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MÉTODOS ANALÍTICOS NA DETERMINAÇÃO DE
POLIFENÓIS EM FRUTOS
Edgar Pinto1,2
1 Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, Porto, Portugal
2 Escola Superior de Saúde do Instituto Politécnico do Porto, Porto, Portugal
1. INTRODUÇÃO
As plantas produzem um vasto número de metabolitos durante o seu ciclo de vida. Estes
metabolitos podem ser divididos em primários e secundários. Os metabolitos primários
são aqueles que têm um papel vital e estão normalmente associados à fotossíntese,
respiração, crescimento e desenvolvimento da planta. Neste grupo incluem-se os hidratos
de carbono, lípidos, nucleótidos, aminoácidos e vários outros ácidos orgânicos. Os
metabolitos secundários não são essenciais ao crescimento e desenvolvimento das
plantas, mas estão frequentemente envolvidos na adaptação destas às condições
ambientais (Nascimento e Fett-Neto, 2010).
Os polifenóis são uma das principais famílias de metabolitos secundários nas plantas.
Esta família inclui um vasto número de compostos de distinta estrutura química e
reatividade, variando entre compostos de estrutura simples como os ácidos fenólicos, até
estruturas altamente polimerizadas como os taninos condensados. Até ao momento, estão
descritos cerca de 8000 polifenóis, sendo os grupos mais representativos desta grande
família os ácidos fenólicos, os flavonóides, os estilbenos e as ligninas (Manach et al.,
2004; Pandey e Rizvi, 2009).
Nos últimos anos vários métodos têm sido propostos para extrair e quantificar os
polifenóis nas mais diversas matrizes. Nesta comunicação serão revistos os principais
métodos de determinação dos polifenóis em frutos. Os passos mais importantes
(preparação da amostra, extração, identificação e quantificação dos polifenóis) serão alvo
de discussão. As novas tendências nesta área de investigação serão também abordadas.
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2. POLIFENÓIS
Os polifenóis (também denominados compostos fenólicos) são um grupo de metabolitos
secundários das plantas que atuam principalmente na defesa destas contra fatores de stress
biótico e abiótico (Ramakrishna e Ravishankar, 2011). Até ao momento, mais de 8000
compostos foram já identificados em várias espécies de plantas. Todos os polifenóis
presentes nas plantas têm uma origem comum, isto é, todos derivam da fenilalanina, ou
do seu precursor, o ácido chiquímico. Os polifenóis ocorrem principalmente na sua forma
conjugada, com um ou mais açucares ligados a grupos hidroxilo (Manach et al., 2004;
Fraser e Chapple, 2011).
Os polifenóis podem ser classificados em diferentes classes de acordo com dois critérios:
(1) o número de anéis fenol existentes na sua estrutura e (2) os elementos que ligam esses
anéis. Como já referido, as principais classes de polifenóis são os ácidos fenólicos, os
flavonóides, os estilbenos e as ligninas (Figura 1). Além destes, podem também estar
presentes nas plantas polifenóis de estrutura mais complexa, onde se incluem os taninos
hidrolisáveis e condensáveis (Manach et al., 2004; Pandey e Rizvi, 2009).
Os ácidos fenólicos são uma classe de compostos que estão amplamente presentes no
reino vegetal. Dividem-se em ácidos hidroxibenzóicos e ácidos hidroxicinâmicos de
acordo a sua estrutura química. Os ácidos hidroxibenzóicos são compostos de estrutura
C6-C1. São exemplos os ácidos gálico, protocatecuico e vanílico. Os ácidos
hidroxicinâmicos têm uma estrutura C6-C3. São exemplos os ácidos cafeico, p-cumárico
e ferúlico. Os ácidos fenólicos raramente estão presentes nas plantas na forma livre,
encontrando-se geralmente ligados por ligações éster, éter ou acetal a componentes
estruturais da planta (celulose, proteínas, lignina), a outros polifenóis (ex. flavonóides)
ou a outras moléculas (ex. glucose, ácidos orgânicos) (Pandey e Rizvi, 2009; Ignat et al.,
2011).
Os flavonóides constituem a maior e mais diversa classe de polifenóis nas plantas. Estes
compostos desempenham um papel importante em vários processos fisiológicos da
planta, tais como pigmentação e proteção contra a radiação UV (Perez-Jimenez et al.,
2010; Ramakrishna e Ravishankar, 2011).
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Figura 1 – Principais grupos de polifenóis encontrados nas plantas
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Os flavonóides são compostos caracterizados pela sua estrutura C6-C3-C6 em que um anel
heterocíclico pirânico (C) une dois anéis fenólicos (A e B) (Figura 2). As modificações
estruturais do anel central C estão na origem das diferentes famílias de compostos,
incluindo, como já referido, os flavonóis, as flavanonas, as flavonas, os flavanóis, as
antocianinas e as isoflavonas (Valls et al., 2009).
Figura 2 – Estrutura básica de um flavonóide
Os flavonóis e os flavanóis encontram-se amplamente distribuídos na natureza. Os
flavonóis incluem uma grande diversidade de compostos, muito devido à modificação
enzimática da sua estrutura, isto é, alguns grupos hidroxilo são frequentemente metilados,
acetilados, prenilados ou sulfurados, dando origem a compostos com propriedades
biológicas bastante distintas. Estes compostos estão maioritariamente presentes nas
plantas na forma glicosilada (Fraser e Chapple, 2011).
Os flavanóis podem estar presentes nos frutos como monómeros, oligómeros e mesmo na
forma de polímeros. Apresentam elevados graus de hidroxilação dos anéis A e B e a
terceira posição do anel heterocíclico C está normalmente ligada a um grupo hidroxilo, o
qual, por sua vez, pode estar esterificado com ácido gálico. Os monómeros flavanóis mais
comuns são a catequina, a epicatequina, a catequina galato e a epicatequina galato (Valls
et al., 2009). Os oligómeros dos flavanóis, denominados proantocianidinas, são
classificados em procianidinas e prodelfinidinas, consoante a sua origem.
Proantocianidinas altamente polimerizadas são conhecidas por taninos condensados e são
o segundo grupo de polifenóis mais abundante na natureza (Monagas et al., 2010).
As flavonas compreendem um grupo de compostos com várias substituições nos anéis A
e B da estrutura básica dos flavonóides, um grupo carbonil em C4 e uma dupla ligação
em C2-C3 do anel C. Nos frutos, principalmente nos citrinos, estes compostos estão
maioritariamente presentes na forma glicosilada (Gattuso et al., 2007). Nestes frutos estão
também presente flavonas polimetoxiladas, constituindo um grupo muito importante de
flavonóides (Zhang et al., 2012).
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As isoflavonas diferem dos outros flavonóides em termos de estrutura química,
especificamente na posição do anel B, que se encontra ligado ao C3 do anel C ao contrário
dos restantes flavonóides onde a ligação é feita ao C2 do anel C (Figura 1). As isoflavonas
mais conhecidas são as que se encontram presentes na soja: a genisteína e a daidzeína
(Valls et al., 2009).
As flavanonas são compostos muito semelhantes às flavonas em termos estruturais. As
duas principais diferenças são a ausência da ligação dupla C2-C3 e a presença de um centro
quiral em C2 no anel C. Nos frutos, as flavanonas encontram-se principalmente na sua
forma glicosilada. Os citrinos apresentam uma elevada diversidade deste grupo de
compostos (Khan et al., 2014).
As antocianinas são compostos formados pela ligação de uma aglicona (a antocianidina),
responsável pela cor da planta, a um ou mais O-glicosídeos. A valores de pH inferior a 3
as antocianinas apresentam-se na forma catiónica (cor vermelha) enquanto a valores de
pH superiores a 6 se apresentam na sua forma quinonoidal (cor azul). As principais
diferenças entre as antocianinas são: (1) o número de grupos hidroxilo na sua estrutura;
(2) a natureza e o número de açúcares que entram na sua composição; (3) o tipo de ligação
(ex., alifática ou aromática) do açúcar à aglicona e (4) a posição destas ligações. As
diferentes antocianidinas e os diferentes tipos de glicosilação dão origem a um elevado
número de estruturas, tendo sido já identificadas cerca de 500 antocianinas em plantas
(Castaneda-Ovando et al., 2009).
3. MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE POLIFENÓIS EM FRUTOS
3.1 Preparação da amostra
A preparação da amostra é considerada um passo crucial em qualquer tipo de análise,
podendo ter um grande impacto no resultado final. Devido à sua natureza sólida, os frutos
têm de sofrer um processo prévio de trituração, homogeneização e tamisação, que
normalmente é precedido de secagem (ao ar, em estufa ou utilizando um liofilizador)
(Perez-Jimenez et al., 2008). O processo de secagem tem elevada importância, uma vez
que, dependendo do tipo de secagem, o teor de polifenóis pode variar. A secagem com
temperaturas elevadas ou por longos períodos de tempo deve ser evitada porque leva a
uma diminuição do teor de polifenóis. Quando não é possível analisar as amostras
imediatamente, o pré-tratamento mais indicado é a liofilização. Se o laboratório não
possuir um liofilizador, a melhor opção é a secagem a uma temperatura inferior a 50-60
°C (Garau et al., 2007; Madrau et al., 2009). No que diz respeito à trituração, o
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aquecimento da amostra durante este processo e a sua exposição a uma atmosfera
oxidante devem ser minimizadas para evitar a perda dos polifenóis mais lábeis (Perez-
Jimenez et al., 2008). Quanto à tamisação, a redução do tamanho das partículas é
desejável e traduz-se num teor mais elevado de polifenóis no extrato final em comparação
com amostras não tamisadas, devido à maior eficiência do processo extrativo (Khoddami
et al., 2013).
3.2 Extração dos polifenóis
A extração dos polifenóis dos frutos é um passo chave no processo analítico. Vários
métodos de extração têm sido propostos, sendo a maioria baseados no uso de misturas de
solventes orgânicos e inorgânicos. Além do tipo de solvente, outros parâmetros (ex.
tempo de extração, temperatura, rácio amostra-solvente, número de extrações) precisam
de ser otimizados para aumentar a eficiência da extração.
Os agentes de extracção normalmente utilizados são misturas de água com solventes
orgânicos, tais como metanol, etanol e acetona (Ignat et al., 2011; Khoddami et al., 2013).
Devido à grande diversidade de polifenóis nos frutos, o uso de um único solvente torna-
se praticamente impossível caso o objetivo seja a análise de múltiplos polifenóis de
estruturas diversificadas. Neste sentido, vários estudos têm vindo a demonstrar que
extrações sequenciais com solventes de diferente polaridade resultam numa maior
eficiência na extração dos polifenóis (Ignat et al., 2011; De Melo et al., 2014). O tempo
e a temperatura de extração são também parâmetros muito importantes. Normalmente,
um aumento do tempo e da temperatura de extração aumentam a eficiência do processo;
contudo, alguns polifenóis podem ser degradados ou sofrer reações indesejáveis (ex.
oxidação) quando o tempo de extração e a temperatura são demasiado elevados (Perez-
Jimenez et al., 2008). Por fim, o rácio solvente-amostra deve também ser otimizado de
forma a aumentar a eficiência da extração. O aumento deste rácio geralmente promove a
extração dos polifenóis, contudo rácios muito elevados são indesejados devido ao efeito
de diluição e ao acrescido gasto de solvente associado ao processo (Khoddami et al.,
2013).
Os procedimentos de extração de polifenóis dos frutos mais convencionais compreendem
a simples agitação da amostra com um solvente (ou uma mistura de solventes) adequado.
Apesar deste processo de extração poder ser bastante eficiente, muitas vezes o resíduo
remanescente mantém um elevado teor de polifenóis, que estão geralmente ligados a
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proteínas, à parede celular ou à fibra do fruto. Neste caso, pode-se recorrer a uma hidrólise
ácida ou alcalina para extrair estes compostos da matriz (Perez-Jimenez et al., 2008).
Neste grupo dos procedimentos de extração mais convencionais pode ainda incluir-se a
extração em refluxo e a extração Soxhlet. As vantagens destas técnicas são a simplicidade
e o facto de utilizarem material de baixo custo. Contudo, também apresentam várias
desvantagens: requerem volumes elevados de solventes orgânicos tóxicos, considerados
poluentes ambientais; requerem tempos de extração muito longos; são pouco seletivas
(extraem interferentes indesejados); e promovem a degradação de alguns compostos de
interesse, devido a fatores inerentes ao processo, tais como temperaturas elevadas,
exposição ao ar e à luz, entre outros (Ignat et al., 2011; Khoddami et al., 2013;
Kontogianni, 2014).
O aparecimento do Soxetec (modificação do método Soxhlet) permitiu reduzir o volume
de solventes orgânicos utilizados assim como o tempo de extração (Kontogianni, 2014).
Apesar destas melhorias, nos últimos anos têm sido propostas várias outras técnicas para
tornar o processo de extração dos polifenóis ainda mais eficiente, rápido, simples e amigo
do ambiente. Surgiram assim a extração assistida por ultrassons (UAE), a extração
assistida por micro-ondas (MAE), a extração com fluidos supercríticos (SFE) e a extração
por líquido pressurizado (PLE).
3.2.1. Extração assistida por ultrassons (UAE)
O uso de ultrassons, som de frequência entre os 20 kHz e os 10 MHz, é reconhecido por
facilitar a extração de compostos orgânicos e inorgânicos de várias matrizes sólidas
usando solventes líquidos. O processo de sonicação refere-se à produção de ondas sonoras
capazes de provocar cavitação; esta cavitação é que é responsável pelo rompimento da
parede das células, libertando assim os seus conteúdos intracelulares. A eficiência da
UAE não é apenas afetada pelo tempo de sonicação mas também pela temperatura, tipo
de solvente utilizado, frequência dos ultrassons e sua distribuição (Picó, 2013).
Atualmente estão disponíveis dois sistemas para realizar este tipo de extração: (1) sonda
de ultrassons e (2) banho de ultrassons. A sonda de ultrassons está constantemente em
contato com a amostra, e apesar de ser uma fonte energética superior ao banho de
ultrassons (o que permite uma extração mais rápida dos compostos de interesse),
apresenta várias desvantagens. De destacar são o risco de contaminação cruzada (a sonda
é normalmente mergulhada na amostra) e de degradação de compostos de interesse. O
banho de ultrassons, mais comumente utilizado nos laboratórios, é uma ferramenta de
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baixa potência. Estes sistemas funcionam apenas numa frequência fixa (normalmente 40
kHz) e com uma fonte de irradiação de energia que varia entre os 1-5 W/cm2. A sua
grande vantagem é que permite realizar a extração de várias amostras simultaneamente,
com elevada reprodutibilidade (Khoddami et al., 2013). A escolha do sistema de extração
mais adequado irá depender da aplicação em questão.
De qualquer modo, a UAE é um dos procedimentos de extração mais simples, rápido e
que requer instrumentação de mais baixo custo. Comparada com os procedimentos de
extração convencionais, a UAE permite a extração de polifenóis de frutos de uma forma
mais rápida e eficiente. Vários estudos têm demonstrado a aplicabilidade desta técnica no
caso específico da extração de polifenóis de frutos (Carrera et al., 2012; D'alessandro et
al., 2012; Morelli e Prado, 2012; Singanusong et al., 2015; Altemimi et al., 2016).
3.2.2. Extração assistida por micro-ondas (MAE)
As micro-ondas são ondas eletromagnéticas com frequências que variam entre os 0.3 e os
300 GHz. Ao contrário do aquecimento convencional, o aquecimento por micro-ondas
resulta da rotação do dipolo (das moléculas) e da condução iónica (migração de iões).
Para que o mecanismo de aquecimento seja eficaz, as moléculas de interesse e o solvente
utilizado na extração têm de possuir um momento dipolar. Durante a extração o solvente
é aquecido assim como a água presente no interior das células vegetais; este aquecimento
gera uma pressão na parede celular que leva à sua rutura e consequente libertação do
conteúdo intracelular (Tatke e Jaiswal, 2011; Delazar et al., 2012).
Um dos aspetos mais importantes na MAE é a escolha do solvente a utilizar. Os
parâmetros mais importantes a ter em conta são o seu ponto de ebulição, constante
dielétrica e fator de dissipação. Os solventes polares são muito utilizados precisamente
devido à sua elevada constante dielétrica e ao facto de absorverem facilmente as micro-
ondas. O fator de dissipação diz respeito à capacidade do solvente libertar a energia
absorvida sob a forma de calor (Khoddami et al., 2013).
Estão disponíveis dois tipos de sistemas de MAE: (1) vaso aberto e (2) vaso fechado. Os
sistemas de vaso aberto são mais seguros e baratos e permitem a utilização de quantidades
superiores de amostra e de solventes. Contudo, requerem maiores tempos de extração. Os
sistemas de vaso fechado são sistemas de alta pressão que permitem que se atinjam
temperaturas superiores ao ponto de ebulição do solvente, resultando em tempos de
extração mais curtos e uma elevada eficiência da extração (Delazar et al., 2012).
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As vantagens da MAE em relação aos procedimentos de extração convencionais são o
reduzido volume de solvente utilizado, o reduzido tempo de extração e a elevada
eficiência de extração. Várias aplicações da MAE na extração de polifenóis de frutos
estão descritas na literatura (Simsek et al., 2012; Zou et al., 2012; Krishnaswamy et al.,
2013; Karabegovic et al., 2014).
3.2.3. Extração com fluidos supercríticos (SFE)
A extração com fluidos supercríticos (SFE) é também reconhecida como uma alternativa
viável aos procedimentos convencionais na extração de polifenóis. O uso da SFE permite
reduzir o consumo de solventes tóxicos, aumentar a seletividade e reduzir o tempo de
extracção, sem comprometer a eficiência do processo. Além destes aspetos, a utilização
da SFE permite evitar a degradação de compostos de interesse, uma vez que a matriz não
é exposta à luz ou ao ar. A sua grande desvantagem é sem dúvida o elevado investimento
inicial em instrumentação que é necessário (De Melo et al., 2014).
Para que a extração ocorra é necessário que as condições de temperatura e pressão do
sistema sejam otimizados de forma a obter um fluido supercrítico. Este fluido possui as
propriedades desejadas para a extracção, baixa viscosidade e elevada difusibilidade,
conseguindo assim penetrar os tecidos de forma mais eficiente (Ignat et al., 2011).
Os solventes normalmente utilizados em SFE são o dióxido de carbono (CO2), metano,
etano, propano e etanol. O CO2 é o solvente de eleição uma vez que é estável, apresenta
baixa toxicidade, não é inflamável, é barato e não produz tensão superficial. Além disso,
o CO2 forma um fluido supercrítico a uma temperatura relativamente baixa (± 31 °C),
tornando-o o solvente ideal para a extração de compostos termolábeis. A principal
desvantagem do CO2 é o seu caráter apolar, o que o torna inapropriado para a extração
dos polifenóis mais polares. Contudo, esta limitação pode ser contornada com a adição
de solventes polares como o etanol ou o metanol (Khoddami et al., 2013).
Além das vantagens já mencionadas, a SFE apresenta elevada versatilidade (as condições
de temperatura e pressão podem ser ajustadas para extrair os compostos de interesse) e
permite uma extração teoricamente completa da amostra, uma vez que existe uma
contínua exposição a solvente novo. Apesar do seu custo elevado, esta técnica tem vindo
a ser crescentemente utilizada, incluindo na extração de polifenóis de frutos (Liu et al.,
2010; Akay et al., 2011; Ghafoor et al., 2012; Liu et al., 2013; Maran et al., 2014).
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3.2.4. Extração liquida pressurizada (PLE)
A extração liquida pressurizada (PLE), também conhecida por extração acelerada por
solvente (ACE), é um tipo de extração que se baseia no uso de solventes a elevada pressão
e temperatura (Carabias-Martinez et al., 2005). A PLE pode ser utilizada em modo
estático ou dinâmico, ou numa combinação de ambos. A diferença prende-se com o facto
de no modo dinâmico o solvente ser continuamente adicionado à amostra, ao contrário
do modo estático onde a quantidade de solvente é mantida constante (Mustafa e Turner,
2011).
Tal como na SFE, vários parâmetros necessitam de ser otimizados e, mais uma vez, a
pressão e temperatura são considerados os mais importantes. A escolha do solvente de
extração é também um parâmetro crucial, devendo-se escolher um solvente capaz de
solubilizar os compostos de interesse e que, ao mesmo tempo, minimize a coextração de
outros componentes da matriz (Skalicka-Wozniak e Glowniak, 2012).
As vantagens da PLE em relação aos procedimentos de extração convencionais são
também muito semelhantes às da SFE e incluem a rapidez, facilidade e seletividade do
processo de extracção, bem como o reduzido consumo de solventes e a elevada eficiência
do processo. A principal desvantagem é o custo da instrumentação (Carabias-Martinez et
al., 2005; Mustafa e Turner, 2011).
A PLE tem vindo a ser utilizada na extração de polifenóis de frutos (Lee e Kim, 2010;
Veggi et al., 2011; Santos et al., 2012; Skalicka-Wozniak e Glowniak, 2012).
3.3. Quantificação dos polifenóis
Apesar do elevado número de publicações que tratam da quantificação de polifenóis, a
sua determinação permanece um desafio para os químicos analíticos, e estão
constantemente a surgir novos trabalhos de investigação direcionados para a otimização
e validação de metodologias analíticas para determinação de polifenóis. Os métodos
espectrofotométricos continuam a ser muito utilizados devido sobretudo à sua
simplicidade e rapidez. Contudo, a utilização da cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC) acoplada a vários tipos de detetores é assumida como a técnica ideal para a
identificação e quantificação destes compostos (Valls et al., 2009; Ignat et al., 2011;
Khoddami et al., 2013).
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3.3.1. Métodos espectrofotométricos
A espectrofotometria é uma das técnicas analíticas mais simples para quantificar o teor
de polifenóis. O método de Folin-Ciocalteu (F-C) é reconhecido pela sua simplicidade,
rapidez e baixo custo, e é comumente usado para a determinação do teor de polifenóis
nos frutos (Khoddami et al., 2013). O método baseia-se na oxidação dos polifenóis e na
consequente redução do reagente F-C (mistura de fosfomolibdato e fosfotungstato),
resultando a formação de um complexo de cor azul proporcional à concentração de
polifenois. A reação entre os polifenóis e o reagente F-C ocorre a um pH alcalino (≈ 10).
Nestas condições alcalinas, ocorre a desprotonação dos grupos hidroxilo da molécula dos
polifenóis e a consequente libertação de eletrões que, por sua vez, levarão à redução do
reagente F-C. A cor azul formada tem um máximo de absorção a 760 nm (Singleton et
al., 1999; Huang et al., 2005). A grande desvantagem deste método é o elevado número
de interferentes (o ácido ascórbico é um dos principais) (Everette et al., 2010). Algumas
modificações têm sido propostas para aumentar a seletividade do método, contudo o
método original continua a ser o mais utilizado nos trabalhos publicados nesta área
(Sanchez-Rangel et al., 2013).
Vários métodos espectrofotométricos foram também desenvolvidos para a determinação
de algumas classes e grupos específicos de polifenóis. Para a determinação dos
flavonóides é utilizado um método baseado na formação do complexo alumínio-
flavonóides. Neste método, uma solução de cloreto de alumínio (AlCl3) é adicionada à
amostra, dando-se a formação de um complexo com um máximo de absorvência entre os
405-430 nm. Este método, inicialmente proposto por Christ e Müller (1960), tem sofrido
várias alterações ao longo dos anos, sendo a principal a inclusão do nitrito de sódio
(Barnum, 1977). Apesar desta modificação, mantêm várias limitações, uma vez que não
permite determinar todos os compostos que pertencem à classe dos flavonóides (Pekal e
Pyrzynska, 2014).
Para a quantificação das antocianinas o método mais simples é a medição direta da
absorvência do extrato a um comprimento de onda entre os 490 e os 550 nm. Contudo,
este método também quantifica outros compostos, o que leva à sobrestimação do teor de
antocianinas. Desta forma, o uso do método de diferenciação por pH para a quantificação
dos monómeros de antocianinas é considerado o mais adequado (Wrolstad et al., 2005).
A determinação das proantocianidinas também pode ser feita através de métodos
espectrofotométricos. O método da vanilina é o mais conhecido e compreende a reação
das proantocianidinas com a vanilina com a consequente formação de complexos de cor
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vermelha (Bate-Smith, 1975). O método de Harbertson et al. (2003), que se baseia na
precipitação das proantocianidinas com a albumina de soro bovino (BSA), é também uma
alternativa para a determinação dos monómeros de antocianinas e de outros pigmentos
poliméricos. A substituição da BSA pela metilcelulose permitiu ultrapassar algumas
limitações do método (Sarneckis et al., 2006). A determinação das proantocianidinas é
também muitas vezes realizada pelo método butanol-HCl. Este baseia-se na clivagem das
ligações interflavonóides da estrutura das proantocianidinas em meio ácido seguida de
reações de auto-oxidação que convertem os flavanóis em antocianidinas (Schofield et al.,
2001).
Os métodos espectrofotométricos são métodos simples, económicos e rápidos para a
determinação de polifenóis em frutos, contudo, fornecem unicamente uma estimativa do
teor total destes compostos. Além disso, estes métodos apresentam várias limitações de
onde se destaca a reduzida especificidade (Ignat et al., 2011; Khoddami et al., 2013).
3.3.2. Métodos cromatográficos
A complexidade da matriz frutos e a existência de vários tipos de polifenóis que podem
estar presentes simultaneamente levou ao desenvolvimento de técnicas separativas
capazes de dar resposta em termos qualitativos e quantitativos. Neste contexto, destaca-
se a utilização de várias técnicas separativas, tais como a cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC), a cromatografia gasosa (GC), a cromatografia contracorrente (CCC),
entre outras. Aqui será unicamente referida a cromatografia líquida, devido ao facto de
ser considerada a técnica de eleição para a análise de polifenóis em frutos.
3.3.2.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
Do leque de técnicas separativas atualmente disponíveis, a cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC) é sem dúvida a técnica de eleição para a separação e quantificação de
polifenóis em frutos. As condições cromatográficas de um método típico para a
determinação de polifenóis em frutos compreendem uma coluna de fase reversa, um
detetor de UV-Vis ou de díodos (DAD) e um sistema binário de solventes (ex. solvente
A – H2O acidificada; solvente B – solvente orgânico polar). Estes sistemas oferecem
diversas vantagens relativamente aos métodos espectrofotométricos, de onde se destaca a
capacidade de analisar simultaneamente polifenóis de diferentes classes e grupos, bem
como os seus produtos de degradação (Kontogianni, 2014). Os polifenóis absorvem
radiação eletromagnética de diferentes comprimentos de onda. Por exemplo, os
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flavonóides têm duas bandas características: a primeira tem um máximo de absorção entre
os 240 e os 285 nm (corresponde ao anel A); a segunda tem um máximo entre os 300 e
os 550 nm (corresponde ao anel C). Desta forma, é possível selecionar comprimentos de
onda específicos para a quantificação dos diversos polifenóis (Khoddami et al., 2013).
Existem vários tipos de detetores de UV-Vis: os que monitorizam apenas um
comprimento de onda, os que monitorizam vários comprimentos de onda e o DAD. O
sistema HPLC-DAD é considerado o mais adequado para a quantificação de polifenóis
em frutos (Kontogianni, 2014).
A utilização de um espectrómetro de massa (MS) acoplado a um sistema de HPLC
permite obter mais informação ao nível estrutural e facilita a identificação dos polifenóis
presentes nos frutos. Nestes sistemas, as moléculas são ionizadas, e eventualmente
fragmentadas, sendo separadas pela sua relação massa-carga (Valls et al., 2009). Existem
diferentes fontes de ionização, sendo as mais comumente utilizadas na análise dos
polifenóis a ionização por eletrospray (ESI), a ionização química a pressão atmosférica
(APCI) e a ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI). A deteção dos
compostos pode ser realizada em modo positivo ou negativo, sendo este último o mais
utilizado na análise dos polifenóis. Dentro do leque de opções dos analisadores de massa
podemos encontrar os sistemas de quadrupolo simples (MS), de triplo quadrupolo
(MS/MS), ion trap (MSn), time-of-flight (TOF), entre outros (Ignat et al., 2011;
Khoddami et al., 2013). A grande diversidade de sistemas permite aplicações específicas;
os sistemas MS e MS/MS são aplicados principalmente para identificação e quantificação
de compostos de estrutura conhecida; por outro lado, os sistemas de alta resolução (ex.
TOF, TOF-MS, ion trap-MS) são destinados para a identificação de compostos
desconhecidos e sua elucidação estrutural (Monagas et al., 2010).
Recentemente, a introdução de novas colunas cromatográficas de tamanho de partícula
reduzido (sub-2 µm) permitiu melhorar as separações cromatográficas. Estes “novos”
sistemas (UHPLC e UPLC) apresentam maior sensibilidade e resolução de picos assim
como tempos de análise mais curtos comparativamente aos sistemas convencionais de
HPLC (Kontogianni, 2014).
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4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A caracterização dos polifenóis em frutos é uma tarefa difícil de realizar devido ao
elevado número de compostos potencialmente presentes na matriz e à sua inerente
complexidade. A identificação e determinação destes compostos envolve um conjunto de
passos que vão desde o tratamento da amostra até à quantificação propriamente dita.
Atualmente estão disponíveis vários métodos para a extração dos polifenóis dos frutos
que se caracterizam pela sua rapidez, baixo consumo de solventes, seletividade e
eficiência. No que diz respeito à identificação e quantificação dos polifenóis, o uso da
cromatografia líquida acoplada a um detetor de díodos (HPLC-DAD) permanece como a
técnica standard para a análise de polifenóis de estrutura conhecida. Contudo, o uso da
espectrometria de massa tem vindo a ganhar relevo neste campo através do uso dos
sistemas MS/MS, populares pela sua elevada sensibilidade e especificidade. Para a
identificação e elucidação estrutural de polifenóis de estrutura desconhecida, o uso de
espectrómetros de massa de alta resolução e de sistemas híbridos é o golden standard,
devido à sua capacidade para realizar múltiplas fragmentações das moléculas de interesse
e para a determinação exata da massa dos compostos originais ou dos seus produtos de
degradação.
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REFERÊNCIAS
AKAY, S.; ALPAK, I.; YESIL-CELIKTAS, O. Effects of process parameters on supercritical CO2 extraction of total phenols from strawberry (Arbutus unedo L.) fruits: An optimization study. Journal of Separation Science, v. 34, n. 15, p. 1925-1931, 2011.
ALTEMIMI, A. et al. Ultrasound Assisted Extraction of Phenolic Compounds from Peaches and Pumpkins. Plos One, v. 11, n. 2, 2016.
BARNUM, D. W. Spectrophotometric determination of catechol, epinephrine, dopa, dopamine and other aromatic vic-diols. Analytica Chimica Acta, v. 89, n. 1, p. 157-166, 1977.
BATE-SMITH, E. C. Phytochemistry of proanthocyanidins. Phytochemistry, v. 14, n. 4, p. 1107-1113, 1975.
CARABIAS-MARTINEZ, R. et al. Pressurized liquid extraction in the analysis of food and biological samples. Journal of Chromatography A, v. 1089, n. 1-2, p. 1-17, 2005.
CARRERA, C. et al. Ultrasound assisted extraction of phenolic compounds from grapes. Analytica Chimica Acta, v. 732, p. 100-104, 2012.
CASTANEDA-OVANDO, A. et al. Chemical studies of anthocyanins: A review. Food Chemistry, v. 113, n. 4, p. 859-871, 2009.
D'ALESSANDRO, L. G. et al. Ultrasound assisted extraction of polyphenols from black chokeberry. Separation and Purification Technology, v. 93, p. 42-47, 2012.
DE MELO, M. M. R.; SILVESTRE, A. J. D.; SILVA, C. M. Supercritical fluid extraction of vegetable matrices: Applications, trends and future perspectives of a convincing green technology. The Journal of Supercritical Fluids, v. 92, p. 115-176, 2014.
DELAZAR, A. et al. Microwave-Assisted Extraction in Natural Products Isolation. In: SARKER, D. S. e NAHAR, L. (Ed.). Natural Products Isolation. Totowa, NJ: Humana Press, 2012. p.89-115.
EVERETTE, J. D. et al. Thorough Study of Reactivity of Various Compound Classes toward the Folin-Ciocalteu Reagent. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 58, n. 14, p. 8139-8144, 2010.
FRASER, C. M.; CHAPPLE, C. The phenylpropanoid pathway in Arabidopsis. Arabidopsis Book, v. 9, p. e0152, 2011.
GARAU, M. C. et al. Effect of air-drying temperature on physico-chemical properties of dietary fibre and antioxidant capacity of orange (Citrus aurantium v. Canoneta) by-products. Food Chemistry, v. 104, n. 3, p. 1014-1024, 2007.
GATTUSO, G. et al. Flavonoid composition of citrus juices. Molecules, v. 12, n. 8, p. 1641-1673, 2007.
GHAFOOR, K.; AL-JUHAIMI, F. Y.; CHOI, Y. H. Supercritical Fluid Extraction of Phenolic Compounds and Antioxidants from Grape (Vitis labrusca B.) Seeds. Plant Foods for Human Nutrition, v. 67, n. 4, p. 407-414, 2012.
HARBERTSON, J. F.; PICCIOTTO, E. A.; ADAMS, D. O. Measurement of Polymeric Pigments in Grape Berry Extract sand Wines Using a Protein Precipitation Assay Combined with Bisulfite Bleaching. American Journal of Enology and Viticulture, v. 54, n. 4, p. 301-306, 2003.
16
HUANG, D. J.; OU, B. X.; PRIOR, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 53, n. 6, p. 1841-1856, 2005.
IGNAT, I.; VOLF, I.; POPA, V. I. A critical review of methods for characterisation of polyphenolic compounds in fruits and vegetables. Food Chemistry, v. 126, n. 4, p. 1821-1835, 2011.
KARABEGOVIC, I. T. et al. Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Cherry Laurel Fruit. Separation Science and Technology, v. 49, n. 3, p. 416-423, 2014.
KHAN, M. K.; ZILL-E-HUMA; DANGLES, O. A comprehensive review on flavanones, the major citrus polyphenols. Journal of Food Composition and Analysis, v. 33, n. 1, p. 85-104, 2014.
KHODDAMI, A.; WILKES, M. A.; ROBERTS, T. H. Techniques for analysis of plant phenolic compounds. Molecules, v. 18, n. 2, p. 2328-75, 2013.
KONTOGIANNI, V. G. Novel Techniques Towards the Identification of Different Classes of Polyphenols. In: (Ed.). Polyphenols in Plants: Isolation, Purification and Extract Preparation, 2014. cap. 8, p.159-185.
KRISHNASWAMY, K. et al. Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Phenolic Antioxidants from Grape Seeds (Vitis vinifera). Food and Bioprocess Technology, v. 6, n. 2, p. 441-455, 2013.
LEE, H. J.; KIM, C. Y. Simultaneous determination of nine lignans using pressurized liquid extraction and HPLC-DAD in the fruits of Schisandra chinensis. Food Chemistry, v. 120, n. 4, p. 1224-1228, 2010.
LIU, B. et al. Optimization of extraction of evodiamine and rutaecarpine from fruit of Evodia rutaecarpa using modified supercritical CO2. Journal of Chromatography A, v. 1217, n. 50, p. 7833-7839, 2010.
LIU, H. et al. Optimization of Supercritical Fluid Extraction of Phenolics from Date Seeds and Characterization of its Antioxidant Activity. Food Analytical Methods, v. 6, n. 3, p. 781-788, 2013.
MADRAU, M. A. et al. Effect of drying temperature on polyphenolic content and antioxidant activity of apricots. European Food Research and Technology, v. 228, n. 3, p. 441-448, 2009.
MANACH, C. et al. Polyphenols: food sources and bioavailability. American Journal of Clinical Nutrition, v. 79, n. 5, p. 727-747, 2004.
MARAN, J. P.; PRIYA, B.; MANIKANDAN, S. Modeling and optimization of supercritical fluid extraction of anthocyanin and phenolic compounds from Syzygium cumini fruit pulp. Journal of Food Science and Technology-Mysore, v. 51, n. 9, p. 1938-1946, 2014.
MONAGAS, M. et al. MALDI-TOF MS analysis of plant proanthocyanidins. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 51, n. 2, p. 358-372, 2010.
MORELLI, L. L. L.; PRADO, M. A. Extraction optimization for antioxidant phenolic compounds in red grape jam using ultrasound with a response surface methodology. Ultrasonics Sonochemistry, v. 19, n. 6, p. 1144-1149, 2012.
MUSTAFA, A.; TURNER, C. Pressurized liquid extraction as a green approach in food and herbal plants extraction: A review. Analytica Chimica Acta, v. 703, n. 1, p. 8-18, 2011.
17
NASCIMENTO, N. C.; FETT-NETO, A. G. Plant secondary metabolism and challenges in modifying its operation: an overview. Methods Mol Biol, v. 643, p. 1-13, 2010.
PANDEY, K. B.; RIZVI, S. I. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 2, n. 5, p. 270-278, 2009.
PEKAL, A.; PYRZYNSKA, K. Evaluation of Aluminium Complexation Reaction for Flavonoid Content Assay. Food Analytical Methods, v. 7, n. 9, p. 1776-1782, 2014.
PEREZ-JIMENEZ, J. et al. Updated methodology to determine antioxidant capacity in plant foods, oils and beverages: Extraction, measurement and expression of. Food Research International, v. 41, n. 3, p. 274-285, 2008.
PEREZ-JIMENEZ, J. et al. Identification of the 100 richest dietary sources of polyphenols: an application of the Phenol-Explorer database. European Journal of Clinical Nutrition, v. 64, p. S112-S120, 2010.
PICÓ, Y. Ultrasound-assisted extraction for food and environmental samples. Trac-Trends in Analytical Chemistry, v. 43, p. 84-99, 2013.
RAMAKRISHNA, A.; RAVISHANKAR, G. A. Influence of abiotic stress signals on secondary metabolites in plants. Plant Signal Behav, v. 6, n. 11, p. 1720-31, 2011.
SANCHEZ-RANGEL, J. C. et al. The Folin-Ciocalteu assay revisited: improvement of its specificity for total phenolic content determination. Analytical Methods, v. 5, n. 21, p. 5990-5999, 2013.
SANTOS, D. T.; VEGGI, P. C.; MEIRELES, M. A. A. Optimization and economic evaluation of pressurized liquid extraction of phenolic compounds from jabuticaba skins. Journal of Food Engineering, v. 108, n. 3, p. 444-452, 2012.
SARNECKIS, C. J. et al. Quantification of condensed tannins by precipitation with methyl cellulose: development and validation of an optimised tool for grape and wine analysis. Australian Journal of Grape and Wine Research, v. 12, n. 1, p. 39-49, 2006.
SCHOFIELD, P.; MBUGUA, D. M.; PELL, A. N. Analysis of condensed tannins: a review. Animal Feed Science and Technology, v. 91, n. 1-2, p. 21-40, 2001.
SIMSEK, M.; SUMNU, G.; SAHIN, S. Microwave Assisted Extraction of Phenolic Compounds from Sour Cherry Pomace. Separation Science and Technology, v. 47, n. 8, p. 1248-1254, 2012.
SINGANUSONG, R. et al. Low Power Ultrasound-Assisted Extraction of Phenolic Compounds from Mandarin (Citrus reticulata Blanco cv. Sainampueng) and Lime (Citrus aurantifolia) Peels and the Antioxidant. Food Analytical Methods, v. 8, n. 5, p. 1112-1123, 2015.
SINGLETON, V. L.; ORTHOFER, R.; LAMUELA-RAVENTOS, R. M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Oxidants and Antioxidants, Pt A, v. 299, p. 152-178, 1999.
SKALICKA-WOZNIAK, K.; GLOWNIAK, K. Pressurized Liquid Extraction of Coumarins from Fruits of Heracleum leskowii with Application of Solvents with Different Polarity under Increasing Temperature. Molecules, v. 17, n. 4, p. 4133-4141, 2012.
TATKE, P.; JAISWAL, Y. An overview of microwave assisted extraction and its applications in herbal drug research. Res. J. Med. Plant, v. 5, p. 21-31, 2011.
18
VALLS, J. et al. Advanced separation methods of food anthocyanins, isoflavones and flavanols. Journal of Chromatography A, v. 1216, n. 43, p. 7143-7172, 2009.
VEGGI, P. C.; SANTOS, D. T.; MEIRELES, M. A. A. Anthocyanin extraction from Jabuticaba (Myrciaria cauliflora) skins by different techniques: economic evaluation. 11th International Congress on Engineering and Food (Icef11), v. 1, p. 1725-1731, 2011.
WROLSTAD, R. E.; DURST, R. W.; LEE, J. Tracking color and pigment changes in anthocyanin products. Trends in Food Science & Technology, v. 16, n. 9, p. 423-428, 2005.
ZHANG, J. Y. et al. Characterization of Polymethoxylated Flavonoids (PMFs) in the Peels of 'Shatangju' Mandarin (Citrus reticulata Blanco) by Online High-Performance Liquid Chromatography Coupled to Photodiode Array Detection and Electrospray Tandem Mass Spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 60, n. 36, p. 9023-9034, 2012.
ZOU, T. B. et al. Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Anthocyanins from Mulberry and Identification of Anthocyanins in Extract Using HPLC-ESI-MS. Journal of Food Science, v. 77, n. 1, p. C46-C50, 2012.