LA TINCIÓN DE PAPANICOLAOU
「Bases y práctica」
JICA
Yoshikuni Taira
Dr. Pablo Anaya Rivera Secretario de Salud y Director General de los
Servicios de Salud de Veracruz Dra. Minerva Junco González
Subsecretaria de Salud Dra. Irasema A. Guerrero Lagunes
Directora de Salud de Pública Dr. Alejandro Escobar Mesa
Subdirector de Prevención y Control de Enfermedades
Dra. Rosa Aguilar y Meza Jefa del Departamento de Salud Reproductiva
Dra. Martha Lilia Flores Guzmán Coordinadora Estatal del Programa de Salud de la
Mujer
PRIMERO
El diagnóstico citológico de alta
confiabilidad se puede lograr con la
observación exacta de las muestras
elaboradas adecuadamente y con la
interpretación correcta.
Se logra obtener una muestra de
buena calidad y con uniformidad,
realizando el procedimiento de tinción
adecuado.
H FALTA DE TRANSPARENCIA
Posibles causas
1. Deshidratación inadecuada （ el alcohol está mezclado con agua）
2. Aclaramiento(xilol de baja pureza ） Material inadecuado para el montaje.（no es transparente
PRINCIPIO DE LA TINCIÓN
3 REGLAS DE LA TINCIÓN（DE PAPANICOLAOU）
1) Afinididad química.
Unificacion de los colorantes y el radical funcional quimico en
componentes celulares.
Ejemplo： enlace ionico del quelato de hematin aluminio y
radical fosforico del ADN.
2) Concentración.
Densidad del radical funcional quimico en componente celular
con el cual une con los colorantes.
3) Permeabilidad.
Relacion del tamaño de las moleculas de los colorantes y
densidad de la estructura celular.
Ejemplo：Diferentes tamaños de las moleculas de los
colorantes acidos (OG, EosinY, Verde Claro), penetran en
diferentes estructuras celulares y logran teñir.
E LA TINCIÓN INADECUADA DEL CITOPLASMA. （ROSADO～NARANJA TENUE）
Posibles causas
1. Sequedad antes de la fijación.
2. Tiempo Insuficiente para la fijación.
3. Deficiencia del líquido de EA-50.
PRINCIPIO DE LA TINCIÓN DEL NÚCLEO
La cromatina es una sustancia nuclear que se
tiñe de obscuro con el colorante básico
(hematoxilina).
Cromatina está constituída por finas cadenas de
ácido desoxirribonucleico unidas a una proteína
base, por lo general histona; contiene la proteína
no- histona y poca cantidad de ARN.
D TINCIÓN INADECUADA DEL
CITOPLASMA (OSCURA).
Posibles causas
1. Exceso del tiempo de tinción.
2. Falta de fraccionamiento
3. Concentración de los líquidos de tinción.
CAMBIO DEL NÚCLEO POR LA FIJACIÓN
Por la fijación del núcleo, hay cambio en la histona del
mismo, produciéndose la disolución del radical fosfórico del
ADN, el cual tiene carga negativa.
Lograr la tinción por la unión del ADN con el radical fosfórico
（－） y con hematoxilina(＋).
TINCION DEL NUCLEO
La hematixilina tiene color transparente o blanco, se oxida
por medio de un oxidante quimico para unirse fuertemente
con los componentes vitales.
Si se agrega aluminio el cual es mordente, forma el quelato
y hace enlace ionico con la parte que tiene carga negativa
de los componentes vitales, por consiguiente tiñe a esa
parte con azul morado a azul.
EL「PH」DE LA HEMATOXILINA Y LA TINCIÓN
LOS RADICALES FUNCIONALES ANIÓNICOS.
1. El radical ácido sulfúrico（－SO４）mucosidad, cartílago, etc.
2. El radical fosfórico（＝PO４）núcleo, etc.
3. El radical carboxilo（－COO） citoplasma, etc.
Dependiendo del pH de la solucion de hematoxilina, cambia la
disolucion del radical funcional del anion.
El radical funcional del anion de la celula, el cual se une con la
hematoxilina, esta mostrado en la diapositiva izquierda. Hasta
pH 3.0, la hematoxilina se une con los tres radicales funcionales
y tiñe en forma general.
La hematoxilina de Harris de pH 2.7 2.8 se une con el nucleo
que contiene el radical fosforico y con el citoplasma que contiene
el radical carboxilo( COO), por esa razon, es necesario hacer el
fraccionamiento.
C TINCIÓN DEFECTOSA DEL
CITOPLASMA (TENUE） Posibles causas
1. Líquidos de tinción deficientes.
2. Deterioro del líquido de tinción por dilución.
3. Tiempo insuficiente de tinción.
4. Exceso de fraccionamiento.
5. Deshidratación y aclaramiento inadecuado.
CLASE DE HEMATOXILINA Y LA
TINCIÓN
1. Tinción progresiva la hematoxilina de Ｍａｙｅｒ contenido de la
hematoxilina：１ Ｇ／Ｌ ｐＨ：２，４～２，５
2. Tinción regresiva la hematoxilina de Ｈａrｒｉｓ contenido de la
hematoxilina：５ Ｇ／Ｌ ｐＨ：２，７～２，８
Después de teñir con la hematoxilina, el núcleo y el citoplasma se
tiñen conjuntamente.
Comparando con el numero absoluto del radical anion de la celula,
con una mayor cantidad de colorante de hematoxilina, se tiñe
mas fuerte el nucleo, si embargo, al mismo tiempo, tiñe en forma
general.
La utilizacion de la hematoxilina de Harris o Gill de alta
concentracion en la citologia , es para uniformizar el grado de
tincion del extendido el cual no es uniforme, si no que presenta
areas gruesas. Caso particular en la citologia. Si se utiliza el
liquido colorante con menos densidad (Mayer), dependiendo del
extendido de la laminilla, se tiñe irregularmente.
B LA TINCIÓN DEL NÚCLEO ES FUERTE Y
LA ESTRUCTURA DEL NÚCLEO QUEDA
AMBIGUA.
POSIBLES CAUSAS
1. Uso de alcohol de alta concentración.
2. Exceso de tiempo para la tinción del núcleo.
3. Falta de fraccionamiento.
PRINCIPIO DEL FRACCIONAMIENTO
Despues de la tincion con hematoxilina, el nucleo y el
citoplasma estan teñidos conjuntamente. Despues de teñir
fuerte a toda la celula se sumerge en el acido(H )clohidrico, el
quelato de hematin aluminio que se unio con el citoplasma, se
intercambia con el ion hidrogeno y por este resultado, se
decolora la parte del citoplasma. La diapositiva señala que
esta teñido conjuntamente.
se señala que esta sumergida en el liquido para fraccionar. Se
señala el intercambio del quelato de hematin aluminio que se
unio con el citoplasma, con el ion hidrogeno. Sin embargo, hay
que tener cuidado porque si se deja mucho tiempo el quelato
que se ha unido con el nucleo, tambien intercambia con el ion
hidrogeno y lo decolora. Dependiendo de la densidad del
alcohol de acido clorhidrico, cambia tambien la intensidad del
fraccionamiento. El liquido de hematoxilina es acido, por esa
razon, si se deja como esta, las partes teñidas cambian a color
pardo rojo y ademas tienden a decolorarse.
A LA TINCIÓN DEL NÚCLEO ES TENUE
POSIBLES CAUSAS
1. Líquido de tinción deficiente.
2. Sequedad antes de la fijación.
3. Tiempo insuficiente para la fijación.
4. Tiempo insuficiente para la tinción del
núcleo.
5. Deterioro de la hematoxilina por dilución.
6. Exceso de fraccionamiento con alcohol de
ácido clorhídrico.
7. Blanqueado por el cloro del agua de la llave.
8. Mezcla con el líquido de citospray para la
fijación.
PRINCIPIO DE LA COLORACIÓN
(VIRAJE)
Disolución acuosa de hematoxilina
ｐＨ４～５： amarillo
ｐＨ６～７： rojo～morado
ｐＨ７～８： azul
La tinción recibe influencia del ｐＨ del
agua, densidad del cloro y temperatura del
líquido colorante.
CAUSAS DE UNA TINCIÓN INADECUADA
El diagnóstico citológico de alta confiabilidad se puede lograr con las muestras elaboradas adecuadamente. Así que todos nosotros, quienes nos dedicamos al examen de citología, siempre debemos tratar de elaborar muestras de buena calidad.
Para esto, no hay que ignorar las muestras inadecuadas, sino buscar la causa y mejorarlas.
DESHIDRATACIÓN
Deshidratar bien con alcohol de 96％～alcohol absoluto. Si
no se hace bien la deshidratación, las laminillas se vuelven
color blanquecido y no se logra obtener una muestra
adecuada. Los colorantes tienden a disolverse en el agua o
en alcohol, y ésta es la causa de la decoloración.
OrangeーG
OG‐6 contiene el radical sulfito(SO3) que tiende a
disociarse.
Si baja el pH, aumenta la intensidad de la tinción. Cerca
de la neutralización, se debilita la intensidad de la tinción.
Con esto puede pensarse que el radical sulfito es bastante
fácil de disociarse y dificulta la unión de la proteína con el
colorante.
Principio de la tinción del citoplasma.
Los colorantes OG6 (orange G) y EA 50 (eoginY, verde
palido) son colorantes acidos que tienen el radical funcional
acido, y carga negativa. Los componentes principales del
citoplasma son azucar, lipidos y proteinas antoferas que
contiene RNA y tiene la caracteristica de tener carga
negativa y positiva. Sin embargo, dependiendo de las
condiciones de la tincion(pH), cambian estas cargas.
Cuando el pH es neutro, muchas veces tiene carga negativa
y cada vez que tiende a la acidez, el radical amino se ioniza y
toma carga positiva y por esa razon se mejora la tincion.
ACLARAMIENTO(PENETRACIÓN
COMPLETO) ・MONTAJE
Eosin Y
contiene el radical carboxilo(COOH), el cual tiene tendencia a
no disociarse; con pH 5 ～ 6 se tiñe más fuerte y cada vez
que baja el pH, tiende a bajar la intensidad de la tinción. Si
baja el pH, se reduce la ionización del radical
carboxilo(COOH) de eosin Y y es frenado, por esa razón no se
puede combinar con las proteínas.
Light green SF yellowish
Es un colorante antófero que tiene el radical funcional ácido
（el radical sulfito）y el radical funcional básico（el radical
amino), sin embargo, contiene más radical funcional ácido,
por lo que se califica como colorante ácido.
Como contiene el radical sulfito(SO 3) el cual tiende a
disociarse, con pH2 tiene la intensidad más fuerte de tinción
y cerca del pH neutro, la intensidad de la tinción se debilita.
Igual que en el OG 6.
ACLARAMIENTO(PENETRACIÓN
COMPLETO) ・MONTAJE
Realizar bien la desalcoholización con xilol. En la última etapa de la elaboración de la laminilla, sino
se hace bien la deshidratación y desalcoholización, después del montaje, los colorantes, los cuales están en las células, se disuelven en el material para montar.
Es importante utilizar alcohol y xilol para evitar la disolución.
Ahora vamos a ver desde el punto de vista de la estructura del
citoplasma. En la tincion del citoplasma se tiene mucha relacion
del tamaño de las moleculas de los colorantes con la densidad
de la estructura celular. El tamaño comparativo de las moleculas
de los colorantes es ： Orange G es menor que Eosina Y es
menor que Light Green yellow
En la imagen de la izquierda señala la estructura de la celula no
teñida.
En la imagen de la derecha señala la estructura de la celula
teñida con diferentes colorantes. (con imaginacion)
DESHIDRATACIÓN
En cada caja se sumergen diez veces despacio y
deben escurrirse lo más posible.
En la última caja, se debe usar alcohol limpio. Para
eliminar el agua, si es posible, agregar un desecante como el Molecular Sheave.
Aclaramiento(Penetración completa)
En cada caja se sumergen diez veces despacio, deben
escurrirse lo más posible. El líquido para el
aclaramiento, se utiliza el que no contenga agua
(agregar un desecante como el Molecular Sheave).
En la imagen de la izquierda señala una celula que esta
sumergida en OG 6,parece que el colorante tiñe a toda la celula,
sin embargo, por fraccionamiento con el alcohol, se hece la
tincion selectiva.
En la imagen de la derecha señala la tincion de EA 50, y se
muestra como tiñe cada colorante. Tambien señala hasta el
ultimo proceso de deshidratacion y fraccionamiento con alcohol.
De esta manera se lleva a cabo el proceso de la hermosa tincion del Papanicolaou.
DESHIDRATACIÓN
En cada caja se sumergen diez veces despacio y deben
escurrirse lo más posible.
En la última caja, se debe usar alcohol limpio.
EA-５０
3 minutos La eosin Y y Verde claro SF amarillo, los cuales estan
contenidos en EA-50, son colorantes ácidos y tienen carga negativa.
Por eso se unen con las proteínas que tienen características de carga positiva.
PRÁCTICA
DE LA
TINCIÓN
DESHIDRATACIÓN
Después de hacer bien la coloración, realizar la deshidratación
con alcohol. En cada caja se sumergen diez veces despacio y se deben
escurrir lo más posible. En la última caja , se debe usar alcohol limpio.
OG-６
２～3 minutos
El OG 6 contiene el radical sulfito que tiende a disociarse, si baja el pH,
aumenta la intensidad de la tinción. Cerca de la neutralización, se
debilita la intensidad de tinción.
Las moléculas de OG-6 son pequeñas, tiñen a los citoplasmas
queratinizados de color amarillo a naranja
PARA OBTENER UNA BUENA TINCIÓN
1. Después del extendido, sumergir inmediatamente(en
menos de 5 segundos）en alcohol de 96％（durante más de 15minutos
2. Evitar la sequedad en lo absoluto. Si hay sequedad no se observa claramente la estructura del núcleo.
3. Cambiar los líquidos de tinción deficientes.
4. Obedecer exactamente el procedimiento de la tinción. （Fraccionamiento ・ coloración：viraje ・ deshidratación ・aclaramiento）
EL PROCESO DE LA TINCIÓN.
Para obtener el color óptimo, se deberá hacer el paso de la
coloración viendo posteriormente al microscopio para evitar una
posible equivocación del resultado por la diferencia de la tinción
(tomando como pauta los leucocitos polimorfonucleares.)
COLORACIÓN
TINCIÓN DEL NÚCLEO CON HEMATOXILINA
LAVADO CON AGUA（DECOLORACIÓN）
Se lava con agua para eliminar de la muestra el líquido de
hematoxilina sobrante.
Fraccionamiento
Se fracciona con alcohol de ácido clorhídrico a 0.5％ para
eliminar la hematoxilina sobrante que ha teñdo conjuntamente
tanto el núcleo como el citoplasma.
Se debe tener cuidado porque dependiendo de la densidad,
tiempo de sumersión y temperatura, cambia el grado de
fraccionamiento.
Después de fraccionar en alcohol de ácido clohídrico, si se deja
tal como está, las partes teñidas cambian a color pardo-rojo y
además tienden a decolorarse.
LAVADO CON AGUA
Disolución acuosa de la hematoxilina
pH4~5：amarillo
pH6~7：rojo～morado
Por elevación del pH con lavado de agua o neutralización, el núcleo cambia a color azul.
COLORACIÓN ： VIRAJE
Después del fraccionamiento y lavado con agua, vira con el
agua de la llave, si contiene nivel de cloro alto, es mejor usar
agua tibia o un alcali débil( solución de carbonato de litio,
solución de amonia)
Recommended
