'O Lago'-1928
Controle biológico de Produtos Farmacêuticos
Esterilidade(1932 na Inglaterra, primeiro teste)
• Conceito: total ausência de formas viáveis capazes de reprodução.
• Estatisticamente: esterilidade é um termo absoluto que não pode ser garantido.
• USP-33: a condição de esterilidade de um produto deve ser considerada quando o processamento ocorreu em condições adequadas e a análise de uma amostra representativa do lote, submetida ao teste de esterilidade, indique ausência de micro-organismos viáveis.
Teste de EsterilidadeTeste de Esterilidade
Produto1.000 mL
Filtração em membrana
200 mL
tioglicolato caseína-soja
14
dias
TESTE DE ESTERILIDADE “INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADO”
negativo
positivo
APROVAR O LOTE
positivo
negativo
•Revisão de registros da produção;
• Verificar possibilidade de contaminação acidental;
• Realizar RETESTE
positivo negativo
APROVADOREPROVADO
REPIQUE (+ 4 dias)
positivo negativo
APROVADOREPROVADO
Coleta de amostraColeta de amostra
• Os testes de esterilidade e de Os testes de esterilidade e de pirogêniopirogênio são são realizados em diferentes etapas críticas do realizados em diferentes etapas críticas do processo, mas seguindo o mesmo roteiro.processo, mas seguindo o mesmo roteiro.
Amostragem:( de acordo com a monografia ou tabelas)
exemplos:
PREPARO DA AMOSTRA
• A natureza da amostra exige preparação prévia para que o resultado do teste seja válido
Cuidados:• - Proceder a desinfecção externa dos frascos,
ampolas, materiais de acondicionamentos ou embalagens com soluções anti-sépticas por imersão ou nebulização. Tempo de contacto determinado experimentalmente;
• - Solução para desinfecção: fenol 5%, álcool iodado, formaldeido 5%, álcool isopropílico,etc;
• - Violação da amostra somente no momento da inoculação no meio de cultura;
• - Agitar o frasco e retirar, assepticamente, um número suficiente de unidades, ou volume de cada meio.
Limitante do Teste de Esterilidade
• Os testes de esterilidade não detectam a presença de impurezas tóxicas.
Impurezas tóxicas: substâncias que, por ação direta, ou indireta sobre um órgão, ou sistema passam a produzir alterações nocivas
ao paciente.
“Algumas dessas substâncias são classificadas como PIROGÊNICAS”
PIROGÊNIO
São “COMPOSTOS” QUE, QUANDO EM CONTATO COM O SANGUE, DESENCADEIAM REAÇÃO FEBRIL
Os pirogênios não são eliminados das preparações pelos processos de esterilização convencionais e também apresentam um elevado grau de termoestabilidade.
FEBRE
• É definida como uma elevação controlada da temperatura interna do indivíduo acima dos níveis normais, decorrente da elevação do ponto de regulagem hipotalâmico.
DINARELLO et al. 1988
PIROGÊNIO
FEBRE• É uma resposta fisiológica complexa a infecção ou lesão;• É o primeiro componente da resposta de fase aguda (RFA) a
ser observada na resposta inflamatória.Hasday et al., 2000
• A RFA é uma reação imediata e complexa a agressões, como:– Infecções:
• Bacterianas;• Virais;• Parasitária.
– Traumas:• “Químicos”;• Mecânicos;• Térmicos;
– Necrose isquêmicas;– Tumores– “Tóxinas”
Koj, 1996
PIROGÊNIO
PIROGÊNIO
Centanni - última década do século XIX: isolamento de toxina bacteriana responsável pela febre;
Hort e Penfold – febre das injeções (material estéril, porém pirogênio) 1912: teste de pirogênio em coelhos;
Seibert - 1923: pirogênios filtráveis e termoestáveis.esterilidade ≠ apirogenicidade (exige controle em todos os estágios da
produção)
USP XII – 1942: desenvolvimento do primeiro teste oficial em coelhos;
Shear e Turner – termo lipopolissacarídeo (LPS);
Atualmente sabe-se que a porção lipídica do LPS, uma endotoxina, é responsável pelas reações biológicas.
Histórico
Lipopolissacarídeo (LPS)
• Também conhecido como endotoxina é uma molécula altamente tóxica derivada da membrana celular externa de bactérias gram-negativas.
Fonte: GIROIR, B.P. Mediators of septic shock: new approaches for interrupting the endogenous inflammatory cascade. Crit. Care Med., v.21, p. 780-9, 1993.
Estrutura do LPS
•O antígeno O (polissacarídeos) varia em composição e comprimento entre as bactérias Gram -;
•O núcleo e o lipídeo A são mais constantes. (conservados entre diferentes espécies) ;
•O lipídeo A é o principal responsável pela toxicidade da endotoxina.
LPS(presente na parede das bactérias Gram -)
Endotoxina
Nos produtos farmacêuticos podem ser encontradas unidades não purificadas nas etapas do processo, ou no produto acabado – POR ISSO USA-SE A TERMINOLOGIA ENDOTOXINA;
Para a industria farmacêutica o termo endotoxina se refere a LPS, o pirogênio mais significativo.
PIROGÊNIO
Endotoxina(exógena, estão no interior do corpo mas foram “formadas” fora)
Alto peso molecularMembrana externa de bactériasPurificadas – lipopolissacarídeos (LPS)TermoestáveisInativação - ciclos extensos de calor seco, condições alcalinas ou ácidasAtividade biológica - porção lipídica
PIROGÊNIO
Classes de PIROGÊNIO(2 classes)
exógeno
Lipopolissacarídeo (endotoxina)
Induzem a febre quando injetados
endógeno
resposta a pirogênio (toxina)exógeno
Produzido internamente pelo
hospedeiro
Mediador primário da febre
PIROGÊNIO
Mecanismo da febre
Fagocitose do lipídeo AProdução pirogênio endógeno
Atravessa barreira hematoencefálicaRegulação da temperatura
Prostaglandina E2 e AMPc
PIROGÊNIO
pirogenicidade unidade lipídica da endotoxina
Níveis aceitáveis de pirogênios:
•Parenterais de grande volume - 0,5 EU/mL•Água para injeção - 0,25 EU/mL•Drogas intratecais - 0,2 EU/mL•Solução salina - 0,5 EU/mL•Solução glicose injetável 5% - 0,5 EU/mL
PIROGÊNIO
EU/ mL = unidades de endotoxina por mL
TESTES
Os testes para determinar a presença, ou não de pirogênio em uma amostra pode ser in
vitro ou in vivo.
PIROGÊNIO
MÉTODOS ANALÍTICOS(a USP – 33 recomenda qual a ser usado)
Ponto final de geleificação
Ensaio turbidimétrico
Método cromogênico
Outros…
PIROGÊNIO
TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO IN VITRO
1885 – sangue de Limulus polyphemus formava um coágulo em gel sólido;
Amebócitos- única célula circulante encontrada no sangue de Limulus polyphemus ;
Posteriormente – bactérias marinhas Gram (-) provocavam coagulação intravascular e morte dos caranguejos;
Origem: Derivado termoestável das bactérias;
1964 – Levin e Bang: (1) amebócitos eram necessários para a reação, (2) quantidades de endotoxina eram inativadas na reação
PIROGÊNIO
Tachypleus gigas (in Indonesia)
Tachypleus gigas (in Indonesia)
MECANISMO DA REAÇÃO
(1)reação é dependente da ativação da enzima de
alto peso molecular pela endotoxina (dependente de Ca++ e outros íons bivalentes)
(2) geleifica proteínas coaguláveis de baixo peso molecular (coagulógeno)
PIROGÊNIO
Cascata de coagulação
Preparo do lisado do amebócito de Limulus (LAL)
Sangria do caranguejo
Lavagem do amebócito
Liberação do conteúdo intracelular do amebócito
Liofilizar
LAL introduzido na USP XX e 4a. Edição Farmacopéia Brasileira 1996
PIROGÊNIO
MÉTODOS ANALÍTICOS Ponto final de geleificação (LAL + solução teste incuba a 37±1ºC por 1 hora (+-2`). Observar formação do gel (inverter cuidadozamente o tubo para 180º)Ensaio limiteSensibilidade: 0,25 a 0,015 EU/mL
PIROGÊNIO
Outro método: MÉTODO CROMOGÊNICO
CURVA PADRÃO
LAL + EU/mL
(incuba 10 min 37 ºC)
Substrato cromogênico (37 ºC)
(20 min a 37 ºC)
ácido acético (interromper a reação)
Leitura a 405 nm
PIROGÊNIO
Teste de PirogênioTeste de Pirogênio((MÉTODO CROMOGÊNICO)
Padrões Amostra (em triplicata*)
0,05(10%)
0,25(50%)
0,50(100%)
0,75(150%)
1,00 EU/mL(200%) *
* USP 33
+ LAL
+ substrato cromogênico
10 min, 37ºC
20 min, 37ºC
+ ác. acético leitura (405 nm)
C1 C2 C3
Resultado Resultado (exemplo)(exemplo)
C C (EU/mL)(EU/mL) A A (405 nm)(405 nm)0,050,05 0,0600,0600,250,25 0,3000,3000,500,50 0,6000,6000,750,75 0,9000,9001,001,00 1,2001,200CC11 0,0970,097
CC22 0,0820,082
CC33 0,0860,086
Resultado Resultado (exemplo)(exemplo)
A = 0,288C - 0,252
R2 = 0,9983
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0,05 0,25 0,5 0,75 1
Endotoxina (EU/mL)
A (4
05 n
m)
C1 = 0,080 EU/mL
C2 = 0,068 EU/mL
C3 = 0,072 EU/mL
C = 0,088 EU/mL
FluxogramaFluxogramaRecebimento das amostras
Preparo da sala de esterilidade. Desinfecção com nebulizador
Paramentação dos analistas Vestimento de roupa, sapato e EPEI’S estéreis na ante-sala
Entrada na sala de esterilidade
Aspiração da amostra com seringa e transferência para frasco estéril
Preparo da amostra (em triplicata)
Fluxograma (continuação)Fluxograma (continuação)
Adição de 0,1 ml de cada diluição em frasco de L.A.L com 0,1 ml de reagente de L.A.L.
Incubação 10 min, 37ºC
Adição substrato cromogênico
Incubação 20 min, 37ºC
Adição ácido acético
Leitura (405 nm)
Produto aprovado
Não mais que 0,5 EU/mL
Produto reprovado
Mais que 0,5 EU/mL
PIROGÊNIO
APLICAÇÃO
Utilizado em produtos parenterais, água para injeção e em fluidos biológicos
Método extremamente sensível, específico,reprodutível, simples e rápido.
TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO IN VIVO
TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO IN VIVO
- Ensaio limite-Aprovar ou rejeitar uma amostra mediante as variações do estado febril de um grupo de coelhos
☻ Cada grupo de animais (coelhos) recebe injeção intravenosa da amostra e é observado durante um período de 3 horas
Pontos a serem considerados: Valor igual ou maior que 0,6 ºC
Somatória de elevação térmica individual de todos os animais testados
Valores até 0,6ºC podem ser considerados normais
PIROGÊNIO
EXIGÊNCIAS PARA O TESTE
- Material utilizado (vidraria, injeção) - despirogenizado, tratamento térmico (250 graus por 1 hora) ou material apirogênico descartável
- Animal sadio
- Avaliação do peso do animal equivalência entre as espécies;Injetáveis de grande volume (10 mL/Kg)
- Raça de escolha
- Triagem dos animais em relação à resposta febril – indução de tolerânciaInoculação de nucleianato sódico 5 mg/Kg – resposta febril de 0,8 a 1,2 ºC
-Treinamento dos animais - tempo para resposta febril
-Reutilização dos animaisDescanso de 2-3 dias quando material apirogênicoDescanso de 2-3 semanas quando material pirogênicoAtenção com doses sub-pirogênicas mecanismo de tolerância
- Controle da temperatura fisiológica
PIROGÊNIO
AMOSTRA
Injetáveis, equipos de transfusão, infusão, dispositivos implantáveis ou descartáveis
Injetáveis de grande e pequeno volume
Produtos em forma de aerossol
Via de administração intratecal (a endotoxina é 1000 vezes mais potente)
Material plástico (preferência pelo LAL)
PIROGÊNIO
AMOSTRA
- Grande volume e líquidos extratores: 10 mL/Kg
- Velocidade da injeção: 4 a 6 mL/min (não ultrapassar 4 min)
- Temperatura da amostra: 37 a 38 ºC
Fármacos que atuam sobre o sistema termo-regulador
Produtos incompatíveis com a metodologia animal: hipnóticos, anestésicos, gluconato de
cálcio, radiofármacos
PIROGÊNIO
ANIMAL(coelhos adultos de 1,5Kg aproximadamente)
Manuseio do animal é fundamental
Suspender alimentação no dia do ensaio
Determinar temperatura corporal basal (40 a 90 min antes da injeção, 3 determinações a cada 30 min)
Solução teste na veia marginal da orelha
Registro temperatura corporal – 3 horas
Ideal: tomada contínua da temperatura
PIROGÊNIO
INTERPRETAÇÃO
USP XXXIII e Farmacopéia Brasileira IVDuas condições PARA RESULTADO NEGATIVO (liberar lote): Todos os animais com elevação térmica crítica ≤ 0,6oCSomatória da elevação térmica dos 3 coelhos < 1,14oC
AMOSTRA APROVADAAMOSTRA APROVADA
UMA DAS CONDIÇÕES NÃO ATENDIDA – RETESTE+ 5 animais – não mais que 3 animais devem acusar
elevação térmica crítica ≥ 0,6oCValor da somatória (8 animais) não deve exceder 3,7
oC
PIROGÊNIO
Teste in vivo(vantagem)
Detecta qualquer contaminante estranho capaz de ser detectado pelo teste animal
PIROGÊNIO
PROCESSOS DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO DAS PROCESSOS DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO DAS ENDOTOXINASENDOTOXINAS
Hidrólise ácido-baseSepara o lipídeo A do restante da molécula do LPSAltera a conformação (lipídeo A) em sítios funcionais essenciaisHCl 0,05 N por 30 min a 100 ºCÁcido acético glacial 1,0% por 2-3 horas a 100 ºC
OxidaçãoH2O2 – oxidação dos ácidos graxos presentes no lipídeo A do LPSInativação dependente do tempo, pH e concentraçãoOutros: O2 molecular, ácido hipocloroso ou hipoclorito, ácido periódico, permanganato de potássio diluído
AlquilaçãoAnidrido acético e succínico- redução de 100 a 1000 vezesÓxido de etileno- redução significativa de endotoxinasMaiores informações – quantidade de endotoxinas
Calor secoMateriais termo resistentes: frascos de vidro, instrumentos metálicos250 ºC/30 min – mecanismo incineração
PIROGÊNIO
DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO DE ENDOTOXINASDESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO DE ENDOTOXINAS
Lavagem (aplicação em embalagens)Lavagem com solvente apirogênico – água estéril para injeção
Destilação (aplicação em água)Mudança de estado físicoMoléculas de LPS são grandes e de elevado peso molecularÁgua recém destilada é estéril e apirogênica
Ultrafiltração (aplicação em antibióticos)Exclusão por peso molecular
Osmose reversa (aplicação em água)Membrana de acetato de celulose ou poliamidaRemoção de endotoxinas por exclusão (porosidade 10 Aº)
PIROGÊNIO
OBTENÇÃO DE PRODUTOS APIROGÊNICOSOBTENÇÃO DE PRODUTOS APIROGÊNICOS
Processo produtivo em condições adequadas de higiene
Operadores: qualificado e treinado
Matéria-prima com baixa carga microbiana
Processos validados
Ambiente
Boas práticas de fabricação
Monitorização do processo (técnicas analíticas validadas – in vivo e in vitro)
PIROGÊNIO