Maria Carla Petrellis
Avaliação dos Efeitos do Azul de Metileno Fotoativado no Modelo
Experimental do Tumor de Walker 256
Tese Apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
São Paulo 2014
Maria Carla Petrellis
Avaliação dos Efeitos do Azul de Metileno Fotoativado no Modelo
Experimental do Tumor de Walker 256
Tese Apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Álvaro B. L. Martins.
Versão original
São Paulo
2014
“Aos meus pais, pela formação, compreensão e principalmente apoio e
incentivo em todas as etapas da minha vida”.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais e familiares pelo estímulo, confiança e apoio recebido ao longo
da minha vida.
Ao Prof. Dr. Rodrigo Álvaro Brandão Lopes Martins, pela oportunidade,
confiança e por me aceitar como aluna de doutorado.
Aos professores Dr.Durvanei Augusto Maria do Instituto Butantan e Dra.
Marília Cerqueira Leite Seelaender do Departamento de Biologia Celular e do
Desenvolvimento do ICB, pelo apoio científico e experiência em pesquisas com
câncer durante a realização deste trabalho.
A Simone Aparecida Teixeira e Rosangela Aparecida dos Santos Eichler pelo
apoio e auxílio técnico em análises de biologia molecular recebido durante a
realização dos experimentos.
A toda e equipe do laboratório, em especial Patrícia de Almeida, pela
amizade, carinho, apoio, compreensão, paciência, incentivo e convivência durante
este período. Aos amigos Rodney Capp Pallotta e Rodrigo Labat, pela amizade,
paciência e ajuda científica recebida durante a realização deste trabalho.
Agradeço aos demais professores do Departamento de Farmacologia, em
especial ao Prof. Dr. Marcelo Nícolas Muscará e Profa. Dra. Maria Helena Catelli de
Carvalho, pela oportunidade e confiança na realização dos experimentos em seus
laboratórios.
A todos os funcionários do Departamento de Farmacologia do ICB, em
especial a Mônica Nunes e Camila Gonçalves Trindade, pela ajuda e orientação nos
prazos e datas durante o doutorado.
Agradeço a Capes pela conceção da bolsa de doutorado no Departamento de
Farmacologia do ICB - USP.
“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original”.
Albert Einstein
RESUMO
PETRELLIS, M. C. Avaliação dos efeitos do azul de metileno fotoativado no modelo experimental do tumor de Walker 256. 2014. 158 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Instituto de Ciências Biomédicas. Universidade São Paulo, São Paulo, 2014.
A TFD é considerada como uma nova modalidade terapêutica minimamente invasiva destinada ao tratamento localizado e destruição seletiva de diversos tipos de cânceres e desordens malignas. Esta terapia esta baseada na captação e retenção seletiva do agente fotossensibilizante em sítios alvos que por sua vez sofre ativação através da irradiação de uma fonte externa de luz levando à geração de efeitos citotóxicos induzindo a morte das células tumorais. O azul de metileno é um corante que pertence à classe dos corantes fenotiazínicos e que deperta grande interesse devido às suas propriedades eletrocatalíticas em face da NADH4, que é uma coenzima do grupo das dehidrogenases Além disso, o mesmo têm-se mostrado como um potente agente fotossensibilizante com excelentes propriedades
fotoquímicas em função de possuir alto rendimento na geração de 1O
2 e EROs na
presença de agentes redutores. Devido às suas características fotodinâmicas e fototóxicas e demonstrar alta afinidade com a membrana mitocondrial celular, o azul de metileno têm-se destacado como um efetivo fotossensibilizante de grande potencial para à aplicação médica como agente terapêutico na TFD. Objetivo principal deste estudo foi avaliar se os efeitos do azul de metileno fotoativado podem desencadear processos inflamatórios interferindo no desenvolvimento e na progressão tumoral empregando como modelo experimental o Tumor de Walker 256. Dessa forma investigamos a regulação e a expressão de mediadores inflamatórios, COX -1 e COX -2 por RT-PCR; a produção de prostanóides, citocinas, bem como a geração de EROs pelo método de TBAR e a presença neutrofílica pela análises da MPO na massa tumoral sólida. Além disso, verificamos as alterações morfológicas peri e intra-tumoral utilizando método histológico com coloração em H.E. Nossos resultados demosntraram que o grupo tratado com 0.1% de azul de metileno + 1J provocou um aumento extremamente expressivo e que foi estatísticamente diferente quando comparado em relação aos diferentes grupos tratado e o controle, nos níveis dos diferentes marcadores inflamatório IL-1β, IL-6, IL-10 e TNF-α,bem como na quantificação da expressão gênica de COX-1, COX-2, iNOS e na geração EROS e PGE2. A análise histológica também complementou com os resultados anteriores, indicando que no grupo tratado com 0.1% azul de metileno + 1J pode-se verificar alterações morfológicas representadas por grandes áreas de necrose na massa tumoral sólida com presença neutrofílica. Com bases em nossos resultados podemos concluir que há indícios que o tratamento com azul de metileno 0.1% + 1J foi capaz de gerar efeitos citotóxicos na geração de EROs que por consequência aumentando a expressão de mediadores inflamatórios promovendo inflamação e finalmente induzindo morte celular por necrose. Em decorrência deste fato podemos também verificar a possibilidade de haver uma resposta imune tumoricida em decorrência da presença de neutrófilios sugerindo um controle imunitário á longo prazo no tratamento contra o câncer.
Palavras-chave: Terapia Fotodiâmica. Laser. Agentes Fotosensibilizantes. Azul de Metileno. Câncer.Tumor de Walker 256.
ABSTRACT
PETRELLIS, M. C. Evaluation of the effects of methylene blue photoactivated in experimental model of Tumor Walker 256. 2014. 158 p. Ph. D. thesis (Pharmacology) - Instituto de Ciências Biomédicas. Universidade São Paulo, São Paulo, 2014. PDT is considered as a new minimally invasive therapeutic modality for the treatment localized and selective destruction of various types of cancers and malignant disorders. This therapy is based on the selective uptake and retention of the photosensitizing agent into target sites which in turn undergoes activation by irradiation of an external source of light leading to the generation of cytotoxic effects by inducing tumor cell death. Methylene blue is a dye which belongs to the class of phenothiazine dyes and great interest due to their electrochemical properties in the face of NADH4, which is a coenzyme of the group of dehydrogenases Moreover, the same have been shown to be a potent agent photosensitizer with excellent photochemical properties due to having high yield and ROS generation of 1O2 in the presence of reduced agents. Due to its photodynamic - phototoxic properties and show high affinity for mitochondrial membrane, methylene blue have been highlighted as an effective photosensitizer of great potential for medical application as a therapeutic agent in PDT. Main objective of this study was to evaluate the effects of photoactivated methylene blue may trigger inflammatory processes interfering with development and tumor progression using an experimental model of the Walker 256 tumor. Thus investigate the regulation and expression of inflammatory mediators COX-1 and COX - 2 by RT-PCR , the production of prostanoids , cytokines and ROS generation by the method of the present TBAR and neutrophils presence by MPO analyzes of the tumor mass solid . Furthermore , we checked the peri-and intra - tumor morphological changes using histological analysis by HE colorationOur results showed that treated group with 0.1 % methylene blue + 1J provoked an extremely significant increase , which was statistically different when compared for the different treated groups and the control on the levels of several inflammatory markers IL - 1β , IL - 6 , IL - 10 and TNF - α as well as the quantification of gene expression of COX - 1 , COX - 2 , iNOS and ROS generation and PGE2 . Histological analysis also complemented with previous results , indicating that the group treated with 0.1 % methylene blue + 1J can observe morphological changes represented by large areas of necrosis in the mass tumor solid with neutrophils presence. Based on our results we can conclude that treatment with 0.1% methylene blue + 1J was able to generate cytotoxic effects by increasing ROS which consequently increasing the expression of inflammatory mediators, promoting inflammation triggering cell death by necrosis. Due to this fact we can see that there is evidence of an immune response tumoricidal by neutrophils presence suggesting an immune response on control long term in cancer treatment. Keywords: Photodynamic Therapy. Laser. Photosensitizers Agents. Methylene Blue. Cancer. Walker Tumor 256
LISTAS DE FIGURAS
Figura 01 – Estimativa das curvas de Kaplan-Meier para os diferentes grupos
tratados com azul de metileno (A.M) e grupo controle ..............................................80
Figura 02 - Atividade enzimática sérica da ALT após o protocolo de tratamento para
os diferentes grupos experimentais............................................................................82
Figura 03 - Atividade enzimática sérica da AST após o protocolo de tratamento para
os diferentes grupos experimentais............................................................................83
Figura 04 - Atividade enzimática sérica da gama-GT após o protocolo de tratamento
para os diferentes grupos experimentais...................................................................83
Figura 05 – Estimativa das curvas de Kaplan-Meier para os grupos tratados com
azul de metileno (A.M) na concentração de 0.1% e laser nas diferentes doses de
energia e grupo controle.............................................................................................86
Figura 06 - Níveis de IL-1β após o protocolo de tratamento nas diferentes
concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256.......93
Figura 07 - Níveis de IL-1β após o protocolo de irradiação com Laser no
comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor
de Walker 256............................................................................................................93
Figura 08 - Níveis de IL-6 após o protocolo de tratamento nas diferentes
concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256.......94
Figura 09 - Níveis de IL-6 após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento
de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker
256............................................................................................................................. 94
Figura 10 - Níveis de IL-10 após o protocolo de tratamento nas diferentes
concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256.......95
Figura 11 - Níveis de IL-10 após o protocolo de irradiação com Laser no
comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor
de Walker 256............................................................................................................95
Figura 12 - Níveis de TNF-α Figura após o protocolo de tratamento nas diferentes
concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256.......96
Figura 13 - Níveis de TNF-α após o protocolo de irradiação com Laser no
comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor
de Walker 256............................................................................................................96
Figura 14 - Níveis de IL-1β após a associação dos protocolos de tratamento do azul
de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no
comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor
de Walker 256............................................................................................................98
Figura 15 - Níveis de IL-6 após a associação dos protocolos de tratamento do azul
de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no
comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor
de Walker 256............................................................................................................98
Figura 16 - Níveis de IL-10 após a associação dos protocolos de tratamento do azul
de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no
comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor
de Walker 256............................................................................................................99
Figura 17 - Níveis de TNF-α após a associação dos protocolos de tratamento do
azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no
comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor
de Walker 256............................................................................................................99
Figura 18 – Quantificação da expressão gênica da COX-1 após o protocolo de
tratamento nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do
Tumor de Walker 256...............................................................................................106
Figura 19 - Quantificação da expressão gênica da COX-1 após o protocolo de
irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no
tecido tumoral do Tumor de Walker 256..................................................................106
Figura 20 – Quantificação da expressão gênica da COX-2 após o protocolo de
tratamento nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do
Tumor de Walker 256...............................................................................................107
Figura 21 - Quantificação da expressão gênica da COX-2 após o protocolo de
irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no
tecido tumoral do Tumor de Walker 256..................................................................107
Figura 22 – Quantificação da expressão gênica da iNOS após o protocolo de
tratamento nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do
Tumor de Walker 256...............................................................................................108
Figura 23 - Quantificação da expressão gênica da iNOS após o protocolo de
irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no
tecido tumoral do Tumor de Walker 256..................................................................108
Figura 24 – Quantificação da expressão gênica da eNOS após o protocolo de
tratamento nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do
Tumor de Walker 256...............................................................................................109
Figura 25 - Quantificação da expressão gênica da eNOS após o protocolo de
irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no
tecido tumoral do Tumor de Walker 256..................................................................109
Figura 26 - Quantificação da expressão gênica da COX-1 após a associação dos
protocolos de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de
irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no
tecido tumoral do Tumor de Walker 256..................................................................111
Figura 27 - Quantificação da expressão gênica da COX-2 após a associação dos
protocolos de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de
irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no
tecido tumoral do Tumor de Walker 256..................................................................111
Figura 28 - Quantificação da expressão gênica da iNOS após a associação dos
protocolos de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de
irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no
tecido tumoral do Tumor de Walker 256..................................................................112
Figura 29 - Quantificação da expressão gênica da eNOS após a associação dos protocolos
de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser
no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de
Walker 256............................................................................................................................112
Figura 30 - Níveis de PEG2 após a associação dos protocolos de tratamento do
azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no
comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor
de Walker 256..........................................................................................................114
Figura 31 - Níveis de TBARS após a associação dos protocolos de tratamento do
azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no
comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor
de Walker 256..........................................................................................................116
Figura 32 – Correlação níveis de atividade da MPO após a associação dos
protocolos de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de
irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no
tecido tumoral do Tumor de Walker 256..................................................................118
Figura 33 – Microscopia óptica do grupo controle. As figuras A e B correspondem a
microscopia óptica nos aumentos de 100 e 400 vezes respectivamente. ..............121
Figura 34 – Microscopia óptica do grupo 0.1% azul de metileno + 1J. As figuras A e
B correspondem a microscopia óptica nos aumentos de 100 e 400 vezes
respectivamente.......................................................................................................122
Figura 35 – Microscopia óptica do grupo 0.1% azul de metileno + 3J. As figuras A e
B correspondem a microscopia óptica nos aumentos de 100 e 400 vezes
respectivamente.......................................................................................................123
Figura 36 – Mcroscopia óptica do grupo 0.1% azul de metileno + 6J. As figuras A e
B correspondem a microscopia ótica nos aumentos de 100 e 400 vezes
respectivamente.......................................................................................................124
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 - Esquema dos Grupos Experimentais.....................................................63
Tabela 02 - Esquema dos Grupos Experimentais.....................................................64
Tabela 03 - Esquema dos Grupos Experimentais.....................................................66
Tabela 04 – Esquema dos Grupos Experimentais....................................................68
Tabela 05 - Esquema dos Grupos Experimentais.....................................................70
Tabela 06 – Sequência de Primers empregados na análise da expressão de mRNA,
pela técnica RT-PCR em tempo real.........................................................................74
Tabela 07 – Resultados sumarizados da análise da sobrevida dos diferentes grupos
tratados. com azul de metileno e do grupo controle...................................................79
Tabela 08 - Testes para a igualdade das curvas estimadas de Kaplan-Meier entre os
diferentes grupos tratados com azul de metileno e o grupo controle.........................79
Tabela 09 - Correlação entre as atividades enzimáticas séricas de AST, ALT e
gama-GT dos diferentes grupos tratados...................................................................82
Tabela 10 – Resultados sumarizados da análise da sobrevida dos grupos tratados
com azul de metileno na concentração de 0.1% e Laser nas diferentes energias e do
grupo controle.............................................................................................................85
Tabela 11 - Testes para a igualdade das curvas estimadas de Kaplan-Meier entre os
grupos tratados com azul de metileno na concentração de 0.1% e laser nas
diferentes energias e o grupo controle.......................................................................85
Tabela 12 – Dados dos níveis dos diferentes marcadores inflamatórios após o
protocolo de tratamento nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido
tumoral do Tumor de Walker 256...............................................................................91
Tabela 13 – Dados dos níveis dos diferentes marcadores inflamatórios após o
protocolo de irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes
energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256................................................92
Tabela 14 – Dados dos níveis dos diferentes marcadores inflamatórios após a
associação dos protocolos de tratamento do azul de metileno na concentração fixa
de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas
diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256................................97
Tabela 15 – Dados da quantificação da expressão gênica dos marcadores
inflamatórios após o protocolo de tratamento nas diferentes concentrações do azul
de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256..........................................104
Tabela 16 – Dados da quantificação da expressão gênica dos marcadores
inflamatórios após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento de onda de
660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256...........105
Tabela 17 – Dados da quantificação da expressão gênica dos marcadores
inflamatórios após a associação dos protocolos de tratamento do azul de metileno
na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda de
660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256...........110
Tabela 18 – Dados dos níveis de PEG2 após a associação dos protocolos de
tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com
Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral
do Tumor de Walker 256..........................................................................................114
Tabela 19 – Dados dos níveis de TBARS após a associação dos protocolos de
tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com
Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral
do Tumor de Walker 256..........................................................................................116
Tabela 20 – Dados dos níveis de atividade da MPO após a associação dos
protocolos de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de
irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no
tecido tumoral do Tumor de Walker 256..................................................................118
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS/HIV – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida/Vírus da Imunodeficiência
humana
INCA/MS – Instituto Nacional do Câncer / Ministério da Saúde
MS/INCA - Ministério da Saúde/ Instituto Nacional do Cãncer
O.M.S – Organização Mundial da Saúde
WHO - World Health Organization
IARC – Internacional Agency for Research on Cancer
UV – Ultravioleta
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
RNA – Ácido Ribonucleico
Rb – gene Retinoblastoma
p53 – gene Phosphoprotein p53
BRCA - 1 – gene Breast Cancer 1
BRCA – 2 – gene Breast Cancer 2
NF-1 – gene Neurofibromatosis type 1.
APC – gene Adenomatous polyposis coli
Bcl 2 – gene B-Cell Lynphoma 2
Bcl-xl – gene B-Cell Lynphoma –extra large
Bax – gene BCL2-associated X protein
Bad – gene Bcl-2-associated death promoter
BER - Reparo por excisão de bases
NERB – reparo por excisão de nucleotídeos
TFD – Terapia Fotodinâmica
HP – Hematoporfirina
HPd – Derivado da Hematoporfirina
ALA – Ácido Aminolevulínico
EROs – Espécies Reativas de Oxigênio
1O2 – Oxigênio Singleto
O2
.- - Superóxido Aniônico
OH. - Radical Hidroxila
H2O
2 – Peróxido de Hidrogênio
Cyt c – Cytocromo C
CL – Cardiolipina
COX-1 – Cicloxigenase 1
COX-2 – Cicloxigenase 2
iNOS – Óxido Nítrico Sintase induzível
eNOS – Óxido Nítrico Sintase endotelial
IL-1 – Interleucina 1
IL-1β – Interleucina 1β
IL-6 – Interleucina 6
IL-8 – Interleucina 8
IL-10 – Interleucina 10
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral α
TGFβ – Fator de transformação do crescimento β
VEGF – Fator de crescimento vascular endotelial
NFkB – Fator Nuclear Kappa B
AP-1 – Proteína Ativadora 1
MIP-1 – Proteína Inflamatória de Macrófago 1
MIP-2 – Proteína Inflamatória de Macrófago 2
MMPs – Metalloproteinases de Matriz Extracelular
HSPs – Proteínas de choque térmico ou Chaperonas moleculares
APCs – Células Apresentadoras de Reconhecimento de Antígenos
CD8+ - Cluster de Diferenciação 8
C3 – Componente do complemento 3
C5 – Componente do complemento 5
E-Selectina – Moléculas de Adesão Celular endotelial
ICAM-1 – Moléculas de Adesão Intercelular
NADH4 – Nicotinamina Adenina Dinucleotídeo Desidrogenase tipo 4
NADPH – Nicotinamide Adenine dinucleotídeo Fosfato-Oxidase
D.P – Desvio Padrâo Relativo
E.R – Erro Padrão
ANOVA – Análise de Variância
pH – Potencial Hidrogeniônico
AST – Aspartato Amino Transferase
ALT – Alanina Amino Transferase
Gama GT – Gama Glutamil Transferase
CEEA - Comissão de Ética em Experimentação Animal
COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
TW 256 – Tumor de Walker 256
RT-PCR - Reação em Cadeia da Polimerase após Transcrição Reversa
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................21
1.1 Câncer.................................................................................................................21
1.2 Terapia Fotodinâmica (TFD) no Câncer...........................................................33
1.3 Azul de Metileno.................................................................................................52
2 HIPOTESE..............................................................................................................56
3 OBJETIVOS............................................................................................................57
4 METODOLOGIA.....................................................................................................58
4.1 Protocolos Experimentais no Modelo do Tumor de Walker 256...................58
4.2 Avaliações do Perfil Hepático no Protocolo de Tratamento do Azul de
Metileno na Massa Tumoral sólida..................................................................72
4.3 Avaliações dos níveis de citocinas na massa tumoral sólida.......................73
4.4 Análises de expressão gênica dos marcadores inflamatórios na massa
tumoral sólida pela reação em cadeia da polimerase após transcrição
reversa em tempo real (real time RT-PCR).......................................................74
4.5 Determinação da Prostaglandina E2 na massa tumoral sólida.....................75
4.6 Avaliações da Peroxidação Lipídica na massa tumoral sólida pelo Método
de TBARS............................................................................................................76
4.7 Análises da atividade da Mieloperoxidade (MPO)...........................................77
4.8 Análises Histológicas........................................................................................78
4.9 Análises Estatísticas..........................................................................................78
5 RESULTADOS........................................................................................................79
5.1 Estudo de Sobrevida: Emprego do Azul de Metileno no Modelo
Experimental do Tumor de Walker 256...........................................................79
5.2 Avaliações do Perfil Hepátco no Protocolo de Tratamento do Azul de
Metileno na Massa Tumoral sólida...................................................................82
5.3 Estudo de Sobrevida: Emprego do Azul de Metileno na concentração de
0.1% e Laser no Modelo Experimental do Tumor de Walker 256..................85
5.4 Avaliações dos níveis das citocinas na massa tumoral sólida.....................88
5.5 Análises da expressão gênica dos marcadores inflamatórios na massa
tumoral sólida pela reação em cadeia da polimerase após transcrição
reversa em tempo real (real time RT-PCR)....................................................101
5.6 Determinação da Prostaglandina E2 na massa tumoral sólida....................114
5.7 Avaliação da Peroxidação Lipídica na massa tumoral sólida pelo Método
de TBARS.........................................................................................................116
5.8 Análises da atividade da Mieloperoxidade (MPO).........................................118
5.9 Análises Histológicas......................................................................................120
6 DISCUSSÃO.........................................................................................................126
REFERÊNCIAS........................................................................................................159
21
1 INTRODUÇÃO
1.1 Câncer
1.1.1 Panorama do Câncer no Mundo e no Brasil
O processo global de industrialização ocorrido principalmente no século
passado conduziu uma crescente integração das economias e das sociedades dos
vários países desencadeando a redefinição de padrões de vida com a uniformização
das condições de trabalho, nutrição e consumo (GUERRA et al., 2005; WALTERS,
2001). Assim, a industrialização e a urbanização contribuíram de forma significativa
na alteração demográfica mundial devido à redução nas taxas de natalidade e
mortalidade com o aumento da expectativa de vida e envelhecimento populacional
(GUERRA et al., 2005).
Este processo de reorganização global determinou importantes modificações
nos padrões de saúde-doença, e tais modificações são conhecidas como transições
epidemiológicas que foram caracterizadas pela mudança no perfil de mortalidade
com a diminuição da taxa de doenças infecciosas e concomitantemente o aumento
da incidência de doenças crônico-degenerativas especialmente as doenças
cardiovasculares e o câncer (ALBALA et al., 1997; JEMAL et al., 2008; LAURENTI,
1990; WHO, 2002). Esta transformação do perfil epidemiológico das populações
vem tornando-se ao longo dos anos, cada vez mais complexa e de difícil
entendimento em função do aparecimento de novas doenças e o ressurgimento de
antigos agravos à saúde como, AIDS/HIV, malária, dengue, tuberculose entre outras
no cenário da saúde pública mundial (GUERRA et al., 2005; SUSSER; SUSSER,
1998; WALTERS, 2001).
Dessa forma a urbanização, a industrialização juntamente com as mudanças
dos hábitos de vida e aumento da expectativa de vida preponderou
considerávelmente para o aumento da taxa de doenças crônico-degenerativas em
virtude da exposição dos seres humanos a agentes carcinogênicos (INSTITUTO
NACIONAL DO CÂNCER, 2001, 2005; RISI; NOGUEIRA, 2002; SANTOS; CRUZ,
2001). Apesar dos avanços tecnológicos na área da Medicina, a incidência e a
mortalidade por câncer têm aumentado nas últimas décadas e desta forma
importantes pesquisas científicas na área médica, esforços e medidas adotadas
22
devem ser mobilizados para o combate, na cura e prevenção do câncer
(FERNANDEZ; MAFRA, 2005; SANTOS; CRUZ, 2001).
O câncer é um importante problema de saúde pública em países
desenvolvidos e em desenvolvimento e segundo as estimativas da Organização
Mundial da Saúde (O.M.S.), desde o ano de 2000, o mesmo é responsável por mais
de 6 milhões de óbitos a cada ano, 10,9 milhões de casos incidentes e 26 milhões
de casos prevalentes. Além disso, o câncer representa cerca de 12.0 % de todas as
causas de morte no mundo, possuindo a maior taxa de mortalidade quando
comparado às outras taxas de mortalidade causadas por HIV/AIDS, tuberculose e
malária (GUERRA et al., 2005; WHO, 2002; WHO, 2008).
Embora as maiores taxas de incidência de câncer sejam encontradas em
países desenvolvidos, dos 10 milhões de casos novos anuais de câncer, 5.5 milhões
são diagnosticados nos países em desenvolvimento (GUERRA et al., 2005; WHO,
2002; WHO, 2003). Contudo, a O.M.S. estima um aumento de 50.0% nas taxas de
incidência desta patologia para o ano de 2020, sendo que mais de um terço dos
casos ocorrerão tanto nos países desenvolvidos como nos países em
desenvolvimento (WHO, 2003).
No período do ano de 2005, dados da taxa de mortalidade informaram que
um total de 35 milhões de mortes ocorridas no mundo, o câncer foi responsável por
7.5 milhões de óbitos representando cerca de 22.0% do total de mortes ocorridas
por esta condição patológica (WHO, 2005). No ano 2008, a Agência Internacional
para a Pesquisa em Câncer (IARC) da O.M.S., estimou que a ocorrência de 12.4
milhões de casos novos e 7.6 milhões de óbitos no mundo (WHO, 2008). Em 2012,
as estimativas do projeto Globoan 2012 desta mesma organização apontaram o
surgimento de 14,1 milhões de casos novos em um total de 8,2 milhões de óbitos de
câncer em todo mundo. Também há projeções para o ano de 2020 um número
maior de novos casos anuais que sejam na ordem de 15 milhões e até o ano de
2030 o câncer deverá alcançar a maior carga global correspondendo um total de
21,4 milhões de casos novos e 17 milhões de óbitos atingindo a maior taxa de
mortalidade quando comparado às outras doenças e até então consideradas como
de maior ocorrência (BRAYAND; MOLLER, 2006; INCA/MS, 2012; INCA/MS, 2014;
JEMAL et al., 2007; JEMAL et al., 2008; WHO, 2008). Para o ano de 2050, estima-
se 24 milhões de novos casos, mais do que o dobro dos casos estimados em 2002
23
na ordem de 10.8 milhões (JEMAL et al., 2008; SANDHU et al., 2010; THUN et al.,
2010; WHO, 2007).
Desde o ano de 2000, considerando as causas de morte por doenças,
excluindo as causas externas e as causas não definidas, o câncer vem sendo
definido como a terceira causa de mortalidade mundial, correspondendo 11.84% do
total de óbitos. Segundo a O.M.S. têm constantemente alertado a presença de um
fenômeno crescente na incidência anual o qual o câncer vem atingindo cerca de 9
milhões de pessoas e mata aproximadamente 5 milhões, sendo também
considerado como a segunda causa de mortalidade depois das doenças
cardiovasculares, correspondendo 27.63% do total de óbitos em países
desenvolvidos e em desenvolvimento (CUPPARI, 2005; INCA/MS, 2006; JEMAL et
al., 2007; PISANI et al., 2002; SILVA, 2006; WUNSCH; MONCAU, 2002).
A distribuição epidemiológica global do câncer demonstra um aumento entre
os tipos de cânceres de maior prevalência associados ao status socioeconômico, em
países desenvolvidos como os de pulmão, mama, próstata, cólon-reto, quanto aos
cânceres relacionados à pobreza presentes nos países em desenvolvimento, tais
como os de colo uterino, pênis, estômago e cavidade oral (GUERRA et al., 1997;
INCA/MS 2001; INCA/MS, 2002; INCA/MS, 2005; KOIFMAN; KOIFMAN, 2003; RISI;
NOGUEIRA, 2002).
Além disso, sua distribuição epidemiológica pode ser avaliada de acordo com
o sexo, onde cânceres mais incidentes e que acometem os homens são os de
próstata, pulmão e estômago e entre as mulheres os mais prevalentes são os de
mama, colo uterino e cólon-reto (INCA/MS, 2014; WHO, 2008). Dentre os diferentes
sítios primários de tumores, o câncer de mama representa o segundo tipo mais
frequente na população mundial e o mais prevalente entre as mulheres (PARKIN,
BRAY, DEVESA, 2001).
Vale destacar, que segundo a O.M.S., sobressaem-se, entre os cinco tipos de
câncer mais frequentes, os tumores de pulmão, de cólon-reto e de estômago, tanto
nos países industrializados, quanto nos países em desenvolvimento. Com relação
ao sexo, a prevalência de câncer entre homens e mulheres é muito similar nos
países desenvolvidos, enquanto nos países em desenvolvimento, a prevalência nas
mulheres é de 25% maior, o que reflete o predomínio, em homens, de localizações
de câncer com pior sobrevida, tais como fígado, esôfago e estômago (PISANI;
BRAY; PARKIN, 2002).
24
Assim, o contínuo crescimento populacional bem como o seu envelhecimento
afetará de forma significativa o impacto do câncer no mundo. Esse impacto recairá
principalmente sobre os países em desenvolvimento devido à contínua presença de
fatores como as disparidades socioeconômicas, carência nas condições de
saneamento básico, de moradia, de serviços de atenção à saúde, heterogeneidade
cultural e questões de variações geográficas que impedem o acesso aos serviços
sociais e de saúde pública. Em 1975, os índices de câncer no mundo inteiro
representavam 51% em países de médio e baixo desenvolvimento. Porém, esta
proporção aumentou para 55% em 2007 e está projetada para alcançar 61% em
2050, fato este se deve apenas pelo crescimento populacional e o envelhecimento,
como também por fatores de risco modificáveis como o tabagismo, inatividade física
e o lento declínio em cânceres relacionados à doenças infecciosas (INCA/MS, 2009;
THUN et al., 2010; WHO, 2008).
Nos países que fazem parte da América Latina, do contrário dos países
desenvolvidos, a transição epidemiológica ainda não se completou, observando um
aumento na ocorrência de doenças crônico-degenerativas, enquanto que a
frequência de doenças infecciosas e de doenças transmissíveis por vetores
biológicos como, malária e dengue permanecem elevadas, além da presença
constante de desnutrição. (ALBALA; YANES, 1997; GUERRA et al., 2005;
LAURENTI, 1990). Atualmente, considera-se a América Latina como a mais
urbanizada das regiões menos desenvolvidas do mundo, sendo que esta
urbanização tem sido acompanhada de pobreza urbana maciça que têm contribuído
para um agravamento das disparidades sociais (PARKIN et al., 2001). Deve-se levar
em consideração também, a repercussão da rápida mudança na condição nutricional
desta região, desencadeada pelo processo de industrialização o que afetou de
sobremaneira a prevalência de doenças crônicas como o câncer, doenças
cardiovasculares, diabetes tipo 2, doenças de Alzheimer e outros agravos
relacionados ao envelhecimento e a obesidade (ALBALA et al., 2001; GUERRA et
al., 2005; WALTERS, 2001).
Contudo, ainda observa-se a presença de menores taxas de mortalidade por
cânceres quando comparadas às taxas dos países da Europa Ocidental, Estados
Unidos e Canadá, mas de uma maneira, nestas últimas décadas houve uma
redução da taxa de mortalidade por câncer de pulmão, estômago, útero e cânceres
25
tabaco-relacionado. Porém é notória a ocorrência de um aumento na mortalidade
por cânceres de pulmão e mama acometidos nas mulheres (WHO, 2003).
Em virtude das desigualdades sociais existentes na América Latina, o mapa
global de distribuição dos tipos de câncer nesta região segue uma superposição
semelhante à encontrada no perfil de morbimortalidade global (GUERRA et al.,
1997).
O Brasil destaca-se como uma área interessante para o monitoramento e
controle das tendências na incidência de câncer, assim como para estudo das
variações geográficas nos padrões de doença. Entretanto a população brasileira
vem experimentando mutações significativas no seu perfil demográfico em
decorrência da queda da taxa de fecundidade e o aumento da expectativa de vida
devido às melhorias nas condições sanitárias que fizeram com que houvesse um
progressivo aumento na população de idosos (ROSAS et al., 2013). Em 1930, dados
de registros de base populacional de saúde indicavam que as doenças infecto-
parasitárias representaram 45,7% dos óbitos informados no Brasil, e em 1999, foram
responsáveis por apenas 5,9% das mortes com causas definidas (INCA/ MS 2001;
INCA/MS, 2005; RISI; NOGUEIRA, 2002). Portanto, a distribuição epidemiológica do
câncer no Brasil vem seguindo a mesma tendência mundial e encontra-se em
transição epidemiológica acelerada passando do predomínio das doenças infecto-
parasitárias para doenças crônico-degenerativas (INCA/MS 2012; ROSAS et al.,
2013).
Importante causa de doença e morte no Brasil, desde 2003, as neoplasias
malignas constituem-se a segunda causa de morte na população, representando
quase 17% (140 mil) dos óbitos de causa conhecida, notificados em 2007 no
Sistema de Informações sobre Mortalidade (MS/INCA, 2009). Apenas as doenças
circulatórias matam mais que o câncer, em torno de 27,9% do total de mortes no
mundo (MS/INCA, 2003). Têm-se observado o aumento entre os tipos de câncer
normalmente associados ao status socioeconômico, tais como o câncer de mama,
de próstata e do cólon-reto e, simultaneamente a presença de taxas de incidência
persistentemente elevadas de tumores geralmente relacionados à pobreza, como os
cânceres de colo uterino, pênis, estômago e cavidade oral (INCA/MS, 2012;
KOIFMAN; KOIFMAN, 2003; ROSAS et al., 2013). Esta distribuição certamente
resulta da exposição a um grande número de diferentes fatores de risco ambientais
relacionados também ao processo de industrialização – agentes químicos, físicos e
26
biológicos e de exposição a outros fatores relacionados às disparidades sociais.
(GUERRA et al., 2005; ROSAS et al., 2013).
No ano de 2005, as doenças cardiovasculares, as neoplasias, as causas
externas e o diabetes representaram 55,2% do total de óbitos com importante
contribuição das neoplasias em especial ao câncer de colo uterino (INCA/MS, 2001;
INCA/MS, 2005; RISI; NOGUEIRA, 2002). De acordo com os dados de dez registros
de câncer de base populacional no Brasil, os tumores mais frequentes são os de
próstata, pulmão, estômago, cólon-reto e esôfago na população masculina. Em
mulheres, predomina o câncer de mama, seguido pelos cânceres de colo uterino,
cólon-reto, pulmão e estômago (INCA/MS, 2012; ROSAS et al., 2013). Considerando
as principais causas de morte por câncer no Brasil desde 2001 podemos citar os
tumores de pulmão, próstata, estômago, esôfago, boca e laringe em homens e
tumores de mama, pulmão, cólon-reto, colo uterino e estômago em mulheres
(MS/BRASIL, 2004).
No Brasil, as estimativas para o ano de 2010 e 2011, apontaram para a
ocorrência de 489.270 casos novos de câncer/ano, sendo 236.240 para o sexo
masculino e 253.030 para o sexo feminino. Para o período de 2012 e 2013, as
expectativas indicavam o aparecimento de 518.510 mil casos novos de câncer
(INCA/MS, 2009). Nos próximos anos também há projeções que indicarão à
ocorrência de 576 mil casos novos impulsionados pelo constante crescimento
populacional bem como o seu envelhecimento (INCA/MS, 2009; INCA/MS, 2012;
INCA/MS, 2014; ROSAS et al.,2013). Os tipos mais incidentes, à exceção do câncer
de pele do tipo não melanoma, foram os cânceres de próstata e de pulmão no sexo
masculino e os cânceres de mama e do colo uterino no sexo feminino. Dentre a
população feminina, o câncer de mama apresenta uma estimativa de 49.240 novos
casos e 11.194 mortes (MS/INCA, 2009).
O câncer de mama representa o segundo tipo mais frequente na população
geral e o mais comum entre as mulheres (PARKIN et al., 2001). No Brasil, a doença
constitui a primeira causa de morte por câncer entre as mulheres (BOING et al.,
2007). No período de 1979 a 2000, a taxa de mortalidade por câncer de mama entre
as mulheres brasileiras apresentou um aumento considerável, passando de
5,77/100.000 a 9,74/100.000, correspondendo a uma variação percentual relativa de
80,3% (MS/INCA, 2003). Segundo dados do Ministério da Saúde, a taxa de
mortalidade nas mulheres por câncer de mama no Brasil no período de 1979 a 2004
27
aumentou 38,62%. Na Região Sudeste, o câncer de mama é o mais incidente entre
as mulheres, com um risco estimado de 65 casos novos por 100.000 habitantes
(MS/INCA, 2009).
1.1.2 Etiologia do Câncer
A palavra câncer vem do grego “karkinos” que significa caranguejo, referência
a sua capacidade de crescimento infiltrante comparado às pernas do crustáceo, que
as introduzem na areia ou na lama com finalidade de fixar-se e dificultar a sua
remoção (INCA/MS, 2012; KUMAR et al., 2008).
O termo câncer é utilizado genericamente para representar um conjunto de
mais de 100 doenças incluindo tumores malignos e benignos de diferentes
localizações (INCA/MS 2002; INCA/MS, 2009; INCA/MS, 2012). Também é definido
como uma enfermidade multifatorial crônica caracterizada pela presença de
alterações genéticas nas células que crescem de forma anormal em virtude da perda
do controle da proliferação celular. Em alguns casos como nos tumores malignos,
apresentam ganho da capacidade de invadir tecidos adjacentes sadios ou de sofrer
metastatização disseminando-se para outras estruturas orgânicas distantes
(FENECH, 2002; FERREIRA; ROCHA, 2004; INCA/MS, 2002; INCA/MS, 2008;
INCA/MS, 2009; INCA/MS, 2012; KOWATA et al., 2009; MAFRA; FERNANDEZ,
2005; RIBEIRO et al., 2003).
As neoplasias podem ser classificadas como benignas e malignas,
dependendo de suas características celulares (OLIVEIRA et al., 2007). As
neoplasias malignas são caracterizadas por constituintes celulares que apresentam
alto grau de diferenciação celular em relação ao comportamento biológico, possui
um crescimento desordenado refletindo-se na formação de um novo tecido
denominado de neoplasma ou tumor maligno. Também, as suas células cancerosas
se proliferam com alta autonomia e diferenciação celular invadindo tecidos
adjacentes sadios e frequentemente apresentam alta metastatização em tecidos
sadios ou em estruturas orgânicas distantes do tumor primário e normalmente
oferecem risco de vida ao paciente (ALBERTS et al., 2002; HANNAHAN;
WEINBERG, 2000; OLIVEIRA et al., 2007; SHACTER; WEITZMAN, 2002).
Diferentemente dos cânceres malignos, as neoplasias benignas são
caracterizadas por uma massa tissular bem definida contendo células cancerosas
28
que se multiplicam lentamente e que se assemelha ao tecido de origem. Possui
comportamento biológico não invasivo e raramente fornecem risco de vida ao
paciente (ALMEIDA et al., 2005; INCA/MS, 2002; OLIVEIRA et al., 2007; PLAYER et
al., 2004; ROBBINS; CONTRAN, 2005; WEINBERG, 2008).
Em relação à nomenclatura das neoplasias, normalmente o tipo de tumor é
denominado conforme o nome do tecido em que se originou e, portanto, a
designação é feita indicando o nome do tecido seguido pelo sufixo OMA. Por
exemplo, linfoma designa um tumor do tecido linfático. Assim essa nomenclatura
primária pode ser utilizada para nomear tanto tumores benignos quanto malignos.
Quando tumores malignos surgem do tecido mesenquimal, eles são
denominados de sarcomas, como ocorre nos tecidos de sustentação, tais como
ossos, tecido gorduroso, músculos e tecidos fibrosos. Os neoplasmas malignos
originários das células epiteliais são denominados de carcinomas. Estes constituem
o tipo mais comum de câncer maligno incluindo cânceres de pele, intestino, bexiga,
útero, ovários, ductos mamários, próstata e pâncreas. Além disso, carcinomas que
possuem padrão glandular recebem ainda a terminologia de adenocarcinoma
(ALBERTS et al., 2002; ALMEIDA et al., 2005; ROBBINS; CONTRAN, 2005).
Sabemos que o corpo humano é composto de por milhões de tipos de células
que crescem e dividem-se de forma controlada com a finalidade de produzir mais
células necessárias para a manutenção saudável corporal. Quando estas células
tornam-se velhas ou danificadas, elas morrem e são substituídas por novas células
sadias. Contudo, este processo pode ocorrer de forma anormal e dessa forma o
material genético celular danificado ou alterado passa a produzir mutações que
afetam o crescimento de células neoplásicas levando a formar uma massa de tecido
chamada de tumor (INCA/MS, 2009). Além disso, estas células cancerosas passam
a se comportar de forma anormal, multiplicando-se rapidamente e
desordenadamente em relação às células sadias presentes nos tecidos adjacentes,
invadindo-os e levando ao desenvolvimento de microvasos a partir das células
endoteliais presentes nos capilares situados próximos às células neoplásicas. Dessa
forma estabelecendo o processo de angiogênese, necessário para a manutenção e
do suprimento de oxigênio e nutrientes para a massa tumoral sólida. Observamos
também que algumas células neoplásicas adquirem a capacidade de se destacar da
massa tumoral sólida e disseminar através dos vasos sanguíneos e linfáticos
29
promovendo o surgimento de metástases (FERREIRA; ROCHA, 2004; INCA/MS,
2009; OPPENHEIMER, 2006).
Assim o câncer é uma doença que surge a partir de uma célula normal que
sofreu um acúmulo progressivo de mutações em seu material genético, as quais
acarretam em importantes alterações essenciais na fisiologia celular e que
coletivamente contribuem para o crescimento de malignidades. Dentre estas
alterações essenciais podemos citar (1) suficiência em relação aos fatores de
crescimento, (2) resistência à apoptose, (3) potencial ilimitado de replicação celular,
(4) angiogênese sustentada, invasão tecidual e disseminação à distância (DIXON;
KOPRAS, 2004; HANNAHAN; WEINBERG, 2000; SHACHAF; FELSHER, 2005;
ZHIVOTOVSKY; ORRENIUS, 2003).
O câncer sendo considerado como uma doença multifatorial, podemos
destacar que as causas primárias que levam ao aparecimento dessa patologia ainda
não estão totalmente esclarecidas. Porém sabemos que os fatores ambientais
possuem um importante papel na etiologia do câncer. Dentre eles podemos destacar
a presença de agentes cancerígenos físicos (radiações UV e ionizantes), químicos
(tabaco, álcool, xebobióticos, metais pesados, compostos aromáticos, pesticidas e
etc.), bem como agentes infecciosos (vírus, bactérias e parasitas), também hábitos e
estilo de vida. Portanto tais fatores contribuem para a desordem do ciclo celular
acarretando na formação de agrupamentos de clones de células neoplásicas, ou
seja, em tumores (ANAND et al., 2008; COTRAN et al., 2000; FERRARI; TORRES,
2003; INCA/MS, 2002; IRIGARAY et al., 2007; MAFRA; FERNANDES, 2005; SILVA
et al., 2004).
Também o câncer pode ser definido como uma doença genética, uma vez
que é desencadeado por alterações ou mutações no DNA celular. No entanto, ao
contrário das síndromes genéticas humanas, o câncer não é necessariamente uma
doença hereditária. Sabemos que os cânceres na sua maioria são de origem
somática resultantes da interação entre os fatores genéticos, envelhecimento e as
influências do ambiente externo (BLUME-JENSEN; HUNTER, 2001; CHEN;
HUNTER, 2005; COHEN et al.,1992; CURI et al., 2002; FOOTE, 2005; INCA/MS,
2012; KUMAR et al., 2008; PERERA, 1997; WHO, 2009). No caso do câncer
heredidário, as mutações germinativas estão diretamente associadas à
predisposição genética familiar para o desenvolvimento de tumores e nestes casos
específicos, o câncer é considerado uma doença genética e hereditária (CAMARGO
30
et al., 1999). Cerca de 5 á 10% dos cânceres são hereditários provenientes de
mutações nas linhagens germinativas e diversos genes vem sendo identificados e
investigados como sendo importantes alvos na etiologia destes tumores (FEARON,
1997; MINAMOTO et al., 1999).
Durante o processo da carcinogênese, uma célula sadia passa por várias
etapas sendo estas, iniciação, promoção, progressão e manifestação tumoral
(ALBERTS et al, 2010; CHAMMAS et al., 2004; COHEN, 1991; GUTIÉRREZ;
SALSAMENDI, 2000; HASEGAWA et al., 1998; MEHTA, 1995; OLIVEIRA et al.,
2007; TANNOCK; HILL, 1998; TROSKO, 2001).
A iniciação é o primeiro estágio que envolve passos nos quais o DNA de uma
célula sadia acumula uma série de mutações ou alterações genéticas induzidas por
agentes cancerígenos e, dessa maneira alterando suas respostas ao ambiente
celular (BRASILEIRO FILHO et al., 2006; HANNAHAN; WEINBERG, 2000;
OLIVEIRA et al., 2007; PLAYER et al., 2004; SANTELLA et al., 2005; SHACTER;
WEITZMAN, 2002; TROSKO, 2001; TROSKO, 2003).
Em geral, estas mutações genéticas incluem alterações de sequência,
perdas, ganhos, mutações pontuais, rearranjos cromossômico simples ou
complexos, os quais são responsáveis por sucessivas divisões celulares anormais
acarretando num processo de evolução clonal (CAVENEE; WHITE, 1995;
CHAMMAS et al., 2004; ESTELLER; HERMAN, 2002; FERREIRA; ROCHA, 2004;
GREAVES, M., 2000; POIRIER, 2004; SINGH; FARMER, 2006).
Atualmente entende-se que o câncer é causado em sua grande maioria dos
casos pela ação dos agentes cancerígenos, por erros durante a replicação do DNA
celular ou no reparo das lesões cromossômicas que alteram geneticamente e
funcionalmente os principais genes responsáveis pelo controle da homeostasia
celular (COTRAN et al., 2000; COUPIER; PUJOL, 2005; LOURO, 2000; SILVA et al.,
2004). Portanto, as ações destes fatores resultam em importantes modificações
progressivas afetando não só em diferentes fases do ciclo celular bem como na
interação do comportamento biológico da célula com o meio extracelular
(HANNAHAN; WEINBERG, 2000; OLIVEIRA et al., 2007; SILVA et al., 2004).
Contudo, ainda existem genes responsáveis e que participam dentro do
processo da carcinogênese principalmente tanto na ativação dos proto-oncogeneses
quanto na inativação de genes supressores de tumores (CHANG et al., 1995; CHEN;
HUNTER, 2005; DELFINO et al., 1997, HANNAHAN; WEINBERG, 2000; LUCH,
31
2005; OLIVEIRA et al., 2007; SILVA et al., 2004). Neste sentido, progressos no
entendimento das bases dos mecanismos da carcinogênese têm sido feito a partir
das descobertas e investigações dos papéis fundamentais dos proto-oncogeneses,
genes supressores de tumores e oncogeneses (STRAHM; CAPRA, 2005).
Os proto-oncogeneses são genes celulares normais que participam do
controle das funções vitais celulares como proliferação, diferenciação, migração e
morte celular. Assim agem no controle positivo, estimulando e codificando várias
proteínas do complexo sinalizador que permite à célula normal a responder aos
fatores de crescimento celular e dessa forma tais genes são capazes de induzir e
manter a diferenciação celular. Além disso, estes proto-oncogeneses podem tornar-
se oncogeneses por meio de mutações resultantes da exposição aos agentes
cancerígenos, e sua ativação pode ocorrer por meio de translocações
cromossômicas, amplificações gênicas ou mutações de ponto de maneira que
modificações em um único alelo são suficientes para transformá-los em
oncogeneses, contribuindo na transformação maligna (COOPER, 1994; CARRENÕ
et al., 1999; IRISH; BERNSTEIN, 1993; MCKINNELL, 1998; SILVA et al., 2004).
Os genes supressores de tumores atuam codificando proteínas com funções
específicas, por exemplo, agem impedindo o acúmulo de mutações no DNA celular
ou controlando a progressão da célula ao longo das fases do ciclo celular e, portanto
garantindo a integridade genômica. Além disso, possuem a habilidade de induzir a
morte celular programada (apoptose) suprimindo o crescimento de células tumorais
que contenham múltiplas alterações genéticas (ALFANO, 2006; CHAMMAS et al.,
2004; GOTTLIEB; KOPNIN, 2000; OREN, 1998; VELCULESCU; EL-DEIRY, 1996;
WEINBERG, 1994). Dentre os genes supressores tumorais podemos destacar
aqueles genes que regulam a transcrição nuclear e o ciclo celular (Rb, p53, BRCA-1
e BRCA-2), os genes que regulam a transdução de sinais (NF-1, APC), os
receptores da superfície celular (receptor TGFβ e caderinas), e os genes que
impedem (Bcl 2, Bcl-xl) ou induzem (Bax, Bad) à morte celular (BABENKO et al.,
2006; COOPER, 1995; COTRAN et al., 2000; DELFINO et al., 1997; DENG;
BRODIE, 2001; HANAWALT et al., 2003; INGVARSSON, 2001, KLAUNING et al.,
2000; LOURO, 2000; LUCH, 2005; MAREEL; LEROY, 2003; PERATONI, 1998;
SILVA et al., 2004).
Recentemente, alterações em genes que estão associados aos mecanismos
de reparo do DNA, reparo por excisão de bases (BER) e reparo por excisão de
32
nucleotídeos (NERB), tem sido relatados em diferentes tipos de cânceres, sendo
frequentemente associados às síndromes hereditárias que cursam com o
desenvolvimento de tumores (ABBOTTS et al., 2014; ADIMOOLAN; FORD, 2002;
CHAMMAS et al., 2004; CHAO; LIPKIN, 2006; FRIEDBERG, 2003; HARMS et al.,
2004; TAN; CHU, 2002). Normalmente estes genes são considerados como um
terceiro grupo que atuam diretamente ou indiretamente no processo da
carcinigênese (BOER; HOEIJMAKERS, 2000; COTRAN et al., 2000; FRIEDBERG et
al., 2005; HOEIJMARKERS, 2001; LINDAHL; WOOD, 1999; LOURO, 2000;
POIRIER, 2004).
Portanto, a identificação e a caracterização dos genes envolvidos na
carcinogênese são de fundamental importância para a compreensão das bases dos
mecanismos moleculares desta patologia (BERTRAM, 2001; KLAUNING et al., 2000;
OLIVEIRA et al., 2007; PARMIGIANI; CAMARGO, 2004).
Finalmente concluímos que o câncer é a resultante do crescimento de
sucessivas populações celulares nas quais, as mutações genéticas acumulam-se
em um processo de expansão monoclonal culminando na formação de uma massa
tumoral contendo células cancerígenas de diferentes padrões de alterações
genéticas com extensa heterogeneidade intratumoral (MICHOR et al., 2001;
SCHOR; SCHOR, 2001).
A promoção é a segunda etapa da carcinogenese e que consiste na
proliferação ou expansão das células “iniciadas” através da ação dos agentes
denominados de onco-promotores (SHILS et al., 2003). Estes agentes são
caracterizados por substâncias mediadoras inflamatórias que têm em comum a
propriedade de induzir irritação nos tecidos biológicos provocando reações
inflamatórias e ação proliferativa tumoral (COUSSENS; WEB, 2002; INCA/MS, 2012;
KEMPEN et al., 2006; KUMAR et al., 2008; WEISS, 2002).
Com a permanência dos onco-promotores, ocorre a terceira etapa da
carcinogenese, denominada de progressão. Nesta etapa é caracterizada pela
presença de alterações fenotípicas, ou seja, as células geneticamente mutadas
passam a multiplicar-se desordenadamente, adquirindo autonomia, tornando-se
agressivas e invasivas (BRASILEIRO FILHO, 2006; HANNAHAN; WEINBERG,
2000, INCA/MS, 2012; KUMAR et al., 2008)..
A manifestação dos sinais do tumor é o último passo na carcinogenese,
podendo levar até décadas para surgir os primeiros sintomas da doença (SHILS et
33
al., 2003). Dependendo da localização do tumor e da função da estrutura orgânica
acometida, os sintomas podem variar desde sangramentos, úlceras, emagrecimento,
caquexia, anorexia entre outros (BARACAT et al., 2000).
1.1.3 Tumor de Walker 256
O carcinossarcoma 256 de Walker foi descoberto em 1928 no laboratório de
George Walker do John Hopkins University School of Medicine a partir do
desenvolvimento espontâneo de um adenocarcinoma de mama em rata, que por sua
vez é mantido em vários laboratórios, por sucessivas inoculações (BRITO et al.,
2009; DORNELAS et al., 2006). É um dos poucos modelos de tumores, disponíveis
para estudos experimentais nas áreas médicas e biológicas em diferentes linhas de
pesquisa (BEVILACQUA et al., 1984; BLACK et al., 1994; EARLE, 1935; GUAITANI
et al., 1982; HURTADO et al., 1991; KLULBES et al., 1987; MOTA; REZKALLAH-
IWASSO, 1981; MUND et al., 2007; PEREIRA; GUASTALE, 1992).
O carcinossarcoma de Walker 256 é uma neoplasia bem caracterizada,
facilmente mantida em laboratório com vantagem de ser obtido "in vivo" através da
inoculação de células em ratos e, desenvolve-se rapidamente e falhas de inoculação
e regressão espontânea são pouco frequentes (CAVALCANTE et al., 2003;
FERNANDES et al., 1990; FERNANDES, 1995; MORAES et al., 2000; PEREIRA;
GUASTALE, 1992; SCHANOSKI et al., 2004).
Possui comportamento biológico agressivo, sendo localmente invasivo e com
alto poder de desenvolver metástase por via linfática e hematogênica
(CAVALCANTE et al., 2003; FOLADOR et al., 2009; MORAES et al., 2000; OBA-
SHINJO et al., 2003; PAVLAKI et al., 2009; SEELANDER et al., 1996). É
amplamente empregado como modelo experimental em diversos estudos em câncer
como pulmão, estômago, rins, bexiga, cavidade oral e fígado (ALVES et al., 2004;
GUIMARAES et al., 1999; GUIMARAES et al., 2010; NETO et al., 2002; OLIVEIRA
et al., 1998; SILVA et al., 2002; VIDO et al., 2000; ZARUR et al., 2004).
1.3 Terapia Fotodinâmica (TFD) no Câncer
A luz tem sido empregada como terapia de forma empírica por milhares de
anos em função da descoberta de suas propriedades terapêuticas por antigas
34
civilizações como a egípcia, indiana e a chinesa que utilizavam para o tratamento de
várias enfermidades incluindo a psoríase, vitiligo e câncer (ACKROYD et al., 2001;
DOLMANS et al., 2003; DANIELL; HILLS, 1991; SPYKES, 1985). Entretanto, foi a
partir do final do século 19, que estabeleceu a sua importância terapêutica no
tratamento de diversas doenças cutâneas graças às pesquisas iniciadas por Niels
Finsen, onde ele observou que a exposição da luz vermelha era capaz de prevenir
pústulas da varíola e, portanto, ser utilizada para tratar tal doença. Também em
outras investigações, o mesmo utilizou a luz ultravioleta para o tratamento da
tuberculose cutânea (FINSEL, 1901). Assim, seus trabalhos científicos pioneiros
puderam contribuir de forma significativa na área médica e ganharam importância e
reconhecimento, tanto que em 1903 Finsel foi contemplado pelo Prêmio Nobel por
suas descobertas.
Na mesma época, outros pesquisadores, Oscar Raab e Von Tappeiner
iniciaram estudos científicos onde foi observado que em combinação com a luz,
certas substâncias químicas eram capazes de induzir morte celular em seres
unicelulares. Eles demonstraram que em certos comprimentos de onda da luz, os
compostos químicos podiam desencadear suas propriedades tóxico-fluorescentes,
por exemplo, empregaram acrinidina em combinação com a luz, levando a exercer
seus efeitos letais em espécies de protozoários do tipo Paramecium (ACKROYD et
al., 2001; RAAB, O.,1900). Dessa forma, concluíram que somente a captação da
energia solar na forma de fótons pelo composto químico era capaz de produzir
fluorescência, sendo condição necessária para que o mesmo exerça seus efeitos
tóxicos em organismos unicelulares. Em conclusão deste achado, o potencial
terapêutico da aplicação do efeito de fluorescência dos compostos químicos na
Medicina, ganhou grande importância e notoriedade, sendo considerado como uma
nova ferramenta terapêutica dentro do conjunto do arsenal de armas na terapia
médica (ACKROYD et al., 2001; DOLMANS et al., 2002; DOLMANS et al., 2003;
JUARRANZ et al., 2008; JUZCNIENE et al., 2007; VON TAPPEINER, 1900).
No mesmo período, o neurologista francês J. Prime observou que em
pacientes epiléticos tratados com eosina oralmente desenvolviam dermatite em
áreas da pele expostas ao sol (ACKROYD et al., 2001; PRIME, 1900). Esta
descoberta levou ao desenvolvimento da primeira aplicação médica da interação
entre o efeito fluorescente da substância química e a luz que, em trabalhos
posteriores em conjunto com outros pesquisadores, Von Tappeiner e Jesioneck,
35
empregaram a eosina topicamente em combinação com a luz branca no tratamento
de tumores de pele, por exemplo, o carcinoma de células basais da pele
(TRIESSCHEIJN et al., 2006).
Mais tarde, estes mesmos pesquisadores trabalhando em colaboração com
outro pesquisador Jodlbauer, demonstraram que a presença de oxigênio era uma
condição necessária para efetivar a reação de foto sensibilização. Assim em 1907,
este grupo de pesquisadores puderam descrever este fenômeno e introduzir o termo
“Ação Fotodinâmica” (ACKROYD et al., 2001; BLUM, 1941; PERVAIZ, 2001;
TAPPEINER; JESIONECK, 1903; TAPPEINNER; JODLBAUER, 1904; TAPPEINER;
JODLBAUER, 1907; TRIESSCHEIJN et al., 2006).
De fato, a principal aplicação biomédica da ação fotodinâmica é a Terapia
Fotodinâmica (TFD), que representa uma recente modalidade terapêutica para o
tratamento paliativo e curativo de algumas formas de cânceres e lesões pré-
cancerosas. Embora Tappeiner e Jesioneck fossem os primeiros pesquisadores a
utilizarem a terapia fotodinâmica no tratamento contra o câncer de pele, empregando
a luz juntamente com a eosina aplicada topicamente, foi Figge e colaboradores que
em 1950 demonstraram em suas investigações as propriedades seletivas de
retenção das Hematoporfirinas (HP) em tecidos tumorais por análises de detecção
de imagem por iluminescência.
Muitos agentes fotossensibilizantes que têm sido avaliados desde que a TFD
foi proposta, são baseados à partir de moléculas que apresentam núcleo semelhante
aos das porfirinas, composto por quatro anéis pirrólicos conectados por pontes de
metila ligadas em uma configuração espacial cíclica e com uma cadeia lateral
normalmente metálica (DETTY et al., 2004).
Durante a década de 60, Richard Lipson e seus colaboradores iniciaram a era
moderna da Terapia Fotodinâmica voltada em aplicações terapêuticas na Clínica
Mayo nos Estados Unidos, onde novas avaliações culminaram para o
desenvolvimento de novos tratamentos e o surgimento de novos compostos
fotossensibilizantes. O primeiro agente fotossensibilizante utilizado em estudos
experimentais na TFD foi a Hematoporfirina (HP) e posteriormente surgiram
compostos a partir da mistura de diferentes porfirinas com propriedades
fluorescentes composta por mono, di e oligômeros da hematoporfirina que foi
denominada mais tarde de “Derivado de Hematoforfirina” (HPd) (JUARRANZ et al.,
2008; JUZCNIENE et al., 2007; KELLY; SNELL, 1976; KESSEL et al., 1985).
36
Neste cenário, Lipson e seus colaboradores ainda deram continuidade em
suas investigações e demonstraram através de dados achados a confirmação que
tanto a hematoporfirina como seus derivados apresentam propriedades seletivas de
retenção em tecidos tumorais utilizando técnicas de análises de detecção de
imagem pelo método de captação de fluorescência. Dessa forma este fato levou a
abrir novas perspectivas não só na otimização da análise diagnóstica por imagem
para detecção de tumores como também no uso clínico de tais compostos em
combinação com a luz vermelha destinados no tratamento e erradicação de tumores
malignos de mama e bexiga inicialmente aplicados em modelos experimentais
(DOLMANS et al., 2002; DOLMANS et al., 2003; DOUGHERTY et al., 1978;
DOUGHERTY et al., 1998; GOMER et al., 2006; KELLY; SNELL, 1976; SCHWARTY
et al., 1955; TRIESSCHEIJN et al., 2006).
Já na década de 70, várias preparações de derivados hematoporfirínicos
começaram a ser testados para o uso em terapia fotodinâmica, culminando no
desenvolvimento do Photofrin® (Pinnacle Biologics Inc., USA), composto por uma
mistura sódica de derivados hematoporfirínicos. Em 1994, a Terapia Fotodinâmica
foi previamente aprovada para o uso clínico no Canadá utilizando como agente
fotossensibilizante o Photofrin® (Pinnacle Biologics Inc., USA) (JUARRANZ et al.,
2008; JUZCNIENE et al., 2007; TRIESSCHEIJN et al., 2006).
Embora a ativação sob a luz visível de compostos químicos tem sido aplicada
experimentalmente na Terapia Fotodinâmica com o objetivo de foto destruir tecidos
neoplásicos desde que foi introduzida no início de século 20, atualmente muitos dos
resultados obtidos na clínica têm sido cada vez mais promissores e, portanto, a TFD
vem ganhando maior reconhecimento como uma nova modalidade terapêutica
efetiva contra o câncer e enfermidades não malignas (DOUGHERTY, 2002;
GARCIA-ZUAZAGA et al., 2005; HAMBLIN; HASAN, 1996; SARIKA et al., 2007 .
Contudo, os mecanismos foto dinâmicos da TFD em tumores ainda continuam
sendo largamente investigados e, portanto com base em achados científicos recém-
publicados, atualmente a TFD vêm recebendo cada vez maior aprovação por órgãos
regulamentadores de saúde em diversos países no tratamento de um grande
número de enfermidades malignas que acometem severamente a população
mundial (SARIKA et al., 2007).
37
Em alguns países, tais como o Canadá e Estados Unidos, a TFD tem sido
aprovada para o uso na terapia primária nos casos de neoplasias e malignidades
que se encontram em estágios iniciais e como terapia paliativa em cânceres em
estágios avançados. Também, a TFD pose ser utilizada como adjuvante terapêutico
em procedimentos cirúrgicos no tratamento de cânceres de pulmão, bexiga, esôfago
e estômago em diversos países. Além disso, a TFD é extensivamente avaliada em
testes clínicos para o tratamento de muitos outros tipos de cânceres incluindo, os de
mama, cólon-reto, vesícula biliar e cérebro (DOUGHERTY et al., 1998; MAKOWISKI
et al., 2003; MCBRIDGE, 2002).
Atualmente os regimes de tratamento que são adotados com TFD,
normalmente têm como finalidade ação paliativa, entretanto, em função do tipo de
neoplasia e o estágio que se encontra a patologia, melhorias na resposta terapêutica
poderão ser alcançadas dispondo de ferramentas terapêuticas alternativas com
aplicação localizada ou segmentada que podem ser necessárias quando estão
envolvidos sítios anatômicos de maior complexidade localizados em estruturas
anatômicas intrínsecas e de conformidades tridimensionais, por exemplo, tumores
presentes nas cavidades abdominais e torácicas. Neste caso, alguns tipos de
cânceres já estão sendo tratados com TFD endoscopicamente tais como, cânceres
de pulmão, bexiga, neoplasias do trato gastrointestinal e ginecológico (JUARRANZ
et al., 2008; SARIKA et al., 2007). Assim, um pleno conhecimento da terapia bem
como o amplo desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas aliados ao
desenvolvimento de novos agentes fotossensibilizantes mais potentes e eficazes,
protocolos terapêuticos mais específicos e a modernização tecnológica de
equipamentos para área médica, serão de grande importância e necessários e
contribuirão de forma positiva na otimização e o melhoramento na eficácia
terapêutica na luta contra o câncer (HASAN et al., 2003; MCBRIDGE, 2002; SARIKA
et al., 2007).
A TFD é definida como tratamento localizado contra o câncer e está baseado
na captação e retenção seletiva do composto fotossensibilizante em sítios alvos que
por sua vez sofre foto ativação por intermédio de um comprimento de onda da luz
visível levando à geração de efeitos citotóxicos de forma direcionada e que por
consequência induzindo a morte das células tumorais (CALIN et al., 2005;
DOUGHERTY, 1987; JUARRANZ et al., 2008; SARIKA et al., 2007). Também, a
TFD pode ser considerada como uma nova modalidade terapêutica minimamente
38
invasiva, amplamente testada e aplicada na Clínica Médica destinada ao tratamento
e destruição seletiva de diversos tipos de cânceres e desordens não malignas
(DOUGHERTY et al., 1998; GOMER et al., 1989; HSI et al., 1999; KESSEL, 1992;
PERVAIZ, 2001).
O tratamento consiste na administração sistêmica ou local do agente
fotossensibilizante não tóxico que se acumula de forma seletiva nos tecidos
tumorais. A ativação do agente fotossensibilizante se dá através da exposição à
irradiação do espectro da luz na região alvo, preferencialmente em um comprimento
de onda apropriado, normalmente na faixa do vermelho do espectro da luz (ʎ≥
600nm), onde os tecidos biológicos são mais suscetíveis à ação da luz vermelha,
dessa forma, a mesma atinge com mais facilidade as camadas mais profundas dos
tecidos biológicos. A energia da luz vermelha captada pelo agente
fotossensibilizante na forma excitável é transferida para o oxigênio molecular,
convertendo-o em oxigênio singleto (1O2) e promovendo também a geração de
espécies reativas de oxigênio. Durante este processo, é de extrema importância
destacar o papel fundamental do 1O2 sendo responsável por causar os efeitos
citotóxicos mais severos diretamente nas células tumorais e contribuir para a
regressão tumoral (MAKOWSKI et al., 2003; SHARMAN et al., 2000).
Além disso, os fotos produtos citotóxicos gerados pelo processo da TFD,
iniciam uma cascata de eventos bioquímicos no microambiente tumoral induzindo
danos irreversíveis e importantes além de morte celular. (ACKROYD et al., 2001;
DANIELL; HILLS, 1991; DOLMANS et al., 2003; GARCIA-ZUAZAGA et al., 2005;
JUARRANZ et al., 2008; MAKOWSKI et al., 2003; MOAN; BERG, 1991; SARIKA et
al., 2007; SHARMAN et al., 2000; TAMIETTI et al., 2007).
Portanto, para produzir os efeitos desejáveis na TFD, é necessária a
presença dos três componentes e que atuem simultaneamente para garantir uma
eficácia terapêutica, sendo estes, a luz (FOSTER et al., 1993; HENDERSON et al.,
2006), oxigênio em quantidade suficiente no tecido biológico (CHEN et al., 2002;
FOSTER et al., 1991) e o agente fotossensibilizante (HENDERSON; DOUGHERTY,
1992).
As principais vantagens da TFD em comparação aos tratamentos
convencionais contra o câncer são: (1) baixa toxicidade sistêmica, pelo fato do
agente fotossensibilizante ser somente foto ativado na presença da luz vermelha e
possuir rápida eliminação corporal, (2) habilidade de destruir s células tumorais
39
seletivamente, (3) a TFD pode ser aplicada isoladamente ou em combinação com
outras modalidades terapêuticas, tais como quimioterapia, radioterapia, imunoterapia
e procedimentos cirúrgicos. Além disso, os agentes fotossensibilizantes podem ser
aplicados sistemicamente ou localmente dependendo do tipo de tumor e sua
localização (JUARRANZ et al., 2008).
Os resultados ou as respostas terapêuticas alcançadas pela TFD são vários,
que vão desde o retardamento do crescimento tumoral nos casos de neoplasias
malignas em estágios avançados acompanhado da melhora na qualidade e no
aumento da expectativa de vida do paciente até a completa regressão tumoral
(DOLMANS et al., 2003; JUARRANZ et al., 2008; PERVAIZ; OLIVO, 2006).
1.2.1 Agentes Fotossensibilizantes
Geralmente é aceito um bom composto fotosenssibilizante na TFD quando o
mesmo atende as seguintes condições: (1) pureza química e uma estrutura química
bem definida, (2) alta afinidade na captação e retenção por sítios alvos de tecidos
tumorais, (3) baixa toxicidade em condições no “escuro”, (4) rápida eliminação
corporal, (5) seja citotóxico quando sofre alta sensibilização por meio de uma fonte
externa de luz, (6) possuir estado tripleto e que seja suficientemente de longa
duração, (7) alto rendimento na geração do 1O2, (8) seja suficientemente solúvel nos
fluidos biológicos dos tecidos corporais e (9) alto coeficiente de extinção molar e alta
absorbância da luz na faixa do comprimento de onda do vermelho até o
infravermelho (ʎ = 600-800 nm) onde a luz penetra com mais facilidade até as
camadas mais profundas dos tecidos biológicos; neste caso, o composto químico
também deve apresentar um grau de permeabilidade relativo nos tecidos biológicos
(CALIN et al., 2005; DOUGHERTY et al.,1998; JUARRANZ et al., 2008;
TRIESSCHEIJN et al., 2006).
Com base nas propriedades ideais de um bom agente fotossensibilizante, um
número de compostos tem sido avaliado em teste in vitro e in vivo e alguns deles já
se encontram presentes em etapas avançadas em teste clínicos e ou aprovados
para o uso clínico no tratamento contra o câncer (DETTY et al., 2004; SARIKA et al.,
2007; SHARMAN et al.,1999).
Os primeiros agentes fotossensibilizantes utilizados na TFD foram
denominados como Agentes Fotossensibilizantes de 1ª Geração, nesta classe estão
40
incluídos as hematoporfirinas e seus derivados. Como representante principal desta
classe, podemos destacar o Photofrin® (Pinnacle Biologics Inc., USA), que é
constituído por uma mistura sódica de diferentes derivados das hematoporfirinas e
que apresenta uma alta seletividade por tecidos tumorais e dessa forma, possuindo
uma boa ação tumoricida em combinação com a luz vermelha (DOUGHERTY et
al.,1975; LIPSON et al.,1961). O Photofrin® (Pinnacle Biologics Inc., USA) possui
indicações clínicas para o tratamento de diversas formas de cânceres em estágios
iniciais e avançados, entre eles podemos citar os cânceres de bexiga, pulmão, do
trato gastrointestinal e principalmente o Câncer de Barrett do esôfago
(DOUGHERTY et al., 1978; JUARRANZ et al., 2008; KELLY; SNELL, 1976; SARIKA
et al., 2007; TRIESSCHEIJN et al., 2006).
Com relação aos agentes fotosensibilizantes de 2ª Geração, podemos
destacar o ácido aminolevulínico (ALA) cujo nome comercial Levulan® (DUSA
Pharmaceuticals, Inc., USA), foi aprovado na Clínica Médica em 1999 destinado ao
tratamento de queratoses actínias e cânceres de pele, da cavidade oral e do trato
gastrointerstinal. Outro derivado do ALA, o éster metílico do ALA (Metevix®,
Galderma Pharma, USA), foi aprovado em 2001 pelos órgãos regulamentadores de
saúde da União Européia e do Japão com indicação terapêutica no tratamento
paliativo de cânceres de cabeça e pescoço. Já a verteporfirina (Visudyne®, Novartis
Pharma, USA), outro agente fotossensibilizante de segunda geração têm sido
aprovado para o tratamento da degeneração macular senil (AZAB et al., 2005).
As principais vantagens do emprego dos agentes fotossensibilizante de
segunda geração em relação aos de primeira geração são: (1) apresentam melhor
seletividade ao tumor, (2) possuem rápida eliminação corporal, causando menos
efeitos adversos, (3) podem ser administrados oralmente ou topicamente (BOURRE
et al., 2002; DOUGHERTY, 2002; MA et al., 1994; REZZOUG et al.,1996; SARIKA et
al., 2007; TRIESSCHEIJN et al., 2006; VAN GEEL et al.,1995; YOW et al., 2000).
Desde o início do século passado, têm-se despertado um grande interesse
em investigar o fenômeno da foto sensibilização de substâncias com ação
potencialmente tumoricida e para fins de diagnóstico, graças às pesquisas pioneiras
iniciadas por Tappeiner e Jesioneck, o qual avaliou se o efeito da exposição à
irradiação da luz na presença de eosina e posteriormente na década de 60 trabalhos
realizados por Lipson e Schwartz empregando o uso das hematoporfirinas e seus
derivados em testes de detecção por imagem de tumores. Dessa forma contribuíram
41
significantemente para a inclusão de novos compostos químicos de diversas
naturezas com potencial ação fotosensibilizante para a TFD (DOUGHERTY et al.,
1998; JUARRANZ et al., 2008; PERVAIZ; OLIVO, 2006; TRIESSCHEIJN et al.,
2006).
Entretanto, a procura por novos compostos fotossensibilizantes de última
geração ainda permanece em curso, especialmente na busca de estabelecer novos
agentes fotossensíveis que possam ser fotoativados em longos comprimentos de
onda da luz e que provoquem uma efetiva ação de fotosensibilização e que
possuem alta especificidade por tecidos tumorais (DETTY et al.,2004; DOUGHERTY
et al.,1998; JUARRANZ et al., 2008; TRIESSCHEIJN et al., 2006). Assim, muitos
compostos fotossensibilizantes têm sido avaliados em teste clínicos, porém ainda
existem poucos resultados satisfatórios publicados na comunidade científica.
Atualmente têm-se proposto uma gama de agentes fotosensíveis de diversas
naturezas com potencial para a TFD, entre eles estão as porfirinas sintéticas,
benzoporfirinas, clorinas, bacterioclorofilas, feoforbidas, cianinas nos caso das
ftalocianinas e naftalocianinas, cromóforos naturais das hidroquinonas em especial
as hipericinas, porficenes (isômeros das porfirinas), purinas, xantinas e oxzinas
(ANDERSON et al.,1997; BROWN; MELLISH, 2001; CHAN et al., 2005; DIWU;
LOWN, 1994; FERREIRA et al., 2004; GARBO, 1996, KAPLAN et al., 1998;
KRYSKO et al., 2001; de LAEY et al., 2000; LUI et al., 2001; MANG et al., 1998;
PANDEY et al., 1991; STOCKERT et al., 2007; TABER et al., 1998; VERIGOS et al.,
2006).
1.2.2 Princípio da TFD
Com o advento da teoria quântica e as modernas pesquisas na área da
fotoquímica, tornou-se claro que os processos fotobiológicos são dependentes dos
limites da absorção do espectro da luz de diversas substâncias químicas com
propriedades fotossensibilizantes. Assim, para que uma substância química seja um
eficiente agente fotossensibilizante, a mesma deve ser capaz de tornar-se excitável
quando exposta à irradiação da luz e dessa forma, convertendo-se em um estado
altamente energético e relativamente de longa duração na forma tripleto (PERVAIZ,
2001; VOGELMANN; KRAMER, 1976).
42
A TFD envolve a administração local ou sistêmica do agente
fotossensibilizante seguido posteriormente pela irradiação da luz em um
comprimento de onda apropriado no sítio alvo para fotoativar o composto químico
(TRIESSCHEIJN et al., 2006).
Uma vez que a energia da luz é captada na forma de fótons pelo componente
químico, iniciam-se reações intercruzadas dentro da estrutura química, levando ao
salto de elétrons para um nível orbital altamente energético, seguido por uma
inversão em alta rotação orbital de elétrons, convertendo então o componente
químico em um estado altamente excitável na forma tripleto (CALIN et al., 2005;
DOLMANS et al., 2003; DOUGHERTY, 1992; HERDERSON; PERVAIZ, 2001;
JUARRANZ et al., 2008; OCHSNER, 1997; TRIESSCHEIJN et al., 2006;
VERMEERSCH et al., 1991).
Quando o componente químico retorna ao seu estado energético de repouso,
ele emite a energia sob forma de calor ou fluorescência, sendo esta última
propriedade utilizada na Clínica Médica para detecção de diversas patologias por
exames de diagnóstico por imagem (JUARRANZ et al., 2008; TRIESSCHEIJN et al.,
2006).
O agente fotossensibilizante estando na forma tripleto, ele pode sofrer dois
tipos de reações. Na primeira reação (Reação Tipo 1), o composto químico
fotossensibilizante pode reagir diretamente com o substrato biológico que pode ser
membranas celulares e biomoléculas (lipídeos, proteínas, ácidos nucleicos e etc.)
transferindo prótons (íons hidrogênio) ou elétrons, levando à geração de radicais
iônicos que por sua vez, interagem com o oxigênio produzindo espécies reativas de
oxigênio (EROs) tais como, superóxido aniônico (O2
.-), radical hidroxila (OH
.) e
peróxido de hidrogênio (H2O
2), culminando em danos importantes celulares (CALIN
et al., 2005; DOLMANS et al., 2003; FOOTE,1976; JUARRANZ et al., 2008;
PATHAK, 1982; PERVAIZ, 2001; TRIESSCHEIJN et al., 2006; VERMEERSCH et
al.,1991). Na segunda reação (Reação Tipo 2), a energia produzida pelo composto
químico na forma tripleto é transferida diretamente para o oxigênio molecular,
convertendo em 1O
2, sendo este considerado como uma das espécies altamente
reativas e extremamente eletrofílico, responsável por causar importantes alterações
nas membranas celulares, proteínas e DNA, levando à geração de danos severos e
citotóxicos até a morte celular durante o processo da TFD. Dessa forma, os danos
43
ocasionados em membranas celulares são de particular interesse para o processo
da TFD, uma vez que os compostos fotossensibilizantes tendem a acumular se
seletivamente em membranas celulares e ou organelas, e quando são fotoativados
produzem danos e morte celular. Em termos químicos, as alterações nos
fosfolipídeos de membranas e ou organelas celulares ocorrem devido à reação de
peroxidação lipídica que se inicia em consequência da formação de radicais livres e
oxigênio singleto (BALZANI; SCANDOLA, 1987; CALIN et al.,2005; CLAYTON,
1970; DOLMANS et al., 2003; DOUGHERTY et al., 1998; FOOTE, 1976; FOOTE,
1991; JUARRANZ et al., 2008; PERVAIZ, 2001; TRIESSCHEIJN et al., 2006).
Embora os mecanismos da ação da TFD ainda não são completamente
elucidados, normalmente é aceito que todos os efeitos citotóxicos gerados pela
fotoativação dos compostos químicos são dependentes da presença de oxigênio e
dessa forma, a reação de fotosensibilização não ocorre em áreas com anóxia nos
tecidos biológicos. Estudos in vivo demonstram que a indução de hipóxia do tecido
biológico por meio de clamping, abole os efeitos da TFD (DOLMANS et al., 2003;
GOMER; RAZUM, 1984).
Durante o processo da TFD, ambas as reações tipo 1 e 2 ocorrem
simultaneamente, contudo, a razão entre as duas reações e suas contribuições para
o desencadeamento dos processos de estress oxidativos levando à peroxidação
lipídica e por consequência gerando importantes efeitos citotóxicos até a morte
celular, são dependentes de alguns fatores tais como, natureza química do
composto químico fotossensibilizante, afinidade de retenção às estruturas
intracelulares e extracelulares , presença de oxigênio tissular e o tipo de substrato
biológico.
Estudo experimentais na TFD demonstram que em condições de hipóxia
tissular, a geração de radicais livres oriundos da reação de fotossensibilização Tipo
1 são primariamente responsáveis pela sensibilização. Porém, em condições de
média oxigenação tissular, o1O
2 gerado pela reação Tipo 2, desempenha um papel
fundamental por mediar amplamente todo o processo de fotossensibilização e
também dar suporte a ação dos radicais livres produzidos pela reação tipo 1 na
geração dos efeitos citotóxicos (JUARRANZ et al., 2008).
Devido à alta reatividade e a curta vida de duração das espécies reativas de
oxigênio, somente áreas próximas aos locais onde foram produzidos os efeitos da
44
TFD são afetados diretamente, pois a meia vida de duração do 1O
2 em sistemas
biológicos é menor que 0.04µs (micro segundos) e seu raio de ação é menor que
0.02 µm (micrômetro) (DOLMANS et al.,2003; JUARRANZ et al., 2008; PERVAIZ,
S., 2001; MOAN; BERG, 1991). Portanto, a extensão do foto dano é multifatorial e
depende do tipo do agente fotossensibilizante, da retenção seletiva extracelular ou
intracelular, do total da dose posológica do agente fotossensibilizante, da dose total
de exposição à irradiação da luz, da taxa de fluência da luz, da disponibilidade de
oxigênio tissular e do tempo entre a administração do agente fotossensibilizante e a
exposição à irradiação da luz (ACKROYD et al., 2001; DOLMANS et al., 2003).
1.2.3 Efeitos da TFD em Tumores
A TFD tem demonstrado possui efeitos a nível celular (HENDERSON, B.W.;
DOUGHERTY; MALONE, 1984) e subsequentemente atua na geração de
importantes alterações na vascularização tumoral contribuindo para a destruição de
tumores (ACKROYD et al., 2001; JUARRANZ et al., 2008; STAR et al., 1986).
Sabe-se que há três principais mecanismos pelos quais a TFD media a
destruição do tecido canceroso (DOLMANS et al., 2003; DOUGHERTY et al., 1998;
HASAN et al., 2003). No primeiro mecanismo, as EROs e principalmente o1O
2
gerados durante o processo de fotossensibilização da TFD produzem danos severos
diretamente às células tumorais promovendo à destruição tumoral (DOLMANS et al.,
2003; JUARRANZ et al., 2008). No segundo mecanismo, a TFD também pode gerar
danos relevantes nos vasos sanguíneos, prejudicando a vascularização tissular
levando ao colapso e falência vascular originando um quadro de severa hipóxia.
Dessa forma, a resposta vascular atua desempenhando um importante papel na
morte celular devido ao comprometimento do aporte de oxigênio e nutrientes
necessários para a manutenção e sobrevivência celular e também corroborando na
redução do fluxo sanguíneo possibilitando a ocorrência da formação de trombos
(ACKROYD et al., 2001; DOLMANS et al., 2003; REED et al., 1989; STAR et al.,
1986). E finalmente, o último mecanismo pelo qual a TFD atua é ativando a resposta
imune contra as células tumorais reminicentes do processo de fotossensibilização
(DOLMANS et al., 2003; DOUGHERTY et al., 1998; HENDERSON; GOLLNICK;
SNYDER et al., 2004; JUARRANZ et al., 2008; SOLBAN; RIZVI; HASANT, 2006;
45
TRIEESSCHEIJN et al., 2006). Portanto a contribuição de cada um desses
mecanismos durante o processo de fotosensibilização depende de vários fatores os
quais podemos incluir a natureza do agente fotossensibilizante, local de retenção
dentro do tecido tumoral, dose de exposição da luz adotada, tipo de tumor e seu
grau de vascularização (JUARRANZ et al.,2008; TRIESSCHEIJN et al., 2006).
Desde 1991, pesquisas experimentais têm mostrados que a TFD causa nas
células neoplásicas uma resposta de morte celular tanto por meio de apoptose
quanto de necrose (AGARWAL et al.,1991) fornecendo amplas bases na avaliação
da eficácia terapêutica da TFD. Normalmente, a apoptose é definida como um
processo de energia dependente que ocorre na maioria das células e que atua
regulando o processo de morte celular programada. Têm-se sugerido que o
processo apopótico é causado primariamente pelo dano mitocondrial (KESSEL;
LUO, 1998). Entretanto, injúrias fotooxidativas desencadeadas durante o processo
da TFD também estimulam um número de respostas, os quais incluíram efeitos
citotóxicos diretos dentro do microambiente tumoral (MOOR, 2000) e danos
relevantes nas células endoteliais vasculares que podem estar em combinação ou
não resultando em um colapso vascular que por consequência levando à morte
celular por severa hipóxia (ACKROYD et al., 2001; FINGAR, 1996; REED et al.,
1989). Portanto tais efeitos são imprescindíveis para o início da ablação da massa
tumoral no processo da TFD e que são determinantes na regulação da resposta
imunitária tanto no processo de ativação quanto na supressão. Além disso, os
processos inflamatórios são caracterizados pela geração de uma ampla variedade
de mediadores pró-inflamatórios e vem acompanhado pelo recrutamento leucocitário
e que normalmente ocorrem após o processo da TFD. Assim as amplificações de
suas ações, bem como a indução da resposta inflamatória aguda e a geração da
resposta imunitária tumor-específica desempenham um papel decisivo para garantir
o controle da resposta imunitária a longo prazo durante o processo da TFD
(DOLMANS et al., 2003; KORBELIK, 1996; KORBELIK; CECIC, 1999).
Ação Letal Direta nas células tumorais
Em experimentos com modelos tumorais in vivo utilizando a TFD observa-se
uma redução do número de células tumorais clonogênicas em virtude do foto dano
pela geração de EROs decorrentes da ação de peroxidação lipídica, foto oxidação
46
das bases de guanina do DNA e danos nas membranas do citoesqueleto e de outros
sítios intracelulares, dessa forma, desencadeando o processo de morte celular e a
destruição do tecido biológico (CASTANO et al., 2005; DOLMANS et al., 2003;
HUANG et al., 2005; KÜBLER, A.C., 2005; TAMIETTI et al., 2007).
Contudo, várias membranas celulares têm sido postuladas como sítios alvos
em potencial de interesse para a TFD com aplicação para os diferentes tipos de
agentes fotossensibilizantes entre elas podem citar membrana plasmática,
mitocondrial, nuclear, do lisossoma, do complexo de Golgi, do retículo
endoplasmático e estruturas biomoleculares do cito esqueleto (ACKROYD et al.,
2001; ASSUNÇÃO GUIMARÃES, C.; LINDEN, 2004; BUCKMANN et al., 2001;
CANDAL et al., 2005; CASTANO et al., 2004; CREGAN et al., 2002; HUANG, et al.,
2005; JUARRANZ et al., 2008; KLIONSKY; EMR, 2000; KÜBLER, 2005; PENG et
al.,1996; TAMIETTI et al., 2007). Assim, tais sítios têm sido extensivamente
considerados como um importante local constituído por biomoléculas que são
fortemente suscetíveis ao ataque do oxigênio singleto 1O
2 e EROs geradas a partir
da ação de peroxidação lipídica durante o processo de fotossensibilização da TFD
(HENDERSON; DOUGHERTY, 1992; PENG et al., 1996; PERVAIZ, 2001).
Portanto, o dano letal está intrinsecamente relacionado tanto ao processo de
peroxidação lipídica mediado pela ação do 1O
2 como importantes modificações
oxidativas de proteínas presentes nas membranas celulares (DAS; MUKHTAR et al.,
1985; DAVIES, 1987; PERVAIZ, 2001).
Os principais mecanismos de morte celular, apoptose e necrose têm sido
descritos após o emprego da TFD e parecem estarem relacionados com o local de
retenção celular do composto fotossensibilizante no tecido biológico (JUARRANZ et
al., 2008). A necrose é normalmente caracterizada pelo modo de morte celular que
está associado com a perda da homeostasia em decorrência do aumento do volume
celular, agregação da cromatina, desorganização do citoplasma, perda da
integridade da membrana plasmática e conseqüente ruptura celular. Assim durante o
processo da necrose, o conteúdo celular é liberado causando danos às células
vizinhas e uma reação inflamatória no local. Por outro lado, processo de morte
celular por apoptose que é regulado geneticamente, há à ocorrência da perda do
volume celular, formação de Blebbing na membrana plasmática, condensação
nuclear, agregação da cromatina e degradação endonucleocítica do DNA em
47
fragmentos nucleossomais e formação de corpos apoptóticos. Tais mudanças
celulares ocorrem após uma cascata de sinalização celular e eventos mediados por
caspases que regulam a expressão de proteínas pró e anti-apoptóticas
Posteriormente os corpos apoptóticos são rapidamente fagocitados por
macrófagos e removidos sem causar comprometimento às estruturas vizinhas e
inflamação (GRIVICICH et al., 2007; HU; KANAVAGH, 2003; RUPNARAIN et al.,
2006; ZIEGLER; GROSCURTH, 2004; ZONG; THOMPSON, 2006; WILLIANS;
SMITH, 1993).
Contudo a mitocôndria parece desempenhar um papel crucial no processo de
apoptose pela geração de fatores apoptóticos tais como cytocromo c (Cyt c) e
fatores intermembranários presentes no citoplasma celular. Este processo ocorre em
função da ação de peroxidação da cardiolipina (CL), um fosfolipídio essencial que
atua no metabolismo energético de organismos celulares e pluricelulares, presente
na membrana mitocondrial e que está envolvida nos mecanismos fisiológicos e em
alterações patológicas onde a via de síntese e metabólica desempenha um papel
chave na manutenção estrutural e funcional da mitocôndria e por consequência na
sobrevivência celular (TAMIETTI et al., 2007).
Embora o mecanismo de destruição direta da TFD nas células neoplásicas
ainda continua sendo objeto de investigação têm-se sugerido que a ação do 1O
2
durante a TFD apresenta tendência a induzir a morte celular por apoptose, enquanto
que a geração de danos celulares pelas EROs levam ao processo de morte celular
por necrose (FRUTOS; CORN, 1998; KOCHEVAR et al., 2000; LIN, 2000). Assim,
dependendo do sítio de geração do fotodano provocado pela ativação do composto
fotossensibilizante, tanto o mecanismo de apoptose quanto o de necrose estão
intimamente envolvidos na morte celular e que são descritos em trabalhos com
células e tecidos neoplásicos tratados com TFD (DAHLE et al., 1999; DAVIES, 1987;
PERVAIZ, 2001; VILLANUEVA et al., 1999).
Muitos trabalhos experimentais indicam que os agentes fotossensibilizantes
que se ligam em organelas celulares tais como, mitocôndria e retículo
endoplasmático são melhores indutores ao processo de apoptose, pois levam
principalmente à indução transitória da permeabilidade da membrana mitocondrial
liberando fatores pró-apoptóticos dentro do citosol celular e dessa forma
desencadeando a morte celular por apoptose (JUARRANZ et al., 2008; KESSEL;
48
LUO, 1999; KROEMER et al., 1997; KROEMER, 2003; PERVAIZ, 2001; TAMIETTI
et al., 2007). Por outro lado, agentes fotossensibilizantes que se ligam
predominantemente em membranas plasmáticas, lisossomos e estruturas do
complexo de Golgi ou que ficam totalmente difundidos no citosol celular tendem a
desencadear a morte celular por necrose (BUYTAERT et al., 2007; JUARRANZ et
al., 2008; KESSEL; LUO, 1999; KESSEL; VICENTE; REINERS, 2006; KROEMER et
al., 1997; KROEMER, 2003; OLEINICK et al., 2002; PERVAIZ, 2001; VILLANUEVA
et al., 2003).
Considerando que 1O
2 apresenta um uma curta vida de durarção, vale
destacar que o alvo primário a ser atacado deve estar necessáriamente bem
próximo do agente fotossensibilizante para que ocorra uma ação efetora de
fotodano. Além disso, relocalização do agente fotossensibilizante a nível celular têm
sido observado durante o proesso de irradiação, desta forma, afentando outros alvos
secundários. Neste caso, a localização do sítio primário pode não ser decisiva para
desencadear morte celular, mas sim provocar um efetivo fotodano que possa
amplificar seus efeitos em sites secundários onde o agente fotosenssibilizante é
relocalizado (BUYTAERT et al., 2007; JUARRANZ et al., 2008; KESSEL, 2002).
Portanto a eficácia na TFD é multifatorial e dependente da natureza química,
das propriedades físico químicas e da concentração dos agentes
fotossensibilizantes empregados, da via de administração adotada, do tempo de
incubação, da dose de energia da luz utilizada e finalmente do tipo de tumor e o seu
grau de vascularização tissular. Todos estes fatores descritos são extremamente
relevantes e determinam o sitio de retenção e geração tanto do 1O
2 como das EROs
no processo de fotoativação do componente fotossensibilizante levando ao
desencadeamento de danos celulares até a morte celular (JUARRANZ et al., 2008;
PERVAIZ, 2001).
Danos na Vascularização tumoral
A viabilidade das células tumorais é dependente principalmente da
manutenção do suprimento de oxigênio e nutrientes presentes nos vasos
sanguíneos e dessa forma, a formação e o controle da angiogênese são mediados
49
pela ação dos fatores de crescimento produzidos pelo ambiente tumoral (DOLMANS
et al., 2003).
Contudo, a vascularização é considerada como uma rota comum permitindo à
disseminação das células cancerosas para outros órgãos distantes do sítio primário
tumoral levando ao processo de metastatização. Além disso, a mesma tem como
finalidade garantir a viabilidade celular promovendo o aporte de oxigênio e nutrientes
necessários para a manutenção celular (DOLMANS et al., 2003; JUARRANZ et al.,
2008). Assim, a vascularização tumoral é apontada como uma importante e
promissora abordagem do ponto de vista terapêutico contra câncer (CARMELIET;
JAIN, 2000; DOLMANS et al., 2003; JAIN; CARMELIET, 2001; JUARRANZ et al.,
2008). Neste sentido, o dano vascular tem sido largamente investigado auxiliando de
certa forma no suporte e na garantia de se obter resultados mais confiáveis e
eficazes na aplicação da TFD com diversos tipos de agentes fotossensibilizantes na
terapêutica contra o câncer (DOLMANS et al., 2003; JUARRANZ et al., 2008).
Em experimentos iniciais com TFD têm descrito que normalmente todos os
agentes fotossensibilizantes invariavelmente induzem vasoconstrição e formação de
trombos pela ativação dos fatoresde agregação plaquetária, dessa forma, limitando
o suprimento de oxigênio e nutrientes para as células neoplásicas e finalmente
promovendo o colapso ou falência vascular levando a um quadro de severa hipóxia
ou anóxia tissular (BUSCH et al., 2002; CHEN et al.,1996; DOLMANS et al., 2002;
DOLMANS et al., 2003; FINGAR et al., 1997; FINGAR et al., 1999; HENDERSON;
FINGAR, 1987; JUARRANZ et al., 2008; STAR et al., 1986).
Também Henderson e seus colaboradores demonstraram em suas pesquisas
no modelo de fibrosarcoma o qual o Photofrin® (Pinnacle Biologics Inc., USA),
induzido pela TFD causa falência vascular com diminuição do aporte de oxigênio e
nutrientes no tecido tumoral (HENDERSON; FINGER, 1989). Em outros estudos pré-
clínicos com TFD os quais foram utilizados outros compostos fotossensibilizantes
tais como, derivados da Hematoporfirina, da feoforbida e da benzoporfirina
descrevem que a resposta ao dano vascular possui caráter bifásico. Geralmente é
observada uma vasoconstrição de efeito imediato e após 3 horas do processo da
TFD, uma resposta secundária e de longo prazo é caracterizada pela ocorrência de
formação de trombos retardando o crescimento tumoral (DOLMANS et al., 2003).
Assim tais efeitos que estão associados ao dano vascular são determinantes
para a inibição ou retardamento da progressão tumoral (CASTANO et al., 2006;
50
DOLMANS et al., 2002; DOLMANS et al., 2003; GOMER et al., 2006; JUARRANZ et
al., 2003; TOZER; KANTHON; BAGULEY, 2005). Além disso, nota-se durante o
processo de fotossensibilização há a ocorrência de danos as células endoteliais
vasculares em tumores tratados com TFD e que ativam uma cascata de eventos
levando à vasodilatação, alterações na permeabilidade vascular pelo aumento dos
fatores de adesão molecular, ativação de fatores de agregação plaquetária e
finalmente desencadeando um quadro inflamatório agudo, sendo este responsável
por atuar modulando a resposta imunológica (CASTANO et al., 2006; GOMER et al.,
2006; JUARRANZ et al., 2008). Assim a resultante da injúria vascular, uma vez
caracterizada pela resposta inflamatória aguda induzida pela TFD é também
responsável pela morte das células neoplásicas tanto pelo processo de necrose
quanto de apoptose, as quais são eliminadas rapidamente por macrófagos,
granulócitos e pelo infiltrado leucocitário presente no ambiente tumoral (JUARRANZ
et al., 2008). Contudo, os restos celulares resultantes do processo de
fotosensibilização da TFD estimulam o microambiente tumoral na ativação e no
aumento da expressão dos fatores pró-inflamatório tais como, fator de crescimento
endotelial vascular (VEGF), cicloxigenase-2 (COX-2), prostaglandinas, fator de
necrose tumoral (TNF-α), metaloproteinases de matriz extracelular (MMPs),
integrinas, interleucinas (IL-1, IL-6 e IL-8) e proteínas de choque térmico (HSPs),
promovendo dessa forma na viabilização de antígenos necessários para
sensibilização e na atração de macrófagos e células dendríticas oriundos dos
nódulos linfáticos ativando a resposta imunológica. Contudo, sugerem-se estudos
adicionais que serão necessários para se determinar com mais precisão os efeitos
dos danos vasculares induzidos pela TFD no controle da resposta imune a longo
prazo (DOLMANS et al., 2003; JUARRANZ et al., 2008).
Resposta Imunológica
A inflamação aguda é gerada a partir do dano celular (necrose/apoptose)
induzida pela TFD e que pode potencializar a resposta imunitária anti-tumoral
específica através da atração leucocitária ou seja, por neutrófilos, linfócitos,
macrófagos e células dendríticas para dentro do ambiente tumoral e
consequentemente aumentando o reconhecimento de antígenos (CASTANO et al.,
2006).
51
Um dos principais marcadores celulares induzíveis pelo processo TFD e
posteriormente liberado pelos restos celulares tumorais em decorrência do dano
celular é a proteína extracelular 70 de choque térmico (HSP70). Esta proteína é
eficientemente ativada após o estress oxidadativo celular e a mesma permenece
intracelularmente prevenindo a morte celular pela inibição da agregação de
proteínas celulares (YENARI et al., 2005). Esta propriedade não só permite a
inibição da morte celular, mas também promove a formação de um complexo estável
com antígenos citoplasmáticos das células tumorais. Estes complexos podem ser
expressos na superfície celular e escapam intactamente dos restos celulares
interagindo com as células apresentadoras de reconhecimento de antígenos (APCs)
estimulando a resposta imune (KORBELIK, M.; SUN, J.; CECIC, I., 2005). Portanto,
as chaperonas em especial a HSP70 atua ligando-se aos receptores de alta
afinidade de superfície das células APCs, promovendo a ativação, sensibilização
das células dendríticas, permitindo a apresentação cruzada do peptídeo do antígeno
de carga HSP70 das APCs para as células linfócitas citotóxica tipo CD8+ (TODRYK
et al., 1999).
Dessa forma este processo leva a sensibilização não só das células
dendríticas, mas também, macrófagos, linfócitos, neutrófilos que migram dos
nódulos linfáticos para o sitio tumoral ativando a resposta imune (Juarranz et al.,
2008). São previstas alterações induzidas pela TFD caracterizadas pelo aumento da
expressão da transcrição de fatores como NFkB (fator nuclear kappa B) e proteína
ativadora 1 (AP-1) que estimulam a ativação da transcrição de genes que codificam
diversas proteínas imunoreguladoras e pró-inflamatórias por consequência do dano
oxidativo celular (BAEUERLE; HENKEL,1994; CASTANO et al., 2006; HAEFNER,
2002; SUN; XIAO, 2003). Também há relatos que o processo inflamatóro induzido
pela TFD é controlado pelo aumento da expressão de mediadores inflamatórios tais
como IL-1 β, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, proteína inflamatória de macrófago (MIP-1 e
MIP-2), prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanas, COX-2, proteinases,
peroxidades, EROs, substâncias vasoativas , componentes do complemento (C3 e
C5), fatores de coagulação plaquetária, integrinas e fatores de crescimento (TGFβ,
VEGF). (CASTANO et al., 2006; DOLMANS et al., 2003; EVANS et al., 1990;
EVANS et al., 2001; GOLLNICK et al., 1997; GOLLNICK et al., 2003; JUARRANZ et
al., 2008; KICK et al., 1995; KORBELICK; KROSL, 1994; NSEYO et al., 1990;
STEUBING et al.,1991).
52
Pesquisas têm sugerido que o recrutamento neutrofílico para os sítios
tumorais que receberam tratamento com TFD é fortemente controlado não só pela
ação dos mediadores inflamatórios produzidos por macrófagos residentes e células
do estroma e células endoteliais do tumor sólido mas também por alterações na
permeabilidade vascular e no aumento da expressão de fatores de adesão vascular
(E-Selectina) e intracelular (ICAM-1) que colaboram nas etapas da cascata de
adesão celular necessárias para a diapedese neutrofílica, e dessa forma
contribuíndo para uma efetiva resposta tumoricida (BHUVANESWARI et al., 2009;
BOZIC et al., 1995; BUTCHER; PICKER, 1996; CASTANO et al., 2006; CHEN et al.
2006; DI CARLO et al., 2002; GOLLNICK et al., 2003; MACKAY, 2001)
Embora o dano vascular e a ocorrencia de hipoxia após a TFD contribui para
uma efetiva resposta inflamatória no ambiente tumoral, reduções dos níveis de
oxiigênio tissular durante o tratamento podem limitar a eficácia no controle de
progressão tumoral, induzindo à produção de marcadores inflamatórios pró-
angiogênicos tais como VEGF, TGFβ, COX-2, metaloproteinases entre outros
levando à ressurgência tumoral. (BHUVANESWARI et al., 2009). Portanto é
importante gerar dados no perfil das citocinas inflamatórias e outros marcadores em
sítios tumorais tratados com TFD desde que possam auxiliar a estabelecer
adequados parâmetros no esquema de tratamento e que garantem uma correta
resposta imunitária anti-tumoral específica tanto inata bem como adaptativa
(CASTANO et al., 2006; FERRARIO et al., 2000; FERRARIO et al., 2004;
FERRARIO et al., 2005; GARG et al., 2010).
1.3 Azul de Metileno
O azul de metileno é um corante que pertence à classe dos corantes
fenotiazínicos e que deperta grande interesse devido às suas propriedades
eletrocatalíticas em face da NADH4, que é uma coenzima do grupo das
dehidrogenases (SCHIRMER et al., 2011; WAINWRIGHT; AMARAL, 2005). Além
disso, o mesmo têm-se mostrado como um potente agente fotossensibilizante com
excelentes propriedades fotoquímicas em função de possuir alto rendimento na
geração de 1O
2 e EROs na presença de agentes redutores (CHEN et al., 2008;
GABRIELLI et al., 2004; PELOI et al., 2008; TARDIVO et al., 2004; TARDIVO et al.,
53
2005). Devido às suas características fotodinâmicas e fototóxicas e demonstrar alta
afinidade com a membrana mitocondrial celular, o azul de metileno têm-se
destacado como um efetivo fotossensibilizante de grande potencial para à aplicação
médica como agente terapêutico na TFD. Em face de suas propriedades físico-
químicas, o mesmo quando está na forma fotoativada, liga-se significantemente na
membrana mitocondrial, causando importantes alterações funcionais levando ao
quadro de falência mitocondrial que por consequência promovendo morte celular por
apoptose (BALL et al., 1998; CHEN et al., 2008; NOODT et al., 1998; ORTH et al.,
2000).
O azul de metileno também é definido como um inibidor da óxido nítrico
sintase e da guanilato ciclase, tendo diversas aplicações terapêuticas tanto na
Medicina como na Veterinária (AUERBACH et al., 2010; BURROWS, 1984; JENA;
CHAINY, et al., 2008; SHIRMER et al., 2011). Também um de seus empregos na
área médica está baseado no seu papel como transportador de elétrons em
sistemas inativos da metemoglobina redutase dependente de NADPH (BURROWS,
1984; SMITH, 1980) como implicações clínicas no tratamento de várias formas da
metemoglobinemia, mas principalmente na forma adquirida, que é uma
manifestação severa da infecção por malária levando ao quadro de uma profunda
anemia que pode levar ao óbito. Portanto, o azul de metileno é utilizado
classicamente como um efetivo agente antimalárico, principalmente nos países onde
há um aumento da resistência do Plasmodium falciparum (P. falciparum), pelo uso
de agentes antimaláricos de primeira geração relacionados ao grupo da cloroquina e
da pirimetamina-sulfadoxina (GINIMUGE; JYOTHI, 2010; MEISSNER et al., 2006;
SCHIRMER et al., 2003).
Como agente antiparasitário, o mesmo apresenta peliotropismo; primeiro ele
age interferindo no metabolismo da hemoglobina e do grupo heme presente nas
organelas digestivas do parasita, impedindo o seu crescimento e desenvolvimento.
Por último, o azul de metileno atua como inibidor seletivo da enzima glutationa
redutase, promovendo depleção dos níveis de glutationa dentro do citosol
parasitário, revertendo o quadro de sensibilização P. falciparum à ação da
cloroquina, e também prevenindo a reação de polimerização do grupo heme em
hemozoin semelhante à ação dos agentes antimaláricos derivados de 4-
aminoquinolina (AKOMPONG et al., 2000; ATAMNA et al., 1996; BECKER et al.,
54
2003; DAVIOUD – CHARVET et al., 2001; GINIMUGE; JYOTHI, 2010; MEISSNER
et al., 2006; MÜLLER et al., 2001; RIDLEY, 2002; SCHIRMER et al., 2003).
Embora, o emprego do azul de metileno como agente antimalárico tenha sido
utilizado desde 1891 por Guttmann e Erlich exclusivamente no tratamento contra a
malária, atualmente suas indicações clínicas têm sido amplamente revisadas
(COULIBALY et al., 2009; FÄBER et al., 1998; SCHIRMER et al., 2011;
VENNERSTROM et al., 1995). Desde 2010, houve mais de 11.000 acessos de
procura do azul de metileno nas bases de dados científicos na área médica, e
observamos que tais ferramentas de pesquisa ainda não foram totalmente cobertas
por trabalhos anteriormente publicados ao uso do banco de dados e, portanto,
levando à aquisição de poucas informações relacionadas ao azul de metileno
(SCHIRMER, et al., 2011).
Recentemente as indicações terapêuticas do azul de metileno têm sido
aprovadas pelo FDA e estão sendo direcionadas não só para o tratamento de
diversas formas da metemoglobinemia (hereditária, aguda e adquirida), mas também
estão sendo indroduzidas clinicamente no tratamento de diversas condições tais
como na síndrome de vasoplegia refratária, em distúrbios cardiovasculares
realcionados ao choque séptico, na encefalopatia induzida pela isofosfamida em
pacientes com câncer e na síndrome hepatopulmonar que causa severa hipoxemia
(AUERBACH et al., 2010; GINIMUGE; JYOTHI, 2010; JENA; CHAINY, 2008; KWOL;
HOWES, 2006; PATEL, 2006; PELGRIMS et al., 2000; SCHIRMER et al., 2011;
SHANMUGAM, 2005). Contudo o azul de metileno ainda tem despertado grande
interesse na área médica por apresentar grande potencial uso terapêutico no
tratamento contra a doença de Alzheimer (AUERBACH et al. 2010; GINIMUGE;
JYOTHI, 2010; SCHEINDLIN, 2008).
Além disso, os efeitos do azul de metileno têm sido amplamente investigados
na TFD com destaque princincipalmente contra o câncer (GINIMUGE; JYOTHI,
2010; WONDRAK, 2007).
Considerando o azul de metileno como um pigmento com ação redutora, o
mesmo também apresenta atividade ant-fúngica, antimicrobiana e antiviral, sendo
muito efetiva sua utilização na clínica médica na prevenção de infecções no trato
urinário em pacientes idosos, no tratamento de úlceras e feridas que apresentam
resistência bacteriana, psoríases e afecções causadas pelo vírus da hepatite C e do
HIV em combinação com uma fonte de luz externa (CALZAVARA-PINTON et al.,
55
2005; GINIMUGE; JYOTHI, 2010; PELOI et al., 2008; PHOENIX et al., 2003;
WAINWRIGHT; CROSSLEY, 2002).
Atualmente as doses recomendadas em diferentes condições clínicas variam
de acordo com a indicação terapêutica e posologia (GINIMUGE et al., 2011;
SCHIMER et al., 2011). Em humanos o azul de metileno quando administrado, o
mesmo apresenta boa tolerância, excelente absorção e é amplamente difundido
para outros tecidos e órgãos tais como, coração, pulmão, fígado, rins e também
atravessa a barreira hematoencefálica. Sua biodisponibilidade é aproximadamente
de 73% e sua eliminação é exclusivamente renal na forma leuco- azul de metileno e
metabólitos demetilados (azure a e b) (AUERBACH et al., 2010; GAUDETTE;
LODGE, 2005; PETER et al., 2000; SCHIRMER et al., 2011; WALTER–SACK et al.,
2009). Reações adversas podem ocorrer quando o azul de metileno é administrado
em altas doses acima de 7mg/kg peso corporal (i.v), entre elas podemos citar
náuseas, distúrbios gastrointestinais, dores abdominais e peitorais, cianose,
sudorese, cefaleias, tonturas, confusão mental e metemoglobinemia (AUERBACH et
al., 2010; CLIFTON; LEIKIN, 2003; SCHIRMER et al., 2011).
56
2 HIPOTESE
O presente estudo visa investigar a hipótese deque baixas doses de azul de
metileno, como agente fotossensível, associado à radiação do Laser de baixa
oitência em baixas doses pode ativar ou amplificar um processo inflamatório
intra=tumoral, e desta forma modular o processo da progressão tumoral.
57
3 OBJETIVOS
Estudar a regulação e expressão de mediadores inflamatórios no
desenvolvimento e progressão do Tumor de Walker 256, com o emprego da Terapia
Fotodinâmica e a utilização do azul de metileno como agente fotossensibilizante
quimioterápico.
Dessa forma, investigaremos a expressão de COX -1 e COX -2 por RT-PCR
na massa tumoral; a produção de mediadores inflamatórios, prostanóides e citocinas
no tumor com e sem a PDT e as alterações morfológicas peri e intra-tumoral
utilizando método histológico com coloração em H.E
58
4 METODOLOGIA
4.1 Protocolos Experimentais no Modelo do Tumor de Walker 256
O experimento foi realizado no Laboratório de Farmacologia e Terapêutica
Experimental do Departamento de Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas
localizado na Universidade São Paulo, seguindo todas as normas e procedimentos
de biossegurança.
4.1.1 Animais
Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo CEEA do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade São Paulo seguindo os princípios
éticos em experimentação animal elaborados pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA), sobre os protocolos de experimentação que
envolva o uso de animais.
Ratos albinos machos da linhagem Wistar com idade mínima de oito semanas,
pesando cerca de 200 gramas, provenientes do Biotério Central do Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade São Paulo foram empregados semanalmente
neste modelo experimental para manutenção in vivo das células tumorais de Walker
256 no peritônio. Os animais foram alocados, em grupos de no mínimo três animais,
em caixa de polietileno com medidas de 40 x 60 x 18 cm, sendo mantidos no
Biotério do Departamento de Farmacologia, para a devida ambientação , durante
três dias; que antecederam o início do experimento; sob condições padrão de
higiene, com ciclo de luz de 12h/dia, temperatura e umidade constantes, ruído
mínimo e água e ração ad libitum.
4.1.2 Procedência das células tumorais de Walker 256
A linhagem do tumor de Walker 256 foi cedida gentilmente pela Profa. Dra.
Marília Cerqueira Leite Seelaender responsável do Laboratório do Metabolismo e
Câncer do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade São Paulo para o Laboratório de
Farmacologia e Terapêutica Experimental do Departamento de Farmacologia do
59
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade São Paulo, com finalidade do
estabelecimento e manutenção in vivo da mesma linhagem no laboratório para o
emprego nesta pesquisa.
As células tumorais de Walker 256 foram recebidas em vials criogênicos
correspondendo a uma alíquota de dois mL do líquido hemorrágico peritoneal numa
concentração final de 5x107 células TW 256/ml. Os vials criogênicos foram
estocados e mantidos em condições de congelamento sob nitrogênio líquido antes
do início do procedimento experimental. A manutenção das células tumorais de
Walker 256 foi realizada semanalmente através de transplantação de animais numa
concentração de 2x107 células TW 256/ml.
4.1.3 Materiais e Reagentes
A metodologia empregada utilizou de materiais e reagentes que foram
devidamente documentados para a realização do procedimento operacional padrão.
Materiais
Material cirúrgico de inox: pinça dente de rato, tesoura de ponta curva e de ponta
reta;
Algodão e gazes descartáveis para curativos;
Seringas descartáveis de 3 mL, BD Plastipack; Brasil
Seringas descaráveis de insulina de 1 mL BD Plastipack; Brasil
Agulhas descartáveis 0.45x13 26G ½, BD Precision Glide;Brasil
Agulhas descartáveis 0.70x25 22G 1, BD Precision Glide;Brasil
Eppendorfs; Unilab, São Paulo; Brasil
Pipetas ajustáveis (2, 20, 200, 1000 e 5000 L) Gilson DistrimanT.M
; France
Ponteiras descartáveis de plástico na cor branca (1-20 L); amarela (1-200 L) e
azul (200 – 1000 L), Unilab, São Paulo; Brasil
Proveta volumétrica graduada com volume de 100 mL, Laborglass ; Brasil
Tubos tipo Falcon graduado com volume de 50 mL; SPLabor; Brasil
Pipeta Pasteur descartável de vidro de 230 mm, Bioline; Brasil
Câmara de Neubauer e lamínula de vidro; Ciencor Scientific; Brasil
60
Contador de células manual;
pH-metro Quimis, modelo Q400P, part n.610874; USA
Microscópio Biológico Binocular – E200 – Nikon, Nikon Corpotation
Sistema de Laser de baixa potência, Thera lase, DMC®, São Carlos, Brasil.
Reagentes e soluções
Fosfato monossódico mono-hidratado (NaH2PO4 . 1H2O), Sigma-Aldrich
Fosfato dissódico hepta-hidratado (Na2HPO4 . 7H2O), Sigma-Aldrich
Cloreto de Sódio (NaCl), Merck
EDTA dissódico, Sigma - Aldrich
Azul de Tripan, Merck
Água Deionizada (Sistema Milli-Q ou Elga UHQ)
Solução Fisiológica – NaCl 0.9%
Solução de Tampão Fosfato 0.1mM pH= 7.4
Solução de EDTA dissódico 5%
Solução de Azul de Tripan 0.4%
Solução de azul de metileno 3%
A solução de Azul de Metileno 3% foi cedida gentilmente pelo Prof. Dr.
Maurício S. Baptista responsável pelo laboratório de cinética rápida e fototermia do
Departamento de Bioquímica do Instituto de Quimica da Universidade São Paulo
Preparo das Soluções
Todas as soluções preparadas foram acondicionadas a + 4C em tubos tipo
falcom e devidamente identificados com a concentração final da solução obtida, bem
como a sua data de preparo.
Solução Fisiológica - NaCl 0.9%
Solução Fisiológica foi preparada dissolvendo 81,82 g de Cloreto de Sódio
(NaCl) em 1L de água deionizada, obtendo uma concentração final de 0,9 g/mL.
61
Solução de Tampão Fosfato (PBS) 0.1mM pH = 7,4
Para a solução de tampão fosfato (PBS), primeiramente foi preparada a
Solução A dissolvendo 27,8 g do Fosfato monossódico mono-hidratado (NaH2PO4
1H2O) em 1 L de água deionizada, obtendo uma concentração final de 0,028 g/mL
ou 0,2 Molar de NaH2PO4, Depois foi preparado a Solução B dissolvendo 53,65 g de
Fosfato dissódico hepta-hidratado (Na2HPO4 . 7H2O) em 1 L de água deionizada,
obtendo uma concentração de 0,054 g/mL ou 0,2 Molar de (Na2HPO4 . 7H2O). A
solução de tampão fosfato (PBS) foi então preparada transferindo 19 mL da Solução
A e 81 mL da Solução B para uma proveta graduada de 200 mL , em seguida o
volume final foi completado Solução Fisiológica 0,9%. Ajustar o pH = 7,4 se
necessário.
Solução de EDTA dissódico 5%
A solução de EDTA dissódico (Ácido Etilenodiamino dissódico) foi preparada
dissolvendo 5 g do reagente em 100 mL de Solução Fisiológica, obtendo uma
concentração final de 0,05 g/mL.
Solução salina de Azul de Tripan 0,4%
A solução de Azul de Tripan foi preparada dissolvendo 0,4 g do reagente em
100 mL de Solução Fisiológica, obtendo uma concentração final de 0,004 g/mL.
Solução de Azul de Metileno
As diferentes concentrações de azul de metileno 0.1%, 0.3% e 1.0% foram
preparadas a partir da solução primária de azul de metileno na concentração de 3%
utilizando a seguinte equação:
C
A.M 3% x V
A.M 3% = Cfinal x V
final
Onde:
CA.M 3%
= Concentração da solução primária de azul de metileno
VA.M 3%
= volume a ser pipetado da solução primária de azul de metileno
62
Cfinal
= Concentração final da solução de azul de metileno
Vfinal
= volume final da solução de azul de metileno
4.1.4 Obtenção do Tumor de Walker 256 Intraperitoneal
Após o desenvolvimento da ascite, os animais foram eutanaziados em câmara
de CO2. Após a eutanazia, realizou-se uma laparotomia para a exposição da
cavidade abdominal do animal. O líquido hemorrágico presente na cavidade
abdominal foi coletado através de uma pipeta descartável de 5 mL e transferido para
um tubo tipo falcom de 50 mL contendo previamente 1 mL da solução de EDTA 5%,
dessa forma, obtendo o líquido ascítico do Tumor de Walker 256.
Contagem das células viáveis do Tumor de Walker 256
A contagem das células viáveis do Tumor de Walker 256 foi realizada por meio
de leitura no quadrante central da câmara de Neubauer utilizando o método de
exclusão do Azul de Tripan, com o emprego de um microscópio óptico no aumento
de 400 vezes e um contador de células manual. Para a realização da contagem
celular, primeiro foram preparadas as diluições das células tumorais de Walker 256
de acordo com o seguinte procedimento:
a) Pipetar 1L do tumor ascítico e transferir para um eppendorf contendo 999
L de solução tampão fosfato (PBS), obtendo a Solução A com fator de diluição
1000.
b) Pipetar 50 L da Solução A para outro eppendorf e adicionar 50 L da Solução
de Azul de Tripan 0,4%, obtendo assim a Solução B com fator de diluição 2
c) Pipetar 50 L da Solução B e preencher com este volume o espaço entre a área
espelhada da câmara de Neubauer e a lamínula de vidro.
A contagem das células tumorais de Walker 256 foi determinada através da
seguinte equação:
Concentração de células / mL = n de células contadas x 1.000 x 2 x 104
63
Onde:
fator de diluição da Solução A = 1.000
fator de diluição da Solução B = 2
contagem na câmara de Neubauer = 104
4.1.5 Protocolo de implantação das células do Tumor de Walker 256 nos animais
Preparo da solução de inoculação
A solução de inoculação das células do Tumor de Walker 256 foi preparada
numa concentração final de 1x107células/mL em solução tampão fosfato (PBS) a
partir da solução do tumor ascítico com sua concentração previamente determinada
através do procedimento de contagem e utilizando a seguinte equação:
CTA
x VTA = CD
x VD
Onde:
CTA
= Concentração do tumor ascítico (n de células x 107/mL)
VTA
= volume do tumor ascítico em mL
CD= Concentração de 1 x 10
7/mL da diluição em solução tampão fosfato (PBS)
VD= volume da diluição correspondente
Procedimento de implantação via subcutânea das células do Tumor de
Walker 256 nos animais
Para o procedimento de implantação do Tumor de Walker 256, todos os animais
foram previamente anestesiados por via inalatória com halotano na dose de
1mg/mL. Durante a anestesia, a implantação do tumor nos animais foi realizada
através da inoculação de 1 mL via subcutânea (s.c) da suspensão de células do
Tumor de Walker 256 na concentração de 1 x 106/mL, na região dorsal, empregando
a técnica clássica de “Air Pouch”. Após o procedimento, os animais retornaram ao
biotério, os quais foram mantidos em observação para a avaliação do
desenvolvimento da massa tumoral sólida.
64
4.1.6 Estudo de Sobrevida: Emprego do Azul de Metileno no Modelo
Experimental do Tumor de Walker 256
Protocolo de tratamento com Azul de Metileno na massa sólida do Tumor
de Walker 256.
Após o período de avaliação de 14 dias do crescimento da massa tumoral
sólida, os animais foram randomizados em cinco grupos com n=5, conforme
apresentado a Tabela 1 a seguir.
Tabela 1 - Esquema dos Grupos Experimentais
Tratamento dos grupos
n=5
Salina
NaCl
0.9% (mL)
Azul de Metileno
Dose
(mg/mL)
Controle 0.1 -
Azul de Metileno 0.1% - 1
Azul de Metileno 0.3% - 3
Azul de Metileno 1.0% - 10
Azul de Metileno 3.0% - 30
Os animais foram previamente anestesiados por via inalatória com halotano na
dose de 1 mg/mL. O procedimento do tratamento foi realizado sob anestesia, que
consistiu na administração intratumoral de 0,1 mL de salina para grupo controle e
0,1 mL de azul de metileno nas concentrações de acordo com os seus respectivos
grupos tratados em seis pontos diferentes da massa tumoral, compreendendo no
total de 3 tratamentos em dias alternados.
Após o procedimento, os animais retornaram ao biotério, os quais foram
mantidos em observação para a avaliação da sobrevida, por um período de 30 dias
a partir do primeiro dia de tratamento.
65
Análise Estatística
Os dados da sobrevida foram analisados com o emprego do teste Kaplan-Meier
(KM) que é um método não-paramétrico utilizado para a estimação da curva de
sobrevivência, até a ocorrência de algum evento de interesse (morte, por exemplo).
Para comparar as curvas de sobrevivência entre os diferentes grupos tratados,
foram utilizados os testes Log-rank (Mantel Cox), Log-rank for trend e Gehan-
Breslow-Wilcoxon. As medidas de mediana para a variável tempo (dias) foram
calculadas por interpolação utilizando-se as informações das estimativas da
sobrevivência O software estatístico empregado foi o GraphPad Prism Version 5.0
(Graph Pad Software Inc.). O nível de significância foi ajustado para p ≤ 0,05.
4.1.7 Protocolos de tratamento da Curva Dose-Resposta do Azul de Metileno e do Laser no Modelo Experimental do Tumor de Walker 256
Protocolo de tratamento com Azul de Metileno na massa sólida do Tumor
de Walker 256
Após o período de avaliação de 14 dias do crescimento da massa tumoral
sólida os animais foram randomizados em quatro grupos com n=5, conforme
apresentado a Tabela 2 à seguir.
Tabela 2 - Esquema dos Grupos Experimentais
Tratamento dos grupos
n=5
Salina
NaCl
0.9% (mL)
Azul de Metileno
Dose
(mg/mL)
Controle 0.1 -
Azul de Metileno 0.1% - 1
Azul de Metileno 0.3% - 3
Azul de Metileno 1.0% - 10
Azul de Metileno 3.0% - 30
66
Os animais foram previamente anestesiados por via inalatória com halotano
na dose de 1mg/mL. O procedimento do tratamento foi realizado sob anestesia, que
consistiu na administração intratumoral de 0,1mL de salina para grupo controle e 0,1
mL de azul de metileno nas concentrações de acordo com os seus respectivos
grupos tratados em seis pontos diferentes da massa tumoral, compreendendo no
total de 3 tratamentos em dias alternados. Após 24 horas do último tratamento,
todos os animais foram previamente anestesiados por via inalatória com halotano na
dose de 1mg/mL para a coleta do material biológico e posteriormente foram
eutanaziados através do deslocamento cervical.
Durante o procedimento de retirada do material biológico os animais foram
mantidos sob anestesia sendo os quais foram coletados amostras de sangue obtidas
através de uma punção na veia porta hepática e amostras de tecido vivo da massa
tumoral sólida.
Após o procedimento, as amostras de sangue foram centrifugadas durante 15
minutos a 4000 rpm para a obtenção do plasma. Todas as amostras do material
biológico, plasma e tecido da massa tumoral sólida foram acondicionadas em tubos
tipo eppendorf de 2 mL devidamente identificados, armazenados e mantidos em bio-
freezer nas condições de temperatura de -80 °C para posterior análise do perfil
toxicológico e dos mediadores inflamatórios no desenvolvimento e progressão do
Tumor de Walker 256.
Protocolo de tratamento com Laser na massa sólida do Tumor de Walker
256
Para o procedimento do protocolo de tratamento com laser, um sistema de laser
de baixa potência – Thera Lase / DMC® Brasil equipado com um terminal de saída
do laser acoplado ao cabo de fibra óptica, responsável pela transmissão da luz do
laser, foram utilizados.
O tempo de irradiação é variável para cada energia apresentada, de acordo com
a seguinte fórmula de Densidade de Energia (DE):
DE= E/A ou DE= P * t / A
67
Onde:
DE= densidade de energia
E= energia em J(Joules)
P= potência (Watts)
A= área (cm2)
t = tempo (segundos)
Após o período de avaliação de 14 dias do crescimento da massa tumoral
sólida os animais foram randomizados em quatro grupos com n=5, conforme
apresentado a Tabela 3 à seguir.
Tabela 3 - Esquema dos Grupos Experimentais
Tratamento dos
grupos
n=5
Dose
Energia
(J/cm2)
Energia
J (Joules)
Potência
(mwatts)
Área de
Aplicação
(cm2)
Tempo
(segundos)
Controle - - - - -
Laser 1J 33,5 1 100 1 10
Laser 3J 100 3 100 1 30
Laser 6J 200 6 100 1 60
Os animais foram previamente anestesiados por via inalatória com halotano na
dose de 1 mg/mL. O procedimento do tratamento com Laser foi realizado com
anestesia, onde a massa tumoral sólida foi irradiada em quatro pontos eqüidistantes
no comprimento de onda de 660 nm com uma energia de 1 J/cm2 e na potência de
100 mW de acordo com os seus respectivos grupos de tratamento em diferentes
doses de energia, compreendendo no total de 3 tratamentos em dias alternados.
Após 24 horas do último tratamento, todos os animais foram previamente
anestesiados por via inalatória com halotano na dose de 1 mg/mL para a coleta do
material biológico e posteriormente foram eutanaziados através do deslocamento
cervical. Durante o procedimento de retirada do material biológico os animais foram
mantidos sob anestesia, sendo os quais foram coletados amostras de tecido vivo da
massa tumoral sólida.
68
Após o procedimento, todas as amostras do tecido da massa tumoral sólida
foram acondicionadas em tubos tipo eppendorf de 2 mL devidamente identificados,
armazenados e mantidos em bio-freezer nas condições de temperatura de -80°C
para posterior análise do perfil hepático no protocolo de tratamento do azul de
metileno na massa tumoral sólida e dos mediadores inflamatórios no
desenvolvimento e progressão do Tumor de Walker 256.
4.1.8 Estudo de Sobrevida: Emprego do Azul de Metileno na concentração
de 0.1% e Laser no Modelo Experimental do Tumor de Walker 256
Protocolo de tratamento com Azul de Metileno na concentração de 0.1% e
Laser na massa sólida do Tumor de Walker 256
Para o procedimento com aplicação de laser, um sistema de laser de baixa
potência – Thera Lase / DMC® Brasil foi utilizado equipado com um terminal de saída
do laser acoplado ao cabo de fibra óptica, responsável pela transmissão da luz do
laser, foram utilizados.
O tempo de irradiação é variável para cada energia apresentada, de acordo com
a seguinte fórmula de Densidade de Energia (DE):
DE= E/A ou DE= P * t / A
Onde:
DE= densidade de energia
E= energia em J(Joules)
P= potência (Watts)
A= área (cm2)
t = tempo (segundos)
Após o período de avaliação de 14 dias do crescimento da massa tumoral
sólida os animais foram randomizados em quatro grupos com n=5, conforme
apresentado a Tabela 4 à seguir.
69
Tabela 4 - Esquema dos Grupos Experimentais
Tratamento dos
grupos
n=5
Salina
NaCl
0.9%
(mL)
Azul de
Metileno
Dose
(mg/mL)
Dose
Energia
(J/cm2)
Energia
(Joules)
Potência
(mwatts)
Área de
Aplicação
(cm2)
Tempo
(s)
Controle 0.1 - - - - - -
AM 0.1% + Laser 1J - 1 33,5 1 100 1 10
A.M 0.1% + Laser 3J - 1 100 3 100 1 30
A.M 0.1% + Laser 6J - 1 200 6 100 1 60
A.M, Azul de Metileno; s, segundos ; J, Joules.
Os animais foram previamente anestesiados por via inalatória com halotano
na dose de 1mg/mL. O procedimento do tratamento foi realizado sob anestesia, que
consistiu na administração intratumoral de 0,1 mL de salina para grupo controle e
0,1 mL de azul de metileno na concentração de 0,1% de acordo com os seus
respectivos grupos tratados em seis pontos diferentes da massa tumoral. Após uma
hora do tratamento com o azul de metileno, a massa tumoral sólida foi irradiada em
quatro pontos equidistantes no comprimento de onda de 660 nm com uma energia
de 1J/cm2 e na potência de 100 mW de acordo com os seus respectivos grupos de
tratamento em diferentes doses de energia, compreendendo no total de três
tratamentos em dias alternados.
Após o procedimento, os animais retornaram ao biotério, os quais foram mantidos
em observação para a avaliação da sobrevida, por um período de 30 dias a partir do
primeiro dia de tratamento.
Análise Estatística
Os dados da sobrevida foram analisados com o emprego do teste Kaplan-
Meier (KM) que é um método não-paramétrico utilizado para a estimação da curva
de sobrevivência, até a ocorrência de algum evento de interesse (morte, por
exemplo). Para comparar as curvas de sobrevivência entre os diferentes grupos
tratados, foram utilizados os testes Log-rank (Mantel Cox), Log-rank for trend e
Gehan-Breslow-Wilcoxon. As medidas de mediana para a variável tempo (dias)
70
foram calculadas por interpolação utilizando-se as informações das estimativas da
sobrevivência O software estatístico empregado foi o GraphPad Prism Version 5.0
(Graph Pad Software Inc.). O nível de significância foi ajustado para p ≤ 0,05.
4.1.9 Protocolo de tratamento do Azul de Metileno na concentração de 0.1%
e Laser no Modelo Experimental do Tumor de Walker 256
Protocolo de tratamento com Azul de Metileno na concentração de 0.1% e
Laser na massa sólida do Tumor de Walker 256
Para o procedimento com aplicação do laser, um sistema de laser de baixa
potência – Thera Lase / DMC® Brasil dói utilizado equipado com um terminal de
saída do laser acoplado ao cabo de fibra óptica, responsável pela transmissão da luz
do laser, foram utilizados.
O tempo de irradiação é variável para cada energia apresentada, de acordo
com a seguinte fórmula de Densidade de Energia (DE):
DE= E/A ou DE= P * t / A
Onde:
DE= densidade de energia
E= energia em J(Joules)
P= potência (Watts)
A= área (cm2)
t = tempo (segundos)
Após o período de avaliação de 14 dias do crescimento da massa tumoral
sólida os animais foram randomizados em quatro grupos com n=5, conforme
apresentado a Tabela 5 á seguir.
71
Tabela 5 - Esquema dos Grupos Experimentais
Tratamento dos
grupos
n=5
Salina
NaCl
0.9%
(mL)
Azul de
Metileno
Dose
(mg/mL)
Dose
Energia
(J/cm2)
Energia
(Joules)
Potência
(mwatts)
Área de
Aplicação
(cm2)
Tempo
(s)
Controle 0.1 - - - - - -
AM 0.1% + Laser 1J - 1 33,5 1 100 1 10
A.M 0.1% + Laser 3J - 1 100 3 100 1 30
A.M 0.1% + Laser 6J - 1 200 6 100 1 60
A.M, Azul de Metileno; s, segundos; J, Joules.
Os animais foram previamente anestesiados por via inalatória com halotano
na dose de 1 mg/mL. O procedimento do tratamento foi realizado sob anestesia, que
consistiu na administração intratumoral de 0,1 mL de salina para grupo controle e
0,1 mL de azul de metileno na concentração de 0.1% de acordo com os seus
respectivos grupos tratados em seis pontos diferentes da massa tumoral,
compreendendo no total de 3 tratamentos em dias alternados. Uma hora após do
tratamento com azul de metileno, a massa tumoral sólida foi irradiada em quatro
pontos eqüidistantes no comprimento de onda de 660 nm com uma energia de
1J/cm2 e na potência de 100 mW de acordo com os seus respectivos grupos de
tratamento em diferentes doses de energia, compreendendo no total de 3
tratamentos em dias alternados.
Após 24 horas do último tratamento, todos os animais foram previamente
anestesiados por via inalatória com halotano na dose de 1mg/mL para a coleta do
material biológico e posteriormente foram eutanaziados através do deslocamento
cervical. Durante o procedimento de retirada do material biológico os animais foram
mantidos sob anestesia, sendo os quais foram coletados amostras de tecido vivo da
massa tumoral sólida.
Após o procedimento, todas as amostras do tecido da massa tumoral sólida
foram devidamente acondicionadas e identificadas em tubos tipo eppendorf de 2 mL
devidamente identificados, armazenados e mantidos em bio-freezer nas condições
de temperatura de -80 °C para posterior análise no protocolo de tratamento do azul
de metileno na concentração 0.1% e Laser na massa tumoral sólida dos mediadores
inflamatórios no desenvolvimento e progressão do Tumor de Walker 256. Amostras
72
de tecido da massa tumoral sólida também foram coletadas e devidamente
acondicionadas e identificadas em recipientes do tipo coletor universal contendo
uma solução de formol a 10% com volume suficiente para cobrir a amostra do
material biológico para posterior análise histológica.
4.2 Avaliações do Perfil Hepático no Protocolo de Tratamento do Azul de
Metileno na Massa Tumoral sólida
A determinação dos níveis de Aspartato Amino Transferase (AST ou TGO),
Alanina Amino Transferase (ALT ou TGP) e Gama GT nas amostras de plasma
sanguíneo foram realizadas pelo método enzimático, ou seja, teste cinético,
seguindo as instruções do fabricante do kit comercial (Bioclin, Brasil).
Para a quantificação de Aspartato Amino Transferase (AST ou TGO) e
Alanina Amino Transferase (ALT ou TGP) em uma placa de 96 poços pipetar 100 μl
de cada amostra em cada poço e depois adicionar 1mL do Reagente de Trabalho. A
leitura foi realizada em espectrofotômetro Espectra Max plus 384 (Sunnyvale, CA,
EUA) em comprimento de onda de 340nm, 37 °C, fazendo uma leitura inicial,
disparando simultaneamente o cronômetro e repetir as leituras após 1, 2 e 3
minutos. Após as leituras, calcular a média das diferenças de absorção por minuto
(ΔA/min.) e utilizando o seguinte cálculo.
AST e ou ALT (U/L) 340nm = ΔA/min. X 1746
Sendo que os resultados são expressos em U/L e posteriormente convertidos
em U/mL
Para a quantificação de Gama Glutamil Transferase (gama GT), em uma placa
de 96 poços pipetar 50 μl de cada amostra em cada poço e depois adicionar 1 mL
do Reagente de Trabalho. A leitura foi realizada em espectrofotômetro Espectra Max
plus 384 (Sunnyvale, CA, EUA) em comprimento de onda de 405 nm, 37 °C, fazendo
uma leitura inicial, disparando simultaneamente o cronômetro e repetir as leitura
após 1, 2 e 3 minutos. Após as leituras, calcular a média das diferenças de absorção
por minuto (ΔA/min.) e utilizando o seguinte cálculo.
Gama GT(U/L) 405nm = ΔA/min. X 2121
73
Sendo que os resultados são expressos em U/L e posteriormente convertidos
em U/mL
4.3 Avaliações dos níveis de citocinas na massa tumoral sólida
Após as amostras do tecido da massa tumoral sólida serem homogeneizadas por
meio de um homogeneizador tipo mix Dremel® 300 (Racine, WI, USA), o conteúdo
proteico presente no sobrenadante foi determinado pelo método de Bradford (1976),
empregando o kit comercial (Bio Rad, USA) e albumina de soro bovino para a
construção da curva padrão.
As dosagens das citocinas TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10 nas amostras de tecido
tumoral foram realizadas pelo teste imunoenzimático (ELISA), seguindo instruções
do kit comercial (R&D System, EUA). Para isto, placas de 96 poços foram
sensibilizadas com 100 μL de anticorpo monoclonal para cada citocina: anti-IL1β e
IL-6 foram diluídos em tampão carbonato de sódio (0,1M, pH 9,6), enquanto anti IL-
10 e TNF-α foram diluídos em tampão fosfato de sódio (0,2 M, pH 6,5). As placas
foram incubadas (4 ºC) por 18 h. Para o bloqueio, as placas foram lavadas com
PBST (solução PBS contendo 0,05% de Tween 20) por 4 vezes e depois
preenchidas com 300 μl/poço de solução de bloqueio (3 % gelatina em PBST,
Sigma) à 37 ºC por 3 horas e submetidas a novo ciclo de lavagens. A seguir, 100 μL
das amostras devidamente diluídas ou dos padrões das citocinas recombinantes
foram adicionados à placa e deixadas por 18 h em temperatura de 4 ºC. Após
lavagem, 100 μL dos respectivos anticorpos biotinilados específicos de detecção
para cada citocina foram acrescentados e deixados por 1 h em temperatura
ambiente. Após lavagem das placas, o volume de 100 μL de estreptavidina –
peroxidase foi adicionado e deixado por 1 h em temperatura ambiente (22 ºC)
seguida de novas lavagens. A reação foi revelada pela adição de 100 μL/poço da
solução de 3.3’5.5’ tetrametilbenzidina (TMB) e interrompida pela adição de 50
μl/poço de ácido sulfúrico (2 N). A leitura foi realizada em espectrofotômetro
Espectra Max plus 384 (Sunnyvale, CA, EUA) em comprimento de onda de 450nm
com correção a 570 nm. As concentrações das amostras foram calculadas a partir
das curvas-padrão obtidas com as citocinas recombinantes utilizando o programa de
aquisição de dados SOFTmax Pro Version 3.1.2 (Molecular Devices Corp, USA) do
espectrofotômetro Espectra Max plus 384 .
74
O limite de detecção para IL-1β, IL-10 e TNF-α foi de 1.95 pg/mL, enquanto
para IL-6 foi de 15.6 pg/mL.
4.4 Análises de expressão gênica dos marcadores inflamatórios na massa
tumoral sólida pela reação em cadeia da polimerase após transcrição
reversa em tempo real (real time RT-PCR)
A expressão gênica da enzima COX-1, COX-2. iNOS e eNOS foram
quantificadas pela reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Uma
biópsia massa tumoral, foi removida e imediatamente congelada em nitrogênio
líquido e mantido a -80 ºC até o processamento. O RNA total foi extraído usando o
reagente Trizol (Gibco BRL, EUA) de acordo com instruções do fabricante.
Posteriormente o RNA isolado, foi dissolvido em água tratada com PEPC foi
quantificado por método de espectrofotometria no comprimento de onda de 260nm,
verificando a razão entre 260/280. A análise da sua integridade foi verificada através
de eletroforese em gel de agarose contendo brometo de etídio, para a revelação das
bandas sob luz ultravioleta (UV). Após tratamento com DNAse, a síntese dos cDNAs
foram processadas pelo método da transcriptase reversa empregando a enzima
SuperScript (Invitrogen) a partir de 2 g de RNA total e na presença de mistura de
primers randômicos e oligo dT, incubando a 42 C por 50 minutos para otimizar a
reação de transcriptase reversa e posteriormente, inativando a enzima incubando a
70 C por 15 minutos. Os experimentos de Real-Time PCR foram programados da
seguinte maneira: 1 ciclo de desnaturação inicial de 10 min a 95 °C, e 40 ciclos de
amplificação (30 seg de desnaturação a 95 C e 1 min de anelamento e extensão a
60 C); as sequências dos primers que foram utilizados constam no trabalho de
Ferraz et al. (2004) . Os resultados foram interpretados usando a fórmula 2-Ct
(Ct: número de ciclos necessários para atingir o limiar de fluorescência acima do
valor de fundo - background) que relaciona a expressão do gene de interesse
comparado aquela do gene endógeno de controle HPRT (Hypoxanthine
Phosphoribosyltransferase).
As sequências dos primers utilizados neste trabalho são apresentados na
Tabela 6 conforme as referências utilizadas para a correta seleção durante os
experimentos.
75
Tabela 6 – Sequência de Primers empregados na análise da expressão de mRNA, pela
técnica RT-PCR em tempo real.
4.5 Determinação da Prostaglandina E2 na massa tumoral sólida
Para análise de prostaglandina E2 (PGE2), logo após a coleta, as amostras de
tecido foram armazenadas em freezer a -80 °C até o momento de sua
homegenização. A quantificação dos níveis de PGE2 foi feita através de um kit
comercial (Prostaglandin E2 EIA – Monoclonal; Cayman Chemicon, EUA). De acordo
com instruções do fabricante, as amostras foram homogeneizadas em 5 ml de
tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH7,4 contendo EDTA 1 mM e indometacina 10 M,
para cada 1 g de tecido. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 3000 g por
10 min a 4 C e o sobrenadante foi purificado utilizando-se colunas de extração C-18
(Waters, EUA). Primeiramente, o sobrenadante foi acidificado (50 L de HCl 2 M
para 1 mL de sobrenadante, ~pH 3,5) e em seguida, as amostras foram
centrifugadas novamente a 10.000 g por 10min a 4 °C. As colunas C-18 foram
previamentes preparadas passando-se 2 mL de metanol seguidos de 2 mL de água
deionizada. As amostras foram aplicadas vagarosamente às colunas C-18 e lavadas
com 2 ml de água deionizada e depois com 2 L de hexano. O eluído foi descartado e
a coluna foi seca. O conteúdo de PGE2 das amostras foram eluídos com 4 mL de
acetato de etila. Esse conteúdo foi evaporado usando-se gás nitrogênio. A amostra
foi ressuspendida adicionando-se 500 l de “EIA Buffer”.
Primer Forward/ Sense/ Left Reverse/ Anti-Sense/ Right Referência
HPRT AAG CTT GCT GGT GAA AAG GA TGA TTC AAA TCC CTG AAG TGC Bustin S.A.,
1997
COX-1 GCAGCTCTTCCAGACCACTC GCTGCAGGAAATAGCCACTC Ferraz et al.,
1997
COX-2 TGAGCACAGGATTTGACCAG CCTTGAAGTGGGTCAGGATG Ferraz et al.,
1997
iNOS GGATATCTTCGGTGCGGTCTT GCTGTAACTCTTCTGGGTGTCAGA Ferraz et al.,
1997
eNOS TTCTGGCAAGACCGATTACACGAC
AT
AAAGGCGGAGAGGACTTGTCCAA
A
Ferraz et al.,
1997
76
O método de dosagem dos níveis de PGE2 é baseado na competição entre a
PGE2 da amostra e um conjugado de PGE2-acetilcolinesterase (PGE2 Tracer) para
uma quantidade de anticorpo monoclonal de PGE2.
Para tal, amostras e curva padrão de PGE2 (com concentrações que variaram
de 7,8 a 1.000 pg/ml) foram aplicadas em placa pré-tratada com anticorpo IgG
policlonal anti-camundongo, juntamente com anticorpo monoclonal de PGE2 e tracer,
durante 18 horas a 4 °C. Em seguida, a placa foi lavada 4 vezes com 200 µl de
solução “wash buffer” e, incubada na presença de solução substrato “Ellman´s
reagent”. A leitura das absorbâncias geradas a cada 15 s foi realizada em
espectrofotômetro Espectra Max plus 384 (Sunnyvale, CA, EUA) em comprimento de
onda de 405 nm durante 1 hora. Os resultados foram obtidos através do emprego do
programa de aquisição de dados SOFTmax Pro Version 3.1.2 (Molecular Devices
Corp, USA) do espectrofotômetro Espectra Max plus 384 e expressos em ng
PGE2/g de tecido.
4.6 Avaliações da Peroxidação Lipídica na massa tumoral sólida pelo Método
de TBARS
O teste do ácido tiobarbitúrico (TBA) é uma das técnicas mais usadas para a
medida de aldeídos resultantes de peroxidação de lipídios de membranas e ácidos
graxos. Trata-se de um método simples descrito por Draper e colaboradores (1993)
e que consiste na formação de um cromóforo entre o MDA (malonalaldeído) e o TBA
com máximo de absorbância a 535 nm.
As amostras da massa tumoral sóilida foram pesadas e homogeneizadas em
tampão fosfato de potássio 0.1 M (pH 7,4 Mallinckrodt AR, México) na proporção de
5 mL de tampão para cada 1 g de tecido. Duzentos microlitros de homogenato foram
misturados a 400 L de uma solução que continha: ácido tricloroacético 15% (Merck,
Alemanha), ácido tiobarbitúrico 0,37% (Merk, Alemanha) e ácido clorídrico 0.25 N
(Mallinckrodt AR, México), e incubadas durante 45 minutos a 90 oC. Os tubos foram
centrifugados durante 15 minutos a 2000 g e a absorbância de 200 L do
sobrenadante foram lidas a 535 nm e corrigidas a 570 nm em um leitor de Elisa
(Spectramax plus 384, E.U.A.).
77
Nos brancos de reação, a amostra foi substituída pelo tampão fosfato. Os
resultados foram expressos em nmol de aldeído formado / mg de proteína, utilizando
o programa de aquisição de dados SOFTmax Pro Version 3.1.2 (Molecular Devices
Corp, USA) do espectrofotômetro Espectra Max plus 384 através do cálculo do
coeficiente de extinção molar do produto resultante da reação do TBA com o MDA
1,55 M-1 cm-1.
4.7 Análises da atividade da Mieloperoxidade (MPO)
A presença de neutrófilos foi avaliada pela dosagem da atividade da
mieloperoxidase (MPO), sendo considerado um marcador específico da presença
deste tipo celular. Portanto, avaliou-se a atividade desta enzima como um indicador
da presença e da quantidade de neutrófilos presentes na massa tumoral sólida. O
método da medida da atividade da MPO baseia-se na velocidade de oxidação do
substrato o-dianisidina na presença da água oxigenada, que é evidenciada pela
mudança da absorbância medida por espectrofotometria a 460 nm.
Após o procedimento de anestesia nos animais, foi retirada amostras do
tecido da massa tumoral sólida e transferidas para um tubo tipo eppendorf de 2 mL e
foi adicionado um volume correspondente 10x ao peso em gramas da massa da
amostra biológica, em seguida foi realizada homogenização através de um
homogeneizador tipo mix Dremel® 300 (Racine, WI, USA) durante 1 minuto. Os
tubos foram aquecidos durante 2h a 60 ºC em estufa, para a inativação da atividade
endógena da Catalase (Sato, et al., 2003), e então centrifugados a 12.000 g durante
2 minutos. Dez microlitros do sobrenadante foram pipetados em duplicatas em
microplaca de 96 poços e acrescidos com 200 microlitros de uma solução de tampão
fosfato de potássio (pH=6,0) contendo 0,164 mg/mL de dihidrocloreto de o-
dianisidina (Sigma Chemical Co., USA) e 0,0005% de peróxido de hidrogênio
(Merck, Alemanha). A mudança de absorbância a 460nm foi medida em um leitor de
microplacas (Espectra Max plus 384, USA) durante 10 minutos. Atividade da MPO
foi calculada a partir da velocodade máxima da reação por segundos utilizando o
programa de aquisição de dados SOFTmax Pro Version 3.1.2 (Molecular Devices
Corp, USA) do espectrofotômetro Espectra Max plus 384. Os resultados foram
expressos em Unidade (U) de MPO/peso da massa tumoral sólida, sendo que uma
78
unidade de MPO é definida como a quantidade em µmol de H2O2 degradado por
minuto.
4.8 Análises Histológicas
Após a fixação do tecido tumoral em uma solução de formol a 10%,por um
período mínimo de 24 horas, as peças foram lavadas e desidratadas em
concentrações crescentes de álcool por um período total de 12 horas. No dia
seguinte, as amostras de tecido tumoral foram diafanizadas com xilol por 2 horas,
trocando a solução de xilol mais uma vez e novamente deixa em repouso por mais 2
horas. Para impregnação do tecido, as peças foram então depositadas em um
recipiente de vidro com parafina liquida aquecida na estufa a 58 ºC por 2 horas.
Novamente foi trocado a solução de parafina líquida e foi deixada a peça
permenecer por mais 2 horas. Após a impregnação do corte histológico, este foi
colocado em um pequeno recipiente coberto com parafina fundida por inteiro e
deixando por endurecer, formando um bloco contendo o tecido.
Para a microtomia foram realizados cortes de 5 µm de espessura em
micrótomo LEICA RM 2125 RT Os cortes semi-seriados com espessura de 5µm
obtidos foram colocados em banho-maria a 40ºC para o posicionamento nas
lâminas, depois foram levados a estufa por no mínimo de 4 horas para posterior
reidratação e coloração com hematoxilina e eosina. Finalmente os cortes foram
cobertos com lamínulas em meio de montagem e observados sob microscopia
óptica e fotografados no aumento de100x, 400x e 1000x.
4.9 Análises Estatísticas
A análise estatística foi realizada através da ajuda com o emprego do
software Graph Pad Prism Version 5.0. Os dados foram expresssos como médias ±
EPM e submetidos à análise de variância (ANOVA) seguida da aplicação do teste
de Turkey-Kramer de comparação múltiplas. Valores de P<0,05 foram considerados
estatisticamente significativos.
79
5 RESULTADOS
5.1 Estudo de Sobrevida: Emprego do Azul de Metileno no Modelo
Experimental do Tumor de Walker 256
Os resultados da análise da sobrevida dos diferentes grupos tratados com
azul de metileno conforme apresentados na tabela 07, apresentaram valores do
tempo mediano de sobrevida de 30 dias para os grupos tratados com azul de
metileno nas concentrações de 0.1% e 0.3%, caracterizando uma probabilidade
maior de sobrevida, Em relação aos grupos tratados com azul de metileno nas
concentrações de 1.0% e 3.0%, apresentaram tempos medianos de sobrevida de 21
dias e 15dias, respectivamente, sendo semelhante o tempo mediano de sobrevida
do grupo controle e, portanto mantendo o mesmo padrão e a dinâmica do tempo de
sobrevida do Tumor de Walker 256 que varia de 15 a 20 dias quando implantado vis
subcutânea.
Na Tabela 08 são apresentados os resultados na análise do Teste para
igualdade das curvas estimadas de Kaplan- Meier, entre os diferentes grupos
tratados com azul de metileno, assim podemos observar que não houve diferença
estatisticamente significante (p< 0.9241 – Teste Long-rank e p< 0.6762 - Teste
Long-rank for trend) quando comparado com o grupo controle.
A Figura 01 apresenta os resultados da estimativa das curvas de
sobrevivência de Kaplan-Meier dos diferentes grupos tratados com azul de metileno
quando comparado com o grupo controle, podemos verificar que os grupos tratados
com azul de metileno nas concentrações de 0.1% e 0.3% mostraram uma maior
probabilidade de sobrevida quando comparado o grupo controle. Com relação aos
grupos tratados com azul de metileno nas concentrações de 1.0% e 3.0%
promoveram a mesma probabilidade de sobrevida quando comparados com o grupo
controle.
80
Tabela 07 – Resultados sumarizados da análise da sobrevida dos diferentes grupos
tratados. com azul de metileno e do grupo controle
Grupos
(n=5)
Controle
(salina)
Azul de
Metileno
0.1%
Azul de
Metileno
0.3%
Azul de
Metileno
1.0%
Azul de
Metileno
3.0%
Animais
censurados 1 2 1 1 1
Morte/evento 4 3 4 4 4
Sobrevida
Mediana
(dias)
20 30 30 21 15
Tabela 08 - Testes para a igualdade das curvas estimadas de Kaplan-Meier entre os
diferentes grupos tratados com azul de metileno e o grupo controle.
Teste Qui-Quadrado g.i Significância (P)
Long-rank 0.9035 4 0.9241
Longrank for
trend 0.1744 1 0.6762
g.i., grau de liberdade.
81
Figura 01 – Estimativa das curvas de Kaplan-Meier para os diferentes grupos tratados com
azul de metileno (A.M) e grupo controle. (A): Comparação das curvas estimativas de Kaplan-
Meier do grupo tratado azul de metileno 0.1% com grupo controle. (B): Comparação das
curvas estimativas de Kaplan-Meier do grupo tratado azul de metileno 0.3% com grupo
controle. (C): Comparação das curvas estimativas de Kaplan-Meier do grupo tratado azul de
metileno 1.0% com grupo controle. (D): Comparação das curvas estimativas de Kaplan-
Meier do grupo tratado azul de metileno 3.0% com grupo controle.
82
5.2 Avaliações do Perfil Hepátco no Protocolo de Tratamento do Azul de
Metileno na Massa Tumoral sólida
A tabela 09 mostra a correlação obtida entre as diferentes atividade
enzimáticas séricas de AST, ALT e Gama-GT nos diferente grupos tratados,onde os
dados são expressos pela média ± EPM (Erro Padrão da Média) com n=5.
A figura 02 representa a atividade enzimática sérica da ALT dos diferentes
grupos de tratamento do azul de metileno na massa tumoral sólida. Ao compararmos
as atividades enzimáticas da ALT para os diferentes grupos tratados com azul de
metileno em relação ao grupo controle observamos que não ocorreu nenhum
aumento estatisticamente significativo.
A figura 03 ilustra a atividade enzimática sérica da AST dos diferentes grupos
de tratamento do azul de metileno na massa tumoral sólida. Quando comparamos as
atividades enzimáticas da AST para os diferentes grupos tratados com azul de
metileno em relação ao grupo controle não observamos nenhum aumento
estatisticamente significativo.
A figura 04 representa a atividade enzimática sérica da Gama-GT dos
diferentes grupos de tratamento do azul de metileno na massa tumoral sólida.
Nenhum aumento estatisticamente significativo foi observado ao compararmos as
atividades da gama-GT para os diferentes grupos tratados com azul de metileno em
relação ao grupo controle.
83
Tabela 09 - Correlação entre as atividades enzimáticas séricas de AST, ALT e gama-GT
dos diferentes grupos tratados. Os dados são expressos pela média ± EPM, n=5.
Tratamento dos grupos
n=5
Salina
NaCl
0.9%
(mL)
Dose
(mg/mL)
ALT
(U/mL)
AST
(U/mL)
Gama-GT
(U/mL)
Controle 0.1 - 18.73 ± 2.53 65,17 ± 6.13 31.46 ± 6.44
Azul de Metileno 0.1% - 1 17.56 ± 4.83 68.61 ± 3.83 37.92 ± 5.04
Azul de Metileno 0.3% - 3 18.18 ± 3.67 55.50 ± 3.11 22.63 ± 4.48
Azul de Metileno 1.0% - 10 8.26 ± 2.14 68.57 ± 5.81 27.61 ± 2.21
Azul de Metileno 3.0% - 30 16.04 ± 2.02 56.01 ± 4.09 24.51 ± 1.97
ALT
Contr
ole
0.1%
AM
0.3%
AM
1.0%
AM
3.0%
AM
0
10
20
30
40
U/m
L
Figura 02 - Atividade enzimática sérica da ALT após o protocolo de tratamento para os
diferentes grupos experimentais. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05
quando comparado ao grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de
comparação múltipla).
84
AST
Contr
ole
0.1%
AM
0.3%
AM
1.0%
AM
3.0%
AM
0
40
80
120
U/m
L
Figura 03 - Atividade enzimática sérica da AST após o protocolo de tratamento para os
diferentes grupos experimentais. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05
quando comparado ao grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de
comparação múltipla).
Gama - GT
Contr
ole
0.1%
AM
0.3%
AM
1.0%
AM
3.0%
AM
0
15
30
45
60
U/m
L
Figura 04 - Atividade enzimática sérica da gama-GT após o protocolo de tratamento para
os diferentes grupos experimentais. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05
quando comparado ao grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de
comparação múltipla).
85
5.3 Estudo de Sobrevida: Emprego do Azul de Metileno na concentração de
0.1% e Laser no Modelo Experimental do Tumor de Walker 256
Os resultados da análise da sobrevida dos grupos tratados com azul de metileno
na concentração de 0.1% e laser nas diferentes energias conforme apresentados na
tabela 10, apresentaram valores do tempo mediano de sobrevida de 21 dias para os
grupos tratados com azul de metileno na concentração de 0.1% e laser na energia
de 1J, caracterizando uma probabilidade maior de sobrevida, Em relação aos grupos
tratados com azul de metileno na concentração de 0.1% e laser na energia de 3 e 6J
respectivamente, apresentaram tempos medianos de sobrevida de 6 dias, sendo
semelhante o tempo mediano de sobrevida do grupo controle e portanto mantendo o
mesmo padrão e a dinâmica do tempo de sobrevida do Tumor de Walker 256 que
pode variar até 20 dias quando implantado vis subcutânea.
Na Tabela 11 são apresentados os resultados na análise do Teste para
igualdade das curvas estimadas de Kaplan- Meier, entre os grupos tratados com
azul de metileno na concentração de 0.1% e laser nas diferentes energias, assim
podemos observar que não houve diferença estatisticamente significante (p< 0.6871
– Teste Long-rank e p< 0.6566 - Teste Long-rank for trend) quando comparado com
o grupo controle.
A Figura 05 apresenta os resultados da estimativa das curvas de sobrevivência
de Kaplan-Meier dos grupos tratados com azul de metileno na concentração de
0.1% e laser nas diferentes energias, quando comparado com o grupo controle,
podemos verificar que os grupos tratados com azul de metileno na concentração de
0.1% e laser na energia de 1J mostrou uma maior probabilidade de sobrevida
quando comparado o grupo controle. Com relação aos grupos tratados com azul de
metileno na concentração de 0.1% e laser na energia de 3J e 6J respectivamente,
promoveram a mesma probabilidade de sobrevida quando comparados com o grupo
controle.
86
Tabela 10 – Resultados sumarizados da análise da sobrevida dos grupos tratados com
azul de metileno na concentração de 0.1% e Laser nas diferentes energias e do grupo
controle
Grupos
(n=5)
Controle
(salina)
Azul de Metileno
0.1% + 1J
Azul de Metileno
0.1% + 3J
Azul de Metileno
0.1% + 6J
Animais
censurados 0 3 2 2
Morte/evento 5 2 3 3
Sobrevida
Mediana
(dias)
5 21 6 6
Tabela 11 - Testes para a igualdade das curvas estimadas de Kaplan-Meier entre os
grupos tratados com azul de metileno na concentração de 0.1% e laser nas diferentes
energias e o grupo controle.
Teste Qui-Quadrado g.i Significância (P)
Long-rank 1.479 3 0.6871
Longrank for
trend 0.1976 1 0.6566
g.i., grau de liberdade.
87
Figura 05 – Estimativa das curvas de Kaplan-Meier para os grupos tratados com azul de
metileno (A.M) na concentração de 0.1% e laser nas diferentes doses de energia e grupo
controle. (A): Comparação das curvas estimativas de Kaplan-Meier do grupo tratado azul de
metileno 0.1% e laser 1J com grupo controle. (B): Comparação das curvas estimativas de
Kaplan-Meier do grupo tratado azul de metileno 0.1% e laser 3J com grupo controle. (C):
Comparação das curvas estimativas de Kaplan-Meier do grupo tratado azul de metileno
0.1% e laser 6J com grupo controle.
88
5.4 Avaliações dos níveis das citocinas na massa tumoral sólida
As tabelas 12 e 13 ilustram os níveis dos diferentes marcadores do processo
inflamatório após o tratamento nas diferentes concentrações do azul de metileno no
tecido tumoral do Tumor de Walker 256 e também após o tratamento com irradiação
do Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido
tumoral do Tumor de Walker 256 Os dados são expressos pela média ± EPM, n=5.
A figura 06 representa os níveis de IL-1β dos diferentes grupos de tratamento
do azul de metileno na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno 0.1%, azul
de metileno 0.3%, azul de metileno 1.0% e azul de metileno 3.0%) 24 horas após o
último tratamento. Ao compararmos os níveis de IL-1 β para os diferentes grupos
tratados com azul de metileno em relação ao grupo controle, observamos que não
foi encontrada nenhuma diferença estatisticamente significativa.
Na figura 07 apresenta os níveis de IL-1β dos diferentes grupos de tratamento
do Laser no comprimento de onda de 660 nm na massa tumoral sólida (controle, 1J,
3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis de IL-1 β
para os diferentes grupos tratados com Laser observamos que ocorreu um aumento
estatisticamente significativo nos níveis de IL-1 β no grupo de 1J, quando
comparado ao grupo controle e aos grupos de 3J e 6J respectivamente.
Os níveis de IL-6 dos diferentes grupos de tratamento do azul de metileno na
massa tumoral sólida (controle, azul de metileno 0.1%, azul de metileno 0.3%, azul
de metileno 1.0% e azul de metileno 3.0%) 24 horas após o último tratamento são
apresentados na figura 08. Ao compararmos os níveis de IL-6 para os diferentes
grupos tratados com azul de metileno e o grupo controle, podemos observar um
aumento expressivo nos níveis de IL-6 no grupo 0.1% azul de metileno, sendo este
estatisticamente de extrema significância quando comparado aos diferentes grupos
tratados e ao grupo controle.
A figura 09 apresenta os níveis de IL-6 dos diferentes grupos de tratamento
do Laser no comprimento de onda de 660 nm na massa tumoral sólida (controle, 1J,
3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis de IL-6 para
os diferentes grupos tratados com Laser e o grupo controle, observamos que
ocorreu um aumento estatisticamente significativo nos níveis de IL-6 no grupo de 3J,
quando comparado o grupo 3J com os demais grupos tratados e o grupo controle.
89
Os níveis de IL-10 dos diferentes grupos de tratamento do azul de metileno na
massa tumoral sólida (controle, azul de metileno 0.1%, azul de metileno 0.3%, azul
de metileno 1.0% e azul de metileno 3.0%) 24 horas após o último tratamento são
demonstrados na figura 10. Ao compararmos os níveis de IL-10 para os diferentes
grupos tratados com azul de metileno e o grupo controle, observamos um aumento
bastante expressivo e estatisticamente significativo nos níveis de IL-10 do grupo
0.1% azul de metileno quando comparado aos demais grupos tratados e o grupo
controle.
Na figura 11, apresentamos os níveis de IL-10 dos diferentes grupos de
tratamento do Laser no comprimento de onda de 660 nm na massa tumoral sólida
(controle, 1J, 3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis
de IL-10 para os diferentes grupos tratados com Laser e o grupo controle,
observamos uma expressiva redução estatisticamente significativa, quando
comparado o grupo 1J em relação aos demais grupos tratados 3J e 6J, porém não
foi demonstrada diferença estatística significativa quando comparado os níveis de IL-
10 do grupo 1J em relação aos níveis de IL-10 do grupo controle.
A figura 12 representa os níveis de TNF-a dos diferentes grupos de
tratamento do azul de metileno na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno
0.1%, azul de metileno 0.3%, azul de metileno 1.0% e azul de metileno 3.0%) 24
horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis de TNF-a para os
diferentes grupos tratados com azul de metileno e o grupo controle, observamos um
aumento bastante expressivo e estatisticamente significativo nos níveis de TNF-a do
grupo 0.1% azul de metileno quando comparado aos demais grupos tratados e o
grupo controle.
Na figura 13 apresenta os níveis de TNF-a dos diferentes grupos de
tratamento do Laser no comprimento de onda de 660 nm na massa tumoral sólida
(controle, 1J, 3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis
de TNF-a para os diferentes grupos tratados com Laser e o grupo controle,
observamos que ocorreu uma diminuição estatisticamente significativa, quando
comparado o grupo 1J em relação aos grupos de 3J e 6J, porém não encontramos
diferenças estatisticamente significativas quando comparamos o grupo de 1J com o
grupo controle.
A tabela 14 ilustra os níveis dos diferentes marcadores do processo
inflamatório após a associação dos protocolos de tratamento do azul de metileno na
90
concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda de
660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256.
Na figura 14 apresenta os níveis de IL-1β dos diferentes grupos com azul de
metileno na concentração 0.1% em diferentes doses de energia do laser no
comprimento de onda de 660nm na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno
0.1% + 1J, azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno 0.1% + 6J) 24 horas após
o último tratamento. Ao compararmos os níveis de IL-1 β para os diferentes grupos
tratados na associação de azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do
laser observamos que ocorreu um aumento expressivo sendo estatisticamente
significativo nos níveis de IL-1 no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando
comparado ao grupo controle e aos grupos de azul de metileno 0.1% + 3J e azul de
metileno 0.1% + 6J respectivamente.
Na figura 15 apresenta os níveis de IL-6 dos diferentes grupos com azul de
metileno na concentração 0.1% em diferentes doses de energia do laser no
comprimento de onda de 660nm na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno
0.1% + 1J, azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno 0.1% + 6J) 24 horas após
o último tratamento. Ao compararmos os níveis de IL-6 para os diferentes grupos
tratados na associação de azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do
laser observamos que ocorreu um aumento expressivo sendo estatisticamente
significativo nos níveis de IL-6 no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando
comparado ao grupo controle e aos grupos de azul de metileno 0.1% + 3J e azul de
metileno 0.1% + 6J respectivamente.
Na figura 16 apresenta os níveis de IL-10 dos diferentes grupos com azul de
metileno na concentração 0.1% em diferentes doses de energia do laser no
comprimento de onda de 660nm na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno
0.1% + 1J, azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno 0.1% + 6J) 24 horas após
o último tratamento. Ao compararmos os níveis de IL-10 para os diferentes grupos
tratados na associação de azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do
laser observamos que ocorreu um aumento expressivo sendo estatisticamente
significativo nos níveis de IL-10 no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando
comparado ao grupo controle e aos grupos de azul de metileno 0.1% + 3J e azul de
metileno 0.1% + 6J respectivamente.
Na figura 17 apresenta os níveis de TNF-a dos diferentes grupos com azul de
metileno na concentração 0.1% em diferentes doses de energia do laser no
91
comprimento de onda de 660nm na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno
0.1% + 1J, azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno 0.1% + 6J) 24 horas após
o último tratamento. Ao compararmos os níveis de TNF-a para os diferentes grupos
tratados na associação de azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do
laser observamos que ocorreu um aumento expressivo sendo estatisticamente
significativo nos níveis de TNF-a no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando
comparado ao grupo controle e aos grupos de azul de metileno 0.1% + 3J e azul de
metileno 0.1% + 6J respectivamente.
92
Tabela 12 – Dados dos níveis dos diferentes marcadores inflamatórios após o protocolo de
tratamento nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de
Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p
Tratamento
dos grupos
n=5
Salina
NaCl
0.9%
(mL)
Dose
(mg/mL)
IL-1β
(ρmol/mg
prot.)
IL-6
(ρmol/mg
prot)
IL-10
(ρmol/mg
prot)
TNF-α
(ρmol/mg
prot)
Controle 0.1 -
32.29 ± 6.40 80.96 ± 16.74 5.20 ± 1.30 3.70 ± 0.75
Azul de
Metileno
0.1%
- 1 44.32 ± 9.44 235.06 ± 14.22 17.64 ± 0.25 13.40 ± 0.81
Azul de
Metileno
0.3%
- 3 37.25 ± 2.01 99.63 ± 16.82 9.38 ± 0.95 4.96 ± 0.53
Azul de
Metileno
1.0%
- 10 42.48 ± 4.0 86.33 ± 11.02 5.73 ± 0.67 4.22 ± 1.14
Azul de
Metileno
3.0%
- 30 44.80± 2.02 92.82± 5.62 6.00 ± 1.03 4.48 ± 0.66
93
Tabela 13 – Dados dos níveis dos diferentes marcadores inflamatórios após o protocolo de
irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido
tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5,
Tratamento
dos grupos
n=5
Dose
Energia
(J/cm2)
IL-1β
(ρmol/mg prot.)
IL-6
(ρmol/mg prot)
IL-10
(ρmol/mg prot)
TNF-α
(ρmol/mg prot)
Controle - 17.75 ± 2.80 27.36 ± 0.56 3.26 ± 0.68 1.63 ± 0.22
1J 33,5 45.53 ± 2.51 60.40 ± 5.58 4.54 ± 1.10 2.57 ± 0.26
3J 100 30.35 ± 1.57 124.93 ± 8.42 12.90 ± 1.27 3.99 ± 0.36
6J 200 21.34± 0.81 82.83 ± 7.95 23.05 ± 2.31 5.53 ± 0.27
J, Joules
94
IL-1
Contr
ole
0.1%
AM
0.3%
AM
1.0%
AM
3.0%
AM
0
20
40
60
80
pm
ol/
mg
pro
t
Figura 06 - Níveis de IL-1β após o protocolo de tratamento nas diferentes concentrações do
azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados representam a média
± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle (ANOVA, seguido teste de
Turkey-Kramer de comparação múltipla).
IL-1
Controle 1 J 3J
6J 0
20
40
60
***##
pm
ol/m
g p
rot
Figura 07 - Níveis de IL-1β após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento de
onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os
dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle
(ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 1J vs.
Controle; ***p˂ 0.001 1J vs. 6J; ##p˂ 0.01 1J vs. 3J.
95
IL-6
Controle
0.1%
AM
0.3%
AM
1.0%
AM
3.0%
AM
0
75
150
225
300
***
pm
ol/m
g p
rot
Figura 08 - Níveis de IL-6 após o protocolo de tratamento nas diferentes concentrações do
azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados representam a média
± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle (ANOVA, seguido teste de
Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 0.1% AM vs. Controle, vs. 0.3% AM,
vs. 1.0% AM, vs. 3.0%AM.
IL-6
Controle 1 J 3J
6J 0
50
100
150
200
***##
pm
ol/m
g p
rot
Figura 09 - Níveis de IL-6 após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento de
onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os
dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle
(ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 3J vs.
Controle, vs. 1J; ##p˂ 0.01 3J vs. 6J
96
IL-10
Controle
0.1%
AM
0.3%
AM
1.0%
AM
3.0%
AM
0
5
10
15
20
25
***
pm
ol/m
g p
rot
Figura 10 - Níveis de IL-10 Figura após o protocolo de tratamento nas diferentes
concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados
representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle (ANOVA,
seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 0.1% AM vs.
Controle, vs. 0.3% AM, vs. 1.0% AM, vs. 3.0%AM.
IL-10
Controle 1 J 3J
6J 0.0
7.5
15.0
22.5
30.0
***
***
##
##**
pm
ol/m
g p
rot
Figura 11 - Níveis de IL-10 após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento de
onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os
dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle
(ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). *** p˂ 0.001 1J vs. 6J;
*** p˂ 0.001 6J vs. Controle; **p˂ 0.01 3J vs.Controle; ## p˂ 0.01 1J vs. 3J, 3J vs.6J
97
TNF-
Controle
0.1%
AM
0.3%
AM
1.0%
AM
3.0%
AM
0
5
10
15
20
***
pm
ol/m
g p
rot
Figura 12 - Níveis de TNF-α Figura após o protocolo de tratamento nas diferentes
concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados
representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle (ANOVA,
seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p ˂ 0.001 0.1% AM vs.
Controle; vs. 0.3% AM; vs. 1.0% AM; vs. 3.0%AM.
TNF-
Controle 1 J 3J
6J 0
2
4
6
8
###
***
***
#
*
pm
ol/m
g p
rot
Figura 13 - Níveis de TNF-α após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento de
onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os
dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle
(ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). *** p˂ 0.001 6J vs.
Controle, 3J vs. Controle; ###p˂ 0.001 1J vs. 6J; #p˂ 0.05 3J vs. 6J; *p˂ 0.05 1J vs. 3J.
98
Tabela 14 – Dados dos níveis dos diferentes marcadores inflamatórios após a associação
dos protocolos de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de
irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido
tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5.
Tratamento
dos grupos
n=5
Salina
NaCl
0.9%
(mL)
Dose
(mg/m)
Dose
Energia
(J/cm2)
IL-1β
(ρmol/mg
prot.)
IL-6
(ρmol/mg
prot)
IL-10
(ρmol/mg
prot)
TNF-α
(ρmol/mg
prot)
Controle 0.1 - - 5.47 ± 0.69 3.75 ± 0.73 2.05 ± 0.35 0.96 ± 0.1
AM 0.1% +
1J - 1 33,5 14.14 ± 0.76 9.81 ± 0.52 6.47 ± 0.90 3.00 ± 0.06
AM 0.1% +
3J - 1 100 6.53 ± 1.22 1.69 ± 0.41 1.69 ± 0.33 0.90 ± 0.11
AM 0.1% +
6J - 1 200 4.23 ± 1.33 1.74 ± 0.43 2.18 ± 0.69 0.95 ± 0.17
A.M, Azul de Metileno; J, Joules.
99
IL-1
Contr
ole
0.1%
AM
+1J
0.1%
AM
+3J
0.1%
AM
+6J
0
5
10
15
20
***
pm
ol/m
g p
rot
Figura 14 - Níveis de IL-1β após a associação dos protocolos de tratamento do azul de
metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda
de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados
representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle (ANOVA,
seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 0.1% AM + 1J vs.
Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J.
IL-6
Contr
ole
0.1%
AM
+1J
0.1%
AM
+3J
0.1%
AM
+6J
0.0
3.5
7.0
10.5
14.0
***
pm
ol/m
g p
rot
Figura 15 - Níveis de IL-6 após a associação dos protocolos de tratamento do azul de
metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda
de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados
representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle (ANOVA,
seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 0.1% AM + 1J vs.
Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J.
100
IL-10
Contr
ole
0.1%
AM
+1J
0.1%
AM
+3J
0.1%
AM
+6J
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
***
pm
ol/m
g p
rot
Figura 16 - Níveis de IL-10 após a associação dos protocolos de tratamento do azul de
metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda
de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados
representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle (ANOVA,
seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 0.1% AM + 1J vs.
Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J.
]
TNF-
Contr
ole
0.1%
AM
+1J
0.1%
AM
+3J
0.1%
AM
+6J
0
1
2
3
4
***
pm
ol/m
g p
rot
Figura 17 - Níveis de TNF-α após a associação dos protocolos de tratamento do azul de
metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda
de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados
representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle (ANOVA,
seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 0.1% AM + 1J vs.
Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J.
101
5.5 Análises da expressão gênica dos marcadores inflamatórios na massa
tumoral sólida pela reação em cadeia da polimerase após transcrição
reversa em tempo real (real time RT-PCR)
As tabelas 15 e 16 ilustram a quantificação da expressão gênica dos
diferentes marcadores do processo inflamatório após o tratamento nas diferentes
concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256 e
também após o tratamento com irradiação do Laser no comprimento de onda de
660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256 Os dados
são expressos pela média ± EPM, n=5.
A figura 18 representa a quantificação da expressão gênica de COX-1 por PCR em
tempo real dos diferentes grupos de tratamento do azul de metileno na massa
tumoral sólida (controle, azul de metileno 0.1%, azul de metileno 0.3%, azul de
metileno 1.0% e azul de metileno 3.0%) 24 horas após o último tratamento. Ao
compararmos a expressão gênica de COX-1 para os diferentes grupos tratados com
azul de metileno em relação ao grupo controle, observamos um aumento
estatisticamente significativo nos níveis de expressão gênica de COX-1 no grupo de
0.1% de azul de metileno, quando comparado ao grupo controle aos grupos de
0.3%, 1.0% e 3.0% respectivamente.
Na figura 19 apresenta a quantificação da expressão gênica de COX-1 dos
diferentes grupos de tratamento do Laser no comprimento de onda de 660 nm na
massa tumoral sólida (controle, 1J, 3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao
compararmos a expressão gênica de COX-1 para os diferentes grupos tratados com
Laser observamos que ocorreu um aumento estatisticamente significativo nos níveis
de expressão gênica de COX-1 no grupo de 1J, quando comparado ao grupo
controle e aos grupos de 3J e 6J respectivamente.
A quantificação da expressão gênica de COX-2 dos diferentes grupos de
tratamento do azul de metileno na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno
0.1%, azul de metileno 0.3%, azul de metileno 1.0% e azul de metileno 3.0%) 24
horas após o último tratamento são apresentados na figura 20. Ao compararmos a
expressão gênica de COX-2 para os diferentes grupos tratados com azul de metileno
e o grupo controle, podemos observar um aumento expressivo nos níveis de
expressão gênica de COX-2 no grupo 0.1% azul de metileno, sendo este
102
estatisticamente de extrema significância quando comparado aos demais grupos
tratados e ao grupo controle.
A figura 21 apresenta a expressão gênica de COX-2 dos diferentes grupos de
tratamento do Laser no comprimento de onda de 660 nm na massa tumoral sólida
(controle, 1J, 3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos a
expressão gênica de COX-2 para os diferentes grupos tratados com Laser e o grupo
controle, também observamos que ocorreu um extremo aumento, sendo
estatisticamente significativo nos níveis de expressão gênica de COX-2 no grupo de
1J, quando comparado com os demais grupos tratados e o grupo controle.
A quantificação da expressão gênica de iNOS dos diferentes grupos de
tratamento do azul de metileno na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno
0.1%, azul de metileno 0.3%, azul de metileno 1.0% e azul de metileno 3.0%) 24
horas após o último tratamento são demonstrados na figura 22. Ao compararmos
expressão gênica de iNOS para os diferentes grupos tratados com azul de metileno e
o grupo controle, observamos um aumento extremamente expressivo e
estatisticamente significativo nos níveis de expressão gênica de iNOS do grupo
0.1% azul de metileno quando comparado aos demais grupos tratados e o grupo
controle.
Na figura 23, apresentamos a quantificação da expressão gênica de iNOS dos
diferentes grupos de tratamento do Laser no comprimento de onda de 660 nm na
massa tumoral sólida (controle, 1J, 3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao
compararmos os níveis expressão gênica de iNOS para os diferentes grupos
tratados com Laser e o grupo controle, observamos um expressivo aumento
estatisticamente significativo, quando comparado o grupo 1J em relação aos demais
grupos tratados e o grupo controle.
A quantificação da expressão gênica de eNOS dos diferentes grupos de
tratamento do azul de metileno na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno
0.1%, azul de metileno 0.3%, azul de metileno 1.0% e azul de metileno 3.0%) 24
horas após o último tratamento são demonstrados na figura 24. Ao compararmos os
níveis de expressão gênica de eNOS para os diferentes grupos tratados com azul
de metileno e o grupo controle, observamos um aumento bastante expressivo e
estatisticamente significativo nos níveis de expressão gênica de eNOS do grupo
0.1% azul de metileno quando comparado aos demais grupos tratados e o grupo
controle.
103
Na figura 25, apresentamos a quantificação da expressão gênica de eNOS dos
diferentes grupos de tratamento do Laser no comprimento de onda de 660 nm na
massa tumoral sólida (controle, 1J, 3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao
compararmos os níveis de eNOS para os diferentes grupos tratados com Laser e o
grupo controle, observamos uma redução expressiva nos níveis expressão gênica
de eNOS sendo estatisticamente significativa, quando comparado os grupo 3J e 6J
em relação ao grupo controle, porém não observamos diferenças estatisticamente
significativas quando comparadas entre si. Também observamos uma redução com
significância nos níveis de expressão gênica de eNOS do grupo tratado com 1J, uma
vez comparados em relação aos do grupo controle. Entretanto os níveis de
expressão gênica de eNOS em 1J formam maiores e estatisticamente significativos
quando comparados com os grupos de 3J e 6J respectivamente.
A tabela 17 ilustra a quantificação da expressão gênica dos diferentes
marcadores do processo inflamatório após associação do tratamento do azul de
metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento
de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker
256.
Na figura 26 apresenta a quantificação da expressão gênica de COX-1 dos
diferentes grupos com azul de metileno na concentração 0.1% em diferentes doses
de energia do laser no comprimento de onda de 660nm na massa tumoral sólida
(controle, azul de metileno 0.1% + 1J, azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno
0.1% + 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis de
expressão gênica de COX-1 para os diferentes grupos tratados na associação de
azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do laser em relação o grupo
controle, observou que nenhuma diferença estatisticamente significativa foi
encontrada.
Na figura 27 apresenta a quantificação de expressão gênica de COX-2 dos
diferentes grupos com azul de metileno na concentração 0.1% em diferentes doses
de energia do laser no comprimento de onda de 660nm na massa tumoral sólida
(controle, azul de metileno 0.1% + 1J, azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno
0.1% + 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis de
expressão gênica de COX-2 para os diferentes grupos tratados na associação de
azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do laser observamos que
104
ocorreu um aumento expressivo sendo estatisticamente significativo nos níveis de
expressão gênica de COX-2 no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando
comparado ao grupo controle e aos grupos de azul de metileno 0.1% + 3J e azul de
metileno 0.1% + 6J respectivamente.
Na figura 28 apresenta a quantificação de expressão gênica de iNOS dos
diferentes grupos com azul de metileno na concentração 0.1% em diferentes doses
de energia do laser no comprimento de onda de 660nm na massa tumoral sólida
(controle, azul de metileno 0.1% + 1J, azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno
0.1% + 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis de
expressão gênica de iNOS para os diferentes grupos tratados na associação de azul
de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do laser observamos que ocorreu
um aumento expressivo sendo estatisticamente significativo nos níveis de expressão
gênica de iNOS no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando comparado ao
grupo controle e aos grupos de azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno 0.1%
+ 6J respectivamente.
Na figura 29 apresenta a quantificação de expressão gênica de eNOS dos
diferentes grupos com azul de metileno na concentração 0.1% em diferentes doses
de energia do laser no comprimento de onda de 660nm na massa tumoral sólida
(controle, azul de metileno 0.1% + 1J, azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno
0.1% + 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis de
expressão gênica de eNOS para os diferentes grupos tratados na associação de
azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do laser observamos que
ocorreu uma redução expressiva sendo estatisticamente significativa nos níveis de
expressão gênica de eNOS no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando
comparado aos grupos de azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno 0.1% + 6J,
porém foi maior e estatisticamente diferente quando comparado aos níveis de
expressão gênica de eNOS do grupo controle.
105
Tabela 15 – Dados da quantificação da expressão gênica dos marcadores inflamatórios
após o protocolo de tratamento nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido
tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados são expressos pela média ± EPM,n=5.
HPRT, Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase
Tratamento
dos grupos
n=5
Salina
NaCl
0.9%
(mL)
Dose
(mg/mL)
COX-1/HPRT
COX-2/HPRT
iNOS/HPRT
eNOS/HPRT
Controle 0.1 - 0.49 ± 0.13 0.43 ± 0.02 0.28 ± 0.10 0.28 ± 0.02
Azul de
Metileno
0.1%
- 1 2.54 ± 0.22 0.95 ± 0.11 1.83 ± 0.23 0.49 ± 0.07
Azul de
Metileno
0.3%
- 3 1.32 ± 0.20 0.09 ± 0.07 0.22 ± 0.06 0.25 ± 0.22
Azul de
Metileno
1.0%
- 10 1.38 ±0.24 0.14 ± 0.08 0.20 ±0.07 0.21 ± 0.07
Azul de
Metileno
3.0%
- 30 1.02 ±0.27 0.11 ± 0.06 0.40 ± 0.15 0.17 ± 0.07
106
Tabela 16 – Dados da quantificação da expressão gênica dos marcadores inflamatórios
após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes
energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados são expressos pela média ±
EPM, n=5.
Tratamento
dos grupos
n=5
Dose
Energia
(J/cm2)
COX-1/HPRT
COX-2/HPRT
iNOS/HPRT
eNOS/HPRT
Controle - 1.26 ± 0.12 1.25 ± 0.23 0.69 ± 0.13 0.65 ± 0.06
1J 33,5 1.97 ± 0.10 18.18 ± 0.25 1.49 ± 0.05 0.45 ± 0.04
3J 100 1.13 ± 0.13 0.77 ± 0.21 0.68 ± 0.08 0.17 ± 0.05
6J 200 1.35 ±0.19 3.60 ± 0.18 0.34 ± 0.11 0.18 ± 0.03
HPRT, Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase; J, Joules
107
COX-1 AM
Contr
ole
0.1%
AM
0.3%
AM
1.0%
AM
3.0%
AM
0
1
2
3
4
***
#
CO
X-1
/HP
RT
Figura 18 – Quantificação da expressão gênica da COX-1 após o protocolo de tratamento
nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker
256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo
controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001
0.1% AM vs. Controle, 0.1% AM vs. 3.0% AM; #p˂ 0.05 0.1% AM vs. 0.3% AM, 0.1% AM vs.
1.0% AM.
COX-1 Laser
Contr
ole 1 J
3J
6J
0.00
0.75
1.50
2.25
3.00
CO
X-1
/HP
RT
**
Figura 19 - Quantificação da expressão gênica da COX-1 após o protocolo de irradiação
com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do
Tumor de Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando
comparado ao grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação
múltipla). **p˂ 0.01 1J vs. Controle, vs. 3J, 6J
108
COX-2 AM
Contr
ole
0.1%
AM
0.3%
AM
1.0%
AM
3.0%
AM
0.00
0.35
0.70
1.05
1.40
***
CO
X-2
/HP
RT
##
Figura 20 – Quantificação da expressão gênica da COX-2 após o protocolo de tratamento
nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker
256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo
controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001
0.1% AM vs. 0.3% AM, vs. 1.0%, vs. 3.0%; ## p˂ 0.01 0.1% AM vs. Controle..
COX-2 Laser
Contr
ole 1 J
3J
6J
0.0
7.5
15.0
22.5
30.0
CO
X-2
/HP
RT
***
Figura 21 - Quantificação da expressão gênica da COX-2 após o protocolo de irradiação
com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do
Tumor de Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando
comparado ao grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação
múltipla). ***p˂ 0.001 1J vs. Controle, vs. 3J, 6J
109
iNOS AM
Contr
ole
0.1%
AM
0.3%
AM
1.0%
AM
3.0%
AM
0.0
0.6
1.2
1.8
2.4
***
iNO
S/H
PR
T
Figura 22 – Quantificação da expressão gênica da iNOS após o protocolo de tratamento
nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker
256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo
controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001
0.1% AM vs. Controle, vs. 0.3% AM, vs. 1.0% AM, vs. 3.0%AM.
iNOS Laser
Contr
ole 1 J
3J
6J
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
***
iNO
S/H
PR
T
Figura 23 - Quantificação da expressão gênica da iNOS após o protocolo de irradiação com
Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do
Tumor de Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando
comparado ao grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação
múltipla). ***p˂ 0.001 1J vs. Controle, vs. 3J, 6J.
110
eNOS AM
Contr
ole
0.1%
AM
0.3%
AM
1.0%
AM
3.0%
AM
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
**
eN
OS
/HP
RT
#
Figura 24 – Quantificação da expressão gênica da eNOS após o protocolo de tratamento
nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker
256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo
controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). **p˂ 0.01 0.1%
AM, vs.0.3% AM, vs. 1.0% AM, vs. 3.0%AM; #p˂ 0.5.1% AM, vs. Controle.
eNOS Laser
Contr
ole 1 J 3J 6J 0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
eN
OS
/HP
RT
*** ***
*##
Figura 25 - Quantificação da expressão gênica da eNOS após o protocolo de irradiação
com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do
Tumor de Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando
comparado ao grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação
múltipla). ***p˂ 0.001 6J vs. Controle, 3J vs. Controle; *p˂ 0.5 1J vs. Controle; ##p p˂ 0.01
1J vs. 3J, vs. 6J.
111
Tabela 17 – Dados da quantificação da expressão gênica dos marcadores inflamatórios
após a associação dos protocolos de tratamento do azul de metileno na concentração fixa
de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes
energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados representam a média ± EPM,
n = 5.
Tratamento
dos grupos
n=5
Salina
NaCl
0.9%
(mL)
Dose
(mg/mL)
Dose
Energia
(J/cm2)
COX1/
HPRT
COX2/
HPRT
iNOS/
HPRT
eNOS/
HPRT
Controle 0.1 - - 1.08 ± 0.21 0.92 ± 0.27 0.90 ± 0.20 1.07 ± 0.24
AM 0.1% +
1J - 1 33,5 0.82 ± 0.25 3.01 ± 0.26 2.58 ± 0.21 2.79 ± 0.14
AM 0.1% +
3J - 1 100 0.97 ± 0.17 1.19 ± 0.26 1.12 ± 0.23 6.90 ± 0.26
AM 0.1% +
6J - 1 200 1.42 ± 0.20 1.31 ± 0.14 0.99 ± 0.27 10.03 ± 0.21
A.M, Azul de Metileno; HPRT, Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase;,J, Joules.
112
COX-1
Contr
ole
0.1%
AM
+1J
0.1%
AM
+3J
0.1%
AM
+6J
0.0
0.6
1.2
1.8
2.4
CO
X-1
/HP
RT
Figura 26 - Quantificação da expressão gênica da COX-1 após a associação dos protocolos
de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser
no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de
Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao
grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla).
COX-2
Controle
0.1%
AM+1J
0.1%
AM+3J
0.1%
AM+6J
0.00
1.25
2.50
3.75
5.00
***
CO
X-2
/HP
RT
Figura 27 - Quantificação da expressão gênica da COX-2 após a associação dos protocolos
de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser
no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de
Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao
grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂
0.001 0.1% AM + 1J vs. Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J.
113
iNOS
Contr
ole
0.1%
AM
+1J
0.1%
AM
+3J
0.1%
AM
+6J
0
1
2
3
4
***
iNO
S/H
PR
T
Figura 28 - Quantificação da expressão gênica da iNOS após a associação dos protocolos
de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser
no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de
Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao
grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂
0.001 0.1% AM + 1J vs. Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J
eNOS
Contr
ole
0.1%
AM
+1J
0.1%
AM
+3J
0.1%
AM
+6J
0
4
8
12
16
***
eN
OS
/HP
RT
Figura 29 - Quantificação da expressão gênica da eNOS após a associação dos protocolos
de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser
no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de
Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao
grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂
0.001 0.1% AM + 1J vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J.
114
5.6 Determinação da Prostaglandina E2 na massa tumoral sólida
A tabela 18 ilustra os níveis de PGE2 após a associação dos protocolos de
tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com
Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral
do Tumor de Walker 256.
Na figura 30 apresenta os níveis de PGE2 dos diferentes grupos com azul de
metileno na concentração 0.1% em diferentes doses de energia do laser no
comprimento de onda de 660nm na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno
0.1% + 1J, azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno 0.1% + 6J) 24 horas após
o último tratamento. Ao compararmos os níveis de PGE2 para os diferentes grupos
tratados na associação de azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do
laser observamos que ocorreu um aumento expressivo sendo estatisticamente
significativo nos níveis de PGE2 no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando
comparado ao grupo controle e aos grupos de azul de metileno 0.1% + 3J e azul de
metileno 0.1% + 6J respectivamente.
115
Tabela 18 – Dados dos níveis de PGE2 após a associação dos protocolos de tratamento do
azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento
de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os
dados representam a média ± EPM, n = 5.
A.M, Azul de Metileno; J, Joules.
PGE2
Contr
ole
0.1AM
+ 1
J
0.1AM
+ 3
J
0.1AM
+ 6
J
0
400
800
1200
1600
***
pg
PG
E2/
mg
pro
t
Figura 30 - Níveis de PGE2 após a associação dos protocolos de tratamento do azul de
metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda
de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados
representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle (ANOVA,
seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 0.1% AM + 1J vs.
Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J,
Tratamento dos grupos
n=5
Salina
NaCL
0.9%
(mL)
Dose
(mg/mL)
Dose
Energia
(J/cm2)
PGE2
pg/mg prot.
Controle 0.1 - - 163.2 ± 2.3
AM 0.1% + 1J - 1 33,5 1186.2 ± 3.0
AM 0.1% + 3J - 1 100 187.1 ± 2.2
AM 0.1% + 6J - 1 200 160.7 ± 1.7
116
5.7 Avaliação da Peroxidação Lipídica na massa tumoral sólida pelo Método
de TBARS
A tabela 19 ilustra os níveis de TBARS após a associação dos protocolos de
tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com
Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral
do Tumor de Walker 256.
Na figura 31 apresenta os níveis de TBARS dos diferentes grupos com azul
de metileno na concentração 0.1% em diferentes doses de energia do laser no
comprimento de onda de 660nm na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno
0.1% + 1J, azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno 0.1% + 6J) 24 horas após
o último tratamento. Ao compararmos os níveis de TBARS para os diferentes grupos
tratados na associação de azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do
laser observamos que ocorreu um aumento expressivo sendo estatisticamente
significativo nos níveis de TBARS no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando
comparado ao grupo controle e aos grupos de azul de metileno 0.1% + 3J e azul de
metileno 0.1% + 6J respectivamente.
117
Tabela 19 – Dados dos níveis de TBARS após a associação dos protocolos de tratamento
do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no
comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de
Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5.
A.M, Azul de Metileno; J, Joules.
TBARS
Controle
0.1%
AM+1J
0.1%
AM+3J
0.1%
AM+6J
0
1
2
3
4
***
TB
AR
S n
mo
l/g
Figura 31 - Níveis de TBARS após a associação dos protocolos de tratamento do azul de
metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda
de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados
representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle (ANOVA,
seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 0.1% AM + 1J vs.
Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J,
Tratamento dos grupos
n=5
Salina
NaCL
0.9%
(mL)
Dose
(mg/mL)
Dose
Energia
(J/cm2)
TBARS
nmol/g
Controle 0.1 - - 1.43 ± 0.14
AM 0.1% + 1J - 1 33,5 2.75 ± 0.26
AM 0.1% + 3J - 1 100 1.32 ± 0.11
AM 0.1% + 6J - 1 200 1.32 ± 0.13
118
5.8 Análises da atividade da Mieloperoxidade (MPO)
A tabela 20 ilustra os níveis de atividade da MPO após a associação dos
protocolos de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de
irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no
tecido tumoral do Tumor de Walker 256.
Na figura 32 apresenta os níveis de MPO dos diferentes grupos com azul de
metileno na concentração 0.1% em diferentes doses de energia do laser no
comprimento de onda de 660nm na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno
0.1% + 1J, azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno 0.1% + 6J) 24 horas após
o último tratamento. Ao compararmos os níveis de MPO para os diferentes grupos
tratados na associação de azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do
laser observamos que ocorreu um aumento expressivo sendo estatisticamente
significativo nos níveis de MPO no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando
comparado ao grupo controle e aos grupos de azul de metileno 0.1% + 3J e azul de
metileno 0.1% + 6J respectivamente.
119
Tabela 20 – Dados dos níveis de atividade da MPO após a associação dos protocolos de
tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no
comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de
Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5.
A.M, Azul de Metileno; L, Joules.
MPO
Contr
ole
0.1AM
+ 1
J
0.1AM
+ 3
J
0.1 +
6J
0
200
400
600
800
***
UM
PO
/g
Figura 32 – Correlação níveis de atividade da MPO após a associação dos protocolos de
tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no
comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de
Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao
grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂
0.001 0.1% AM + 1J vs. Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J,
Tratamento dos
grupos
n=5
Salina
NaCL
0.9%
(mL)
Dose
(mg/mL)
Dose
Energia
(J/cm2)
MPO
UMPO/g
Controle 0.1 - - 0.8 ± 0.4
AM 0.1% + 1J - 1 33,5 537.6 ± 0.6
AM 0.1% + 3J - 1 100 4.3 ± 0.6
AM 0.1% + 6J - 1 200 2.8 ± 0.7
120
5.9 Análises Histológicas
A análise histológica da massa tumoral sólida do Tumor de Walker 256 foi
realizada utilizando o emprego da coloração hematoxilina eosina. As figuras 33 A e
B correspondem à microscopia óptica do grupo controle nos aumentos de 100 e 400
vezes respectivamente. Nestas figuras evidenciou-se que as células tumorais
apresentam um volume maior que o normal, contornos irregulares e formas bizarras,
caracterizando moderado a acentuado pleomorfismo, ou seja, variação no tamanho
e forma. Podemos observar que os núcleos das células tumorais apresentam-se de
forma central, oval; são hipercromáticos, estão aumentados, em desproporção ao
tamanho da própria célula e normalmente possuem cromatina periférica. A
cromatina está aumentada ou condensada e distribuída de forma aleatória, e os
nucléolos se tornam evidentes, frequentemente apresentam lobulação ou então em
forma irregular, podendo mostrar a mesma tendência ao pleomorfismo da própria
célula. A quantidade de núcleo-proteína está aumentada e as mitoses são atípicas,
originando células multinucleadas. Entre as células, há a presença de pequenos
feixes de tecido conjuntivo e moderada quantidade de vasos, sendo que em
algumas áreas podemos observar a presença de células tumorais nos seus
interiores.
As figuras 34 A e B ilustram a microscopia óptica do grupo tratado 0.1% azul
de metileno + 1J nos aumentos de 100 e 400 vezes respectivamente. Nestas figuras
observam-se grandes áreas de necrose com presença neutrofílica. A microscopia
óptica do grupo tratado 0.1% azul de metileno + 3J está representada nas figuras 35
A e B nos aumentos de 100 e 400 vezes respectivamente. Nestas figuras podemos
notar algumas áreas de necrose, entretanto, ainda há presença de células
neoplásicas multinucleadas, apresentando pleomorfismo celular com
hipercromatização nuclear e cromatina condensada distribuída irregularmente.
As figuras 36 A e B correspodem a microscopia óptica do gurpo tratado 0.1%
azul de metileno + 6J nos aumentos de 100 e 400 vezes respectivamente. Nota-se
nestas figuras segue o mesmo comportamento em relação a microscopia óptica do
grupo tratado 0.1% azul de metileno + 3J apresentando algumas áreas de necrose,
porém podemos observar a presença de células neoplásicas também
121
multinucleadas, apresentando pelomorfismo celular com hipercromatização nuclear
e cromatina condensada distribuída irregularmente.
122
Figura 33 – Microscopia óptica do grupo controle. As figuras A e B correspondem a
microscopia óptica nos aumentos de 100 e 400 vezes respectivamente.
A
B
123
Figura 34 – Microscopia óptica do grupo 0.1% azul de metileno + 1J. As figuras A e
B correspondem a microscopia óptica nos aumentos de 100 e 400 vezes
respectivamente.
A
B
124
Figura 35 – Microscopia óptica do grupo 0.1% azul de metileno + 3J. As figuras A e
B correspondem a microscopia óptica nos aumentos de 100 e 400 vezes
respectivamente.
B
A
125
Figura 36 – Mcroscopia óptica do grupo 0.1% azul de metileno + 6J. As figuras A e
B correspondem a microscopia ótica nos aumentos de 100 e 400 vezes
respectivamente.
A
B
126
6 DISCUSSÃO
A Análise Estatística de Sobrevida têm sido amplamente empregada no
tratamento de dados de sobrevivência em estudos de laboratórios, ou seja, ela
avalia, por exemplo, o tempo em que um indivíduo sobrevive a um determinado
tratamento e o tempo de resposta a um dado tratamento e por meio desta análise,
os quais buscam novos produtos farmacêuticos e terapias mais adequados para
cada situação.
Em relação ao presente estudo, os resultados da análise da sobrevida dos
diferentes grupos tratados com azul de metileno na massa tumoral sólida
apresentaram valores do tempo mediano de sobrevida de 30 dias para os grupos
tratados com azul de metileno nas concentrações de 0.1% e 0.3%, caracterizando
uma probabilidade maior de sobrevida, Em relação aos grupos tratados com azul de
metileno nas concentrações de 1.0% e 3.0%, apresentaram tempos medianos de
sobrevida de 21 dias e 15 dias, respectivamente, sendo semelhante o tempo
mediano de sobrevida do grupo controle e, portanto mantendo o mesmo padrão e a
dinâmica do tempo de sobrevida do Tumor de Walker 256 que varia de 15 a 20 dias
quando implantado via subcutânea. Na análise do teste para igualdade das curvas
estimadas de Kaplan- Meier, entre os diferentes grupos tratados com azul de
metileno observa-se nenhuma diferença estatisticamente significante (p< 0.9241 –
Teste Long-rank e p< 0.6762 - Teste Long-rank for trend) quando comparado com o
grupo controle. Os resultados da estimativa das curvas de sobrevivência de Kaplan-
Meier dos diferentes grupos tratados com azul de metileno quando comparado com
o grupo controle, podemos verificar que os grupos tratados com azul de metileno
nas concentrações de 0.1% e 0.3% mostraram uma maior probabilidade de
sobrevida quando comparado o grupo controle. Com relação aos grupos tratados
com azul de metileno nas concentrações de 1.0% e 3.0% promoveram a mesma
probabilidade de sobrevida quando comparados com o grupo controle. Com base
nestes dados podemos concluir que os tratamentos nas concentrações de 0.1% e
0.3% do azul de metileno demonstraram uma maior probabilidade de sobrevida do
animal quando comparado aos grupos controle e nas concentrações de 1.0% e
3.0%.
Em relação aos grupos das concentrações de 1.0% e 3.0% do azul de metileno
não apresentaram diferenças significativas na probabilidade de sobrevida quando
127
comparado ao grupo controle, o que podemos sugerir indícios de efeitos de uma
toxicêmia, visto que dados encontrados na literatura recomenda-se a dose
terapêutica do azul de metileno na faixa de 1-2 mg/kg peso (i.v).
Muitos medicamentos empregados rotineiramente na clínica podem
apresentar como reação colateral indesejável, a agressão ao fígado, o que poderá
limitar seu uso e os benefícios esperados. O dano hepático induzido por
medicamentos pode ser hepatocelular, o que se traduzirá por aumento das
transaminases pirúvica e oxalacética (ALT e AST), ou colestático, o que levará ao
aumento de bilirrubinas, da fosfatase alcalina e da gama-glutaril transferase (G-GT).
Desde 1950, têm-se procurado teste de avaliações das condições do fígado
para determinar o potencial hepatotóxico de medicamentos empregados na
terapêutica. As determinações bioquímicas prontamente disponíveis e usadas
universalmente sãos testes das transaminases (ALT e AST) e gama-GT. As
aminotransferases são um indicativo de integridade celular e são enzimas
intercelulares. As provas de laboratório para medir essas enzimas baseiam-se na
ação sobre diferentes substratos que no final vão fornecer os substratos alanina
glutamato ou aspartato. A ALT é a enzima mais utilizada para medir processo
inflamatório ou necrótico no fígado. A mesma é encontrada no fígado e está
localizada no citosol da célula hepática. A AST é uma enzima que se encontra tanto
no citoplasma como nas mitocôndrias dos hepatócitos. Esta enzima está presente
em muitos órgãos além do fígado, incluindo coração e músculos. Segundo Gayoto e
Alves (2001) a AST é muito útil na caracterização de doenças hepáticas crônicas.
A gama glutamil transferase (gama GT) é uma enzima envolvida na
transferência de um resíduo gama glutamil de alguns peptídeos para outros
compostos (água, aminoácidos e outros peptídeos menores). Fisiologicamente, está
envolvida na síntese protéica e peptídica, regulação dos níveis teciduais de glutation
e transporte de aminoácidos entre membranas. É encontrada em vários tecidos: rins,
cérebro, pâncreas e fígado (quase a totalidade da gama GT corpórea está presente
nos hepatócitos). No fígado, esta enzima está localizada nos canalículos das células
hepáticas e particularmente nas células epiteliais dos ductos biliares. Devido a esta
localização característica, a enzima aparece elevada em quase todas as desordens
hepatobiliares, sendo um dos testes mais sensíveis no diagnóstico destas
condições. Nas células do parênquima hepático, a enzima é localizada tipicamente
128
no retículo endoplasmático liso, estando sujeita a indução microssomal hepática e
fazendo dela um marcador sensível a agressões hepáticas induzidas por
medicamentos e álcool. Valores aumentados de gama GT são indicativos de
doenças hepáticas em geral (hepatites agudas e crônicas, carcinomas, cirrose,
colestase, metástases etc.), pancreatites, infarto agudo do miocárdio, lupus
eritematoso sistêmico, obesidade patológica, hipertireoidismo, estados pós-
operatórios, carcinoma de próstata, uso de medicamentos hepatotóxicos ou capazes
de ativar indução enzimática (barbituratos, fenitoína, antidepressivos tricíclicos,
acetaminofen).
Apesar de não ser o objetivo principal do nosso projeto, avaliamos a
hepatoxocidade do tratamento com azul de metileno nas concentrações empregadas
de 0.1%, 0.3%, 1.0% e 3.0% no modelo tumoral, pois surgiu uma grande
preocupação quanto ao emprego e segurança de tais concentrações, visto que se
encontram muito acima dos limites de dose terapêutica recomendada pela literatura
que é de 1-2 mg/kg de peso (i.v). Além disso, dados encontrados na literatura
informam que o tecido tumoral é caracterizado presença de alta angiogênese, ou
seja, neovascularização para o aporte de oxigênio e nutrientes no desenvolvimento
e progressão tumoral. Assim, também surgiu o fato da possibilidade da dose via
intratumoral (i.t) das quatro concentrações de azul de metileno poder alcançar à
corrente sanguínea e exercer seus efeitos toxicêmicos. Portanto, nossos resultados
da avaliação da hepatotoxicidade puderam demonstrar que o emprego das
concentrações de 0.1%, 0.3%, 1.0% e 3.0% de azul de metileno bem como a via de
administração adotada não apresentaram nenhum aumento estatisticamente
significativos nos níveis dos marcadores de lesão hepática, AST, ALT e gama- GT
quando comparado ao grupo controle. Com bases nos resultados obtidos, podemos
concluir que o azul de metileno apresentou uma segurança e tolerância quanto ao
emprego das quatro concentrações, bem como na sua via da administração, sem
causar efeito hepatotóxico pelo aumento dos níveis de AST, ALT e gama-GT.
Atualmente a TFD é considerada como uma nova modalidade terapêutica
minimamente invasiva e suas aplicações têm sido direcionadas ao tratamento
localizado bem como na destruição seletiva de diversos tipos de cânceres e
desordens malignas (DOUGHERTY et al., 1998; GOMER et al., 1989; HSI et al.,
1999; KESSEL, D., 1992; PERVAIZ, S., 2001). Esta terapia está baseada na
129
captação e retenção seletiva do agente fotossensibilizante em sítios alvos que por
sua vez sofre ativação através da irradiação de uma fonte externa de luz levando à
geração de efeitos citotóxicos induzindo a morte das células tumorais. (CALIN et al.,
2005; DOUGHERTY et al., 1987; JUARRANZ et al., 2008; SARIKA et al., 2007).
Os principais mecanismos pelos quais a TFD media a destruição do tecido
canceroso são, primeiro as espécies reativas de oxigênio (EROs) e principalmente o
1O
2 gerados durante o processo de fotossensibilização da TFD produzem danos
severos diretamente às células tumorais promovendo à destruição tumoral (DENNIS
et al., 2003; DOUGHERTY T. et al., 1998; HASAN et al., 2003; JUARRANZ et al.,
2008). No segundo mecanismo, a TFD atua gerando danos relevantes nos vasos
sanguíneos levando a formação de trombos e dessa maneira, prejudicando a
vascularização tissular levando ao colapso e falência vascular originando um quadro
de severa hipóxia. Também, a resposta ao dano vascular atua desempenhando um
importante papel na ação tumoricida por induzir alterações na permeabilidade dos
vasos sanguíneos estimulando a ativação dos fatores de adesão molecular (E-
selectina/ ICAM) colaborando para a diapedese neutrofílica (ACKROYD et al., 2001;
DENNIS et al., 2003; REED et al., 1989; STAR et al., 1986). E finalmente, o último
mecanismo pelo qual a TFD atua é ativando a resposta imune contra as células
tumorais reminicentes em decorrência do dano oxidativo celular pelo aumento da
expressão de proteínas imunoreguladoras e pró-inflamatórias sensibilizam não só
das células dendríticas, mas também, macrófagos, linfócitos, neutrófilos que migram
dos nódulos linfáticos para o sitio tumoral (DOUGHERTY et al., 1998; DOLMANS et
al., 2003; HENDERSON, B.W., GOLLNICK, S.O., SNYDER, J.W. et al., 2004;
JUARRANZ et al., 2008; SOLBAN, N.; RIZUI, I.; HASANT, T., 2006;
TRIEESSCHEIJIN et al., 2006).
O azul de metileno é um corante que pertence à classe dos corantes
fenotiazínicos e que deperta grande interesse devido às suas propriedades
eletrocatalíticas em face da NADH4, que é uma coenzima do grupo das
dehidrogenases (SCHIRMER et al., 2011; WAINWRIGHT; AMARAL, 2005). Além
disso, o mesmo têm-se mostrado como um potente agente fotossensibilizante com
excelentes propriedades fotoquímicas em função de possuir alto rendimento na
geração de 1O
2 e EROs na presença de agentes redutores. Devido às suas
130
características fotodinâmicas e fototóxicas e demonstrar alta afinidade com a
membrana mitocondrial celular, o azul de metileno têm-se destacado como um
efetivo fotossensibilizante de grande potencial para à aplicação médica como agente
terapêutico na TFD (CHEN et al., 2008; GABRIELLI et al., 2004; PELOI et al., 2008;
TARDIVO et al., 2004; TARDIVO et al., 2005).
Em nosso trabalho avaliamos a expressão dos principais mediadores pró-
inflamatórios na massa tumoral sólida nos tratamentos tanto com azul de metileno
em diferentes doses bem como com laser aplicado em diferentes energias e em
associação com azul de metileno na concentração fixa de 0.1% com o objetivo de
investigar se seus efeitos podem desencadear processos inflamatórios interferindo
no desenvolvimento e na progressão tumoral.
Assim nossos resultados demonstraram que o tratamento com azul de
metileno na concentração de 0.1% na massa tumoral desencadeou um processo
inflamatório pela elevação não só dos níveis das citocinas IL-6, IL-10 e TNF-α como
na expressão gênica de COX-1, COX-2, iNOS e eNOS, sugerindo que há indícios da
ocorrência de efeitos citotóxicos em decorrência da alta afinidade do azul de
metileno pela membrana mitocondrial mas também de uma resposta imune
tumoricida contra as células tumorais o que levaria a desencadear morte celular.
Com relação aos tratamentos com azul de metileno nas concentrações de 0.3%,
1.0% e 3.0%, os dados dos mediadores envolvidos em processos inflamatórios na
massa tumoral sólida, foram semelhantes em relação ao grupo controle, o que
podemos indicar uma possível perda do efeito farmacológico devido à saturação de
tais concentrações nos ligantes da membrana mitocondrial. Este fato também pode
corroborar de forma consistente com os dados da análise de sobrevida do
tratamento do azul de metileno de diferentes concentrações na massa tumoral
sólida, onde foi observada uma menor probabilidade do tempo de sobrevida dos
grupos tratados com azul de metileno nas concentrações de 1.0% e 3.0% quando
comparado com o tempo de sobrevida do grupo controle, sugerindo a permanência
da progressão tumoral nestas condições. Diferentemente em relação aos grupos
tratados com 0.1% e 0.3% que tiveram uma probabilidade do tempo de sobrevida
maior que o do grupo controle. Também estes dados puderam complementar de
forma contundente no sentido de descartar qualquer dúvida sobre a ocorrência de
131
efeitos toxicêmicos no emprego das quatro concentrações do azul de metileno do
tratamento na massa tumoral sólida.
Com relação aos resultados prévios do tratamento com Laser, no grupo de 1J
observou um aumento bem expressivo nos níveis de IL-1 β, na expressão gênica de
COX-1, COX-2 e iNOS e uma redução na expressão gênica de eNOS em relação
aos demais grupos. Este fato leva presumir a existência de um quadro inflamatório
agudo, sugerindo indícios da ocorrência de uma resposta imunitária contra a massa
tumoral sólida. Além disso, os dados dos níveis de IL-6 também corroboram para
este fato, pois no grupo tratado com 1J foi observada uma redução dos níveis de IL-
6 quando comparado ao grupo de 3J, e com isto tendo menor ocorrência de
inflamação crônica. Neste mesmo grupo de 1J nota-se também uma menor resposta
biológica da massa tumoral sólida frente ao tratamento, em decorrência da redução
dos níveis de IL-10 quando comparado aos outros grupos de tratamento, dessa
forma mantendo a massa tumoral sólida em estado de inflamação aguda,
possibilitando a uma melhor resposta imune contra o tumor. Também foram
observados reduções dos níveis de TNF-α no grupo de 1J quando comparado com
as outras energias e consequentemente podemos indicar indícios de uma redução
do efeito necrótico severo, o que poderia ativar o aumento da expressão de fatores
de crescimento levando a estimular a proliferação das células reminiscentes
tumorais do dano celular e com isso favorecer a progressão ou ressurgência
tumoral.
De acordo com nossos resultados, podemos sugerir a energia do laser de 1J
como mais favorável para aplicação na TFD no tratamento de tumores, pois nesta
condição demonstrou-se a ocorrência de um quadro inflamatório agudo gerado a
partir do dano celular pelo aumento da expressão de IL-1β, COX-1, COX-2, iNOS,
colaborando na sensibilização neutrofílica e com isto desencadeando uma resposta
imunitária contra o tumor. Por outro lado nas energias de 3 e 6J, nestas condições
um quadro inflamatório crônico com necrose pode ser observado pelo aumento dos
níveis de IL-6, IL-10, TNF-α e redução da expressão gênica de eNOS, caracterizado
por danos mais severos não só celular como vascular, o que não seria bom do ponto
de vista terapêutico pois pode levar ao aumento da expressão de antígenos ativando
fatores de crescimento e fatores angiogênicos estimulando a proliferação das células
tumorais reminiscentes e dessa forma permitindo a ressurgência tumoral.
132
Os resultados do protocolo de tratamento com azul de metileno na
concentração de 0.1% em diferentes energias do laser pode-se verificar que no
grupo 0.1% azul de metileno + 1J um aumento extremamente expressivo nos níveis
de importantes marcadores envolvidos no processo inflamatório tais como, IL-1β, IL-
6, IL-10, TNF-α, COX-2, iNOS, PGE2 quando comparado com os demais grupos.
Além disso, dados da quantificação de EROs por TBARS e da atividade da MPO na
massa tumoral sólida também corroboraram com os resultados anteriores onde
também pode-se demonstrar elevados níveis de TBARS e na atividade da MPO no
grupo 0.1% azul de metileno +1J quando comparado em relação aos outros grupos
tratados. Este fato nos leva a indicar que nesta condição há ocorrência de uma
efetiva ação fotodinâmica do azul metileno na massa tumoral sólida em decorrência
da geração não só de radicais livres como do 1O2 responsáveis por causar
importantes danos oxidativos no ambiente tumoral, os quais foram confirmados pela
análise de TBARS. Consequentemente resultados de elevados níveis dos
mediadores inflamatórios também foram confirmados ocorrendo inflamação
necessária para a sensibilização das células dendríticas, macrófagos, linfócitos,
neutrófilos que migram dos nódulos linfáticos para o sitio tumoral e dessa forma
contribuindo para uma resposta imunitária tumoricida sendo esta última confirmada
através da análise da MPO, sugerindo a presença neutrofílica. A Análise histológica
também complementou com os resultados das citocinas (IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α),
COX-2, iNOS, PGE2 e MPO, onde no grupo 0.1% azul de metileno + 1J observa-se
grande áreas de necrose com presença de neutrófilos.
Com bases em nossos resultados podemos concluir que existem evidências
de uma ação tumoricida do azul de metileno em associação com 1 J de energia do
laser, em virtude da geração de importantes danos oxidativos celulares no ambiente
tumoral levando à morte celular, no aumento da expressão de importantes
marcadores pró-inflamatórios desencadeando inflamação que por sua vez
colaborando para sensibilização e atração neutrofílica numa efetiva resposta
imunitária tumoral específica. Entretanto, sugere-se a adição de novas pesquisas no
sentido de investigar outros parâmetros principalmente relacionados não só a fatores
de crescimento como indicadores de morte celular apoptose/necrose com o objetivo
de estabelecer uma efetiva ação terapêutica de controle á longo prazo contra o
câncer.
133
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