Neue Einsatzmöglichkeiten von Polyphenoloxidasen
und Peroxidasen zur Synthese von Hybrid-
molekülen und Wirkstoffen und Entwicklung des
Gebiets der Kombinatorischen Biochemie
Prof. Dr. F. Schauer, Institut für Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Prof. Dr. F. Schauer, Institut für Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Enzyme mit Fähigkeiten zur Kopplung von Substanzen und zur Herstellung von Hybridmolekülen
Polyphenoloxidasen Laccase
TyrosinasePeroxidasen
LigninperoxidaseManganperoxidaseMeerrettichperoxidase
Laccase
ein bekanntes pilzliches Enzymmit neuen biotechnologischen Anwendungen
Prof. Dr. F. Schauer, Institut für Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
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Zählt zum extrazellulären, ligninolytischen Enzymsystem
von Weissfäulepilzen
Erstmals im Saft des japanischen Lac-Baumes
Toxicodendron verniciflua 1883 entdeckt
Nachweis in Pflanzen, Insekten, Bakterien und Pilzen
Vorkommen und natürliche Bedeutung der Laccase
Prof. Dr. F. Schauer, Institut für Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Vorkommen und natürliche Bedeutung der Laccase
Meist extrazelluläres Glycoprotein
Ligninabbau
Konidienfärbung bei der Morphogenese in Pilzen
Zellwandbiosynthese in Pflanzen
Pigmentbildung und Cuticula-Härtung bei Insekten
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Laccase = Polyphenoloxidase (EC 1.10.3.2)
Zur Gruppe der blauen Kupfer-Oxidasen gehörend
Oxidation zahlreicher phenolischer Verbindungen
Substratoxidation verbunden mit gleichzeitiger
Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser
Breites Substratspektrum
Unterschiedliche pH- sowie Temperatur-Optima
Merkmale der Laccase
Die Laccasereaktion - Bildung von Chinonen
Beispiel: Oxidation von Methoxyhydrochinon
1. Schritt: Bildung eines Phenoxy-Radikals
2. Schritt: nicht-enzymatische Disproportionierung unter Bildung vonMethoxy- p- Benzochinon.
O
O
OMe
OH
OH
OMe
+
OH
OH
OMe
OH
OMe
O
2 2Laccase, O2 spontan
Prof. Dr. F. Schauer, Institut für Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
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Anwendungsmöglichkeiten der Laccase
Schadstoffeliminierung
Einsatz in der Lebensmittelindustrie
Herstellung von Verbundwerkstoffen
Biosensor- und Diagnostik-Anwendungen
Biokombinatorische Reaktionen
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Am Institut für Mikrobiologie verfügbare Laccasen
Pycnoporus cinnabarinus Trametes villosaTrametes spec.
Myceliophthora thermophila
Nutzung der Laccasereaktion für eine gerichtete Produkt-bildung Patent PCP/EP 01/07152, 2001
Homologe Oligomerbildung
Heterologe Oligomerbildung
R
R
RRR
+2
R
+ + ReagensR
Reagens
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Transformation von Umweltschadstoffen durch Laccase
O
OH
O
OH
O
OH2
2-Hydroxydibenzofuran
O
OHO
OH
O
OH
2
2-Hydroxydiphenylether
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Schultz, A.; Jonas, U.; Hammer, E., ;Schauer, F. Dehalogenation of chlorinated hydroxybiphenyls by fungal laccaseAppl. Environ. Microbiol. 67 (2001) 4377-81
HO
Cl
HO
HOLaccase
3-Chlor-4-hydroxybiphenyl 3,3‘-Di-(4-hydroxybiphenyl)
2
Dechlorierung von 3-Chlor-4-hydroxybiphenyl durch Laccase
Prof. Dr. F. Schauer, Institut für Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Beispiel einer homomolekularen Kopplung
Ciecholewski, S.; Hammer, E.; Manda, K.; Bose, G.; Nguyen, V. T. H.; Langer, P.; Schauer,F. Laccase-catalyzed carbon-carbon bond formation: oxidative dimerization of salicylic esters by air inaqueous solution. Tetrahedron 61 (2005) 4615-4619
OH
O
O
OH
O
OOH
O
O
2 Laccase
Salicylsäure-DerivateC-C-gekoppeltesDimerisationsprodukt
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Einsatz von Laccase in der organischen Synthese
O
N
NH
NH
O
NNH2
ONH
*n
O
N
N
NH
NH
n
O
2
N-(2-Alkylamino-4-phenyl-imidazol-1-yl)-acetamid
Mikolasch, A.; Schauer, F.; (2003): Characterization of N-(2-alkylamino-4-phenylimidazol-1-yl)-acetamides in kinetic studies byusing cells and laccase from Trametes versicolor. J. Basic Microbiol. 43, 508-521
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Laccasevermittelte Biotransformationen
dihydroxylierteraromatischer
Reaktionspartner
Fungizide
NH
NN
R
NH
N
R
R
Zytostatika
N NH
N
R
R
N
N
N
R
RAnthelminthika
NH
NR
R
Aminosäuren
R
NH2O
OH
Naturstoffderivate
N
NH2 O
R
OHR
R
R
+
+ +
++
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Nutzung der Laccasereaktion für eine gerichtete Produktbildung
Laccasesubstrate
Aromaten mit 2 ortho-ständigenHydroxygruppenAromaten mit 2 para-ständigenHydroxygruppen Ligninbausteine oder Biaryl-verbindungen mit 1 Hydroxygruppe
Tausende von Reaktionsmöglichkeiten über C-C, C-O, C-N und C-S- Kopplung
Reaktionspartner
Aromaten mit 2 ortho-ständigen oder 2para-ständigen OH-Gruppen
Hydroxygruppen tragendeVerbindungen
Aminogruppen tragende Verbindungen
Thiogruppen tragende Verbindungen
Beispieltransformation eines Wirkstoffes
Hydrokaffeesäure
Hexylamin Hydrokaffee-säure
1,2,4-Tri-hydroxybenzen
2-Aminobenzoe-säure
3-Aminobenzoe-säure 4-Aminobenzoe-
säure
1 Produkt 1 Produkt
>3 Produkte>5 Produkte1 Produkt
1 Produkt
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Laccase als Katalysator für eine Derivatisierung von aromatischen Aminen
OH
OH
R3R1
R2
NH2
R4
O
ONH
R4
R1 R3
R2
O
ONH
NH
R3
R3
R2
R3
+
alkylierte para-Hydrochinone
4-Aminobenzoesäurederivate,para-substituierte Aniline
2,5-Dihydroxybenzoesäurederivate
4-Aminobenzoesäurederivate,para-substituierte Aniline
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0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 25 50 75 1000
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 25 50 75 1000
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 25 50 75 1000
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 25 50 75 100
Kon
zent
ratio
n [ µ
mol
/ m
l ]
Zeit [min]
Substrate: 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)-benzamid (■), 4-Aminobenzoesäure ( )Produkt: 2-(4'-Carboxy-anilino)-N-(2''-hydroxyethyl)-3,6-dioxo-1,4-cyclohexadien-1-carboxamid (▲)
Kinetik des Laccase-vermittelten Substratverbrauchs
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Ausgangsstoffe und Laccase in entsprechenden Puffersystemen pH 5,0 oder pH 7,0,
mit Substraten in Gegenwart von Sauerstoff inkubieren
Erfassung der Produktbildung mittels HPLC ( oftmals mit Farbveränderung verbunden)
Aufarbeitung über Festphasenextraktion
Strukturaufklärung gebildeter Produkte mittels GC, GC-MS, LC-MS-NMR-Kopplung
Versuchsoptimierung und Maßstabsvergrößerung
Durchführung von Laccase-Umsetzungen
Bedarf an neuen bioaktiven Substanzen
Wirkstoff-ForschungMedizinVeterinärmedizinPflanzenschutz
MaterialwissenschaftenKatalyseKosmetik
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Quellen neuer Wirkstoffe Effizienz
Naturstoffscreeningchemische Synthese kombinatorische ChemieBiotransformation
14
33001-10
ca. 1000Biokombinatorik
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Biologisches Derivatisierungs-verfahren für Wirkstoffe unter Einsatz des BiokatalysatorsLaccase
Gewinnung des Enzyms mit breitem Substratspektrum ausWeißfäulepilzen
Pycnoporus cinnabarinus,Zinnoberroter Zunderschwamm
Prof. Dr. F. Schauer, Institut für Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
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Derivatisierung von Wirkstoffen mittels Laccase
Dihydroxylierte oder monohydroxylierte aromatische Verbindungen als
Laccasesubstrat
Radikalisierung des Substrates durch Laccasezusatz
Reaktion des radikalisierten Laccasesubstrates mit Wirkstoffgrundstrukturen
(z.B. Aminogruppen tragend)
Entstehung eines neuen potentiellen Wirkstoffes
OH
OH
R
R
Wirkstoff-grundstruktur
+ Laccase neues Wirkstoff-derivat
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Laccase als Katalysator für eine Derivatisierung von Antibiotika
Wirkstoff A / Substrat A + Wirkstoff B Wirkstoff AB
OH
OH
R1
NH2
R3
O
O
R1
R2 R2NHR3
+
ß-Lactame,Amino-glycoside
2,5-Dihydroxybenzoesäure-Derivate, alkyliertepara-Hydrochinone
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Testung der Wirkstoffeigenschaften
Antimikrobielle Testung in vitrogramnegative Keime: Escherichia coli
grampositive Keime: Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis
ZytotoxizitätAntimikrobielle Wirksamkeit in vivoInfektionsmodell „mit Staphylococcus aureus infizierte Maus“
Vorteile der biokombinatorischen Derivatisierung
Herstellung einer Vielzahl von Verbindungen innerhalb kurzer Zeit
Breites Substratspektrum der Enzyme
Hohe Umsatzgeschwindigkeit und Substratumsätze
Umsatz von empfindlichen Naturstoffen möglich (RT, Normaldruck, etc.)
Verknüpfung von Wirksubstanzen möglich
Reaktion ohne chemische Katalysatoren, Lösungsmittel,etc.
Leichte Enzymgewinnung, hohe Enzymstabilität
Prof. Dr. F. Schauer, Institut für Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
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Derivatisierung von Aminosäuren mittels Laccasen
2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)-benzamid
+ NH
O
OH
OH
OH
L-Tryptophan
NH2
O
NH
OH
Kopplungsprodukt
O
O
NH
NH
O
OH
NH
O
OH
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Transformation von 2,3-Dimethylhydrochinon und L-Phenylalanin mittels Laccase
Derivatisierung von Phenylalanin mittels Laccase
OH
OH
O
O2,3-Dimethyl-hydrochinon
2,3-Dimethyl -benzochinon
O
O
NH
COOH
DMHC + PHE - P1
COOHNH2+
-2H+
L-Phenylalanin-2H+, -2e-
Prof. Dr. F. Schauer, Institut für Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Kopplungsversuche zur Entwicklung neuer Kleb-stoffe auf Strukturbasis von MAP`s
MAP`s = mussel adhesive proteins
Enzymatische Vernetzung von Peptidsequenzen
Beispiel
Prof. Dr. F. Schauer, Institut für Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Beispiele für Anwendungen derKombinatorischen Biokatalyse mittels Laccasen
Herstellung von Funktionsmusternentsprechend dem Patent "Biologisch aktive Verbindungen aus G. pfeifferi" Ganomycin Gesellschaft für biomedizinischeForschung mbH Greifswald
Derivatisierung von Antibiotika
Landesforschungsschwerpunkt (LFS)Anwendungsoptimierung neuer Wirkstoffeund Biomaterialien durch Derivatisierungund Strukturveränderung mittels Laccasen
Derivatisierung von AminosäurenDerivatisierung von N-analogenCorollosporinen
Technologieberatungsinstitut (TBI)Untersuchungen zur Erweiterung des Anwendungsspektrums Laccase-vermittelter biokombinatorischer Reaktionen
Derivatisierung von Purinen undPyrimidinen (Zytostatika)Derivatisierung von Imidazolen undTriazolen (Antimykotika)
Riemser Arzneimittel AGStiftung Industrieforschung (SIF)Verbesserung der Anwendungseigenschaftenvon Wirkstoffen durch Biotransformation
Derivatisierung von 4-Hydroxyprolin Derivatisierung von aromatischen Aminen und aliphatischen Aminen
Zusammenfassung einiger Vorteile des Einsatzes von Laccasen
Prof. Dr. F. Schauer, Institut für Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Breites Substratspektrum (ca. 200 Substrate)Reaktion mit Tausenden von Nicht-Laccase-Substratenhohe Enzymstabilitätaußer O2 keine Cofaktoren erforderlichEnzymproduktion im technischen Maßstab bereits möglichEnzymreaktoren in der Entwicklungsphasebreite mögliche Anwendungsgebiete: Organische Synthese,C-C-Kopplungen, Protein-Modifizierung, Oligomerisierungen, Polymer-Chemie,Umsatz und Derivatisierung von hochempfindlichen Natur- und Wirkstoffen möglich.
Forschungsbedarf: Für welche Reaktionen kann die kombinatori-sche Biochemie als umweltfreundliches Syntheseverfahren konkretnutzbar gemacht und ökonomisch sinnvoll eingesetzt werden?