Nuevas técnicas de secuenciación en el diagnóstico
genético Ana Mª Pérez Caballero
FEA en Análisis Clínicos
Molecular Clinical Scientist
NE Thames Regional Genetics Service
Great Ormond Street Hospital
Congreso Nacional Laboratorio Clínico
2018
• 1977 -Frederick Sanger desarrolló la tecnología de secuenciación basada en la terminación de cadena.
• 1987- Introducción de secuenciadores automatizados ABI 370 seguido de secuenciadores capilares.Tamaño de lectura de 600 pb produciendo una lectura de 500Kbases/día
• 1995- ABI 3730XL 2.88M bases por día tamaño de lectura 900 pb
• 2001 – Se completa la secuenciación del Genoma Humano – necesidad de nuevas tecnologías
• 2005 – 454 desarrollo de la pirosecuenciación (Roche) y Solexa Genome Analyser secunciación por síntesis(Illumina)
• 2006 – ABI/Life technologies introducen SOLID system (Sequence by Oligo Ligation Detection).
• Futura 3º generación – Secuenciadores de moléculas sencillas y secuenciadores de lectura larga.
Un poco de historia
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chain termination through dideoxynucleotide incorporation
Dideoxynucletide is labelled to allow detection. Original Sanger method used radioactivity to do this
4 separate reactions for each nucleotide
Fragments are size-separated in a gel
• Síntesis por terminaciónmediante incorporación de dideoxinucleótidos
• El cebador está marcado. El método original usabaradioactividad.
• Hay 4 reacciones distintas, unapara cada tipo nucleótido.
• Los fragmentos son separadospor tamaño en un gel
Secuenciación Sanger o de terminación de cadena
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• Cada dideoxinucleótido está marcado con fluorocomo diferente,por lo que el proceso se lleva a cabo en una única reacción.
• La electroforesis capilar separa los distintos fragmentos portamaño e identifica el nucleótido presente al final de cadafragmento dependiendo del tipo de fluorocromo.
• Hasta 96 muestras pueden ser secuenciadas al mismo tiempo,pero sólo un único fragmento.
Secuenciación Sanger automatizada
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BRCA1 c.5266dup p.(Gln1756Profs*74)
• Gold standard• Estudio de pequeños genes (Conexina 26), estudios familiares y
confirmación de resultados de NGS
Secuenciación Sanger
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• Distintas plataformas de NGS que usan diferentes técnicas desecuenciación están disponibles en el mercado.
• Todas las plataformas de secuenciación masiva llevan a cabo lasecuenciación de millones de pequeños fragmentos de ADN dedistintos pacientes en paralelo.
• Los análisis bioinformáticos se utilizan para poder agrupar todaesta información y mapear las lecturas individuales con el genomahumano de referencia.
• Cada base es secuenciada múltiples veces para conseguir
resultados precisos.
Secuenciación masiva Next Generation Sequencing (NGS)
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• NGS – secuenciación masiva• Roche, 454 Life Sciences• Life Technologies (ION Torrent & ION Proton)• Illumina (Hiseq, Miseq & Nextseq)
• Tercera generación de secuenciación• Pacific Biosciences (PacBio RS)• Oxford Nanopore (MinION, PromethION, GridION)
Roche 454 GS FLX Illumina
ThermoFisher Ion PGM Applied Biosystem SOLID
Secuenciación masiva Next Generation Sequencing (NGS)
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Secuenciación Sanger vs Secuenciación masiva
Sanger NGS
Secuenciación de fragmentos largos Secuenciación de fragmentos cortos
Baja tasa de error Alto rendimiento
Secuencia por muestra Se pueden secuenciar distintas muestras al mismo tiempo
Requiere grandes cantidades de ADN Screening de paneles de genes es más rápido
Alto costo por base Método más económico
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Preparación de librería
Enriquecimiento Secuenciación Análisis de datos
NGS - Pasos
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• Fragmentación de ADN (pequeños fragmentos) Fragmentación física Fragmentación enzimática Fragmentación química
• Unión de adaptadores y barcodes
• Selección de los fragmentos de ADN.
• Cuantificación de la librería.
Preparación de librería / preparación de la muestra
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• Secuencia específica para la unión a la fase sólida• Secuencia específica para secuenciación • Barcodes – único para cada muestra
ADN fragmentado
Adaptadores
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Preparación de librería
Enriquecimiento Secuenciación Análisis de datos
NGS - pasos
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PCR por emulsión
Amplificación en puente (bridge amplification)
Imágenes publicadas por M. Metzker Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46. doi: 10.1038/nrg2626. Epub 2009 Dec 8.
Enriquecimiento / cluster generation
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Preparación de librería
Enriquecimiento Secuenciación Análisis de datos
NGS - pasos
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Pirosecuenciación (Roche 454 GS)
Terminación reversible cíclica (Illumina / Helicos BioSciences)
Secuenciación
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Preparación de librería
Enriquecimiento Secuenciación Análisis de datos
NGS - pasos
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NGS Pipeline
• .blc
• .fasq
Raw data
• Genomas de referencia
• De novo
Alineamento • Mapeo
• Anotación
Identificación y anotación de
variantes
• Bases de datos generales y locales
Filtro de variantes • Delecciones
• Duplicaciones
CNVs
Análisis de calidad
Profundidad: número de veces que cada base de ADN está presente en las lecturas producidas durante la secuenciación. Determina la fiabilidad del nucleótido asignado a una posición dada en el genoma.
Cobertura: número de lecturas presentes una región dada o en la totalidad de regiones de la secuencia reconstruida. Informa de cómo ha funcionado la secuenciación (normalmente x30).
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NGS Pipeline
• .blc
• .fasq
Raw data
• Genomas de referencia
• De novo
Alineamento • Mapeo
• Anotación
Identificación y anotación de
variantes
• Bases de datos generales y locales
Filtro de variantes • Delecciones
• Duplicaciones
CNVs
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Clasificación de variantes
Tipo de variante (missense, nonsense, frameshift)
Localización de la variante (Hot spot, dominio importante para la proteína?)
Frecuencia en la población (Exac, gnomAD)
De novo
In silico tools
Publicado previamente?
Segrega la variante con la enfermedad
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• Diagnóstico molecular de enfermedades hereditarias Secuenciación dirigida Secuenciación del exoma Secuenciación del genoma
• Diagnóstico prenatal NIPT NIPD
• Análisis del transcriptoma (ARN-Seq - Transcriptoma completo)
• Estudio del microtranscriptoma
• Identificación de zonas de interacción proteína-ADN (ChIP-seq)
• Identificación de patrones de Metilación (metiloma)
Aplicaciones
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Diagnóstico Prenatal
Informar de resultado desfavorable para el feto y / o la madre
Manejo del embarazo
Posibilidad de intervención rápido después del nacimiento
Idear plan para posibles complicaciones durante el parto
Planificar futuros embarazos
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Invasivo vs no invasivo
CVS: entre 11-14 semanas de gestación Pequeño riesgo de aborto asociado Pequeño riesgo de infección Posibilidad de tener que repetir la toma de muestra
Amniocentesis entre 15-20 semanas de gestación Pequeño riesgo de aborto asociado Pequeño riesgo de infección
cffDNA
no riesgo asociado de aborto
obtención de la muestra es más sencilla
diagnóstico más temprano (desde 7 semanas)
AMNIOCENTESISCVS
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ADN fetal circulante (cffDNA)
Es producido por la placenta (trofoblasto)
Representa el genoma fetal completo
Detectable desde 4 semana
% incrementa con el embarazo
10-20% del total cfDNA
Es eliminado de la circulación en 30 mins después del parto
Más corto que el cfDNA materno
cfDNA materno 166bp
cffDNA 143bp
Cell free DNA
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Definiciones
• NIPD: DIAGNÓSTICO – No es necesario una técnica invasiva para confirmar los resultados
• Transtornos de un solo gen
• Determinación del sexo
• NIPT or NIPS: TESTING or SCREENING
• Aneuploidías
Requiere de técnica invasiva para confirmación de los resultados
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NIPT or NIPS: TESTING or SCREENING
10-11 semanas de gestación
NIPT para T21 tiene un alta tasa de detección (>99%)
Menos falsos positivos que el triple screening
Reducción del número de técnicas invasivas
No ofrecido por el NHS, pero en proceso de deliberación (para mujeres con triple screening positivo)
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NIPT – ¿Por qué no es una técnica de diagnóstico?
Técnica invasiva es necesaria para confirma los resultados
Reorganizamientos cromosómicos maternos/
Mosaicismo
Tumores en la madre
Vanishing twin
Falsos positivos
Mosaicismo confinado a la placenta
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• Enfermedades severas ligadas X
• Únicamente afecta a hombres
• DMD, SCID, hemofilia, etc
• Diagnóstico invasivo sólo se lleva a cabo si el feto es de sexo masculino
• Hiperplasia adrenal congénita
• Autosómica recesiva
• Riesgo de virilización genital en niñas afectadas
• El saber el sexo del feto permite la administración de dexametasona
• Diagnóstico invasivo únicamente necesario si es niña
• Identificación mediante ecografía de genitales ambiguos
Hill et al 2011 Prenat Diagn 31:267-73; Hill et al 2011 Clin Genet 80:68-75
Determinación no invasiva del sexo
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Diagnóstico prenatal no invasivo (NIPD)
Detección de ADN fetal circulante (cffDNA) en plasma materno para ofrecer unaalternativa a las técnicas de diagnóstico invasivo.
Enfermedades dominates de origen paterno
Anomalias ecográficas asociadas a determinadas enfermedades genéticas –displasias esqueléticas ( acondroplasia, Apert o Crouzon)
Parejas con previa descencendia con enfermedad genética (variantes patogénicaes de novo)
Exclusión del alelo paterno en enfermedades recesivas en las que los padres sonportadores de distintas variantes.
Análisis de dosis de haplotipos relativos. Relative Haplotype Dosage Analysis(RHDO) Parejas con riesgo de tener descencencia con enfermedad genéticarecesiva
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