CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyNFCEyN--INTIINTI
Materia de Articulación CEBI_E1a
Técnicas de Análisis en Biotecnología –Moléculas Pequeñas
Docente a cargo: Marianela SANCHEZe-mail: [email protected]
CEBI_E1a
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Moléculas pequeñas:
• Compuestos orgánicos de bajo peso molecular (<800 Da, no poliméricos)
• Variedad de funciones biológica:– Comunicador celular,
– Drogas
– Pesticidas
• Pueden ser naturales (metabolitos secundarios) o artificiales (sintéticos)
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Muestreo y análisis de las materias
primas
Análisis de productos
intermedios
Monitorización de la calidad de los
productos
Monitorización de la calidad de los
efluentes
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• Técnicas cromatográficas:– HPLC
– CG
• Espectroscopía de RMN• Espectrometría de Masas
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Cromatografía:
• Técnica que permite separar los diferentes componentes de una mezcla compleja.
• La separación se logra por diferencias en la movilidad relativa de los solutos (interacciones físicas y químicas entre los componentes).
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Cromatografía:
– Fase estacionaria
– Fase móvil
– Soluto o muestra
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Cromatografía:
Se pueden clasificar:
• De acuerdo al soporte• Al tipo de equilibrio que se establece
en la separación• Al estado de agregación de la fase
móvil
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Cromatografía:
• Constante de distribución(Kc)= relaciona la concentración de un soluto entre la fase móvil y la estacionaria.
Kc = CsCm
Concentración del analito en fase estacionaria
Concentración del analito en fase móvil
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Durante la migración de la muestra a través de la FE se produce la separación de los componentes.
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k= Tr – TmTm
IMPORTANTE: k <<<<< a 1 soluto muy poco retenidok entre 1 y 5 valor idealk 20 o mayor cromatografías muy largas
Factor de retención (k) = permite comparar la velocidad de migración de los diferentes solutos. Se puede determinar experimentalmente.
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Ensanchamiento de banda: dispersión
Caminos múltiples•Empaquetamiento•Rango de tamaño de partícula•Diámetro de partícula
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Dispersión Ensanchamiento a flujos bajos
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DispersiónTransferencia de masa
Difusión del analito dentro y fuera de la FM estancada en el poro de la FE.
Diferentes profundidades de penetración causan diferentes ensanchamientos de banda
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Ecuación de van Deemter:
Multiplicidad de caminos
Difusión longitudinal Transferencia de masa
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Caudal: Volúmen transportado por unidad de tiempo.
Q = π r2 µ
Área de sección de la columna
Velocidad lineal media de flujo
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Cromatografía líquida
• Principales mecanismos de interacción FM-FE:
– Adsorción superficial– Partición – Intercambio iónico– Exclusión molecular
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Cromatografía:
• De adsorción: fenómeno superficial, partículas de soluto adsorbidas en la fase estacionaria
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Cromatografía de Adsorción
• FE: Sólidos muy porosos con capacidad adsorbente– Sílica
– Alúmina
• FM:– Solventes orgánicos
Capacidad de cargaPresentaciones
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• Solvente y soluto compiten por los sitios de adsorción en la fase estacionaria!
Cromatografía de Adsorción
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Cromatografía de Adsorción
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Cromatografía de Adsorción• La fuerza eluyente ε0 es la energía de adsorción del disolvente por
unidad de superficie (sílica).
Solvente Fuerza de EluciónFluorcalcanos -0.20N-pentano 0.00N-hexano 0.011-clorubutano 0.20Benceno 0.20Xileno 0.24Cloroformo 0.26Tolueno 0.28Cloruro de metileno 0.32Acetato de etilo 0.38Tetrahidrofurano 0.44Acetonitrilo 0.50Metanol 0.70 M. Sánchez-CEBI_E1a 22
• Tipos de rellenos:Esférico Irregular
Cromatografía de Adsorción
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Ejemplo
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Separación de cis y trans pirazolina. Columna 100 x 0.3 cm, sílice pelicular. Fase móvil: 50% cloruro de metileno / isooctano. Caudal 0.25 mL/min. Detector UV 254 nm.
La cromatografía de adsorción es mas adecuada para compuestos no polares (solubilidad limitada en solventes acuosos) con masas moleculares < 5000.
Que la diferencia de otros métodos??capacidad de diferenciar isómeros!
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Q = π r2 µµ=0.06
Cromatografía de reparto
Los componentes de la mezcla se separan según su distribución entre dos líquidos inmiscibles.
FE
OJO!! soporte ≠ FE!!
Soporte:Sílica finamente particulada (<10 μ)Superficie completamente hidrolizada
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Fase Unida (o Ligada)Fase Unida (o Ligada)
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Cromatografía en fase reversa
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Cromatografía en fase reversa
THF
i-PROPANOLACETONAETANOL
ACETONITRILOMETANOL
AGUA
LONGITUD DE ONDA MINIMA UV
212 nm
205 nm330 nm210 nm190 nm205 nm190 nm
INDICE DE REFRACCION
1.405
1.3841.3561.3591.3411.4571.333
FUERZA DE SOLVENTE
4.4
4.23.43.63.13.00.0
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Fase Ligada
Fase reversa
Fase normal
C-18 Mas utilizada en RP-HPLC
C-8 menor retención que C18
C-3, C-4 Proteínas y péptidos
CN compuestos de polaridad intermedia
NH2 hidratos de Carbono
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Ejemplo
Efecto de la longitud de la cadena en la eficiencia de las columnas de siloxano en fase inversa empaquetadas con partículas de 5 µm. Fase móvil: 50/50 metanol/agua. Caudal 1 mL/min
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A: H 2OB: MeOH
↑ % A
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A: H 2OB: CH3CN
☹
↑ tiempo=solvente (=$)↓ resolución de picos mas retenidosSolución: GRADIENTE!
☺
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Aplicaciones
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Analitos ionizables(débiles)
pKa=4.6
Muy polar = menos retenidaMenos polar = más retenida
Variar pH de FM
Supresión de iones
Par iónico(IPC)
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Supresión de iones
↑ proporción de ácido protonado (neutro)
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Analitos ionizables
Para trabajar con las especies cargadas:
Cromatografía de:•Intercambio Iónico (IEC)•Par Iónico (IPC)
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Cromatografía de Intercambio Iónico
• Sirve para separar compuestos iónicos (aniones y/o cationes)
• Soporte: poliestireno o sílica
• Solvente: buffer (control de pH y fuerza iónica)
• Mecanismo de separación: intercambio reversible de iones entre el analito y la FE. Intervienen fuerzas electrostáticas.
Intercambiador de aniones
Intercambiador de cationes
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Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC)
Intercambiadores fuertes
Intercambiadores débiles
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Cromatografía de Intercambio Iónico: Aplicaciones
• Cationes y anionesinorgánicos
• Acidos orgánicos, aminas, carbohidratos, proteínas, etc.
OJO: NO SON MOLÉCULAS PEQUEÑAS!!
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Cromatografía de Par Iónico
• Utiliza una columna HPLC de fase reversa.• Se añade a la FM un reactivo que se aloja en la FE convirtiéndola
en un intercambiador iónico.• Los iones del analito se pueden unir a la fase estacionaria por
atracción electrostática con los iones del surfactante.• Mecanismo de retención: mezcla de interacciones con fase reversa
y de intercambio iónico.
SO3
SO3 N
R
R
R
H+
Na+
Fase unida Reactivo de par iónico
MuestraN+
N+
O C RO
H2PO4
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Longitud de cadena del reactivo de par iónico
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Cromatografía de exclusión molecular
• FE: geles porosos• Fundamento de separación: separación
en base a forma y tamaño del analito
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Cromatografía de exclusión molecular
Cromatografía de exclusión molecular
Muy útil con macromoléculas,Aacs, péptidos,azúcares.
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Instrumentación
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Suministro de solventes:
Funciones básicas:• Proveer flujo constante y preciso• Proveer composiciones precisas de fase
móvil• Proveer la fuerza necesaria para empujar
la FM a través del empaquetamiento compacto de la fase de la columna
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Suministro de solventes:
• Agua, soluciones buffer acuosas y solventes orgánicos tales como metanol, acetonitrilo o diferentes mezclas. Grado HPLC.
• FM sin elementos particulados. Evitar obstrucciones en el sistema (conexiones muy estrechas, pistones de zafiro y columna muy empaquetada)
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Bomba pistón
• Movimiento del pistón atrás-adelante
• Sello flexible alrededor de la periferia del pistón (impide la fuga de la FM)
• Válvulas de retención (flujo unidireccional de disolvente)
• Variación del flujo
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Pistones en paralelo
• Mientras un cilindro se está llenando, el otro entrega FM.
Flujo Combinado
Pistón A Pistón B
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Pistones en serie
• Mientras se llena el pistón grande llena el pequeño entrega FM. Cuando se llena el pequeño, el proporciona FM (para llenar tanto el pistón pequeño y proporcionar un flujo neto hacia la columna)
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Amortiguador de pulsos
• Tubo en forma de “T”
• Fuelle flexible o gas compresible (absorbe energía de la pulsación)
• Cuando la bomba se esta llenando, esta energía se libera
• Reduce el ruido de la bomba
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Inyector Manual
• Válvula de 6 vías, con loop de volumen conocido y una palanca con dos posiciones: llenado e inyección
• Llenado: la FM pasa a la columna y la muestra se introduce en el loop
• Inyección: la FM impulsa la muestra desde el loop hasta la columna
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Inyección manual vs. automática
> precisión
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Columnas
• Columnas analíticas: Ø interno: 4.6 mm, < 0.1 mg muestra
• Columnas semipreparativas: Ø interno: 1 a 3 cm, de 1 a 200 mg muestra
• Columnas preparativas: Ø interno: varios cm. Solo para uso industrial. Requieren equipo especial.
Cuidados físicos con la columna:
• No golpear la columna
• No dejar secar la columna
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Detectores
• Basados en una PROPIEDAD física o físico-química DEL SOLUTO (no la presenta la FM). Bastante selectivos y muy sensibles.– UV– Fluorescencia– Electroquímicos
• Basados en una PROPIEDAD DE LA DISOLUCIÓN comparan el cambio global de alguna propiedad física de la FM con y sin soluto eluido. Responden a un conjunto amplio de solutos. Poco sensibles.– Índice de refracción– Conductividad
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Propiedades del detector• Sensibilidad adecuada• Respuesta lineal amplia• Respuesta rápida y reproducible• Manejo sencillo
• Límite de detección: relación señal/ruido. No solo depende del detector!
• Límite de cuantificación: límite de concentración más bajo para mediciones cuantitativamente precisas
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UV-VisibleLey de Beer: A = ɛ l c
Coeficiente de extinción
concentraciónlong. de la celda
ɛ sustancia
longitud de onda
Se analiza una longitud de onda por cada mediciónSolvente!!
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Detector UV por arreglo de diodos
Va realizando barridos completos del espectro UV-Vis
Permite reprocesar el mismo cromatogramadetectando a diferentes λλλλ
Se puede obtener el espectro UV-Vis de cada pico del cromatograma y compararlo
con una base de datos
Rtλλλλ
Abs
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Detector de fluorescencia
Muy sensibles y selectivos.Dos λ de trabajo:
-excitación-emisión
Para analitos fluorescentes (derivados)
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Detectores de índice de refracción
• Miden variaciones en el RI del analito con respecto al de la FM
• Sólo se pueden usar si la elución es isocrática
• Son universales, pero tienen baja sensibilidad
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Detectores de conductividad
•Aplicaciones: Iones, ácidos, bases y sales • Baja sensibilidad• Sensibles a impurezas de la fase móvil
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Detectores electroquímicos• Se basan en la reacción redox entre el analito y
un electrodo
• El nivel de reacción es proporcional a la concentración del analito.
• Se mide y se compara con un electrodo de referencia.
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Detectores por espectrometría de masas
• Introducción de la FM en cámara de vacío
• Vaporización previa de solvente
• Termovaporizador-ionizador
• Aplicable a compuestos termoestables y no volátiles
• Espectros de impacto electrónico
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Análisis cualitativo
• Permite identificar los compuestos individuales en la muestra– El parámetro más común es su tiempo de
retención
– Dependiendo del detector utilizado la identificación se puede basar en la estructura química, molecular, peso o algún otro parámetro molecular.
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Análisis cuantitativo
• Detectores dan una respuesta proporcional a la cantidad de sustancia (m):
• Respuesta = a x m
a: característico para cada sustancia
Como el componente atraviesa el detector en un período de tiempo
Área
f: factor de respuesta. Cantidad de sustancia por unidad de área
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Método del estándar externo• Se preparan soluciones del estándar de
concentración conocida.• Se grafica área vs. concentración
Debe verificarse el rango de linealidad de respuesta!!
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Bibliografía
• The LC Handbook. Guide to LC columns andmethod development. Agilent. 2011.
Publication number 5990-7595EN.www.chem.agilent.com\Library\primers\public\LC-
Handbook-Complete-2.pdf• Agilent ZORBAX column guide selection.• Trends in universal detection in high performance
liquid chromatography. Joshi, P. B.; Bhoir, S. I.; Bhagwat, A. M. www.sepscience.com