Mejoramiento genético
MAS ( SelecciónAsistida por Marcadores)
5- Mejoramiento genético
3- Diversidad
1° - Mutación
1960
2 ° - Recombinaciónnatural (ó dirigida)
4- Selección
- Variación
- Hibridación
MAS: ( SelecciónAsistida porMarcadores)
- Enzimas de restricción
- Recombinaciónartificial:
Ingeniería genética:
(Construcciones genéticas: ADN recombinante)
- Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):
replicación “in vitro”
Biol. (Mgter) Laura Torres
- Genéticos
- Moleculares
Gen de interés agronómico
Locus “marcador”
* Marcadores genéticos*
Biol. (Mgter) Laura Torres
Huellas……. Huellitas……
.
Marcador genético
- Herencia mendeliana clásica- Polimórfico - Codominante - No epistático - Sin influencia ambiental
Características deseables de un marcador
Biol. (Mgter) Laura Torres
Ingeniería Genética: (Recombinación Artificial)
Marcadores Genéticos y Moleculares
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético
Cruzamientos dirigidos….Hibridación, Recombinación …..y Selección
Hibridación con “sondas”
RFLPs
Amplificación por PCR
- Morfológicos
- Isoenzimáticos
Secuencias nucleotídicas “codificantes”
- Moleculares Secuencias nucleotídicas “codificantes” y “no codificantes”
Cebada
sex1 1cM ms 9
sex1 ms 9
Y 5 cM ms1
Y ms1
MaízMarcadores Morfológicos
- loci de expresión temprana
Biol.(Mgter) Laura Torres. Fac. Cs. Agropecuarias. UNC
Loci marcador:Endosperma blanco Loci de interés:
Androesterilidad (ms1)
Loci marcador:Endosperma arrugado
Loci de interés:Androesterilidad (ms9)
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético
Marcadores morfológicos: controlados por un solo loci y presentan expresión temprana
a) En Brassica:
Loci marcador: primera hoja vellosa
b) En maíz:
Loci marcador: raíz primaria ó coleoptilo púrpura
Loci con carácter de interés:
Haploidía
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético: SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)
Mapa genético(Marcadores morfológicos)
enanoalto
pubescenteliso
normal
moteadaonormal
necrosisnormal
Infloresc compInfl. simple
Lycopersicum esculentum (2n= 24)
Biol. (Mgter) Laura Torres
Detección de marcadores
MetodologíaElectroforesisEquipoTecnología de los marcadores Interpretación de las combinaciones de bandasVentajas y desventajas
Tratamiento del material vegetal
Electroforesis en geles de almidón, de acrilamida ó capilar (cromatógrafos)
Tinción histoquímica, química, fluorocromos
Análisis de los patrones de bandas ó cromatogramasBiol. (Mgter) Laura Torres
MARCADORES Isoenzimáticos :
MARCADORES Isoenzimáticos :
MARCADORES Isoenzimáticos :
MARCADORES Isoenzimáticos :
MARCADORES Isoenzimáticos :
MARCADORES Isoenzimáticos :
MARCADORES Isoenzimáticos :
- Polimorfismo a nivel del producto génico (polipéptido o proteína)
MARCADORES Isoenzimáticos :
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Ventajas
- Técnica consistente, reproducible y bajo costo- Co dominantes- Estudios de
diversidad parámetros poblacionales mapas genéticos
Desventajas
- Bajo número de sistemas de tinción para detectar enzimas- Análisis basado en el fenotipo- Inapropiados para MAS (ej: Tomate: el loci Mi controla la resistencia nemátodes está ligado al loci de la fosfatasa ácida
El loci para androesterilidadestá ligado a una fosfatasaBiol. (Mgter) Laura Torres
- Genética de poblaciones - Conservación ex situde germoplasma- Evolución de especies cultivadas (evaluar la diversidad genética de las poblaciones locales de Allium sp, mediante isoenzimas)- Evaluación y caracterización de germoplasma (evaluar la diversidad genética y la estructura de una colección de base de Arachis spp)- Erosión genética- Flujo de genes - Estabilidad genética en bancos de germoplasma (evaluar la diversidad genética de las entradas de semilla de ….spp,conservadas y suministradas por jardines botánicos europeos
Aplicaciones
Biol. (Mgter) Laura Torres
Ingeniería Genética: (Recombinación Artificial)
Marcadores
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético
Cruzamientos dirigidos….Hibridación, Recombinación …..y Selección
Hibridación con “sondas”:
RFLPs
Amplificación por PCR
- Morfológicos
- Isoenzimáticos
Secuencias nucleotídicas “codificantes”
- Moleculares Secuencias nucleotídicas
“no codificantes” y “codificantes”
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético: Marcadores Moleculares
- Microsatélites ó SSR:
Simple Sequence Repeats
- CAPS:
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
- SCARs:
Sequence Characterised Amplified Region
- STSs:
Sequence-Tagged Sites
- ESTs:
Espressed Sequence Tags
- EST - SSRs:
Espressed Sequence Tags of SSRs
- SNPs:
Single Nucleotide Polymorphism
Información previa de la secuencia: NO
- RAPDs:
Random Amplified Polymorphic DNA
- RFLP:
Restriction Fragment Lenght Polymorphism
- AFLPs:
Amplified Fragment Lenght Polymorphism
- SAMPLs:
Selective Amplification of M icrosatellite Polymorphism
- ISSRs: Inter-Simple Sequence Repeats
- Minisatélites ó VNTRs
Información previa de la secuencia:
SI
Biol. (Mgter) Laura Torres
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Enzimas de restricción:
Digestión (ó corte) de la doble cadena de ADN
Endonucleasas: enzimas de restricción
AluIArthrobacter luteus: AG´CT
TC´GA Sitio de restricción (palíndromo)
BamHIBacillus amyloliquefaciens: G´GATCC
CCTAG´GSitio de restricción (palíndromo)
Biol. (Mgter) Laura Torres
Marcador molecular de tipo:
RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms)
1- Digestión
2- Electroforesis
3- Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa)
4- Hibridación con “sondas marcadas”
5- Lavados
6- Revelado
Biol. (Mgter) Laura Torres
1- Basados en la amplificación del ADN (PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa)
(Numerosos sistemas)
2- Basados en la digestión con endonucleasas (enzimas de restricción) :
RFLPs (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricciòn)
*MARCADORES MOLECULARES - Polimorfismo genético a nivel del DNA
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Marcador molecular
RFLPs (RestrictionFragmentLenghtPolymorphisms)
Biol.(Mgter) Laura Torres.
5’…ATAAAAAGTTATACTATTCCAAATGATTGTCCTGTGGTATGTAATTCTATTCCTCGTAAACCTAACTTATCTTTGATGTTTATTAGAGCAATATTAGTTATTATGTTAATTAAAGATTATAGTGAAATTAAAGAAACACCAATTTATCAGCAACAACTTGAATTAGAAGATCCTGCGCGCAACGCCTGTCTTGTAACTGATAGTGGAATTCGAACTGAGCTGCAAAATGAACCAGTTACTGTACCAGTAACTCTTCCAACTTTGCCGACTTTTTCAAGTCCTAAAAATTAATCCTGTTAATTCATGTCAATTACGCGATTGCATAAGATGAGTTGTTTTAATGGATAGTGAGCGCCACTATGAATATGGTTCGTATTCAAACTCTCATGGCATTGAATTTGATCCAAATCACCCTTACATTGATTTGATTAACGATGATTTCGATGAAAATGATTATCTTGATCTCGAGACGTTAAATCTTGAAGCTGATTATGATGATGTTGAAAGTTTAGCTCTTAGGCTTAAAAATGCTCCTGACTACACTACTGAGATATTCGAGAAAATAGATAGAATACCAAACTTTGCGAGTTACAGATACTTCAGATGAGTTTTATACTTTAAGTTCGATGTTAACCGAGCATATGCAATCAATAATTACATTGCTTCCCAGTATACTATGGCCAATGGTCAGTCAGTTAACCAAATCTAATGTATTTCAAGCTGCAGACGATGTTAATATTACTAATTATTGGCGTTTGATGGACAGAAGATGGGATTTTATCGATGAACAGTTGAGAGTTCAATTTATTTTTAGAGCTTATGACTTGCGAGCGTATCAAAACGAGCGTGTGTCTCAAATTCTTTCTAGCAGTTTATTATTTGCTGGATTAAATCTAAT
TGG……….3'
pb
900
692
208
secuencia de ADN de 900 pb
Eco RI : (1 sitio de corte)
GAATTC
- Enzima EcoRI
- Buffer
- H2O
Biol. (Mgter) Laura Torres
Enzimas de restricción
Segregación Mendeliana de alelos marcadores de tipo molecular (Ej. RFLP, SSR)
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Ingeniería Genética: (Recombinación Artificial)
Marcadores Genéticos
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético
Cruzamientos dirigidos….Hibridación, Recombinación …..y Selección
Basados en hibridación con sondas: RFLPs
Basados en la amplificación por PCR
- Morfológicos
- Isoenzimáticos
Secuencias nucleotídicas “codificantes”
- Moleculares Secuencias nucleotídicas
“no codificantes” y “codificantes”
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Biol. (Mgter) Laura Torres
Replicación “in vivo” del DNA
* Helicasa
* Proteínas de unión a cadena sencilla (SSBP)
* Topoisomerasa ADN girasa
* Iniciación de la síntesis
* ADN polimerasa III
* Primasa, ARN polimerasa
* ADN ligasa.
* Corrección : polimerasas I y III
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Replicación natural del ADN
Biol.(Mgter) Laura Torres.
REPLICACIÓN NATURAL DEL DNA
Reacción en Cadena de la PolimerasaPCR….(Replicación “in vitro” de un fragmento de ADN ó ARN)
Biol. (Mgter) Laura Torres
Cebador
Biol. (Mgter) Laura Torres
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
NucleótidosAgua
Enzima Taq-polimerasa
Cebadores Buffer y Mg+ +
ADN molde
Muestra de tejido
Extracción de ADN
Termociclador
Millones de copias (10 6)de un fragmento de ADN
Electroforesis: visualización del fragmento de ADN amplificado a partir de los cebadores
Biol. (Mgter) Laura TorresBiol. (Mgter) Laura Torres
Reacción en Cadena de la PolimerasaPCR (Polimerase Chain Reaction)
Biol. (Mgter) Laura Torres
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que, tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado
Condiciones de amplificación del DNA
1º Etapa:Desnaturalización
94ºC 30s a 2 min
2º Etapa:Hibridación de cebadores
35-60 ºC 15-120seg
3º Etapa:Polimerización
68-72ºC 30-150seg
Etapas 1 a 3: 25-45 ciclos ó repeticiones
Polimerización Final:5min
68-72ºC
Desnaturalización Inicial:5min95ºC
Termociclador
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético: SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Etapas para la reacción de PCR
Los pasos 2 a 4 se repiten 30-35 veces e incrementan más de 106 veces el fragmento de DNA de interés
Biol.(Mgter) Laura Torres.
RAPDs(Random Amplified Polymorphic DNAs)
Base genética
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Base genética de marcadores tipo RAPDs
Biol.(Mgter) Laura Torres. Fac. Cs. Agropecuarias. UNC
-
+
Biol. (Mgter) Laura Torres
Variedades de olivo : Frantoio y Oblonga ¿Sinonimia?
Electroforesis de marcadores RAPDs
Biol.(Mgter) Laura Torres.
MARCADORES GENÉTICOS MOLECULARES “ BASADOS EN LA PCR
(Replicación “in vitro” del DNA )
5´- AT AT AT AT AT AT AT – 3´
Microsatélites (SSR: Single Sequence Repeat)
Cebador 1
Cebador 2
Cebador 3
Cebador 1
Cebador 2
Cebador 3
Región de longitud variable (microsatélite)
Región de secuencia conservada
Región de secuencia conservada
5´- GTC GTC GTC GTC GTC – 3´
5´- CGAT CGAT CGAT CGAT– 3´
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético: SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)
Base genética de marcadores tipo Microsatélite ó SSRs (Simple Sequence Repeats)
1 2 1 x 2
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Marcadores tipo SSRs (Microsatélites)
Dinucleótidos: (AT AT ATAT) – (AT)23
Trinucleótidos: ATC ATC ATC (ATC)16
Tetranucleótidos: ACGGACGG ACGG (ACGG)22
Biol.(Mgter) Laura Torres.
-
+
Sinonimia: electroforesis de marcadores tipo SSRs en las variedades de olivo Frantoio y Oblonga
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Fingerprinting: Variedad “Arbequina” de Olivo
oli 11 oli 12 oli 17 oli 22
1 2 3 4 1 2 3 4 M 1 2 3 4 1 2 3 4
MPM (pb)
500
400
300
200
100
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Fingerprinting (huella genética)
Autoincompatibilidad en cerezo Prunus avium L.
Biol.(Mgter) Laura Torres.
MPM (pb)
200
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
Electroforesis en gel de agarosa 3%
1- Empeltre de referencia(CSIC, España);
2- Empeltre LP;
3- Manzanilla de referencia(CSIC, España);
4-Manzanilla EC;
5- Manzanilla 4S;
6- Manzanilla gigante 4S;
7- Picual de referencia;
8- Nevadillo EC;
9- Nevadillo 4S;
M: 100 pb. DNA ladder (Sigma).
Biol.(Mgter) Laura Torres.
IAS oli 12
IAS oli 17
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Análisis de diversidad
Mejoramiento genético:
SelecciónAsistida porMarcadores(MAS)
Plantas con genotipo aa
Selección: plantas homocigotas m/m”
Análisis por PCR: cebadores para el loci M/ m
Extracción de ADN
Loci A/a(genotipo de interés: aa).
LocimarcadorM/m
Genotipo mm Mm MM mm MM
Cebador
Cebador
M m
A a
Biol. (Mgter) Laura Torres
Peritaje forense
Biol. (Mgter) Laura Torres
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Electroforesis capilar: resolución de marcadores microsatélites (SSRs): tamaño en pares de bases
1000750
1 2 3 4 5 6 7
870 pb
M M1 M2 M3 M4 TE TS
Detección del agente causal del “maize bushy stunt”
Microfotografía electrónica de fitoplasmas
Planta sintomática de maíz
CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
1- Amplificación por PCR
2- Digestión con enzimas de restricción
3- Electroforesis
Biol. (Mgter) Laura Torres
HaeIII RsaI
Figura 1. RFLP analysis of 1.2-kb PCR products (R16F2/R16R2 primers) of 16S rRNA genedigested with HaeIII (A) y RsaI (B) restriction enzymes S, 100 bp.ladder (Promega), fragment size (bp) from
Regiones genómicas evolutivamente conservadas
AluI
Figura 3. AluI restriction profile of a phytoplasmal tuf gene fragment amplified with primer pair fTufAy/rTufAy . Phytoplasma strain abreviations : AAY (American aster yellows), ACLLcba, ACLLctes y ACLLjun (Argentinian catharanthus little leaf), ChamAY (Chamomilla aster yellows), MBS (Maize bushy stunt) y DauAY (Daucus aster yellows). S, 100 bp ladder (Promega).
Taxonomía y filogenia de Fitoplasmas
Regiones genómicas mas variables
CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
Biol. (Mgter) Laura Torres
NlaIII
RsaI
Tsp509I
TaqI
MseI
(CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
Biol. (Mgter) Laura Torres
AY1 (16SrI-B)
Maryland aster yellows (16SrI-B)
SAY (16SrI-B)
MBS (16SrI-B)
PRIVC (16SrI-B)
AV2192 (16SrI-L)
IOWB (16SrI-N)
OAY (Ca. Phytoplasma ateris)
PaWB (16SrI-D)
AVUT (16SrI-M)
RapePh (16SrI-C)
Valeriana rrnA (16SrI-M)
ACLLcbaI
ACLLctes
ACLLcbaII
ChamAY
Soybean purple stem (16SrI-O)
SPS (16SrI-O)
ChLL (16SrI-Q)
Valeriana rrnB (16SrI-M)
Alfalfa stunt (16SrI-B)
THP Ca. Phytoplasma licopersicy
STRAWBERY multiplier (16SrI-K)
BBS3 (16SrI-E)
Blueberry stunt (16SrI-E)
Carrot proliferation (16SrI-A)
Oat proliferation (16SrI-A)
HYDP (16SrI-A)
BB (16SrI-A)
STRAWBERY phylloid fruit (16SrI-R)
CPh rrnA (16SrI-C)
KVG (16SrI-C)
CPh rrnB (16SrI-C)
KVE (16SrI-C)
ACLR AY 16SrI-F
CVB (16SrI-F)
MPV
JHP (Ca. Phytoplasma japonicum)
AusGY (Ca. Phytoplasma australiense)
Stolbur
A laidlawi
A palmae
96
81
69
100
100
99
74
63
48
95
65
90
73
72
65
59
57
55
42
10036
2238
17
32
21
6
3
0 .001
Figura 6. Phylogenetic tree constructed by the neighbour-joining method of 16S rRNA gene sequences from 31 phytoplasmas 16SrI -aster yellows representative subgroups strains, other related 16Sr phytoplasmas groups, and A. palmae y A. laidlawi as the outgroup. The numbers on the branches are bootsatrap (confidence) values. GenBank accessions numbers of phytoplasmal 16S rRNA gene sequences: AY1 (Maryland aster yellows) AF322644; SAY (Severe aster yellows) M86340; MBS (Maize bushy stunt) AY265208 ; PRIVC (Primose virescence) AY265210; AV2192 (Aster yellows phytoplasma) AY180957; IOWB (Ipomea obscura witche´s -broom) AY265205; OAY (Ca. Phytoplasma asteris) M30790; PaWB (Paulownia witche´s -broom) AY265206; AVUT (Aster yellows phytoplasma) AY265209, *, strains sequenced in this study. Bar represents 1 substitution in
1000 nt.
Biol. (Mgter) Laura Torres
Análisis filogenético
Marcador SCARS
Sequence Characterized Amplified Regions
Biol.(Mgter) Laura Torres.
En tomate:Marcador asociado a resistencia a Verticillium (loci Ve/ve).
SNPs (SingleNucleotidePolimorphism)
Biol. Mgter. Laura Torres
AFLPs RFLPs RAPDs SSRs (Microsatélites)
Ensayo de de detección
Rápido Lento Rápido Rápido
Reproducibilidad Alta Alta Baja Alta
Tipo de marcador Co-dominante ó dominante*
Co-dominante Dominante Co-dominante
Información sobre la secuencia
No No No Si
* según el análisis se realice mediante softwere o visualmente
Biol. (Mgter) Laura Torres
Biol.(Mgter) Laura Torres.
1: valor mas bajo5: valor mas altoDom: dominanciaCod: codominancia
Utilidad de los marcadores genéticos y moleculares1- Fingerprinting (huella genética: Identidad)
2- Conservación y Uso de Recursos Genéticos:
- Construcción de colecciones nucleares (bancos de germoplasma)
- Relaciones filogenéticas
- Identificación de germoplasma elite
3- Mapas Genéticos
3- Diversidad y Estructura Genética:
- Nivel de heterocigosidad
- Frecuencias génicas y genotípicas
4- Diagnóstico: salud humana, animal, fitopatología
6- Agroindustria
7- Peritajes forenses
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético
7- Conocimiento y Uso del Sistema Reproductivo:
- Grado de alogamia.
- Sistema de incompatibilidad.
- Identificación temprana del sexo del organismo.
8- MAS (Selección Asistida por Marcadores):
Resistencias a factores bióticos yabióticos
- Grado de introgresión
- Desarrollo de líneas puras.
- Protección legal: obtenciones de genotipos de propagación agámica . Mejora de caracteres cuantitativos (QTLs: Quantitative trait loci
Métodos de selección: (detección de genotipos superiores)
Convencional Vs ¿…?
Asistida por marcadores (MAS)
Costo - beneficio
-Fácil identificación de fenotipos segregantes
- Esquemas de retrocruzamientos: observación visual de fenotipos a campo y análisis de tejidos en laboratorio.
- Expresión tardía del carácter de interés.
- Proyecto privado o público? Tiempo de retorno.
- Costo de implementación: en disminución.
- Efectividad: en incremento. Influenciada por factores ambientales y epigenéticos.
- Esquemas de retrocruzamientos: rápida y certera identificación de individuos con el genoma recurrente.
↑ grado de precisión
↑ tasa de progreso
↓ tiempo de obtención del producto.
- MAS no es la “LA” solución …….
Convencional
y ¿…?Asistida por marcadores (MAS) Mayor evidencia empírica
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Empresas biotecnológicas
Agricultura:
Caracterización de genotipos
Diagnóstico de patógenos
Análisis del control genético de caracteres cuanti y cualitativos
Mejora genética
Identificar MM ligados a caracteres de interés
Retrocruzamientos asistidos por MM
Cadena Agro-alimentaria:cuantificación y seguimiento de materia prima en productos elaborados
Cs. Biológicas:
Desarrollos tecnológicos para detección de variaciones cuanticualitativas de ADN y proteínas
Empresas producción y servicios agropecuarios
Empresas de servicios para industria agro-alimentaria
Perspectiva de los Marcadores Moleculares
Biol. (Mgter) Laura Torres