijas forman cadenas
Estafilococolas células permanecen unidas pero después de unadivisión celular en dos o más planos y los cocosforman grupos irregulares en ocasiones de granvolumen similares a racimos de uvas.
Bacilos En forma de bastón
IV. DISCUSIÓN
¿Por qué es importante un microscopio en la observación de microorganismos?
Porque es la única manera en que las puedes observar a través de un instrumento con
lentes de aumento y así identificarlas.
¿Qué tipo de formas y agrupaciones bacterianas podemos encontrar en una muestra
tomada de un agua contaminada?
Para la muestra que hemos tomado encontramos: Cocos y bacilos y agrupaciones de
diplococos, estreptococos y estafilococos. Pero también podemos encontrar espirilos y
agrupaciones de sarcinas, tétradas, etc.
V. BIBLIOGRAFÍA
Manual Práctico de Microbiología. R. Díaz, y colaboradores, 2a edición. Ed.
Masson, Barcelona, 1999
Manual de Laboratorio, MICROBIOLOGIA APLICADA. Universidad Autónoma
Metropolitana. www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia
http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/bac
t_clasif.htm
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TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS
I. INTRODUCCIÓN:
En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menoscomplejas. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos
que dependerán del tipo de microorganismo y del período de tiempo de conservaciónque se requiera. Para ello existen técnicas de siembra, conservación y mantenimientode los cultivos microbianos. Una técnica esencial en Microbiología es la de obtenciónde cultivos puros, a partir de los cuales podemos realizar estudios sobre laspropiedades de los microorganismos. Un cultivo puro es aquel que contiene una solaclase de microorganismo. Para poder obtenerlo es necesario concurrir a las técnicasconocidas como aislamiento.
Sembrar: una bacteria es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo a lasexigencias vitales del microorganismo, lo que permite su desarrollo y multiplicación, sise incuba en condiciones adecuadas, un tiempo conveniente.
Técnicas para medio sólido: Cuando el medio de cultivo a sembrar es sólido, se puedesembrar en superficie, en profundidad o en profundidad y superficie.
1.- En superficie:
a). Por estría: Introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el
fondo diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte,
luego mover el ansa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en
zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.
2.- En profundidad:
a). Por Puntura: El medio de cultivo que se emplea está solidificado en tubo en forma
vertical y la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con el inóculo
rápidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La punción se realiza
en el centro del medio o excéntricamente.
3). En profundidad y superficie:
a). Por puntura y estría: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con
mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo, se
retira y se realiza un trazo o estría en el pico de flauta.
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II. MATERIALES Y MÉTODOS
Mechero
Placas Petri
Mac Conkey
TSI
CITRATO
LIA
Asa bacteriológica
Muestra de leche contaminada
Espátula o hisopo
Técnicas de siembra:
1.- Por estría: para la elaboración de esta técnica de siembra se utilizó agar Mac
Conkey, muestras de: agua estancada y leche contaminada. Este tipo de siembra seutiliza para un aislamiento primario; se necesita una placa Petri con medio de cultivo
Mac Conkey. Con un asa bacteriológica cogemos la muestra a utilizar y la estriamos, se
protege la siembra y se rotula. No hay que olvidar que para la esterilidad de nuestro
trabajo se utiliza un mechero.
2.- Por puntura: se esteriliza el asa bacteriológica, con esta misma se toma una
porción de nuestra muestra a utilizar y se somete en los tubos de ensayo (TSI, LIA y
CITRATO), aproximadamente hasta los ¾, se retira por el mismo lugar y se estría en el
pico de flauta, luego se tapa el tubo de ensayo y se rotula. Este tipo de técnica de
siembra nos permite estudiar la bioquímica de los microorganismos.
3.- Por diseminación: se cuenta con el agar nutritivo solidificado, entonces se funde y
se agrega en una placa Petri entre unos 15 y 18 mL. Se deja enfriar nuevamente, pero
esta vez en la placa Petri, se agrega la muestra (0,1 mL) y se hace la extensión de la
muestra, se protege el material y se rotula.
4.- Por incorporación: se agrega 1 mL de muestra en la placa Petri estéril vacía; se
funde el agar, se deja enfriar y se agrega sobre la muestra aproximadamente 15 a 18
mL y se realiza movimientos giratorios arriba y abajo para homogenizar tanto la
muestra como el agar, se protege y se rotula.
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III. RESULTADOS
IV. DISCUSIÓN¿Cuál es la finalidad de una siembra?
Puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento. La primera se efectúa con
cultivos puros (una sola especie bacteriana), ya sea con el objeto de renovar el medio
de cultivo para perpetuar la especie, o bien para conocer alguna de sus propiedades
culturales o bioquímicas. El aislamiento, en cambio, se realiza a partir de un material
que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para
obtener cultivos puros.
¿Cuál es la finalidad de siembra por incorporación?
La principal función es la de homogenizar tanto la muestra como el medio de cultivo
para el recuento bacteriano. Es muy importante la distribución de las bacterias.
¿Cuál es la finalidad de la técnica de siembra por diseminación?
Con este tipo de siembra lo que se obtendrá es la biomasa de los microorganismos
cultivados.
¿Cuál es la diferencia entre los diferentes tipos de siembra?
Todos los tipos de siembra son muy diferentes, los pasos a seguir nos lo demuestran,
por ejemplo en la técnica de siembra por puntura tenemos los tubos de ensayo con
pico de flauta, la finalidad de esta inclinación es la utilización de la densidad de las
sustancias nutritivas que componen el agar utilizado.
V. BIBLIOGRAFÍA
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
Gamazo, C., López-Goñi, I., y R. Díaz. 2005. Manual práctico de microbiología.
Ed. Masson. S.A. Barcelona. España
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RECONOCIMIENTO DE PROTOZOARIOS Y HELMINTOS
I. INTRODUCCIÓN:La parasitología es una ciencia que comprende aquellos seres vivos que de manera
permanente o temporal viven a expensas de otros organismos. El termino parásito es
aplicado a los protozoos, platelmintos y nematelmintos. Estos son excretados por las
heces de modo que pueden ser transmitidos al hombre a través del agua y suelo.
Algunos parasitarios pueden ser objeto de investigación en aguas de consumo y agua
utilizada en diferentes actividades; protozoarios como: Entamoeba histolytica, Giardia
lamblia, Cryptosporidium spp. Y algunos Helmintos como: Ascaris lumbricoides,
Trichiuris trichiura, Taenia solium, Enterobius vermicularis, etc. En aguas estancadas
(naturales, piscinas, sistemas de calefacción y refrigeración, etc.), pueden vivir
facultativamente en forma parásita: Amibas de vida libre como Acanthamoeba sp. yNaegleria sp. que suelen provocar inflamaciones de mucosas. Las técnicas de
investigación de protozoos parásitos intestinales están basadas en la detección del
parásito tras la filtración de volúmenes de agua.
Protozoarios:
Son seres unicelulares, constituidos por una masa de protoplasma; en su mayoría
microscópicos. Se encuentran en todos los ambientes; unos de vida libre, otros
parásitos y soprofitas, algunos poseen estructura relativamente compleja.
El phylum protozoarios incluye más de 30 especies que pueden atacar al hombre. De
estos, doce son patógenos verdaderos, diez son transmitidos por insectos y el resto(Giardia lamblia y Entamoeba histolítica) pueden ser transmitidos por moscas o por el
agua.
Helmintos:
Los platelmintos se caracterizan por ser gusanos aplanados, cuyo grupo originario está
constituido por los turbelarios. Los gusanos chupadores (trematodos) y los acintados
(cestodos), viven exclusivamente de modo parasitario.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Microscopio Muestras de agua
Algunas variedades de helmintos
Aceite de inmersión
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III. RESULTADOS
Protozoarios:
Se observaron amebas (Las amebas son protistas unicelulares. Son células eucariotas,
que se caracterizan por su forma cambiante, puesto que carecen de pared celular, y
por su movimiento ameboide a base de seudópodos (prolongación del citoplasma),
que también usan para capturar alimentos (a través del proceso llamado fagocitosis).
Las amebas pueden vivir libres en agua o tierra o parasitando el intestino del hombre
o de los animales.
Helmintos:
El término "helminto" se utiliza en referencia a una variedad de gusanos que parasitan
el intestino del ser humano. La infección por helmintos es el resultado de la
penetración de un gusano al interior del cuerpo donde maduran, depositan huevos y
obtienen nutrición del huésped. Estas infecciones pueden ser provocadas por
nematodos intestinales presentes en el suelo tales como la lombriz intestinal (Ascarislumbricoides) el gusano flageliforme (Trichuris trichiura), la tenia y especies que
habitan en el agua como el Schistosomahaematobiumy S. mansoni.
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Trichuris trichiura: Es un parásito que puede ser considerado cosmopolita, al
igual que el Ascarislumbricoides, de localización intestinal baja (intestino
grueso) y ciego. El gusano adulto sexualmente maduro mide 5 cinsde longitud
y se presenta en forma de %átigo%la hembra parasitaria estáenrollada en un
extremo en forma de mazo de reloj. La infección se produce por ingerir las
larvas contenidas en el huevo y cuyo desarrollo se produce entre 1 a 3 meses.
Sólo si la infección es masiva se produce (6) : diarrea, muco-sanguinolenta,
anemia y en casos extremos por el continuo pujo y tenesmo rectal, que
debilitan los músculos elevadores del ano, se produce el '1elescopaje" rectal,
de tal manera que la mucosa rectal protuyehacia fuera, inclusive apreciándose
los gusanos adultos adheridos a la mucosa. La profilaxis consiste en no ingerir
agua y principalmente verduras crudas.
Ascaris Lumbricoides (las lombrices): El Ascaris lumbricoides es un nematodo
que produce una de las parasitoide mayor difusión en el mundo: la ascariasis.Esta enfermedad cursa con una sintomatología muy variable; generalmente es
asintomática en el adulto, y es en el niño donde vemos la más florida signo
sintomatología y las complicaciones de esta enfermedad. Como la mayoría de
las enteroparasitosis, la ascariasis prevalece y es endémica en áreas
desprovistas de infraestructura sanitaria, con viviendas precarias, pobreza e
ignorancia.
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Fasciola
Huevo de heminolepsis nana
IV. DISCUSION
La mayor parte de estos helmintos actúan como parásitos por no decir todos, estos
viven parasitando los diversos medios donde se desarrollan. Algunos de ellos causan la
muerte o lesiones graves. Los citados en la parte inferior tienen síntomas muy
variables. Es muy importante su estudio porque le causan daño a los seres humanos,
su estudio sería una de las llaves para conocer más acerca de este mundo y prevenir
ciertas acciones.
V. BIBLIOGRAFIA
http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/p24.pdf
Villegas, Elsi. 2005. Parasitología. Editorial sombra. Guadalajara. Mexico.
PIEKKARSKI, Gerhard. Tratado de parasitología. Madrid, Aguilar, 1959