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Molekulare Charakterisierung und Identifizierung
eines Aktivierungsmechanismus
von Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med.
an der Medizinischen Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von: Julia Schön
geb. 03. September 1989 in Aschersleben
angefertigt im: Institut für Biochemie
Abteilung Molekulare Biochemie
Betreuer: Prof. Dr. med. Torsten Schöneberg
Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 15. Dezember 2015
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Bibliographische Beschreibung
Schön, Julia
Molekulare Charakterisierung und Identifizierung eines Aktivierungsmechanismus von
Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
Universität Leipzig, Dissertation
89 Seiten, 135 Lit, 20 Abb, 5 Tab, 3 Anlagen
Referat:
Die Familie der Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (aGPCR) stellt die zweitgrößte
Gruppe der GPCR dar. Ein strukturelles Charakteristikum der aGPCR ist der modular
aufgebaute N-Terminus, welcher eine GPCR-proteolytic site (GPS) mit einem konservierten
Spaltungsmotiv enthält. Trotz der hohen medizinischen Relevanz dieser Rezeptorgruppe sind
für die meisten der 33 humanen Vertreter der aGPCR bis heute weder Funktion noch
endogener Agonist bekannt. Um sie jedoch zukünftig als potentielle Angriffspunkte
diagnostisch und therapeutisch nutzen zu können, kommt der umfassenden Charakterisierung
der aGPCR hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen und Signaltransduktion große
Bedeutung zu.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine kurze Peptidsequenz im C-terminalen
Bereich des N-Terminus (Stachel-Sequenz genannt) als gebundener Agonist der aGPCR
fungiert und G-Protein-vermittelte Signalwege aktiviert. Dazu wurden ortsgerichtete
Mutagenesestudien durchgeführt und synthetisierte Peptide analog der Stachel-Sequenz der
aGPCR in funktionellen second messenger-Akkumulationsexperimenten getestet. Während
die Untersuchungen des Aktivierungsmechanismus an den bereits initial charakterisierten
Rezeptoren GPR126 und GPR133 unternommen wurden, konnten 11 weitere aGPCR
hinsichtlich ihrer Kopplung an G-Proteine, Expression und ihres autoproteolytischen
Spaltungsverhaltens in vitro analysiert werden. Dabei ist herauszustellen, dass alle
untersuchten aGPCR an das Gs-Protein koppeln. GPR115, GPR116 und GPR128 zeigten
sogar eine multiple Kopplung an Gs-, Gq- und Gi-Proteine. Weiterhin konnte dargelegt
werden, dass die Zerstörung hoch konservierter Disulfidbrückenbindungen innerhalb der GPS
durch Aminosäuresubstitution in einer konstitutiven Aktivierung des Wildtyp-Rezeptors
resultiert.
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Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................................................ 4
Tabellenverzeichnis ................................................................................................................................................ 4
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................................................... 5
1 Einleitung ............................................................................................................................................................. 8
1.1 Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ................................................................................. 8
1.2 Kinetik der Pharmakon-Rezeptor-Interaktion ..................................................................................................10
1.3 Deorphanisierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ..............................................................................11
1.4 Die Klasse der Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren .........................................................................12
1.4.1 Struktureller Überblick der aGPCR ..............................................................................................................13
1.4.2 Physiologische Bedeutung der aGPCR .........................................................................................................15
1.4.3 Die Signaltransduktion der aGPCR ...............................................................................................................16
1.4.4 Liganden von aGPCR ...................................................................................................................................18
1.4.5 Die Bedeutung des cleavage der aGPCR ......................................................................................................18
1.4.6 Der GPR126 ..................................................................................................................................................20
1.4.7 Der GPR133 ..................................................................................................................................................22
2 Ziele und Fragestellungen ...................................................................................................................................24
3 Material/Methoden ..............................................................................................................................................26
3.1 Chemikalien und allgemeine Labormaterialien................................................................................................26
3.2 Molekularbiologische Standardmethoden ........................................................................................................26
3.3 Klonierung .......................................................................................................................................................27
3.3.1 E. coli–Stamm SW102 ..................................................................................................................................28
3.3.2 Gibson Assembly ..........................................................................................................................................29
3.4 Zellkultur und Transfektion .............................................................................................................................30
3.4.1 Messung der cAMP-Akkumulation mittels AlphaScreen-Technologie ........................................................31
3.4.2 Inositolphosphat–Akkumulationsassay .........................................................................................................32
3.4.3 Oberflächen-ELISA ......................................................................................................................................33
3.4.4 Sandwich-ELISA ..........................................................................................................................................33
3.4.5 Westernblot ...................................................................................................................................................35
3.4.6 Immunfluoreszenz .........................................................................................................................................35
3.5 Peptidsynthese ..................................................................................................................................................36
3.6 Statistische Auswertung ...................................................................................................................................37
4 Ergebnisse ...........................................................................................................................................................38
4.1 Aktivierung der aGPCR durch Deletion der ECD ...........................................................................................38
4.2 Identifizierung potentiell agonistischer Strukturen im N-Terminus .................................................................40
4.3 Aktivierung des GPR126 und GPR133 durch ein gebundenes Peptid .............................................................42
4.4 G-Protein-Kopplung als allgemeines Prinzip der aGPCR ................................................................................47
4.4.1 Promiskuität der aGPCR in der G-Protein-Kopplung ...................................................................................51
4.5 Autoproteolytische Spaltung der aGPCR .........................................................................................................51
4.6 Konstitutive Aktivierung von aGPCR durch Punktmutationen .......................................................................54
3
5 Diskussion ...........................................................................................................................................................57
5.1 Die agonistische Stachel-Sequenz der aGPCR ................................................................................................57
5.2 Gs-Protein-Kopplung ist ein generelles Charakteristikum ...............................................................................60
5.3 Multiple G-Protein-Interaktion ........................................................................................................................63
5.4 Autoproteolytische Spaltung ............................................................................................................................65
5.5 Konstitutive Aktivierung an konservierten Cysteinen .....................................................................................67
5.6 Ausblick ...........................................................................................................................................................68
6. Zusammenfassung der Arbeit ............................................................................................................................71
7. Literaturverzeichnis ...........................................................................................................................................73
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit ........................................................................................81
Anlagen ..................................................................................................................................................................82
Lebenslauf ..............................................................................................................................................................85
Veröffentlichungen ................................................................................................................................................87
Danksagung............................................................................................................................................................88
4
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Schematischer Aufbau eines aGPCR
Abb. 2 Strukturelle Eigenschaften von GPCR mit komplexen N-Termini
Abb. 3 Hypothetische Aktivierungsmechanismen der aGPCR
Abb. 4 Einfluss des CTF auf die Basalaktivität des GPR126 und GPR133
Abb. 5 Schematische Darstellung der Aminosäuresequenz in der GPS des GPR126 und GPR133
Abb. 6 Sequentielle Aminosäure-Deletion in der GPS des GPR126
Abb. 7 Alaninscan innerhalb der GPS des GPR126 und GPR133 durch ortsgerichtete Mutagenese
Abb. 8 cAMP-Akkumulation durch Stimulation des GPR126 mit agonistischen Peptiden
Abb. 9 Konzentrationsabhängige cAMP-Akkumulation durch Stimulation mit p16
Abb. 10 Alaninscan des p16 Peptids des GPR126
Abb. 11 Endogene Expression des GPR126 in COS-7-Zellen
Abb. 12 cAMP-Akkumulation durch Stimulation des GPR133 mit agonistischen Peptiden
Abb. 13 Konzentrationsabhängige cAMP-Akkumulation durch Stimulation mit p13
Abb. 14 Spezifitätsprüfung der Peptide p16 und p13
Abb. 15 Immunfluoreszenz zur Detektion des GPR128
Abb. 16 Konzentrationsabhängige Signaltransduktion des GPR116
Abb. 17 Westernblot zur Analyse der Autoproteolyse von aGPCR
Abb. 18 Cystein-zu-Serin-Mutationen in aGPCR
Abb. 19 Untersuchung der CS-Mutationen für den GPR126 und GPR133
Abb. 20 Alignment der cleavage site von aGPCR
Tabellenverzeichnis
Tab. 1 Liste der verwendeten molekularbiologischen Standardmethoden
Tab. 2 Übersicht der verwendeten Laborgeräte
Tab. 3 Zusammenfassung der funktionellen Charakterisierung von aGPCR
Tab. 4 Übersicht cleavage–Analyse im Westernblot
Tab. 5 Übersicht der molekularen Charakterisierung von ausgewählten aGPCR
5
Abkürzungsverzeichnis
*O2 Singulett-Sauerstoff
7TM Sieben-Transmembran-Domäne
ß2-AR ß2-Adrenorezeptor
AC Adenylylcyclase
A2BR Adenosin 2B Rezeptor
ADP Adenosindiphosphat
aGPCR Adhesion-G-Protein-gekoppelter Rezeptor
Alpha Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay
ANOVA Analysis of Variance
AS Aminosäure
ATP Adenosintriphosphat
BAI Brain-specific angiogenesis inhibitor
BFPP bilaterale frontoparietale Polymikrogyrie
bp Basenpaar
BSA bovines Serumalbumin
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
CD Cluster of Differentiation
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
CELSR Cadherin EGF LAG Seven-Pass G-Type Receptor
CIRL Calcium-independent Receptor of α-Latrotoxin
CRE cAMP Responsive Element
CREB cAMP Responsive Element Binding Protein
CRD cysteine-rich domain
CRP C-reaktives Protein
CTF C-terminales Fragment
CUB C1r/C1s urinary EGF and bone morphogenetic domain
DAF Decay Accelerating Factor
DAG Diacylglycerol
DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat
DREG Developmentally Regulated G Protein–coupled Receptor
ECD extrazelluläre Domäne eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors
ECL extrazellulärer Loop
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGF Epidermal Growth Factor
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EMR EGF-like module-containing, Mucin-like hormone Receptor
6
ERK Extracellular-signal regulated Kinase
Fab Antigen-bindendes Fragment des Antikörpers
FAE Follikel-assoziiertes Epithel
FBS fetales Rinderserum
FLRT fibronectin-leucine-rich repeat transmembrane
Fmoc Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe
GAIN GPCR Autoproteolysis Inducing domain
GDP Guanosindiphosphat
GEF Guanin-Austauschfaktor
GFP grün-fluoreszierendes Protein
GIRK G protein-gated inwardly rectifying potassium channel
G-Protein Guaninnukleotid-bindendes Protein
GPCR G-Protein-gekoppelter Rezeptor
GPS GPCR proteolytic site
GRK GPCR-regulatorische Kinasen
GTP Guanosintriphosphat
h human, Mensch
HA humanes Influenza-Hämagglutinin
HBD Hormon-bindende Domäne
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
HPLC Hochdruckflüssigchromatographie
IBMX 3-Isobutyl-1-Methylxanthin
ICD intrazelluläre Domäne eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors
Ig Immunglobulin
IMPase Inositolmonophosphatase
IP Inositolphosphat
IP3 Inositol-1,4,5-Triphosphat
LAT1 Latrophilin-1
LB lysogeny broth, komplexes Nährmedium für Bakterien
LH luteinisierendes Hormon
LRR leucine-rich repeats
m murin, Maus
M3R muskarinischer M3-Acetylcholinrezeptor
MALDI-MS Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Massenspektrometrie
MALT Mukosa-assoziiertes lymphatisches Gewebe
MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase
MBP Myelin-Basisches Protein
MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein 1
MeS-ADP 2- Methylthioadenosin-5'-O-diphosphat
mRNA messenger Ribonukleinsäure
NFAT nuclear factor of activated T-cells
7
NK Negativkontrolle
NTF N-terminales Fragment
OD optische Dichte
OPD o-Phenylendiamin
ORL-1 Opioid Receptor-Like 1
PAR Protease-activated Receptor
PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung
PBS-T Phosphat-gepufferte Salzlösung inklusive 0,05% Triton X-100
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PI3Kγ Phosphatidylinositol-3-Kinase γ
PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat
PK Positivkontrolle
POD Peroxidase
PTH Parathormon
PTX Pentraxin Domäne
R inaktiver Rezeptor
R* aktiver Rezeptor
RHO Rhodopsin
RhoGEF Rho guanine nucleotide exchange factor
RIPA Radio-Immunoprecipitation Assay
S1P1 Sphingosin-1-phosphat Rezeptor 1
SD Standardabweichung
SEA SEA urchin sperm protein domain
SEM Standardfehler
SNP Single Nucleotide Polymorphism
S.O.C. Super Optimal broth with Catabolic repressor
SP Signalpeptid
SRE serum response element
SV40 Simian-Virus 40
TL tethered receptor-activating ligand
TM Transmembrandomäne
TSHR Thyroidea stimulierendes Hormon Rezeptor
TSR thrombospondin type 1 repeat
THR Thyroidea stimulierendes Hormon Rezeptor
VFT Venus flytrap domain
VIGR Vascular inducible G Protein-coupled Receptor
VLGR Very Large GPCR
WT Wildtyp
8
1 Einleitung
Die Kommunikation zwischen Zellen im Organismus beruht neben elektrophysiologischen
Vernetzungen häufig auf Transmitter-Rezeptor-Interaktionen. Transmitter in Form von
Aminosäuren, Polypeptidhormonen, Chemokinen, Calciumionen, Licht, Geruchs- oder
Geschmacksreizen initialisieren in Zusammenarbeit mit Rezeptoren die Aktivierung
intrazellulärer, biochemischer Signalwege, die zu zellulären Antworten und schließlich zu
physiologischen Veränderungen führen. Um diese chemisch und physikalisch diversen
Signale nach intrazellulär zu transduzieren, sind komplexe Erkennungsmechanismen
(Rezeptorklassen) notwendig. Die größte Anzahl solcher Oberflächenrezeptormoleküle stellt
dabei die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) dar (Civelli et al.,
2013).
1.1 Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
Die Superfamilie der GPCR stellt mit über 800 Vertretern im menschlichen Genom eine
große und evolutionär alte Gruppe Membran-gebundener Proteine dar (Bjarnadóttir et al.,
2004). Während Bakterien keine GPCR exprimieren, sind sie in fast allen eukaryontischen
Lebensformen, z.B. Pflanzen, Insekten, Pilzen und der Amöbe Dictyostelium discoideum zu
finden (Nordström et al., 2008b). Allen Mitgliedern der GPCR sind ihre sieben Zellmembran-
durchspannenden Helices gemeinsam, aufgrund deren sie auch als Sieben-Transmembran-
Rezeptoren (7TM) bekannt sind. Weiterhin besitzen sie einen extrazellulär gelegenen N-
Terminus und einen intrazellulär lokalisierten C-Terminus. Namensgebend für diese
Rezeptorsuperfamilie ist die Interaktion mit intrazellulären G-Proteinen.
Die Bindung eines Agonisten an eine extrazelluläre und/oder transmembranäre Region des
Rezeptors initiiert dessen Interaktion mit einem heterotrimeren G-Protein. Aktivierte GPCR
kann man auch als guanine nucleotide exchange factors (GEF) für die α-Untereinheit des G-
Proteins bezeichnen, denn sie bewirken den Austausch von GDP gegen GTP an der Gα-
Untereinheit (Ritter and Hall, 2009). Die beiden verbliebenen Untereinheiten Gßγ dissoziieren
von der GTP-gebunden Gα-Untereinheit. Die Gα-Untereinheit kann nun an verschiedene
Effektormoleküle binden und deren Aktivität regulieren. Es sind verschiedene Familien von
G-Proteinen identifiziert worden, unter ihnen Gαs, Gαi, Gαq und Gα12/13, die über spezifische
Proteine die Bildung von second messengern veranlassen. So bewirkt eine GTP-gebundene
Gαs–Untereinheit eine Aktivierung der Adenylylcyclase, welche die Bildung von cyclischen
9
AMP aus ATP unter Abspaltung von Pyrophosphat katalysiert. Der Botenstoff cAMP ist nun
in der Lage, weitere Effektorproteine, z.B. die Proteinkinase A, zu aktivieren. Die Gαi –
Untereinheit hemmt als Gegenspieler zu Gαs Adenylycyclasen. Über Gαq wird dagegen die
Phospholipase Cß aktiviert, wodurch es zu einer Akkumulation von Inositoltrisphosphat (IP3)
und Diacylglycerol (DAG) durch Hydrolyse von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2)
kommt. DAG führt zur Aktivierung der Proteinkinase C, IP3 ermöglicht die Freisetzung von
Calciumionen aus dem Endoplasmatischen Retikulum. Gα12/13 interagiert mit Rho guanine
nucleotide exchange factors (RhoGEFs), die über Aktivierung von Rho beispielsweise zur
Formation von Stressfasern in der Zelle führen. Es ist dabei erwähnenswert, dass viele GPCR
an mehr als nur eine Klasse von G-Proteinen binden (Gudermann et al., 1997).
Die bereits erwähnten Untereinheiten Gßγ können neben ihrer Interaktion mit der Gα-
Untereinheit auch auf primäre Effektoren wirken: beispielsweise auf N-Typ Calciumkanäle, G
protein-gated inwardly rectifying potassium channels (GIRK), Isoformen der Adenylycylase,
Phospholipase Cß2 /ß3 und Phosphatidylinositol-3-Kinasen γ (PI3Kγ) (Lin and Smrcka, 2011).
Agonist-gebundene GPCR werden jedoch nicht nur von G-Proteinen erkannt, sondern auch
durch GPCR regulierende Kinasen (GRK), welche eine Phosphorylierung der Rezeptoren
hervorrufen. Phosphorylierte GPCR gehen verstärkt eine Assoziation mit ß-Arrestin ein. ß-
Arrestin bewirkt nicht nur eine Desensibilisierung des Rezeptors für G-Proteine, sondern
leitet auch die Internalisierung des Rezeptors in Endosomen mit nachfolgender Degradation
oder Recycling des GPCR ein (Ritter and Hall, 2009). Neben diesem Mechanismus stellt auch
die intrinsische GTPase Aktivität der Gα-Untereinheit die Signalabschaltung sicher.
Die Bedeutung von GPCR wird besonders im Hinblick auf die heute zur Verfügung
stehenden Pharmakotherapeutika deutlich: 36 % aller zugelassenen Medikamente wirken an
82 verschiedenen GPCR und machen diese Rezeptoren zu den wohl therapeutisch
interessantesten Zielstrukturen (Civelli et al., 2013).
Die Superfamilie der GPCR wird seit dem Jahre 2003 nach phylogenetischen
Gesichtspunkten in 5 Klassen eingeteilt: Glutamat (22 Vertreter im Menschen), Rhodopsin
(672 Vertreter), Adhesion (33 Vertreter), Frizzled/ Taste2 (11/25 Vertreter) und Sekretin (15
Vertreter), zusammengefasst unter dem Akronym GRAFS (Fredriksson et al., 2003).
10
1.2 Kinetik der Pharmakon-Rezeptor-Interaktion
Lefkowitz beschrieb im Jahre 1993 in seinem allosteric ternary complex model, dass sich
Rezeptoren in einem Gleichgewicht zwischen zwei Zuständen befinden: in der inaktiven R-
Form oder der entspannten, potentiell aktiven R*-Form. Man geht davon aus, dass nur R* in
der Lage ist, mit G-Proteinen zu interagieren. Substanzen, die die Rezeptorfunktion
aktivieren, werden als Agonist bezeichnet. Ein spezifischer Agonist für einen Rezeptor
beeinflusst das Gleichgewicht zwischen R und R* dahingehend, dass die Konversion zu R*
erleichtert und der ternäre Komplex zwischen Ligand-R* und G-Protein stabilisiert wird.
Ein Agonist bindet mit hoher Affinität an R* und mit niedriger Affinität an R. Die Affinität
eines Pharmakons (P) zu seinem Rezeptor wird dabei durch die Dissoziationskonstante KD
beschrieben:
KD=
1
1*
k
k
RP
PR ff
wobei [ ]f jeweils für freie Konzentrationen steht und k-1 und k+1 als
Geschwindigkeitskonstanten der Hin- und Rückreaktion definiert sind. KD entspricht
derjenigen Konzentration des Agonisten/ Antagonisten, bei der die Hälfte der Rezeptoren
durch das Pharmakon besetzt ist.
Substanzen, die die Rezeptorfunktion durch ihre Bindung nicht aktivieren, stattdessen aber
die Interaktion mit dem Agonist blockieren, werden als kompetitive Antagonisten bezeichnet.
Partielle Agonisten dagegen lösen - verglichen mit einem reinen Agonist - geringere
Wirkungen am Rezeptor aus. Sie binden mit nur leicht höherer Affinität den R*- als den R-
Zustand. Die intrinsische Aktivität a (Synonym efficacy) bezeichnet das Maß der maximalen
Wirkstärke eines Pharmakons. Während bei reinen Agonisten a=1 ist, binden Substanzen mit
a=0 R und R* mit gleicher Affinität. Eine weitere wichtige Konstante stellt der EC50–Wert als
mittlere effektive Konzentration dar. Der EC50–Wert ist die Pharmakonkonzentration, durch
die die halbmaximale Wirkung des Rezeptors erreicht wird. Je niedriger der EC50–Wert, desto
potenter verhält sich die Substanz. Die Charakterisierung des biologischen Effekts in
Abhängigkeit von verschiedenen Konzentrationsstufen kann in einer Konzentrations-
Wirkungs-Kurve grafisch verdeutlicht werden. Diese wird in vitro an Zellen (second
messenger-Konzentration) oder an isolierten Organen im Organbad und in vivo im
Tierversuch experimentell bestimmt. Beispielsweise kann durch Kontraktionsmessung eines
11
Aortenstreifens durch Titration einer gefäßkontrahierenden Substanz deren Wirkstärke
ermittelt werden. Zur Übertragung auf den menschlichen Organismus müssen jedoch
zusätzlich Resorption, Verteilungsvolumen, Elimination und Interaktionen mit anderen
Pharmaka in Betracht gezogen werden, sodass klinisch die Dosis-Wirkungs-Beziehung
höhere Relevanz aufweist (Aktories, 2006).
1.3 Deorphanisierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
Kennt man über einen Rezeptor weder dessen Funktion noch seinen endogenen Agonist, so
bezeichnet man ihn als orphan. Die Geschichte der Deorphanisierung begann im Jahre 1988,
als für den 5TH1A - und den D2 Dopamin-Rezeptor mit Hilfe der Reversen Pharmakologie der
natürliche Agonist identifiziert werden konnte (Libert et al., 1991; Mills and Duggan, 1994).
Die Basis dieser Erkenntnisse stellten neue molekularbiologische Methoden dar, mit deren
Hilfe orphane GPCR kloniert und in heterologen Zellsystemen exprimiert werden konnten.
Potentielle GPCR-Agonisten, für die zuvor noch kein Rezeptor identifiziert wurde, konnten
so in Signaltransduktionsanalysen getestet werden. Im Jahre 1995 erreichte die
Deorphanisierung eine neue Dimension, als durch den orphanen ORL-1 (Opioid Receptor-
Like 1) ein zuvor unbekanntes Neuropeptid orphanin FQ als Agonist isoliert wurde (Meunier
et al., 1995; Reinscheid et al., 1995). Für ORL-1 war bereits bekannt, dass seine Aktivierung
mit einer verminderten intrazellulären cAMP-Konzentration einhergeht. Aufgrund von
Expressionsanalysen des ORL-1 im zentralen Nervensystem wurden schließlich
Hirngewebeextrakte hergestellt und Fraktionen auf ihre Fähigkeit getestet, die
Adenylylcyclase zu hemmen (Civelli et al., 2013). Mit der Entschlüsselung des menschlichen
Erbguts durch das International Human Genome Sequencing Consortium im Jahre 2004
erweiterte sich das Wissen über das Vorhandensein weiterer GPCR erheblich, jedoch ohne
Anhaltspunkte über deren Liganden bzw. Signaltransduktion in der Zelle zu liefern (Human
Genome Sequencing Consortium, 2004).
Doch auch in Abwesenheit eines Liganden ist ein gewisser Anteil der Rezeptoren spontan im
aktiven Zustand R* (Lefkowitz et al., 1993). Dies ermöglicht nun, auch ohne Kenntnis eines
Agonisten die Signaltransduktion eines orphanen Rezeptors mit Hilfe der artifiziellen
Überexpression zu untersuchen. Die Anzahl an spontan aktiven Rezeptoren steigt äquivalent
mit der Gesamtzahl an Rezeptoren in der Zellmembran und erlaubt dann mit einer
12
ausreichenden Anzahl an R* die Untersuchung von z.B. second messenger-Systemen wie
cAMP, Phosphatidylinositol oder Ca2+ (Basalaktivität).
Darüber hinaus kann durch bestimmte Veränderungen in der Aminosäureabfolge
(Mutationen) eines Rezeptors ein Zustand erreicht werden, in der die Bildung von R*
favorisiert ist. Diese konstitutiv aktive Form des ursprünglichen Wildtyp-Rezeptors imitiert
den aktiven Agonist-gebundenen Zustand des Rezeptors. Die so erlangten Kenntnisse der
intrazellulären Signalkaskaden können schließlich genutzt werden, um Substanzbibliotheken
auf aktivierende bzw. inaktivierende Eigenschaften am Wildtyp-Rezeptor zu testen.
Die GPCR-Deorphanisierung führte so zur Entdeckung dutzender neuer Neuropeptidfamilien,
wie der Orexin/ Hypocretin-, Kisspeptin- oder Ghrelinfamilie und leistet so einen
entscheidenden Beitrag zum Verständnis physiologischer Prozesse (Civelli et al., 2013). Bis
heute sind noch mehr als 100 GPCR orphane Rezeptoren, die größte Gruppe unter ihnen
bildet die Familie der aGPCR (Paavola and Hall, 2012).
1.4 Die Klasse der Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
Mit 33 Vertretern im menschlichen Genom stellt die Gruppe der Adhesion-G-Protein-
gekoppelten Rezeptoren (aGPCR) die zweitgrößte Gruppe unter den GPCR dar. Die aGPCR
sind eine evolutionär alte Gruppe, die sowohl in Vertebraten als auch Invertebraten vertreten
sind. Einige aGPCR sind bis in die Gruppe der Urochordata (Manteltiere) und
Cephalochordata (Schädellose) konserviert, die aGPCR Latrophilin 1 und Flamingo sind
sogar im Fadenwurm Caenorhabditis elegans und in der Taufliege Drosophila melanogaster
gefunden worden (Nordström et al., 2008b). Alle Familienmitglieder werden durch Gene mit
multiplen Exons kodiert, sodass angenommen werden kann, dass sie durch Mechanismen wie
Genduplikation, -deletion oder –konversion entstanden sind (Kwakkenbos et al., 2006).
Während bis heute 31 murine Rezeptoren identifiziert wurden, exprimiert der Seeigel über 90
verschiedene aGPCR (Whittaker et al., 2006). Charakteristikum dieser GPCR-Klasse ist ihre
enorme Größe, welche vor allem durch die Länge ihrer extrazellulär gelegenen N-Termini
bedingt wird. Mit bis zu 6300 Aminosäureresten gehören die aGPCR zu den größten
existierenden Membranproteinen.
13
1.4.1 Struktureller Überblick der aGPCR
Die allgemeine Struktur der aGPCR besteht aus einem extrazellulären, N-terminal gelegenen
Bereich (ECD), einer membranständigen Domäne (7TM) sowie einem intrazellulären, C-
terminalen Bereich (ICD) (Abb. 1).
Abb. 1 Schematischer Aufbau eines aGPCR (nach Liebscher et al., 2013)
Die Struktur eines aGPCR besteht aus einer extrazellulären Domäne (ECD) mit Signalpeptid (SP), einer 7TM
und einer intrazellulären Domäne (ICD). Im C-terminalen Bereich der ECD befindet sich die GPCR
Autoproteolysis Inducing domain (GAIN) mit der GPCR proteolytic site (GPS), an welcher eine Spaltung des
Rezeptors in ein N-terminales Fragment (NTF) und C-terminales Fragment (CTF) erfolgt. Zur Detektion des
Rezeptors in funktionellen Assays wurden N-terminal ein Hämagglutinin (HA) und C-terminal ein FLAG-Epitop
eingebracht.
Die N-terminalen extrazellulären Bereiche der aGPCR weisen dabei bekannte strukturelle
Domänen auf, die in anderen Proteinen Aufgaben der Protein-Protein-Interaktion oder
Zelladhäsion übernehmen. Häufig identifizierte Strukturen innerhalb der aGPCR-N-Termini
sind EGF-(epidermal growth factor)-ähnliche Bereiche, Thrombospondin-Wiederholungen,
Leucin-reiche Regionen (LRR), Immunglobulin- (Ig) oder Cadherin-ähnliche Domänen
(Yona et al., 2008). Die Existenz solcher funktionellen Domänen ist unter den GPCR für die
Vertreter der aGPCR einzigartig (Foord et al., 2002). Des Weiteren finden sich in der
Sequenz der ECD dieser Rezeptoren vermehrt Serin- und Threoninreste, sodass davon
ausgegangen wird, dass die aGPCR stark glykosyliert werden (Bjarnadóttir et al., 2004). Am
C-terminal gelegenen Ende des N-Terminus schließt sich bei der Vielzahl der aGPCR eine
14
besondere Struktur an, die GPCR proteolytic site (GPS). Die GPS besteht aus einer
konservierten, 40 Aminosäuren umfassenden Sequenz mit Cystein- und Tryptophanresten und
ist Teil einer größeren Domäne, der GAIN (GPCR Autoproteolysis INducing domain) (Araç
et al., 2012). Vier konservierte Cystein-Reste bilden innerhalb der GPS zwei
Disulfidbrückenbindungen aus. Viele, jedoch nicht alle, aGPCR werden autoproteolytisch an
dieser Region gespalten. Dies bedeutet, dass ein N-terminales Fragment (NTF) von dem C-
Terminalen Fragment (CTF) des Rezeptors separiert wird, diese aber an der Zelloberfläche
nicht-kovalent verbunden bleiben. Dabei erfolgt die Spaltung (cleavage) zwischen einem
konservierten aliphatischen Rest (meist einem Leucin) und einem Threonin-, Serin- oder
Cysteinrest. Durch Araç et al. wurde 2012 beschrieben, dass nur die vollständige GAIN in der
Lage zu dieser autoproteolytischen Spaltung ist.
Interessanterweise gibt es unter den GPCR mehrere Gruppen von Rezeptoren, die
verblüffende Ähnlichkeiten zu den aGPCR aufweisen (Abb. 2). Die
Glykoproteinhormonrezeptoren gehören zu den Rhodopsin-ähnlichen GPCR und weisen
neben 7TM sowie ICD auch einen langen, extrazellulären Bereich auf. Allen
Glykoproteinhormonrezeptoren, zu denen z.B. die Rezeptoren für Thyreotropin (TSH) oder
Lutropin (LH) gehören, ist eine besondere extrazelluläre Struktur gemeinsam. Nach einem
Signalpeptid schließen sich die Cysteinbox 1, welche Teil der leucine-rich repeat domain ist,
sowie die am Ende des N-Terminus lokalisierte hinge region an. Die hinge region enthält
ähnlich der GPS von aGPCR mehrere Cysteinreste, die untereinander
Disulfidbrückenbindungen formen. Diese Region wird für den TSH-Rezeptor (TSHR) auch
cleavage domain genannt. Durch Konformationsänderung dieser Domäne soll die Bindung
von TSH an den TSHR erleichtert werden. Weiterhin soll die hinge region notwendig für
Stabilisierung der Basalkonformation des TSHR sein. Auf Hormon-Rezeptor-Interaktion
folgend kommt es vermutlich durch Freilegung eines intramolekularen Agonisten zur
Aktivierung des Rezeptors (Sangkuhl, 2002; Kleinau et al., 2011).
15
Abb. 2 Strukturelle Eigenschaften von GPCR mit komplexen N-Termini (Liebscher et al., 2013).
Neben den aGPCR gibt es weitere Vertreter von GPCR, die ähnlich komplexe Strukturen im N-Terminus
aufweisen. Sowohl Glykoproteinhormonrezeptoren als auch Sekretin-ähnliche und glutamaterge Rezeptoren
weisen Cystein-reiche und proteolytische Regionen auf. Signal peptide (SP), cysteine-rich domain (CRD), Venus
flytrap domain (VFT), leucine-rich repeat domain (LRR)
1.4.2 Physiologische Bedeutung der aGPCR
Verschiedene Untersuchungen unterstreichen die physiologische Relevanz der aGPCR. So
besitzen einige Rezeptoren Bedeutung in der Entwicklung des Immunsystems, der
Embryogenese, Tumorigenese oder im Metabolismus. Der aGPCR CD97 zum Beispiel,
welcher sich durch zahlreiche EGF-Domänen im N-Terminus auszeichnet, scheint eine
wichtige Rolle in der Funktion und Migration von neutrophilen Granulozyten zu spielen.
Untersuchungen mit spezifischen EGF-blockierenden Antikörpern zeigen einen Einfluss des
CD97 vor allem für das angeborene Immunsystem, währenddessen die adaptive
Immunantwort unbeeinträchtigt bleibt (Hamann et al., 2010).
Weiterhin sind mehrere Vertreter der aGPCR essentielle Regulatoren der Embryogenese. So
soll der GPR125 den Wnt/planar cell polarity Signalweg während der Gastrulation im
Zebrafisch modulieren. Dabei trägt die Rekrutierung von Dishevelled als cytoplasmatisches
Protein an die Zellmembran durch den GPR125 zur entwicklungsgerechten Migration der
fazialen brachiomotorischen Neuronen des Embryos bei (Li et al., 2013). In diesem
Zusammenhang ist des Weiteren beschrieben worden, dass auch der aGPCR
Flamingo1/CELSR1 den Prozess der Konvergenz und Ausdehnung embryonaler Zellen
während der Gastrulation vermittelt (Formstone and Mason, 2005).
16
Bestimmte Mutationen des humanen GPR56 gehen mit einer gestörten Gehirnentwicklung
einher und rufen das Krankheitsbild der bilateralen frontoparietalen Polymikrogyrie (BFPP)
hervor (Piao et al., 2004). Das Usher Syndrom dagegen, eine angeborene Blind- und Taubheit,
entsteht durch Mutation des Very large G Protein-coupled receptor (VLGR) (Weston et al.,
2004). Auch in der Tumorigenese nehmen aGPCR eine wichtige Rolle ein. Es konnte gezeigt
werden, dass die Expression des Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 (BAI1) in
Karzinomen der Lunge, des Magens und des Kolorektums signifikant reduziert ist
(Fukushima et al., 1998; Hatanaka et al., 2000; Lee et al., 2001). Die Vaskularisierung in
Glioblastomen ist dabei erheblich durch BAI1-exprimierende Zellen gestört (Kang et al.,
2006). Der CD97 wird in einer Vielzahl von Tumoren (Schilddrüse, Magen,
Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre) exprimiert und ist mit schlechtem klinischen Staging
inklusive Lymphknotenmetastasen assoziiert (Aust et al., 1997; Aust et al., 2002; Steinert et
al., 2002). Auch der GPR56 soll in der Metastasenbildung von Melanomen beteiligt sein (Xu
et al., 2006).
Eine Deletion des aGPCR GPR116 im Fettgewebe beeinträchtigt die Insulinsensitivität durch
Störung der Fettgewebsentwicklung. Fettgewebs-spezifische, konditionelle knock-out-Mäuse
zeigen weiterhin einen erhöhten Grad an Leberverfettung als Wildtyp-Mäuse, verminderte
Adiponektinwerte und einen erhöhten Resistin-Spiegel im Serum (Nie et al., 2012).
Wie hier dargestellt, sind die größtenteils orphanen aGPCR in den letzten Jahren verstärkt in
den Fokus des klinischen Interesses gerückt. Um diese Rezeptorgruppe jedoch zukünftig als
potentielle Targets diagnostisch und therapeutisch nutzen zu können, steht deren umfassende
Charakterisierung hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen und Signaltransduktion an
erster Stelle experimenteller Untersuchungen.
1.4.3 Die Signaltransduktion der aGPCR
Die besondere Struktur der aGPCR führte zu der Annahme, dass Rezeptoren dieser GPCR-
Klasse eine duale Rolle in der Physiologie einnehmen. Mit Hilfe ihrer funktionellen Domänen
in der ECD sollen sie als Zelloberflächenmoleküle Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen
vermitteln sowie weiterhin über G-Proteine die Aufgaben klassischer GPCR erfüllen (Yona et
al., 2008). Lange Zeit war jedoch nicht eindeutig geklärt, ob die aGPCR tatsächlich an ihre
namensgebenden G-Proteine koppeln. Erste Hinweise zur Klärung dieser Fragestellung
kamen im Jahre 1997 auf. Für das Latrophilin, dem identifizierten Rezeptor des α-Latrotoxins
17
(Gift der Schwarzen Witwe Latrodectus), konnte eine physische Interaktion mit der Gαo-
Untereinheit von G-Proteinen gezeigt werden. Dazu wurde eine zweistufige
Affinitätschromatographie eingesetzt (Lelianova et al., 1997). Mit Hilfe von serum response
element (SRE)-Reportergen-Experimenten und einem Pulldown-Assay mit Rho-GTP wurde
für den GPR56 eine Kopplung an Gα12/13 beschrieben (Iguchi et al., 2008).
Monk et al. zeigten für den GPR126 im Zebrafisch Danio rerio einen funktionellen
Anhaltspunkt für eine Gαs-Interaktion. Eine Myelinisierungsstörung auf Grund einer
GPR126-Defizienz im Zebrafisch konnte durch die Applikation von Forskolin, einem
Aktivator der Adenylylcyclase, und nachfolgender cAMP-Steigerung funktionell gerettet
werden (Monk et al., 2009).
Im Jahre 2011 konnte durch Bohnekamp und Schöneberg erstmalig die G-Protein-Kopplung
für den GPR133 mit Hilfe eines second messenger-Systems bewiesen werden. Transiente
Transfektion des humanen und murinen GPR133 zog eine konzentrationsabhängige cAMP-
Akkumulation nach sich, die spezifsch durch siRNA (gerichtet gegen endogenes Gαs)
gehemmt werden konnte (Bohnekamp and Schöneberg, 2011). Später konnte vervollständigt
werden, dass der GPR133 nicht nur an Gαs, sondern auch eine Kopplung an Gαi eingeht
(Liebscher et al., 2013). Weiterhin konnte durch Gupte et al. sowohl eine Gαs-Kopplung des
GPR114 als auch Inositolphosphat-Akkumulationen nach Transfektion mit chimären G-
Proteinen für GPR97 und GPR110 gezeigt werden. Ergebnisse dieser Arbeit lassen vermuten,
dass der GPR110 an Gαq und GPR97 an Gαo koppeln. GPR115 und EMR2 waren durch Co-
Transfektion mit Gα15 aktiv (Gupte et al., 2012). G-Protein-Kopplung scheint folglich auch
für die aGPCR eine generelle Eigenschaft zu sein.
Es sind jedoch auch G-Protein-unabhängige Signaltransduktionsmechanismen für die aGPCR
beschrieben worden. Der Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 (BAI1) bindet über seine
thrombospondin type 1 repeats (TSR) externalisiertes Phosphatidylserin auf der Zellmembran
apoptotischer Zellen. Nach Komplexbildung des BAI1 mit ELMO und Dock180 bewirkt dies
über die kleine GPTase Rac die Endozytose apoptotischer Zellen (Park et al., 2007). Das
120 kDa große Vasculostatin, das NTF des BAI1, verhindert weiterhin in vitro die Migration
von Endothelzellen und in vivo Angiogenese. Dies deutet an, dass auch das N-terminale
Fragment per se funktionelle Eigenschaften aufweist (Kaur et al., 2009).
Prömel et al. zeigten für die extrazelluläre Domäne des Latrophilins 1 (LAT1) eine von dem
CTF unabhängige Funktion in Caenorhabditis elegans. Dabei sind zwei unterschiedliche
Mechanismen denkbar: Die Interaktion der Ektodomäne als Ligand für Rezeptoren auf sich in
18
der Nähe befindlichen Zellen (reverse signaling) oder die Assoziation der ECD mit einem
Co-Rezeptor auf derselben Zelle (forward signaling) (Prömel et al., 2012a).
Auch der GPR126 besitzt eine unabhängige Funktion des N-Terminus. GPR126-knock-out
Mäuse und GPR126-knock-down Zebrafische weisen eine verminderte Trabekularisierung des
Herzmuskels auf. Ektope Expression des NTF (ohne GPS-Motiv) des GPR126 ist jedoch in
der Lage, diesem Phänotyp entgegen zu wirken (Patra et al., 2013).
1.4.4 Liganden von aGPCR
Bereits 1996 ist für den CD97 das Komplementsystem-regulierende Oberflächenmolekül
CD55 als Ligand geschrieben worden (Hamann et al., 1996). Auch in den darauf folgenden
Jahren wurden weitere Liganden verschiedener aGPCR veröffentlicht: Chondroitinsulfat-
Glykosaminoglykan für sowohl EMR2 als auch CD97 (Stacey, 2003), α5β1 Integrin für den
CD97 (Wang, 2005) und Gewebstransglutaminase 2 für den GPR56 (Xu et al., 2006). Für
Latrophilin 1 (LAT1) wurden neben dem Gift der Schwarzen Witwe Latrotoxin weitere drei
potentielle Liganden publiziert: Teneurin-2 (Silva et al., 2011), Neurexin (Boucard et al.,
2012) und FLRT (fibronectin leucine-rich repeat transmembrane)-Proteine (O'Sullivan et al.,
2012).
Es bleibt zu bedenken, dass die beschriebenen Interaktionen mit Chondroitinsulfat als niedrig-
affine und Calcium-abhängige Assoziationen charakterisiert sind. Bis heute gibt es auch
keinen Nachweis, dass CD55 die G-Protein-vermittelte Signaltransduktion des CD97 aktiviert
(Paavola and Hall, 2012). Darüber hinaus ist auffällig, dass viele potentielle Liganden
Bestandteile der extrazellulären Matrix darstellen. Im Hinblick auf die Vielzahl funktioneller
Domänen in der ECD, deren Homologie zu Matrixproteinen charakteristisch für die aGPCR
ist, scheinen Interaktionen mit solchen Extrazellulärbestandteilen gut erklärbar. Fraglich
bleibt jedoch, ob es sich bei den Liganden tatsächlich um Agonisten der aGPCR handelt.
1.4.5 Die Bedeutung des cleavage der aGPCR
Im Jahre 1997 konnte für den aGPCR Calcium-independent receptor of α-latrotoxin (CIRL,
auch als Latrophilin bekannt) gezeigt werden, dass der Rezeptor aus zwei nicht-kovalent
gebundenen Fragmenten p120 und p85 besteht. Das extrazellulär gelegene, hydrophile p120
19
weist dabei strukturelle Eigenschaften eines Adhäsionsmoleküls auf, währenddessen p85
einem typischen GPCR entspricht. Da beide Untereinheiten auf demselben Gen kodiert
werden, lag die Vermutung nahe, dass ein Vorläufermolekül durch proteolytische Spaltung
prozessiert wird (Krasnoperov et al., 1997). Die Spaltungsstelle des CIRL wurde in einer
Cystein- und Tryptophan-reichen Region im N-terminalen Fragment lokalisiert. Es konnte
gezeigt werden, dass Mutationen in diesem Bereich die proteolytische Spaltung verhindern
und mit einer erhöhten Degradation des nichtgespaltenen Rezeptors einhergehen. Diese
spezielle Region - als G Protein-coupled Receptor proteolysis site (GPS) bezeichnet - wurde
in vielen aGPCR identifiziert und als besonderes Charakteristikum der gesamten Gruppe
postuliert (Krasnoperov et al., 2002).
Interessanterweise zeigten verschiedene Arbeitsgruppen, dass durch die Abspaltung des NTF
die intrazelluläre Signaltransduktion von aGPCR aktiviert wird. So legte die Gruppe um
Okajima am Brain-specific angiogenesis inhibitor 2 (BAI2) dar, dass die an der GPS
trunkierte Variante in einem Reportergen-Assay NFAT (nuclear factor of activated T-cells)
10fach stärker aktiviert als der Wildtyp ist (Okajima et al., 2010). Für den GPR56 wurde
beschrieben, dass eine homolog verkürzte Form dieses Rezeptors mit einer erhöhten Gα12/13-
Protein-Kopplung im Vergleich zum WT einhergeht (Paavola et al., 2011). Neuere
Untersuchungen des Brain-specific angiogenesis inhibitors 1 (BAI1) zeigten eine Aktivierung
des Rho-Signalwegs über Gα12/13 und die Phosphorylierung der Extracellular-signal regulated
Kinase (ERK) auf, welche durch die Trunkierung des N-Terminus drastisch gesteigert werden
konnten (Stephenson et al., 2013).
In Hinblick auf die potenzielle Aktivierung durch das cleavage der aGPCR wurde 2002 für
den BAI2 ein Modell vorgeschlagen, das die bis dahin publizierten Forschungsergebnisse
vereint. Der BAI2 soll im Endoplasmatischen Retikulum glykosyliert und an der GPS (sowie
durch Furin) so gespalten werden, dass NTF und CTF weiterhin nicht-kovalent assoziiert
bleiben. Zur Zelloberfläche transportiert, kann der extrazellulär gelegene Bereich über seine
funktionellen Domänen mit Matrix- oder Membranproteinen interagieren und von dem CTF
dissoziieren. Dies löst in dem verbliebenen membrangebundenen CTF eine
Konformationsänderung zur aktiven Form des Rezeptors aus und resultiert in der Kopplung
an dessen spezifisches G-Protein. Bis heute ist diese generelle Vorstellung der aGPCR-
Aktivierung aktuell geblieben und wurde von verschiedenen Autoren erneut aufgegriffen. So
beschrieben auch Paavola et al. den inhibitorischen Effekt des N-Terminus des GPR56
(Paavola et al., 2011). Es wird davon ausgegangen, dass sich im N-Terminus ein gebundener
20
inverser Agonist befindet, der erst durch einen Liganden sterisch von der
Transmembranregion entkoppelt wird.
Obwohl die Struktur der GAIN-Domäne und der Mechanismus der autoproteolytischen
Spaltung gut verstanden zu sein scheinen (Paavola et al., 2011; Araç et al., 2012), bleibt die
Funktion des cleavage unklar. Zwei BFPP-assoziierte Mutationen in der GPS des GPR56
gehen mit einem gestörten intrazellulären Transport des Rezeptors zur Plasmamembran und
cleavage-Defizienz einher (Jin et al., 2007). Mutationen konservierter Cysteinreste innerhalb
der GPS des GPR126 wurden als cleavage-defizient postuliert und sollen in intrazellulären
Vesikeln lokaliert sein (Moriguchi et al., 2004). Für den EMR2 dagegen wurden verschiedene
Punktmutationen der cleavage site untersucht, ohne dass eine konsistente Korrelation
zwischen proteolytischer Spaltung und Expression gefunden werden konnte (Lin et al., 2004).
Cleavage-defiziente Mutationen des Latrophilins 1 (LAT1) zeigten hinsichtlich Fertilität und
Letalität in Caenorhabditis elegans keinen Unterschied zum Wildtyp auf, sodass cleavage für
LAT1 verzichtbar erscheint (Prömel et al., 2012a).
Erwähnenswert ist des Weiteren, dass einige Vertreter dieser Rezeptorfamilie wie GPR111
und GPR115 eine veränderte Struktur der GPS aufweisen und dort keine autoproteolytische
Spaltung erfolgt (Prömel et al., 2012b). Dem aGPCR GPR123 fehlt die GPS-Domäne
gänzlich (Bjarnadóttir et al., 2007a; UniProtKB/Swiss-Prot, 2014). Für den GPR56 und
GPR124 sind weiterhin gewebespezifische Splicevarianten ohne GPS erkannt worden
(Bjarnadóttir et al., 2007b).
1.4.6 Der GPR126
Der GPR126, auch als Developmentally Regulated G Protein–coupled Receptor (DREG) oder
Vascular inducible G Protein-coupled Receptor (VIGR) beschrieben, ist ein Vertreter der
aGPCR. Orthologe des GPR126 sind spezifisch in Vertebraten wie Fischen, Reptilien, Vögeln
und Säugetieren zu finden. Chordatiere wie Ciona intestinalis und das Neunauge Petromyzon
marinus exprimieren den GPR126 dagegen nicht (Waller-Evans et al., 2010). Nächster
Verwandter des GPR126 ist der GPR112, welcher auch nur in Vertebraten exprimiert ist.
Gewebespezifisch ist der GPR126 in der Plazenta, Schwannzellen und in Endothelzellen zu
finden (Moriguchi et al., 2004; Stehlik et al., 2004; Monk et al., 2009). Während der
Embryogenese ist der GPR126 im murinen Herz und in den Somiten hoch exprimiert, im
adulten Gewebe dagegen besonders in der Lunge (Moriguchi et al., 2004).
21
Das Gen für den humanen GPR126 ist auf dem langen Arm q24.1 des Chromosoms 6
lokalisiert. Es wurden bisher drei Splicevarianten des GPR126 beschrieben, von denen für
zwei eine funktionelle Bedeutung vorausgesagt wird. Eine Variante, der 26 Aminosäuren im
N-Terminus fehlen, ist sogar konserviert in Maus und Affe gefunden worden (Bjarnadóttir et
al., 2007b).
Der GPR126 weist typische strukturelle Charakteristika der aGPCR-Klasse auf. Im
extrazellulären Bereich des GPR126 sind als funktionelle Bestandteile die Pentraxin (PTX)-
und CUB-Domänen identifiziert worden. Pentraxine sind Pentamere und umfassen Akute-
Phase-Proteine wie das humane C-reaktive Protein (CRP) und das Serumamyloid P. Calcium-
abhängige Bindung von Bakterien, Chromatin und Kohlenhydraten sowie Interaktionen mit
dem Komplementsystem und Leukozyten verdeutlichen die Rolle von Pentraxinen in der
natürlichen Immunabwehr (Gewurz et al., 1995). Die CUB-Domäne wurde erstmalig in
Subkomponenten des Komplementsystems (C1r/C1s) erkannt und ist darüber hinaus als
Bestandteil von Kollagen-spaltenden Proteasen (Hulmes et al., 1997), in
Entwicklungsprozesse vermittelnden Proteinen (Bork and Beckmann, 1993) und in der
zellulären Immunabwehr beschrieben worden (Duke-Cohan et al., 2000). Es darf deshalb
vermutet werden, dass auch der GPR126 eine entscheidende Rolle in der angeborenen
Immunabwehr einnimmt (Stehlik et al., 2004).
Am C-terminalen Ende des N-Terminus befindet sich die GPS, an der der GPR126
intrazellulär autoproteolytisch gespalten wird. Moriguchi et al. beschrieben, dass resultierend
aus dieser Spaltung ein 35 kDa großes membrangebundenes Fragment im Westernblot
gefunden werden kann. Weiterhin soll aus einer N-terminal lokalisierten Furin-Spaltstelle ein
70 kDa großes Fragment hervorgehen. Es wurden bereits erste Untersuchungen zweier
GPR126-knock-out Mauslinien angestellt. Waller-Evans et al. beschrieben, dass homozygot
GPR126-negative Mausembryonen aufgrund kardiovaskulärer Fehlentwicklung nicht
lebensfähig sind. Defekte der Ventrikelentwicklung mit ausgedünnten Myokardwänden
wurden als wahrscheinlichste Todesursache bei GPR126-Funktionsverlust aufgezeigt.
Dagegen stellten Monk et al. heraus, dass Nachkommen einer anderen GPR126-knock-out
Mauslinie zwar auch vielfach schon in utero verstarben, einige jedoch postnatale Stadien
erreichen konnten. Diese wiesen Myelinisierungsstörungen des peripheren Nervensystems
sowie multiple Defekte peripherer Nerven auf (Monk et al., 2011). Ein ähnlicher Phänotyp
charakterisiert auch den GPR126-knock-out im Zebrafisch Danio rerio. Die Mutation st49
führt N-terminal der GPS des GPR126 ein vorzeitiges Stopcodon ein und bewirkt einen
Myelinisierungsdefekt im peripheren Nervensystem. Untersuchungen bekannter
22
Differenzierungsmarker von Schwannzellen ergaben, dass die frühsten Defekte durch
GPR126-knock-out ab Stunde 42 nach Fertilisation der Zebrafischlarven nachweisbar sind. Es
konnte geschlussfolgert werden, dass der GPR126 durch die Expression von Oct6 und krox20
die Myelinisierung von motorischen und sensorischen Nerven initiiert und sie im
Adultstadium aufrechterhält (Monk et al., 2009).
Neben einer Ohrschwellung gab es durch st49 keine weiteren Auffälligkeiten, insbesondere
keine kardiovaskulären Phänomene. Eine Erklärung für diese unterschiedlichen Phänotypen
lieferten nun neue Untersuchungen durch Patra et al.. Das GPR126-CTF, welches in der
Zebrafisch-Mutation st49 nachweislich fehlt, soll die strukturelle Ursache für die
Myelinisierungsstörung darstellen. Für eine regelrechte Herzentwicklung soll das GPR126-
CTF nicht notwendig sein. Im Gegensatz dazu genügt das GPR126-NTF-ΔGPS (N-terminaler
Bereich des Rezeptors ohne GPS) für eine korrekte Herzanlage, kann jedoch dem
Myelinisierungsschaden nicht entgegen wirken. Das lässt vermuten, dass der GPR126 als
Rezeptor das Myelingen in Schwannzellen beeinflusst und im Herzen möglicherweise durch
sein NTF als Ligand oder Co-Rezeptor einen unbekannten Rezeptor aktiviert (Patra et al.,
2013).
Genomweite Assoziationsstudien zeigten weiterhin eine entscheidende Rolle des humanen
GPR126 in der Ausprägung von Körpergröße auf (Hancock et al., 2009; Soranzo et al., 2009;
Zhao et al., 2010). Nach dem in vivo Hinweis im Zebrafisch, der eine Gs-Kopplung nahelegte,
konnten nun Ergebnisse der Arbeitsgruppe eine Interaktion des GPR126 mit Gs- und Gi-
Proteinen bestätigen (Mogha et al., 2013).
1.4.7 Der GPR133
Der aGPCR GPR133, früher auch als G-Protein Coupled Receptor PGR25 bezeichnet (NCBI
Gene, 2014), ist im humanen Genom auf dem langen Arm q24.33 des Chromosoms 12
lokalisiert. Orthologe des GPR133 finden sich in Säugetieren, Fischen, Vögeln und Reptilien,
aber auch im Plattentier Trichoplax adhaerens, Stachelhäutern und der kleinpolypigen
Steinkoralle Acropora millepora.
Der nächstverwandte Rezeptor ist der aGPCR GPR144 (Bjarnadóttir et al., 2007a). Man geht
heute davon aus, dass sich die GPCR der Sekretin-Familie ausgehend vom GPR133 und
GPR144 entwickelt haben (Nordström et al., 2008a).
23
Im Gegensatz zum GPR126 ist im extrazellulären Rezeptorbereich des GPR133 nur eine
Pentraxin-(PTX) Domäne enthalten. Bjarnadόttir et al. beschrieben zwei funktionelle
Splicevarianten des GPR133 und deren Expression in fetalem Gewebe, Lunge, Milz und
Testis (Bjarnadóttir et al., 2007b). Northernblot Untersuchungen wiesen Transkripte des
GPR133 in der humanen Hypophyse und im Putamen nach (Vanti et al., 2003). Kobayashi et
al. fanden des Weiteren die Expression des GPR133 im Follikel-assoziierten Epithel
(Kobayashi et al., 2012). Im Ileum erkennt man Follikel-assoziiertes Epithel in den
sogenannten Peyer´s Plaques. Diese Plaques als Zusammenschluss mehrerer hunderter
Lymphfollikel sind Orte der Immunabwehr: Exogene Antigene werden über spezialisierte M-
Zellen über Endozytose aufgenommen und Zellen der adaptiven Immunabwehr präsentiert
(Aumüller, 2010).
Ähnlich dem GPR126 ist auch der GPR133 in genomweiten Assoziationsstudien mit
Körpergröße assoziiert worden (Tönjes et al., 2009). Weiterhin soll der GPR133 das
Körpergewicht von Mäusen kontrollieren (Chan et al., 2012) und die Länge des RR-Intervals
im Elektrokardiogramm modulieren. Marroni et al. identifizierten zwei Single Nucleotide
Polymorphisms (SNP) des GPR133, welche die Herzfrequenz um durchschnittlich etwa einen
Herzschlag pro Minute erhöhen. Eine Herzfrequenzsteigerung stellt einen bekannten
Risikofaktor für die Morbidität und Mortalität kardiovaskulärer Erkrankungen dar (Marroni et
al., 2009). Genotyp-Phänotyp-Untersuchungen ergab eine Assoziation eines GPR133-SNP
mit vermehrter Lipidaufnahme (Kraja et al., 2013).
Der GPR133 ist der erste Vertreter der aGPCR für den G-Protein-Kopplung überzeugend
durch Akkumulation des second messengers cAMP bewiesen werden konnte. Heute ist
bekannt, dass der GPR133 sowohl über Gαs- als auch über Gαi–Proteine Signaltransduktion
ausübt (Bohnekamp and Schöneberg, 2011; Liebscher et al., 2013).
24
2 Ziele und Fragestellungen
Bis heute sind die aGPCR orphane Rezeptoren. Für die beschriebenen Liganden fehlt bisher
der Nachweis einer agonistischen Funktion. Die Rolle des enorm langen N-Terminus ist nach
wie vor unklar und für den überwiegenden Teil der aGPCR-Klasse ist die intrazelluläre
Signaltransduktion unbekannt. Für die beiden aGPCR Vertreter GPR126 und GPR133 wurde
am Institut für Biochemie die Signaltransduktion geklärt und damit ein funktionelles read-
out-System etabliert. Anhand dessen konnten Mutagenesestudien durchgeführt werden,
welche die Basis zur Klärung aktivitätsrelevanter Positionen und letztendlich des
Aktivierungsmechanismus bilden. Basierend auf Voruntersuchungen anderer Arbeitsgruppen
werden zwei Aktivierungsmechanismen postuliert (Liebscher et al., 2013):
a. Bereiche der ECD wirken als inverser gebundener Agonist und blockieren die
Rezeptorfunktion bis zum Zeitpunkt einer Ligandbindung.
b. In der ECD befindet sich ein gebundener Agonist, welcher durch Ligandbindung
freigelegt wird und die Signaltransduktion des Rezeptors aktiviert.
Abb. 3 Hypothetische Aktivierungsmechanismen der aGPCR
A) Der N-Terminus enthält einen gebundenen inversen Agonist, welcher die 7TM-Signaltransduktion inhibiert.
Ligandenbindung an die ECD oder künstliche Abspaltung der ECD beendet diese Inhibierung. B) Bindung eines
Ligandes an die ECD oder Entfernung von Teilen der ECD löst eine Konformationsänderung aus und legt einen
gebundenen Agonist frei.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der molekularen Charakterisierung der Klasse der
aGPCR und soll dabei folgende Fragen beantworten:
1. Gibt es einen generellen Mechanismus, durch den alle aGPCR aktiviert werden? Wie
sieht dieser Mechanismus konkret aus (Hypothese des gebundenen inversen Agonist
versus gebundenen Agonist)?
A B
25
2. Gibt es generelle Kopplungsmerkmale der aGPCR-Klasse? Koppeln weitere Vertreter
(neben GPR126 und GPR133) an G-Proteine und wie spezifisch ist diese Kopplung?
3. Werden alle aGPCR, die eine charakteristische cleavage-Sequenz aufweisen,
tatsächlich gespalten? Hat dies einen Einfluss auf die Expression bzw. Basalaktivität
der Rezeptoren?
4. Können Punktmutationen identifiziert werden, welche eine konstitutive Aktivität des
Rezeptors nach sich ziehen?
Um diesen Fragestellungen nachzugehen, wurden 11 orphane aGPCR-Vertreter molekular
charakterisiert. Hauptsächlich basierend auf murinen cDNA-Bibliotheken wurden die
Rezeptoren in einen Säugetier-Expressionsvektor kloniert und hinsichtlich ihrer
intrazellulären G-Protein-abhängigen Signaltransduktion untersucht.
Die Frage eines allgemeinen Aktivierungsmechanismus der aGPCR wurde anhand der bereits
basal charakterisierten Rezeptoren GPR126 und GPR133 analysiert.
26
3 Material/Methoden
3.1 Chemikalien und allgemeine Labormaterialien
Falls nicht konkret angegeben, wurden alle Standardchemikalien von Sigma Aldrich
(Taufkirchen, Deutschland), Merck (Darmstadt, Deutschland) oder C. Roth GmbH
(Karlsruhe, Deutschland) erworben. Zellkultur- und Laborplastikmaterialien waren von
Greiner Bio-One GmbH (Frickenhausen, Deutschland) und Sarstedt (Nürnberg, Deutschland)
sowie Pipetten von Eppendorf (Hamburg, Deutschland) und VWR (Darmstadt, Deutschland)
bezogen. Primer wurden durch Invitrogen (Life Technologies, Darmstadt, Deutschland)
hergestellt. Es wurden weiterhin Enzyme und DNA/Protein-Größenstandards von Thermo
Scientific (München, Deutschland) oder New England Biolabs GmbH (Frankfurt am Main,
Deutschland) bezogen.
3.2 Molekularbiologische Standardmethoden
Tab. 1 Liste der verwendeten molekularbiologischen Standardmethoden
Methode Protokoll Firma, System
Nukleinsäurekonzen-
trationsbestimmung Sambrook et al., 1989
Spektrophotometer, NanoDrop ND1000, Peq Lab
Biotechnologie (Nürnberg, Deutschland)
Agarosegelelektrophorese Sambrook et al., 1989 Horizontalgelelektrophorese-Systeme, Peq Lab
(Nürnberg, Deutschland)
Polyacylamidgelelektro-
phorese SDS-PAGE Laemmli, 1970
Mini-Protean II Cell BioRad, Laboratories, Inc.
(München, Deutschland)
Restriktionsverdau Nach Angaben des
Herstellers
Restriktionsendonukleasen, Thermo Scientific
(München, Deutschland)
Polymerasekettenreaktion Sambrook et al., 1989 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, Thermo
Scientific (München, Deutschland)
Agarosegel-Elution Nach Angaben des
Herstellers
Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System,
Promega (Mannheim, Deutschland)
DNA-Reinigung Nach Angaben des
Herstellers
Wizard Plus SV, Miniprep/Midiprep DNA
purification System, Promega (Mannheim,
Deutschland)
Sequenzierung Sanger et al., 1977
Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit,
Sequenziergerät ABI 3730, Applied Biosystems,
Life Technologies GmbH (Darmstadt, Deutschland)
27
Tab 2. Übersicht der verwendeten Laborgeräte
Funktion Gerät, Firma
Zentrifuge für 50 ml Falcons und
96 Well-Platten
Multifuge 1 S-R, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH (Hanau,
Deutschland)
Zentrifuge für 0,5-2,0 ml
Röhrchen
Biofuge pico, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH (Hanau,
Deutschland)
Spektrophotometer Sunrise™, Tecan Deutschland GmbH (Crailsheim, Deutschland)
37 °C Kulturschrank Memmert (Schwabach, Deutschland)
37 °C Schüttel-Kulturschrank Kulturschrank, Edmund Bühler GmbH (Hechingen, Deutschland)
Kreisschüttler Heidolph Polymax 1040 (Schwabach Deutschland)
Überkopfschüttler Reax 2, Heidolph Instruments GmbH (Schwabach, Deutschland)
Vortexer Vortex-Genie 2, Scientific Industries (New York, USA)
PCR-Zykler DNA engine, thermal cycler, Bio-Rad Laboratories GmbH (München,
Deutschland)
Zellkultur Bench HERA Safe, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH (Hanau,
Deutschland)
Zellkultur Brutschrank, 37 °C
5% CO2
HERA (el) 150, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH (Hanau,
Deutschland)
Thermomixer Thermomixer comfort, Eppendorf AG (Hamburg, Deutschland)
Fluoreszenzmikroskop Axiovert 200, Zeiss (Jena, Deutschland)
Kamerasystem (Westernblot) Decon Dc Sience Tec, DeVision DBOX (Hohengandern, Deutschland)
3.3 Klonierung
Während der Großteil an Wildtyp-Rezeptoren durch Verwendung von murinen cDNA-
Bibliotheken in den Säugetier-Expressionsvektor pcDps kloniert werden konnte, bedurfte es
für das Konstrukt des murinen Brain-specific angiogenesis inhibitors 2 (BAI2) die Nutzung
eines kommerziell erhältlichen Imageclons (Source BioScience LifeSciences, Nottingham,
Großbritannien). Der hier stets eingesetzte pcDps-Vektor besitzt eine Ampicillin-
Resistenzkassette, welche zur Selektion in Bakterien genutzt werden kann, und einen SV40-
Promotor (Okayama and Berg, 1983). Alle Rezeptoren wurden mit mindestens zwei Epitop-
tags (Markierungen) versehen, um die Expression der Konstrukte an der Zellmembran zu
gewährleisten und deren Detektion in Zellkompartimenten zu ermöglichen. N-terminal
wurden deshalb die Aminosäuren YPYDVPDYA des humanen Influenza-Hämagglutinins
(HA) hinter dem Signalpeptid eingebracht, am Ende des C-Terminus dagegen eine FLAG-
28
Sequenz (DYKDDDDKI). Für einige Rezeptoren war es zusätzlich notwendig, ein weiteres
tag N-terminal einzufügen: Das RHO-tag, welches den ersten 20 Aminosäuren des bovinen
Rhodopsins entspricht, konnte schon für andere GPCR erfolgreich eingesetzt werden, um
deren Oberflächenexpression an der Zellmembran zu erhöhen (Bohnekamp and Schöneberg,
2011). Länge und Lokalisation des Signalpeptids für diese Rezeptoren wurde durch SignalP
4.1 Server vorhergesagt (Center for Biological Sequence Analysis CBS). Alle
Vektorkonstrukte wurden mit einer Kozak-Sequenz im 5‘-Bereich des Start-Codons ATG als
ribosomale Bindungsstelle und damit als Startsignal für die Proteinbiosynthese versehen
(Kozak, 1987).
Für die Klonierung von Rezeptoren mit bis 4000 bp Sequenzlänge wurde eine Standard-PCR
durchgeführt. Teilweise war es jedoch unumgänglich, die Sequenz eines aGPCR in mehrere
Teilstücke zur besseren Handhabung während der Klonierungsschritte zu zerlegen. Die
Sequenz des murinen BAI2 ist beispielsweise 1561 Aminosäuren lang und wurde in drei
Teilstücke aufgeteilt. In einem ersten Schritt wurden die Teilbereiche des Rezeptors in den
Plasmidvektor pCR™4-TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen) eingefügt und
sequenziert. Da sich der übliche Einsatz von Restriktionsenzymen dieses Rezeptors
kompliziert gestaltete, wurden unter Nutzung des E.coli.-Stamms SW102 und des Gibson
Assembly zwei Rekombinationsmethoden eingesetzt.
3.3.1 E. coli–Stamm SW102
Der Rekombinationsstamm SW102 erlaubt die Klonierung von DNA in E. coli ohne den
üblichen Einsatz von Restriktionsenzymen und DNA-Ligase. Zellen des Stamms SW102
enthalten einen defekten λ Prophagen. Dabei sind drei λ-kodierte Gene von Bedeutung: Exo,
Bet und Gam. Der λPL Promotor für diese Gene wird bei 32 °C durch einen Temperatur-
sensitiven Repressor behindert. Während bei 32 °C demnach keine Rekombinationsproteine
produziert werden, veranlasst eine kurze Temperaturerhöhung auf 42 °C (Hitzeschock für 15
Minuten) die Produktion einer ausreichenden Menge solcher Rekombinationsproteine: Exo
kodiert für eine 5´-3´-Exonuklease, die 3´-Überhange der eingebrachten doppelsträngigen
DNA produziert. Bet schützt diese Überhänge und unterstützt den nachfolgenden
Rekombinationsprozess, wohingegen Gam die Degradation der linearen DNA durch das
E. coli RecBCD-Protein verhindert.
29
Im ersten Schritt erfolgt die Transformation des nativen pcDps-Vektors in die SW102-Zellen
mit nachfolgender Kompetenzerzeugung mit Calciumchlorid (Mandel and Higa, 1970) und
Aktivierung der Rekombinaseaktivität durch 15-minütige Inkubation bei 42 °C. Danach
schließt sich die Transformation des PCR-Produktes in die nun chemisch-kompetenten
SW102-Zellen inklusive pcDps an, welche allein durch die drei λ-kodierten Gene ermöglicht
wird. Die SW102-Zellen werden bei 32 °C für 32-48 Stunden auf LB-Platten inkubiert, bis
Zellklone erkennbar sind.
Zum Gelingen der Rekombination ist ein spezielles Primerdesign nötig, welche 5‘ 60 bp
homologe Sequenzen zum Zielvektor und 3‘ 30 bp Homologie zur Resistenzkassette
sicherstellen. Für die Klonierung des BAI2 wurde dafür eine zusätzliche Kanamycin-
Resistenzkassette an das Ende des 1. Teilstückes durch eine Overlap-PCR eingefügt. Die
Kanamycin-Resistenz konnte so zur Unterscheidung zwischen nativem pcDps-Vektor und
erfolgreicher Rekombination in den Vektor auf Kanamycin-haltigen Kulturplatten dienen. Die
Kanamycin-Resistenzkassette wurde nachträglich über eine XbaI-Restriktionsenzymstelle
entfernt (NCI at Frederick; Warming, 2005).
3.3.2 Gibson Assembly
Die Gibson Assembly Methode erlaubt eine effiziente Vereinigung multipler überlappender
DNA-Fragmente in einer einstufigen isothermalen Reaktion. Das Protokoll ermöglicht die
Fusion von bis zu mehreren hundert Kilobasenfragmenten. Wichtig dabei ist, dass die
Fragmentenden mindestens 16 bp lange homologe Sequenzen zum zu überlappenden
Fragment aufweisen (Gibson et al., 2009).
Es werden gleichzeitig drei verschiedene Enzyme eingesetzt: 5′ T5-Exonuklease, Phusion
DNA-Polymerase und Taq DNA-Ligase. Die Exonuklease erzeugt 3‘-Einzelstrangüberhänge
und erleichtert so das Annealing komplementärer Fragmente. Die Polymerase füllt Lücken
innerhalb der überlappenden Regionen mit Desoxy-Nukleosidtriphosphaten (dNTPs) auf.
Schließlich verbindet die Ligase die vereinigten DNA-Fragmente.
Alle Reaktionsbestandteile (Exonuklease, Polymerase, Ligase, DNA-Fragmente, Puffer,
ddH2O) werden in einem Thermocycler bei 50 °C für 15 Minuten inkubiert. Nun schließt sich
eine gewöhnliche Transformation an. Eine Reinigung des Reaktionsansatzes ist nicht nötig.
Dazu werden chemisch kompetente Zellen (One Shot E. coli DH5α, Invitrogen) auf Eis
langsam aufgetaut und 1 µl des Reaktionsansatzes unter vorsichtigem Mischen hinzugefügt.
30
Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis erfolgt ein kurzer Hitzeschock der Proben bei 42 °C für
30 Sekunden. Zur Regeneration wird nun auf 37 °C erwärmtes S.O.C.-Medium (350 µl pro
Reaktionsgefäß) zugegeben und bei 37 °C für eine weitere Stunde unter konstanter Rotation
inkubiert. 150 µl der Zellsuspension werden schließlich auf angewärmten LB-Platten mit
geeignetem Antibiotikum (Kanamycin) ausgestrichen. Über Nacht werden die Platten in
einem Brutschrank bei 37 °C aufbewahrt und gewachsene Klone am darauf folgenden Tag auf
das Vorhandensein der gewünschten Fragmente mithilfe einer PCR untersucht. Auch hier
wurde ähnlich der SW102-Klonierungsstrategie eine zusätzliche Antibiotikaresistenzkassette
in das Konstrukt des BAI2 eingebaut.
3.4 Zellkultur und Transfektion
Die Zelllinie COS-7 besteht aus Simian Vacuolating Virus 40 (SV40)-immortalisierten
Nierenzellen der äthiopischen Grünmeerkatze Cercopithecus aethiops. Die Zellen werden in
Dulbecco's Modified Eagle´s Medium (DMEM) inklusive 10 % fetalem Rinderserum (FBS),
100 units/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO2 unter gesättigter
Luftfeuchtigkeit kultiviert. Für funktionelle Untersuchungen werden die Zellen in 6-Well-
(3x106 Zellen/Well), 12-Well- (1x105 Zellen/Well) und 48-Well-Platten (3×104 Zellen/Well)
oder in 25-cm²-Zellkulturflaschen (7x106 Zellen) ausgesetzt. Dazu wird der Zellrasen mit PBS
gewaschen und durch Inkubation mit Trypsin/EDTA für zwei Minuten bei 37 °C abgelöst. In
einer Neubauer-Zählkammer wird die Anzahl der vereinzelten Zellen bestimmt.
Am darauf folgenden Tag wird bei 80-90 % Konfluenz des Zellrasens in den Wells eine
transiente Transfektion der Rezeptorkonstrukte mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Paisley,
UK) laut Herstellerprotokoll vorgenommen. Dafür setzt man für den cAMP-Assay 100-
600 ng, für die PI-Assay 500-1500 ng, für den Oberflächen-ELISA 300 ng bzw. 1000 ng des
DNA-Rezeptorkonstrukts im Sandwich-ELISA pro Well ein. Für die Transfektion kommt ein
speziell dafür entwickeltes Minimalmedium Opti-MEM (Life Technologies, Darmstadt,
Deutschland) zum Einsatz. Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wird in jedem Assay
zusätzlich ein GFP-Expressionsplasmid mitgeführt, sodass dessen Expression nach 24
Stunden durch grün-fluoreszierende COS-7-Zellen im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen
werden kann.
31
3.4.1 Messung der cAMP-Akkumulation mittels AlphaScreen-Technologie
GPCR, welche eine Interaktion mit der Gαs-Untereinheit von G-Proteinen eingehen, führen
zur Aktivierung der Adenylylcyclase und vermitteln somit eine intrazelluläre Steigerung des
cAMP-Spiegels. Zur Bestimmung des cyclischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Gehalts
werden die Zellen in Wells 48 Stunden nach erfolgter Transfektion mit 1 mM 3-Isobutyl-1-
Methylxanthin (IBMX)-versetztem DMEM zuerst gewaschen und anschließend für 60
Minuten inkubiert. IBMX ist ein kompetitiver, nicht-selektiver Inhibitor von
Phosphodiesterasen. Durch Blockierung des endogenen Abbauweges von cAMP führt der
Einsatz von IBMX schließlich zur intrazellulären cAMP-Akkumulation. Wird zusätzlich
während dieser Inkubationsperiode mit 10 µM Forskolin stimuliert, steigt die cAMP-
Konzentration erheblich an (Positivkontrolle). Forskolin aktiviert nicht-selektiv
Adenylylcyclasen, welche die cAMP-Generation aus ATP katalysieren. Nach der erwähnten
Inkubation wird das IBMX-Medium gründlich auf Eis abgesaugt und jedes Well mit 50 µl
gekühltem LI-Lysepuffer (5 mM 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-Ethansulfonsäure
(HEPES), pH 7.6, 0,3 % Tween-20, 0,1 % BSA, 1 mM IBMX) versetzt. Die Zellkulturplatten
werden nun für mindestens 30 Minuten bei -20 °C eingefroren, bevor für die Messung der
cAMP-Konzentration jeweils 5 µl des Lysats in eine spezielle 384-Well-Platte (White
Opaque, PerkinElmer) übertragen werden. Eine Standardmessreihe mit definierten cAMP-
Konzentrationen ist dabei mitzuführen.
Die AlphaScreen-Methode (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay,
PerkinElmer, Rodgau, Deutschland) setzt zwei verschiedene Antikörper-gekoppelte beads
ein: Der Akzeptor-bead bindet im Zelllysat vorhandenes cAMP. Der anschließend dazu
gegebene Donor-bead enthält bereits Streptavidin-gebundenes biotinyliertes cAMP und kann
darüber nur mit freien Akzeptor-beads interagieren, deren Antikörper nicht mit cAMP aus
dem Zelllysat besetzt sind. Eine solche Interaktion, die von Donor- und Akzeptor-beads
eingegangen wird, kann in der Messung im Fusion™ α-FP (PerkinElmer, Rodgau,
Deutschland) detektiert werden. Dazu wird der Donor-bead durch Licht einer Wellenlänge
von 680 nm angeregt. Es kommt nur dann zum Energietransfer in Form von Singulett-
Sauerstoff (*O2) zwischen Donor und Akzeptor, wenn diese räumliche Nähe aufweisen, also
eine Assoziation eingegangen sind. Ein durch den Donor- angeregter Akzeptor-bead emittiert
nun grünes Licht, das bei 520 nm gemessen wird.
Ein Zelllysat ohne cAMP erzeugt dementsprechend maximal hohe Emissionswerte, weil alle
Akzeptor-beads frei von den Donor-beads gebunden werden können und so einen hohen
32
Energietransfer zulassen. Dagegen sprechen niedrige Punktwerte im AlphaScreen für eine
hohe endogene Konzentration an cAMP.
3.4.2 Inositolphosphat–Akkumulationsassay
GPCR, welche eine Interaktion mit der Gαq-Untereinheit von G-Proteinen eingehen, führen
zur Aktivierung der Phospholipase Cß und vermitteln somit eine intrazelluläre Steigerung der
Diacylglycerol (DAG)- und Inositoltriphosphat (IP3)-Spiegel. Dies erfolgt durch die
Hydrolyse von Zellmembran-gebundenem Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2).
Inkubiert man nun die transfizierten Zellen mit 3H-markiertem myo-Inositol über Nacht, wird
dies in Form von PIP2 in die Zellmembran eingelagert. Auch in diesem Assay wird zur
Bestimmung der second messenger-Konzentration deren intrazellulärer Abbau blockiert. In
diesem Fall hemmt Lithium Inositolmonophosphatasen (IMPase) und führt dabei zur
Akkumulation von 3H-markierten Inositoltriphosphaten (IP, im Wesentlichen IP1), wenn der
zu untersuchende Rezeptor den Gq-Signalweg aktiviert. Durch Co-Transfektion mit dem
chimären G-Protein Gqi4, bei welchem die vier C-terminalen Aminosäuren von Gq durch die
korrespondierenden von Gi ersetzt sind, können in diesem Experiment auch endogene Gi-
Koppler detektiert werden. Das chimäre G-Protein Gqi4 leitet dann Aktivität anstelle des Gi-
Signalwegs auf die Phospholipase Cß und IP3 um. Nach dem Zellaufschluss erfolgt die
Messung von IP mittels sequenzieller Ionenaustauschchromographie (Berridge, 1983).
Am Tag nach der Transfektion werden konkret 2 µCi/ml myo-3H-Inositol in DMEM für eine
mindestens 16-stündige Inkubation eingesetzt. Dem schließt sich ein Waschschritt und eine
Inkubation für eine Stunde mit 1 mM LiCl bei 37 °C im Zellkulturschrank an. Sollen
potentielle Liganden getestet werden, können diese dem Lithiumchlorid in diesem Schritt
zugefügt werden. Als Positivkontrollen für diesen Assay werden der muskarinische
Acetylcholinrezeptor M3, ein bekannter Gq-Koppler mit 10 µM Carbachol stimuliert, bzw. der
purinerge P2Y12 Rezeptor, als bekannter Gi-Koppler mit 10 µM MeS-ADP stimuliert,
eingesetzt. Nachdem die Stimulationslösung abgesaugt ist, werden zur Lyse nun 300 µl 0,1 M
NaOH, 100 µl 0,2 M Ameisensäure und 2 ml Verdünnungspuffer (5 mM Natriumborat, 0,5
mM EDTA) auf die Zellen pipettiert. Die Lysate werden dann (ohne Zelldetritus) auf die
Dowexsäulen (AG1 X8, 2 g/Säule, Säulendurchmesser 8 mm) überführt und mittels 5 ml
Elutionspuffer (0,2 M Ammoniumformiat, 0,1 M Ameisensäure) in Szintillationsgefäße mit
15 ml LumaSafe Plus (PerkinElmer) eluiert. Die Messung der darin enthaltenen
33
Radioaktivität wird mit einem ß-Counter (Beckmann) durchgeführt. Vor und nach jedem
Experiment sind die Dowexsäulen zu wässern und zu regenerieren (3 M Ammoniumformiat,
0,25 M Ameisensäure).
3.4.3 Oberflächen-ELISA
GPCR sind Transmembranproteine. Um den Anteil der Rezeptoren zu bestimmen, die
tatsächlich an die Plasmamembran transportiert worden sind, wird in diesem Enzyme-linked
Immunosorbent Assay (ELISA) der N-terminal eingefügte HA-tag detektiert.
Dazu werden 48 Stunden nach Transfektion die Zellen mit 4 % Formaldehyd in PBS für 20
Minuten fixiert und nach dreimaligem Waschen mit PBS schließlich mit FBS-haltigem
DMEM blockiert. Die Blockierung beugt unspezifischen Antikörperbindungen vor und
erfolgt unter leichten Schwenkbewegungen bei 37 °C für eine Stunde. Nach weiteren drei
Waschschritten mit PBS werden die Proben mit Peroxidase-gekoppeltem monoklonalen Anti-
HA-Antikörper (3F10, Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland, 1:1000 verdünnt in
Blockierungslösung) inkubiert. Da die Zellen in diesem Assay nicht lysiert werden, kann der
Antikörper nur an Rezeptoren binden, deren HA-tag nach extrazellulär weist, somit
ausschließlich an in der äußeren Zellmembran lokalisierte GPCR. In Anwesenheit von H2O2
katalysiert die Peroxidase die Oxidation des nahezu farblosen o-Phenylendiamin (OPD) in ein
orange-gelbes Produkt mit einem Absorptionsmaximum bei 420 nm Wellenlänge. Daher wird
zur Detektion (nach drei erneuten Waschschritten) 200 µl des Substratpuffers (0,1 M
Zitronensäuremonohydrat, 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat, pH 5 versetzt mit 10 mg OPD
und 40 µl H2O2) auf die Zellen gegeben und nach 2 bis 20 Minuten mit 50 µl 1 M HCl die
Reaktion beendet. Der Farbumschlag wird bichromatisch bei 492 und 620 nm in einem
Mikrotiterplattenlesegerät (Sunrise, Tecan Group Ltd, Crailsheim, Deutschland) ermittelt. Je
höher die Absorptionswerte einer Probe ausfallen, desto mehr HA-markierter Rezeptor
befindet sich in der Zellmembran.
3.4.4 Sandwich-ELISA
Werden für einen Rezeptor nur niedrige Absorptionswerte im Oberflächen-ELISA
festgestellt, so kann dies verschiedene Ursachen haben. Es ist z.B. denkbar, dass der
34
intrazelluläre Transport eines Rezeptors gestört ist und der Rezeptor in einem
Zellkompartiment retiniert wird oder aber auch, dass dies in einer unzureichenden
Produktionsmenge des Rezeptors per se begründet liegt. Der Sandwich-ELISA weist nun die
basale Produktionsrate eines Rezeptors nach, unabhängig davon, in welchem Zellbestandteil
konkret der Rezeptor lokalisiert ist.
Hierfür werden die Zellen 24 Stunden nach der Transfektion mit Versene (0,5 mM EDTA in
PBS) von den Zellkulturplatten abgelöst und in Reaktionsgefäße, gefüllt mit 500 µl PBS,
überführt. Nach Zentrifugation bei 13000 rpm für fünf Minuten wird das Zellpellet lysiert (10
mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 0,2 mM Natriumdesoxycholat, 1 %
NP-40) und über Nacht in einem Überkopfschüttler bei 4 °C konstant rotiert. Weiterhin
werden NUNC MaxiSorp-Platten (Thermo Scientific) mit monoklonalem Anti-FLAG-
Antikörper (M2, Sigma-Aldrich, München, Deutschland, 1:100 in Coating-Puffer (0,15 mM
Natriumtetraborat, pH 8)) beschichtet.
Am darauf folgenden Tag werden die Reaktionsgefäße erneut bei 13000 rpm für 10 Minuten
zentrifugiert und schließlich der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß mit 300 µl PBS-T
übertragen. Das darin enthaltene Triton X-100 als ungeladenes neutrales Detergens
permeabilisiert die Zellmembran, denaturiert Proteine dagegen nur schwach. Auf die
abgesaugte und mit PBS-T gewaschene MaxiSorp-Platte wird eine Blockierungslösung
bestehend aus 10 %igem FBS in DMEM gegeben und diese für eine Stunde bei 37 °C im
Schüttelschrank inkubiert. Nach weiteren drei Waschschritten mit PBS-T werden nun die
Zelllysatproben jeweils in Dreifachbestimmung in Wells der Mitrotiterplatte pipettiert.
Während der nun erfolgenden Inkubation interagiert der an die MaxiSorp-Platte gebundene
M2-Antikörper mit seinen Fab-Anteilen (antigen-binding fragment) mit dem C-terminalen
FLAG-tag des Rezeptors. Es folgen drei weitere Waschschritte und eine Inkubation mit
Peroxidase-gekoppeltem monoklonalen Anti-HA-Antikörper (3F10, Roche Applied Science,
Mannheim, Deutschland, 1:1000 in PBS-T) für eine Stunde. Auch in diesem Assay sorgt die
Peroxidase für einen orange-gelben Farbumschlag bei Zugabe des Substratpuffers mit OPD.
Absorptionsmesswerte ermittelt man bichromatisch bei 492 und 620 nm (Sunrise, Tecan
Group Ltd, Crailsheim, Deutschland).
35
3.4.5 Westernblot
Cleavage, die Spaltung des N-terminalen vom C-terminalen Fragment, ist als bedeutsames
Charakteristikum der aGPCR-Familie beschrieben und wird nach wie vor kontrovers
diskutiert. Um für die untersuchten Rezeptoren eine Aussage über diese autoproteolytische
Spaltung treffen zu können, wurden Zelllysate angefertigt und mittels HA-tag versucht, N-
terminale Rezeptorteilbereiche im Westernblot zu detektieren.
Zwei Tage nach der Transfektion werden dazu COS-7-Zellen mit 4 °C kaltem PBS
gewaschen und 200 µl RIPA-Puffer (150 mM Natriumchlorid, 1 % Triton X-100, 0,5 %
Natriumdeoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulphat, 50 mM Tris, pH 8,0 inklusive
Proteaseinhibitoren (cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche)) in die
Zellkulturflasche zugefügt. Mithilfe eines Zellschabers (Greiner Bio One) können die Zellen
abgelöst und in ein vorgekühltes Reaktionsgefäß überführt werden. Nach 30-minütiger
Rotation bei 4 °C wird die Zellsuspension bei 13000 rpm zentrifugiert und der Überstand in
ein neues Reaktionsgefäß aufgenommen. Äquimolare Probenmengen werden durch eine
10 %ige Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) dem Molekulargewicht gemäß
aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran (GE Healthcare Amersham
Hybond ECL, München, Deutschland) mittels Westernblot übertragen (BioRad Mini-Protean
II Cell, BioRad Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell). Als Referenz wird ein
Proteingrößenmarker mitgeführt (Thermo Scientific PageRuler Unstained Protein Ladder).
Anschließend erfolgt eine Inkubation für eine Stunde bei 20 °C in 5 % Magermilch-PBS
inklusive 0,05 % Tween 20, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Über Nacht bei 4 °C
reiht sich eine weitere Inkubation mit monoklonalem Ratten-Anti-HA-Peroxidase
gekoppelten Antikörper (Roche 3F10, 1:1000 in PBS-0,05 % Tween 20) an. Die Membran
wird nachfolgend mehrfach mit PBS-0,05 % Tween 20 gewaschen, um sie mit SuperSignal
West Pico Chemilumineszenz-Substrat (Thermo Scientific) zu inkubieren. Identische
zelluläre Expressionslevel bestätigt man durch Färbung mit monoklonalem Kaninchen-Anti-
ß-Aktin-Antikörper (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland).
3.4.6 Immunfluoreszenz
COS-7-Zellen werden auf Coverslips (Thermo Scientific, Cover Glasses, Ø 12mm) ausgesetzt
und am zweiten Tag nach Transfektion mit PBS gewaschen, um anschließend bei
36
Raumtemperatur mit 4 % Formaldehyd in PBS für 30 Minuten fixiert zu werden.
Anschließend werden die Zellen mehrfach für fünf Minuten mit PBS und Zusatz von 0,05 %
Triton X-100 gewaschen und permeabilisiert. Es folgt eine einstündige Blockierung mit 10 %
FBS-haltigem DMEM bei 37 °C. Nach drei Waschschritten für jeweils fünf Minuten mit
PBS-0,05 % Triton X-100 (PBS-T) schließt sich die Inkubation mit primärem monoklonalen
Maus-Anti-FLAG-M2-Antikörper (1:100 in Blockierungsmedium, Sigma-Aldrich F9291) für
eine Stunde bei Raumtemperatur an. Die mehrfach gewaschenen Zellen werden dann mit
sekundärem TRITC markierten Maus-Anti-IgG-Antikörper (1:1000 in Blockierungsmedium,
Sigma T2402) für eine weitere Stunde bei 20 °C inkubiert. Erneutem Waschen der Coverslips
reiht sich eine Zellkernfärbung mit DAPI (1:1000 in PBS) an. Schließlich können die
Glaszellträger mithilfe von Fluoromount (Sigma Aldrich F4680) mit Deckgläschen versehen
und lichtgeschützt getrocknet werden. Diese Methode ermöglicht, die genaue Lokalisation
eines Rezeptors in Zellorganellen mit einem konfokalen Mikroskop (LSM 510, Zeiss,
Germany) festzustellen und kann eingesetzt werden, wenn Oberflächen- und Sandwich-
ELISA Hinweise auf eine inkorrekte Rezeptorprozessierung geben.
3.5 Peptidsynthese
Die getesteten Peptide wurden durch die Core Unit Peptid-Technologien (Interdisziplinäres
Zentrum für Klinische Forschung (IZKF), Universität Leipzig) mit dem automatischen
Peptidgenerator MultiPep (Intavis AG, Köln, Deutschland) nach dem zugrunde liegenden
Prinzip der Festphasen-Peptidsynthese (Merrifield RB) und unter Verwendung von
Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppen (Fmoc) hergestellt. Die Fmoc-Gruppen werden
von der finalen Seitenkette mittels eines Gemisches aus Trifluoressigsäure, H2O und
Benzylmercaptan (95:2,5:2,5 Vol %) entfernt (Entschützung) und die Peptide von einem
soliden Träger abgespalten. Die Peptide werden auf >95 % Reinheit durch eine
Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie RP-HPLC (Shimadzu LC-8,
Duisburg, Deutschland) mittels einer PLRP-S Säule (300x25mm, Agilent, Waldbronn,
Deutschland) purifiziert. Sowohl für den analytischen als auch präparativen Gebrauch werden
als mobile Phase H2O und Acetonitril inklusive 0,1 % Trifluoressigsäure eingesetzt. Durch
einen linearen Gradienten von 5 % bis zu 90 % Acetonitril können die Proben in 30 Minuten
(eines analytischen Zyklus) beziehungsweise in 90 Minuten (eines präparativen Zyklus)
eluiert werden. Abschließend werden alle Peptide durch eine analytische HPLC (Agilent
37
1100) und Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Massenspektrometrie MALDI-MS
(Bruker Microflex LT, Bremen, Deutschland) charakterisiert.
3.6 Statistische Auswertung
Funktionelle Daten sind als arithmetisches Mittel mit jeweiligem Standardfehler angegeben
und wurden in drei unabhängigen Experimenten jeweils in Triplikaten erhoben. Analyse und
graphische Darstellung erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism 5 (GraphPad Software,
Inc., La Jolla, USA). Dazu wurde eine einseitige ANOVA (Analysis of Variance) in
Kombination mit einer Bonferroni-Korrektur als post-hoc Test eingesetzt (*p<0,05, **p<0,01,
***p<0,001).
Speziell für die Wildtypen-Charakterisierung wurden Effekte steigender Rezeptor-
konzentrationen mittels eines einfachen linearen Regressionsmodels hinsichtlich Signifikanz
untersucht (R, Version 3.0.1). Der daraus resultierende p-Wert (probability,
Wahrscheinlichkeit) wird als signifikant (*p<0,05), sehr signifikant (**p<0,01) und hoch
signifikant (***p<0,001) eingeordnet. Rezeptoren, welche keine Signifikanz in der linearen
Regression aufwiesen, wurden in einem zweiten Schritt in einem Einstichproben-t-Test der
niedrigsten getesteten Konzentration überprüft (cAMP-Assay 100 ng/Well, PI-Assay 500
ng/Well). So konnte sichergestellt werden, dass auch Rezeptoren mit
konzentrationsunabhängigem Signalplateau als signifikant detektiert werden (°P<0,05,
°°P<0,01, °°°P<0,001).
38
4 Ergebnisse
4.1 Aktivierung der aGPCR durch Deletion der ECD
Es ist bereits bekannt, dass einige aGPCR-Vertreter wie der GPR56, BAI1 und BAI2 durch
die Abspaltung des N-Terminus an der cleavage site der GPS in ihrer Rezeptorfunktion
aktiviert werden (Okajima et al., 2010; Paavola et al., 2011; Stephenson et al., 2013). Um die
Frage nach einer generellen Übertragbarkeit dieser Erkenntnis nachzugehen, wurden auch für
den GPR126 und GPR133 die extrazellulären Domänen (ECD) an ihrer natürlich
vorkommenden GPS-Spaltstelle trunkiert und im cAMP-Assay untersucht. Da für beide
Wildtyp-Rezeptoren bereits eine Gαs-Kopplung mit einer konzentrationsabhängigen cAMP-
Akkumulation demonstriert werden konnte (Bohnekamp and Schöneberg, 2011; Mogha et al.,
2013), deuten nun Veränderungen des cAMP-Levels im Vergleich zum WT auf eine
modifizierte Signaltransduktion durch die spezifische Mutation hin. Die beiden Konstrukte
CTF(GPR126) und CTF(GPR133) beinhalten neben dem jeweiligen Signalpeptid nur den C-
terminalen Bereich der GPS, 7TM und den C-Terminus des Rezeptors (Abb. 4A). Wie
erwartet wiesen die CTF-Mutanten signifikant gesteigerte cAMP-Signalwerte in Bezug zum
jeweiligen WT-Rezeptor auf und waren somit konform mit Vorergebnissen anderer
Arbeitsgruppen. Überraschend war jedoch, dass CTF(GPR126) und CTF(GPR133) im ELISA
nur in geringem Maße an der Zellmembranoberfläche detektiert werden konnten (Abb. 4F).
Um jedoch eine entsprechende Detektion der Oberflächenexpression zu gewährleisten, wurde
der N-Terminus des P2Y12 den CTF-Konstrukten vorangestellt (Abb. 4B). Der P2Y12 gehört
zu den purinergen GPCR und ist als Chemorezeptor für Adenosindiphosphat (ADP) bekannt
(Hollopeter et al., 2001). Durch diese Substitution - als P2Y12-CTF(GPR126) und P2Y12-
CTF(GPR133) bezeichnet - gelang es, bei erhaltener Oberflächenexpression des Rezeptors bis
zu sechsfach gesteigerte cAMP-Level im Vergleich zum WT zu messen.
39
CTF P2Y12-CTF ΔGPS-CTF P2Y12-ΔGPS-CTF
Abb. 4 Einfluss des CTF auf die Basalaktivität des GPR126 und GPR133
A) Im CTF-Konstrukt ist der N-Terminus bis auf den C-terminalen Bereich der GPS deletiert. B) Im P2Y12-
CTF–Konstrukt ist der N-Terminus des P2Y12 an das Spaltungsmotiv der GPS angefügt. C) Deletion des
aGPCR-N-Terminus inklusive GPS-Domäne. D) Der N-Terminus des P2Y12 ist dem ΔGPS-CTF-Konstrukt
vorangestellt. Roter Halbkreis: C-terminaler Teil der GPS nach der cleavage site, Gelbes Dreieck: Signalpeptid,
Gelbe Quadrate: N-terminales HA-tag und C-terminales FLAG-tag, Hellgraue Linie: N-Terminus des P2Y12
E) COS-7-Zellen wurden mit jeweils 500 ng/Well Plasmid-DNA transfiziert und bezüglich cAMP-
Akkumulation getestet. Ergebnisse im cAMP-Assay sind in % des jeweiligen Wildtyp-Rezeptors angegeben,
wobei der leere pcDps-Vektor als Negativkontrolle mit cAMP-Spiegel von 3,68 ± 2,54 nM/Well diente. F) COS-
7-Zellen wurden mit jeweils 300 ng/Well Plasmid-DNA transfiziert und anschließend im ELISA getestet. Im
Oberflächen-ELISA ist die spezifische optische Dichte (OD) zur Referenz des P2Y12 in % dargestellt.
Angegeben sind das arithmetische Mittel ± Standardfehler SEM für drei unabhängige Assays in Triplikaten
(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).
wt
CT
F
P2Y
12 -
CT
F
G
PS
-CT
F
P2Y
12 -G
PS
-CT
F wt
CT
F
P2Y
12 -C
TF
G
PS
-CT
F
P2Y
12 -G
PS
-CT
F
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
*
***
***
G P R 1 26 G P R 1 33
cA
MP
ac
cu
mu
lati
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[% o
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***
wt
CT
F
P2Y
12 -
CT
F
G
PS
-CT
F
P2Y
12 -
GP
S-C
TF w
t
CT
F
P2Y
12 -
CT
F
G
PS
-CT
F
P2Y
12 -
GP
S-C
TF
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
G P R 1 26 G P R 1 33
Ce
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ac
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pre
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[%
of
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D C B A
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P A
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[% d
es W
T]
Ober
fläc
hen
expre
ssio
n
[% d
er P
K]
E F
40
4.2 Identifizierung potentiell agonistischer Strukturen im N-Terminus
Interessanterweise reduzierte sich die Signaltransduktion im cAMP-Spiegel erheblich, wenn
nicht nur der N-terminale Bereich der GPS, sondern die gesamte Domäne deletiert wurde. Im
Vergleich zum jeweiligen WT erzeugten ΔGPS-CTF–Konstrukte nur 39 % (GPR126)
beziehungsweise 5 % (GPR133) der Signalintensität im cAMP-Assay (Abb. 4E). Während
also durch Deletion des N-Terminus bis zur cleavage site der GPS die Rezeptorfunktion
signifikant gesteigert werden konnte, reduzierte sich das cAMP-Signal durch Deletion der
nachfolgenden Aminosäuren der GPS nach der Spaltungsstelle. Auch chimäre Konstrukte mit
dem P2Y12-N-Terminus (vgl. P2Y12-ΔGPS-CTF in Abb. 4D) konnten trotz nachgewiesener
Oberflächenexpression die cAMP-Akkumulation in diesem Fall nicht retten.
Die Ergebnisse der Konstrukte ΔGPS-CTF(GPR126) und ΔGPS-CTF(GPR133) deuteten
dabei auf eine entscheidende Rolle der C-terminalen GPS bei der Signaltransduktion hin. An
dieser Stelle konnte bereits ein wichtiger Hinweis zur Beantwortung der Frage des aGPCR-
Aktivierungsmechanismus abgeleitet werden. Würde der N-Terminus des GPR126 und
GPR133 tatsächlich einen inversen gebundenen Agonist enthalten, so hätten auch für die
ΔGPS-CTF-Varianten signifikant erhöhte cAMP-Konzentrationen im Vergleich zum Wildtyp
detektiert werden müssen. Die Ergebnisse der beiden aGPCR sprachen demnach vermehrt für
das Postulat eines gebundenen Agonisten im N-Terminus, der sich im C-terminalen Bereich
der GPS vermuten ließ.
Um den mutmaßlichen Agonist näher lokalisieren zu können, wurde mithilfe ortsgerichteter
Mutagenesestudien nachfolgend jede Aminosäure beginnend an der cleavage-Stelle der GPS
deletiert (Abb. 5). Auch für diese Untersuchung war es zur Sicherung der
Oberflächenexpression notwendig, chimäre Konstrukte mit dem P2Y12-N-Terminus zu
verwenden. Abbildung 6 zeigt, dass für den GPR126 nur die erste Aminosäure (+1, Thr813) C-
terminal der Spaltungsstelle nicht notwendig für die Rezeptoraktivierung zu sein scheint. Es
muss jedoch beachtet werden, dass durch Deletion des Thr813 die letzte C-terminale
Aminosäure des P2Y12-N-Terminus an Position +1 der cleavage site rückte. Demnach
entsprach diese Mutation eher einer Substitution zu einem Glutamin. Alle sich anschließenden
Aminosäuren ab +2 zogen durch ihre Deletion radikal verminderte Signaltransduktionslevel
nach sich. Es konnte damit vermutet werden, dass mindestens die Sequenz ab Position +2
His814 essentiell für die Basalaktivität des GPR126 ist.
41
Abb. 6 Sequentielle Aminosäure-Deletion in der GPS des GPR126
Zur Darstellung kommen auf der linken Seite die Ergebnisse der cAMP-Akkumulationsmessung (Transfektion
mit 500 ng/Well). Es ist ersichtlich, dass die Deletion des Thr813 mit einer zusätzlichen Signalsteigerung
verbunden ist, während alle sich anschließenden Aminosäuredeletionen die Rezeptorbasalaktivität auslöschen
(jeweils angegeben als % des WT GPR126). Auf der rechten Seite sind die Ergebnisse im Oberflächen- und
Sandwich-ELISA als OD zur Referenz des P2Y12 aufgezeigt. Angegeben sind das arithmetische Mittel ±
Standardfehler SEM für drei unabhängige Assays in Triplikaten(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).
Um einen Effekt der Verkürzung der Aminosäuresequenz per se auszuschließen, wurden die
hoch konservierten Aminosäuren der GPS systematisch durch Alanin ersetzt (sogenannter
Alaninscan). Da ein Austausch einer funktionell oder strukturell essentiellen Aminosäure
gegen Alanin meist einen Verlust der Proteinfunktion zur Folge hat, können mit dieser
wt
P2Y
12 -C
TF
P2Y
12 -C
TF
-T
P2Y
12 -C
TF -TH
P2Y
12 -C
TF -TH
F
P2Y
12 -C
TF -TH
FG
P2Y
12 -C
TF -TH
FG
V
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
cA
MP
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t]
***
***
wt
P2Y
12 -C
TF
P2Y
12 -C
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P2Y
12 -C
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P2Y
12 -C
TF -TH
F
P2Y
12 -C
TF -TH
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P2Y
12 -C
TF -TH
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0
5 0
1 0 0
1 5 0
Ex
pre
ss
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[%
of
pC
]
c e ll s u r fa c e E L IS A
w h o le c e ll E L IS A
Abb. 5 Schematische Darstellung der Aminosäuresequenz
in der GPS des GPR126 und GPR133
Roter Halbkreis: C-terminaler Teil der GPS nach der
cleavage site
Gelbes Dreieck: Signalpeptid
Gelbe Quadrate: N-terminales HA-tag und C-terminales
FLAG-tag
cAM
P A
kkum
ula
tion
[% d
es W
T]
Oberflächen-ELISA
Sandwich-ELISA
Expre
ssio
n
[% d
es W
T]
42
Methode die für die Rezeptorfunktion notwendigen Aminosäuren identifiziert werden
(Morrison and Weiss, 2001). Ersetzte man Position +1, Thr813 des GPR126 durch Alanin, als
P2Y12-CTF T813A bezeichnet, erhielt man eine gesteigerte Basalaktivität, während die
Position +3, +6 oder +7 die Signalaktivität des Rezeptors auslöschten (Abb. 7). Eine
Aminosäuresubstitution an Position +10 dagegen besaß für beide untersuchten aGPCR keinen
Einfluss auf die Signaltransduktion. Alle untersuchten Rezeptormutanten wurden dank P2Y12-
N-Terminus an die Zellmembran transportiert, meist in geringerem Maße als der jeweilige
WT. Die erhöhten Basalaktivitäten einzelner Mutationen waren daher nicht auf eine
gesteigerte Zellmembranexpression zurückzuführen. Dies verdeutlicht, dass es sich hier
tatsächlich um konstitutiv aktive Rezeptorvarianten handelte.
Abb. 7 Alaninscan innerhalb der GPS des GPR126 und GPR133 durch ortsgerichtete Mutagenese
Dargestellt sind sowohl das cAMP second messenger-Signal im Vergleich zum WT als auch die
Oberflächenexpression als OD im Vergleich zur P2Y12-Expression in COS-7. Angegeben sind das arithmetische
Mittel ± Standardfehler SEM für drei unabhängige Assays in Triplikaten (*p<0,05, **p<0.01, ***p<0,001).
4.3 Aktivierung des GPR126 und GPR133 durch ein gebundenes Peptid
Um die vermutete agonistische Struktur innerhalb der GPS von aGPCR nachzuweisen,
wurden synthetisierte Peptide analog der Aminosäuresequenz des GPR126 und GPR133 auf
ihren Effekt für die P2Y12-ΔGPS-CTF-Konstrukte getestet. P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) und
P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR133) besaßen jeweils bis auf eine kleine Spacer-Region zwischen
GPS und TM1 keine endogenen Sequenzabschnitte der ECD (Abb. 4D), wurden jedoch an
der Zellmembran exprimiert.
wt
P2Y
12 -C
TF
P2Y
12 -C
TF -T813 A
P2Y
12 -C
TF -H
814 A
P2Y
12 -C
TF -F815 A
P2Y
12 -C
TF -L818 A
P2Y
12 -C
TF -M
819 A
P2Y
12 -C
TF -P822 A
w
t
P2Y
12 -C
TF
P2Y
12 -C
TF -T545 A
P2Y
12 -C
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546 A
P2Y
12 -C
TF -F547 A
P2Y
12 -C
TF -L550 A
P2Y
12 -C
TF -M
551 A
P2Y
12 -C
TF -V554 A
0
5 0
1 0 0
1 5 0
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G P R 1 2 6 G P R 1 3 3
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P A
kkum
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[% d
es W
T]
Ober
fläc
hen
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ssio
n
[% d
er P
K]
43
Für den GPR126 wurden Peptide einer Länge von vier bis 19 Aminosäuren im cAMP-Assay
getestet. Die mit p4 bis p19 bezeichneten Peptide entsprachen der jeweils um eine
Aminosäure verlängerten Sequenz der GPS nach der cleavage site, beginnend mit THFG (p4).
Dazu wurden die mit jeweils 100 ng Plasmid-DNA transient transfizierten COS-7-Zellen für
60 Minuten mit 1 mM IBMX-DMEM inkubiert, welches zusätzlich 1 mM des entsprechenden
Peptids beinhaltete. Neben dem P2Y12-ΔGPS-CTF-Konstrukt wurde auch der leere
Säugetierexpressionsvektor pcDps mitgeführt, um unspezifische Nebeneffekte der Peptide auf
die Zellen detektieren zu können (Abb. 8). Alle Peptide wurden zuvor in 50 mM Tris, pH 8
und DMSO mit einer Endkonzentration von 1 % gelöst. Darin begründete sich folglich ein
äquivalenter Einsatz von Tris/DMSO zur IBMX-DMEM-Stimulationslösung für Kontrollen
dieses Experiments. Die stärkste Aktivierung konnte dabei mit dem Peptid p16 mit einer bis
zu 10,2-fachen cAMP-Steigerung im Vergleich zur Negativkontrolle pcDps erreicht werden.
Konzentrationsabhängige Testungen mit 10 µM bis 1000 µM des p16 zeigten auf, dass erst
mit relativ hohen Peptidkonzentrationen (EC50>100 µM) signifikante second messenger-
Steigerungen erreicht werden. p16 war dabei in der Lage, nicht nur das chimäre Konstrukt
P2Y12-ΔGPS-CTF (GPR126) sondern auch den Wildtyp-Rezeptor GPR126 zu aktivieren
(Abb. 9).
Abb. 8 cAMP-Akkumulation durch Stimulation des GPR126 mit agonistischen Peptiden
COS-7 wurden mit 100 ng pcDps bzw. P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) transfiziert und mit 1 mM des jeweiligen
Peptids für 60 Minuten stimuliert. In der Grafik sind x-fache der cAMP-Akkumulation zur Negativkontrolle
angegeben. p16 zeigte hierbei die höchste stimulierende Potenz aller untersuchten Peptide. Dargestellt sind die
Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten mit Triplikaten als arithmetisches Mittel ± Standardfehler
(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).
0 4 812
16
p 1 6 - 1 : F T H F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _
p 1 6 - 2 : H F T H F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _
p 1 6 - 3 : N H F T H F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _
p 1 6 - 4 : C N H F T H F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _
p 1 6 + 2 : F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _
p 1 6 + 1 : H F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _
p 4 : T H F G _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
p 5 : T H F G V _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
p 6 : T H F G V L _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
p 7 : T H F G V L M _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
p 8 : T H F G V L M D _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
p 9 : T H F G V L M D L _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
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p 1 3 : T H F G V L M D L P R S A _ _ _ _ _ _
p 1 4 : T H F G V L M D L P R S A S _ _ _ _ _
p 1 5 : T H F G V L M D L P R S A S Q _ _ _ _
p 1 6 : T H F G V L M D L P R S A S Q L _ _ _
p 1 7 : T H F G V L M D L P R S A S Q L D _ _
p 1 8 : T H F G V L M D L P R S A S Q L D A _
p 1 9 : T H F G V L M D L P R S A S Q L D A R
n o p e p t i d e
P 2 Y 1 2 -G P S -C T F
p c D p s
c A M P a c c u m u la tio n
[x - fo ld o v e r p c D p s ]
cAMP Akkumulation
[x-faches der NK]
kein Peptid
44
Weitere Variationen des p16-Peptids durch N-terminale Verkürzung (p16+1/p16+2) oder
durch Verlängerung (p16-1 bis p16-4) konnten keine zusätzlichen Signalsteigerungen erzielen
(Abb. 8). Stattdessen zeigte sich, dass die erste Aminosäure Thr813 des p16 essentiell für die
Signalaktivierung zu sein scheint, da sich durch Stimulation mit p16+1 die cAMP-
Akkumulation signifikant verhindern ließ. Im Gegensatz zum P2Y12-CTF T813A Konstrukt
stellte dieses Experiment eine tatsächliche Deletion der Thr813 dar und verdeutlichte den
enormen Einfluss des Threonins für die aktivierende Potenz des p16.
Vergleichsweise niedrige cAMP-Werte des p16-1 bis p16-4 unterstrichen, dass Aminosäuren
vor der cleavage site keinen Bestandteil des Agonisten darstellen.
Ein Alaninscan, bei dem alle spezifischen Aminosäuren des p16 systematisch durch Alanin
ersetzt wurden, untermauerte zusätzlich die durch Mutagenese generierten Vorergebnisse:
Während Substitutionen an Position +2 bis +7 das cAMP-Signal auslöschten, konnten die
Positionen +8 bis +16 ohne Signalbeeinträchtigung mit Alanin ersetzt werden (Abb. 10). Dass
die C-terminalen Aminosäuren trotzdem eine Beteiligung zur Funktion des p16 aufweisen,
zeigte sich darin, dass deren Deletion mit signifikantem Aktivitätsverlust des Peptids
einherging (vgl. Peptid p7 in Abb. 8). Auffällig war, dass alle getesteten GPR126-Peptide
auch in mit pcDps transfizierten COS-7-Zellen leichte cAMP-Akkumulationen auslösten.
Dies ließ sich durch eine endogene Expression des GPR126 in dieser Zelllinie erklären
(Abb. 11).
p16 Peptid, log [M]
cAM
P A
kku
mu
lati
on
[x-f
ach
es d
er N
K]
Abb. 9 Konzentrationsabhängige cAMP-
Akkumulation durch Stimulation mit p16
100 ng der Plasmid-DNA/Well wurden transfiziert und
mit 10 µM, 100 µM und 1 mM des p16 stimuliert.
Dargestellt sind die Ergebnisse als x-faches der
Negativkontrolle pcDps für den WT GPR126, für
P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) und P2Y12. Ergebnisse
sind als arithmetisches Mittel ± Standardfehler SEM
für drei unabhängige Assays in Triplikaten angegeben.
45
Abb. 10 Alaninscan des p16 Peptids des GPR126
Darstellung des cAMP-Signals nach Stimulation mit 1 mM des angegebenen Peptids als x-faches der
Negativkontrolle pcDps. Ergebnisse sind als arithmetisches Mittel ± Standardfehler SEM für drei unabhängige
Assays in Triplikaten analysiert.
Um eine Aussage zur Allgemeingültigkeit dieser Ergebnisse treffen zu können, wurden
identische Experimente für den aGPCR GPR133 unternommen. Die höchsten
Stimulationsergebnisse erbrachten in diesem Fall 1 mM des p13 mit einer 5,2-fachen cAMP-
Steigerung mit Vergleich zur Negativkontrolle (Abb. 12). Im Gegensatz zum p16 des
GPR126 verursachte bereits eine Konzentration von 100 µM des p13 eine leichte cAMP-
Steigerung (Abb. 13), weshalb geschlussfolgert werden konnte, dass EC50(p13)<EC50(p16).
0 2 0 4 0 6 0
T H F G V L M D L P R S A S Q A
T H F G V L M D L P R S A S A L
T H F G V L M D L P R S A A Q L
T H F G V L M D L P R A A S Q L
T H F G V L M D L P A S A S Q L
T H F G V L M D L A R S A S Q L
T H F G V L M D A P R S A S Q L
T H F G V L M A L P R S A S Q L
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P 2 Y 12 - G P S -C T F
c A M P a c c u m u la tio n
[x - fo ld o v e r p c D p s ]
kein Peptid
cAMP Akkumulation
[x-faches der NK]
Abb. 11 Endogene Expression des GPR126 in COS-7-
Zellen
Durch die Verwendung von Primern (Tab.S2), die an
konservierte Bereiche des GPR126 binden, konnten
Transkripte des GPR126 in cDNA von COS-7-Zellen
nachgewiesen werden. Die Detektion des housekeeping-Gens
ß-Aktin in der cDNA durch entsprechende Primer bzw. ohne
cDNA im selben PCR-Setup gelten als Positiv- und
Negativkontrollen.
46
Abb. 12 cAMP-Akkumulation durch Stimulation des GPR133 mit agonistischen Peptiden
COS-7-Zellen wurden mit 100 ng pcDps bzw. P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR133) transfiziert und mit 1 mM des
jeweiligen Peptids für 60 Minuten stimuliert. In der Grafik sind x-fache der cAMP-Akkumulation zur
Negativkontrolle pcDps angegeben. p13 zeigte hierbei die höchste stimulierende Potenz aller untersuchten
Peptide. Dargestellt sind die Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten mit Triplikaten als arithmetisches
Mittel ± Standardfehler.
Zur Überprüfung der Spezifität der eingesetzten Peptide wurden der Wildtyp GPR126 und das
Konstrukt P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) auch mit dem GPR133-Peptid p13 stimuliert, der WT
GPR133 und das Konstrukt P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR133) umgekehrt mit dem GPR126-Peptid
p16. Zusätzlich wurden die Peptide auf dem purinergen Rezeptor P2Y12 getestet (Abb. 14A).
Es konnte festgestellt werden, dass p16 spezifisch auf den GPR126 wirkt, p13 dagegen
spezifisch auf den GPR133. Zu erwähnen ist, dass es durch die Stimulation mit p16 zu
0 2 4 6 8
p4:TNFA_______________
p5:TNFAI______________
p6:TNFAIL_____________
p7:TNFAILM____________
p8:TNFAILMQ___________
p9:TNFAILMQV__________
p10:TNFAILMQVV_________
p11:TNFAILMQVVP________
p12:TNFAILMQVVPL_______
p13:TNFAILMQVVPLE______
p14:TNFAILMQVVPLEL_____
p15:TNFAILMQVVPLELA____
p16:TNFAILMQVVPLELAR___
p17:TNFAILMQVVPLELARG__
p18:TNFAILMQVVPLELARGH_
p19:TNFAILMQVVPLELARGHQ
no peptide
P2Y12-GPS-CTF
pcDps
cAMP accumulation[x-fold over pcDps]
cAMP Akkumulation
[x-faches der NK]
p13 Peptid, log [M]
cAM
P A
kku
mu
lati
on
[x-f
aches
der
NK
] kein Peptid
Abb. 13 Konzentrationsabhängige cAMP-
Akkumulation durch Stimulation mit p13
100 ng der Plasmid-DNA/Well wurden transfiziert und
mit 10 µM, 100 µM und 1 mM des p13 stimuliert.
Dargestellt sind die Ergebnisse als x-faches der
Negativkontrolle pcDps für den WT GPR133, für
P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) und P2Y12. Ergebnisse
sind als arithmetisches Mittel ± Standardfehler SEM
für drei unabhängige Assays in Triplikaten angegeben.
47
leichten cAMP-Akkumulationen auf mit GPR133 und P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR133)
transzifierten COS-7-Zellen gekommen ist. Dies war durch die endogene Expression des
GPR126 in COS-7-Zellen zu erklären (Abb. 11). Experimente mit HEK 293-T-Zellen, welche
den GPR126 nicht exprimieren, bestätigten diese Vermutung (Abb. 14B). Durch dieses
Experiment wurde deutlich, dass p16 spezifisch auf den WT GPR126 und dessen
Rezeptormutante P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) wirkt. Der GPR133 wurde durch p16 nicht
aktiviert.
pcD
ps
P2Y
12
P2Y
12-
GP
S-C
TF
wt
P2Y
12-
GP
S-C
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0
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4 0
- p 1 6 p e p t id e
+ p 1 6 p e p tid e
cA
MP
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[x-fo
ld o
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cD
ps
]
G P R 1 2 6
G P R 1 3 3
Abb. 14 Spezifitätsprüfung der Peptide p16 und p13
A) COS-7-Zellen wurden mit 100 ng/Well pcDps, P2Y12, GPR126, GPR133, P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR126) bzw.
P2Y12-ΔGPS-CTF(GPR133) transfiziert. Am dritten Tag nach der Transfektion wurde jeweils mit 1 mM p16,
1 mM p13 und ohne Peptid in IBXM-DMEM stimuliert. Ergebnisse sind als arithmetisches Mittel ±
Standardfehler SEM für drei unabhängige Assays in Triplikaten angegeben. B) HEK293-T-Zellen wurden mit
100 ng Plasmid-DNA pro Well transfiziert und mit/ohne 1 mM p16 Peptid für eine Stunde in IBMX-DMEM
inkubiert. Angegeben sind die cAMP-Akkumulationswerte als arithmetisches Mittel ± Standardfehler SEM aus
drei unabhängigen Assays jeweils in Triplikaten.
4.4 G-Protein-Kopplung als allgemeines Prinzip der aGPCR
Zur Beantwortung der Frage, ob die namensgebenden G-Proteine tatsächlich an alle Vertreter
der aGPCR binden, wurden in dieser Arbeit 11 murine Rezeptoren kloniert und mit Hilfe
etablierter second messenger-Akkumulationsassays funktionell getestet. Die jeweiligen
Accession numbers und die eingesetzten Primer zur Klonierung finden sich in der Tabelle S1
im Anhang. Alle Konstrukte sind mit einem N-terminalen HA- und einem C-terminalem
pcD
ps
P2Y
12
P2Y
12-
GP
S-C
TF
wt
P2Y
12-
GP
S-C
TF
wt
0
1 0
2 0
3 0
n o p e p t id e
+ p 1 6 p e p tid e
cA
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on
[x-f
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pc
Dp
s]
G P R 1 26
G P R 1 33
+ p 1 3 p e p tid e
cAM
P A
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[x-f
ach
es d
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K]
kein Peptid
+ p16
+ p13
+ p16 Peptid
- p16 Peptid cA
MP
Akkum
ula
tion
[x-f
ach
es d
er N
K]
A B
48
FLAG-tag versehen. Für einige Rezeptoren stellte eine ausreichende Expression an der
Zellmembran ein Problem dar, welchem meist durch die zusätzliche Insertion eines N-
terminalen Rhodopsin-tags entgegnet werden konnte. Für den GPR111 galt dies jedoch nicht.
Auch durch die Rhodopsin-Markierung wurden nur 4,2 % der Oberflächenexpression der
Positivkontrolle P2Y12 erreicht. Der HA-markierte GPR128 dagegen zeigte trotz niedriger
Ergebnisse im Oberflächen-ELISA relativ hohe Signalwerte im cAMP- und PI-Assay. Zum
Nachweis des GPR128 wurden zusätzlich Immunfluoreszenz-Bilder angefertigt (Abb. 15).
Diese verdeutlichten zwar eine Expression des GPR128 in der Zelle, jedoch nicht in der
äußeren Zellmembran, sondern vermutlich eine Retention des Rezeptors im Golgi-Apparat.
Jeder Rezeptor wurde in mindestens drei unabhängigen Assays im cAMP- und im PI-Assay
sowie im Oberflächen- und Sandwich-ELISA getestet. Dazu wurden für den cAMP-Assay
100 bis 600 ng Plasmid-DNA eingesetzt, im PI-Assay 500 bis 1500 ng Plasmid. Um eine Gαi-
Kopplung detektieren zu können, wurden 100 ng des chimären G-Proteins Gαi4 co-transfiziert,
welches eine Umleitung des Gi-Signalwegs auf Gq-Effektorproteine bewirkt.
Als Positivkontrolle im cAMP-Assay fungierte eine mit 10 µM Forskolin stimulierte pcDps-
Leervektor-Transfektion. Im PI-Assay stellte ein mit 10 µM Carbachol aktivierter M3-
Rezeptor als Gq-Koppler und ein mit 10 µM MeS-ADP stimulierter P2Y12 als Gi-Koppler den
Erfolg des Experiments sicher.
Die Zusammenfassung der Charakterisierung der 11 aGPCR findet sich in Tabelle 3. Für den
cAMP-Assay sind jeweils die Ergebnisse einer Transfektion mit 600 ng/Well, für den PI-
Assay einer Transfektion mit 1500 ng Plasmid/Well als Mittelwert und Standardfehler
angegeben. Im Oberflächen-ELISA wurden 300 ng, im Sandwich-ELISA 1000 ng Plasmid
pro Well eingesetzt. Statistische Signifikanz wurde mit einer einfachen linearen Regression
über alle Konzentrationen (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001) überprüft. Für Rezeptoren ohne
signifikantes Ergebnis innerhalb der linearen Regression wurde zusätzlich ein Einstichproben-
t-Test für Werte der 100 ng (cAMP-Assay) bzw. 500 ng (PI-Assay) Plasmid-Transfektion
angeschlossen (°P<0,05, °°P<0,01, °°°P<0,001).
Es war augenscheinlich, dass alle hier untersuchten aGPCR die Gαs-Kopplung gemeinsam
haben. Besonders ist der GPR114 zu erwähnen, welcher bereits in der Basalaktivität ein
cAMP-Signal (27-faches der Negativkontrolle) auf der Höhe der eingesetzten Positivkontrolle
erzeugte. Der GPR114 konnte damit als ein konstitutiv aktiver Rezeptor identifiziert werden.
Eine Ausnahme stellte nur der murine BAI2 dar, für den bisher als HA-markiertes Konstrukt
keine signifikante G-Protein-Kopplung dargestellt werden konnte. Da jedoch auch nur
niedrige Oberflächenexpressionsspiegel (25,1 % der PK) erzielt wurden, ist zu erwarten, dass
49
mithilfe des RHO-tags eindeutige Ergebnisse in der Signaltransduktion erreicht werden.
GPR115, GPR116 und GPR128 vermittelten über die Gαq-Untereinheit. EMR1, GPR64,
GPR115, GPR116 und GPR128 dagegen bewirkten intrazellulär den Gαi- Signalweg. G-
Protein-Kopplung ist somit ein allgemein gültiges Prinzip für die meisten aGPCR.
Abb. 15 Immunfluoreszenz zur Detektion des GPR128
COS-7-Zellen wurden mit dem HA- und FLAG-markierten Konstrukt des murinen GPR128 transfiziert. Zwei
Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit 4 % Formaldehydlösung fixiert, mit DAPI und Anti-FLAG-
M2-Antikörper detektiert und mit Anti-Mouse-markiertem TRITC Antikörper angefärbt. Die Zellkerne sind in
blau und FLAG-markierte GPR128-Konstrukte sind in rot dargestellt. Der GPR128 wird zwar in der Zelle
exprimiert, jedoch im Golgi-Apparat retiniert.
0
Rezeptor N-terminales tag
cAMP-
Akkumualtion
x-faches der NK
IP-Akkumulation x-faches der NK
Oberflächen-ELISA
% der PK
Sandwich-ELISA
% der PK + Gαqi4
Human P2Y12 + MeS ADP HA - 1,3 ± 0,1 8,1 ± 0, 7*** 100 100
Ratte M3R + CCh HA - 20,4 ± 7,9*** - 102,4 ± 8,7 87,5 ± 10,9
Forskolin 32,9 ± 8,5*** - - - -
Maus BAI2 HA 1,21± 0,5 1,04± 0,39 1,14± 0,25 25,1± 10,6 61,1± 13,6
Maus EMR1 HA 2,3 ± 1,2* 1,0 ± 0,5 3,9 ± 1,2*** 45,3 ± 11,1 93,4 ± 7,0
Maus GPR64 Isoform 4 HA 5,5 ± 1,6* 1,0 ± 0,1 1,6 ± 0,4° 63,9 ± 23,7 71,8 ± 14,0
Maus GPR97 HA 2,6 ± 0,8° 1,1 ± 0,5 1,1 ± 0,3 29,4 ± 10,7 91,2 ± 1,2
Maus GPR111
HA 1,9 ± 0,7° 1,1 ± 0,2 2,9 ± 1,9 1,6 ± 0,5 39,0 ± 19,1
HA-RHO 1,1 ± 0,2 0,9±0,02 1,1±0,1 4,2±2,4 72,9±17,6
Maus GPR114 Isoform 1
HA 26,9 ± 7,1** 0,9 ± 0,1 1,3 ± 0,4 1,1 ± 0,8 5,2 ± 1,6
HA-RHO 21,4±6,6* 1,3±0,3 1,3±0,2 64,5±25,9 95,2±9,3
Maus GPR115 HA 2,5 ± 1,0°°° 2,4 ± 1,1* 4,4 ± 1,5°° 75,7 ± 13,0 81,6 ± 3,9
Maus GPR116
HA 4,6 ± 2,4° 1,5 ± 0,4°°° 2,2 ± 0,6* 8,2 ± 2,6 88,5 ± 7,3
HA-RHO 2,4 ± 1,6° 1,7 ± 0,5** 2,2 ± 0,9** 99,1 ± 17,8 89,8 ± 7,2
Maus GPR123
HA 1,5 ± 0,3 1,0 ± 0,0 1,1 ± 0,3 0,9 ± 0,4 31,0 ± 6,3
HA-RHO 2,3 ± 0,9°° 1,2 ± 0,6 1,1 ± 0,3 85,3 ± 19,3 86,5 ± 3,5
Maus GPR124
HA 2,0 ± 0,6 1,1 ± 0,2 1,4 ± 0,2 54,0 ± 8,1 61,4 ± 9,5
HA-RHO 2,4 ± 0,7°° 1,1 ± 0,2 1,0 ± 0,1 71,6 ± 8,9 94,6 ± 4,8
Maus GPR128 HA 12,5 ± 5,4*** 7,0 ± 1,8*** 10,5 ± 3,6** 0,1 ± 0,1 0,0 ± 0,6
Tab. 3 Zusammenfassung der
funktionellen
Charakterisierung von aGPCR
Untersucht wurden 11 aGPCR im
cAMP- und PI-Assay sowie im
Oberflächen- und Sandwich-
ELISA. Als Positivkontrollen sind
die Ergebnisse mit 10 µM
Forskolin (Gs), 10 µM
Carbachol/M3R (Gq), 10 µM
MeS-ADP/P2Y12 (Gi) angegeben.
Dargestellt sind die Ergebnisse
aus drei unabhängigen
Experimenten mit Triplikaten als
arithmetisches Mittel ±
Standardfehler. Für den cAMP-
Assay sind die Ergebnisse für 600
ng/Well, PI-Assay 1500 ng/Well,
Oberflächen-ELISA 300 ng/Well
und Sandwich-ELISA 1000
ng/Well hier eingetragen.
Signifikanz in der linearen
Regression (*p<0,05, **p<0,01,
***p<0,001), Signifikanz im
Einstichproben-t-Test (°P<0,05,
°°P<0,01, °°°P<0,001).
51
4.4.1 Promiskuität der aGPCR in der G-Protein-Kopplung
In der Arbeitsgruppe konnte bereits gezeigt werden, dass GPR126 und GPR133 jeweils
sowohl mit Gs- als auch mit Gi-Proteinen interagiert. Neu war, dass auch EMR1, GPR64,
GPR115, GPR116 und GPR128 an multiple G-Proteinfamilien binden. Drei der getesteten
aGPCR-Vertreter - GPR115, GPR116 und GPR128 - waren sogar in der Lage mit drei (Gs, Gi,
Gq) verschiedenen G-Protein-Familien zu interagieren. In der Abbildung 16 ist die
konzentrationsabhängige G-Protein-Kopplung des GPR116 exemplarisch dargestellt.
PK PK PK0
2
4
6
8
10
15
35
55Gs
Gq Gi
x-fa
ches d
er
NK
Abb. 16 Konzentrationsabhängige Signaltransduktion des GPR116
Der GPR116 wurde konzentrationsabhängig im cAMP-Assay (100-600 ng/Well) und im PI-Assay (500-1500
ng/Well) getestet. Zur Detektion als Gi-Koppler wurden 100 ng des chimären Gqi4-Proteins co-transfiziert.
Als Positivkontrollen (PK) wurden der transfizierte pcDps-Vektor mit 10 µM Forskolin (Gs), M3R mit 10 µM
Carbachol (Gq) und P2Y12 mit 10 µM MeS-ADP (Gi) stimuliert. Dargestellt sind die Ergebnisse aus drei
unabhängigen Experimenten mit Triplikaten als arithmetisches Mittel ± Standardfehler.
4.5 Autoproteolytische Spaltung der aGPCR
Unabhängig von einer potentiellen funktionellen Bedeutung des cleavage für den einzelnen
Rezeptor sollte in dieser Arbeit untersucht werden, welche der zu untersuchenden Rezeptoren
autoproteolytisch gespalten werden. Dazu wurden die mit HA- und FLAG-tag versehenen
Rezeptorkonstrukte in COS-7-Zellen transfiziert, die Zellen lysiert und schließlich mit Hilfe
eines Anti-HA-Antikörpers im Westernblot detektiert. Rezeptoren, welche durch das
52
Rhodopsin-tag eine verbesserte Oberflächenexpression aufwiesen, wurden in dieser Variante
bevorzugt verwendet.
Die komplexe Struktur von GPCR mit ihren sieben membrandurchspannenden Helices
machte eine vollständige Membranlyse kompliziert. Die hier eingesetzte Lyse war jedoch in
der Lage, die nicht-kovalente Bindung nach dem cleavage zwischen NTF und CTF zu
zerstören. Somit konnten HA-markierte NTF im Lysat durch einen Westernblot analysiert
werden. Der Auftrag äquimolarer Proteinmengen wurde durch den Nachweis von ß-Aktin als
Housekeeping-Protein gezeigt. Den Westernblot-Ergebnissen zufolge zeigten EMR1,
GPR116 und GPR133 deutlich autoproteolytische Spaltung.
Detektierte Banden mit einer theoretischen Größe>200 kDa stellten vermutlich unspezifische
Reaktionen gegenüber nicht vollständig lysierten Zellmembranbestandteilen mit den
überexprimierten aGPCR dar. Einige Rezeptoren waren im Westernblot nur als vollständiger
Rezeptor detektiert worden - wie der GPR64, für den eine Länge von 108 kDa ohne
Glykosylierungen vorausgesagt wird. Beim GPR123, dem die Domäne der GPS
einschließlich des Spaltungsmotivs der aGPCR fehlt, wurde eine Bande um 70 kDa detektiert.
Da für den gesamten Rezeptor eine Größe von 64 kDa vorhergesagt wird, konnte
geschlussfolgert werden, dass es sich auch hier um den vollständigen, nichtgespaltenen
Rezeptor handelte. Der humane GPR133 besitzt eine Gesamtlänge von rund 96 kDa. Man
konnte davon ausgehen, dass die beiden Banden im Westernblot den gespaltenen und
ungespaltenen Rezeptor darstellten (Abb.17C). Für den GPR126 wurde bereits 2004 cleavage
beschrieben (Moriguchi et al., 2004). Das hier gezeigte Ergebnis in Abbildung 17C war somit
unerwartet. In einer unabhängigen Wiederholung dieses Experiments konnte für den GPR126
eine Bande auf Höhe von rund 70 kDa detektiert werden (Abb. 17E). Dies stellte jedoch
vermutlich nicht den an der cleavage site, sondern den an der postulierten Furinspaltstelle
abgetrennten NTF des GPR126 dar (Moriguchi et al., 2004). Das an der cleavage site
gespaltene CTF des GPR126 beträgt rund 140 kDa (inklusive 25 putative N-
Glykosylierungsstellen, vgl. Tab.4). Der GPR97 wies eine dünne Bande auf Höhe von 35 kDa
auf (in Abb. 17A mit Pfeil markiert). Im Hinblick auf die vorhergesagte Größe seines N-
Terminus inklusive drei potentieller Glykosylierungsstellen bis zur cleavage site war auch der
GPR97 als spaltbarer aGPCR denkbar. Einige aGPCR (BAI2, GPR111, GPR114, GPR115,
GPR124, GPR128) konnten im Westernblot nicht detektiert werden, obgleich zumindest das
Gesamtprotein durch die HA-Markierung zu erwarten gewesen wäre.
Abweichungen in der Proteingröße waren auf die zusätzlichen Insertionen N-terminaler tags
(HA und RHO) und die zahlreichen für die aGPCR typischen Glykosylierungen (Bjarnadóttir
53
et al., 2004) zurückzuführen. Die Tabelle 4 fasst die erwarteten und erzielten Ergebnisse des
cleavage zusammen.
Abb. 17 Westernblot zur Analyse der Autoproteolyse von aGPCR
60 µg Proteinmenge von COS-7-Zelllysaten nach Transfektion des entsprechenden aGPCR wurden in der SDS-
PAGE aufgetrennt. Der anschließende Westernblot wurde mit Peroxidase-gekoppeltem Anti-HA-Antikörper
(A+C+E) bzw. mit Anti-ß-Aktin-Antikörper (B+D+F) inkubiert. Die Detektion erfolgte mit SuperSignal West
Pico Chemilumineszenzsubstrat (Thermo Scientific). Für den GPR97 verdeutlicht ein Pfeil (A) eine Bande auf
35 kDa.
A
B
C
D
E
F
54
Tab. 4 Übersicht cleavage–Analyse im Westernblot
Das Molekulargewicht der Proteinsequenzen wurde für die NTF der aGPCR errechnet (Protein Molecular
Weight Calculator, 2014), dabei wurde das HA-tag mit 1,1 kDa, das RHO-tag zusätzlich mit 2,2 kDa
einbezogen. Für den GPR123 konnte aufgrund der nicht vorhandenen GPS nur das Gesamtprotein angegeben
werden. Die Anzahl potentieller Glykosylierungen wurden mithilfe des UniProt Consortiums
(http://www.uniprot.org) ermittelt, je Glykosylierung wurden 2 kDa in die errechnete cleavage Größe
einbezogen. Für den GPR111 war es nur möglich, Glykosylierungen der humanen Orthologe zu erheben.
Größe Anzahl
errechnet publiziert im Westernblot Glykosylierungen
Maus Bai2 113 kDa
80 kDa (Okajima et al.,
2010) 8
Maus EMR1 85 kDa 70 kDa 9
Maus GPR64 Iso 4 97 kDa 120 kDa 19
Maus GPR97 32 kDa 35 kDa 3
Maus GPR111 54 kDa
Kein cleavage (Prömel et
al., 2012b) (7)
Maus GPR114 Iso 1 36 kDa 6
Maus GPR115 56 kDa
Kein cleavage (Prömel et
al., 2012b) 7
Maus GPR116 153 kDa (34 kDa SEA)
150 kDa (Abe et al.,
2002) (32 kDa SEA)
(Fukuzawa and Hirose,
2006) 35 kDa SEA 21 (SEA-Site 4)
Maus GPR123 (64 kDa Gesamtprotein) 80 kDa nicht eingetragen
Maus GPR124 104 kDa 12
Human GPR126 140 kDa (69 kDa Furin)
135 kDa (70 kDa Furin)
(Moriguchi et al., 2004) 70 kDa Furin 25 (Furin-Site 10)
Maus GPR128 68 kDa 12
Human GPR133 78 kDa 80 kDa 9
4.6 Konstitutive Aktivierung von aGPCR durch Punktmutationen
Moriguchi et al. beschrieben für den GPR126 vier interessante Mutationen innerhalb der GPS,
welche die Konformation der GPS negativ beeinträchtigt haben sollen. Vier Cysteine, welche
gegen Serine ausgetauscht worden waren, wurden als cleavage-defizient beschrieben
(Moriguchi et al., 2004). Darüber hinaus sollten diese Mutationen mit einer Retention des
Rezeptors in intrazellulären Vesikeln einhergehen, eine Untersuchung der damit verbundenen
Signaltransduktion erfolgte jedoch bisher nicht. Unter den aGPCR-Vertretern sind diese vier
Cysteine (Abb. 18) hoch konserviert und an der Ausbildung von Disulfidbrückenbindungen
beteiligt. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass durch diese Cystein-Substitutionen
das cAMP-Signal im Vergleich zum WT GPR126 erheblich gesteigert werden konnte (Abb.
55
19A). Die Mutante C807S, die den Austausch des dritten Cysteins enthält, versechsfachte
sogar das second messenger-Signal des nativen GPR126. Die Übertragung dieser spezifischen
Mutationen auf den GPR133 verdeutlichte, dass auch für diesen aGPCR die Cysteine in der
GPS aktivitätsentscheidend sind. Es war auffällig, dass die beiden C-terminal positionierten
CysteinSerin-Substitutionen in GPR126 und GPR133 besonders aktiv waren. In eigenen
Westernblot-Untersuchungen konnte die cleavage-Defizienz dieser CysteinSerin
Mutationen für den GPR126 bestätigt werden. In Abbildung 19C ist exemplarisch die
Detektion des GPR126 CSII Konstrukts im Vergleich zum WT GPR126 durch einen Anti-
HA-Antikörper dargestellt.
Trotz vermutlicher Konformationsänderung in der GPS wurden alle mutierten Konstrukte in
zum WT vergleichbarem Maße an die Zellmembran transportiert. Es konnten somit vier
konstitutiv aktive Rezeptormutationen identifiziert werden, die für sowohl den GPR126 als
auch den GPR133 gelten.
Abb. 18 Cystein-zu-Serin-Mutationen in aGPCR
In die allgemeine Struktur eines aGPCR ist die konservierte
Aminosäuresequenz der GPS angegeben. Mit CSI bis CSIV
sind die vier Aminosäuresubstitutionen von Cystein zu Serin
eingezeichnet.
56
wt
C
S I
C
S II
C
S II I
C
S IV w
t
C
S I
C
S II
C
S II I
C
S IV
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
***
***
***
G P R 1 2 6 G P R 1 3 3
cA
MP
ac
cu
mu
lati
on
[%
of w
t]
wt
C
S I
C
S II
C
S II I
C
S IV w
t
C
S I
C
S II
C
S II I
C
S IV
0
5 0
1 0 0
1 5 0
G P R 1 2 6 G P R 1 3 3
c e ll s u r fa c e E L IS A
w h o le c e ll E L IS A
Ex
pre
ss
ion
[%
of
pC
]
Abb. 19 Untersuchung der CS-Mutationen für den GPR126 und GPR133
(A) Ergebnisse der cAMP-Akkumulationen für die CS Mutationen des GPR126 und GPR133 sind jeweils im
Vergleich zum jeweiligen WT angegeben. (B) Die jeweilige Oberflächenexpression und Gesamtzellexpression
sind als % zur Expression des P2Y12-Konstrukts zu sehen. Dargestellt sind die Ergebnisse aus drei unabhängigen
Experimenten mit Triplikaten als arithmetisches Mittel ± Standardfehler, Signifikanz als (*p<0,05, **p<0,01,
***p<0,001) angegeben. (C+D) COS-7-Zellen, transfiziert mit WT GPR126 bzw. GPR126 CSII Konstrukt,
wurden lysiert und im Westernblot mit Peroxidase-gekoppeltem Anti-HA-Antikörper (C) bzw. mit Anti-ß-Aktin-
Antikörper (D) inkubiert. Die Detektion erfolgte mit SuperSignal West Pico Chemilumineszenzsubstrat (Thermo
Scientific).
Oberflächen-ELISA
Sandwich-ELISA
cAM
P A
kku
mu
lati
on
[% d
es W
T]
Exp
ress
ion
[% d
er P
K]
A B
C
D
57
5 Diskussion
5.1 Die agonistische Stachel-Sequenz der aGPCR
Die Klasse der aGPCR ist die zweitgrößte Gruppe unter den GPCR. Trotz vermehrter
Hinweise auf enorme physiologische und pathophysiologische Relevanz dieser
Rezeptorgruppe sind bis heute alle 33 humanen Vertreter der aGPCR als orphan zu
bezeichnen. Die Suche nach dem spezifischen Agonist, der die Rezeptorfunktion zu
aktivieren vermag, ist bei der Charakterisierung eines Rezeptors wohl eine der vermutlich
schwierigsten, aber auch für mögliche therapeutische Zwecke bedeutsamsten Aufgaben. Für
einige Vertreter der aGPCR ist bereits beschrieben worden, dass durch die Abspaltung des N-
Terminus die Basalaktivität des Rezeptors gesteigert werden kann (Okajima et al., 2010;
Paavola et al., 2011; Stephenson et al., 2013). Verbunden mit dieser wiederholten
Beobachtung verschiedener Arbeitsgruppen entstand die Hypothese, dass sich im N-Terminus
von aGPCR ein inverser gebundener Agonist befinden muss. Es ist jedoch auch ein zweiter
Aktivierungsmechanismus denkbar, welcher einen gebundenen Agonist im N-Terminus von
aGPCR vorsieht.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Deletion des N-Terminus an der cleavage
site auch für GRP126 und GPR133 zu einer Steigerung der Basalaktivität führt. Dies ging
jedoch mit einer verminderten Oberflächenexpression der CTF-Konstrukte einher. Um diesem
Problem entgegenzuwirken, wurde anstelle des aGPCR-spezifischen NTF der N-Terminus
des purinergen GPCR P2Y12 eingesetzt. Diese als P2Y12-CTF bezeichneten
Rezeptorkonstrukte erzielten sogar noch höhere cAMP-Akkumulationen bei nachgewiesener
Oberflächenexpression. Um das Vorhandensein eines inversen gebundenen Agonisten im N-
Terminus von aGPCR zu analysieren, wurde basierend auf diesen Vorergebnissen das
gesamte NTF inklusive GPS-Domäne in dem Konstrukt ΔGPS-CTF deletiert. Entsprechend
der Hypothese eines inversen gebundenen Agonisten wäre von dieser Mutation konstitutiv
aktive Signaltransduktion zu erwarten gewesen. Da der gesamte N-Terminus im ΔGPS-CTF-
Konstrukt deletiert wurde, müssten folglich auch alle potentiell invers agonistischen
Sequenzen innerhalb dessen beseitigt worden sein. Entgegen dieser Vermutung wurden
jedoch nur minimale cAMP-Spiegel im Vergleich zum jeweiligen WT gemessen. Auch bei
nachweisbarer Oberflächenexpression durch den P2Y12-N-Terminus wurden konstant
niedrige Basalaktivitäten erzielt. Während diese Ergebnisse die Existenz eines inversen
gebundenen Agonisten unwahrscheinlich machten, schien der GPS-Domäne, insbesondere
58
deren C-terminaler Bereich, eine besondere Rolle in der Rezeptoraktivierung zuzukommen.
Die beiden Mutationen CTF (hoch aktiv) und ΔGPS-CTF (inaktiv) unterschieden sich
lediglich im Vorhandensein einer kurzen Sequenz (12 AS bei GPR126) nach der cleavage site
des aGPCR. Untersuchungen, in denen der potentiell aktivierende Bereich in der GPS-
Domäne schrittweise eingekürzt bzw. jede einzelne Aminosäure gegen Alanin substituiert
wurde, bestärkten die Hypothese eines gebundenen Agonisten. Schließlich gelang es, Peptide
analog der Sequenz dieser agonistischen Region nach der cleavage site zu generieren, mit
denen der WT und P2Y12-ΔGPS-CTF Konstrukte signifikant in der Signaltransduktion
aktiviert werden konnten. Für den GPR126 erzielte ein 16 AS langes Peptid (p16) die besten
Ergebnisse, währenddessen p13 für den GPR133 identifiziert worden ist. Beide Peptide
wirkten spezifisch nur auf die jeweiligen aGPCR.
Dass ein gebundener Agonist einen GPCR zu aktivieren vermag, ist bereits für die protease-
activated receptors (PAR) gezeigt worden. Aktivierung dieser nur vier Mitglieder
umfassenden Familie der GPCR benötigt die proteolytische Freilegung einer N-terminalen
Rezeptorsequenz durch beispielsweise Thrombin oder Trypsin. Dadurch faltet sich der
gebundene Rezeptor-aktivierende Ligand (TL) der PARs und aktiviert Signaltransduktion
über Gi, Gq und G12/13. Synthetische Rezeptor-aktivierende Peptide analog der exponierten
TL-Sequenz initiieren auch ohne proteolytische Spaltung G-Protein-Kopplung, benötigen
jedoch 100- bis 1000-fach höhere Konzentrationen als die der Proteinasen (Hollenberg et al.,
2013).
Zwei bereits basal charakterisierte Vertreter der aGPCR, GPR126 und GPR133, wurden in
dieser Arbeit hinsichtlich eines allgemein gültigen Aktivierungsmechanismus mit Hilfe
ortsgerichteter Mutagenesestudien und spezifisch synthetisierten Peptiden analysiert. Dabei
konnte die Sequenz zwischen der cleavage site und der TM1 als agonistische Region
identifiziert werden. Aufgrund ihrer Position am C-terminalen Ende der GPS und der
räumlichen Beziehung zur TM1 wurde der aktivierende Bereich als „Stachel-Sequenz“
bezeichnet.
Die Basis für unser heutiges Verständnis über Aktivierungswege von GPCR und
Konformationsänderungen stellen u.a. primäre biophysikalisch und biochemische
Experimente am bovinen Rhodopsin-Rezeptor dar, welcher durch Licht-induzierte
Isomerisierung aktiviert wird (Ahuja et al., 2009).
Die für den GPR126 und GPR133 auf dieser Grundlage der Stachel-Sequenz hergestellten
aktivierenden Peptide (p16 bzw. p13) zeigten nur niedrig-affine Eigenschaften mit einer EC50
>100 µM. Ein klassischer Agonist sollte dagegen in der Lage sein, einen hoch-affinen
59
Zustand des Rezeptors zu initialisieren und zu stabilisieren (Lefkowitz et al., 1993). In diesem
Zusammenhang waren nun mehrere Hypothesen als Erklärung der niedrigen Affinität des p16
und p13 diskutierbar: Theoretisch denkbar wäre, dass sich p16/p13 und der natürlich
vorkommende gebundene Agonist in der ECD in Form einer kompetitiven Hemmung durch
Konkurrenz an der Bindungsstelle behindern. Experimente mit P2Y12-∆GPS-CTF-
Konstrukten, denen die endogene agonistische Sequenz des N-Terminus fehlt, zeigten jedoch
vergleichbare Stimulationswerte durch die Peptide wie Wildtyp-Rezeptoren mit intrinsischer
Stachel-Sequenz. Ein kompetitiver Mechanismus scheint deshalb ausgeschlossen.
Ein Agonist muss in einer spezifischen Konformation vorliegen, um den Rezeptor effektiv
aktivieren zu können. Geht man beispielsweise davon aus, dass eine einzelne Proteinbindung
in drei unterschiedlichen Rotationszuständen vorliegen kann, ergeben sich bei nur 10 solcher
Bindungen innerhalb eines Peptids theoretisch 310 = 59049 verschiedene Konformationen
(Stockwell and Thornton, 2006). Auch wenn nicht jede dieser Konformationen physikalisch
möglich und andere energetisch unvorteilhaft sind, bleiben eine Vielzahl unterschiedlicher
Raumanordnungen für ein solches Peptid möglich. In den meisten Fällen unterscheidet sich
zusätzlich die Konformation eines Liganden im gebundenen Zustand von seiner günstigsten
sterischen Anordnung in Lösung (Gao et al., 2010). Für die aktivierenden Peptide p16 und
p13 ist deshalb nicht auszuschließen, dass nur ein geringer Teil in einer Konformation
vorliegt, welche tatsächlich die Rezeptorfunktion beeinflussen kann. Dementsprechend waren
hohe Konzentrationen notwendig, um den halbmaximalen Effekt (EC50) des Rezeptors zu
erreichen. Innerhalb der ECD des Wildtyp-Rezeptors wird dagegen die korrekte räumliche
Positionierung der Stachel-Sequenz durch ihre Einbindung in die Domänenstruktur
sichergestellt. Die Generierung einer Kristallstruktur für die Stachel-Sequenz ähnlich der
GAIN durch Araç et al. (Araç et al., 2012) könnte bei der Optimierung von therapeutisch oder
diagnostisch nutzbaren aGPCR-Agonisten hilfreich sein.
Die Fähigkeit eines Peptids eine bestimmte Konformation einzunehmen, kann trotz allem
auch als große Chance gesehen werden: Peptidmedikamente zeichnen sich durch höhere
Selektivität als andere small molecule Agonisten aus, was bedeutet, dass sie nur ihren
Zielrezeptor binden. Ernsthafte Nebenwirkungen können dadurch theoretisch minimiert
werden.
Einen weiteren Erklärungsansatz der niedrigen Affinität bieten experimentelle Daten des
Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP-1) Rezeptors. Ligandenbindung und
Rezeptoraktivierung beinhalten demnach einen Zwei-Stufen-Mechanismus: Während MCP-1
im ersten Schritt mit hoher Affinität an den N-Terminus des Rezeptors bindet, erfolgt im
60
zweiten Schritt eine niedrig-affine Interaktion des „pseudo-gebundenen“ Liganden mit den
extrazellulären Loops. In Abwesenheit des N-Terminus wurden jedoch höhere MCP-1
Konzentrationen zur Rezeptoraktivierung benötigt. Übertragen auf die Stachel-Sequenz ist der
erste Schritt nicht notwendig, da der aktivierende Ligand bereits Teil des N-Terminus ist.
Geht man weiterhin davon aus, dass die Stachel-Sequenz mit extrazellulären Loops und
oberen Helixbündeln ähnlich anderen Peptid-GPCR-Komplexen interagiert (Thompson et al.,
2012), scheinen die hohen p16 und p13 Peptid-Konzentrationen eher nachvollziehbar.
Bekannte Peptidhormone wie TSH oder Insulin besitzen nur kurze Halbwertszeiten, da
zirkulierende Enzyme für die Degradation im Blutstrom sorgen. Man kann vermuten, dass die
agonistische Stachel-Sequenz innerhalb der GPCR-Struktur dagegen keinen so rasanten
Abbauvorgängen ausgesetzt ist. Würde die Stachel-Sequenz, welche ja in einer 1:1
Stöchiometrie zur 7TM vorliegt, zusätzlich noch eine hohe Affinität zur Bindungsstelle
aufweisen, wären alle Rezeptoren dauerstimuliert.
Neue Untersuchungen zur Interaktion des aGPCR CD97 und seines Liganden CD55 zeigten
eine ähnlich niedrige Affinität (KD von 86 μM) auf. Die Expressionsregulation des CD97
nach CD55-Bindung soll dabei von mechanischen Kräften (Scherspannung) in vitro und in
vivo abhängig sein. Da für die CD97-CD55-Interaktion keine Änderung von downstream
Effektorproteinen gefunden werden konnte, erscheint es den Autoren denkbar, dass CD55
allein adhäsive Kontakte vermittelt (Karpus et al., 2013). In Zusammenschau der Ergebnisse
mit den niedrig-affinen Peptiden p16/p13 ist auch der Gedanke möglich, dass zur
vollständigen Rezeptoraktivierung eine Kombination aus endogenem Agonist und exogener
Ligandenbindung an den extrazellulären Domänen nötig ist.
Dieser neue Mechanismus eines endogen gebundenen Agonisten der aGPCR widerspricht
demnach nicht den zuvor publizierten Liganden, welche an adhäsive Domänen des N-
Terminus binden, sondern erweitert sie durch einen zusätzlichen Gesichtspunkt.
5.2 Gs-Protein-Kopplung ist ein generelles Charakteristikum
2011 konnte für den GPR133 als ersten Vertreter der aGPCR erstmalig G-Protein-Kopplung
anhand eines second messenger-Signalexperiments bewiesen werden. Das Gs-Signal wurde
u.a. durch den spezifischen knock-down von Gαs mit siRNA und Überexpression von Gαs
verifiziert (Bohnekamp and Schöneberg, 2011). Nachfolgend wurden für den GPR114 eine
Bindung an Gαs, für den GPR110 an Gαq sowie GPR97 an Gαo gezeigt (Gupte et al., 2012).
61
Signaltransduktionsmechanismen und G-Protein-Kopplung blieben für den Großteil der
aGPCR jedoch weiterhin unbekannt.
In dieser Arbeit wurden deshalb 11 murine Rezeptoren der aGPCR aus cDNA-Bibliotheken
kloniert und funktionell anhand von second messenger-Akkumulationsassays getestet. Eine
Alternativmethode zum Nachweis einer G-Protein-Kopplung stellt die Bindung von
radioaktiv-markiertem GTP an einen GPCR dar. Dazu wird meist ein 35S markiertes, nicht-
hydrolysierbares Analogon von GTP (GTPγS) eingesetzt. GPCR, überexprimiert in
Zellmembranen, binden nach Agonistaktivierung entsprechende G-Proteine, welche den
Austausch von GDP durch GTP bewirken. Die Höhe der Rezeptoraktivierung kann in der
Menge des radioaktiv-markierten GTP an die Zellmembranen gemessen werden
(PerkinElmer, 2014). In den hier eingesetzten Methoden wurden second messenger-Signale
ausgelesen. Diese liegen zwar downstream der G-Protein-vermittelten Signalkaskade und sind
damit per se nur indirekter G-Protein-Bindungsnachweis, jedoch ist ein entscheidender
Vorteil dieser Methode, dass zur Bestimmung von second messengern meist auf den Einsatz
radioaktiver Substanzen verzichtet werden kann und somit Konstrukte im Hochdurchsatz
getestet werden können. Eine nicht-radioaktive Variante zum Nachweis von G-Protein-
Kopplung ist der hier verwendete AlphaScreen cAMP Assay von PerkinElmer. Der second
messenger 3´5´-cyclisches AMP (cAMP) wird durch die Adenylylcyclase aus ATP gebildet.
Die Regulation der Adenylylcyclase ist weitreichend untersucht. Neben den durch G-Proteine
vermittelten Effekten kann die Adenylycyclase nur durch Forskolin aktiviert und durch
Calcium/Calmodulin moduliert werden (Tang and Hurley, 1998). Da Forskolin eine
chemische Verbindung aus dem Harfenstrauch Plectranthus barbatus ist (Metzger and
Lindner, 1981) und endogen im Säugetierorganismus nicht vorkommt, verweist ein erhöhtes
cAMP-Signal spezifisch auf eine Gs-Protein-Aktivierung durch GPCR. Die verwendeten
Methoden sind darüber hinaus seit Jahrzehnten in der Arbeitsgruppe etabliert und sind in der
Validität und Spezifität umfangreich bestätigt (Sangkuhl et al., 2002; Bohnekamp and
Schöneberg, 2011).
Für einige Rezeptoren wie GPR111, GPR114 und GPR128 wurden nur niedrige
Expressionsspiegel an der Zellmembran im ELISA detektiert. Teilweise konnte dem durch die
Insertion eines N-terminalen Rhodopsin-tags entgegnet werden. Das Rhodopsin-tag umfasst
die ersten 20 Aminosäuren des N-Terminus des bovinen Rhodopsin-Rezeptors und konnte
bereits für unterschiedlichste GPCR als Modifikation, welche die Zelloberflächenexpression
erhöht, gezeigt werden (Liberles and Buck, 2006; Bohnekamp and Schöneberg, 2011). Für
einige Rezeptoren wurden jedoch trotz niedriger Oberflächenexpression im ELISA
62
signifikante second messenger-Akkumulationen gemessen, beispielsweise für die HA- und
FLAG-markierten Konstrukte des GPR114 und des GPR128. Dank interner Assay-
spezifischer Kontrollen konnten unspezifische Nebenreaktionen ausgeschlossen werden: In
jedem Experiment wurde als Negativkontrolle der leere pcDps-Vektor transfiziert, auf den
sich alle Rezeptor-spezifischen Daten beziehen (x-faches der Negativkontrolle). Am
wahrscheinlichsten war, dass sich der HA-tag aufgrund sterischer Anordnung im N-Terminus
nicht durch den eingesetzten Antikörper (Anti-HA-Antikörper 3F10, Roche Applied Science)
erfassen ließ. Eine andere Möglichkeit zur Expressionskontrolle ist der Nachweis des
Rezeptors im Westernblot. In einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese werden Sekundär-
und Tertiärstrukturen eines Proteins durch die Zugabe von SDS und anschließendem Erhitzen
auf 95 °C zerstört. Neben diesem Aufbrechen der Wasserstoffbrücken können vorhandene
Disulfidbrücken durch ß-Mercaptoethanol gespalten werden. So ist es im Westernblot eher
möglich, eine zu untersuchende Struktur mit einem Antikörper nachzuweisen als bei intakter
Tertiärstruktur des Proteins. Westernblot-Untersuchungen dieser Rezeptoren ließen leider
keine eindeutige Aussage über die Expression zu. Der GPR114 und der GPR128 konnten
nicht als Gesamtprotein detektiert werden.
Die HA-Markierung wurde C-terminal des vorausgesagten Signalpeptids des Rezeptors
eingefügt (SignalP 4.1 Server, Center for Biological Sequence Analysis CBS). Daher ist es
nicht auszuschließen, dass es durch diese exogene Insertion zu einer Fehlfaltung oder zur
Funktionslosigkeit des Signalpetids kam. Versuche, das HA-tag um einzelne
Aminosäurepositionen nach C-terminal zu versetzen, erhöhten bislang die
Oberflächenexpression des Rezeptors nicht.
Zum gleichen Zwecke diente auch der Nachweis des Immunfluoreszenz-markierten FLAG-
tags des GPR128: Der GPR128 konnte zwar mikroskopisch detektiert werden, schien jedoch
in der Zelle retiniert zu werden. Eine nähere Bestimmung der intrazellulären Lokalisation
wäre durch die Anfärbung spezifischer Golgi-Marker (z.B. α-Mannosidase II) oder ER-
Marker (z.B. Calnexin) möglich. Die Retention des Rezeptors schien jedoch keine negative
Auswirkung auf die intrazelluläre Signaltransduktion zu besitzen, konnte doch für den
GPR128 multiple G-Protein-Kopplung an Gs, Gq und Gi ermittelt werden. Neben der
klassischen Vorstellung, welche GPCR in der Zellmembran lokalisiert sieht, gibt es starke
Hinweise darauf, dass heterotrimere G-Proteine und Adenylylcyclasen auch in Endosomen
vorkommen. Es konnte gezeigt werden, dass internalisierte TSH-TSHR-Komplexe
intrazellulär die cAMP-Produktion fortführend stimulieren (Calebiro et al., 2009). Darüber
hinaus soll intrazellulär der Sphingosin-1-phosphat Rezeptor 1 (S1P1) Gi-vermittelte
63
Signalwege aktivieren (Mullershausen et al., 2009). GPCR sollen in sekretorischen Granula,
dem Endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat eine Rolle im Vesikeltransport
übernehmen (Slessareva et al., 2006). Möglicherweise übt auch der GPR128 eine solche
Funktion im Golgi-Apparat aus.
Alle in dieser Arbeit untersuchten aGPCR zeigten eine Bindung an Gs-Proteine. Die Sekretin-
Familie der GPCR, welche sich aus den aGPCR entwickelt hat, soll sowohl intrazelluläre
cAMP- als auch Calciumspiegel regulieren und umfasst die Rezeptoren für u.a. Sekretin,
Calcitonin und Parathormon (Patel et al., 1995). Damit fügt sich die Fähigkeit der aGPCR an
Gs-Proteine zu binden, adäquat in den evolutionären Kontext ein.
5.3 Multiple G-Protein-Interaktion
Es wurden 11 orphane aGPCR hinsichtlich ihrer G-Protein-Kopplungseigenschaften
untersucht. Eine duale Kopplung an Gi/o und Gq/11-Proteine ist bereits 1994 für den
muskarinischen Acetylcholinrezeptor beschrieben worden (Offermanns et al., 1994), an Gs-
und Gq/11-Proteine 2001 für den stimulierten D1 Dopaminrezeptor (Jin et al., 2001). Seltener
dagegen scheint die simultane Interaktion mit drei oder vier G-Protein-Familien zu sein (Gs-,
Gi/o-, Gq/11- und G12/13-Kopplung des Thyrotropinrezeptors) (Laugwitz et al., 1996)). Es wird
nach wie vor dabei die Frage diskutiert, ob multiple G-Protein-Kopplung Pleiotropie
(physiologische Aktivierung mehrerer unterschiedlicher G-Proteine) oder Promiskuität
(niedereffiziente unspezifische G-Protein-Aktivierung als Ergebnis von Rezeptor- oder G-
Protein-Überexpression) darstellt (Maudsley et al., 2005). Ein GPCR, welcher von einem
Agonist aktiviert wird, soll dabei intrazellulär jedes G-Protein mit unterschiedlicher
intrinsischen Aktivität/ Potenz binden können (Offermanns et al., 1994).
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass neben der dualen G-Protein-Kopplung des
GPR126 (Mogha et al., 2013) und des GPR133 (Bohnekamp and Schöneberg, 2011;
Liebscher et al., 2013) auch andere Vertreter der aGPCR an mehr als eine G-Protein-Familie
binden. Herauszustellen waren dabei GPR115, GPR116 sowie GPR128, welche an jeweils
alle drei getesteten G-Proteine (Gs, Gq und Gi) koppeln konnten. Weiterführende
Untersuchungen sollten klären, ob auch der G12/13-Signalweg durch die genannten aGPCR
aktiviert werden kann. Die Gα12/13 Untereinheit heterotrimärer G-Proteine stimuliert mitogene
Signalwege wie die Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) und führt zur Formation von
Stressfasern in der Zelle über Rho-Aktivierung (Dhanasekaran and Dermott, 1996).
64
Zur Untersuchung des Gq- und Gi-Signalwegs wurde der bereits in der Arbeitsgruppe
etablierte PI-Assay verwendet. Prinzip dessen ist die Hydrolyse von 3H-markiertem
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) durch Gq-vermittelte Aktivierung der
Phospholipase Cß. Das dabei entstehende 3H-markierte IP3 kann mit Hilfe eines ß-Counters
quantifiziert werden. Durch Co-Transfektion eines chimären G-Protein Gqi4 erlaubt dieser
Ansatz auch die Untersuchung des Gi-Signalwegs. Um den Erfolg eines jeden Assays
gewährleisten zu können, wurden bekannte Gq- bzw. Gi-koppelnde GPCR, stimuliert mit dem
jeweils bekannten endogenen Agonist, als Positivkontrolle mitgeführt (M3R und P2Y12).
Unspezifische Nebenreaktionen in der Zelle konnten vernachlässigt werden, da alle
Ergebnisse als x-faches des transfizierten Leervektors angegeben sind.
Darin begründet, dass alle aGPCR bislang orphan sind, man also keine endogene Agonisten
kennt, konnte nur die Basalaktivität der Rezeptoren nachverfolgt werden. Es ist denkbar, dass
mehrfache G-Protein-Kopplung durch den Einsatz des spezifischen Agonisten (z.B. Peptide
analog der jeweiligen Stachel-Sequenz) sogar noch häufiger aufträte.
Die duale Kopplung an Gs- und Gi-Proteine eines Rezeptors mit simultaner Stimulierung und
Inhibierung der Adenylylcyclase mag kontrovers erscheinen. Für den ß2-Adrenozeptor,
welcher Gs- und Gi-Proteine aktiviert, konnte der Mechanismus einer wechselnden G-Protein-
Kopplung aufgeklärt werden. Die ß2-AR-vermittelte MAPK-Aktivierung durch die ßγ-
Untereinheit des Gi-Proteins wird dabei erst durch Gs-Protein-Rezeptorbindung ermöglicht:
Durch Aktivierung der Proteinkinase A und nachfolgende Phosphorylierung des ß2-AR
kommt es zur Stimulation des Gi-Signalwegs. Die ßγ-Untereinheit des Gi-Proteins vermittelt
dabei über die Tyrosinkinase c-Src und das G-Protein Ras das MAPK-Signal des ß2-AR
(Lefkowitz et al., 1997). Anstelle konkurrierender Effekte sind also auch synergistische
Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen G-Proteinen bedeutsam.
In murinen Schwannzellen sind darüber hinaus niedrige cAMP-Spiegel mit Proliferation und
hohe cAMP-Level mit Differenzierung assoziiert worden (Arthur-Farraj et al., 2011). Der
aGPCR GPR126 nimmt dabei eine entscheidende Position ein (Mogha et al., 2013). Es darf
vermutet werden, dass multiple G-Protein-Kopplung der aGPCR eine wichtige Rolle bei der
Feinabstimmung dieser und anderer physiologisch notwendigen second messenger-Spiegel
spielt.
65
5.4 Autoproteolytische Spaltung
Cleavage, die autoproteolytische Spaltung an einer konservierten Stelle innerhalb der GPS, ist
ein viel diskutiertes Charakteristikum der aGPCR. Die intrazelluläre Spaltung ist für einige
Vertreter der aGPCR beschrieben worden (CD97 (Hsiao et al., 2009), GPR56 (Paavola et al.,
2011), GPR126 (Moriguchi et al., 2004)), für andere jedoch Gegenteiliges (GPR111 und
GPR115 (Prömel et al., 2012b)).
Da die Spaltung des NTF im Endoplasmatischen Retikulum zu einer frühen Phase der
Proteinprozessierung erfolgen soll, kam die Vermutung auf, dass cleavage für die Reifung,
Transport und Funktion der aGPCR von großer Bedeutung sein muss. Krasnoperov et al.
schlussfolgerten, dass cleavage an der GPS essentiell für den Transport des Latrophilins an
die Plasmamembran sei (Krasnoperov et al., 2002). Andere Untersuchungen zeigten, dass
Oberflächenexpression und cleavage von aGPCR keinen direkten Zusammenhang aufweisen
(Lin et al., 2004). Für die bilaterale frontoparietale Polymikrogyrie, einer
Gehirnentwicklungsstörung, sind unter anderen Mutationen (C346S und W349S) des GPR56
beschrieben, welche die autoproteolytische Spaltung und zugleich den Austritt des Rezeptors
aus dem Endoplasmatischen Retikulum behindern (Jin et al., 2007). In vivo konnte kürzlich
jedoch gezeigt werden, dass die GPS des Latrophilins 1 nicht notwendig für
Rezeptortransport und –aktivität ist (Prömel et al., 2012a). Die physiologische Relevanz
dieser Spaltung bleibt somit kontrovers diskutiert.
In dieser Arbeit wurden für die 11 primär auf Signaltransduktion untersuchten aGPCR
Westernblots angefertigt, um eine Aussage zum cleavage dieser Rezeptoren treffen zu
können. Zusätzlich wurden GPR126 und GPR133, für welche bereits Vorergebnisse
bezüglich der autoproteolytischen Spaltung existieren, mitgeführt. In dieser Arbeit zeigten
GPR97, GPR116, GPR126, GPR133 und EMR1 das für die aGPCR charakteristische
cleavage.
GPR116, GPR126, GPR133 sowie EMR1 sind gute Oberflächenexpression und multiple G-
Protein-Kopplung gemeinsam. Der GPR97, dessen NTF nur in geringem Maße im
Westernblot dargestellt wurde, war dagegen im Vergleich zur Positivkontrolle P2Y12 in
niedrigerem Maße an der Zellmembran lokalisiert und vermittelt nur den Gs-Signalweg. In
Zusammenschau der Ergebnisse dieser Arbeit konnte nicht ausgeschlossen werden, dass die
Detektion von cleavage im Westernblot mit der Expression eines aGPCR assoziiert ist. Es
lässt sich vermuten, dass möglicherweise auch andere aGPCR - wie GPR114 oder GPR128 -
cleavage zeigen würden, wären sie stärker an der Zelloberfläche exprimiert. Aufgrund einer
66
mutierten cleavage site des GPR115 und GPR111 (Prömel et al., 2012b) wäre dies jedoch
nicht von allen aGPCR zu erwarten.
Für EMR2 und EMR4 ist bereits Proteolyse an der GPS beschrieben worden (Stacey et al.,
2002; Lin et al., 2004). In dieser Arbeit zeigte der nahe verwandte EMR1 im Westernblot
Banden unterschiedlicher Höhe. Mit rund 102 kDa wird der vollständige Rezeptor
vorhergesagt, sodass hier vermutlich sowohl ungespaltene als auch gespaltene Rezeptoren
dargestellt sind. Die autokatalytische Reaktion des cleavage kann laut Iguchi et. al. keine
100 % Effizienz aufweisen, wodurch gespaltene und ungespaltene Moleküle des Rezeptors in
der Zelle co-existieren (Iguchi et al., 2008).
Für den GPR114, welcher eine Gesamtlänge von nur 58 kDa besitzt, war im Westernblot eine
Bande auf Höhe von 200 kDa gefunden worden. Dies war vermutlich auf eine nicht
vollständige Membranlyse zurückzuführen und stellte keinen Beweis für autoproteolytische
Spaltung des GPR114 dar. Der GRP116 enthält im N-Terminus eine SEA-Box. Eine solche
SEA-Box, die auch in anderen Proteinen identifiziert worden ist, soll sich als zusätzliche
Spaltstelle im GPR116 darstellen (Fredriksson et al., 2002). Die SEA-vermittelte-Spaltung
soll dem Protein eine Funktion sowohl als Ligand als auch als Rezeptor erlauben (Wreschner
et al., 2002). Es konnte vermutet werden, dass die hier dargestellte Bande des GPR116 die
SEA-Domäne darstellt.
Für den BAI2 ist cleavage bereits publiziert worden (Okajima et al., 2010). Die Fähigkeit der
BAI-Subfamilie zur autoproteolytischen Spaltung scheint dabei zellspezifisch zu sein, BAI1
und BAI3 spalten in HEK293T-Zellen nicht (Stephenson et al., 2014).
Moriguchi et al. beschrieben den GPR126 als intrazellulär gespaltenen aGPCR. Für ihre
Untersuchungen generierte die Arbeitsgruppe Antikörper gegen carboxy-terminal
cytosolische Bereiche des GPR126. Damit gelang es ein 35 kDa großes Fragment als CTF zu
detektieren, der Gesamtrezeptor wird mit 170 kDa angegeben. Eine weitere Spaltungsstelle
wird zwischen Lysin467 und Arginin468 angegeben und konnte durch den Furininhibitor
Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-Chloromethylketon gehemmt werden (Moriguchi et al., 2004). In
den Untersuchungen dieser Arbeit konnte für den GPR126 kein einheitliches Ergebnis erlangt
werden, einige Westernblots wiesen eine Bande auf Höhe von 70 kDa auf. Da die
Furinspaltstelle N-terminal der cleavage site liegt und damit näher am von Antikörper
erkannten HA-tag, war es für den GPR126 nicht möglich, eine Aussage über die
Autoproteolyse an der GPS zu treffen.
Wie bereits erwähnt, ist eine vollständige Solubilisierung bei Membranproteinen wie den 7-
Transmembranrezeptoren nur selten zu erreichen. Eine elegante Lösung dieses Problems stellt
67
die Klonierung des Rezeptors in einen spezifischen Sekretions-Vektor dar. Der Säugetier-
Expressionsvektor pSecTag2 (life technologies, Invitrogen, Darmstadt, Deutschland)
beispielsweise enthält ein Sekretionssignal der V-J2-C-Region der murinen Ig-κ-Kette und
ermöglicht so eine effiziente Sekretion von Proteinen. Auf diese Weise werden potentiell
gespaltene NTF von aGPCR in das Zellkulturmedium sekretiert und lassen sich durch
Methanol/Chloroform Präzipitation konzentrieren (Wessel and Flügge, 1984; Prömel et al.,
2012b). Durch die artifizielle Sekretion ist keine Zelllyse nötig, wodurch diese Methode
definitive Aussagen eher ermöglicht.
Die Ergebnisse zum cleavage bestätigen zusammenfassend den Eindruck, dass zwar die
intrazelluläre Spaltung von aGPCR eine besondere Eigenschaft dieser GPCR-Klasse darstellt,
dass dieses Charakteristikum jedoch nicht allen Vertretern der aGPCR eigen ist.
5.5 Konstitutive Aktivierung an konservierten Cysteinen
Spezifische Aminosäuresubstitutionen eines GPCR können den mutierten Rezeptor
befähigen, den entspannten, aktiven R*-Zustand zu favorisieren. Die strukturelle
Konformationsänderung - ausgelöst durch den Aminosäureaustausch - imitiert den unter
natürlichen Umständen durch Agonisten verursachten allosterischen Übergangszustand. Es ist
dabei möglich, dass es durch Mutagenese zu einer Favorisierung des aktiven oder aber auch
des inaktiven R-Zustandes kommt (Lefkowitz et al., 1993). Trotz weitreichender
Untersuchungen ist es bis heute nicht vorhersagbar, welche Substitutionen einen GPCR
konstitutiv aktivieren. In Rhodopsin-ähnlichen GPCR werden solche Mutationen häufig in der
Transmembranregion gefunden. Cöster et al. ersetzten dafür jede einzelne Aminosäure der
TM6 und TM7 des P2Y12 durch die verbliebenen 19 anderen Aminosäuren und beschrieben,
dass nur 1,7 % der 1254 generierten Mutationen konstitutive Aktivität aufwiesen (Cöster et
al., 2012). Für den purinergen Adenosin 2B Rezeptor (A2BR) konnten drei
Schwerpunktbereiche ausgemacht werden, an denen konstitutive Aktivierung des Rezeptors
durch Aminosäureaustausch erzeugt werden können: Neben jeweils einem Bereich in der
TM4 und TM5 stach eine Cystein-reiche Region innerhalb des extrazellulären Loops 2
(ECL2) hervor. Es konnte dargestellt werden, dass eine putative Disulfidbrücke zwischen
ECL 1 und ECL 2 wichtig für die Ribose-Agonist Bindung und Aktivierung ist (Peeters et al.,
2012). Der GABA1B-Rezeptor dagegen soll durch die Einführung zweier Cysteine, welche
68
untereinander eine Disulfidbrücke ausbilden, im aktiven Zustand blockiert werden (Kniazeff,
2004). Für die aGPCR waren bislang keine konstitutiv aktiven Rezeptorvarianten bekannt.
In dieser Arbeit konnten für die aGPCR vier Positionen identifiziert werden, an denen durch
Aminosäuresubstitution zuverlässig eine basal aktivere Rezeptormutante generiert werden
kann. Es handelt sich dabei um innerhalb der aGPCR-Familie hoch konservierte Cysteine
(Cys775, Cys794, Cys807 und Cys809 des GPR126), welche N-terminal der cleavage site
lokalisiert sind und deren Schwefelatome potentiell untereinander Disulfidbrückenbindungen
ausbilden. Disulfidbrücken formen und stabilisieren die dreidimensionale Tertiärstruktur
eines Proteins, vernetzen und verknüpfen Peptidketten. Durch Austausch der Cysteine durch
die polare Aminosäure Serin bedingte sich eine bis zu sechsfach gesteigerte cAMP-
Akkumulation bei leicht verminderter Oberflächenexpression der Mutanten. Die Positionen
waren dabei nicht für den GPR126 spezifisch, sondern waren auf den GPR133 übertragbar.
Als potentiell allgemeingültiger Aktivierungsmechanismus wird - wie bereits erwähnt - die
Abspaltung N-terminaler Bereiche an der cleavage site durch autoproteolytische Prozesse
diskutiert (Paavola and Hall, 2012). Interessanterweise wurden die konstitutiv aktiven
Mutationen an den Cysteinen des GPR126 bereits in einer früheren Untersuchung als
cleavage-defizient beschrieben (Moriguchi et al., 2004). Cleavage erschien zumindest für die
Aktivierung dieser Mutanten nicht notwendig zu sein.
Während Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen bereits die Schlussfolgerung zuließen, dass
die Neuformation einer Disulfidbrücke einen generellen Mechanismus für die
Aktivitätsregulation von 7TM-Rezeptoren darstellt (Storjohann et al., 2008), demonstrieren
diese Ergebnisse, dass auch die Zerstörung einer solchen Bindung in Rezeptoraktivierung der
aGPCR resultiert. Das in dieser Arbeit postulierte Aktivierungsmodel der aGPCR geht davon
aus, dass der intramolekulare agonistische Bereich, also die Stachel-Sequenz, durch
Konformationsänderungen in der ECD freigelegt und damit befähigt wird, 7TM-vermittelte
G-Protein-Kaskaden zu initialisieren. Strukturelle Änderungen in der GPS - hier durch
Zerstörung einer Disulfidbrückenbindung - aktivieren folglich in Analogie zur Stachel-
Sequenz die Signaltransduktion eines aGPCR.
5.6 Ausblick
Diese Arbeit umfasst die molekularbiologische Charakterisierung von 11 Vertretern der
aGPCR (Tab. 5) sowie die Identifikation eines gebundenen Agonisten im N-Terminus als
69
Aktivierungsmechanismus dieser Rezeptorfamilie. Es bleiben jedoch noch einige Fragen
offen. So wurde bis heute für die Rezeptoren der Gruppe V der aGPCR, welche die Cadherin
EGF LAG Seven-Pass G-Type Receptors CELSR1, CELSR2 und CELSR3 umfasst, noch
keine G-Protein-Kopplung gezeigt. Aber auch für BAI3, EMR3-4, GPR112, GPR113,
GPR125, GPR144 und VLGR steht eine Untersuchung auf putative G-Protein-Interaktion
noch aus. Dabei ist zu erwarten, dass auch diese Rezeptoren intrazellulär auf second
messenger wie cAMP oder Phosphatidylinositol wirken. Für möglichen therapeutischen oder
diagnostischen Einsatz sind jedoch genauere Kenntnisse von Nöten.
Ziel wird es sein, alle Rezeptoren der Adhesion-Familie umfassend zu charakterisieren. Dabei
sollte auch der G12/13-Signalweg, dessen Untersuchung nicht Bestandteil dieser Arbeit war, in
zukünftigen Studien einbezogen werden. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit soll dafür ein
Grundstein gelegt sein.
Das Vorhandensein eines gebundenen Agonisten im N-Terminus der aGPCR wurde bislang
nur für den GPR126 und GPR133 gezeigt. Trotz Einordnung dieser beiden Rezeptoren in
unterschiedliche Untergruppen innerhalb der aGPCR-Klasse bleibt die Frage, ob sich alle
aGPCR-Vertreter durch denselben Mechanismus aktivieren lassen. Gerade im Hinblick auf
die große Heterogenität dieser Gruppe müssen sich noch weitere Untersuchungen
anschließen. Interessant sind dabei Rezeptoren wie der GPR111 und GPR115, welche eine
modifizierte cleavage-Sequenz aufweisen (Abb. 20). Aber auch der GPR123, dem die GPS-
Domäne vollständig fehlt, wird in weiterführenden Experimenten aufschlussreiche
Erkenntnisse mit sich bringen. Der GPR114 (Isoform 1) zeichnete sich als konstitutiv aktiver
Rezeptor aus. Es stellt sich hier die Frage, ob dieser Rezeptor durch Peptide noch stärker
aktiviert oder ein anderer Mechanismus identifiziert werden kann.
Die als Agonisten wirkenden Peptide p16 und p13 bestehen aus 16 bzw. 13 Aminosäuren.
Obwohl bereits mit dem Alaninscan des p16 begonnen wurde, steht die genaue Lokalisierung
der agonistischen Kernsequenz noch aus. Zukünftig müssen neben pharmakodynamischen
auch pharmakokinetische Gesichtspunkte untersucht werden, um Aspekte der Resorption,
Distribution, Metabolisierung und Exkretion im Organismus für die Peptidagonisten
einschätzen zu können. Nicht nur für diese Themenstellung sind in vivo-Untersuchungen
anzustreben. Der Aktivierungsmechanismus wurde für die humanen aGPCR-Konstrukte des
GPR126 und GPR133 aufgedeckt. Ob die Peptide p16 und p13 auch agonistische Effekte auf
andere Orthologe besitzen und damit ein evolutionär konservierter Mechanismus vorherrscht,
kann beispielsweise in zukünftigen Maus- oder Zebrafischstudien nachgegangen werden.
70
Peptide werden natürlicherweise durch zirkulierende Enzyme degradiert, sodass kurze
Halbwertszeiten von 2-30 Minuten keine Seltenheit darstellen. Auch die Aufnahme eines
solch großen Peptids in die Blutbahn stellt eine Herausforderung dar. Daher sind
möglicherweise biotechnologische Weiterentwicklungen der Peptide nötig, um
Schwierigkeiten für den therapeutischen Einsatz entgegenzuwirken.
*
Abb. 20 Alignment der cleavage site von aGPCR
Die Proteinsequenzen der in dieser Arbeit untersuchten aGPCR wurden in BioEdit mithilfe des ClustalW
Algorithmus analysiert. Da der GPR123 keine GPS enthält, sind die Sequenzen für diesen Rezeptor hier nicht
aufgeführt. Farbig unterlegt sind die Aminosäuren, die >90 % Konservierung unter den Sequenzen aufweisen.
Die potentielle cleavage site ist mit * markiert.
Tab. 5 Übersicht der molekularen Charakterisierung von ausgewählten aGPCR
Dargestellt sind arithmetische Mittel im Oberflächen-ELISA als (+++) 80-100%, (++) 40-79%, (+) 10-39%,
(-) 0-9% der Positivkontrolle P2Y12, im cAMP-und IP-Assay anhand des Signifikanzniveaus als (+++) <0,001,
(++) <0,01, (+) <0,05. Cleavage ist in Westernblots dieser Arbeit als (+) vorhanden bzw. (-) nicht vorhanden
angegeben. Das klassische cleavage Motiv HL↓T/S nach (Lin et al., 2004) ist erkennbar (+) oder nicht
vorhanden (-).
Oberflächen- Signaltransduktion klassisches
Rezeptor expression Gs Gq Gi cleavage cleavage Motiv
Maus BAI2 + - +
Maus EMR1 ++ + +++ + -
Maus GPR64 Iso 4 ++ + + - +
Maus GPR97 + + + +
Maus GPR111 - + - -
Maus GPR114 Iso 1 ++ ++ - +
Maus GPR115 ++ +++ + ++ - -
Maus GPR116 +++ + ++ ++ (+) +
Maus GPR123 +++ ++ - -
Maus GPR124 ++ ++ - -
Human GPR126 +++ +++ ++ (+) -
Maus GPR128 - +++ +++ ++ - -
Human GPR133 +++ +++ + ++ + +
Maus BAI2 - - T T D P H C A S W D Y S R A D T N S G D W N T E S C Q T L E T - - - Q A A H T R C Q C Q H - - - L ~ ~ ~ S T F A V L A Q P P K D L T L E L A - - - -
Maus EMR1 - - - - R P I C V S W N T D V E D - - - G R W T P S G C E I V E A - - - S E T H T V C S C N R - - - M ~ ~ ~ A N L A I I M A S G - - - - - E L - - - - -
Maus GPR64 - - - - T V K C V F W D L G R N G - G K G G W S S D G C S V K - D - - K R M N E T I C T C S H - - - L ~ ~ ~ T S F G I L L D L S R T - - - - - - - - - -
Maus GPR97 P P N V I L T C V F W D M A - - K - G D - - W D S H G C S T V - P - - G D - G R T V C R C D H - - - L ~ ~ ~ T F F A L L L R P I - L D L A T A Q - - - -
Maus GPR111 S G E R K S Q C V G W H S - - - - - L E S R W D W R A C K T I Q E - - - N S R Q A V C R C R P N K L Y ~ ~ ~ T S F S I L M S P N T L E S P - - - - - - -
Maus GPR114 Iso1 L E G Y T V S C V F W K E G A S K S S W G A W S P E G C Y T E Q P - - - S A T Q V L C H C N H - - - L ~ ~ ~ T Y F A V L M Q L S G D P V P A E L Q - - -
Maus GPR115 S Q S T S S Q C V S W D P - - - - - A T G Q W D E S P C T V M S D - - - I N S T V K C R C R H T K A V ~ ~ ~ T S F S I L M S S K P V K N T - - - - - - -
Maus GPR116 S G G - K P Q C V F W N F S L A N - N T G G W D S S G C S V E D D G R D N R D R V F C K C N H - - - L ~ ~ ~ T S F S I L M S P D S P D P G S L L K I - -
Maus GPR124 - - - A D P M A A WW N Q D - - - - G P G G W S S E G C R L R Y S - - - Q P N V S S L Y C Q H - - - L ~ ~ ~ G N V A V L M E L N A F P R E A G G S G - -
Human GPR126 - E V H H P I C A F W D L N K N K - S F G G W N T S G C V A H R D - - S D A S E T V C L C N H - - - F ~ ~ ~ T H F G V L M D L P R S A S - Q L D A R N -
Maus GPR128 - - - - S Y A C V Y W N F - - - - - L I N D W D T Q G C Q K T G N - - - T T E F L R C N C S H T - - - ~ ~ ~ T N F A V L M S F K - - K D - - - - - - - -
Human GPR133 S N R V F V Y C A F L D F S - - S - G E G V W S N H G C A L T - R - - G N L T Y S V C R C T H - - - L ~ ~ ~ T N F A I L M Q V V P L E L A R G H Q - - -
71
6. Zusammenfassung der Arbeit
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med.
Titel: Molekulare Charakterisierung und Identifizierung eines Aktivierungsmechanismus von
Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
eingereicht von Julia Schön
angefertigt am Institut für Biochemie
Abteilung Molekulare Biochemie
Medizinische Fakultät
Universität Leipzig
betreut von Prof. Dr. med. Torsten Schöneberg
Juli 2014
Die Klasse der Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (aGPCR) umfasst die
zweitgrößte Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Trotz vermehrter Hinweise auf
physiologische und pathophysiologische Relevanz dieser Rezeptorgruppe in genomweiten
Assoziationsstudien und ersten in vivo-Untersuchungen, bleiben bis heute alle 33 humanen
Vertreter dieser Gruppe orphan. Dies bedeutet, dass weder die Funktion noch der endogene
Agonist eines Rezeptors hinreichend bekannt sind.
In dieser Arbeit wurden 11 orphane aGPCR hinsichtlich ihrer G-Protein-Kopplung,
Expression und autoproteolytischen Spaltung untersucht. Durch ortsgerichtete Mutagenese
und Testung synthetisierter Peptide wurde ein genereller Aktivierungsmechanismus der
aGPCR aufgedeckt. Bei diesen Untersuchungen wurden die folgenden wesentlichen
Ergebnisse erzielt:
Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten aGPCR tatsächlich an ihre
namensgebenden G-Proteine binden. Alle untersuchten Rezeptoren koppelten dabei an
Gs-Proteine.
72
Promiskuität in der G-Protein-Kopplung konnte für die aGPCR als ein relativ häufig
auftretendes Merkmal ausgemacht werden. Fünf von 11 untersuchten Rezeptoren binden
an mehr als nur eine G-Proteinfamilie. GPR115, GPR116 und GPR128 interagieren sogar
jeweils mit Gs-, Gq- und Gi-Proteinen.
Die in früheren Arbeiten diskutierte Hypothese eines gebundenen inversen Agonisten im
N-Terminus der aGPCR konnte in dieser Arbeit dank zahlreicher Mutagenesestudien in
vitro widerlegt werden. Stattdessen wird ein gebundener Agonist (sogenannte Stachel-
Sequenz) postuliert, welcher sich im N-Terminus des Rezeptors nach dem konservierten
Spaltungsmotiv befindet.
Es konnten Peptide analog der Aminosäuresequenz des vermuteten agonistischen
Bereiches der aGPCR synthetisiert und getestet werden. Dabei stellte sich heraus, dass
Peptid p16 spezifisch den GPR126 und dass Peptid p13 spezifisch den GPR133
aktivieren können. Die Hypothese des gebundenen Agonisten ist dadurch bestätigt
worden.
Mit einem Alaninscan wurde begonnen, die agonistische Kernsequenz des 16-
Aminosäurerest-langen Peptids p16 zu identifizieren. Während die erste Position im p16
bei erhaltener Rezeptoraktivierung gegen Alanin ausgetauscht werden konnte, schienen
die spezifischen Aminosäuren an den Positionen +2 bis +7 essentiell für die Funktion zu
sein. Es kann daher vermutet werden, dass die Positionen +2 bis +7 einen Teil der
agonistischen Kernsequenz darstellen.
EMR1, GPR97, GPR116, GPR126 sowie GPR133 zeigten das charakteristische cleavage
der aGPCR-Klasse. Für die acht weiteren untersuchten aGPCR konnte keine
autoproteolytische Spaltung nachgewiesen werden.
Es konnten übertragbare Positionen in der GPS-Domäne des GPR126 und GPR133
identifizieren werden, welche durch PCR-basierte Mutagenese der spezifischen
Aminosäure konstitutive Aktivität des Rezeptors bedingen. Es handelte sich dabei um
den Austausch hoch konservierter Cysteine gegen Serin. Die generierten
Rezeptormutanten versechsfachten das basale second messenger-Signal des Wildtyp-
Rezeptors bei leicht verminderter Oberflächenexpression.
Mit dieser Arbeit ist ein entscheidender Schritt in Richtung Deorphanisierung der aGPCR
erreicht worden. Die physiologische Bedeutung dieser Rezeptorgruppe ist jedoch bis heute
nur unvollständig verstanden. Weiterführende Untersuchungen sollten sich daher der
Bestätigung der agonistischen Stachel-Sequenz in vivo sowie der Identifizierung der Relevanz
der aGPCR im Organismus widmen.
73
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Genet 11, 96.
81
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne unzulässige Hilfe
oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass
Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten
haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass
die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer
anderen Prüfungsbehörde zum Zwecke einer Promotion oder eines anderen
Prüfungsverfahren vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen
übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug
genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen
genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.
……………………………… ……………………………..
Datum Unterschrift
82
Anlagen
Tab. S1 Zusammenstellung der zur Klonierung eingesetzten Accession numbers, Geweben und Primern
Rezeptor Accession number Gewebe Primer forward Primer reverse
Maus BAI2 IMAGE-ID:5705854 Gehirn ggcaagggacataggatgac ctggctcctggtagttccaa
Maus EMR1 NM_010130.4 Lunge gactccaccccttttcttcc tcctggagtttggttccatc
Maus GPR64
Isoform 4 NM_001079848.1 Hoden cacacggagtttcctcccta tcctttcgaggttgctgaat
Maus GPR97 NM_173036.3 Lunge gcaggaagaaggtcagttgg agaagacagtggagcccaga
Maus GPR111 NM_001033493.2 Gehirn caaagggaccagctgatgtt gccagcctgggatacataag
Maus GPR114
Isoform 1 NM_001145972.1 Gehirn ccatctcgagacagcagtga ccatgggctgttggaaatag
Maus GPR115 NM_030067.1 Herz ctatcactgaagggggctga ctcctggctggaagaagatg
Maus GPR116 NM_001081178.1 Herz aggacacgggttgtcagttc gcagagagagcacgttaccc
Maus GPR123 NM_177469.3 Lunge gagagaagaaccgaggctga tgttcttcccatgggttctt
Maus GPR124 NM_054044.2 Niere atgccggtgcctcccgcgcgtttg acagtaggggcaagcatctg
Human
GPR126 NM_001032395.2 Monozyt atgatgtttcgctcagatcgaatg ttaaaactttgtgctgtggctg
Maus GPR128 NM_172825.3 Lunge ctgttcgtgcagtgttttgg ggcacttgattttgcttggt
Human
GPR133 NM_198827 Monozyt acttggctccgagctttgac caaaggtggggcatttcatt
Tab S2 Primer zum Nachweis des GPR126 in COS-7 Zellen
Rezeptor Primer forward Primer reverse
GPR126 atcagagttgccgtgtcctt ggaaccacagcttaggttgc
ß-Aktin cgagaagatgacccagatcatg ggactccatgcccaggaag
83
Tab. S3 Zusammenstellung der untersuchten Rezeptormutationen
Konstrukt Deletierte
Aminosäuren
P2Y12 Aminosäurereste im
Konstrukt Andere Modifikationen
Human GPR133 (WT: 874 AS) - - -
Maus GPR133 (WT: 903 AS) - - -
Human GPR126 (WT: 1222 AS) - - -
Human GPR126 CS I - - C775S
Human GPR126 CS II - - C794S
Human GPR126 CS III - - C807S
Human GPR126 CS IV - - C809S
Maus GPR133 CS I - - C507S
Maus GPR133 CS II - - C524S
Maus GPR133 CS III - - C536S
Maus GPR133 CS IV - - C538S
Human GPR126-CTF 38-812 - -
Human GPR133-CTF 26-544 - -
Human GPR126 P2Y12-CTF 1-812 1-34 -
Human GPR133 P2Y12-CTF 1-544 1-34 -
Human GPR126 ΔGPS-CTF 38-824 - -
Human GPR133 ΔGPS-CTF 26-556 - -
Human GPR126 P2Y12-ΔGPS-CTF 1-824 1-34 -
Human GPR133 P2Y12-ΔGPS-CTF 1-556 1-34 -
Human GPR126 P2Y12-CTF-T 1-813 1-34 -
Human GPR126 P2Y12-CTF-TH 1-814 1-34 -
Human GPR126 P2Y12-CTF-THF 1-815 1-34 -
Human GPR126 P2Y12-CTF-THFG 1-816 1-34 -
Human GPR126 P2Y12-CTF-THFGV 1-817 1-34 -
Human GPR126 CTF-T813A 38-812 - T813A
Human GPR126 P2Y12-CTF-T813A 1-812 1-34 T813A
Human GPR126 CTF-H814A 38-812 H814A
Human GPR126 P2Y12-CTF-H814A 1-812 1-34 H814A
Human GPR126 CTF-F815A 38-812 - F815A
Human GPR126 P2Y12-CTF-F815A 1-812 1-34 F815A
Human GPR126 CTF-L818A 38-812 - L818A
Human GPR126 P2Y12-CTF-L818A 1-812 1-34 L818A
Human GPR126 CTF-M819A 38-812 - M819A
Human GPR126 P2Y12-CTF-M819A 1-812 1-34 M819A
Human GPR126 CTF-P822A 38-812 - P822A
Human GPR126 P2Y12-CTF-P822A 1-812 1-34 P822A
Human GPR133 CTF-T545A 26-544 - T545A
84
Human GPR133 P2Y12-CTF-T545A 1-544 1-34 T545A
Human GPR133 CTF-N546A 26-544 - N546A
Human GPR133 P2Y12-CTF-N546A 1-544 1-34 N546A
Human GPR133 CTF-F547A 26-544 - F547A
Human GPR133 P2Y12-CTF-F547A 1-544 1-34 F547A
Human GPR133 CTF-L550A 26-544 - L550A
Human GPR133 P2Y12-CTF-L550A 1-544 1-34 L550A
Human GPR133 CTF-M551A 26-544 - M551A
Human GPR133 P2Y12-CTF-M551A 1-544 1-34 M551A
Human GPR133 CTF-V554A 26-544 - V554A
Human GPR133 P2Y12-CTF-V554A 1-544 1-34 V554A
85
Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name: Julia Schön
Wohnort: Nonnenstraße 7
04229 Leipzig
E-Mail: [email protected]
Telefon: 0170/5245680
Geburtsdatum: 03. September 1989
Geburtsort: Aschersleben
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: ledig
Schulische Bildung:
2002 bis 2008 Gymnasium am Markt in Hettstedt,
Abschluss: Abitur (1,0)
2000 bis 2002 Sekundarschule „Einetal-Vorharz“ in
Welbsleben
1996 bis 2000 Grundschule „Einetal-Vorharz“ in Welbsleben
Hochschulbildung:
Seit 2011 Experimentelle Dissertation an der Universität
Leipzig, Institut für Biochemie inklusive 2
Freisemester (WS 2011/12 und SS 2012)
September 2010 Erfolgreiche Teilnahme am ersten Abschnitt
der Ärztlichen Prüfung (sehr gut (1,5))
Seit WS 2008/2009 Universität Leipzig
Studium der Humanmedizin
Sprachkenntnisse:
Englisch 8 Jahre Schulenglisch
Französisch 6 Jahre Schulfranzösisch
Latein Großes Latinum
86
Weitere medizinisch relevante Erfahrungen:
08.-09.2013 Famulatur Urologische Facharztpraxis Dr. Stefan Schmidt, Leipzig
07.-09.2012 Famulatur Universitätsklinikum Gondar, Äthiopien (Gynäkologische
Station)
07.-08.2011 Famulatur Herzzentrum Leipzig (Kardiologische Intensivstation)
06.-07.2009 Krankenpflegepraktikum St. Elisabeth Krankenhaus (Urologisch-
chirurgische Station)
02.-03.2009 Krankenpflegepraktikum Herzzentrum Leipzig (Chirurgische Station)
Seit 2010 staatlich anerkannte Ausbilderin für Erste-Hilfe und Mitglied der AG
EH-MED e.V. (studentische Arbeitsgemeinschaft für Erste Hilfe und
Notfallkunde für Medizinstudierende, gemeinnütziger Verein)
Stipendien:
2013 MD Pro 2 IFB Adipositas Erkrankungen (eigenes Forschungsprojekt)
2011 Promotionsstipendium der Universität Leipzig
87
Veröffentlichungen
Originalarbeiten
Ines Liebscher and Julia Schön, Liane Fischer, Sarah C. Petersen, Maxi Cöster, Kay-Uwe
Simon, Sven Rothemund, Kelly R. Monk and Torsten Schöneberg (2014). A Tethered
Agonist within the N Terminus Activates the Adhesion G protein-coupled Receptors GPR126
and GPR133 (under revision)
Poster
Julia Schön, Torsten Schöneberg and Ines Liebscher (2013) G protein-coupling of adhesion
GPCR Gordon Conference New Opportunities with G-protein Coupled Receptors: From
Single Molecules and Signaling Complexes to Physiology and Therapeutic Interventions.
April 28 - May 3, 2013, Lucca (Barga), Italy
Julia Schön and Liane Fischer, Franziska Rößler, Jens Bohnekamp, Torsten Schöneberg and
Ines Liebscher. G protein-coupling of Adhesion receptors. 11. Research Festival Leipzig
2012. December 14, 2012,
88
Danksagung
Auf dem Weg zur Promotion haben mich eine Vielzahl von Menschen begleitet und
unterstützt. Dafür möchte ich mich ich an dieser Stelle bei allen Mitarbeitern des Instituts für
Biochemie herzlichst bedanken.
Ich danke Herrn Prof. Dr. med. Torsten Schöneberg für stetig kritisches Hinterfragen,
wertvolle Hinweise und konstruktive Kritik, die Anlass und Ansporn für neue Experimente
waren.
Ein besonderes Wort des Dankes möchte ich an meine Betreuerin Frau Dr. med. Ines
Liebscher richten, die stets ein offenes Ohr für Ideen, Probleme und Anregungen hatte und
maßgeblich am Gelingen dieser Arbeit beteiligt war. Vielen Dank für die vielen für mich
geopferten Abende und Nächte, um Daten zu diskutieren sowie Schriftstücke und Poster zu
kontrollieren.
Ich möchte Kay-Uwe Simon und Susann Lautenschläger für ihren fachlichen Rat, die stets
aufmunternden Worte und die angenehme Arbeitsatmosphäre im Labor danken.
Weiterhin möchte ich mich bei Liane Fischer für ihre Unterstützung und Hilfe bei der
Ausführung von Experimenten und während des Schreibprozesses bedanken. Ich danke Felix
Kretschmer für seine Unterstützung in der statistischen Auswertung.
Ich danke Martin Buchold und Caroline Wilde für das gründliche und kritische Gegenlesen
dieser Arbeit.
Für die finanzielle Unterstützung während meiner Doktorarbeit möchte ich mich bei der
Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig und dem IFB Adipositas Erkrankungen
Leipzig bedanken.
Und nicht zuletzt danke ich meinen Eltern, die in jeglicher Hinsicht die Grundsteine für
meinen Weg gelegt haben, stets an die Beendigung meiner Dissertation geglaubt haben und in
schwierigen Situationen mit den richtigen Worten für neue Hoffnung sorgten.