Ministerul Educatiei si Tineretului al Republicii Moldova

Universitatea de Stat din Moldova

Facultatea de Biologie si Pedologie

TEMA:ADN-ul spirala vietii

A efectuat studenta anului ll, grupa B-31

Manea Elena

A verificat doctor in stiintele biologice,lector superior

Frunza Maria

Chisinau, 2011

CUPRINS:1.Materialul genetic si functiile sale...32.Structura macromoleculara a acizilor nucleici.53.Structura macromoleculara a ADN..9 3.1.Denaturarea si renaturarea ADN11 3.2. Polimorfizmul structural al ADN..114.Replicatia ADN..14 4.1.Aparatul enzimatic de replicatie.15 4.2.Energia necesara replicatiei ADN..18 4.3.Replicatia ADN "in vitro"..19Bibliografie...211. Materialul genetic si functiile sale Organismele care alcatuiesc populatia unei specii au un ansamblu de caractere morfologice, de nutritie, de reproducere care le diferentiaza de populatiile altor specii. Aceste caractere nu sunt specifice numai populatiei unei generatii; ele sunt transmise descendentilorin asa fel, incit, in succesiunea de generatii, toate caracterele manifesta stabilitate in timp, in sens ca generatia ascendenta este asemanatoare generatiilor descendente in privinta caracterelor, se datoreste unui complex de functii, grupate sub numele de ereditate.

Astfel, prin ereditate se intelege totalitatea functiilor care asigura mostenirea caracterelor,in succesiunea de generatii descendente fiind copiile ascendentilor din care au provenit. Asadar, ereditatea apare ca un complex de functii analoge respiratiei, digestiei, circulatiei sangvine. Cum fiecare complex de functii este indeplinit in organism de un aparat sau un sistem, tot asa si ereditatea este apanajul functional al unui aparat sau sistem care intra in constitutia organismelor sau a celulelor unui organism.

Un fenomen contrar ereditatii este variabilitatea caracterelor. Fenomenul variabilitatii consta in schimbarea discontinua a caracterelor sau a asocierilor de caractere. Starea schimbata a caracterelor este transmisa ca atare de-a lungul generatiilor. Numai schimbarile transmisibile fac parte din fenomenul variabilitatii. Caracterele morfologice, fiziologice, biochimice ale organismelor au o organizare calitativa si cantitativa, se gasesc in raporturi caracteristice pentru fiecare organism. Totodata, in dezvoltarea ontogenetica a macroorganismelor, din faza de zigot pina la faza de adult, complexul de caractere se schimba necontenit. In fiecare faza apar caractere noi, unele dispar, altele persiste in cursul intregii vietii, iar altele prezinta variatii cantitative inseminate in fiecare faza a dezvoltarii. Persistenta, disparitia sau aparitia caracterelor sunt supuse unor reguli, mereu aceleasi pentru o specie data. Ereditatea, variabilitatea, determinismul calitativ si cantitativ sunt functii esentiale pentru vietuirea organismelor sau a speciilor, in conditiile actiunii factorilor de mediu, factori care se gasesc intr-o continua schimbare. Toate aceste 3 fenomene constituie obiectul de studiu al unei stiinte bine conturate genetica - stiinta care, prin metodele sale, cauta sa elucideze regulile si mecanismele care asigura stabilitatea caracterelor de-a lungul generatiilor, ca si variabilitatea lor. Componenta de baza care asigura ereditatea, variabilitatea si determinismul caracterelor este acidul dezoxiribonucleic (ADN) si de aceea acesta este considerat ca material genetic. ADN, ca si alta substanta care intra in constitutia materiei vii, are o structura adecvata functiilor pe care le indeplineste, dar spre deosebire de alte substante, cu functii diferite, ADN are un mecanism de biosinteza particular si un mod caracteristic de a influenta celelalte sisteme biochimice ale organismului, ceea ce face sa fie considerat ca material de baza al aparatului genetic. Acizii ribonucleici (ARN) sint complexe macromoleculare, structural si functional in relatie directa cu ADN. Categoriile de ARN sint mijloacele de baza prin care ADN influenteaza si conditioneaza celelalte sisteme biochimice ale organismelor.

In monografiile si tratatele clasice de biochimie se descriu 3 categorii de macromolecule participante in structura materiei vii: glucidele, lipidele si proteinele. Acizii nucleici (ADN si ARN) sunt descrisi ca anexe ale proteinelor, fiind considerati ca un grup prostetic al unor heteroproteine si nucleoproteine. Dar cercetarile sin ultimii 20 de ani au demonstat ca acizii nucleici sunt substante de sine statatoare, conturate functional si structural mai bine decit oricare alta categorie de macromolecule. Complexarea acizilor nucleici cu proteinele pot fi usor desfacute prin mijloace chimice simple; acizii nucleici purificati de resturile proteice isi pastreaza functiile lor esentiale. Mai mult, unii acizi nucleici extrasi si purificati de la organisme inferioare, cum sunt virusurile, au capacitatea de a reface structural si functional particule virale intregi, determinind prin functia lor si sinteza proteinelor specific virusului din care acizii nucleici au fost extrasi, cit si sinteza propriilor lor molecule. Astfel de proprietati, proteinele nu le-au manifestat niciodata.

Aceste conditii, precum si faptul ca pina in present nu se cunoaste vietuitoare care sa nu aiba in constitutia ei acizi nucleici ridica problem importante in privinta primordialitatii acizilor nucleici fata de proteine si invers, in procesele ancestrale ale aparitie vietii pe pamint, procese devoltate cindva in etapele de chimiogeneza si biogeneza ale evolutiei materiei vii. Desi aceste etape nu sint inca reproductibile in laborator, este improbabil ca prima forma de organizare a materiei vii sa fi fost lipsita de acizi nucleici. Acizii nucleici, prin funtiile lor, asigura ereditatea, variabilitatea si determinismul caracterelor, ei reusesc sa interconecteze discontinuitatea formelor de organizare a materiei vii, in unitatea continuitatii vietii. Extremitatea de plecare a acestei continuitati impune ca esentiala existent acizilor nucleici, deoarece acestia, pe linga faptul ca sunt substratul autoreproducerii, trasatura definitorie a materiei vii, determina si celelalte trasaturi care definesc organismele. Mai mult, daca respiratia, nutritia sint si ele proprietati definitorii ale materiei vii, acestea au o intindere mai restrinsa decit autoreproducerea. Virusurile, atit de raspindite in biosfera, desi nu au un metabolism autonom, ele au un aparat de autoreproducere propriu, format din acizi nucleici (ADN sau ARN), care este present in orice din fazele ciclului evolutiv al vietii lor. Acest aparat poate asigura autoreproducerea independent de proteina anexa cu care alcatueste paricula virala matura, deoarece acidul nucleic al acestuia, purificat de orice urma de proteina si introdus intr-o celula gazda, reproduce vietuitoare intreaga. Astfel, acizii nucleici nu mai pot fi considerati ca anexe ale proteinelor, ca un grup prostetic dintr-o categorie de heteroproteine. Situatia acizilor nucleici, in privinta functiilor principale, in raport cu alte substante macromoleculare, este urmatoarea:

Glucidele: surse energetice si plastice;

Lipidele: surse energetice si plastic;

Proteinele: functii enzimatine, plastic, hormonale, energetice;

Acizi nucleici: material genetic; asigura ereditatea si variabilitatea. ADN este sintetizat in celula vie din compusi chimici obisnuiti (glicica, bioxid de carbon, acid formic, glucoza, fosfati), compusi care se gasesc fie sub forma materialului nutritiv obisnuit al organismelor, fie sub forma produsilor metabolismului intermediar. Compusii precursori ai ADN sint substante cu greutate moleculara mica, iar ADN este o macromolecula cu greutate moleculara de ordinal milioanelor. Pentru biosinteza unei astfel de macromolecule din compusi chimici simpli sint necesare etape metabolice multiple si un consum mare de energie. Totodata, biosinteza are caracterul unui determinism strict, care da posibilitatea exercitarii functiilor de ereditate si variabilitate.

Pentru a usura intelegerea bazelor moleculare ale ereditatii si variabilitatii organismelor, in monografia de fata s-a adaptat o anumita succesiune in expunerea datelo. S-a analizat intii constitutia chimica a acizilor nucleici si modul in care acestea sunt sintetizati, plecind de la moleculele simple cu greutate moleculara mica. S-a trecut apoi analiza generala a mecanismelor biochimice, prin care acizii nucleici si in special ADN isi exercita functiile in determinismul genetic. In al treilea rind, s-a analizat modul in care ADN este organizat structural si functional in aparatul genetic, precum si felul in care isi exercita functiile sale de ereditate si variabilitate. In sfirsit s-a analizat citeva modele de aparat genetic, mai bine cunoscut, la bacteriofagi si bacterii, si s-au conturat faptele experimentale care sugereaza posibilitatea interpretarilor moleculare in genetica umana. Ceea ce strabate ca un fir conducator intreaga monografie este faptul ca aparatul genetic si materialul sau de baza, ADN, isi exercita functiile in interdependenta cu celelalte sisteme sau aparate metabolice. Dupa cum aparatul circulator al unui macroorganism nu poate functiona fara singe, tot asa materialul ereditar (ADN) din apartul genetic nu poate functiona fara celelalte componente ale celului sau organismului.2. Structura macromoleculara a acizilor nucleici Descoperirea fenomenului de transformare in anul 1944 a constituit piatra fundamentala pentru genetica moleculara, stiinta care avea sa revolutioneze biologia. In perioada urmatoare s-au intensificat cercetarile privind acizii nucleici, fapt care a permis descoperirea structurii lor moleculare, a mecanismului de inregistrare a informatiei cu ajutorul codului genetic, a replicatiei semiconservative a ADN, a fenomenului de reglaj genetic, a mecanismului molecular al mutatiilor. Primele cercetari privind acizii nucleici au fost realizate inca in secolul trecut. Astfel, in anul 1869 biochimistul german F. Miescher a descoperit in laptii somonului (Salmo salar) o substanta pe care a denumit-o nucleina. Studiul acesteia a aratat ca este formata dintr-o proteina si un acid organic care contine fosfor. Meritul de a fi identificat si izolat acest acid organic a revenit histologului R. Altman in 1899 care l-a denumit acid nucleic, denumire ce se pastreaza si in prezent. Cercetari ulterioare, efectuate in primele decenii ale secolului al XX-lea, au aratat ca exista doua tipuri de acizi nucleici, si anume acizi dezoxiribonucleici (ADN), care se gasesc in mare cantitate in nucleul celulelor vegetale si animale, in cromozomul bacterian si la unele virusuri si acizi ribonucleici (ARN), care se gasesc atit in nucleu cat si in citoplasma celulara, precum si in unele virusuri. In anul 1953 a avut loc o descoperire de mare importanta in istoria acizilor nucleici, deoarece in acest an J. Watson si F. Crick studiind, prin difractie in raze Rntgen, structura acidului dezoxiribonucleic, au reusit sa descopere structura macromoleculei de ADN, care a facut posibila dezvoltarea considerabila a cercetarilor privind acizii nucleici. Pentru descoperirea structurii macromoleculei de ADN, cercetatorii J. Watson, F. Crick si M. Wilkins au fost distinsi cu premiul Nobel in anul 1962. Acizii nucleici sunt substante chimice macromoleculare alcatuite din unitati mai simple denumite nucleotide. O nucleotida este alcatuita dintr-o baza azotata, un zahar si un radical fosforic. Bazele azotate din molecula acizilor nucleici sint de doua tipuri: baze purinice si baze pirimidinice, ele rezultind dintr-un nucleu comun numit purina si, respectiv, pirimidina.

Fig.1. Bazele azotate purinice si pirimidinice ce intra in alcatuirea ADN

Purina este o baza azotata alcatuita dintr-un heterociciclu de 9 atomi, din care 5 de carbon si 4 de azot, in timp ce pirimidina are o alcatuire ceva mai simpla, fiind o baza azotata formata dintr-un heterociclu de 6 atomi din care 4 de carbon si 2 de azot. Prin substitutia atomilor de hidrogen apar o multitudine de baze azotate purinice si pirimidinice care intra in alcatuirea acizilor nucieici din materia vie.

Bazele azotate purinice care intra in alcatuirea aciziior nucleici sint adenina (6-aminopurina) si derivatii sai (2-metil adenina, 6-metilaminopurina, 6-dimetilaminopurina), guanina (2 amino-6-oxipurina) si derivatii sai (1-metilguanina si 2-metilaminoguanina).Bazele pirimidinice care intra in alcatuirea acizilor nucleici sunt: citozina, uracilul, 5- metil citozina si timina. In ARN de la drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae) se gasesc niste tipuri deosebite de baze azotate, cum sunt: hipoxantina, N-dimetil guanina, 1-metil guanina, dihidrouracilul si pseudouracilul. Zaharurile care intra in alcatuirea acizilor nucleici sunt riboza la ARN si dezoxiriboza la ADN. Aceste doua zaharuri sunt niste pentoze, avind deci 5 atomi de carbon.

Fig.2. Zaharurile ce intra in alcatuirea acizilor nucleici

Radicalul fosforic care intra in alcatuirea acizilor nucleici are trei hidroxili liberi care pot fi esterificati. In cazul acizilor nucleici are loc esterificarea a doi hidroxili, astfel ca ei sunt fosfodiesteri.

Fig.3. Radicalul fosforic si fosfodiesterul Prin unirea unei baze azotate cu un zahar (riboza sau dezoxiriboza) se obtin asa numitele nucleoside care pot fi deci -D-ribofuranozide sau respectiv -D-dezoxiribofuranozide.

Prin fosforilarea nucleosidelor se obtin nucleotidele, care sunt unitati de baza ale acizilor nucleici. De pilda, prin fosforilarea nucleosidelor se obtin doua tipuri de nucleotide izomere, dupa cum radicalul fosforic se ataseaza de sau . Fenomenul prezentat mai sus are un caracter general, deoarece intotdeauna prin fosforilarea nucleosidelor formate pe baza dezoxiribozei se obtin cite doua nucleotide izomere. Prin fosforilarea nucleosiclelor care au la baza riboza se obtin cite trei nucleotide izomere, dupa cum radicalul fosforic se ataseaza la , sau .

Fig.4. Prin fosforilarea dezoxiadenozinei se obtin 2 tipuri de nucleotide izomere ( si ) In ceea ce priveste adenozina 5-fosfat, ea poate sa existe sub trei forme, in funciie de numarul de radicali fosforici atasati, si anume: monofosfat (AMP), difosfat (ADP) si trifosfat(ATP). Aceste nucleotide au un rol important in schimbul de energie necesar proceselor vitale. In mod similar exista nucleotide monofosfat, difosfat gi trifosfat corespunzatoare celorlalte baze azotate. Prin inlantuirea nucleotidelor se obtin oligonucleotide, care au pina la zece nucleotide si polinucleotide sau acizi nucleici in care intra mai mult de 10 nucleotide. Bazele azotate purinice si pirimidinice se pot afla sub doua forme prin schimbarea pozitiei unui atom de hidrogen, fenomen denumit tautomerie. Existenta tautomeriei, relative rara, are nu numai importanta chimica, ci si genetica, deoarece da o explicatie unor modificari spontane sau experimentale intervenite in macromolecula acizilor nucleici.

Tautomeria determina schimbari ale capacitatii moleculei respective de a intra in reactii chimice. Astfel, atomii de hidrogen atasati la molecula timidinei si guaninei in pozitia C6 au de obicei forma cetonica (keto C=O) si numai in cazuri foarte rare se prezinta sub forma enolica (enol C-OH). In mod similar, atomii de azot atasati inelului purinic si pirimidinic se afla in mod normal sub forma amino (NH2) si numai in cazuri foarte rare sub forma imino (N-H). Din punct de vedere biologic faptul ca atomii de hidrogen isi pastreaza in general pozitia in molecula, are importanta pentru stabilitatea macromoleculei de ADN. Din cauza fenomenului de tautomerie, se produc asa numitele erori de imperechere, prin care adenina se imperecheaza cu citozina, iar guanina cu timina. Aceasta este una din cauzele mutatiilor punctiforme la nivel molecular. Secventa nucleotidelor constituie ceea ce se cheama structura primara a acizilor nucleici, in timp ce forma bicatenara constituie structura secundara. Forma pe care o ia catena singura sau molecula bicatenara, cu toate rasucirile pe care le sufera, alcatuiesc structura tertiara, iar interactiunea intre doua sau mai multe molecule bicatenare, structura cuaternara a acizilor nucleici. De pilda, in sperma porcului mistret, la unele virusuri si bacterii, s-a constatat ca ADN are o forma circulara, fapt pentru care cele doua catene nu pot fi complet separate neavind capete libere. Aceasta structura tertiara a ADN permite ca moleculele de ADN relativ lungi sa poata incapea in containere mici. Modul de dispunere a doua sau mai multe molecule de ADN bicatenar in cromozomi alcatuiesc structura cuaternara a acizilor nucleici.3. Structura macromoleculara a ADN

Cercetarile lui J. Watson si F. Crick (1953) au aratat ca macromolecula de ADN este un helix dextrogen format din catene polinucleotidice antiparalele, infasurate plectonemical in jurul unui ax comun. Distanta dintre doua nucleotide succesive este de 3,4, iar pasul elicei este de 34, ceea ce corespunde la 10 perechi de nucleotide. Diametrul helixului este de 20. In cadrul unei catene polinucleotidice, legatura dintre doua nucleotide succesive se realizeaza cu ajutorul radicalilor fosforici. Acestia asigura legatura intre carbonul 5 al dezoxiribozei unei nucleotide cu carbonul 3 al dezoxiribozei unei alte nucleotide. In felul acesta catenele polinucleotidice au sensul 53. Spre deosebire de ARN, care este, de regula, format dintr-o singura catena polinucleotidica, ADN este alcatuit din doua catene antiparalele, legate intre ele intotdeauna printr-o legatura intre o baza azotata purinica si una pirimidlnica. Ca urmare, in macromolecula de ADN nu exista decit urmatoarele 4 tipuri de legaturi:

adenina-timina timina-adenina guanina-citozina citozina-guanina.

Avind o astfel de structura, cele doua catene polinucleotidice ale unei macromolecule de ADN sint complementare, deoarece de ordinea in care se succed nucleotidele intr-una depinde ordinea nucleotidelor in cealalta. Bazele purinice sunt unite intre ele prin legaturi duble sau triple de hidrogen, care fiind in numar suficient de mare de-a lungul macromoleculei, asigura o coeziune suficienta a acesteia. Legaturile de hidrogen se formeaza intre un atom de hidrogen care are o anumita sarcina pozitiva si un atom acceptor covalent, cu sarcina electrica negativa.

Fig.5. Un segment din macromolecula de ADN In general, legaturile chimice slabe au eficienta numai cind moleculele respective au o structura complementara, adica atunci cind o protuberanta a unei molecule se afla opusa unei cavitati a unei alte molecule. ADN-ul are o structura helicoidala regulata, din cauza ca cele doua catene polinucleotidice au o structura complementara. Intre aceste doua catene polinucleotidice exista o multime de legaturi de hidrogen: intre adenina (amino) si timina (keto) sau intre guanina (keto) si citozina (amino). In centrul macromoleculei se afla bazele purinice si pirimidinice, fapt care le limiteaza contactul lor cu apa, ele fiind de altfel insolubile in apa sau putin solubile. Faptul ca macromolecula de ADN este formata din doua catene complementare ii mareste stabilitatea si ii asigura o structura regulata. Aceasta deoarece toate perechile de baze purinice-pirimidinice au aceeasi dimensiune, in timp ce luate separat, molecula pirimidinica este mai mica decit cea purinica. Intre moleculele de adenine-timina exista doua legaturi de hidrogen, iar intre guanina-citozina exista trei legaturi de hidrogen. Aceasta inseamna ca regiunile macromoleculei de ADN mai bogate in guanina-citozina prezinta o stabilitate mai mare comparativ cu cele bogate in adenine-timina. Macromolecula de ADN este stabila la temperature fiziologice, pe de o parte din cauza numarului mare de legaturi chimice slabe intre catenele polinucleotidice, iar pe de alta parte din cauza ca ruperea helixului dublu catenar aduce molecule hidrofobe de baze azotate in contact cu apa. De aceea, o molecula de acid nucleic cu mai mult de 10 perechi de nucleotide este perfect stabila la temperatura camerei.3.1. Denaturarea si renaturarea ADN

Prin incalzirea solutiei de ADN se rup legaturile de hidrogen si ca urmare cele doua catene se separa. Ca urmare viscozitatea solutiei se reduce considerabil. Fenomenul se cheama denaturare. Pentru AND-ul de la diferitele specii, punctul de topire (meltingpoint) este diferit:

Diplococcus pneumonia - 86C

Escherichia coli - 90C

Serratia marcescens - 94C

Mycobacterium phlei - 97C Cresterea temperaturii punctului de topire este direct proportionala cu cresterea frecventei legaturilor de tip guanina-citozina. AND-ul care contine numai legaturi adenina-timina are punctul de topire 65C. Din aceasta cauza temperatura punctului de topire poate servi ca indicator al compozitiei in baze a solutiei de ADN. Denaturarea ADN bicatenar se poate realiza si prin alte mijloace fizice si chimice, fenomen acompaniat de o marire de pina la 40% a adsobtiei radiatiei ultraviolete de 2580. Fenomenul se numeste efect hipercromic. Daca ADN-ul denaturat este racit brusc, el ramine sub forma monocatenara, adica denaturat. Dimpotriva, in cazul ce se realizeaza o racire treptata se refac legaturile de hidrogen intre catenele complementare. Fenomenul se cheama renaturare iar ADN-ul este renaturat.

Hibridarea moleculara de tip ADN-ADN si ADN-ARN se poate realiza prin folosirea tehnicii de absorbtie a moleculelor monocatenare pe membrane filtrante de derivati celulozici. Datorita complementaritatii moleculelor se realizeaze hibrizi moleculari de tip bicatenar. Prin realizarea de hibrizi de tip ADN-ADN de origini diferite se poate determina gradul de complementaritate a nucleotidelor si, respectiv, inrudirea filogenetica a organismelor de la care s-a preluat ADN-ul. Hibridarea moleculara ADN-ARN permite localizarea pe cromozomi a genelor care determina sinteza diverselor tipuri de ARN (mesager, ribozomal si de transfer), precum si cit reprezinta din genom genele respective.3.2.Polimorfizmul structural al ADN Cerceterile lui J. Watson si F. Crick au permis cunoasterea structurii moleculare de baze a ADN, care are o resucire spre dreapta (dextrogira). Multi ani aceasta a fost considerata structura unice a ADN. In perioada anilor '70 s-a descoperit ca este posibila si o resucire spre stinga, care determina o structura in zig-zag a moleculei, fapt pentru care a fost denumit ADN-Z. In prezent se vorbeste de un adevarat polimonism structural al ADN. Recent, s-au elaborat doua metode elegante de determinare a secventei nucleotidelor in macromolecula de ADN (W. Gilbert Ia Universitatea Harvard si F. Sanger la Cambridge), fapt care a permis cunoasterea a numeroase secvente de nucleotide. S-a inceput chiar un program pentru descifrarea completa a ADN din genomul uman. Modelui Watson-Crick privind structura macromoleculara a ADN a fost elaborat pe baza rezultatelor lui R. Franklin si M. Wilkins care au utilizat difractia in raze X. In perioada anilor '70 s-au creat tehnici de sinteza chimica a unor segmente de nucleotide si astfel obtinerea unor cristale de molecule mici de ADN (mini dublu helixuri de ADN). Datorita ordinei nucleotidelor, in macromolecula de ADN variaza pasul helixului, inclinarea bazelor in raport cu axul helixului. S-a mai descoperit ce helixul de ADN este sediul unor miscari continue care se desfasoara in unitati de timp de ordinul picosecundei (1 milionime dintr-o milionime de secunde). Au loc astfel deformari ale catenelor de nucleotide, precum si miscari mai lente la nivelul perechilor de nucleotide (A-T si G-C). In interiorul celulei, molecula de ADN este supuse unor constringeri fizico-chimice, mai ales din interactiunea cu proteinele, astfel ca are loc o suprarasucire. Aceasta structura se observa mai ales in cazul moleculelor mici de ADN, ca de pilda la AND-ul unor anumite virusuri, care ia forma cifrei 8. In alte cazuri pot avea loc schimbari structurale, cum sunt separerea locala a catenelor, si schimbarea resucirii helixului de la dreapta la stinga, care se observa mai ales atunci cind perechile de nucleotide A-T alterneaze regulat cu cele G-C. Suprarasucirea se observe si la moleculele mai mari, cum este cazul cromozomului bacterian format din circa 4 milioane de perechi de nucleotide, cromozom ce formeaze un cerc. In felul acesta moleculele de ADN atit in celula procariota cit si in celula eucariota pot ocupa un spatiu minim. In ce priveste structura macromoleculei de ADN, modelul Watson-Crick postuleaza ca helixul are o rasucire spre dreapta, cele doua lanturi polinucleotidice fiind antiparalele rasucite in jurul unui ax comun si legate intre ele prin punti de hidrogen. Diametrul spiralei este de 20, distanta intre doua perechi succesive fiind 3.4, iar o rasucire completa are 10 perechi de baze, ceea ce inseamna ca periodicitatea este de 34. Cerceteri mai recente si mai rafinate au demonstrat ca molecula de ADN poate avea 6 forme diferite notate A, B, C ,D, H si Z. Modelul Watson-Crick corespunde in mare masure pentru tipul B, care este caracteristic unor solutii cu o concentratie ionica mai redusa, cum este cazul celulelor vii. Tipul B are in medie 10 perechi de baze intr-o rasucire a helixului, si un spatiu de 3,4 intre doua perechi succesive de nucleotide. Mai recent s-a demonstrat ca molecula de ADN isi poate asuma si o configuratie nu numai in dublu helix ci si in cvadruplu-helix. In acest din urma caz, molecula alcatuita din 4 lanturi polinucleotidice, prezinta o perioada egala cu 136, are 20 perechi de nucleotide per perioada si un unghi fata de ax cle 18. Acest tip de cvadruplu-helix se gaseste la unele forme de viata; dar a fost sintetizat si artificial. Tipul Z al ADN. Modelul Watson-Crick al macromoleculei de ADN considera ca dublul helix clasic prezinta o rasucire spre dreapta (ADN tipul B). Inca in 1967 F. Pohl a aratat ca o molecula de ADN, in care perechile G-C sint distribuite probabilistic, poate adopta o conformatie in care rasucirea este spre stinga. In 1980, A. Rich la Institute of Technology din Massachusetts si K. Itakura la Universitatea din California (Duarte), au aratat ca mici molecule de ADN cu secvente de nucleotide de tip CGCG si CGCGCG prezinta o rasucire spre stinga, rasucire care cuprinde 12 baze. In acest caz bazele C si G pierd echivalenta si in consecinta scheletul fosforilat nu se mai aliniaza sub forma unui helix continuu, ci formeaza un zig-zag. De aici provine denumirea de tipul Z al ADN. In consecinta, prezenta unor perechi de baze G-C nu antreneaza obligatoriu aparitia unei forme Z a moleculei de ADN, dar poate realiza trecerea tipului B in Z. Ca urmare, moleculele de ADN bogate in perechi de nucleotide ce contin G-C pot exista sub doua forme B si Z.

Fig.6. Structura moleculara a ADN-B si ADN-Z

Trecerea de la tipul B la cel Z se realizeaza astfel: la helixul B are loc o separare a catenelor, apoi are loc intoarcerea uneia in raport cu cealalta, si, apoi, se reimperecheaza cu o schimbare in orientarea bazelor in raport cu radicalul fosfat. In acest fel molecula se reorganizeaza sub forma Z. Tranzitia tipului B in Z se realizeaza in conditiile unei concentratii saline puternice (0,7 M de MgCl2) sau prin fixarea unei grupe metil la citozina. Pentru a studia localizarea acestui ADN-Z in cromozomi, s-au obtinut anticorpi specifici formei Z. In cazul cromozornilor uriasi de la Drosophila melanogaster s-a demonstrat ca ADN-Z este situat in regiunile in care materialul genetic nu este activ. La om s-a aratat ca exista numeroase secvente de nucleotide capabile sa adopte forma Z. La Chironomus thummi s-a identificat prin marcaj fluorescent cu anticorpi, prezenta ADN-Z in regiuni active si inactive ale cromozomilor uriasi. Se pare ca tipul ADN-Z intervine in reglajul genetic. In general acest tip este mai putin stabil in conditii fiziologice normale dar el poate fi stabilizat prin metilarea citozinei. Prin aceasta metilare are loc trecerea tipului B in tip Z a unei secvente bogate in perechi de nucleotide G-C. Schimbarea spre tipul Z a unei regiuni din capul unei gene determina imposibilitatea decodificarii ei, si ca urmare, are loc un proces de inactivarea sa. G. Felsenfeld (1982) a aratat ca tipul Z fixeaza foarte puternic histonele, asttel ca are loc o inactivare a genelor. Dupa ce genele recapata forma B ele redevin active. Inversarea sensului helixului modifica astfel accesibilitatea informatiei genetice pentru decodificare. Modelul senestrogir al ADN (tipul Z) are numeroase implicatii biologice, legate nu numai de reglajul genetic, ci si de accesibilitatea moleculei la agentii mutageni si/sau carcinogeni. Structura moleculara a ADN-Z este mult mai deschisa, si, ca urmare, mai usor expusa unor solutii sau substante straine. Iata de ce s-a emis ipoteza ca tipul Z al ADN este implicat in transformarea protooncogenelor in oncogene active si deci in transformarea maligna a celulelor.4. Replicatia ADN Imediet dupa descoperirea structurii moleculere a ADN s-a eleborat ipoteza (J. D. Watscn si F. H. Crick, 1953) ca sinteza sa se realizeaza dupa tipul semiconservativ. Aceasta ipoteza porneste de la premisa ca in macromolecula de ADN, alcatuita din doua lanturi polinucleotidice complementare, are loc la un moment dat ruperea legaturilor de hidrogen dintre cele doua lanturi polinucleotidice, care devin astfel independente si servesc fiecere ca matrita pentru formarea unui lant polinucleotidic complementar. Ca urmare, dintr-o molecula veche, de ADN se formeaza doua macromolecule dar care sunt noi numai pe jumatate. Fiecare macromolecula noua de ADN apere deci ca fiind formate dintr-un lant polinucleotidic vechi si unul nou sintetizat.

Fig.7. Replicatia macromoleculei de ADN Studiul sintezei ADN "in vivo" si "in vitro" a demonstrat ca aceasta se realizeaza dupa tipul semiconservativ propus de J. D. Watson gi F. H. Crick, deoarece acest mecanism asigura cu o inalta fidelitate sinteza noilor macromolecule de ADN identice cu cele vechi.Tinind seama ca sinteza ADN se realizeaza dupa tipul semiconservativ, in acest proces cele doua catene servesc drept matrite pentru catenele nou sintetizate si prin acest proces informatia ereditara este transmisa fidel noilor macromolecule. Procesul de sinteza a ADN a primit denumirea de replicatie.

Sinteza ADN se realizeaza in trei etape mai importante:1. In prima etapa are loc sinteza nucleotidelor pirimidinice de tipul acidului uridilic si a nucleotidelor purinice de tipul acidului inosinic. Acizii uridilic gi inosinic sunt ultimii precursori ai tuturor nucleotidelor care intra in alcatuirea ADN si ARN. 2. In etapa a doua are loc sinteza nucleotidelor care intra direct in alcatuirea ADN, respectiv a urmatoarelor nucleotide: dezoxiadenozintrifosfat, dezoxiguanozintrifosfat, dezoxicitidintrifosfat, timidintrifosfat. Aceste nucleotide sint sintetizate pornind de la acidul uridilic si cel inosinic.

3. In etapa a treia are loc polimerizarea nucleotidelor si formarea de lanturi polinucleotidice. 4.1.Aparatul enzimatic de replicatie

Replicatia ADN se realizeaza cu ajutorul unui aparat enzimatic de replicatie alcatuit din peste 20 de enzime. In linii generale, sinteza ADN dupa tipul semiconservativ se realizeaza astfel: mai intii are loc o rupere a legaturilor de hidrogen intre cele doue lanturi polinucleotidice, dupa care ruperea se continua de-a lungul macromoleculei asemanator cu desfacerea unui fermoar. In acelesi timp are loc o derulare a catenelor polinucleotidice si ca urmare fiecare nucleotida se roteste intr-un plan spre exterior in jurul radicalilor fosforici. In citoplasma se afla nucleotide diferite care au fost sintetizate in celule si care contin cele 4 baze: adenina, guanina, citozina si timina. Tinind seama de corespondenta care trebuie sa existe intre bazele purinice si pirimidinice, o nucleotida care contine adenina se va lega prin punti de hidrogen cu o nucleotida care contine timina, iar une care contine guanina se va lega cu una care contine citozina. In felul acesta are loc replicarea macromoleculelor de ADN, fiecare molecula fiica fiind formate dintr-o catena polinucleotidica veche si una nou sintetizata. O importanta deosebita in procesul de replicatie o are enzime ADN-.polimeraza. Aceasta enzima este formate din cca 1000 aminoacizi si are un diametru de aproximativ 65, fiind deci mult mai mare decit helixul de ADN care are 20. La bacterii sint cunoscute 3 tipuri de ADN-polimezaze, care pot realiza replicatia ADN "in vitro". Polimeraza l este cea mai cunoscuta si mai abundente. Ea este alcatuita dintr-o singura catene polipeptidica cu o masa moleculara de 109000 si prezinta 5 regiuni active cu ajutorul carore realizeaza replicatia ADN bacterian. Polimeraza ll a fost identificate numai la mutante de E. coli deficiente in polimereza l si este atasate de membrana celulara. Ea are o masa moleculara de 60000-90000. Polimeraza ll a fost de asemenea descoperite la mutante de E. coli deficiente in polimereza I. Aceasta enzima este mai sensibila la caldura decit polimereza ll si este rapid inhibata de o solutie de NaCl. Ea era o masa moleculera de 180000 si consta din doua componente de 140000 si 40000. Existe si polimereze la unele virusuri care realizeaza replicatia ADN monocatenar. Enzima ADN-polimeraza are mai multe locusuri care-i dau posibilitatea sa catalizeze replicatie ADN. Astfel, cu ajutorul unui locus enzima este capabile sa se cupleze cu o catene polinucleotidica de ADN, cu un al doilea locus este determinata polimerizarea nucleotidelor si formarea unei catene complementare cu cea care serveste drept matrita. Alungirea moleculei de ADN se realizeaza prin aditia de nucleotide la grupul hidroxil de la carbonul 3' al dezoxiribozei de la un capat al catenei. Enzima ADN polimereza determina esterificarea oxidrilului de la carbonul 3' al catenei polinucleotidice de catre fosfatul ce esterifica oxidrilul carbonic 5' al nucleotidei. Ca urmare, catenele nou sintetizate au polaritatea 5'3. Replicatia semiconservativa "in vitro" a ADN se realizeaze prin cresterea discontinua a celor doua catene, incepind cu un punct de origine a replicatiei, denumit ori C (origin of chromozomal replication). Din acest punct replicatia incepe bidirectional, formindu-se astfel o furca de replicatie, de forma literei Y. Este vorba de o structura asimetrica din cauza ca cele doua catene polinucleotidice au sensuri diferite. ADN-polimeraza poate sintetiza catene de ADN numei in directie 53. Originea replicatiei unei molecule de ADN este reprezentata de o secventa de nucleotide. La eucariote, in cromozomii lor existe un numar de uniteti replicative (repliconi) dispuse in tandem si care prezinta fiecare in centrul sau un punct de origine a replicatiei. Intre doua origini de replicatie, se afla o distanta de 30000300000 perechi de nucleotide. La sfirsitul replicatiei fiecarei unitati, se realizeaza fuzionarea sa cu cele adiacente, astfel ca se formeaza o molecula continua de ADN in cromozomi. In paralel are loc si sinteza proteica cu o rata corespunzatoate pentru realizarea fibrelor de cromatina. Replicatia se realizeaza cu ajutorul uneia sau mai multor polimeraze citoplasmatice, diferite de cele din organitele celulare. Astfel polimeraza C de la sobolan are o masa moleculara de circa 100000. Ea este asociate cu membrane plasmatica celulara si are un rol activ in procesul de replicatie a cromozomilor. Mai recent s-a descoperit ca aceasta enzima este alcatuita din 3 fractii: C1 si C2 care au o greutate au moleculara identica si C3 care este de fapt un fragment al uneia dintre primele doua. Tot la sobolan s-au identificat recent doua polimeraze: P-1(sau N-1) care are o masa moleculara de circa 100000, iar P-2 (sau N-2) cu o masa moleculara de 39000. La diferite grupe de eucariote, ADN polimerazele au o structura si masa moleculara similare. De asemenea, polimerazele mitocondriale sunt similare cu cele citoplasmatice. Initierea, replicatiei ADN in cromozomi are loc in asociatie cu membrana nucleara, la inceputul fazei S a ciclului celular. In procesul de replicatie a ADN are loc o desrasucire a moleculei cu ajutorul unei enzime denumita helicaza. De pilda, la bacteria E. coli la care molecula de ADN are circa 3 milioane perechi de baze, ar insemna ca ea trebuie sa se desrasuceasca de 300000 ori in cca 20 minute in care se realizeaza replicatia la aceasta bacterie. Aceasta ar insemna 15000. rotatii pe minut, adica o viteza mai mare decit a unui motor electric rapid. In procesul de replicatie al macromoleculei de ADN intervin si alte enzime cum sunt girazele care introduc torsiuni suplimentare in molecula de ADN, rasuciri de sens contrar celor provocate de inaintarea furcii de replicatie, si topoizomeraza l, care nu taie decit una dintre catene. Cele doua tipuri de enzime, girazele si topoizomerazele, au o actiune conjugata care determina o stare de echilibru. Cele doua catene au o dispozitie antiparalela. Catena cu replicare continue este numita catena directoare (leading), iar cealalta este catena segmentara sau discontinua (lagging). Sinteza catenei complementare celei orientate in sensul 5'3' se realizeaza in mod discontinuu, fapt pus in evidenta de cercetatorul japonez Okazaki. De aceea segmentele acestea scurte poarta denumirea de fragmente Okazaki. La procaricte aceste fragmente pot avea citeva mii de nucleotide, dar la eucariote sint mult mai scurte (100-200 nucleotide). In sfirsit, intervin si enzimele denumite ligaze, care ataseaza fragmentele cap la cap.

Fig.8. Reprezentarea schematic a replicatiei ADN

Replicatia nu se realizeaza cu fidelitate perfecta. ADN polimeraza realizeaza sinteza catenelor complementare cu o eroare de 1/100000 nucleotide. In cazul erorilor se produc de exemplu legaturi de tip adenina-guanina. Viteza de reactie a ADN-polimerazei este de circa 1000 nucleotide legate intre ele per secunda. Pentru cromozomul bacterian format din 3000000 perechi de nucleotide, frecventa erorilor este de 300 nucleotide per celula. La om, la fiecare catena de nucleotide ce contine 3 miliarde de unitati, se realizeaza circa 30000 erori pentru fiecare generatie celulara. De aceea, in celula are loc un proces reparator al erorilor comise de ADN-polimeraza. Astfel, ADN polimeraza poseda o alta activitate enzimatica de tip exonucleaza care ii permite sa elimine ultima nucleotida in catena in curs de sinteza, atunci cind ea a fost incorporata gresit. M. Radman (1980) a aratat ca ADN-polimeraza este urmata de alte enzime care rnarcheaza regiunea in care imperecherea s-a facut eronat, cu ajutorul unor grupe metil (CH3). Alte enzime care urmeaza sint capabile sa recunoasca regiunea marcata si sa repare erorile.4.2.Energia necesara replicatiei ADN

Pentru realizarea replicatiei ADN prin polimerizarea nucleotidelor si pentru pastrarea stabilitatii sale, este necesara o anumita cantitate de energie libera. Aceasta energie se obtine prin hidroliza adenozintrifosfatului (ATP). Hidroliza ATP, prin care rezulta adenozindifosfat (ADP) si radicalul fosfat (P), este acompaniata de eliberarea de energie, din care o parte se pierde sub forma de caldura. Pentru evitarea acestui fenomen nedorit, in celula exista un mecanism biochimic prin care se transfera grupuri functionale de la o molecula la alta. Enzimele care catalizeaza aceste procese se numesc transferaze. De exemplu, ATP poate transfera energia sa catre GTP care este folosit ca precursor in sinteza acizilor nucleici:

1. ATP+GMPADP+GDP

2. ATP+GDPADP+GTP In aceasta reactie a avut loc transferul grupului P~P de inalta energie, iar GTP este molecula activata. In celula, ATP-ul avind acest grup P~P de inalta energie, este folosit intr-o seama de reactii biochimice in care grupui respectiv P~P este transferat unor molecule de joasa energie, pe care le activeaza. Astfel el serveste la activivarea precursorilor acizilor nucleici, care sint nucleotide 5'-trifosfati si anume pentru ADN:

- dezoxianenozin 5'-trifosfat (d ATP)

- dezoxiguanozin 5'-trifosfat (d GTP)

- dezoxicitid 5'-trifosfat (d CTP)

- dezoxitimidin 5'-trifosfat (d TTP). In celula exista o enzima puternica denumita pirofosfataza, care rupe legatura intre doua grupe de fosfat anorganic si elibereaza o cantitate de energie:

P~PP+P 7kcal/mol Pentru reactia prin care doua nucleotide 5' trifosfat se unesc in procesul de formare a acizilor nucleici este necesara o cantitate de energie de 0,5 kcal/mol. Din reactia de rupere a legaturii dintre doua molecule de pirofosfat rezulta insa 7 kcal/mol. Dintre acestea 0,5 kcal/mol sunt folosite pentru realizarea sintezei respective, iar restul de 6,5 kcal/mol ramin ca energie libera necesara pastrarii echilibrului termodinamic al acizilor nucleici. 4.3.Replicatia ADN "in vitro" Sinteza ADN in afara celulei, dar cu ajutorul enzimelor celulare, a fost realizata pentru prima oara de catre A. Kornberg in anul 1954, de S. Ochoa si M. Grunberg-Monago in anul 1955. Pentru aceasta realizare A. Kornberg a fost distins cu premiul Nobel. Cercetarile privind sinteza artificiala a acizilor nucleici au inceput insa mai inainte. Astfel, in anul 1948 A. R. Todd a reusit sa realizeze, pornind de la bazele azotate si pentozele ce intra in alcatuirea acizilor nucleici, sinteza unor nucleoside, pentru ca apoi prin fosforilarea acestora sa obtina nucleotide. Ulterior, A. R. Todd si colaboratorii au sintentizat dinucleotide, ca de pilda nucleotida monofosfat de timidina. Pentru aceste lucrari el a fost distins cu premiul Nobel.

Sinteza ADN in afara celulei realizata in 1954 de A. Kornberg a insemnat un mare pas inainte, deoarece folosind sistemul enzimatic denumit ADN-polimeraza, s-a reusit obtinerea de ADN cu un inalt grad de polimerizare si cu o productivitate sporita a procesului de sinteza. Pentru realizarea sintezei artificiale a ADN sunt necesare urmatoarele componente ale reactiei:

1. dezoxiribonucleotidele celor 4 baze azotate sub forma de nucleoside trifosfat:

- dezoxiadenozintrifosfat

- dezoxitimidintrifosfat

- dezoxicitidintrifosfat

- dezoxiguanozintrifosfat

2. sistemul enzimatic ADN-polimeraza;

3. ioni de magneziu (Mg++);

4. o cantitate mica de ADN cu un inalt grad de polimerizare, ce serveste drept amorsa si matrita pentru sinieza ADN.

In cazul folosirii drept amorsa a unui ADN dublu catenar, este necesara o prealabila despartire a celor doua catene polinucleotidice, de pilda prin incalzire, care determine ruperea puntilor de hidrogen, adica denaturarea ADN. In conditii favorabile, procesul de sinteza duce la obtinerea unei cantitati de ADN de 10 ori mai mare decit cea care a servit drept amorsa. De asemenea, s-a demonstrat ca ADN-ul nou sintetizat, fapt evidentiat prin incorporarea de nucleotide marcate radioactiv, este identic in ceea ce priveste compozitia bazelor azotate cu ADN amorsa. De pilda, s-a constatat ca daca se foloseste drept amorsa un ADN artificial continind numai doua tipuri de baze azotate (adenina si timina) intr-o succesiune stricta (AT copolimer), atunci ADN sintetizat "de novo" contine exclusiv doua baze azotate: citozina si guanina, aflate in mediul de reactie ramin nefolosite in procesul de biosinteza a ADN. Experientele efectuate cu ADN amorsa de la plante, animale, bacterii si virusuri au demonstrat identitatea dintre ambrsa si ADN-ul nou sintetizat, fenomen evidentiat prin studiul raportului dintre bazele azotate care intra in alcatuirea macromoleculelor respective. De asemenea, s-a dovedit ca ADN monocatenar este mai eficient ca amorsa decit cel bicatenar. In procesul de sinteza "in vitro" a ADN s-a constat ca bazele azotate necesare acestui proces pot fi inlocuite cu analogi lor, cum sunt: 5-bromuracilul, 5-bromcitozina, hipoxantina etc. Acesti analogi inlocuiesc intotdeauna numai bazele azotate ai caror corespondenti sunt. ADN-ul sintetizat artificial este indentic cu cel folosit drept amorsa in ceea ce priveste masa moleculara, constanta de sedimentare, viscozitatea si evident compozitia in baze azotate. In ultima vreme, sinteza artificiala a ADN se realizeaza cu ajutorul unor aparate computerizate. Recent a fost elaborata metoda PCR (Poymerase Chain Reaction) pentru amplificarea unui segment de ADN intr-un numar imens de copii in numai citeva ore. Aceasta este o metoda extraordinar de eficienta, fapt pentru care este utilizata pe scara larga.Concluzie: In urma studierii temei bazele moleculare a ereditatii pot mentiona ca substatul molecular principal al ereditatii este ADN. ADN constituie baza moleculara a conservarii si transmiterii din generatie in generatie a informatiei genetice si baza moleculara a mutatiilor genetice natural sau induse. De asemenea, el asigura si controleaza sinteza proteinelor, asigura diferentiera si reglarea celulara, precum si constanta replicarii celulare. Molecula de ADN sta la baza tuturor formelor organice de viata de pe Terra.Bibliografie:

1. Moraru, I.; Antohi, S. Introducere in genetica moleculara. Ed: Medicala, Bucuresti, 1966.

2. Raicu, P.; Badea, Elena Marcela; Nicolae, I. Genetica moleculara si ingineria genetica. Ed: Atelierul de multiplicare al U.S.A.M.V. Bucuresti, 1997.

3. Severin, Emilia. Genetica umana. Ereditatea caracterelor. Ed: Scripta, Bucuresti, 19964. Dubinin, N.P. Genetica moleculara si actiunea radiatiilor asupra ereditatii. Ed: Stiintifica, Bucuresti, 1966.21